CH675727A5 - - Google Patents

Description

  
 



  Die vorliegende Erfindung betrifft Polyaminosäuren bzw. Polypeptide und biologisch aktive Fragmente davon. Die Verbindungen dienen der Modulierung des Zellwachstums, wie z.B. der Hemmung des Wachstums von Tumorzellen und der Stimulierung des Wachstums von normalen Fibroblasten und können Immunfunktionen modulieren. Die Aminosäure-Sequenzen der erfindungsgemässen Verbindungen sind ausgeprägt anders als Sequenzen anderer Verbindungen, welchen analoge Eigenschaften zugeschrieben wurden. 



  Leukocyten, sowohl Lymphocyten und Monocyten wurden in die Hemmung des Tumorwachstums von verschiedenen Tiertumor-Modellen einbezogen. Das zunehmende Vorkommen von bösartigen Tumoren bei immunschwachen Menschen, stützt das Argument, dass die weissen Blutkörperchen eine Rolle bei der Regulierung des neoplastischen Wachstums spielen. Protein-Faktoren, die durch diese weissen Zellen produziert werden, welche das Tumorwachstum hemmen oder Immunfunktionen modulieren und schon isoliert und charakterisiert worden sind, umfassen die  alpha - und  gamma -Interferone, den Tumor-Necrose-Faktor, das Lymphotoxin, das Interleukin-2 und andere Lymphokine.

  Da jeder der isolierten Faktoren ein anderes Aktivitätsspektrum aufweist und verschieden in Wechselwirkung mit anderen Faktoren reagieren kann, besteht ein fortgesetztes und starkes Interesse an der Isolierung und Charakterisierung sämtlicher Faktoren, welche durch weisse Blutkörperchen zur Modulierung des Zellwachstums oder der Immunfunktionen produziert werden. Diese Verbindungen finden individuell oder zusammen Verwendung bei der Behandlung oder Diagnose von Krebs, als Promotoren der Wundheilung oder  als Immuno-Modulator für die Behandlung von Patienten mit Immunschwäche, bei der Auto-Immunität, bei Organ-Transplantationen und dergleichen. 



  Es bestehen verschiedene Schwierigkeiten, welche bei der Entdeckung, der Isolierung, der Reinigung oder Charakterisierung von natürlich vorkommenden Faktoren in Betracht gezogen werden müssen. Die Methodik muss für die Trennung und Reinigung eines interessierenden Faktors von anderen Faktoren im rohen Ausgangsmaterial entwickelt werden, wobei die Aktivität des gewünschten Faktors nicht denaturiert werden darf; es müssen Bio-Assays entwickelt werden, welche die Identifizierung der Fraktionen während den Trennungsschritten, welche einen bestimmten Faktor konzentrieren, identifizieren; ein neuer Faktor muss von bekannten oder anderen, unbekannten Faktoren unterschieden werden können, welche vorhanden sein können und die Aktivität des gewünschten Faktors entweder negativ oder positiv beeinflussen können; der gereinigte Faktor muss charakterisiert werden;

   und der gereinigte Faktor muss in genügender Weise konzentriert werden, um eine Identifikation und Charakterisierung des Faktors zu ermöglichen. Demzufolge wird mit der zunehmenden Zahl der isolierten Faktoren jeder neue Faktor schwieriger zu identifizieren, da seine Rolle und Funktion durch zahlreiche andere vorhandene Faktoren erschwert wird. 



  Beal et al., Cancer Biochem. Biophys. (1979) 3: 93-96 schildern, dass in humanem Urin Peptide vorhanden sind, welche das Wachstum und die DNA-Synthese in transformierten Zellen mehr als in normalen Zellen hemmen. Holley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (1980) 77: 5989-5992 beschreiben die Reinigung von epithelialen Zellwachstums-Inhibitoren. Letansky,  Biosci. Rep. (1982) 2: 39-45 schildern, dass Peptide, welche aus boviner Placenta isoliert wurden, das Tumorwachstums und den Thymidin-Einbau in DNA in einem grösseren Ausmass in Neoplasmen hemmen, als in normalen Zellen. Chen, Trends Biochem. Sci . ( 1982 ) 7: 364-365 schildert die Isolierung eines Peptides aus einer Ascites-Flüssigkeit mit einer krebshemmenden Eigenschaft. Redding und Schally, Proc. Natl. Acad.

  Sci. ( 1982 ) 79: 7014-7018 schildern die Isolierung und Reinigung von Peptid aus Schweine-Hypothalmi, welches eine anti-mytogene Aktivität gegen verschiedene normale Zellinien und Tumorzellinien aufweist . Sone et al ., Gann ( 1984 ) 75 : 920-928 schildern die Herstellung eines Faktors, der durch humane Macrophagen produziert wird, welcher das Wachstum von verschiedenen Zellinien in vitro hemmt. Ransom et al., Cancer Res. (1985) 45: 851-862 schildern die Isolierung eines Faktors, welcher Leukoregulin genannt wird, der die Replikation von verschiedenen Tumorzellinien hemmt und unterscheidbar von Lymphotoxin, Interferon und Interleukin 1 und 2 auftritt. Die meisten dieser Faktoren sind weder vollständig charakterisiert, noch ist ihre Primär-Struktur bekannt. 



  Aggarwal et al ., J. Biol . Chem. ( 1984 ) 259 : 686-691 reinigten und charakterisierten humanes Lymphotoxin (LT), welches durch eine Lymphoblastoid-Zellinie produziert wurde und welches LT anschliessend sequeniert wurde (Aggarwal et al, J. Biol. Chem. (1985) 260: 2334). Gamma-Interferon (  gamma -IF), welches durch die Lymphoid-Zellen produziert wird und eine Immuno-Modulations- und Tumor-Inhibitor-Aktivität aufweist, wurde geklont und exprimiert (Gray et al., Nature (1982) 295: 503-508 ). Tumor-Necrose-Faktor ( TNF ), welcher das Wachstum von einigen Tumoren hemmt und durch Macrophagen und gewisse Leukämie-Zellinien produziert wird, ist charakterisiert worden und  die TNF-cDNA wurde geklont und in E. coli exprimiert (Pennica et al., Nature (1984) 312: 724). 



  Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, einen Faktor zur Verfügung zu stellen, welcher das Zellwachstum moduliert, insbesondere das Tumor-Zellwachstum hemmt und das Wachstum von normalen Fibroblasten stimuliert und die Immunfunktionen moduliert. 



  Die Aufgabe wurde durch die Gegenstände der vorliegenden Erfindung gelöst. 



  Die Gegenstände der vorliegenden Erfindung sind in den unabhängigen Patentansprüchen definiert. 


 Kurze Beschreibung der Zeichnungen: 
 
 
   Figur 1 zeigt eine Serie von Mikrophotographien von Zellen, welche mit Oncostatin M behandelt wurden, wobei A bis C A375-Melanom-Zellen darstellen, die mit 0,5, bzw. 100 GIA-Einheiten behandelt wurden und D bis F WI38 Fibroblasten darstellen, die mit 0,5, bzw. 100 GIA-Einheiten behandelt wurden; und 
   Figur 2 eine Photographie einer SDS-PAGE-Analyse von Oncostatin M darstellt. 
 



   Es werden neue Polyaminosäuren, Polypeptide, Polypeptid-Zusammensetzungen und Fragmente davon sowie ihre Herstellung und Verwendung beschrieben. Die Zusammensetzungen zeigen eine Aktivität bei der Modulierung des Zellwachstums, insbesondere bei der Hemmung des Tumorzellwachstums und der Stimulierung des Wachstums von normalen Fibroblasten. Ein bevorzug tes Polypeptid wird als Oncostatin M bezeichnet und wird aus Leukocyten erhalten, z.B. aus konditionierten Medien von stimulierten U-937-Zellen oder konditionierten Medien von stimulierten, normalen, peripheralen Blut-Lymphocyten (PBL). Fragmente und Mutanten des Polypeptides, welche die biologische Aktivität des intakten Oncostatin M, wie die Zellwachstums-Modulations-Aktivität oder die immunologische Aktivität aufweisen, werden ebenfalls beschrieben. 



  Die neuen erfindungsgemässen Polypeptid-Fragmente weisen mindestens 8 Aminosäuren auf und besitzen mindestens eine solche biologische Aktivität, dass sie immunologisch kreuzreaktiv sind mit natürlich vorkommendem Oncostatin M. Unter immunologischer Kreuzreaktivität wird verstanden, dass ein Antikörper, welcher durch ein erfindungsgemässes Polypeptid induziert wird, mit intaktem Oncostatin M eine Kreuzreaktion eingeht, zumindest, wenn das Oncostatin M in einem denaturierten Zustand vorliegt. Die Polypeptide sind demzufolge zur Induktion von Antikörpern gegen Oncostatin M nützlich und können demzufolge zur Bestimmung der Konzentration von Oncostatin M in Körperflüssigkeiten, zur Bindung von Oncostatin M und demzufolge zur Modulation seiner Aktivität und zur Reinigung von Oncostatin M, beispielsweise in einer Affinitäts-Säule, verwendet werden.

  Ein Teil dieser Polypeptide kann ebenfalls die Zellmodulations-Aktivität des intakten Oncostatins aufweisen, obschon die Aktivität moduliert sein kann, normalerweise im Vergleich zu intaktem Oncostatin M reduziert ist. 



  Nachstehend sind die Aminosäure-Sequenzen von Poylaminosäuren dargestellt, welche mit Oncostatin M kreuzreaktiv sind, wobei die erste Sequenz (I) den N-Terminus M darstellt. 
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  Die erfindungsgemässen Polyaminosäuren enthalten in der Regel eine Aminosäure-Sequenz, die mindestens 8 aufeinanderfolgende Aminosäuren einer der obigen Aminosäure-Sequenzen umfasst und sich von dieser Sequenz durch nicht mehr als drei normalerweise durch nicht mehr als eine Aminosäure unterscheidet. Der Unterschied kann entweder eine Insertion einer Aminosäure, einer Deletion einer Aminosäure oder einer Substitution einer Aminosäure durch eine andere, insbesondere eine konservative Substitution sein. Normalerweise enthält eine erfindungsgemässe Polyaminosäure mindestens 10, in der Regel mindestens 12 aufeinanderfolgende Aminosäuren, welche den oben dargestellten Sequenzen entsprechen und sich durch nicht mehr als eine Aminosäure unterscheiden. 



