Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue Rekombination-Plasmid-DNS pPR-IFN beta 1-13, die die Synthese des menschlichen Fibroblast- beta 1-Interferons kodiert, ein Verfahren zu ihrer Erzeugung und einen Stamm der Bakterien Escherichia coli VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IFN beta 1-13)-Produzent des menschlichen beta 1-Interferons, der dieselbe enthält.
Stand der Technik
Interferone sind Eiweissstoffe, die von den spezialisierten Menschenzellen als Antwort auf eine Virus-Infektion beziehungsweise auf die Wirkung verschiedener Induktoren synthesiert werden. Die zurzeit vorliegenden experimentellen Angaben zeugen von der Antiviren-, antiproliferativen und immunmodulierenden Wirkung des Interferons bei der Behandlung mit demselben von individuellen Zellen, Geweben und eines Organismus insgesamt. In seinen universellen Anwendungsmöglichkeiten und in seiner Bedeutug für den Organismus ist das Interferon-System mit dem Immunitäts-System vergleichbar.
In Übereinstimung mit den biologischen, chemischen und Antigeneigenschaften sowie in Abhängigkeit vom Typ der Zellen, die sie produzieren, werden die Menschen-Interferone in drei Gruppen geteilt: alpha -Leukozyten, beta -Fibroblast- und gamma -Immun-Interferone, die hauptsächlich von den Zellen der Leukozyte, Fibroblaste bzw. T-Lymphozyte erzeugt werden. Gegenwärtig sind die Anwendungsbereiche der Interferone in der Medizin im grossen und ganzen festgelegt.
Da sind Keratite und Dermatosen, die Behandlung von respiratorischen Infektionen, die durch verschiedene Viren (Grippe, Adenoviren), Hepatitis B und andere provoziert werden.
Der Wirkungsmechanismus der Interferone, ihre strukturellen und funktionellen Besonderheiten und ihr klinisches Potential sind jedoch noch unzureichend untersucht. Das ist in vielem auf die Schwierigkeit der Gewinnung präparativer Mengen reiner Interferone in konventionellen Verfahren zurückzuführen, die auf der Verwendung induzierter Kulturen von Menschenzellen als Quellen dieses Eiweissstoffes beruhen. Der in diesem Fall synthetisierte Interferon stellt ausserdem in der Regel ein kompliziertes Gemisch aus seinen verschiedenen Untertypen und Formen dar, die sich durch ihre strukturellen und funktionellen Kenndaten, unterscheiden. Das kompliziert wesentlich die Untersuchung der Eigenschaften individueller Interferone. In diesem Zusammenhang erfährt die Gewinnung individueller Interferone durch mikrobiologische Synthese eine immer grössere Verbreitung.
Bekannt ist eine Reihe von Verfahren zur Gewinnung von alpha -, beta - und gamma -Menschen-Interferone, die auf der Verwendung von Bakterien als Produzenten, insbesondere verschiedener Stämme von Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas sp., beruhen, die in ihrer Zusammensetzung Rekombination-Plasmid-DNS enthalten, die die Expression heterologischer Gene in einer neuen genetischen Umgebung bewirken. Im Falle mit dem menschlichen Fibroblast-Interferon (IFN beta 1) wurde zur Erreichung der Expression des Gens IFN beta 1-Gens in den E.coli-Zellen der kodierende Teil des reifen Interferons unter die Kontrolle der Signale der Transkription und Translation der Gene (tuf B, rec A) und Operone (lac UV 5 trp) E.coli und Koliphagen (PL lambda ) gestellt.
Der im Ergebnis der mikrobiologischen Synthese entstehende reife beta 1-Interferon (mit einer Molekularmasse von &tilde& 19 000 Dalton) wird durch das Fehlen einer Kohlenhydratkomponente und durch das Vorliegen eines Formyl-Methionin-N-endrestes anstelle des Methioninrestes charakterisiert. Dieser Unterschied führt jedoch nicht zur Veränderung der biologischen Aktivität des Eiweissproduktes, des IFN beta 1-Gens im Vergleich zum natürlichen Glykoprotein, das in den Fibroblast-Zellen produziert wird. Der im genannten mikrobiologischen Verfahren synthetisierte beta 1-Interferon kann sowohl für die Untersuchung molekularer Mechanismen der Wechselwirkung mit Zellen-Rezeptoren als auch in der medizinischen Praxis zum Einsatz kommen.
Bekannt sind Rekombination-Plasmid-DNS, die die Synthese des menschlichen Fibroblast- beta 1-Interferons kodieren, solche wie pC1857 und pPL c 245HFIF25 und E.coli-Stamm SG40444, der die genannten Plasmide enthält (Remaut E, Staussens P., Fiers G, 1983, Nucl. Acida Res. 11, 4677-4688).
In der Zusammensetzung der Rekombination-Plasmid-DNS pPLc245HFIF25 wird die Transkription des IFN beta 1-Gens durch ein Regulator-Element PLOL der lambda -Bakteriophage kontrolliert, und die Einleitung der Translation des Eiweissproduktes des Gens wird auf Kosten des Konstruierens eines Hybridabschnitts der Verknüpfung von Ribosomen auf der Grundlage der SD-Sequenz eines Replikase-Gens der MS2-Phage bewirkt. Die maximale Ausbeute an menschlichem beta 1-Interferon, die durch das Kultivieren des genannten Stammes gesichert wird, beträgt 4%, bezogen auf den Gesamteiweissgehalt der plasmidhaltigen E.coli-Zellen.
