CH673774A5

CH673774A5 -

Info

Publication number: CH673774A5
Application number: CH3106/86A
Authority: CH
Inventors: David R Knighton
Original assignee: Curatech Inc
Priority date: 1984-11-29
Filing date: 1985-11-08
Publication date: 1990-04-12
Also published as: DE3586355T2; DK357386D0; EP0202298A1; WO1986003122A1; EP0383363A2; NL8520384A; DK165169B; DK165169C; AU5094985A; IL77096A; DK357386A; HUT42329A; IE852810L; GB2248777A; GB2248777B; AU596954B2; IE57894B1; SE8603228D0; EP0202298A4; EP0202298B1

Description

BESCHREIBUNG Mit Thrombin aktivierte Plättchen haben die Befähigung,

t,. ,. j „ r- , , . . .. j , Angiogenesis, erhöhte Kollagen-Synthese und Zellteilung sowie

Die vorhegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur , ^ , , , , ,

H . „ 0 . „...2. , . , .. . „ru* das Wachstum zu stimulieren. Es wurde gefunden, dass Proben

Herstellung von von Blut-Plattchen abgeleiteten Wachstums- , . , . .. 6 . ,

. . . . „ „f .. , . von ganzem Blut verwendet werden können, um em an Plattchen und Angiogenesis-Faktoren als Wundheilsubstanzen. Diese wer- ö ,... . , . , ,.

rten prhalfpn inHpm man 45 angereichertes Plasma zu bilden, welches, wenn durch Thrombm a) Blut-Plättchen aus Blut gewinnt und aktiviert angiogenetische sowie Wachstumsfaktoren enthält, die b) die genannten Blut-Plättchen auf solche Weise aktiviert, ™r Beschleunigung des Heilungsprozesses von Wunden verwen-

dass von Blut-Plättchen abgeleitete Wachstums-und Angiogene- e en onnen. .

. - ° , 00 Blut wird gewöhnlich stabilisiert und zentnfugiert, um ein an sis-faKtoren iiergesteiit Avercien. , * , o i « t>i . < .

cu t 11 u • ^ • u a- T7_f- . c ■ • u *i_ ™ Plattchen reiches Serum zu erhalten. Das Blut wird vorzugsweise

Ebenfalls bezieht sich die Erfindung auf eine topische, thera- 50 . .... . . . , ^ ^ . . .

.. , ~ . ü i. ji stabilisiert, indem man es mit Citrat-Phosphat-Dextrose m einem peutischeZusammensetzungzurBehandlungvonWunden,die Tr . T .. ^ i_

m u t v * T. , ' Verhältnis von l:5(20%ige Losung) vermischt. Das an Plattchen von Blut-Plattchen abgeleitete angiogenetische und Wachstums- . , ^ , ö , . , -, • ,

c i <. ■■ „ reiche Plasma (nachfolgend mit PRP bezeichnet) wirdvorzugs-

faktoren enthalt, welche nach dem erfindungsgemassenVerfah- . . , v ° „ ..

, , 00 weise wieder zentnfugiert, bis man eine hohe Konzentration der ren erges e wer en. Plättchen erhält. Die Plättchen werden dann in der Regel in

Angiogenesis, was die Prolifération und das direkte Wachs- 55 . t. « « , „ ..

i-li j i- u j v einen Plattchen-Puffer gegeben. Die Konzentration der Platt-

tum von kapillarem Endothehum bedeutet, zusammen mit , ^ , .

ü-u , • ,,, „ , T, chen sollte mindestens 1000 000 Plattchen pro Milliliter betra-

Fibroplasie und Kollagensynthese, sind wesentliche Komponen- ,r . ,. T, , .. r. , „ .. ,

* j t> i*- • iT7- \ Ar a t-,- at/- gen. Vorzugsweise sollte die Konzentration m der Grossenord-

ten der Reaktion eines Wirtes aufVerwundung. Die Aktivierung 6 imnnmnmui-.. l

, ... „ . , , , ^ & nung von 1000000000 Plattchen pro Milliliter sein,

von Plattchen und die Gennnungskaskade gehören zu den ersten ° r

Reaktionen auf eine Verletzung. eo Man gibt insbesondere Thrombin zu den PRP, um die Plätt-