  Eine bevorzugte Gruppe von erfindungsgemässen Verbindungen besitzt folgende N-terminale Aminosäuresequenz:
 
 X-X-I-G-S-X-S-K-E-Y-R-V-L-L-G-Q-L-X-K-X
 
 worin X irgend eine Aminosäure darstellt. 



  Die Aminosäuren, welche die Bausteine der vorliegenden Polyaminosäuren bilden, können in eine Anzahl von Unterklassen aufgeteilt werden. Die folgende Tabelle stellt diese Unterklassen dar: 
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  Unter konservativer Substitution wird verstanden, dass die Aminosäuren der gleichen Unterklasse (d.h. entweder der neutralen, aliphatischen, der sauren, aliphatischen, der basischen aliphatischen oder der aromatischen) und insbesondere der gleichen Polarität subsituiert werden. Vorzugsweise bilden Aminosäuren von 2 bis 5 C-Atomen oder mit 5-6 C-Atomen Monomer-Gruppierungen in der aliphatischen Unterklasse. 



  Die Polyaminosäuren überschreiten in der Regel die Länge von 1000 Aminosäuren nicht. Normalerweise haben sie weniger als 100 Aminosäuren, insbesondere weniger als 50 Aminosäuren. Demzufolge können die Polyaminosäuren leicht synthetisch hergestellt werden. Wenn eine Polyaminosäure mehr als 100 Aminosäuren in der Länge aufweist, können diese Polyaminosäuren Polymere von Fragmenten von Oncostatin M sein, mit weniger als 100 Aminosäuren oder Fusionsproteine sein, wo das Fragment mit einem Antigen, einem Enzym, mit Enzym-Fragmenten usw. fusioniert ist. Insbesondere können die Polyaminosäuren von höherem Molekulargewicht mindestens ein Polypeptid-Fragment von weniger als etwa 100 Aminosäuren darstellen, das kovalent an einen grossen immunogenen Polypeptid-Träger gebunden ist, welcher die Immunität verleiht.

  Exemplarisch für solche Proteinträger sind bovines Serumalbumin, Schlüssellochschnecken-He mocyanin (Keyhole limpet hemocyanine, KLH) und dergleichen. Diese konjugierten Polypeptide sind nützlich für die Induzierung von Antikörpern in einem zweckmässigen Wirtorganismus. 



  U937-Zellen sind eine Zellinie, die aus einer histiocytischen Lymphom-Zellinie abgeleitet ist (Sundstrom und Nilsson Int. J. Cancer (1976) 17: 565-577), die zur Differenzierung in Zellen induziert werden kann, die macrophage Charakteristiken aufweisen, nachdem sie mit einer Vielzahl von Mitteln behandelt wurde (Harris et al., Cancer Res. (1985) 45: 9-13). Für die Herstellung von Oncostatin M können die U937-Zellen in einer üblichen Nährlösung mit Serum gezüchtet werden und mit einem zweckmässigen Initiator behandelt werden. Der Bequemlichkeit halber können Phorbole oder Ingenole, insbesondere 12-O-Tetradecanoylphorbol-13-acetat (TPA) verwendet werden. Normalerweise wird etwa 5 bis 20 ng/ml Initiator verwendet. Die ursprüngliche Zellzahl liegt im Bereich von 10<5>-10<6> Zellen/ml. 



  Nachdem die Zellen genügend lange mit dem Initiator behandelt waren, im allgemeinen 3 bis 6 Tage, wird der Überstand entfernt, die Zellen mit serumfreiem Nährmedium gewaschen, die gebundenen Zellen wiederum mit serumfreiem Medium gewaschen und schliesslich werden die Zellen mindestens 12 Std. inkubiert, normalerweise nicht mehr als etwa 48 Std. in serumfreiem Nährmedium, z.B. RPMI-1640-Medium. Die Überstände werden dann gesammelt und die Zellen werden durch Zentrifugation entfernt. Die zellfreien Überstände werden auf zellwachstumshemmende Aktivität (GIA) geprüft, wie dies im experimentellen Teil beschrieben ist. Der Überstand enthält 50 bis 500 Einheiten GIA/ml (die GIA-Einheiten sind im experimentellen Teil definiert). 



   Oncostatin M kann ebenfalls aus stickstoff-stimulierten, normalen, humanen, peripheren Blutlymphocyten (PBL) erhalten werden. Die PBL können aus Leuko-Fraktionen isoliert werden, indem die Fraktionen verdünnt werden und über Ficoll-Gradienten zentrifugiert werden. Die Zellen, welche von der Gradientenoberfläche gewonnen wurden, werden gewaschen und schock-lysiert, um die roten Blutkörperchen zu entfernen. Die zurückbleibenden Zellen werden aus dieser Lösung durch Zentrifugation gewonnen, wiederum in Pufferlösung, die Serum und Thrombin enthält, aufgelöst, gerührt und das Blättchenaggregat wird während kurzer Zeit zur Absetzung stehengelassen. Die wiedersuspendierten Zellen werden transferiert, durch Zentrifugation wiedergewonnen, wiederum in Serum suspendiert und auf eine Säule gegeben, die Nylon-Wolle enthält.

  Die Säule wird zur Bindung der Monocyten und B-Lymphocyten inkubiert und dann gewaschen. Die meisten peripheren Blut-T-Lymphocyten werden nicht gebunden und aus der Säule eluiert. Diese Zellen wurden bei 37 DEG C in Kulturmedium (d.h. RPMI-1640-Medium) kultiviert und mit einem zweckmässigen Initiator behandelt, z.B. Phytohemagglutinin (1 bis 5 mg/l) während etwa 100 Std. und dann wurden die Überstände gesammelt. Die Überstände wurden zur Entfernung der Zellen zentrifugiert und beispielsweise durch Ultra-Filtration oder Dialyse konzentriert. 



  Nach der Isolierung des zellfreien Überstandes von U937-Zellen oder normalen PBL wird das konditionierte Medium konzentriert, bequemlichkeitshalber unter Verwendung eines "Hollow-Fiber"-Systems oder einer Ultra-Filtrations-Membrane, anschliessend durch Verdünnung mit Essigsäure (auf eine Konzentration von 0,1N Essigsäure) gefolgt durch etwa 10-fache Konzentration und unter Wiederholung der Verdünnung und Konzentration. Das Konzentrat kann gefriergetrocknet werden und di rekt verwendet werden oder das gefriergetrocknete Produkt kann einem weiteren Reinigungsschritt unterworfen werden. 



  Das Oncostatin M kann durch Gel-Permeation-Chromatographie unter Verwendung von 40% Acetonitril/0,1% Trifluoressigsäure als isokratische, mobile Phase auf einer Bio-Sil TSK250-Säule gereinigt werden, wobei die Aktivität für jede Fraktion gemessen wird. Die Reinigung ergibt eine Zusammensetzung mit einer Aktivität von mindestens 0,5 bis 5 x 10<4> GIA-Einheiten/ml in den aktiven Fraktionen. 



  Das mittels Gel-Permeations-Chromatographie partiell gereinigte Produkt kann unter Verwendung einer Umkehrphasen-Hochdruck-Flüssig-Chromatographie weiter gereinigt werden, wobei ein linearer Gradient eingesetzt wird und das primäre Lösungsmittel 0,1% Trifluoressigsäure in Wasser und das sekundäre Acetonitril mit 0,1% Trifluoressigsäure ist. Das Verfahren kann variiert werden, im allgemeinen erfordert die Chromatographie etwa 3 bis 4 Std., wobei die Hauptzeitdauer grösser als etwa 50% und nicht mehr als etwa 80% der Zeit im Bereich von 30 bis 45% des sekundären Lösungsmittels beträgt. Unter diesen Bedingungen werden die aktiven Fraktionen bei etwa 41 bis 42% Acetonitrol eluiert. 



  Die gepoolten aktiven Fraktionen können weiter gereinigt werden, indem die Umkehrphasen-HPLC wiederholt wird, wobei ein schnellerer Wechsel der Gradientenbedingungen und eine langsamere Fliessgeschwindigkeit verwendet wird. Unter diesen Bedingungen tritt die Aktivität bei etwa 40,5 bis 41,5% Acetonitril auf. 



  Die Umkehrphasen-HPLC kann dann wiederholt werden, wobei  das Lösungsmittelsystem geändert wird, indem als zweites Lösungsmittel n-Propanol/0,1% Trifluoressigsäure eingesetzt wird. Es wird ein linearer Gradient verwendet, wobei der Gradient langsam im Bereich von 23 bis 35% n-Propanol geändert wird. Die Hauptaktivität wird im Bereich von 25,5 bis 27,5% Propanol beobachtet, wobei ein im wesentlichen homogenes Produkt erhalten wird, mit einer spezifischen Aktivität, die höher als 10 GIA-Einheiten/ng Protein ist. Üblicherweise wird das Produkt solange gereinigt, bis eine spezifische Aktivität von 100 GIA-Einheiten/ng Protein und insbesondere 150 GIA-Einheiten/ng erhalten wird. 



  Die Hauptverbindungen sind durch ein Molekulargewicht von etwa 17 bis 19 ku (kD), insbesondere etwa 18 ku (kD) charakterisiert, bestimmt durch Grössen-Ausschluss-Chromatographie. Die Hauptverbindungen werden weiter charakterisiert, dass sie ein scheinbares Molekulargewicht von etwa 28 ku (kD) aufweisen, bestimmt durch Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese unter reduzierenden oder nicht reduzierenden Bedingungen. 



  Es wurde die Aminosäure-Sequenz von Fragmenten des gereinigten Oncostatin M analysiert. Oncostatin besitzt im wesentlichen die folgenden Aminosäure-Sequenzen: 
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  Die erste Sequenz (I) erläutert den N-Terminus von Oncostatin M, während die übrigen Sequenzen (II, III) interne Fragmente des Polypeptides darstellen. 



  Aktive Präparate von isoliertem Oncostatin M enthielten eine Mischung von hohen Mannose- und Komplex-N-Oligosaccharid. Die nicht-glykosilierten Präparate von Oncostatin M enthielten jedoch die zellwachstums-modulierende Aktivität. 