Der genannte Stamm wird dadurch gekennzeichnet, dass die regulierbare Expression des IFN beta 1-Gens, die vom PL-Promotor bewirkt wird, eines zusätzlichen pC1857-Plasmids mit einem auf demselben angeordneten temperaturempfindlichen Regulator-Gen cIts857 der lambda -Phage bedarf. Das führt zu einer potentiellen Instabilität der Rekombination-Plasmid unter den Bedingungen der Kultivierung des Stammes in der grosstechnischen Produktion auf Kosten einer recA-abhängigen Rekombination zwischen den Plasmiden pC1857 und pPLc245HFIF25 nach den Homologie-Bereichen.
Die Verwendung für die Organisation eines Hybridabschnit tes der Verknüpfung der Ribosome einer relativ nichtlangen SD-Sequenz der Replikase-Gens der MS2-Phage ermöglicht es ausserdem nicht, in einem vollen Masse die potentielle Leistung des Translationsapparates von E.coli infolge einer ungenügend effektiven Wechselwirkung mit den Ribosomen bei der Einleitung der Translation des Fibroblast-Interferons zu realisieren. Gleichzeitig verursacht das Fehlen in dem nichttranslationsbaren 3<1>-Endbereich des IFN beta 1-Gens am Plasmid pPLc245HFI25 von rho -unabhängigen Terminatoren der Transkription eine wesentliche Verringerung der Kopienerzeugung und sogar den eventuellen Verlust des Rekombination-Plasmids unter den Bedingungen der Depression des hocheffektiven PL-Promotors der lambda -Phage, die den Start der Transkription des IFN beta 1-Gens bewirkt.
All das gestattet es nicht, ein hohes Niveau der Synthese des Produktes des IFN beta 1-Gens zu erreichen und kann zur weiteren Verringerung des Gehaltes an beta 1-Interferons in der Biomasse eines Produzenten-Stammes bei seiner grosstechnischen Kultivierung führen, was die Isolierung des reinen Eiweissstoffes kompliziert und die Ausbeute an Endprodukt verringert.
Darstellung der Erfindung
Die Rekombination-Plasmid-DNS pPR-IFN beta 1-13, das Verfahren zu ihrem Konstruieren und der Stamm der Bakteriene Escherichia coli VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IFN beta 1-13), der dieselbe enthält, sind neu und wurden in der Literatur nicht beschrieben.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine neue Rekombination-Plasmid-DNS, die die Synthese des menschlichen Fibroblast- beta 1-Interferons kodiert, ein Verfahren zu ihrem Konstruieren und einen neuen hochproduktiven Produzenten-Stamm des menschlichen beta 1-Interferons, der dieselbe enthält, welches die Herstellung des beta 1-Interferons in einer hohen Ausbeute gewährleistet, zu entwickeln.
Die Aufgabe wurde durch die kennzeichnenden Merkmale von Anspruch 1 gelöst.
Erfindungsgemässe Rekombination-Plasmid-DNSpPR-IFN beta 1-13 bewirkt die Expression des IFN beta 1-Gens unter Kontrolle des Regulator-Bereiches PROR der lambda -Bakteriphage. Das cITs857-Gen, das Regulator der Einleitung der Transkription von den früheren Promotoren der lambda -Bakteriophage ist, und das IFN beta 1-Gen, das sich unter Kontrolle des PR-Promotors befindet, sind in der Zusammensetzung eines und desselben Rekombination-Plasmids pPR-IFN beta 1-13 angeordnet. Dieser Umstand ermöglicht es, die potentielle Instabilität beim Kultivieren eines Stammes mit einem Rekombination-DNS-Molekül zu vermeiden, weil in der von uns vorgeschlagenen Konstruktion keine recA-abhängige Rekombination infolge des Fehlens eines zusätzlichen Plasmids in dem Produzenten-Stamm entsteht.
Zur Erfindung gehört auch ein Verfahren zum Konstruieren einer Rekombination-Plasmid-DNS pPR-IFN beta 1-13 gemäss Anspruch 2.
Die Anwendung des Verfahrens zum Konstruieren des Rekombination-Plasmids pPR-IFN beta 1-13, bei dem die von den für die Matrix-RNS E.coli bekannten Koliphagen besonders lange SD-Sequenz des cro-Gens der lambda -Bakteriophage mit dem kodierenden Teil des reifen menschlichen beta 1-Interferons gekoppelt wird, führt zur Organisation eines Hybridabschnitts der Verknüpfung der Ribosome des IFN beta 1-Gens mit der optimalen primären und räumlichen Struktur des 5<1>-Endbereiches der Matrix-RNS.
Im Unterschied zum bekannten Verfahren sichert das erfindungsgemässe Verfahren zum Konstruieren auch das Vorliegen in dem 3<1>-nichttranslationsbaren Bereich des IFN beta 1-Gens am pPR-IFN beta 1-13-Plasmid eines Tandems der rho -abhängigen Terminatoren der Transkription, was die Interferenz zwischen der Replikation der Plasmid-DNS und der hocheffektiven Transkription des Gens des Fibroblast-Interferons unter den Verhältnissen der Depression des PR-Promotors verhindert.
Ausser dem genannten gehört zur Erfindung auch ein Stamm der Bakterien Escherichia coli VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IFN beta 1-13), der Produzent des menschlichen beta 1-Interferons, der die erfindungsgemässe Rekombination-Plasmid-DNS pPR-IFN beta 1-13 enthält und der im gentechnischen Verfahren durch Einführen der Rekombination-Plasmid-DNS pPR-IFN beta 1-13 in Bakterien Escherichia coli erzeugt wurde, der am 12.01.1987 in der Kollektion der Kulturen der Mikroorganismen des Unions-Forschungsinstitutes für Antibiotika, UdSSR, Moskau, Nagatinskaya ulitsa, 3a, deponiert und unter Nr. 1825 registriert wurde.
