CH671960A5

CH671960A5 -

Info

Publication number: CH671960A5
Application number: CH23/87A
Authority: CH
Inventors: Junichi Yano; Tadaaki Ohgi
Original assignee: Nippon Shinyaku Co Ltd
Priority date: 1986-01-06
Filing date: 1987-01-06
Publication date: 1989-10-13
Also published as: BE906157A; GB8700183D0; SE469594B; NL8700016A; CA1315717C; GB2185026A; DE3700164C2; SE8605616L; DE3700164A1; GB2185026B; KR870007198A; FR2596762B1; FR2596762A1; ES2004038A6; JPS62252798A; KR940004076B1; SE8605616D0

Description

BESCHREIBUNG

Die Erfindung betrifft Nucleinsäurederivate gemäss Patentanspruch 1. Die Nucleinsäurederivate können aufgrund ihrer physiologischen Wirksamkeit als Arzneimittel verwendet werden, s Nucleinsäure ist aus solchen Zuckern, wie Ribose, zusammengesetzt, die an einen Purinring oder Pyrimidinring gebunden und über Phosphorsäure in Ketten angeordnet sind.

Unter den Nucleinsäuren ist RNA (Ribonucleotidpolymer) eine hochmolekulare Verbindung in Kettenstruktur, in welcher io Ribose als Zucker enthalten ist und die Zuckereinheiten über eine Diesterbindung der Phosphorsäure kombiniert sind.

Die Doppelkette hat in ihrem sterischen Aufbau durch die Kombination von Purin- oder Pyrimidinringeinheiten der Base (wie Inosin, Cytidin, Uridin usw.), welche die Nucleinsäure bildet, 15 eine Spiralform. Doppelsträngige Nucleinsäuren haben eine sehr nützliche physiologische Wirksamkeit, und sie sind intensiv untersucht worden.

Von diesen sind natürliche (z.B. von Viren herstammende RNA) und synthetische doppelsträngige RNA, wie Polyinosin-2o säure-Polycytidylsäurederivate (nachstehend abgekürzt als «Poly-I-Poly-C» bezeichnet), Polyadenylsäure-Polyuridylsäurederivate usw., gründlich untersucht worden (z.B. De Clercq et al.: Texas Reports on Biology and Medicine, 41, 77,1982).

Ho-P-0-CH

OH

0H OiH C5'-Cytidylsäiure)

HO—P = 0 JL

HN 7r~R

Ribonuc teinsaure

CR = OH, R' = H); Desoxyribonucle insäure

OR CR = H, R' = CH3)

0

H0-Fj-0-CH OH

0 R

OH OH

(51-Inosinsäure)

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Viele RNA-Nucleinsäurederivate sind als solche synthetisiert und ihre physiologischen Wirksamkeiten untersucht worden.

Die Poly-I-Poly-C ist eine Substanz mit hoher Wirksamkeit, und ihre Anwendbarkeit ist aufgrund von Untersuchungen ausgewertet worden. Ein Verbindung, bei der nur ein kleiner Teil des Çytidins in dem Poli-I-Poly-C zu Uridin umgewandelt ist (z.B. fehlgepaarte RNA), ist untersucht worden, weil seine physiologische Wirksamkeit ähnlich oder von Poly-I-Poly-C ist (vgl. japanische Patentveröffentlichung 50/082226).

Studien an Polycytidylsäure sind ebenfalls vorgenommen worden, und es liegt ein Bericht vor (britische Patentanmeldung Nr. 2,038,628) in dem festgestellt wird, dass, wenn eine Mercap-togruppe (-SH) an die Stelle der -NIL-Gruppe des Pyrimidinringes der Polycytidylsäure eingeführt wird, die physiologische Wirksamkeit zunimmt. Eine S-S-Brückenbildung und/oder Steuerung der Kettenlänge sind hier nicht vorgesehen.

Aus der Arbeit «Modification of Cytosine Moieties of Nucleic Acids with Hydrogen Sulfide» von K. Miura und T. Ueda (Chem. Pharm. Bull. 28, 1980, S. 3415-18) ist ebenfalls bekannt, Nucleinsäuren im Çytidinanteil zu sulfidieren. Aber auch hier sind Brückenbildung und Steuerung der Kettenlänge nicht diskutiert oder auch nur erwähnt.

Die herkömmlichen physiologisch wirksamen Substanzen, wie vorstehend angegeben, haben erwartungsgemäss nützliche Wirkungen trotz ihrer Toxizität, wie bei Poly-I-Poly-C feststellbar, die nicht verleugnet werden kann (De Clercq et al.: Infect. Immuni., 6, 344, 1972), und es ist erforderlich, hier Verbesserungen vorzunehmen. Weiterhin ist wünschenswert, die physiologische Wirksamkeit zu steigen.

Im Laufe von langjährigen Untersuchungen der Erfinder ist gefunden worden, dass trotz ziemlicher Koinzidenz RNA durch eine bestimmte kovalente Bindung stabilisierte Derivate mit einer Konformation höherer Ordnung bilden kann. Wenn ihre physiologische Wirksamkeit gemessen wird, stellt man fest, dass sie bei sehr geringer Toxizität eine stärkere Wirksamkeit aufweisen als die herkömmlichen physiologisch wirksamen Substanzen, was zu der vorliegenden Erfindung führte.

Das Merkmal der vorliegenden Erfindung liegt darin, dass als Ergebnis der Kombination einer Brücke mit kovalenter Bindung und der Substitution eines Teils der Molekülstruktur der Nucleinsäure durch eine oder mehrere SH-Gruppen und derefi nachträgliche Oxydation in -S-S-Brücken eine Nucleinsäure mit einer Konformation höherer Ordnung erhalten werden kann, die in stabiler Form vorliegt.

Gegenstand der Erfindung sind dementsprechend Nucleinsäurederivate, wie sie im Patentanspruch 1 definiert sind.

Die Nucleinsäurederivate nach der Erfindung können aus Nucleinbasen synthetisiert werden, in welche -SH-Gruppen eingeführt werden können. Ein spezifisches Beispiel für erfindungs-gemässe Nucleinsäurederivate ist eine solche, die eine komplementäre doppelspiralige Struktur einer Kettenverbindung aufweist (sogenanntes «Poly-C» in der vorliegenden Beschreibung), die ein Cytidylsäurepolymer ist, und eine andere Kettenverbindung (in der vorliegenden Beschreibung als «Poly-I» bezeichnet), die ein Inosinsäurepolymer ist. Obwohl diese Verbindung eine Struktur aufweist, die der des vorstehend erwähnten Poly-I-Poly-C ähnelt, haben die Nucleinsäurederivate nach der Erfindung aus den folgenden Gründen noch besondere Eigenschaften.

Nucleinsäurederivate nach der vorliegenden Erfindung sind solche mit teilweiser Vernetzung (-S-S-Bindung) oder mit gleichzeitiger Anwesenheit von -S-S-Bindungen und -SH-Gruppen, wobei 1 Schwefelatom auf 6-39 in dem Poly-C enthaltener Cytidylsäure kommt.

Die Schwefelatome in den Nucleinsäurederivaten nach der Erfindung können vor oder nach der Herstellung des Polymeren durch Anwendung einer Enzymreaktion eingeführt werden. Die Einfuhrung wird durchgeführt durch Substituieren der Nuclein-base mit -SH-Gruppen, indem beispielsweise an einer -NH2-

Gruppe in einem Pyrimidinring der Cytidinsäure eine -SH-Gruppe substituiert wird. Der substituierte Rest wird als 4-Thio-uridylsäure bezeichnet.