  Oncostatin M wird weiter durch seine Aktivität gegen gewisse Zellstämme charakterisiert. Dem Hauptpolypeptid fehlt die cytotoxische Aktivität gegen die humanen Fibroblasten WI26 und WI38 und gegen die Mäuse-Zellen L929, welche auf den Tumor-Necrose-Faktor empfindlich sind und gegen eine  gamma -Interferon empfindliche humane Tumor-Zellinie. Es wurde ebenfalls gefunden, dass es die Proliferation von normalen, humanen T-Lymphocyten oder die granulocytische/myelocytische Kolonienbildung aus Knochenmarkzellen bei einer Konzentration bis zu 100 GIA-Einheiten/ml nicht hemmt. Weiter stimuliert Oncostatin M die Proliferation von normalen, humanen Fibroblasten wie dies durch WI38 und WI26-Zellen gezeigt wurde und hemmt die Proliferation von Tumor-Zellen, wie A375, HBT10, A549 und SKMEL28 und kann das Wachstum von kolonienbildenden Zellen aus normalem Knochenmark erhöhen.

  Oncostatin M unterdrückt die humanen, proliferativen oder cytotoxischen T-Zell-Antworten nicht in gemischten Leukocyten-Kultur-Reaktionen (MLC) bei Konzentrationen von 500 GIA-Einheiten/ml. 



  Das Polypeptid ist gegen schwache Säuren und Basen sowie gegen Hitzebehandlung bei 56 DEG C stabil. 



   Die Aminosäure-Sequenz des Polypeptid kann unter Verwen dung von kommerziell erhältlichen Sequenatoren vollständig bestimmt werden. Das Polypeptid kann dann gemäss bekannten Techniken synthetisiert werden, unter Verwendung eines automatischen Synthesizers, welche ebenfalls kommerziell erhältlich sind. 



  Alternativ kann das Polypeptid ebenfalls durch rekombinante DNA-Techniken produziert werden. Von einer partiellen Aminosäure-Sequenz können Proben abgeleitet werden, welche dann für das Screening einer humanen Genbank verwendet werden können. Die Genbank kann eine cDNA-Genbank oder eine chromosomale Genbank sein. Wenn das KIon oder die Klone einmal identifiziert sind, wie durch Verschmelzen mit der Probe, können die Fragmente der interessierenden Gene auf zahlreiche Arten identifiziert und auf zahlreiche Arten manipuliert werden. Die Fragmente können in der Grösse durch Endonuklease-Restriktion reduziert werden, wobei die resultierten Fragmente geklont und auf die Gegenwart des gewünschten Gens getestet werden können. Zellen, welche das gewünschte Peptid produzieren oder erhöhte Anteile des gewünschten Peptides produzieren, können für die Produktion der mRNA verwendet werden.

  Aus der mRNA kann eine einsträngige cDNA hergestellt werden. Die cDNA kann dann mit einer gesamten mRNA aus einer Zelle, welche wenig, wenn überhaupt, Polypeptid produziert, verschmolzen werden. Die nicht verschmolzene cDNA kann dann isoliert und zur Herstellung von ds cDNA verwendet werden, welche dann mit den Proben einem Screening unterworfen werden kann. 



  Alternativ können die DNA-Fragmente in  lambda  gtll insertiert werden, so dass die codierenden Fragmente stromabwärts und im Rahmen des  beta -Galactosidase-Gen vorliegen. Es können dann  Antikörper zum Oncostatin M Polypeptid hergestellt und für das Screening des resultierenden, verschmolzenen Proteins für die Kreuzreaktivität verwendet werden. Auf diese Weise können Fragmente, welche das Polypeptid oder Fragmente davon codieren, identifiziert und für die Identifikation des gewünschten Gens verwendet werden. 



  Wenn einmal ein vollständiges Gen identifiziert worden ist, entweder als cDNA oder als chromosomale DNA, kann es dann auf verschiedene Arten manipuliert werden, um eine Expression zu erhalten. Wenn das Gen in einem Wirt exprimiert wird, welcher die transkriptions- und translations-regulierenden Gebiete des Wild-Typs von Oncostatin M erkennt, kann das gesamte Gen, mit seinen 5 min -3 min -Regulierungsgebieten des Wild-Typs in einem zweckmässigen Expressions-Vektor eingeführt werden. Verschiedene existierende Expressions-Vektoren verwenden Replikationssysteme aus Säugetier-Viren, wie aus dem Simian-Virus 40, dem Adenovirus, dem bovinen Papilloma-Virus, dem Vaccinia-Virus, dem Insekten-Baculovirus usw.

  Diese Replikationssysteme sind entwickelt worden, um Markierungsmittel zur Verfügung zu stellen, welche die Selektion von Transfektionsmittel erlauben, ebenso um zweckmässige Restriktionsstellen zur Verfügung zu stellen, in welche das Gen eingeführt werden kann. 



  Wenn das Gen in einem Wort exprimiert werden muss, welcher die natürlich vorkommenden Wild-Typ-transkriptions- und translations-regulierenden Gebiete nicht erkennt, sind weitere Manipulationen erforderlich. Es ist eine Anzahl von zweckmässigen 3 min -transkriptionalen Steuerregionen bekannt, die stromabwärts vom Stop-Codon eingesetzt werden können. Die nicht codierende 5 min -Region, die stromaufwärts vom Struk turgen liegt, kann durch Endonuklease-Restriktion, Bal31-Resektion oder dergleichen entfernt werden. Wenn alternativ eine zweckmässige Restriktionsstelle in der Nähe des 5 min -Terminus des Strukturgens vorhanden ist, kann das Strukturgen einer Restriktion unterworfen werden und ein Adaptor kann für die Verbindung des Strukturgens mit der Promotorregion verwendet werden, wobei der Adaptor als Ersatz für die verlorenen Nukleotide des Strukturgens dient.

  Es können verschiedene Strategien eingeschlagen werden, um eine Expressions-Kassette zu erhalten, welche in 5 min -, 3 min -Richtung der Transkription eine Transkriptions- und Translations-Einleitungsregion, die ebenfalls Steuerungs-Sequenzen für die Einleitung der Steuerung aufweist, das Strukturgen mit der Transkriptions- und Translationssteuerung der Einleitungsregion und ein terminales Transkriptions- und Translationsgebiet aufweist. 



  Beispiele für Transkriptions-Einleitungsgebiete oder -Promotoren sind für Bakterien der  beta -Gal-Promotor, der TAC-Promotor, der Lambda-links- und rechts-Promotor usw; für Hefe die glykolytischen Enzym-Promotoren, wie ADH-I und -II-Promotoren, der GPK-Promotor und der PGI-Promotor, der TRP-Promotor usw; für Säugetierzellen SV40-früh- und -spät-Promotoren, Adenovirus Major-spät-Promotoren usw. Wie bereits angegeben kann die Expressions-Kassette in ein Replikationssystem für die episomale Aufrechterhaltung in einem zweckmässigen, cellulären Wirt eingeschlossen werden oder kann ohne Replikationssystem zur Verfügung gestellt werden, wo es in das Genom des Wirts integriert werden kann.

  Die DNA kann in bekannter Weise in den Wirt eingeführt werden, wie durch Transformation, unter Verwendung von Kalziumphosphat gefällter DNA, Transfektion durch In-Kontakt-Bringen der Zellen mit dem Virus  oder durch Mikro-Injektion der DNA in die Zellen. 



  Ist einmal das Strukturgen in einen zweckmässigen Wirt eingeführt worden, kann der Wirt gezüchtet werden und dieser wird das Strukturgen exprimieren. In einigen Fällen kann es wünschenswert sein, eine Signal-Sequenz (secretory leader) stromaufwärts von und im Leseraster des Strukturgens vorzusehen, was die Sekretion des Strukturgens und die Spaltung des secretory leaders bewirkt, was zur Reifung des reifen Polypeptids im Überstand führt. Wenn keine Sekretion stattfindet, dann können die Wirtszellen geändert werden, gemäss den üblichen Bedingungen lysiert werden und das gewünschte Produkt isoliert und gemäss den bekannten Techniken gereinigt werden, beispielsweise durch Chromatographie, Elektrophorese, Lösungsmittelextraktion oder dergleichen. 



  Die erfindungsgemässen Polyaminosäuren oder Polypeptide können für viele Zwecke sowohl in vivo wie auch in vitro verwendet werden. Diese erfindungsgemässen Verbindungen können für die Herstellung von Antikörpern gegen die erfindungsgemässen Verbindungen verwendet werden, welche in vivo oder in vitro Anwendung finden können. Die Antikörper können in üblicher Weise hergestellt werden, beispielsweise durch Verwendung eines erfindungsgemässen Polypeptids als Immunogen und Injektion des Polypeptides in einen Säugetierwirt, z.B. in eine Maus, eine Kuh, eine Geiss, ein Schaf, ein Kaninchen usw., insbesondere mit einem Adjuvant, z.B. dem vollständigen Freund-Adjuvant oder Aluminiumhydroxidgel.

   Dem Wirt kann das Blut entnommen werden und das Blut kann für die Isolierung von polyclonalen Antikörpern verwendet werden oder bei der Maus können die peripheren Blut-Lymphocyten oder die Milz-Lymphocyten (B-Zellen) für die Fusion mit einer zweckmässigen Myelom-Zelle verwendet werden, um die Chromosome  für die monoclonale Expression von Antikörpern, die spezifisch gegen die erfindungsgemässen Verbindungen sind, zu immortalisieren. 



  Es können sowohl polyclonale als auch monoclonale Antikörper hergestellt werden, welche dann für die Diagnose oder den Nachweis der Gegenwart eines erfindungsgemässen Polypeptides in einer Probe, wie in Form Zellen oder einer physiologischen Flüssigkeit, wie Blut, eingesetzt werden können. Die Antikörper können ebenfalls bei der Affinitäts-Chromatographie für die Reinigung der erfindungsgemässen Polypeptide und ihre Isolierung aus natürlichen und synthetischen Quellen verwendet werden. Die Antikörper können ebenfalls bei der Kontrolle des Gehaltes an erfindungsgemässen Polypeptiden in Zellkulturen oder in vivo Verwendung finden, wobei das Wachstum der Zellen verändert werden kann. Die erfindungsgemässen Verbindungen können dann als Liganden für den Nachweis der Gegenwart von Rezeptoren für die erfindungsgemässen Verbindungen verwendet werden.

  Auf diese Weise können Zellen im Zusammenhang mit der Gegenwart und der Dichte von Rezeptoren für die erfindungsgemässen Verbindungen unterschieden werden, wobei die Wirkung von verschiedenen Verbindungen auf die Gegenwart von solchen Rezeptoren nachgewiesen wird. 