Der erfindungsgemässe Stamm ermöglicht es, eine stabile Speicherung des menschlichen beta 1-Interferons unter den Verhältnissen einer grosstechnischen Kultivierung zu gewährleisten und eine Ausbeute an Endprodukt über 2 x 10<9> Einheiten/l zu erreichen, was 5 bis 10%, bezogen auf die Gesamtmenge des Zelleneiweissstoffes, entspricht.
Bester Weg zur Ausführung der Erfindung
Das Verfahren zum Konstruieren der erfindungsgemässen Rekombination-Plasmid-DNS pPR-IFN beta 1-13 erfolgt in mehreren Etappen.
In der ersten Etappe erfolgt das Konstruieren eines Vektor-Plasmids pPR124 B.
Hierfür wird in der DNS des pPR40-Plasmids [Molekularbiologie, 1987, Band 21, Nr. 5 (Moskau), S. 1309-1321] im Bereich des Abschnitts des Wiedererkennens der Restriktase Bgl II die Deletion mit Hilfe der Exonuklease Bal 31 vorgenommen.
Hierdurch erhält man das Plasmid pPR 100, in dem der Abschnitt des Wiedererkennens BamHI unmittelbar hinter dem Bereich der Verknüpfung der Ribosome der lambda -Page liegt, wobei im Bereich des initiierenden AUG-Kodons folgende Sequenz entsteht:
EMI7.1
Im weiteren wird mit Hilfe der konventionellen gentechnischen Methodiken das kleinere PstI-Bam Hi-Fragment des Plasmids pPR100 mit dem grösseren PstI-Bam HI-Fragment des Plasmids pML 24 unter Entstehung des Plasmids pPR124 gekoppelt, in das man unter Zuhilfenahme eines Oligonukleotid-Linkers einen Abschnitt des Wiedererkennens der Restriktase Bgl II einführt. Man erhält das Plasmid pPR 124B.
Dann erfolgt das Konstruieren eines Zwischen-Plasmids pPR-IFN beta 1-123.
Das konstruierte Vektor-Plasmid pPR 124B spaltet man mit Restriktionsendonukleasen Eco RI und Bgl II und man nimmt die Kopplung des grösseren der entstehenden Fragmente des Vektor-Moleküls mit EcoR I - Sau3A-Fragment vor, das den kodierenden Teil des reifen beta 1-Interferons aus dem Plasmid pIN beta -trp 7 enthält. Man erhält ein Zwischen-Rekombinations-Plasmid pPR-IFN beta 1-123.
Dann wird die dritte Etappe ausgeführt, das Konstruieren des Plasmids pPR-IFN beta 1-13. Hierfür wird in dem Zwischen-Plasmid pPR-IFN beta 1-123 die Annäherung der SD-Sequenz des cro-Gens und des ersten Kodons des beta 1-Interferons vorgenommen, wofür man die Plasmid-DNS mit der Restriktase A Bam HI hydrolysiert, einen Anteil der Nukleoide mit Hilfe der Endonuklease-Aktivität der DNS-Polymerase I E.coli entfernt, die DNS mit der Restriktase E coRI spaltet, mit der SI-Endonuklease mit anschliessender vollständiger Wiederherstellung von Zweiketten-Enden mit Hilfe des Klenowschen Fragmentes der DNS-Polymerase I E.coli behandelt und die Zyklisation der entstandenen linearen DNS-Moleküle mit der DNS-Ligase der T4-Phage bewirkt.
Mit dem hergestellten Präparat werden die Zellen E.coli C600 transformiert, die Transformanten werden einem Nährboden mit Ampizillin bei der Kultivierung von Zellen bei einer Temperatur von 28 DEG C mit anschliessender Selektion auf eine verringerte Wachstumsgeschwindigkeit bei einer Temperatur von 42 DEG C entnommen. Aus den dadurch entnommenen Klonen scheidet man die Plasmid-DNS pPR-IFN beta 1-13 aus.
Der erfindungsgemässe Stamm der Bakterien Escherichia coli VNIIGENETIKA VL 903(pPR-IFN beta 1-13) stellt man durch Transformation des Rezipienten-Stammes mit der Rekombination-Plasmid pPR-IFN beta 1-13 und darauffolgende Entnahme der Rekombination-Klone dem Nährboden mit Ampizillin bei einer Temperatur von 28 DEG C und durch Ermittlung der Aktivität des Fibroblast- beta 1-Interferons in Extrakten der Transormanten-Zellen nach der Depression des PR-Promotors, die durch Kultivierung des Stammes innerhalb von 1 bis 2 h bei einer Temperatur von 42 DEG C erreicht wird, her. Als Rezipient können auch Stämme E.coli C600 und andere Derivate von E.coli K12 eingesetzt werden.
Der Stamm E.coli VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-INF beta 1-13) wird durch folgende Merkmale gekennzeichnet.
Morphologische Merkmale. Zellen sind gerade, stäb chenförmig (1,2-1,6) x (2,0-6,0) mu m, schwachbeweglich, fähig zur Bildung fadenartiger Formen, grammnegativ und nicht sporentragend.
Kulturmerkmale. Zellen wachsen gut an dichten und flüssigen, einfachen, synthetischen, halbsynthetischen und komplexen Nährböden. Beim Wachstum an einem agarisierten Hottinger-Bouillon beziehungsweise am L-Bouillon bilden diese Zellen verschleimte, runde, schwachmattierte Kolonien. Bei der Züchtung an flüssigen Nährböden vom L-Bouillon-Typ oder M9 mit Kasamin-Säure bilden sie eine homogene Suspension.