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OH 0H 5'-4-Thiouridylsäure

Das eingeführte -SH wird durch eine geeignete Methode, wie sie später erläutert wird, weiter oxidiert, so dass eine S-S-Brük-kenbindung gebildet werden kann.

Derivate, die sowohl SH- als auch S-S-Gruppen im Molekül aufweisen, können entweder durch partielle Oxidation einer Verbindung, in die eine -SH-Gruppe eingeführt ist, oder durch partielle Reduktion einer Verbindung, in die die S-S-Gruppe eingeführt ist, hergestellt werden.

Das vorstehend genannte Nucleinsäurepolyiper (Poly-C) besitzt einen einzigen Strang. Das einsträngige Nucleinsäurepoly-mer wird nach der Ausbildung der SH-Substitution und der S-S-Brückenbindung erhalten durch Oxidation der SH-Gruppen mit einem komplementären einsträngigen Nucleinsäurepolyme-35 ren auf eine nachstehend noch erläuterte WeisB zur Ausbildung von Doppelsträngen vereinigt werden. Die so hergestellten Nucleinsäurederivate gehören auch zu den Nucleinsäurederivaten mit physiologischer Wirksamkeit, die erfindungsgemäss angestrebt werden. Somit gehören alle Nucleinsäurepolymeren zu der 40 Erfindung, so lange sie Nucleinbasen enthalten, in die -SH-Gruppen eingeführt sind und anschliessend oxidiert werden. Beispielsweise gehören Verbindungen, die durchJDisulfidierang von Nucleinsäurepolymeren erhalten wurden, welche 4-Thiouridin, 2-Thiouridin-, 2-Thioguanosin, 6-Mercaptopurin, 8-Mercaptopu-45 rin usw. enthalten, in den Rahmen der Erfindung.

Die Nucleinsäurederivate nach der Erfindung können an ihrer Phosphorsäureseitenkette zu niedrigermolekularen Verbindungen aufgespalten werden, und solche mit niedrigerem Molekulargewicht gehören ebenfalls zu der Erfindung. Somit besteht in diesem Sinne ein Unterschied zu dem herkömmlichen Poly-I-Poly-C.

Als Folge des charakteristischen Merkmals der Nucleinsäurederivate nach der Erfindung, d.h. der Substitution mit -SH und die Bildung von Vernetzungen durch S-S-Bindungen und die Bildung von niedrigermolekularen Substanzen durch Aufspaltung an der Phosphorsäureseitenkette, ist es erstmals möglich, den erfin-dungsgemässen Effekt zu erhalten, dass (1) die physiologische Wirksamkeit erhöht und (2) die Sicherheit verbessert werden kann.

Die physiologische Wirksamkeit der Nucleinsäurederivate nach der Erfindung ist für Arzneimittel äusserst vorteilhaft. Wie nachstehend noch erläutert wird, haben die Nucleinsäuderivate nach der Erfindung eine starke Wirksamkeit als Interferoninduktoren. Diese Wirkung ist nur eine von zahlreichen physiologischen Wirkungen der Nucleinsäurederivate nach der Erfindung. 65 Was die physiologischen Wirkungen der Nucleinsäurederivate nach der Erfindung angeht, so können die folgenden zahlreichen Wirkungen genannt werden. Zu diesen gehören die Fähigkeiten, TNF, Interleukin 1 und Interleukin 2 zu bilden, die Makrophagen

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(Fresszellen) zu aktivieren, NK-Zellen zu aktivieren, die Proliferation von Tumorzellen zu hemmen, die Proliferation von Tumoren in krebsbefallenen Mäusen zu hemmen, die Proliferation bei menschlichen Tumorzellen tragenden nackten Mäusen zu hemmen, die Bildung von Metastasen von Tumorzellen in der Lunge zu verhindern usw.

Nucleinsäurederivate nach der Erfindung besitzen eine viel grössere Sicherheit als Interferoninduktoren, wie herkömmliches Poly-I-Poly-C. Folglich sind die Verbindungen nach der Erfindung brauchbare Antivirusmittel und Antitumormittel.

Der Ausdruck «Basenpaar» (abgekürzt BP), der zum Angeben der Molekülgrösse der Nucleinsäure häufig verwendet wird, gibt die Molekülgrösse durch uie Anzahl der Basen in der Nucleinsäure in jedem Komplementärstrang an (d.h. «10 BP» bedeutet, dass das doppelsträngige Polymere 10 Basen besitzt). Da auch andere Nucleinsäurepolymere als doppelsträngige Polymere erfindungsgemäss erfasst sind, wird anstelle von «BP» hier der Ausdruck «Restanzahl» verwendet. Beispielsweise bedeutet «Restanzahl 10», dass das Nucleinsäurepolymer 10 Basen in einem Strang aufweist.

Nucleinsäurederivate nach der Erfindung enthalten Substanzen mit einer Vielzahl von Molekülgrössen, und es ist allgemein zu bevorzugen, dass die Restanzahl nicht weniger als 50 beträgt. d.h., dass die Restanzahl 50 bis 10 000 beträgt. Die Grösse kann sogar noch grösser sein, d.h. 200 000 sind auch noch zu tolerieren, und es hat sich gezeigt, dass die Molekülgrösse einen geringen Einfluss auf die physiologische Wirksamkeit gemäss der Erfindung hat.

Um die Anzahl der Schwefelatome in den Nucleinsäurederivaten nach der Erfindung angeben zu können, wird in der vorliegenden Beschreibung der Ausdruck «Sulfurisierung (n)» verwendet. Die Cytidylsäure wird durch Substitution der -Nth-Gruppe in dem Pyrimidinring durch die -SH-Gruppe in 4-Thiouridylsäure umgewandelt, und «n» ist die Anzahl an Cytidylsäuren auf eine 4-Thiouridylsäure. Die Nucleinsäurederivate nach der Erfindung enthalten Substanzen mit einer Vielzahl von «n», und es ist zu bevorzugen, dass n = 6 oder mehr ist. Wenn n kleiner ist, hat man festgestellt, dass die physiologische Wirksamkeit abnimmt. Wenn n = 6 oder mehr beträgt, besteht keine sonderliche Einschränkung, und n kann sogar 39 betragen. Es besteht nur ein kleiner Einfluss von n auf die physiologische Wirksamkeit gemäss der Erfindung.

Zur Herstellung der Nucleinsäurederivate nach der Erfindung können zahlreiche Methoden angewendet werden. Das Poly-C und dergleichen Stoffe, die Ausgangsmaterialien für die erfin-dungsgemässen Derivate sind, sind leicht verfügbar. Das Poly-C kann durch beispielsweise Umsetzung mit Sulfurisierungsmitteln, wie Schwefelwasserstoff, leicht sulfurisiert werden. Als Folge dieser Umsetzung kann eine bestimmte Anzahl von Cytidylsäurere-sten in dem Poly-C in 4-Thiouridylsäure umgewandelt werden. Wenn die Reaktionsbedingungen, wie Reaktionstemperatur und Reaktionszeit, verändert werden, kann Poly-C mit den gewünschten n-Werten hergestellt werden.

Das sulfurierte Poly-C kann mit Poly-I vereinigt werden, das durch bekannte Methoden leicht verfügbar ist. Das als solches erhaltene Poly-C-Poly 1 wird durch eine Disulfidbildungsreak-tion, wie beispielsweise Oxidation mit einem Jodreagens, in Nucleinsäurederivate nach der Erfindung übergeführt werden.