  Die erfindungsgemässen Polyaminosäuren oder Polypeptide können in vitro-Kulturen verwendet werden, um das Wachstum von Zellen oder Zellinien zu hemmen, welche empfindlich auf die erfindungsgemässen Polypeptide sind und demzufolge von Zellen, welche nicht empfindlich sind, unterschieden werden können. Demzufolge können heterogene Zellmischungen oder Zellinien von unerwünschten Zellen befreit werden, wenn die unerwünschten Zellen auf die erfindungsgemässen Polypeptide empfindlich sind. Die erfin dungsgemässen Polypeptide können in vivo bei neoplastischen Bedingungen verabreicht werden, beispielsweise durch Injektion, intralesional, peritoneal, subcutan.

  Die erfindungsgemässen Verbindungen können in vitro verwendet werden, um bösartige Zellen vom Knochenmark für autologe Marktransplantationen zu entfernen oder die Proliferation zu hemmen oder bösartige Zellen in anderen Geweben, beispielsweise im Blut, vor der Reinfusion zu entfernen. 



  Die erfindungsgemässen Polypeptide können ebenfalls in einem Wundbehandlungs-Verfahren verwendet werden, beispielsweise bei Schnittwunden, Hornhautwunden und zahlreichen anderen Störungen des Epithels und des Stromas, wie bei chronischen Ulcern, Verbrennungen, chirurgischen Eingriffen, traumatischen Wunden und Verletzungen in den hohlen, durch epithel begrenzten Organen, wie in der Speiseröhre, im Magen, im Dick- und Dünndarm, im Mund und im Uro-Genitalen-Trakt. Das Verfahren beruht auf der topischen Anwendung mit einer Behandlungszusammensetzung, die Oncostatin M in einem physiologisch annehmbaren Träger enthält. 



  Die erfindungsgemässe Zusammensetzung kann für die Behandlung einer grossen Anzahl von Wunden, einschliesslich im wesentlichen aller cutaner Wunden, Hornhautwunden und Verletzungen bei den durch epithel begrenzten, hohlen Organen des Körpers verwendet werden. Wunden, welche zweckmässig mit der genannten Zusammensetzung behandelt werden, umfassen denjenigen, welcher von einem Trauma herrühren, wie Verbrennungen, Schürfungen, Schnitte und dergleichen, ebenso wie solche von chirurgischen Verfahren, wie chirurgischen Schnitten und Hauttransplantationen. Andere Bedingungen, welche zweckmässig sind für die Behandlung mit den erfindungsgemässen Zusammensetzun gen umfassen chronische Bedingungen, wie chronischer Ulcer, diabetischer Ulcer und andere nicht heilende (trophische) Bedingungen. 



  Oncostatin M kann in physiologisch annehmbaren Trägern für die Anwendung in angegriffenen Gebieten formuliert werden. Die Natur der Träger kann in einem weiten Bereich variiert werden und hängt von der Lage der beabsichtigten Anwendung ab. Für die Anwendung auf der Haut wird normalerweise eine Creme oder eine Salbenbasis bevorzugt, zweckmässige Basen umfassen Lanolin, Silvaden (Marion) (insbesondere für die Behandlung von Verbrennungen), Aquaphor (Duke Laboratories, South Norwalk, Connecticut) und dergleichen. Gewünschtenfalls ist es möglich, Oncostatin M enthaltende Zusammensetzungen in Verbände und andere Wundbedeckungen einzufügen, damit die Wunde kontinuierlich dem Peptid ausgesetzt ist. Aerosol-Anwendungen können ebenfalls eingesetzt werden. 



  Die Konzentration des Polypeptids in der Behandlungszusammensetzung ist nicht kritisch. Das Polypeptid muss in einem Anteil vorhanden sein, welcher die Epithel-Zell-Proliferation induziert. Die Zusammensetzungen werden topisch beim affektierten Bereich angewendet, typischerweise als Augentropfen für die Augen oder als Cremen, Salben oder Lotionen für die Haut. Im Falle der Augen ist eine häufige Behandlung wünschenswert, normalerweise in Intervallen von 4 Std. oder weniger. Auf der Haut ist eine kontinuierliche Aufrechterhaltung der Behandlungslösung an der angegriffenen Stelle während des Heilungsprozesses wünschenswert, wobei die Anwendung der Behandlungszusammensetzung 2 bis 4 mal täglich oder häufiger erfolgen kann. 



  Die eingesetzte Menge des erfindungsgemässen Polypeptides variiert, je nach Art der Verabreichung, der Verwendung von anderen aktiven Verbindungen und dergleichen, und liegt im allgemeinen im Bereich von 1  mu g bis 100  mu g. Die erfindungsgemässen Polypeptide können mit physiologisch annehmbaren Trägern, wie Kochsalzlösung oder phosphat-gepufferter Kochsalzlösung verwendet werden. Der Anteil der verwendeten Verbindungen wird empirisch festgelegt, wobei die Antwort der Zellen in vitro und die Antwort bei Versuchstieren auf die erfindungsgemässen Polypeptide oder Formulierungen, die sie enthalten, Bezug genommen wird. Die erfindungsgemässen Verbindungen finden als solche oder in Kombination  mit  anderen Wachstums-Faktoren  oder  -Inhibitoren  oder  Immuno-Modulatoren, wie TNF, IL-2,  gamma -Interferin oder monoclonale Antikörper Verwendung.

   Die Menge dieser Verbindung beträgt im allgemeinen 1  mu g bis 100  mu g. Die Konjugate der erfindungsgemässen Verbindungen durch zentrums-gerichtete Reste, beispielsweise Antikörper, können hergestellt werden, wenn die Antikörper spezifisch für besondere bösartige Zellen oder Organe sind. 



  Die nachstehenden Beispiele dienen der Erläuterung der vorliegenden Erfindung. 


 EXPERIMENTELLES 
 


 Material und Methoden 
 


 Oncostatin M isoliert aus U937-Zellen Herstellung eines Inhibitors für das Tumorzellwachstum aus einer hystiocytischen Lymphom-Zellinie 
 



  U937-Zellen, eine hystiocytische Lymphom-Zellinie (Sundstrom und Nilsson, Int. J. Cancer (1976) 17: 565-577) wurden in 850 cm<2>-Rollflaschen (Corning C2540) mit einer Konzentration von 4 x 10<5> Zellen/ml in einem Gesamtvolumen von 300 ml RPMI 1640 Medium, das mit 10% fötalem Kälberserum (FCS), Penicillin/Streptomycin (PS), L-Glutamin und 10 ng/ml 12-O-Tetradecanoylphorbol 13-acetat (TPA) ergänzt wurde, kultiviert. 4 Tage später wurden die Überstände, die FCS und TPA enthielten, entfernt, die Rollflaschen wurden fünfmal mit serumfreiem RPMI-1640 gewaschen und die Zellen, welche gelöst wurden (1 x 10<5> Zellen/ml) wurden dreimal mit serumfreiem Medium gewaschen und in die Flaschen zurückgegeben, wobei ein Endvolumen von 125 ml serumfreies RPMI-1640-Medium pro Rollflasche resultierte.

   1 Tag später wurden die Überstände gesammelt, zur Entfernung der Zellen zentrifugiert und durch ein 0,45  mu m Nalgen-Filter filtriert und unter Verwendung eines Hollow-Fiber-Systems (Amicon-Patrone HIP10-20) auf ein Volumen von 150 ml konzentriert (ursprüngliches Volumen 1500 ml). Das Oncostatin M wurde ebenfalls aus den Überständen von mit serumfreiem TPA behandelten U937-Zellen in 150 cm<2> Kulturflaschen erhalten. Der Überstand wurde mit einer Amicon Diaflo-Membrane PM-10, mit einem Ausschluss 10 kD konzentriert und dialysiert. Nach der Dialyse wurde das Konzentrat mit Essigsäure verdünnt, wobei eine Endkonzentration von 0,1 N Essigsäure in 500 ml erhalten wurde und auf 50 ml konzentriert wurde, wobei ein Amicon PM-10-Filter verwendet wurde. Die 50 ml Konzentrat wurden auf 400 ml mit 0,1 N Essigsäure verdünnt und auf 40 ml mit dem selben Filter konzentriert.

  Das Konzentrat wurde mit 1 N Essigsäure verdünnt und das resultierende Präcipitat wurde durch Zentrifugation entfernt. Das resultierende Konzentrat wurde gefroren und gefriergetrocknet. Das lyophilisierte Material wurde für den Reinigungsschritt verwendet. 


 Gel-Permeations-Chromatographie 
 



  Eine Bio-Sil TSK-250-Säule (600 x 21,5 mm) (Bio-Rad) wurde an ein Hochdruck-Flüssig-Chromatographiesystem angeschlossen. Die rohe Fraktion (10 mg/ml) wurde in 40% Acetonitril in 0,1% wässriger Trifluoressigsäure (0,1% TFA) aufgelöst. Eine 2 ml Aliquot der Mischung wurde injiziert und die Elution wurde isokratisch mit einer mobilen Phase von 40% Acetonitril in 0,1% TFA durchgeführt. Die Fliessgeschwindigkeit betrug 2,5 ml/Min. und die Papiergeschwindigkeit wurde auf 0,25 cm/Min. festgesetzt. Es wurden 5 ml-Fraktionen gesammelt. Die Chromatographie wurde bei Zimmertemperatur durchgeführt. Ein Aliquot von jeder Fraktion wurde abgedampft und dreifach auf wachstumshemmende Aktivität (GIA) von A375-Zellen getestet. 



  Die aktiven Fraktionen (Fraktionen 21 und 22) wurden 6 Läufen gepoolt. Das gepoolte Material hatte ein Total von ungefähr 4,8 x 10<5> GIA-Einheiten. Es wurde gefunden, dass der Faktor ein scheinbares Molekulargewicht von 18 kD aufwies, durch Bestimmung durch Grössen-Ausschluss-Chromatographie (Bio-Sil TSK-250-Säule). 