Plättchen, die durch Thrombin aktiviert sind, lassen ein chen zu aktivieren. Vorzugsweise werden etwa 1 bis etwa 10

Mitogen oder Wachstumsfaktor für Fibroblaste und Zellen der Einheiten Thrombin pro Milliliter PRP verwendet. Die mit glatten Muskulatur frei, um eine erhöhte Kollagensynthese Thrombin aktivierten Plättchen befreien die von Plättchen abge-

durch die Zellen der glatten Muskulatur in vitro zu stimulieren. leiteten Wachstumsfaktoren (nachfolgend mit PDGF bezeich-

Das Mitogen (ein von Plättchen abgeleiteter Wachstumsfaktor, 65 net) und die von Plättchen abgeleiteten Angiogenesis-Faktoren nachfolgend mit PDGF bezeichnet) setzt sich aus zwei Polypepti- (nachfolgend mit PD AF bezeichnet). Man lässt die Plättchen und den zusammen. Ein Artikel, in welchem PDGF beschrieben ist, das Thrombin gewöhnlich bei Zimmertemperatur etwa 5 bis 10

wurde 1982von G.R. Grotendorst, T. Chang, H.EJ. Seppa, min lang inkubieren.

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Das aktivierte PRP, das PDGF und PD AF enthält, wird weniger bevorzugt. Der bevorzugt verwendete Plättchen-Puffer vorzugsweise zu einer biologisch verträglichen makromolekula- enthält 0,05 M Hepes (N-2-Hydroxyethylpiperazin-n-2-ethansul-ren Substanz gegeben, die als Träger agiert. Zuerst können die fonsäure), 0,03 M Glucose, 0,004 M KCl, 0,1 M NaCl und etwa Plättchen bei etwa 950 x g zentrifugiert und die plättchenfreie, 0,35% menschliches Serum-Albumin, eingestellt auf einen pH überstehende Flüssigkeit wird mit demTräger vermischt werden. 5 von etwa 6,5. Eine Probe wird für eine spätere Untersuchung der Man verwendet vorzugsweise ein mikrokristallines Kollagen, wie mitogenen Aktivität bei etwa -20 °C eingefroren. Eine andere Avitene®-Brand-collagen,wieesvonFMCCorp., AvicelDept., Probe wird auf Blut-Agar als Sterilitäts-Test gegeben.

Marcus Hook, PA 19 061 verkauft wird, als biologisch verträgli- Das an Plättchen reiche Plasma stellt die einzige in den chen Träger. Mikrokristalline Kollagene sind im Körper biolo- Verfahren und den Zusammensetzungen gemäss der Erfindung gisch verträglich. Genug Träger wird hinzugefügt, um all das am io verwendete Blut-Fraktion dar. Das PRP wird dann in der Regel Plättchen reiche Kollagen, welches aus dem Blut erhalten wurde, mit gereinigtem Thrombin in einem Verhältnis von etwa 1 bis aufzusaugen, so zum Beispiel würde eine 40 ml Blutprobe etwa 10 Einheiten Thrombin pro Milliliter PRP aktiviert. Vor-

typischerweise 25 ml Träger nach der Anreicherung benötigen. zugsweise werden etwa 1 Einheit Thrombin pro Milliliter des an Die so erhaltene Paste wird vorzugsweise auf Eis oder in dem Plättchen reichen Plasmas verwendet. Die Aktivität des Throm-Kühlschrank gelagert. 15 bins koaguliert das Fibrinogen und aktiviert die Plättchen und

Die pharmazeutischen Präparationen zur Verwendung als ein veranlasst sie, Alpha-Körnchen, die den von Plättchen abgeleite-Wundverband, verkauft von Pharmacia Fine Chemicals, Inc. aus ten Wachstumsfaktor und den von Plättchen abgeleiteten Angio-Piscataway, New Jersey, mit dem Handelsnamen «Debrisan», genesis-Faktor enthalten, freizumachen. Das bevorzugt verwen-sind geeignete Träger. dete Thrombin war eine Thrombinar®-Brand von Armour Phar-