Die Nucleinsäurederivate nach der Erfindung können auf die vorstehend erläuterten Methoden nahezu quantitativ erhalten werden, und es hat sich gezeigt, dass die Gesamtausbeute etwa 90 Prozent beträgt.

Im FaEe der Synthese von anderen Nucleinsäuren, wie Poly-A-Poly-U mit Disulfidbrücke, wird das Polymere zunächst durch eine Enzymreaktion unter Verwendung einer Nucleinbase bereitet, die ein Schwefelatom enthält. Herkömmliche Methoden bei der Herstellung von Heteropolymeren können angewendet werden.

Beispielsweise wird, wenn 36 mmol Uridin-5'-diphosphat (UDP) und 7 mmol 4-Thiouridin-5'-diphosphat (4-SDH UDP) bei 37 °C 5 Stunden lang in 150 mmol Tris-Puffer (pH 8,2) unter Verwendung von 0,5 Einheiten/ml Polynucleotidphosphoiylase (PNPase, Typ 15, PL Biochemical) umgesetzt werden, ein Hetero-polymer erhalten, bei dem ein 4-Thiouridin auf 13 Uridinreste enthalten ist, in einer Ausbeute von etwa 50 Prozent. Wenn 2-Thiouridin-5'-diphosphat anstelle von 4-Thiouridindiphosphat verwendet wird, wird ein 2-Thiouridin enthaltendes Poly-U erhalten.

Wenn ein -SH-Gruppen enthaltendes Nucleinsäurepolymer einmal hergestellt ist, können die nachfolgenden Derivate auf dieselbe Weise erhalten werden, wie es bei sulfuriertem Poly-I-Poly-C der Fall ist, wie in den Beispielen beschrieben. Insbesondere werden sowohl die sulfurierte Polyuridylsäure und die äqui-molare Menge Polyadenylsäure in neutraler wässriger Lösung gelöst und zur Komplexbildung erhitzt. Dann wird nach dem Lösen in Wasser in einem Inkubator die Temperatur allmählich auf 85 °C gesteigert, wonach 10 Minuten lang erhitzt und schliesslich bei Raumtemperatur stehengelassen wird.

Der so erhaltene Komplex wird unter denselben Bedingungen wie bei der Disulfidreaktion von Poly-I-Poly-C oxidiert, d.h. es wird mit 1 n Jodlösung unter Bildung von Poly-A-Poly-U-Derivat mit einer Disulfidbrücke oxidiert. Die Ausbeute nach dem Erhitzen beträgt etwa 80 Prozent, und die Gesamtausbeute liegt bei etwa 40 Prozent.

Der Disulfidkomplex wird zu einer wässrigen Lösung gründlich dialysiert und lyophilisiert, wobei ein weisser und faseriger Feststoff erhalten wird.

Es ist nicht immer klar, welche sterische Struktur die Nucleinsäurederivate nach der Erfindung durch ihre charakteristische S-S-Bindung haben.

Die Nucleinsäurederivate nach der Erfindung ergeben eine bestimmte klare Schmelzkurve, wie nachstehend noch erläutert wird, und daraus wird deutlich, dass sie stabile Grundstrukturen aufweisen.

Die Halbwert-Schmelztemperatur (Tm-Wert) beträgt bei Poly-I-Poly-C unter neutralen Bedingungen in Gegenwart von 0,1 M Natriumionen 59,0 °C, während die Werte im Falle von SH-sub-stituiertem Nucleinsäurederivat, das 4-Ihiouridin in einer Menge von n = 20 enthält, und von dessen S-S-substituiertem Nucleinsäurederivat 59,5 ° C und 59,3 ° C betragen, und folglich sind sie gleich oder noch mehr stabilisiert. Im Falle von OH-substituier-tem Nucleinsäurederivat, das Uridin in einer Menge von n = 20 enthält, wie vorstehend, ist der Wert mit 53,1 °C niedrig.

Somit hat die Einführung von Schwefelatomen eine effektivere Stabilisierungswirkung der hochmolekularen Struktur der Nucleinsäure verglichen mit anderen substituierten Derivaten, wie den mit NH2 oder mit OH substituierten.

Dann wurde die Beständigkeit gegen Hydrolyse durch RNAase A (ein En2ym, das RNA zersetzt) anhand des Zeitverhältnisses, bei dem die Zersetzung 50 Prozent erreicht, verglichen. So lag dieser Wert unter bestimmten enzymatischen Reaktionsbedingungen für Poly-I-Poly-C bei 50 Minuten, während der von 4-Thiouridin (SH-Gruppen) und seinem Nucleinsäurederivat (n = 20; enthaltend S-S) 60 Minuten betrug, während im Gegensatz dazu der von Nucleinsäurederivaten (n = 20), die Uridin-OH-Gruppen enthalten, mit 20 Minuten sehr kurz war. Daraus wird deutlich, dass die Schwefelatome einen Substitutionseffekt selbst bei biochemischer Stabilität aufweisen.

Wenn die Nucleinsäurederivate nach der Erfindung als Arzneimittel an Lebewesen einschliesslich den Menschen verabreicht werden, beträgt die Wirkstoffkonzentration 0,1 bis 99,5 Prozent (vorzugsweise 0,5 bis 90 Prozent) in einem pharmazeutisch verträglichen und nichttoxischen und inerten Trägerstoff.

Als Trägerstoffe können ein oder mehrere flüssige, feste oder halbflüssige Verdünnungsmittel, Füllstoffe und andere Hilfsmittel für pharmazeutische Zubereitungen verwendet werden. Es ist

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wünschenswert, dass die pharmazeutischen Präparate in Formen mit dosierbaren Einheiten gegeben werden. Nucleinsäurederivate nach der Erfindung können peroral, ins Gewebe, lokal oder rektal verabreicht werden. Sie können natürlich in Formen gegeben werden, die für den jeweiligen Verabreichungsweg geeignet sind. Beispielsweise werden sie als oral verabreichbare Form, Injektion, Inhalation, Augenlotion, Salbe, Suppositorien usw. gegeben. Besonders vorteilhaft ist die Verabreichung ins Gewebe oder lokal.

Es ist wünschenswert, dass die Dosis als Heilmittel gegen maligne Tumore unter Berücksichtigung des Status des Patienten (wie Alter, Körpergewicht usw.), Verabreichungsweg und Art und Ausmass der Erkrankung reguliert wird. Im allgemeinen werden 0,05 bis 1000 mg auf einmal als effektive Menge an Nucleinsäure nach der Erfindung an Erwachsene gegeben, und vorzugsweise sind 0,5 bis 50 mg einer intravenösen Infusion üblich. In einigen Fällen ist eine niedrigere Dosis ausreichend, während in einigen anderen Fallen höhere Dosen erforderlich sein können. Es ist auch möglich, dass die Dosis auf einmal gegeben oder auf mehrere Gaben pro Tag oder mit einer Unterbrechung von einem bis mehreren Tagen verteilt wird.

Die Dosen bei der Verwendung als Heilmittel gegen benigne Tumore oder bei Wuserkrankungen werden vorzugsweise unter Berücksichtigung von Art und Ausmass der Erkrankung, das Verabreichungsweges, des Status des Patienten usw. eingestellt, und im allgemeinen ist es üblich, dass die Dosis ebenso gross bis herab auf Vso der Dosis wie bei den vorstehenden malignen Tumoren beträgt.