 Umkehrphasen-Hochdruck-Flüssig-Chromatographie (HPLC) von TSK-250-Fraktionen 
 



  Gepoolte TSK-250-Fraktionen 21 und 22, wie oben beschrieben, wurden zweimal mit 0,1% TFA verdünnt. Diese Mischung wurde isokratisch auf eine  mu -Bondapak-C18-Säule (7,8 x 300 mm) (bezogen auf C18<1> ) bei Zimmertemperatur eingespritzt. Die  Fliessgeschwindigkeit wurde auf 2,0 ml/Min. festgesetzt und die Papiergeschwindigkeit betrug 0,25 cm/Min. Der lineare Gradient wurde zwischen dem primären Lösungsmittel 0,1% TFA und dem sekundären Lösungsmittel Acetonltril/TFA 0,1% gewählt. Die Gradientenbedingungen waren 0,30% in 20 Min., dann 30-45% in 150 Min., 45-55% in 20 Min. und 55-100% in 10 Min. Sämtliche Lösungsmittel waren in der HPLC-Reinheit. Es wurden 4 ml-Fraktionen gesammelt und Aliquote von jeder Fraktion wurden auf wachstumshemmende Aktivität getestet. Es wurde gefunden, dass die Fraktionen 72-75 die Mehrheit an Aktivität aufwiesen.

  Die aktiven Fraktionen wurden zwischen 41 und 42% Acetonitril eluiert. 



  Die Fraktionen 72-75 wurden gepoolt. 16 ml 0,1% TFA wurde zu den gepoolten Fraktionen gegeben. Die Mischung wurde in eine  mu -Bondapak-C18-Säule (3,9 x 300 mm) (als C18<2> bezeichnet) bei Zimmertemperatur eingespritzt. Die Fliessgeschwindigkeit wurde auf 1 ml/Min. festgesetzt und die Papiergeschwincigkeit betrug 0,25 cm/Min. Die Gradientenbedingungen waren 0,35% in 10 Min., 35-45% in 100 Min. und 45-100% in 10 Min. Die Fraktionen wurden gesammelt und aliquote Anteile wurden genommen und auf GIA getestet. Der grösste Teil der Aktivität trat aus der Kolonne zwischen 40,7 bis 41,3% Acetonitril-Konzentration auf (Retentionszeit 83-86 Min.). 



  Die  aktiven Fraktionen  wurden  gepoolt  und  zweimal  mit 0,1% TFA verdünnt und isokratisch auf eine  mu -Bondapack-C18-Säule (3,9 x 300 mm) (bezeichnet als C18<3>) bei Zimmertemperatur eingespritzt. Die Fliessgeschwindigkeit betrug 1 ml/Min. und die Papiergeschwindigkeit war 0,25 cm/Min. Es wurde ein linearer Gradient verwendet, zwischen dem primären Lösungsmittel 0,1% TFA und dem sekundären Lösungsmittel n-Propanol-TFA (0,1%). 



  Die Gradientenbedingungen waren 0-23% in 20 Min. und 23-35% in 120 Min. Die Fraktionen wurden gesammelt und alitquote Anteile jeder Fraktion wurden auf GIA getestet. Der grösste Teil der Aktivität erschien zwischen 25-26,5% Propanolkonzentration (Retentionszeit 59 Min.). Diese scheinbar homogene Fraktion enthielt 300 ng Protein und etwa 40 000 GIA-Einheiten. 


 Zellwachstumsmodulations-Versuch unter Verwendung einer <3>H-Thymidin-Einverleibung in die DNA (GIA) 
 



   Die Tests wurden in Platten 96 flachen Vertiefungen (Costar 3596) durchgeführt. Humane Melanom-Zellen (A375) wurden als empfindliche Indikator-Zellinie verwendet. Die Zellen (3 x 10<3>) in 0,1 ml Eagles-Medium, modifiziert nach Dulbecco (DMEM) wurden mit 10% FCS ergänzt und PS wurden in jede Vertiefung gegeben. 3 Std. später wurden 0,1 ml Testproben in jedes Loch gegeben. Die Platten wurden bei 37 DEG C während 3 Tagen inkubiert. Dann wurde 0,025 ml (0,5  mu Ci) einer Lösung <3>H-Thymidin (spezifische Aktivität 27  mu Ci/ mu g) für die letzten 6 Std. der Inkubation in jedes Loch gegeben. Die Zellen wurden dann auf Glasfilter-Streifen übergeführt, indem ein Multiwell-Harvester verwendet wurde (PHD-Zell-Harvester, Cambridge Technology, Inc.).

  Die Filter wurden in Scintillations-Ampullen übergeführt, zu welchen 2 ml Scintillations-Flüssigkeit (Scienti Verse II, Fisher Scientific Co.) gegeben wurde, bevor auf einem Scintillations-Zähler die <3>H-Thymidin-Einverleibung bestimmt wurde. 


 Softagar-Kolonie-Inhibitions-Test (TGI) 
 



  Eine 0,5 ml Basisschicht von 0,5% Agar (Agar Noble; Difco Laboratories, Detroit, Michigan) in DMEM enthaltenden 10%igen fötalem Kälberserum (FCS) wurde auf 24-Loch-Costar-Gewebekultur-Platten gegeben. 0,5 ml 0,3% Agar, welche die gleiche Medium/FCS-Mischung enthielt, 1-2,5 x 10<3> A375-Zellen und der zu testende Faktor in verschiedenen Konzentrationen wurden auf die Basisschicht von Agar unter Überschichten gegeben. Die Platten wurden bei 37 DEG C in feuchter Atmosphäre mit 5% CO2 in Luft inkubiert und nach 7 Tagen durch Zugabe von 0,5 ml 0,3% Agar, welches das gleiche Medium und die gleichen Faktorkonzentrationen enthielt, genährt. Die Kolonien wurden numeriert, abgelöst und entfernt und Kolonien mit mehr als 6 Zellen wurden zwischen 7-14 Tagen ausgewertet. 


 Resultate 
 


 Sequenzen von Oncostatin M, welches aus U937-Zellen gewonnen wurde 
 



  Die N-terminale Sequenz und die internen Fragmente von Oncostatin M wurden durch Mikrosequenz-Analyse bestimmt unter Verwendung des reduzierten und S-pyridinethylierten Polypeptides und von Peptiden, die aus enzymatischer Verdauung des reduzierten und S-pyridinethylierten Oncostatin M mit Endoproteinase Lys-C und Staphylococcus aureus V8-Protease erhalten wurden. Die Peptid-Fragmente wurden durch Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung von flüchtigen Lösungsmitteln gereinigt. Die  Peptide wurden einem automatisierten, wiederholten Edman-Abbau in einem Sequenator Modell 470 A (Applied Biosystem, Inc. unterworfen. Die Phenylthiohydantoin-Aminosäuren wurden durch Umkehrphasen-HPLC (Applies Biosystems, Inc.) analysiert, wobei eine PTH-C18-Säule (2,1 x 220 mm, ABI) verwendet wurde und zur Elution ein Natriumacetat-Puffer/Tetrahydrofuran/Acetonitril-Gradient eingesetzt wurde. 



  Die resultierenden Aminosäure-Sequenzen entsprechen im wesentlichen den nachstehenden Sequenzen: 
EMI26.1
 



  Ein Vergleich dieser Sequenzen mit denjenigen, welche in der geläufigen Protein-Datenbank gespeichert sind (PIR Release 9,0, Mai 1986) zeigte keine signifikante Sequenz-Homologien mit irgend einer anderen bekannten Sequenz. Zusätzlich besteht keine Homologie zwischen dem Tumor-Necrose-Faktor, dem Lymphotoxin, dem kolonien-stimulierenden Faktor, Interleukin 1 oder 2 oder dem  beta -transformierenden Wachstumsfaktor. 


 Hemmung der Proliferation von Tumorzellen und Verbesserung der Proliferation von normalen humanen Fibroblasten 
 



  Unter Verwendung des Softagar-Kolonien-Hemm-Tests, wie er oben beschrieben ist, wurden folgende Resultate erhalten: 
<tb><TABLE> Columns=3 
<tb>Title: Tabelle 1
Hemmung der Melanom-A375-Zellkolonie-Bildung in Softagar durch gereinigtes Oncostatin M, das aus U937-Zellen* isoliert wurde 
<tb>Head Col 01 AL=L: GIA-Einheiten/Loch 
<tb>Head Col 02 AL=L: % Hemmung der Kolonien 
<tb>Head Col 03 AL=L: Kolonienbildung 
<tb> <SEP>250 <SEP>4 <SEP>96 
<tb> <SEP>83 <SEP>6 <SEP>94 
<tb> <SEP>27 <SEP>11 <SEP>89 
<tb> <SEP>45 <SEP>32 <SEP>69 
<tb> <SEP>0 <SEP>106 <SEP>- 
 * Die A375-Zellen wurden in Softagar aufgetragen, mit oder ohne Faktor in einem Endvolumen von 2 ml, wie oben beschrieben. Der verwendete Faktor wurde durch eine C18-Propanol-Säulen-Fraktion mit der Spitzenaktivität für die Hemmung des Tumorwachstums erhalten (GIA). 11 Tage später wurde die Anzahl der Kolonien gezählt.

  Eine Kolonie wurde als Anhäufung von mindestens 6 Zellen definiert. Eine GIA-Einheit wurde als derjenige Betrag definiert, welcher 50% Hemmung der <3>H-Thymidin-Einverleibung in A375-Zellen in Mikro-Löchern bewirkte, wie oben im einzelnen angegeben.
  
<tb></TABLE> 



  In der nächsten Studie wurden verschiedene Behandlungen verwendet, um die Wirkung der chemischen oder physikalischen Behandlung auf die Aktivität des erfindungsgemässen Polypeptides zu bestimmen. Die nachstehende Tabelle zeigt die Resultate: 
<tb><TABLE> Columns=6 
<tb>Title: Tabelle 2
Wirkung von verschiedenen Behandlungen der Überstände von TPA-induzierten U937-Zellen auf die Tumorwachstums-Hemmungs-Aktivität* 
<tb>Head Col 02 to 04 AL=L:

  Endverdünnung des Überstandes 
<tb>SubHead Col 02 AL=L>1:4: 
<tb>SubHead Col 03 AL=L>1:8: 
<tb>SubHead Col 04 AL=L>1:16: 
<tb> <SEP>Mediumkontrolle <SEP>- <SEP>- <SEP>- <SEP>39 780 
<tb> <SEP>Unbehandelter Überstand <SEP>7206** <SEP>13 896 <SEP>16 000 
<tb> <SEP>1N essigsäure <SEP>6670 <SEP>17 073 <SEP>18 783 
<tb> <SEP>1N NH4OH <SEP>6956 <SEP>15 016 <SEP>13 923 
 * Die U937-Zellen wurden während 3 Tagen mit TPA (10 ng/ml) behandelt, und dann wurden die Zellen mit Medium gewaschen und während 24 Std. in serumfreiem Medium inkubiert, bevor die Überstände gesammelt wurden. Die Überstände wurden mit 1N Essigsäure oder 1N Ammoniumhydroxid (NH4OH) behandelt. Sie wurden dann gegen das Medium dialysiert und auf ihre Fähigkeit, die <3>H-Thymidin-
Einverleibung in A375-Zellen zu hemmen, getestet.