Physiologisch-biochemische Merkmale. Zellen sind fähig zum Wachstum in einem Temperaturenbereich von 5 bis 40 DEG C (Optimum liegt bei 35 DEG C) bei einem pH-Wert von 6,7 bis 7,5. Als Kohlenstoffquelle verwendet man Aminosäuren und Kohlenhydrate (beispielsweise Saccharose). Als Stickstoffquelle können Mineralsalze in Ammoniumform sowie organische Verbindungen in Form von Pepton, Trypton, Hefeextrakt und Aminosäuren dienen.
Resistenz gegenüber Antibiotika. Der Stamm ist resistent gegen Ampizillin in einer Konzentration von höchstens 100 mg/l bei der Züchtung in flüssigen und in agarisierten Nährböden.
Stabilität des Plasmids. Bei der Zellenlagerung am agarisierten Nährboden (während einer Dauer bis zu 1 Monat), bei einer Reihe von hintereinander folgenden Überimpfungen (innerhalb von mindestens 6 Monaten) und bei der Kultivierung im Submersverfahren in einem flüssigen Nährboden mit einem Antibiotikum ist kein Verlust zu verzeichnen und es erfolgt keine Umwandlung des Plasmids.
Der hergestellte Stamm E.coli VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IFN beta 1-13) ist ein hocheffektiver Produzent des menschlichen Fibroblast- beta 1-Interferons und kann für die grosstechnische Produktion von beta 1-Interferon verwendet werden.
Nachstehend wird die Erfindung anhand von Beispielen der Durchführung eines Verfahrens zum Konstruieren des erfindungsgemässen Plasmids, eines Verfahrens zur Herstellung des Stammes und seiner Kultivierung erläutert und durch folgende Figuren veranschaulicht, in denen es zeigen:
Fig. 1 physikalisch-genetische Karte des Rekombination-Plasmids pPR-IFN beta 1-13;
Fig. 2 Schema der Herstellung des erfindungsgemässen Plasmids pPR-IFN beta 1-13.
Beispiel 1
Rekombination-Plasmid pPR-IFN beta 1-13 (Fig. 1) stellt man in mehreren Etappen her. Erste Etappe - Konstruieren des Vektor-Plasmids pPR 124 B.
Hierfür wird das Plasmid pPR 124 wie folgt konstruiert: 3 mu g DNS des Plasmids pPR 40 spaltet man mit der Restriktase Bgl II in 60 mu l Pufferlösung für Restriktion-1, die 10 mMol tris-HCl pH-Wert 8,0 6 mMol MgCl2, 6 mMol 2-Merkaptoäthanol und 150 mMol NaCl enthält. Die DNS wird mit zwei Äthanol-Volumina umgefällt. Den Niederschlag löst man in 20 mu l H2O auf. Die Behandlung der DNS mit der Exonuklease Bal 31 führt man innerhalb von 3 min bei einer Temperatur von 30 DEG C in 30 mu l Pufferlösung durch, die 3 mMol NaCl, 60 mMol CaCl2, 60 mMol MgCl2, 100 mMol tris-HCl pH-Wert 8,0, 5 mMol Äthylendiamintetraessigsäure enthält. Die DNS wird mit zwei Volumina Äthanol umgefällt. Den Niederschlag löst man in 10 mu l H2O auf. Die Behandlung mit Restriktase Bam HI führt man in einer Probe mit einem Volumen von 30 mu l durch, die die genannte Pufferlösung für die Restriktion-1 enthält.
Die Nachbildung der Einketten-3 min -Endabschnitte der DNS führt man mittels Bearbeitung mit dem Klenowschen Fragment der DNS-Polymerase I E.coli in einer Probe mit einem Volumen von 20 mu l durch, die 10 mMol tris-HCl (pH-Wert 8,0), 10 mMol MgCl2, 2 mu g eines DNS-Präparates, je 30 mu Mol jedes der Desoxyribonukleosidtriphosphate und 5 Einheiten eines Fermenten enthält. Die DNS wird aus dem Reaktionsgemisch mit Äthanol umgefällt und in 100 mu l H2O aufgelöst. Die Vereinigung der linearisierten Plasmid-DNS führt man bei einer Temperatur von 16 DEG C innerhalb von 12 h mit Hilfe der DNS-Ligase der T4-Phage in einer Probe durch, die eine Pufferlösung für Ligierung [60 mMol tris-HCl (pH-Wert von 7,6), 10 mMol MgCl2, 10 mMol 2-Merkaptoäthanol, 0,4 mMol Adenosintriphosphat] und 1 mu g DNS enthält. Mit dem hergestellten Gemisch werden die Zellen E.coli C600 transformiert.
Die Effektivität der Transformation beträgt bis 5.10<6> Kolonien je 1 mu g des nativen Plasmids pPR40. Man wählt Klone aus, die gegen Ampizillin (100 mu g/l) resistent sind, aus ihnen scheidet man die Plasmid-DNS nach der modifizierten Birboim-Methode und Doly-Methode aus und verwendet man für die Restriktionsanalyse. Im Ergebnis erhält man das Plasmid pPR100, das einen unikalen Abschnitt der Spaltung von BamHI aufweist. Danach führt man das Konstruieren des Plasmids pPR124 durch.