Die physiologische Wirksamkeit der Nucleinsäurederivate nach der Erfindung wird nachstehend beschrieben.

(1) Interferon-induzierende Wirkung:

Unter Bezugnahme auf sulfuriertes Poly-C-Poly-I-Derivat, das eines der Nucleinsäurederivate nach der Erfindung ist, wurde seine Wirkung als Interferoninduktor durch eine Methode zur Untersuchung der Antiviruswirksamkeit bestimmt. Das sulfurierte Poly-C-Poly-I-Derivat, das S-S-substituiert ist, wurde als Probe I bei dem Test bezeichnet; sie hat einen n-Wert von 13 und eine Restanzahl in ihrer Molekülgrösse von 50 bis 2000.

Die Lymphozyten (106 Zellen pro ml), erhalten aus menschlichem peripherem Blut, wurden 2 Stunden lang mit der Probe (10 jj.g/ml) in einer Kulturflüssigkeit (RPMI1640; 20 Prozent FCS) behandelt. Die umgesetzte Kulturflüssigkeit wurde entfernt, die Zellen wurden in frischer Kulturflüssigkeit (RPMI 1640,20 Prozent FCS) flottiert, 20 Stunden inkubiert, und die überstehende Flüssigkeit wurde unter Verwendung von Sindbi-Viren und FL-Zellen (vgl. Rinsho Kensa, 28,1726,1984) einer üblichen Messmethode für Interferon-Antiviruswirksamkeit unterzogen. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt. Der Titer des Interferons wurde durch eine Verdünnungskonzentration unter Anwendung einer CPEIso-Methode (50prozentige Inhibition des cytopathogenen Effekts) gemessen. Probe I ist ein S-S-substituiertes Nucleinsäurederivat, das 4-Thiouridin in einer Menge von n = 20 enthält. Herkömmliches Poly-I-Poly-C wurde als Vergleichsprobe verwendet.

Konzentration (\xg/ml)

10

100

200

500

Testprobe I

100

>6400

Vergleichsprobe

100

800

1600

>6400

(Interferon-Titer: Einheiten/ml)

Es wird deutlich, dass das Nucleinsäurederivat nach der vorliegenden Erfindung eine höhere Wirkung als Interferoninduktur hat.

Unter den sulfurierten Poly-C-Poly-I-Derivaten der Nucleinsäurederivate nach der Erfindung, die gemäss dem nachfolgend angegebenen Beispiel erhalten werden, wurde eines mit dem n-Wert von 20 und der Molekülgrösse mit Restanzahl 50 bis 300 und ein weiteres mit dem n-Wert 20 und einer Molekülgrösse mit Restanzahl von 200 bis 2000 als Testproben genommen und denselben physiologischen Wirksamkeitstests unterzogen, wobei vergleichbare Ergebnisse erhalten wurden. Dieses Ergebnis wurde auch erhalten, als das Nucleinsäurederivat (n-Wert 20 und Molekülgrösse mit Restanzahl von nicht weniger als 20 000) vor der Umwandlung in niedrigermolekulare Substanzen untersucht wurde.

(2) TNF-Fähigkeit (Tumornekrosefaktor-Induzierung)

Keimbläschenmakrophagen von Kaninchen wurden 10 bis 14 Tage vor der Entnahme mit BCG vorbehandelt und auf 2 x 106 pro Milliliter in einem lOprozentigen FCS-versetzten RPMI-1640-Medium eingestellt. 1 ml davon wurde auf eine Kunststoffschale gegeben und in einem Kohlendioxidgasinkubator (5 Prozent CO2) in Gegenwart oder Abwesenheit der Probe bei 37 0 C kultiviert.

Die überstehende Flüssigkeit der Zellkultur wurde nach 2 oder 8 Stunden dem TNF-Aktivitätstest unterzogen. Das Ergebnis ist nachstehend angeführt. Die TNF-Aktivitätswerte wurden bestimmt durch Messung der Zellhemmungsaktivität auf LM-Zellen nach 72 Stunden unter Anwendung der Farbstoffaufnahmemethode, und die Verdünnung bei 50prozentiger Zellenhemmung wurde als Uter angegeben. Die Tatsache, dass die Zellhemmung auf TNF zurückzuführen ist, wurde unter Anwendung eines monoklonalen Antikörpers auf Kaninchen-TNF durch seine Akti-vitätsneutralisierung bestätigt.

TNF-Aktivität Neutralisierung durch (2 h) (8 h) Anti-TNF-Antikörper

Vergleich - - —

LPS 32 >64 +

Testprobe I 32 > 64 +

Vergleichsprobe 32 >64 +

LPS wurde in einer Konzentration von 1 |ig/ml verwendet, und die Test- und Vergleichsproben wurden bei denselben Konzentrationen von 10 ng/ml eingesetzt. Die Test- und Vergleichsproben waren dieselben wie bei (1). Es wird deutlich, dass die TNF induzierende Wirksamkeit der Nucleinsäurederivate nach der Erfindung hoch ist.

(3) TNF-induzierende Wirksamkeit in vivo Meth-A-Tumor (2 x 105) wurde unter die Bauchhaut von BALB/c-Mäusen (Alter 6 bis 8 Wochen, männlich) transplan-tiert. Die Arzneimittel wurden am 2. und 12. Tag nach der Transplantation gegeben. Blut wurde 1 Stunde nach der zweiten Gabe abgenommen, und die TNF-Aktivität des Serums wurde gemessen. Die Nekroseerscheinung an dem krebstragenden Teil, die danach auftrat, wurde ebenfalls beobachtet. Das Ergebnis ist nachstehend angegeben. Die Werte in der Tabelle waren derselbe Titer wie vorstehend unter (2) verwendet.

Behandlungen

TNF-Aktivität

Nekrose

(1.)

(2.)

im Serum

BCG

LPS

192

beobachtet

BCG

Testprobe!

48

beobachtet

BCG

Vergleichsprobe

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beobachtet

Testprobe I Testprobe I

12

beobachtet

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6

Sowohl die Test- als auch die Vergleichsproben waren dieselben, wie vorstehend unter (1) verwendet. Es ist offensichtlich,

dass die TNF-erzeugende Fähigkeit der Nucleinsäurederivate nach der Erfindung in vivo gross ist.

(4) Wirksamkeit zum Induzieren von Interleukin 1

Normales menschliches, heparinversetztes peripheres Blut wurde von einkernigen Zellen durch eine Wichtezentrifugations-methode unter Verwendung von Ficoll-Paque® getrennt, die Anzahlen wurden auf 5 x lOVml in einem lOprozentigen FCS-versetzten RPMI-Medium eingestellt, in eine Kunststoffschale gegeben, 1 Stunde lang bei 37 ° C inkubiert, und die kohäsiven Zellen wurden als Interleukin 1 erzeugende Quelle verwendet.

Das Arzneimittel wurde den 5 x lOVml von einzelnen Teilchen zugegeben, 24 Stunden lang bei 37 °C inkubiert, und die Interleukin-1-Aktivität in der überstehenden Flüssigkeit wurde durch Messen mittels der 3H-Thymidin-Aufnahme-Methode in PHA-stimulierten Mäuse-Thymuszellen unter Ausnutzung der Proliferationsfahigkeit der Ihymuszellen als Ziel bestimmt. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle angegeben. Als Vergleich wurde physiologische Kochsalzlösung verwendet. Die Konzentration des Interleukins betrug 1,25 Einheiten/ml, und die der Testproben I und II und der Vergleichsprobe waren 100 jig/ml. Die Testproben I und II und die verwendete Vergleichsprobe waren dieselben wie bei (1).