  Die A375-Zellen wurden mit <3>H-Thymidin (<3>H-TdR) für die letzten 6 Std. der dreitägigen Inkubation markiert.
** Die angegebenen Daten betreffen die <3>H-TdR-Einverleibungs-Zählrate pro Minute.
  
<tb></TABLE> 



  Die obigen Resultate zeigen, dass Oncostatin im dialysierten Überstand im wesentlichen gegen lnaktivierung durch 1N Essigsäure und 1N Ammoniumhydroxid resistent ist. Demzufolge sind die erfindungsgemässen Verbindungen im wesentlichen unempfindlich sowohl gegen mittelstarke Säuren wie auch mittelstarke Basen. Die erfindungsgemässen Verbindungen sind gegen Hitzebehandlung bei 26 Std. während 1 Std. stabil, jedoch nicht gegen eine Behandlung bei 90 DEG C während 30 Min. 



   Die erfindungsgemässen Verbindungen wurden ebenfalls auf Hitzestabilität geprüft und es wurde gefunden, dass ihre Aktivität nach der Aussetzung einer Temperatur von 56 DEG C während 1 Std. erhalten bleibt, während sie im wesentlichen die gesamte Aktivität verlieren, wenn sie einer Temperatur von 95 DEG C während 30 Min. ausgesetzt sind. 



  In einer weiteren Studie wurde die Fähigkeit der erfindungsgemässen Polypeptide ermittelt, die Tumorzell-Replikation einer Anzahl von neoplastischen Zellen zu hemmen. Die nachstehende Tabelle zeigt die Resultate: 
<tb><TABLE> Columns=2 
<tb>Title: Tabelle 3
Hemmung der Replikation von Tumorzellen durch gereinigtes Oncostatin M aus U937-Zellen 
<tb>Head Col 01 to 02 AL=L: Einheiten GIA zur Verursachung von 30% Hemmung 
<tb>SubHead Col 01 AL=L>Tumorzellen: 
<tb>SubHead Col 02 AL=L><3>H-TdR-Einverleibung: 
<tb> <SEP>A549 (Lungenkrebs) <SEP>21 
<tb> <SEP>HTB10 (Neuroblastom) <SEP>81 
<tb> <SEP>A375 (Melanom) <SEP>0,3 
<tb></TABLE> 



  Die Tumorzellen wurden 3 Std. vor der Zugabe von verschiedenen Verdünnungen von Oncostatin M, welches durch Umkehrphasen-HPLC wie oben aufgeführt gereinigt wurde, in Mikro-Löcher gegeben. Während den letzten 6 Std. einer dreitätigen Inkubation, wurden die Zellen in 0,2 ml Medium mit <3>H-Thymidin (<3>H-TdR) (0,5 Ci/Loch) markiert. Eine Einheit Tumorwachstums-Inhibitor-Aktivität (GIA) ist in der Fussnote zu Tabelle 1 als diejenige Menge definiert, welche 50% Hemmung der <3>H-TdR-Einverleibung in A375-Melanomzellen bewirkt. Die Einheit wurde aus etwa 10 pg gereinigtem Protein definiert und demzufolge betrug die Konzentrag (ng/ml), welche eine 30% Hemmung <3>H-TdR-Einverleibung in A549, HTB10 und A375-Zellen ungefähr 1,4, 4,0 bzw. 0,15 ng/ml. Die <3>H-TdR-Einverleibung in normale, humane WI26-Fibroblasten wurde in jedem Experiment durch den Faktor U937 nicht unterdrückt. 



  Die obigen Resultate zeigen, dass Oncostatin M in seiner Fähigkeit, die Replikation zu hemmen, selektiv ist und stark variierende Wirkungen, je nach der Natur der Zelle, aufweist. Die erfindungsgemässen Verbindungen sind gegen Melanom-Zellen wie die A375-Melanomzellen, die schuppenartigen Lungenkrebszellen, wie A549 und die Neuroblastomzellen, wie HTB10, wirksam. 



  Die Tumorzellen wurden mit einer Dichte von 3 x 10<3> Zellen/Loch und die normalen Fibroblasten mit einer Dichte von 1, 5 x 10<3> Zellen/Loch in 96-Loch-Platten während 3 Std. angesetzt. Verschiedene Konzentrationen von gereinigtem Oncostatin M, welches aus den Fraktionen mit der höchsten antiproliferativen Aktivität gegen A375-Zellen aus der C18<3>-Säule erhalten wurde, wurden zugegeben und 3 Tage später wurde die <3>H-Thymidin-Einverleibung in die Zellen in 3 Löchern für jede Konzentration gemessen.

  Die Resultate sind in Tabelle 4 dargestellt: 
<tb><TABLE> Columns=5 
<tb>Title: Tabelle 4
Hemmung der Proliferation von Tumorzellen und Verbesserung der Proliferation von normalen Fibroblasten durch Oncostatin M 
<tb>Head Col 02 AL=L: GIA
Einheiten/Loch 
<tb>Head Col 03 AL=L: % Hemmung 
<tb>Head Col 05 AL=L: % Stimulation 
<tb> <SEP>A375 <SEP>WI38 
<tb> <SEP>Exp. 1 <SEP>16 <SEP>83 <SEP>25 
<tb> <SEP>4 <SEP>62 <SEP>30 
<tb> <SEP>1 <SEP>46 <SEP>46 
<tb>Head Col 03 AL=L: A375 
<tb>Head Col 04 AL=L: HTB10 
<tb>Head Col 05 AL=L: WI26 
<tb> <SEP>Exp. 2 <SEP>27 <SEP>NT <SEP>28 <SEP>46 
<tb> <SEP>9 <SEP>87 <SEP>22 <SEP>36 
<tb> <SEP>3 <SEP>76 <SEP>11 <SEP>52 
<tb>Head Col 03 AL=L: A375 
<tb>Head Col 04 AL=L: A549 
<tb> <SEP>Exp. 3 <SEP>75 <SEP>89 <SEP>30 
<tb> <SEP>25 <SEP>85 <SEP>22 
<tb> <SEP>8 <SEP>71 <SEP>16 
<tb>Head Col 03 AL=L: A375 
<tb>Head Col 04 AL=L:

  SK-MEL28 
<tb> <SEP>Exp. 4 <SEP>20 <SEP>87 <SEP>44 
<tb> <SEP>5 <SEP>75 <SEP>25 
<tb> <SEP>1 <SEP>59 <SEP>11 
<tb></TABLE> 



  Die Resultate sind angegeben in %-Hemmung oder %-Stimulation der <3>H-Thymidin-Einverleibung in Tumorzellen (A375, HTB10, A549 und SK-MEL28) bzw. normale Fibroblasten (WI26 und WI38). Eine GIA-Einheit ist in der Fussnote zu Tabelle 1 als derjenige Anteil von Oncostatin M definiert, welcher eine 50% Hemmung der <3>H-Thymidin-Einverleibung in A375-Zellen bewirkt. 



  Zusätzlich zum beobachteten Unterscheidungseffekt bei der <3>H-Thymidin-Einverleibung in Tumorzellen und normale humane Fibroblasten besteht ebenfalls ein beobachteter Unterscheidungseffekt bezüglich Morphologie und Zellanzahl in den der Oncostatin M-Behandlung der beiden Zelltypen folgenden 3 Tagen, wie in Figur 1 dargestellt. 



  Das verwendete Oncostatin M stammte von einer HPLC-C18<3>-Säulenfraktion mit der Spitzenaktivität für die Hemmung der Proliferation von A375-Zellen. Figur 1 stellt eine Serie von Mikro-Photographien von A375-Melanomzellen dar, welche unbehandelt sind (A), mit 5 Wachstums-Hemm-Aktivitäts-Einheiten (GIA-Einheiten) Oncostatin M behandelt (B) und mit 100 GIA-Einheiten Oncostatin M behandelt (C). Die Mikro-Photographien der WI38-Fibroblasten, die unbehandelt waren, sind in der Abbildung (D) diejenigen, die mit 5 GIA-Einheiten behandelt waren, sind in der Abbildung (E) und diejenigen, welche mit 100 GlA-Einheiten behandelt waren, sind in (F) abgebildet. Die Zellen wurden mit Kristallviolett in 0,5% Methanol gefärbt. Vergrösserung: 63 x. 


 NaDodSO<4>/PAGE von Oncostatin M 
 



  Gereinigtes Oncostatin M wurde einer Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE) unter reduzierenden  Bedingungen unterworfen. Es wurde gefunden, dass es ein scheinbares Molekulargewicht von etwa 28 kD, wie in Fig. 2 dargestellt, aufweist. Die folgenden Proteine wurden als Standards verwendet (Gel A): Ovalbumin, Mr = 43 kD;  alpha -Chymotryposinogen, Mr = 25,7 kD;  beta -Lactoglobulin, Mr = 18,4 kD; Lysozym, Mr = 14,2 kD; boviner Trypsin-Inhibitor, Mr = 6,2 kD; Insulin A- und B-Kette, Mr = 2,3 dK bzw. 3,4 kD. Oncostatin M wurde auf das Gel B appliziert. 



  Oncostatin M, das eine PAGE unter nicht reduzierenden Bedingungen unterworfen wurde, hatte ebenfalls ein scheinbares Molekulargewicht von 28 kD und das Protein, welches aus der Bande elektro-eluiert wurde, bewirkte die Hemmung der Proliferation von A375-Zellen. 