Das aktivierte PRP innerhalb des Trägers kann dann für eine 20 maceutical Co. von Kankakee, Illinois. Die Plättchen und das Wunde angewendet werden. Der hoch angereicherte und akti- Thrombin lässt man gewöhnlich bei Zimmertemperatur etwa 5 vierte PDGF und PDAF helfen damit beim Proliferieren und bis 10 min lang inkubieren.

beim Anordnen des Wachstums des Kapillar-Endotheliums, Das PRP wird dann einer Entfernung der Plättchen und des verdoppeln die Geschwindigkeit der Kollagensynthese und sie Fibrins, vorzugsweise durch Zentrifugieren, unterworfen. Die produzieren Leukozyt-Chemotaxis. Die mitogene Aktivität hat ,25 entstandene überstehende Flüssigkeit enthält sowohl PDAF und eine zelluläre Teilung und Wachstum zur Folge, um das verlo- PDGF nach dem Zentrifugieren bei 950 x g, etwa 5 min lang bei rene Gewebe zu ersetzen. 4 °C. Die kleine Pille wird verworfen, da PDAF und PDGF in die

Die tägliche Anwendung des aktivierten PRP für Wunden überstehende Flüssigkeit extrahiert worden sind. PDGE wurde stimuliert und unterstützt die Heilungssequenz. Die Menge an isoliert und charakterisiert. Es ist ein Protein mit einem Moleku-PRP, die aus 40 ml Blut hergestellt wurde, ist in der Regel 30 largewicht von 30 000, welches in zwei Spezies mit einem Mole ausreichend, um Anwendungen für 7 Tage zu produzieren. Das kulargewicht von 15 000 und 14 000 aufbricht.

Material wird vorzugsweise über die gesamte Wunde mit verhält- Um das PDAF und PDGF in der an Plättchen freien überste-nismässig gleichförmiger Dicke gegeben, ungefähr zwei Millime- hendenFlüssigkeit,dieaufdieseWeiseerhaltenwurde,füreine ter dick. Granulation, Kontraktion und Epithelisierung können Wunde anzuwenden, ist es wünschenswert, eine Trägersubstanz durch die Verwendung von PRP initiiert werden, wo die eigenen 35 zu verwenden, die biologisch verträglich ist, und als ein temporä-Reparatursignale des Körpers unzureichend sind, um eine gute res «Depot» agiert. Eine makromolekulare Substanz, wie z. B. Heilung zu stimulieren. mikrokristallines Kollagen, liefert einen geeigneten Träger. Ein

Sooft hier Thrombin verwendet wird, so wird auf Thrombin besonders bevorzugter Träger ist Avitene®-Brandmikrokristam-als biologisches Freigabemittel für die Plättchen-Freigabe bezug nes Kollagen von FMC Corp., Avicel Dept., Marcus Hook, PA genommen. Im Stand der Technik sind andere biologische 40 19 06L Die entstandene Zusammensetzung ist dicker und wird Freigabemittel bekannt, einschliesslich Kollagen, ADP und dazuneigen.mPositionmKontaktmitderWundezuverbleiben.

Serotonin, die anstelle von Thrombin oder als Zusatz zu Throm- Debnsan®-Brand-Wund-Verband, welcher Sepharose®-Brand-bin verwendet werden können, um die Plättchen zu aktivieren, Kügelchen enthält, Handelsnamen von Pharmacia Fine Chemi-obgleich Thrombin bevorzugt ist. cals, Inc. von Piscataway, New Jersey, können als alternative

„ . . , — .-ni ; . ^ , 4s Träger verwendet werden. Vorzugsweise werden etwa 8 bis 10 ml