Verwendete Proben Aufgenommene Menge (DPM ( x 104))

Vergleich 3 370

Testprobe I 11 384

Vergleichsprobe 8 397

Interleukin 1 12 517

Es wird klar, dass die Nucleinsäurederivate nach der Erfindung eine grosse Interleukin 1 induzierende Wirkung hatten.

(5) Die Wirksamkeit zum Induzieren von Interleukin 2

Aus Milzzellen von BALB/c-Mäusen erhaltene Lymphteilchen wurden als Quelle für die Erzeugung von Interleukin 2 verwendet.

Zu 5 x 106/ml Lymphteilchen wurde das Arzneimittel zugesetzt, das Gemisch wurde 24 bis 48 Stunden lang bei 37 0 C inkubiert, und die Interleukin-2-Aktivität in der überstehenden Flüssigkeit wurde bestimmt durch die 3H-Thymidin-Aufnahmeme-thode unter Verwendung von CILL-2 oder NK-7, die in Abhängigkeit von Interleukin 2 zellstammwuchernd wirken, unter Verwendung der Proliferationsfahigkeit als Ziel. Das Ergebnis ist in der folgenden Tabelle angegeben. Als Vergleich wurde physiologische Kochsalzlösung verwendet. Das Interleukin 2 lag in einer Konzentration von 5 Einheiten/ml vor, und beide Testproben I und II und die Vergleichsprobe hatten dieselbe Konzentration von 100 p,g/ml. Die verwendeten Test- und Vergleichsproben waren dieselben wie bei (1).

Proben Aufgenommene Menge (DPM (x 103))

Vergleich 230

Testprobe I 3247

Vergleichsprobe 653

Interleukin 2 3778

Es wird deutlich, dass die Nucleinsäurederivate nach der Erfindung eine starke Interleukin 2 induzierende Aktivität aufweisen.

(6) Makrophagenaktivierang

An BALB/c-Mäuse (Alter 7 bis 10 Wochen, männlich) wurden intraperitoneal die Proben gegeben, 3 bis 5 Tage nach der Verabreichung aus dem Peritoneum abgesonderte Zellen wurden gesammelt, die kunststoffkohäsiven Zellen (hauptsächlich Makrophagen (Fresszellen) wurden als Effektorzellen abgetrennt, und die Fresszellenaktivierung wurde durch 3H-Thymidinisolierangs-methode unter Verwendung von Meth-A-Tumorzellen als Ziel (bei einem E/T-Verhältnis von 15-20:1) untersucht. Das Ergebnis ist in der nachfolgenden Tabelle angegeben. Als Vergleich wurden 0,2 ml physiologische Kochsalzlösung verwendet. Je 50 (ig/Maus der Testproben I und II und der Vergleichsprobe wurde verabreicht. Die verwendeten Test- und Vergleichsproben waren dieselben wie bei (1).

Die prozentuale Cytotoxizität wurde berechnet durch:

(Experimenteller Wert) - (Hintergrund) inn (100% 3H-Freigabe) - (Hintergrund) X

Proben

% (Zytotoxizität

Vergleich

0,5

Testprobe I

10,3

Vergleichsprobe

5,7

Es wird deutlich, dass die Nucleinsäurederivate nach der Erfindung eine starke Makrophagenaktivierang aufweisen.

NK-Zellenaktivierung

Die Aktivierung von NK-Zellen im menschlichen peripheren Blut wurde durch Messung der Hemmungsaktivität unter Verwendung von K562 als Zielzellen durch die Isolationsmethode von 51Cr bestimmt. Das Ergebnis ist nachstehend angegeben. Als Vergleich wurde physiologische Kochsalzlösung verwendet. Die Test-und Vergleichsproben waren dieselben wie bei (1).

Proben (ßg/ml) Schmelze % (% 51Cr-Isolierung)

Vergleich 30

Testprobe I (10) 47

(30) 55

(100) 57

(300) 50

(500) 30

Vergleichsprobe (10) 52

(30) 60

(100) 65

(300) 62

(500) 52

Es wird deutlich, dass die Nucleinsäurederivate nach der Erfindung die NK-Zellen aktivieren.

(8) Inhibitorische Wirkung auf die Proliferation von Tumorzellen

Die inhibitorische Wirkung auf die Proliferation von Zellenlinien-Tumorzellen wurde gemessen. Zellen (3 x lOVml) wurden 48 Stunden lang in einer 10 Prozent enthaltenden Kulturflüssigkeit zusammen mit Proben (10 (ig/ml und 100 jig/ml) behandelt und dann 48 Stunden lang mit tritiummarkiertem Thymidin inkubiert. Die Inhibition in Prozent wurde gegeben durch die aufgenommene Thymidinmenge gegenüber einem Vergleich, der nicht mit der Probe behandelt war. Das Ergebnis ist nachstehend angegeben. Die Test- und Vergleichsproben waren dieselben wie bei

(1).

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Prozentuale Inhibition

Zellen

Testprobe I

Vergleichsproben

100

10

100

10 (Hg/ml)

NAMALWA

65,6

55,7

56,9

37,4

RAJ1

68,3

64,6

74,7

69,4

L929

36,9

35,7

32,7

20,5

RAMOS

40,8

42,2

40,1

52,4

Es wird deutlich, dass die Nucleinsäurederivate nach der Erfindung eine inhibitorische Wirkung auf die Proliferation von Tumorzellen besitzen.

(9) Inhibitorische Wirkung auf die Proliferation von Tumor bei krebstragenden Mäusen

Die inhibitorische Wirkung auf die Tumorproliferation wurde auf die nachfolgende Methode bei mit Meth-A-Krebs befallenen Mäusen, welcher der transplantierte selbe Typ von Krebs ist, untersucht. Meth-A-Zellen (3 x 105/0,1 ml) wurden in physiologischer Kochsalzlösung suspendiert, hypodermisch in BALB/ c-Mäuse (Alter 5 Wochen, männlich) injiziert, und nach 2 Tagen wurde mit der Verabreichung des Arzneimittels dreimal wöchentlich während eines Zeitraums von zwei Wochen begonnen. Am zweiten Tag nach der letzten Gabe wurden die Tumorzellen extrahiert und ihr Gewicht gemessen. Das Ergebnis ist nachstehend angeführt. Die Test- und die Vergleichsproben waren dieselben wie bei (1).

Proben

Anzahl

Mittelwert ±

Inhibition

([ig/Maus)

der Mäuse Standardfehler

(%)

Testprobe I

(10)

7

2,09 ± 0,15

3

(30)

7

1,52 ± 0,28

30

(100)

5

0,96 ± 0,43

56

Vergleichsprobe

(10)

7

2,12 ± 0,27

2 '

(30)

8

1,38 ± 0,38

36

(100)

8

1,08 ± 0,27

50

Es wird deutlich, dass.die Nucleinsäurederivate nach der Erfindung die Proliferation von Tumorzellen bei krebsbefallenen Mäusen hemmen.

(10) Die Proliferation hemmende Wirkung bei nackten, mit Krebs von menschlichen Tumorzellen befallenen Mäusen.