 Antikörper gegen ein synthetisches Peptid von Oncostatin M reagieren mit <1><2><5>I-markiertem Oncostatin M als Readioimmuno-Präcipitate 
 


 a) Peptid-Synthese 
 



   Das Peptid entspricht den Resten 6-9 des Oncostatin M-Proteins und wurde durch Festphasen-Techniken auf einem automatischen Beckmann-Gerät durchgeführt, wie beschrieben durch Gentry et al., J. Biol. Chem. (1983) 258: 11 219). Das Peptide wurde vom Harz unter Verwendung des "low-high"-HF-Verfahrens gelöst (Tam et al., J. Amer. Chem. Soc. (1983) 105: 6442-6445). Die Reinigung wurde durch präparative HPLC durchgeführt. 


 b) Herstellung von Antikörpern 
 



  Das Peptid wurde an bovines  gamma -Globulin, wie beschrieben durch Gentry und Lawton gekoppelt (Virology (1986) 152: 421-431). Weisse Neuseeland-Kaninchen wurden  subcutan behandelt und nachbehandelt (fünfmal) an vier Stellen, wie beschrieben durch Gentry und Lawton (Virology (1986) 152: 421-431). Die Antiseren wurden 2 Wochen nach der fünften Nachbehandlung erhalten. 


 c) Iodierung von Oncostatin M 
 



  Eine Probe von partiell gereinigtem Oncostatin M wurde mit Iod-125 markiert, wobei publizierte Verfahren verwendet wurden (Linsley et al., PNAS (1985) 82: 356-360). Ein Aliquot der markierten Zubereitung, welcher 100 000 cpm enthielt, wurde mit Kaninchen-Antiserum, welches gegen die N-terminalen 17 Aminosäuren von Oncostatin M (Endverdünngung von 1:20) gerichtet war, in Abwesenheit oder Gegenwart des N-terminalen Peptides (die N-terminalen 17 Aminosäuren von Oncostatin M) (2  mu g) gemischt und einer Immuno-Präcipitations-Analyse wie durch Linsley et al., Biochemistry (1986), 25: 2978-2986, beschrieben. 



  Ein Röhrchen, das 5 l enthielt wurde mit 2  mu g des N-terminalen Peptides in 10 ml TNEN (20 mM Tris pH 7,5, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,05% Nonidet P-40), das 0,1% BSA enthielt, während 30 Min. bei 4 DEG C vorinkubiert, bevor I<1><2><5> Oncostatin M in 85  lambda  TNEN, welcher 0,1% BSA und 40 mM Dithioerithrit (DTT) enthielt, zugegeben wurde. 7 Röhrchen, die 5  mu l Antiserum enthielten wurden mit I125 Oncostatin M in 85  lambda l TNEN, welches 0,1% BSA und 40 mM DTT enthielt, während 30 Min. bei 4 DEG C inkubiert, bevor 50  mu l von Formalin-fixiertem Staphylococcus aureus (Pansorbin, Calbiochem) zugegeben wurde. 



  Im Anschluss an eine zusätzliche Inkubation während 30 Min. bei 4 DEG C wurden die Röhrchen mittels einer Mikrozentrifuge zentrifugiert und die Kügelchen wurden 4 x mit 1 ml  TNEN gewaschen, bevor sie einer PAGE-Analyse unterworfen wurden. Ein diffuses Band beim Mr = 32 kD wurde nach der SDS/PAGE-Analyse des Immuno-Präcipitates beobachtet. Die Ausfällung dieser Spezies wurde gehemmt durch Einschluss eines Überschusses an unmarkiertem Peptid, welches den N-terminalen 17 Aminosäuren von Oncostatin M entsprach, was anzeigt, dass die Präcipitation für dieses Peptid spezifisch war. 



  Die Kohlehydrat-Zusammensetzung von Oncostatin M wurde geprüft, indem sie auf Glykosidase-Empfindlichkeit getestet wurde. Die Immuno-Präcipitate, wie sie gemäss dem obigen Absatz c) hergestellt wurden, wurden mit Pufferlösung, Endoglykosidase H oder Neuraminidase behandelt, wie durch Linsley et al., (1986) beschrieben. Die Behandlung mit Endoglykosidase H, einem Enzym mit einer Spezifität für N-gebundene, hohe Mannose-Oligosaccharide, resultierte in der Erscheinung einer Sorte mit niederem Molekulargewicht von Mr = 24 kD. Nur ein Teil des radio-markierten Materials war gegenüber diesem Enzym empfindlich, was zeigte, dass nicht alle Moleküle hohe Mannose-Oligosaccharide enthielten.

  Die Behandlung mit Neuraminidase resultierte in der Erscheinung einer einzelnen Bande von Mr = 27 kD, anzeigte, dass die Grössen-Heterogenität von unbehandeltem <1><2><5>I-markiertem Oncostatin M seine Ursache in der molekularen Heterogenität der Sialysierung des Glykoproteinkerns hatte. Die Resultate zeigten, dass die aktiven Präparate von Oncostatin M eine Mischung von hoher Mannose und Komplex-N-gebundenen Oligosaccharid-Seitenketten war. 



  Oncostatin M, welches aus normalen, humanen, peripheren Blutlymphocyten (PBL) isoliert ist 


 Herstellung eines Tumor-Zellwachstums-Inhibitors aus PBL 
 



  Leukofraktionen, welche PBL enthielten, welche von einer Blutbank erhalten wurden, wurden 1:1 mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (pH 7,4) (PBS) verdünnt. 35 ml verdünntes Blut wurde mit 10 ml einer Lösung unterschichtet, welche aus 9 & Ficoll bestand, welches 20 Vol.-% 50% Natriumdiatrizoat enthielt (finales, spezifisches Gewicht 1,080). Die Gradienten wurden bei Zimmertemperatur während 20 Min. mit 850 x g zentrifugiert. Die Zellen wurden aus der Gradienten-Zwischenschicht gewonnen und mit PBS gewaschen. Die roten Blutkörperchen wurden während 3 bis 4 Min. mit 10 bis 20 ml einer Lösung, die 0,8% Ammoniumchlorid und 0,1% Na4-EDTA enthielt, schock-lysiert. 



  Die Zellen wurden aus der lysierten Lösung der roten Blutkörperchen durch Zentrifugation bei 600 x g während 10 Min. gewonnen und 10 ml RPMI-1640-Medium (GIBCO), die 5% fötales, bovines Serum enthielt, resuspendiert. Es wurde Thrombin bis zu einer finalen Konzentration von 0,5 U/ml zugegeben. Die Zellsuspension wurde während 5 Min. bei 37 DEG C gerührt und anschliessend wurde sie 5 Min. stehengelassen, damit sich das Plättchen-Aggregat absetzen konnte. Die suspendierten Zellen wurden in neue Röhrchen transferiert, wiederum durch Zentrifugation isoliert und in 1 ml fötalem, bovinem Serum resuspendiert und in eine Säule transferiert, die 0,5 g gebürstete, vorgenetzte Nylon-Wolle des Typs 200 (Fenwal) enthielt. 



  Die Nylon-Woll-Kolonne wurde bei 37 DEG C während 60 Min. in kubiert, um die Bindung der Monocyten und B-Lymphocyten zu ermöglichen. Die Säule wurde dann mit 3 x Volumen RPMI-1640-Medium (37 DEG C), welches 5% fötales, bovines Serum enthielt, gewaschen und dann wurden die nicht gebundenen Zellen (PBL) gesammelt. 



  Die PBL (2 x 10<6> Zellen/ml) wurden bei 37 DEG C mit 5% CO2-95% Luft während 96 Std. in RPMI-1640-Medium (10,4 g/l), welches FeSO4 . 7H2O ( 1 mg/l ), ZnSO4 . 7H2O ( 2 mg/l ) Na2SeO3 . 5H2O (0,017 mg/l), 1-Aminoethanol (1 mg/l) humanes Transferrin (5 mg/l), bovines Serumalbumin-Linolsäurekonjugat (Sigma) (200 mg/l), L-Glutamin (300 mg/l), Penicillin/Streptomycin (100 000 Einheiten/l) und Phytohämagglutinin-P (Wellcome) (2 mg/l) enthielt, kultiviert. Die Überstände wurden gesammelt und zur Entfernung der Zellen zentrifugiert, durch Ultrafiltration (Amicon Diaflo-Membrane YM-10, 10 Kd cut-off) konzentriert und gegen 0,1 M Essigsäure (Spectrapore 3-Dialyseschlauch) dialysiert. Die geklärte, zurückgehaltene Lösung wurde gefriergetrocknet. 


 Gel-Permeations-Chromatographie 
 



   Die rohe Fraktion wurde in 20 ml 1 M Essigsäure (50 mg/ml) rekonstituiert und auf eine BioGel-P-100-Säule (2,6 x 88 cm) appliziert, welche mit 1 M Essigsäure mit einer Fliessgeschwindigkeit von 0,5 ml/Min. equilibriert war. Es wurden 12 ml-Fraktionen gesammelt. Ein Aliquot von jeder Fraktion wurde eingedampft und dreifach auf Wachstums-Hemmungs-Aktivität (GIA) gegen A375-Zellen getestet. Die aktiven Fraktionen wurden gepoolt, lyophilisiert und auf einer Bio-Sil TSK-250-Säule (600 x 21,5 mm), wie beschrieben, rechromatographiert. 


 Umkehrphasen-Hochdruckchromatographie von TSK-250-Fraktionen 
 



  Die Endreinigung der gepoolten TSK-250-Fraktionen wurde durch Umkehrphasen-HPLC erzielt, im wesentlichen wie beschrieben. Der PBL-derivierte Tumorzellen-Inhibitor wurde aus  mu -Bondapak-C18-Trägern bei Konzentrationen von 40 bis 41% Acetonitril bzw. 26,5% n-Propanol eluiert. 


 Zellwachstums-Modulations-Test unter Verwendung von <1><2><5>I-Ioddesoxyuridin-Einverleibung in DNA (GIA) 
 



  Diese Tests wurden in 96-Loch-Kulturschalen mit flachem Boden (Costar 3596) durchgeführt. Humane Melanomzellen, A375 (4 x 10<3> ) in 50 l Testprobe wurden in jedes Loch gegeben und während 3 Tagen bei 37 DEG C inkubiert. Die Zellen wurden 24 Std. mit <1><2><5>I-IdU (0,05 Ci/Loch) markiert und zusätzliche 24 Std. inkubiert. Die Zellen wurden dreimal gewaschen und mit einem Mehrfach-Proben-Ernter geerntet und die Radioaktivität wurde in einem  gamma -Zähler gezählt. 


 Resultate 
 



  Ein Präparat von PBL-deriviertem Tumorzellen-Inhibitor wurde einem automatischen repititiven Edman-Abbau unterworfen. Die Amino-terminale Aminosäure-Sequenz ist die folgende: 
EMI38.1
 



  X bedeutet eine Aminosäure, dle noch nicht identifiziert wurde. 