Bei ®m.®r bevorzugten Ausfuhrungsform wird Blut , das von der |berstehenden Flüssigkeit pro Gramm des Trägers verwen-demlndividium, welches mit den wundheilenden Faktoren um ^ Pagte zu gemäss der Erfindung behandelt werden soll, erhalten wurde, in siliconisierten Röhren, die Säure-Citrat-Dextrose (0,15 M Citrat, Die Anwendung der Wundbehandlungs-Zusammensetzung 2% Glucose, pH 4,2) (nachfolgend mit CPD bezeichnet) enthält, findet vorzugsweise durch physikalische Anwendung des Matestabilisiert und zentrifugiert, um daraus das plättchenreiche 50 rials auf oder in die Wunde, wie durch Anwendung einer mit dem Plasma abzutrennen. 40-60 Milliliter des Blutes, kombiniert mit Medikament vermischten Salbe statt. Die Behandlungen sollten 4 bis 6 ml CPD, werden dann vorzugsweise bei etwa 135 X g 20 auf täglicher Basis so lange wiederholt werden, wie die Wunde min lang bei etwa 4 °C zentrifugiert, um plättchenreiches Plasma offenbleibt. Eine bevorzugte Behandlung beruht auf der mor-zu erhalten. Das plättchenreiche Plasma wird entfernt und in eine gendlichen Anwendungeines ungefähr einen mm dicken Verandere sterile 50 ml Röhre gegeben. Eine Plättchen-Zählung 55 bandes des Plättchenfaktors/Trägerkomplexes auf die Wunde. wird dann durchgeführt. Das CPD kann verwendet werden, um Sie ist dann mit einem sterilen, trockenen Verband versehen. Am die Aktivierung der Gerinnungssequenz durch Kontakt des Abend kann der Verband entfernt werden und die Substanz wird

Blutes mit dem Plastik in der Spritze zu verhindern. Das CPD ist durch Waschen mit steriler salzhaltiger Lösung entfernt.

in der Spritze anwesend, während das Blut dem Patienten Obwohl die klinische Untersuchung, die sich auf die Wundbe-

entzogen wird. Das Blut wird kontinuierlich mit dem CPD 60 handlungs-Zusammensetzungen gemäss der Erfindung bezie-gemischt, um eine Koagulierung zu verbinden. Das plättchenrei- hen, sich auf Wunden ausserhalb des Körpers richteten, können che Plasma in der Röhre wird dann bei 750 x g 10 min lang bei die Zusammensetzungen ebensogut innerliche Wunden behan-40 °C zentrifugiert. dein. Nähte können mit den Wundbehandlungs-Zusammenset-

Das an Plättchen freie Plasma wird gewöhnlich entfernt und zungen imprägniert sein, um die innerliche Heilung zu beschleu-verworfen. Die Plättchen-Pille wird vorzugsweise in einer Menge 65 nigen. Die Wundbehandlungs-Zusammensetzungen können eines Plättchen-Puffers wieder suspendiert, um einen endgülti- ebenfalls in Verbindung mit bio-abbaubaren Verbänden verwen-gen Milliliter zu produzieren. Eine niedrigere Konzentration von det werden, wie ein Überzug über implantierbare Vorrichtungen etwa einer Million Plättchen pro Milliliter ist nützlich, aber und bio-abbaubare Vorrichtungen, welche bei chirurgischen

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Prozeduren verwendet werden. Ganz allgemein kann ein beliebig fremder Körper, der in einen Patienten eingefügt werden soll, mit der Zusammensetzung überzogen sein, um den Heilungspro-zess zu beschleunigen. Alternativ kann man die Zusammensetzung direkt auf beschädigtes Gewebe anwenden. 5

Anfängliche klinische Versuche wurden an acht Patienten durchgeführt, alle mit nicht-heilenden Wunden aus Perioden von einem bis fünf Jahren. Alle Patienten erhielten maximal standardisierte Pflege, um die Wunden zu heilen .Diese Therapie hatte gefehlt. In allen Fällen initiierte die Verabreichung von von io Plättchen abgeleiteten Faktoren eine heilende Reaktion, wie durch Granulations-Gewebe-Bildung bewiesen wurde (Granula-tions-GewebeenthältFibroblaste, endotheliale Zellen und Kollagen) . Die Wunden schlössen sich durch Kontraktion und Epithelisierung oder durch Haut-Transplantation. Bei allen 15 Anwendungen trat eine Stimulierung der Heilung und eine schlussendliche Wiederherstellung ein.