Jeweils 2,5 x 106 Zellen des Stamms HeLa S3, herstammend von menschlichem Gebärmutterhals, und des Stammes Hep-2, herstammend von Kehlkopfkrebszellen, wurden unter die Bauchhaut transplantiert, und am 7. bis 10. Tag nach der Transplantation wurde die lebende Kohäsion des Tumors bestätigt. Dann wurden 100 (ig/Maus der Testprobe (intravenös) und 25 mg/kg von 5-FU (intraperitoneal) zweimal wöchentlich während vier Wochen verabreicht. Der Tumor wurde in der vierten Woche nach der Gabe extrahiert, und das Gewicht wurde gemessen. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle angegeben. Die verwendete Testprobe war dieselbe wie bei (1).

(HeLaSs)

Probe

Gewicht (g) ±

Inhibitionsverhältnis (%)

Standardfehler

Vergleich

3,85 ± 0,23

Testprobe I

1,57 ± 0,19

59

5-FU

2,06 ± 0,35

47

671 960

(Hep-2)

Probe

Gewicht (g) ±

Inhibitionsverhältnis (%)

Standardfehler

Vergleich

0,88 ± 0,07

Testprobe I

0,38 ± 0,07

57

5-FU

0,56 ± 0,12

36

Es wird deutlich, dass die Nucleinsäurederivate nach der Erfindung eine starke Hemmungswirkung auf die Proliferation besitzen.

(11) Inhibitorische Wirkung gegen Metatasten von Tumorzellen in der Lunge

In C57BL/6-Mäusen (männlich, Alter 5 Wochen) wurden 2 x 105 B16F10-Zellen intravenös transplantiert, die transplantier-bare Melanoma desselben Typs sind, und die Anzahl der Knoten, die sich in der Lunge bildeten (Anzahl der Kolonien) nach der zweiten Wochen nach der Transplantation wurde ausgezählt. Die Probe wurde intravenös 24 Stunden vor der Transplantation von B16F10-Melanoma gegeben. Die Anzahl betrug 9. Das Ergebnis ist nachfolgend angegeben. Die verwendeten Test- und die Vergleichsproben waren dieselben wie bei (1).

Probe (jig/Maus) Anzahl der in die Lunge gewanderten

Knoten ± Standardfehler

Vergleich

112

±

17

Testprobe I

(1)

33

±

6*

(10)

21

±

10*

(100)

4

±

2*

Vergleichsprobe

(1)

36

±

16*

(10)

3

±

0,7*

(100)

7

±

3*

Es wird deutlich, dass die Nucleinsäurederivate nach der Erfindung eine inhibitorische Wirkung gegen Metastasenbildung von Tumorzellen in der Lunge besitzen.

Sicherheit der Nucleinsäurederivate nach der Erfindung

Die Sicherheit der Nucleinsäurederivate nach der Erfindung wird nachfolgend erläutert. Sulfuriertes Poly-C-Poly-I-Derivat, das eines der Nucleinsäurederivate nach der Erfindung ist, wurde genommen, und sein cytotoxischer Effekt auf Knochenmarkhauptzellen wurde geprüft. Das verwendete sulfurierte Poly-C-Poly-I-Derivat hatte einen n-Wert von 20 und eine Molekülgrösse mit einer Restanzahl von 150-2000.

Die Probe wurde intravenös in Mäuse (Alter 8 Wochen, männlich; jede Gruppe bestand aus 5 Mäusen) in einer Dosis von 100 ng/Maus injiziert, und nach 24 Stunden wurden Knochenmarkzellen von den Tieren entnommen. Die Zellen wurden fixiert und mit Giemsa eingefärbt. Die Zellen der Abstrichprobe wurden unter dem Mikroskop beobachtet, und das Ausmass des Auftretens von Retikulozyten wurde in Prozenten ausgezählt. Bekannte Poly-I-Poly-C wurde als Vergleich verwendet. Physiologische Kochsalzlösung wurde als Vergleich gegeben. Das Ergebnis ist in der nachstehenden Tabelle angegeben.

Eiythrozytenzellen (%)

Vergleich

40

Testprobe I

38

Vergleichsprobe

11

7

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

671 960

8

Es wird deutlich, dass die Nucleinsäurederivate nach der Erfindung eine hochgradige Sicherheit besitzen.

Nachstehend wird der pyrogene Effekt der Nucleinsäurederivate nach der Erfindung erläutert.

Es ist bekannt, dass die Injektion von Poly-I-Poly-C in vivo pyrogen wirkt. Bei Pyrogentests mit Kaninchen zeigte sich, dass Poly-I-Poly-C einen Anstieg der Körpertemperatur im Durchschnitt von 1,45 °C ergibt. Im Gegensatz dazu zeigen die Nucleinsäurederivate nach der Erfindung (sowohl die SH- als auch die S-S-Substanzen bei dem vorstehenden cytotoxischen Experiment) nur einen durchschnittlichen Anstieg der Körpertemperatur von 0,25 °C, so dass der Pyrogentest negativ verlief. Bei diesen Experimenten wurden drei Kaninchen pro Gruppe verwendet, und eine Lösung der Probe (0,2 (Xg/kg) in 10 ml physiologischer Kochsalzlösung wurde intravenös unterhalb der Ohren der Kaninchen injiziert, und die Körpertemperatur 4 Stunden nach der Injektion wurde gemessen.

Es zeigt sich, dass die Nucleinsäurederivate nach der Erfindung einen sehr hohen Sicherheitsgrad aufweisen.

Die Ergebnisse der akuten Toxizitätstests der Nucleinsäurederivate nach der Erfindung sind nachfolgend angegeben. Bei normalen ddY-Mäusen ist die Dosis der Nucleinsäurederivate nach der Erfindung durch die obere Grenze der Löslichkeit des Arzneimittels begrenzt, und die LDso-Werte betrugen nicht weniger als 394 mg/kg. Der Effekt wurde durch die Tatsache beurteilt, ob die Maus eine Woche nach der intravenösen Injektion tot oder lebendig war. Derselbe Test unter Anwendung anderer Mäusestämme (C57BL6 und BALB/c) führte ebenfalls zu dem Ergebnis, dass das Nucleinsäurederivat (dasselbe wie vorstehend) nach der Erfindung eine geringere Toxizität hat als Poly-I-Poly-C.

Es wird deutlich, dass die Sicherheit der Nucleinsäurederivate nach der Erfindung sehr hoch ist.

LD50

Stamm Verabreichungsweg Testprobe I Vergleichsprobe ddY intravenös >394 mg/kg 132 mg/kg

Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen näher erläutert, die Herstellungsverfahren für Nucleinsäurederivate nach der Erfindung betreffen.

Beispiele

(1) Synthese von sulfurierter SH-Polycytidylsäure (Ausgangs-

stofl)

0,5 g Poly-C wurden in einem gemischten Lösungsmittel aus 4 ml Wasser und 2 ml Pyridin gelöst, die Lösung wurde zusammen mit 5 ml flüssigem Schwefelwasserstoff in ein 30-ml-Reakti-onsrohr aus rostfreiem Stahl eingebracht, und es wurde 6 Stunden lang bei 37 °C umgesetzt. Der Druck betrug in dem abgedichteten Rohr während der Reaktion 20 bis 22 bar.

Nach der Umsetzung wurde das Reaktionsrohr auf 0 0 C oder darunter abgekühlt, um den Druck ausreichend abzusenken, und das Reaktionsrohr wurde geöffnet. Ein Überschuss an nichtumge-setztem Schwefelwasserstoff wurde entfernt, und die sulfurierte Poly-C-Lösung wurde in einem 50-ml-Rundkolben übergeführt, und weiterer nichtumgesetzter Schwefelwasserstoff wurde im Vakuum entfernt. Die erhaltene Lösung wurde dreimal gegen Tris-Puffer (pH 7,5) dialysiert, der 10150 M Natriumchlorid enthielt, und die erhaltene durchsichtige Flüssigkeit wurde weiterhin lyophilisiert, wobei 0,47 g einer weissen, fasrigen Substanz erhalten wurden, welche ein Schwefelatom auf 13 Cytidylsäure-Einhei-ten im Poly-C enthielt.