  Ein Verqleich dieser Sequenz mit derjenigen des U937-Faktors zeigt klar die Identität mlt dem N-Terminus des PBL-derlvierten Faktors. 
EMI39.1
 



  In der nächsten Studie wurde die Fähigkeit von PBL-deriviertem Oncostatin M erforscht, die Replikation einer Zellsorte zu bewirken. Es wurde gefunden, dass die L929-Mäusezellen unempfindlich gegen PBL-deriviertes Oncostatin M waren, wenn bis zu 1000 GIA-Einheiten/ml verwendet wurden. Humane Fibroblasten WI26 wurden zum Wachstum stimuliert, wenn mit 1000 GIA-Einheiten/ml behandelt wurde. 72 Std. nach der Mitogenese wurde die Proliferation von normalen, humanen T-Lymphocyten nicht bewirkt bei bis zu 500 GIA-Einheiten/ml. 



  Es ist naheliegend aus den obigen Resultaten, dass ein neues Polypeptid und Polypeptid-Fragmente vorliegen, welche für die Modulation des Zellwachstums verwendet werden können. Es wurde gefunden, dass die Verbindungen eine variierende Aktivität, je nach der Natur der involvierten Zellinie, besitzen, so dass sie als solche oder in Konjugation mit anderen Komponenten bei der Modulierung des Zellwachstums verwendet werden können. Die erfindungsgemässen Polypeptide stellen demzufolge zusätzliche Polypeptide dar, welche mit Zellmischungen sowohl in vivo wie auch in vitro verwendet werden können, um  cellulare Proliferation eines besonderen Zelltypes zu reduzieren oder zu erhöhen. 



  Insbesondere kann der Faktor verwendet werden, um Zellen für autologe Knochenmarktransplantationen zu behandeln. Die Verwendung des Faktors hemmt das Wachstum von Tumorzellen im Knochenmark und kann die Bildung von Zellkolonien stimulieren. Oncostatin M kann ebenfalls verwendet werden, um das Wachstum von epithelialen Zellen zu stimulieren, wobei die Wundheilung gefördert wird. Zusätzlich können die intakten Polypeptide oder Fragmente davon als Immunogene verwendet werden, um die Antikörperbildung einzuleiten. Die eingeleiteten Antikörper finden Verwendung, um Oncostatin M, welches in einer Körperflüssigkeit vorhanden ist, zu titrieren oder die Aktivität des Faktors zu modulieren, indem er gebunden wird.

   Weiter können diese Antikörper zusammen mit gereinigtem Oncostatin M oder von Fragmenten davon als Komponenten von diagnostischen Ausrüstungen verwendet werden, in Konjugation mit anderen Reagenzien, insbesondere Antikörper zum qualitativen und quantitativen Nachweis von Oncostatin M. 



  Obschon die vorliegende Erfindung zum besseren Verständnis und zwecks Klarheit durch Erläuterungen und Beispiele im einzelnen beschrieben ist, ist es naheliegend, dass gewisse Änderungen und Modifikationen innerhalb des Definitionsbereichs der beiliegenden Ansprüche liegen. 

Claims (20)

1. Polyaminosäure mit mindestens acht Aminosäuren, welche immunologisch kreuzreaktiv ist mit einer Verbindung, die ein Polypeptid darstellt, das aus Leukocyten erhalten werden kann, das fähig ist, die Proliferation von neoplastischen Zellen zu hemmen, die Proliferation von normalen, humanen Fibroblasten stimulieren kann, humane, proliferative und cytotoxische T-Zell-Antworten nicht hemmen kann und granulocytische/myelocytische Knochenmark-Zellbildung nicht hemmen kann, ein Molekulargewicht im Bereich von 17 bis 19 ku (kD), bestimmt durch Gel-Ausschluss-Chromatographie, aufweist und ein Molekulargewicht von ungefähr 28 ku (kD), bestimmt durch SDS-PAGE, aufweist und verhältnismässig unempfindlich auf mittelstarke Säure und Basen und Temperaturen von etwa 56 DEG C ist.

2.

Polyaminosäure gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Aminosäure-Sequenz von mindestens 10 aufeinanderfolgenden Aminosäuren aufweist, welche einer der nachstehenden Aminosäure-Sequenzen entspricht: EMI41.1 oder sich von einer dieser Sequenzen nicht durch mehr als drei Aminosäuren unterscheidet.

3. Polyaminosäure gemäss Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass sie 12 aufeinanderfolgende Aminosäuren aufweist, die einer der in Anspruch 2 angegebenen Aminosäure-Sequenzen entspricht oder sich von diesen Sequenzen durch nicht mehr als eine Aminosäure unterscheidet, wobei der Unterschied entweder eine Deletion oder eine konservative Substitution sein kann.

4.

Konjugiertes Polypeptid, dadurch gekennzeichnet, dass es folgende Eigenschaften aufweist: die Proliferation von neoplastischen Zellen hemmen kann, die Proliferation von normalen, humanen Fibroblasten stimulieren kann, humane, proliferative und cytotoxische T-Zell-Antworten nicht hemmt und die Bildung von granulocytischen und myelocytischen Knochenmark-Zellkolonien-Bildung nicht hemmt, ein Molekulargewicht im Bereich von 17 bis 19 ku (kD), bestimmt durch Gel-Ausschluss-Chromatographie, aufweist und von etwa 28 ku (kD), bestimmt durch SDS-PAGE, aufweist und verhältnismässig unempfindlich gegen mittelstarke Säuren und Basen und Temperaturen von etwa 56 DEG C ist; und eine Reinheit aufweist, die eine spezifische Aktivität von mindestens 10 GIA-Einheiten/ng Protein besitzt.

5.

Konjugiertes Polypeptid gemäss Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass es im wesentlichen frei von Zell-Komponenten ist.

6. Konjugiertes Polypeptid gemäss Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die spezifische Aktivität des Polypeptides mindestens 100 GIA-Einheiten/ng Protein aufweist.

7. Polypeptid, das im wesentlichen frei von Zellbestandteilen und anderen leukocytischen Proteinen ist, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid die Proliferation von neoplastischen Zellen verhindern kann, die Antwort von humanen, proliferativen und cytotoxischen T-Zellen nicht hemmt und die Bildung von granulocytischen/myelocytischen Knochenmark-Zellkolonien nicht hemmt, ein Molekulargewicht im Bereich von 17 bis 19 ku (kD), bestimmt durch Gel-Ausschluss-Chromatographie, aufweist und von etwa 28 ku (kD), bestimmt durch SDS-PAGE,

besitzt und verhältnismässig unempfindlich gegen mittelstarke Säuren und Basen und bei Temperaturen von etwa 56 DEG C ist und eine Aminosäure-Sequenz aufweist, die einer der nachstehenden Sequenzen entspricht: EMI43.1 oder sich durch nicht mehr als drei Aminosäuren von den angegebenen Sequenzen unterscheidet.

8. Polypeptid gemäss Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass sich die entsprechende Sequenz durch nicht mehr als eine Aminosäure von den in Anspruch 7 angegebenen Sequenzen unterscheidet.

9. Verfahren zur Herstellung eines konjugierten Polypeptids gemäss Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass Leukocyten gezüchtet werden, die mitogen-aktivierte, normale, humane, peripherale Blutlymphocyten sind und daraus das konjugierte Polypeptid gewonnen wird.

10.

Verfahren zur Herstellung eines konjugierten Polypeptids gemäss Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass Leukocyten gezüchtet werden, die phorbol-diester-induzierte, humane, histiocytische Lymphoma-Zellen sind und daraus das konjugierte Polypeptid gewonnen wird.

11. Verfahren zur Herstellung eines konjugierten Polypeptids gemäss Anspruch 4, das aus induzierten, humanen, histiocytischen Lymphoma-Zellen erhältlich ist und folgende Sequenz in der Nähe des N-Terminus aufweist:

: X-X-I-G-S-X-S-K-E-Y-R-V-L-L-G-Q-L-X-K-X worin X irgendeine Aminosäure bedeutet, dadurch gekennzeichnet, dass eine Zellkultur gezüchtet wird, welche Zellen enthält, die eine Expressionskonstruktion besitzen, die eine DNA- Sequenz enthält, welche unter der regulierenden Steuerung von funktionellen transkriptionalen und translationalen Steuersignalen das Polypeptid in den Zellen codiert und daraus das konjugierte Polypeptid, das im wesentlichen frei von zellulärem Material ist, gewonnen wird.

12. Verfahren zur in vitro-Hemmung der Wucherung von neoplastischen Zellen, dadurch gekennzeichnet, dass man die genannten Zellen mit einem proliferationshemmenden Anteil des konjugierten Polypeptids gemäss Anspruch 6 in Kontakt bringt.

13.

Mittel zur Verbesserung der Wundheilung, dadurch gekennzeichnet, dass es einen die Proliferation der Fibroblasten stimulierenden Anteil eines konjugierten Polypeptides gemäss Anspruch 6 enthält.

14. Antikörper, dadurch gekennzeichnet, dass er spezifisch gegen eine Polyaminosäure gemäss Anspruch 1 oder gegen ein konjugiertes Polypeptid gemäss Anspruch 4 ist.

15. Antikörper gemäss Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass er ein monoklonaler Antikörper ist.

16. Verfahren zum Nachweis der Gegenwart eines konjugierten Polypeptides gemäss Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass es folgende Schritte umfasst: Kombination der zu untersuchenden Substanz-Probe mit einem Antikörper gemäss Anspruch 14, Bestimmung des Anteiles der Komplexbildung mit dem genannten Antikörper.

17.

Diagnostische Ausrüstung, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen Antikörper gemäss Anspruch 14 und mindestens eine Polyaminosäure gemäss Anspruch 1 oder ein konjugiertes Polypeptid gemäss Anspruch 6 enthält.

18. DNA-Sequenz zur Herstellung eines Polypeptids gemäss Anspruch 7.

19. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptides gemäss Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass eine Zellkultur gezüchtet wird, welche eine Expressions-Konstruktion aufweist, die eine DNA-Sequenz gemäss Anspruch 18 enthält, unter der regelnden Kontrolle der Regelungssignale für die Transkription und Translation in den genannten Zellen, wobei das genannte Polypeptid exprimiert wird; und dass das Polypeptid, welches im wesentlichen frei an Zellbestandteilen ist, isoliert wird.

20.

Verfahren gemäss Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die entsprechende Sequenz durch nicht mehr als eine Aminosäure von der genannten, im Anspruch 7 definierten, Sequenz verschieden ist.