Hierfür werden 2 mu g DNS des Plasmids pML24 zusammen mit den Restriktasen BamHI und PstI in 40 mu l Pufferlösung für Restriktion-1 gespaltet. Man vereinigt diese mit Hilfe der DNS-Ligase der T4-Phage bei 0 DEG C mit den Fragmenten, die bei der Hydrolyse der DNS des Plasmids pPR100 mit den Restriktasen Bam HI und PstI erzeugt wurden. Mit dem hergestellten DNS-Präparat transformiert man die Zellen E.coli C600 mit Auswahl der Transformanten an einem Nährboden mit Ampizillin mit anschliessender Selektion von Cm<r>-Klonen auf einem Nährboden mit 300 mu g/l Chloramphenikol bei der Kultivierung der Zellen bei einer Temperatur von 42 DEG C. Aus den dadurch ausgewählten Klonen wird die Plasmid-DNS ausgeschieden und mit Hilfe der Restriktionsanalyse untersucht. Im Ergebnis erhält man das Plasmid pPR 124, das einen unikalen Abschnitt der Spaltung mit der Restriktase BamHI enthält.
Dann werden 3 mu g DNK des Plasmids pPR 124 mit Restriktase Xbal in 70 mu l Pufferlösung für Restriktion-1 gespaltet, die 10 mMol tris-HCl (pH-Wert 7,9), 6 mMol MgCl2, 6 mMol 2-Merkaptoäthanol und 150 mMol NaCl enthält. Die DNS wird mit zwei Volumina des Äthanols umgefällt. Der Niederschlag wird in 15 mu l H2O aufgelöst. Die Nachbildung der Einketten-3<1>-Endabschnitte der DNS führt man durch Behandlung mit dem Klenowschen Fragment der DNS-Polymerase I E.coli in einer Probe mit einem Volumen von 20 mu l durch, die 10 mMol tris-HCl (pH-Wert 8,0), 10 mMol MgCl2, 2 mu g DNS-Präparat, je 30 mu Mol Desoxyribonukleosidtriphosphate und 5 Einheiten eines Fermenten enthält.
Die DNS wird aus dem Reaktionsgemisch mit Äthanol umgefällt und in 100 mu l H2O aufgelöst. Die Wiedervereinigung der linearisierten Plasmid-DNS mit Bgl II-Linkern führt man bei einer Temperatur von 16 DEG C innerhalb von 12 h mit Hilfe der DNS-Ligase der T4-Phage in einer Probe durch, die eine Pufferlösung für Ligierung 60 mMol tris-HCl (pH-Wert 7,6), 10 mMol MgCl2, 10 mMol 2-Merkaptoäthanol, und 0,4 mMol Adenosintriphosphat, 2 mu g Plasmid-DNS und 0,5 mu g Linker enthält.
Nach der Durchführung der Ligierung wird die DNS aus dem Reaktionsgemisch mit Äthanol gefällt, aufgelöst und der fermentativen Hydrolyse mit der Restriktase Bgl II in einer Probe mit einem Volumen von 40 mu l ausgesetzt, die eine Pufferlösung für Restriktion-2 [60 mMol tris-HCl (pH-Wert 7,6), 6 mMol MgCl2, 6 mMol 2-Merkaptoäthanol, 50 mMol MaCl] enthält. Die DNS wird erneut mit Äthanol umgefällt, aufgelöst und man bewirkt die Zyklisierung der DNS-Moleküle, wofür man 1 mu g Präparat der Plasmid-DNS in 240 mu l einer Pufferlösung für Ligierung mit der DNS-Ligase der T4-Phage behandelt. Mit dem hergestellten Gemisch werden die Zellen E.coli C600 transformiert. Die Effektivität der Transformation beträgt 5.10<6> Kolonien, je 1 mu g des nativen Plasmids pPr 124.
Man wählt Klone aus, die resistent gegen Ampizillin (100 mu g/l) sind, aus ihnen wird die Plasmid-DNS nach der modifizierten Birnboim- und Doly-Methode ausgeschieden und sie wird für die Restriktionsanalyse verwendet. Im Ergebnis erhält man das Plasmid pPR 124B, das im Unterschied zum Vektor-Ausgangsmolekül pPR 124 einen unikalen Abschnitt für die Spaltung von Bgl II anstelle der vorhandenen Sequenz des Wiedererkennens XbaI (Fig. 2) enthält.
Zweite Etappe - Konstruieren eines Zwischen-Plasmids pPR-IFN beta 1-123. In die Zusammensetzung des Vektors pPR124B integriert man eine kodierende Sequenz des menschlichen Fibroblast-Interferons aus dem Plasmid pIN beta -trp 7. Hierfür werden 10 mg DNS pIN beta -trp 7 zusammen mit den Restriktasen EcoRI und Sau beta A in einer Probe mit einem Volumen von 100 mu l gehandelt, die eine Pufferlösung für Restriktion-2 enthält. Das hergestellte Präparat wird auf ein Gel aus 1,1%iger leichtschmelzender Agarose aufgetragen und der Elektrophorese in einem tris-Azetat-Puffersystem ausgesetzt. Ein Streifen des Gels, der ein DNS-Fragment mit einer Länge von 510 Basenpaaren enthält, schneidet man aus und die DNS aus dem Gel eluiert. Das dadurch hergestellte DNS-Fragment ( &tilde& 1 mu g) integriert man in das Plasmid pPR124B.