Während es bevorzugt ist, aktiviertes PRP für Wundbehandlungszwecke direkt aus dem eigenen Blut der verletzten Tiere herzustellen, kann man die Vorteile der Erfindung erlangen, 2o indem man Blut oder Plättchen von Tieren der gleichen Art,

wobei das Datum abgelaufen ist, verwendet. Die Verwendung von Blut von verletzten Individuen, die behandelt werden sollen, ist insbesondere bevorzugt, da damit die Aussetzung gegenüber schädlichen Einflüssen einer möglichen Hepatitis oder gegen- 25 über anderen Vergiftungen ausBlutvon einer Bank vermieden wird. Die Verwendung des eigenen Bluts eines Patienten würde ebenfalls alle nur möglichen allergischen Reaktionen eliminieren.

Eine verträgliche Quelle des Materials kann man von gewa- 30 schenen menschlichen Plättchen, deren Datum abgelaufen ist, erhalten. Die Substanzen können auch für Veterinär-Anwendungen verwendet werden, indem man Plättchen, die sich von dem Tier selbst oder einem anderen Tier innerhalb der gleichen Art ableiten, verwendet. 35

Beispiel I

Einem Patienten, der am linken Fuss eine offene Wunde hatte, welche die Folge einer Wundausscheidung von totem Gewebe und einer transmetatarsalen Amputation war, gab man 40 anfänglich PDGF und PDAF, das man, wie weiter oben beschrieben, aus seinem eigenen Blut erhielt. Nach dem Behandlungsprotokoll wurde die Wunde mit neuem Granulationsgewebe gefüllt. Eine anschliessende Wundausscheidung zeigte vollständig bedeckte metatarsale Knochen und eine Kontraktur der ziemlich grossen Wunde.

Beispiel II

Ein Patient musste sich einer Amputation seiner rechten grossen Zehe unterziehen und wurde drei Wochen lang mit einer Standard-Therapie behandelt, ohne dass sich innerhalb der Wunde Granulationsgewebe anhäufte. Dann begann man mit ihm die weiter oben beschriebene Plättchenfaktor-Therapie. , Nach drei Wochen der Behandlung zog sich die Wunde ungefähr 30 bis 40% zusammen und sie heilte schnell.

Beispiel III

Ein Patient, welcher zwei grosse Wunden auf dem medialen und lateralen Aspekt seines transmatatarsalen Amputationsstumpfes hatte, wurde vier Monate lang ohne Heilung unter Verwendung der üblichen Therapie behandelt. Innerhalb zwei Wochen der Behandlung mit PDAF und PDGF, wie weiter oben beschrieben, reinigte sich die Wunde von einer offensichtlichen Infektion und begann, Granulationsgewebe zu produzieren.

Achtunddreissig nicht-heilende Geschwüre von 28 diabetischen Patienten wurden mit der PRP-Paste behandelt. Die mittlere Dauer der Geschwüre vor der Behandlung betrug 654 Jahre. Eine Paste, hergestellt aus PRP bei einer Konzentration von etwa 109 Plättchen/ml wurde mit Avitene-Brand-Kollagen kombiniert. Die Patienten wendeten die PDGF und PDAF enthaltende Paste täglich für 12-Stunden-Perioden während einer mittleren Zeit von 8 Wochen an. Jeden Tag entfernte man totes Gewebe von den Wunden. Alle Wunden produzierten Granulationsgewebe und ein Mittelwert von 83 % schlössen sich, verglichen mit den ursprünglichen Wunden. 95% der Geschwüre wurden erfolgreich behandelt und es entstand entweder eine totale Wund-Epithelisierung oder eine erfolgreiche Haut-Transplantation. Nur zwei dieser nicht-heilenden Wunden heilten nicht. Die geheilten Geschwüre blieben verschlossen zurück mit keinem Anzeichen einer hypertrophischen Narbenbildung oder neoplastischen Bildung.

M

Claims

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PATENTANSPRÜCHE H.K. KleinmanundG.R. Martin in dem Journal ofCellular

1. Verfahren zur Herstellung von von Blut-Plättchen abgelei- Physiology mit dem Titel «Platelet-Derived Growth Factor is a teten Wachstums- und Angiogenesis-Faktoren als Wundheilsub- Chemoattractant for Vascular Smooth Muscle Cells», Band 113, stanzen, dadurch gekennzeichnet, dass man Seiten 261-266 veröffentlicht. Der Artikel wird hier durch Refe-

a) Blut-Plättchen aus Blut gewinnt und 5 renz einverleibt.