Die Ultraviolettabsorptionsspektren der erhaltenen Substanz wurde in einer neutralen wässrigen Lösung gemessen, wobei die in Fig. 1 aufgetragenen Ergebnisse erhalten wurden. Es ist bekannt, dass die maximale Absorptions-Wellenlänge der Cytidylsäure 271 nm beträgt und dass die Absorptionswellenlänge von 4-Ihiouridylsäure, bei welcher die -NKb-Gruppe in 4-Stel-lung des Pyrimidinringes der Cytidylsäure durch die -SH-Gruppe substituiert ist, bie 330 nm gezeigt ist.

5 Aus dem Verhältnis der Höhen der Spitzen in Fig. 1 wurde sichergestellt, dass eine 4-Thiouridylsäure auf 13 Cytidylsäuren vorliegt.

Auf dieselbe Weise wurden Reaktionstemperaturen und Reaktionszeiten in dem rostfreien Rohr variiert, und sulfurierte Polycy-10 tidylsäuren mit Sulfurierungsgraden, wie sie in der nachfolgenden Tabelle angegeben sind, wurden erhalten. Hier ist der Sulfurie-rungsgrad durch «n» angegeben, und dieses «n» bedeutet die Anzahl der Cytidylsäuren auf eine 4-Thiouridylsäure.

Reaktionstemperatur (°C)

Reaktionszeit n

45

12

1

45

6

6 ± 1

37

6

13 ± 2

37

4

26 ± 2

37

2,5

39 ± 2

25 (2) Herstellung der doppelsträngigen Nucleinsäurederivate: (erfmdungsgemässes Produkt)

Poly-I und sulfuriertes Poly-C, wie vorstehend unter (1) erhalten, wurden bei gleichen Molverhältnissen in einem Tris-Puffer, der 50 M Natriumchlorid enthielt, bis zu einer Konzentration von 30 10 bis 20 mg/ml gelöst, und in einem Wasserbad wurde die Temperatur allmählich von Raumtemperatur auf 68 °C gesteigert. Das Gemisch wurde etwa 10 Minuten lang auf 68 0 C gehalten, dann stehengelassen, bis Raumtemperatur erreicht war, und bei 4 °C gelagert.

35 Die erhaltene Lösung wurde lyophilisiert, wobei 1,2 g Nucleinsäurederivat mit SH-Gruppen als weisser Feststoff erhalten wurde.

Dann wurde dazu etwa die lOfache Volumenmenge (im Mol-verhältnis) einer 1 n Jodlösung (Gemisch von V3 Mol Jod und Vi 40 Mol Natriumjodid) zugegeben. Das Gemisch wurde gründlich durchmischt, um es einheitlich zu machen, und 1 Stunde lang bei 0 °C stehengelassen. Die Reaktionslösung wurde gründlich gegen Wasser dialysiert, bis die gelbe Farbe des Jods verschwunden war.

Die so erhaltene Lösung wurde lyophilisiert, wobei 0,98 g 45 eines weissen Feststoffes erhalten wurden, das Disulfidderivat der unter (1) enthaltenen Verbindung.

Die Tatsache, dass der erhaltene Feststoff S-S-Bindungen enthält, wurde wie folgt sichergestellt: 0,1 g dieses Feststoffes wurden in 10 ml Tris-Puffer (pH 7,5), der 0,03 M Natriumsulfit ent-50 hielt, gelöst, bei Raumtemperatur 0 bis 7,5 Stunden lang gelagert, und die Ultraviolettabsorptionsspektren wurden zu jedem Zeitpunkt gemessen. Das Ergebnis ist in Fig. 2 aufgetragen. Es ist bekannt, dass die S-S-Bindungen im allgemeinen reversibel sind und dass eine S-S-Bindung durch Reduktion zu einer S-H-55 Gruppe aufgespalten wird. Mit der Zeit nahm eine Schulterspitze bei 310 nm, die auf die S-S-Bindung zurückzuführen ist, ab, während eine Absorption bei 330 nm zunahm, die auf -SH-Substanz (4-Thiouridin) zurückzuführen ist, und nach 7,5 Stunden war der Grad der Absorption bei 330 nm identisch mit dem von sulfurier-60 tem Poly-C vor der Oxidation. Daraus wird deutlich, dass die S-S-Bindung quantitativ zu der -SH-Gruppe reduziert worden war.

(3) Vernetzungsstruktur und biologische Aktivität 65 Unter den Nucleinsäurederivaten, in welche Schwefelatome eingeführt worden sind, werden Syntheseverfahren und physiologische Aktivitäten der Testprobe I (vom durchwegs zu -SH-Gruppen reduzierten Typ) und die Testprobe III (mit durchwegs oxi-

9

671 960

dierten S-S-Gruppen) nachfolgend beschrieben. Die Vernetzungssubstanzen der hier beschriebenen Nucleinsäurederivate sind Verbindungen, bei welchen ein Teil der in dasselbe Molekül eingeführten Schwefelatome eine Disulfidbindung zwischen den Molekülen oder innerhalb derselben besitzt.

Beispielsweise können die Vernetzungsderivate, die 80 Prozent SH-Gruppen und 30 Prozent S-S-Gruppen in demselben Molekül aufweisen, eine vielsträngige Vernetzungsstruktur in 20 Prozent des gesamten Anteils bilden. Mit anderen Worten hat es beispielsweise im Falle von Poly-C mit 1000 BP eine Vernetzungsstruktur bei 10 Teilen. Jedes Nucleinsäurederivat mit verschiedenen Vernetzungszahlen kann leicht durch teilweise Oxidation der SH-Substanz unter milden Bedingungen oder durch eine teilweise Reduktion der S-S-Substanz unter milden Bedingungen hergestellt werden. Die Synthesebedingungen sind dieselben wie in den Beispielen erläutert.

Das Verhältnis der Anzahlen der SH-Gruppen und der Anzahlen der S-S-Gruppen, d.h. das Ausmass der Vernetzung, kann berechnet werden als Verhältnis der Werte, die durch Dividieren der Ultraviolettextinktionen bei 310 nm der S-S-Gruppe und 330 nm der SH-Gruppe bzw. durch die molekularen Absorptionskoeffizienten erhalten werden.

Eine Alternative verläuft wie folgt: das Nucleinsäurederivat wird mit RNA-ase (d.h. Ribonuclease Pi) zersetzt, das Zersetzungsprodukt wird der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) des Umkehrphasensystems unterzogen, und 4-Ihiouridin (oder 4-Thiouridylsäure) und eine durch eine Disulfidbindung daraus gebildete Bis-Substanz werden abgetrennt und ihre Mengen gemessen.

Was die physiologischen Aktivitäten angeht, so wurde gefunden, dass Nucleinsäurederivate mit beliebigen Vernetzungsgraden von 1 (durchwegs S-S-Substanz; z.B. Testprobe II) zu O (durchwegs SH-Substanz; z.B. Testprobe I) eine ähnliche Aktivität und Sicherheit aufweist, wie die vorstehend erläuterten Testproben I und II. Diese Tatsache legt nahe, dass, selbst wenn die Nucleinsäurederivate teilweise oxidierbar oder reduzierbar sein können, sie dieselbe stabile physiologische Aktivität aufweisen wie die ursprünglichen.