Hierfür wird 1 mu g DNS pPR124B mit den Restriktasen E.coRI und Bgl II in einer Probe mit einem Volumen von 20 mu l in einer Pufferlösung für Restriktion-2 gespaltet. Das hergestellte Präparat setzt man der Phenol-Deproteinisierung aus, die DNS fällt man mit Äthanol aus und löst man in 10 mu l H2O auf. 0,5 mu g DNS des gespalteten Plasmids pPR124B vereinigt man mit 1 mu g des ausgeschiedenen Fragmentes des Plasmids pIN beta -trp 7 und behandelt man mit der DNS-Ligase der T4-Phage in einer Probe mit einem Volumen von 30 mu l in einer Pufferlösung für Ligierung. Mit dem hergestellten Präparat DNS führt man die Transformation der Zellen E.coli C600 mit der Auswahl der Transformanten auf einem Nährboden mit Ampizillin mit anschliessender Selektion der Cm<s>-Klone auf einem Nährboden mit 200 mu g/l Chloramphenikol bei der Züchtung der Zellen bei einer Temperatur von 42 DEG C durch.
Aus den dadurch ausgewählten Klonen wird die Plasmid-DNS ausgeschieden und mit Hilfe der Restriktionsanalyse geprüft. In dem hergestellten Plasmid EcoRI -Bgl II ist das Fragment, das den C-Endabschnitt der Chloramphenikolazetyltransferase in der Zusammensetzung des Vektors pPR124B kodiert, durch eine kodierende Sequenz eines reifen menschlichen beta 1-Interferons substituiert. Dieses Plasmid wird durch pPR-IFN beta 1-123 bezeichnet und in der nächsten Stufe des Konstruierens verwendet.
Dritte Etappe - Konstruieren des Plasmids pPR-IFN beta 1-13.
30 mu g DNS des Plasmids pPR-IFN beta 1-123 spaltet man mit der Restriktase BamHI in 150 mu l einer Pufferlösung für Restriktion-1, die DNS setzt man der Phenol-Deproteinisierung aus und fällt man mit Äthanol aus. Den Niederschlag löst man in 40 mu l H2O auf. Zwecks einer beschränkten Degradation der DNS mit Hilfe von 3<1> -> 5<1>-Exonuklease-Aktivität der DNS-Polymerase I E.coli wird das hergestellte DNS-Präparat in einer Probe mit einem Volumen von 150 mu l inkubiert, die 50 mMol tris-HCl (pH-Wert 8,0), 10 mMol Äthylendiamintetraessigsäure, 5 mMol MgCl2, 100 mu Mol Desoxyadenosintriphosphat (und dann Desoxyguanosinphosphat) und 20 Einheiten der DNS-Polymerase enthält.
Die Reaktion wird zum Stillstand gebracht, man führt das Umfällen der DNS durch und den Niederschlag löst man erneut in 40 mu l H2O auf. 10 mu g des erzeugten Präparates behandelt man mit der Restriktase EcoRI in 50 mu l einer Pufferlösung für Restriktion-2, man führt die Phenol-Deproteinisierung und die Ausfällung der DNS mit Äthanol durch und den Niederschlag löst man in 30 mu l H2O auf.
Die Entfernung der Einfaden-Abschnitte des hergestellten DNS-Präparates führt man mit Hilfe der Endonuklease SI in einer Probe mit einem Volumen von 100 mu l durch, die 30 mMol CH3COONa (pH-Wert 4,4), 4,5 mMol ZnSO4, 250 mMol NaCl, 10 mu g DNS und 200 Einheiten SI-Endonuklease enthält. Die Reaktion führt man bei einer Temperatur von 20 DEG C durch, wonach man das Gemisch der Phenolbehandlung aussetzt und der Umfällung der Nukleinsäure mit Äthanol aussetzt. Den Niederschlag löst man in 20 mu l H2O auf. 4 mu g des auf diese Weise erzeugten DNS-Präparates behandelt man mit dem Klenowschen Fragment der DNS-Polymerase I E.coli unter den oben beschriebenen Verhältnissen zwecks Nachbildung der eventuell vorhandenen Einketten-Enden der Moleküle bis zu den Zweiketten-Enden.
Die Reaktion wird mit Hilfe der Deproteinisierung zum Stillstand gebracht, die Nukleinsäuren werden mit Äthanol ausgefällt und in 20 mu l H2O aufgelöst.
Die Legierung der linearen DNS-Moleküle mit Zweiketten-Enden führt man bei einer Temperatur von 16 DEG C in einer Probe mit einem Volumen von 50 mu l durch, die 60 mMol tris-HCl (pH-Wert 7,6), 10 mMol MgCl2, 10 mMol Dithiothreitol, 4 mMol Adenosintriphosphat, 8 Masse-% Polyäthylenglykol-6000, 4 mu g DNS und 100 Einheiten DNS-Ligase der T4-Phage enthält. Nach der Beendigung der Reaktion wird die Probe vierfach verdünnt und man führt die Ausfällung der Nukleinsäuren mit Äthanol, 2 mu g der in H2O aufgelösten DNS behandelt man mit der Restriktase Bgl II in 30 mu l einer Pufferlösung für Restriktion-2, die DNS wird aus dem Reaktionsgemisch mit Äthanol ausgefällt, in Wasser aufgelöst und mit der DNS-Ligase der T4-Phage in 20 mu l einer Pufferlösung für Ligierung behandelt.
Das hergestellte DNS-Präparat verwendet man für die Transformation der Zellen E.coli C600, wie oben beschrieben, mit anschliessender Selektion der Transformanten an einem Nährboden mit Ampizillin bei der Kultivierung der Zellen innerhalb von 24 h bei einer Temperatur von 28 DEG C. Aus den erzeugten Transformanten wählt man die Varianten aus, die eine verringerte Wachstumsfähigkeit bei der Temperatur von 42 DEG C besitzen. Aus den genannten Klonen wird die Plasmid-DNS, wie oben beschrieben, ausgeschieden und der Restriktionsanalyse ausgesetzt.