b) die genannten Blut-Plättchen auf solche Weise aktiviert, Eine nicht-mitogene Substanz, angiogenetischer Faktor dass von Blut-Plättchen abgeleitete Wachstums- und Angiogene- genannt, wird ebenfalls von durch Thrombin aktivierten Plätt-sis-Faktoren hergestellt werden. chen produziert und stimuliert das Kapillarenwachstum. Ver-
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass schiedene Angiogenesis-Faktoren sind bekannt, einschliesslich die Blut-Plättchen mit Thrombin aktiviert werden. io von Tumor-, Retinal und Wundflüssigkeits-angiogenetischen-
3. Verfahren nach Anspruch 1, umfassend: Faktoren. Es ist nicht bekannt, ob alle Angiogenesis-Faktoren

(a) Isolierung von Blut-Plättchen aus Blut von einem Tier, einen gemeinsamen Mechanismus der Funktion auf kapillare

(b) Aktivierung der genannten Plättchen, um Wachstums- endotheliale Zellen teilen.

und Angiogenesis-Faktoren, die von den Blut-Plättchen abgelei- Angiogenesis-Faktoren wurden isoliert und von M.S. Banda, tet sind, freizusetzen, und 15 D.R. Knighton, T.K. Hunt und Z. Werb in Proc. Nat'l. Acad.

(c) Isolierung der aus den Plättchen freigesetzten Faktoren. Sei. USA (7773-7777, Dezember 1982) in einem Artikel mit dem
4. Topische, therapeutische Zusammensetzung zur Behand- Titel «Isolation of a nonmitogenic angiogenesis factor from lung von Wunden, enthaltend von Blut-Plättchen abgeleitete wound fluid» beschrieben; diese Offenbarung wird hier durch angiogenetische und Wachstumsfaktoren, hergestellt nach dem Referenz einbezogen.

Verfahren nach Anspruch 1. 20 Angiogenesis- und von Plättchen abgeleitete Wachstums-
5. Zusammensetzung nach Anspruch 4, dadurch gekenn- Faktoren wurden von D.R. Knighton, T.K. Hunt, K.K. Thakral zeichnet, dass sie ausserdem einen pharmazeutisch annehmbaren und W.H. Goodson III, in «Role of Platelets and Fibrin in the Träger enthält. Healing Sequence,» Annais of Surgery 196:379-388 (1982)
6. Zusammensetzung nach Anspruch 4, enthaltend von Blut- beschrieben; diese Offenbarung wird durch Referenz umfasst. In Plättchen abgeleitete angiogenetische und Wachstumsfaktoren, 25 diesem Artikel wird die erfolgreiche B ehandlung einer nicht-hergestellt nach dem Verfahren nach Anspruch 3. heilenden Wunde bei einem Patienten beschrieben, dem man
7. Zusammensetzung nach Anspruch 4, dadurch gekenn- eine einzige Zehn-Einheiten-Plättchen-Transfusion gab. Die zeichnet, dass die Zusammensetzung im wesentlichen frei ist von Wunde heilte innerhalb von 3 Wochen.

(a) Blut- oder Plasma-Verunreinigungen und Eine kürzliche Studie hat gezeigt, dass, wenn der normale

(b) Spuren von Plättchen oder anderen Materialien, welche in 30 Heilungsprozess des Körpers arbeitet, so ist es nur bei etwa 50% menschlichen Plättchen, aber nicht aus diesen freigesetzt sind, Wirksamkeitsniveau.

gefunden werden. Ein menschlicher angiogenetischer Faktor wird aus menschli-
8. Zusammensetzung nach Anspruch 7, hergestellt nach dem chen Vorhaut-Fibroblasten gemäss dem US-Patent Nr. 4273 871, Verfahren von Anspruch 3. Tolbertetal., hergestellt. Eine öffentlich zugängliche Vorhaut-

35 Fibroblast-Zell-Linie wird verwendet, um einen angiogeneti-schen Faktor herzustellen.

Im US-Patent Nr. 4479 896, Antoniades, dessen Offenbarung durch Referenz hier eingeschlossen ist, werden von Plättchen abgeleitete Wachstumsfaktoren beschrieben und für die Studie 40 durch Gel-elektrophorese-Mittel extrahiert.