(4) Bildung von niedriger molekularen Substanzen

1 g des gemäss (2) erhaltenen -S-S-haltigen Nucleinsäurede-rivats wurde in 120 ml Wasser gelöst, und 30 ml 5 M Natriumchloridlösung und 150 ml Formaldehyd wurden zugesetzt. Das Gemisch wurde kräftig gerührt, um eine einheitliche Lösung zu erhalten. Die Redaktionslösung wurde 8 Stunden lang auf 80 °C erhitzt, gut gegen Wasser dialysiert und lyophilisiert, wobei 0,95 g eines weissen Feststoffes erhalten wurden.

Dann wurde das auf vorstehende Weise (z) erhaltene S-S-Bindungen enthaltende Nucleinsäurederivat auf die vorstehend erläuterte Weise zu niedriger molekularen Verbindungen umgewandelt, wobei vergleichbare Ergebnisse erhalten wurden.

Diese wurden durch Gelfiltration der Hochleistungsflüssig-keitschromatographie unterzogen, und das erhaltene Muster ist in Fîg. 3 dargestellt. Hierbei wurde als Säulenmaterial ein für die Gelfiltrationschromatographie oder die Grössentrennungschro-matographie gebräuchliches, im wesentlichen aus hydrophilem Kieselgel bestehendes Material sowie als Eluat 50 mmol Tris-HCl-Puffer (pH 7,5), enthaltend 0,5 mol Natriumchlorid, verwendet.

Jeder Pfeil in der Figur zeigt die Eluierposition jeder Stan-dardgrössenmarke (Einheit der Grössenmarke ist BP), und aus Fig. 3 ist ersichtlich, dass diese eine maximale Verteilung bei Restzahlen von etwa 500 hat und dass die Molekülgrössenverteilung zwischen 150 bis 1000 Restzahlen liegt. Dieses Ergebnis stimmt gut mit dem Wert überein, der durch Elektrophorese unter Verwendung von Polyaciylamidgel oder Agarosegel erhalten wird. Wie vorstehend erläutert, wird in der vorliegenden Beschreibung die Molekülgrösse durch den Ausdruck «Restzahlen» angegeben, und in Fig. 3 ist «Restzahl» in Übereinstimmung mit dem «BP» als Einheiten ausgedrückt.

Wenn Reaktionszeit und -temperato bei dieser Umwandlung in niedriger molekulare Verbindungen abgeändert werden, werden auf dieselbe Weise Verbindungen mit den folgenden Mole-külgrössen erhalten:

Reaktionstempe

Reaktionszeit

Maximale

.Verteilung ratur

(h)

Verteilung

(BP)

CQ

(BP)

_

0

2000

80

24

30

10-55

80

16

200

50-300

80

8

500

150-1000

60

8

1000

200-5000

Unter den nach dem vorstehenden Beispiel erhaltenen Nucleinsäurederivaten wurden die mit einer Molekulargrössen-verteilung von 200 bis 5000 Restzahlen genommen, und ihre Schmelzkurven wurden ermittelt.

Die Probe I oder II (0,70D/ml) in 10 M Tris-Puffer (pH 7,5), der 0,1 M Natriumchlorid enthielt, wurde bei einem Temperaturanstieg von 2 ° C/4 Minuten von 20 0 C auf 90 0 C erwärmt, und die Ultraviolettextinktionen bei jeder Temperatur wurden gemessen bei der Wellenlänge von 260 nm. Die Zunahme der Ultraviolettextinktion durch Hyperchrominanz ws wurde repräsentiert durch ein relatives Verhältnis, das den Zustand bei 20 °C als Basis angibt. Für diese Messung wurde ein Beckmann-DU-8B-Spektrophotometer verwendet. Das Ergebnis ist in Fig. 4 aufgetragen. Das Schmelzen der Nucleinsäurederivate verlief von 35 bis 55 ° C allmählich, und bei etwa 59 ° C wurde eine plötzliche Schmelzkurve erhalten. Bei oberhalb 70 °C erreichte die Kurve nahezu ein Plateau, und dies bedeutet das Verschwinden einer hochdimensionalen Struktur und eine Spiralstrukturbildung durch Wasserstofibindungen der Nucleinsäurederivate.

Die Halbwertschmelztemperaturen betrugen für die Proben I und II 59,5 bzw. 59,3 °C. Aus der Berechnung des Anstieg/Abnahme-Verhältnisses bei einer Ultraviolettextinktion von 260 nm zwischen 900 C und 250 C wurde sichergestellt, dass die Hyperchrominanz (Farbverdunkelungseffekt) für die Proben I und II 43,5 Prozent bzw. 42,4 Prozent beträgt. Dies zeigt an, dass die Nucleinsäurederivate unter physiologischen Bedingungen äusserst stabile Strukturen aufweisen.

(5) Kurze Erläuterung der beigefügten Zeichnungen

Fig. 1 zeigt die Ultraviolettabsorptionsspektren von als Ausgangsstoff verwendeter sulfurierter Polycytidylsäure, erhalten gemäss (1) des Beispiels. Die Ordinate und die Abszisse zeigen die Absorption bzw. die Wellenlänge (nm).

Fig. 2 zeigt die Ultraviolettabsorptionsspektren des erfin-dungsgemässen Nucleinsäurederivats, erhalten gemäss (2) des Beispiels. Dieses ist ein UV-Muster der Reduktion durch Natri-umthiosulfat. Die Ordinate und die Abszisse zeigen die Extinktion bzw. die Wellenlänge (nm).

Fig. 3 zeigt die Eluiermuster durch Hochleistungsflüssigkeits-chromatographie von Nucleinsäurederivat nach der Erfindung, erhalten gemäss (3) des Beispiels. Die Abszisse und die Ordinate zeigen die Eluierzeit (min) bzw. die eluierte Menge. Jeder Pfeil zeigt die Eluierposition der Grössenmarke an.

Fig. 4 zeigt die Schmelzkurve der Nucleinsäurederivate nach der Erfindung, in welcher die Molekülgrössenverteilung 50 bis 2000 Restzahlen beträgt. Die Abszisse und die Ordinate zeigen die Temperatur (°C) bzw. die relative Absorption an.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

G

2 Blatt Zeichnungen

Claims

671 960

2

PATENTANSPRÜCHE

1. Nucleinsäurederivate, wobei bei einem Nucleinsäurepoly-mer ein Teil des einen seiner Bestandteile bildenden Purin- oder Pyrimidinringes durch ein oder mehrere Schwefelatome substituiert ist, dadurch gekennzeichnet, dass das oder die substituierten Schwefelatome durch eine Disulfidbindung eine Brücke bilden.
2. Nucleinsäurederivat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Nucleinsäurepolymer ein doppelsträngiges Ribonucleotidpolymer ist.
3. Nucleinsäurederivat nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das doppelsträngige Ribonucleotidpolymer aus Poly-I und Poly-C zusammengesetzt ist, wobei ein Schwefelatom, das durch Substitution einer NEfe-Gruppe in dem Pyrimidinring der Cytidylsäure eingeführt wurde, auf 6 bis 39 in dem Poly-C vorhandener Cytidylsäure anwesend ist.
4. Nucleinsäurederivat nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Länge des Polymeren 50 bis 10 000 beträgt, berechnet auf die Anzahl der Basenpaare.