Für die Ermittlung der primären Struktur des Hybridabschnittes der Verknüpfng der Ribosome vor dem Gen IFN beta 1 in dem auf solche Weise erzeugten Plasmid pPR-IFN beta 1-13 werden 30 mu g einer entsprechenden DNS mit der Restriktase Hind II in 100 mu l einer Pufferlösung für Restriktion-2 behandelt, das Präparat wird auf das Gradienten- (von 4 bis 12%) Polyakrylamidgel aufgetragen und der Elektrophorese in einem tris-Azetat-Puffersystem ausgesetzt. Das DNS-Fragment mit einer Länge von 190 Basenpaaren eluiert man nach der Maxam-Hilbert-Methode, es werden mit Hilfe der DNS-Ligase der T4-Phage die BamHI-Linker an dasselbe analog dem obenbeschriebenen Verfahren der Anlagerung der Bgl II-Linker an das linearisierte Plasmid pPR124 gebunden.
Die DNS wird aus dem Reaktionsgemisch mit Äthanol umgefällt, der Niederschlag in 20 mu l H2O aufgelöst und mit Restriktase BamHI in 30 mu l einer Pufferlösung für Restriktion-1 gespaltet, die DNS wird der Phenol-Deproteinisierung ausgesetzt, erneut mit Äthanol ausgefällt und in H2O aufgelöst.
Die Molekular-Klonung des bei der Spaltung der BamHI des DNS-Fragmentes in der Zusammensetzung der replikativen Form der DNS der Bakteriophage M13mp 10, die Selektion der Rekombination-Phage an einem Indikator-Nährboden, der 5<1>-Brom-4-chlor-3 min -indolyl- beta -D-galaktosid enthält, die Ausscheidung der Einketten-Phagen-DNS und die Ermittlung der primären Struktur des geklonten Fragmentes mit Hilfe der Methode eines beschränkten Matrix-Kopierens (F.Senger-Methode) erfolgen in Übereinstimmung mit den Standard-Methoden. Die in der Senger-Methode festgelegte Nukleotid-Sequenz des Hybrid-Abschnitts der Verknüpfung der Ribosomen in der Zusammensetzung des Plasmids pPR-IFN beta 1-13 ist wie folgt:
5<1>-...TAAGGAGGTTGGATG...-3<1>, worin TAAGGAGGT die SD-Sequenz des cro-Gens der Phage lambda und ATG des Methionin-Koden des beta 1-Interferons ist.
Beispiel 2
Stamm E.coli VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IFN beta 1-13)-Produzent des menschlichen Fibroblast- beta 1-Interferons wird wie folgt erzeugt.
Das Plasmid pPR-IFN beta 1-13, das die Synthese des menschlichen Fibroblast-Interferons kodiert, wird mittels Transformation, wie in Beispiel 1 beschrieben, in die Zellen des Stammes E.coli VNIIGENETIKA VL 903 eingeführt (der in der Allunionskollektion der industriemässigen Mikroorganismen des Allunions-Forschungsinstitutes für Genetik und Selektion industriemässiger Organismen deponiert und unter Nr. BKIIM B-3546 registriert wurde).
Die Effektivität der Transformation der Zellen E.coli VNIIGENETIKA VL 903 beträgt etwa 10<6> Klone je 1 mu g der nativen DNS des Plasmids pPR-IFN beta 1-13. Die Transformanten entnimmt man an einem Nährboden, der Ampizillin (100 mu g/l) nach der Kultivierung der Zellen innerhalb von 24 h bei einer Temperatur von 28 DEG C enthält. Aus den ausgewählten Klonen scheidet man die Plasmid-DNS und weist man ihre Identität mit dem DNS-Präparat pPR-IFN beta 1-13 mit Hilfe der Restriktionsanalyse nach. Man erhält den Stamm E.coli VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IFN beta 1-13).
Zur Ermittlung der Produktivität des Stammes E. coli VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IFN beta 1-13) werden die plasmidhaltigen Zellen bei einer Temperatur von 28 DEG C an einem abgeschrägten agarisierten Standard-Hottinger-Nährboden, der 50 mu g/ml Ampizillin enthält, innerhalb von 14 h gezüchtet. Die an Abschrägungen gewachsene Biomasse verwendet man für die Erzeugung von Inokulums. Hierfür werden die Zellen in die Erlenmeyerkolben mit einem Volumen von 750 ml mit 100 ml Hottinger-Nährboden, mit 100 mu g/ml Ampizillin übertragen und bei einer Temperatur von 28 DEG C in einer Schüttelvorrichtung bei 240 U/min innerhalb von 6 h gezüchtet. Die optische Dichte des Inokulums beträgt von 1,5 bis 2,5 Einheiten.
Die Fermentierung führt man in einem Fermentator, der mit Systemen für die Regulierung des pH-Wertes, der Temperatur, der Geschwindigkeit der Vermischung und Aeration versehen ist, durch. Für die Fermentierung verwendet man den Hottinger-Nährboden mit 100 mu g/ml Ampizillin und 10 mu g/l Glykose. Das Inokulum bringt man in einer Menge von 5 bis 10 Masse-% ein. Die Kultivierung erfolgt bei einem pH-Wert von 6,6 bis 6,8 und dieser Stand wird mittels Zuführung von Ammoniakwasser unterhalten. Der erste Teil der Fermentierung führt man bei einer Temperatur von 28 DEG C bis zur Erzielung einer optischen Dichte gleich 3,5 bei 550 Nm durch und dann erfolgt die Thermoinduktion durch die Temperatursteigerung auf 42 bis 45 DEG C innerhalb von 5 min, wonach man die Fermentierung weitere 2 h bei derselben Temperatur fortsetzt.
Nach der Beendigung der Prozessführung werden die Interferon-Zellen zwecks Ermittlung der Aktivität aus 1 ml Kulturflüssigkeit mittels Zentrifugierens ausgefällt, der Niederschlag wird in 1 ml 1%iger Lösung des Natriumdodezylsulfats in 0,02 Mol Phosphat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,2 resuspendiert, die 1% 2-Mer kaptoäthanol enthält, und 2 bis 4 min bei einer Temperatur von 100 DEG C durchgewärmt. Danach wird der Niederschlag durch Zentrifugieren beseitigt und die Aktivität des Interferons, der im Überlauf enthalten ist, wird mit Standardmethoden beziehungsweise nach dem Schutz von Diploid-Fibroblaste des Menschen vor der zytopatischen Wirkung des Virus der vesikulären Stomatitis oder mit der Methode der Immun-Fermenten-Analyse ermittelt.
Als Standards verwendet man Präparate des beta -Interferons ("Torey", Japan), die gemäss dem Standard des Leukozyten-Interferons B 69/19 (Grossbritannien) titriert wurden.
Gemäss den unterschiedlichen Methoden der Ermittlung beträgt die Aktivität des menschlichen Fibroblast-Interferons, der in den Zellen des Stammes E.coli VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IFN beta 1-13) synthetisiert wird, über 2.10<9> internationaler Einheiten"1 Bakterienkultur.
Zur Ermittlung des Anteils des synthetisierten Fibroblast-Interferons am gesamten Zelleneiweiss werden die Zellen aus 1 ml Kulturflüssigkeit durch Zentrifugieren ausgefällt und, wie oben beschrieben, behandelt, das Präparat wird mittels Elektrophorese in Gegenwart von 1,0%igem Natriumdodezylsulfat in 15%igem Polyakrylamidgel getrennt und in der Kumassi-Lösung R-250 "Serva" (BRD) nach einer Standard-Methodik durchgefärbt. Der quantitative Gehalt an Eiweissstoffen in den Zonen ermittelt man nach dem Abtasten in einem automatischen Laser-Densitometer.
Die Identifizierung der Zone, die dem in den Zellen synthetisierten reifen Fibroblast-Interferon (19kD) entspricht, erfolgt aufgrund des Vergleichs mit der elektrophoretischen Beweglichkeit von Marker-Proteinen sowie mit Hilfe des Immunoblotings geteilter Eiweissfraktionen in Nitrozellulose-Filter und der Identifizierung der Zone des Interferons durch Bearbeitung der Filter in Lösungen, die monoklonale Antikörper der Mäuse gegen den beta -Interferon und Antimäuse-Kaninchen-Antikörper, enthalten, die mit der Peroxydase aus dem Meerrettich konjugiert sind. Nach dem entsprechen den Arbeitsgang der Färbung sieht die Zone des Interferons als ein dunkler Streifen von braunem Farbton auf dem nichtgefärbten Hintergrund eines Nitrozellulose-Filters aus.
Der Gehalt an Eiweiss in der Zone, die dem beta 1-Interferon entspricht, beträgt etwa 10%, bezogen auf die Gesamt-Eiweissmenge der plasmidhaltigen Zellen E.coli VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IFN beta 1-13).
Gewerbliche Verwertbarkeit
Die erfindungsgemässe Rekombination-Plasmid-DNS pPR-IFN beta 1-13, die die Synthese des menschlichen Fibroblast- beta 1-Interferons kodiert, findet Anwendung für die Erzeugung der Produzenten-Stämme des menschlichen beta 1-Interferons mit einer hohen Aktivität.
Der erfindungsgemässe Stamm der Bakterien Escherichia coli VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IFN beta 1-13)-Produzent des menschlichen Interferons findet Anwendung in der mikrobiologischen und medizinischen Industrie für die Herstellung von menschlichem beta 1-Interferon, der in der medizinischen Praxis angewendet werden.
Technical field
The present invention relates to a new recombination plasmid DNA pPR-IFN beta 1-13 which encodes the synthesis of human fibroblast beta 1 interferon, a method for its production and a strain of the bacteria Escherichia coli VNIIGENETIKA VL 903 (pPR- IFN beta 1-13) producer of human beta 1 interferon containing the same.
State of the art
Interferons are proteins that are synthesized by the specialized human cells in response to a virus infection or the effects of various inducers. The experimental data currently available testify to the antiviral, antiproliferative and immunomodulating effect of interferon in the treatment thereof with individual cells, tissues and an organism as a whole. The interferon system is comparable to the immunity system in its universal application possibilities and in its importance for the organism.
In accordance with the biological, chemical and antigenic properties and depending on the type of cells they produce, human interferons are divided into three groups: alpha-leukocytes, beta-fibroblast and gamma-immune interferons, which are mainly derived from the Cells of leukocytes, fibroblasts or T lymphocytes are generated. Currently, the fields of application of interferons in medicine are largely defined.
There are keratites and dermatoses, the treatment of respiratory infections, which are provoked by various viruses (flu, adenoviruses), hepatitis B and others.
However, the mechanism of action of interferons, their structural and functional peculiarities and their clinical potential have not yet been adequately investigated. This is due in large part to the difficulty in obtaining preparative amounts of pure interferons in conventional processes which are based on the use of induced cultures of human cells as sources of this protein. The interferon synthesized in this case also generally represents a complicated mixture of its various subtypes and forms, which differ in their structural and functional characteristics. This significantly complicates the investigation of the properties of individual interferons. In this context, the production of individual interferons through microbiological synthesis is becoming increasingly widespread.
A number of methods for the production of alpha, beta and gamma human interferons are known, which are based on the use of bacteria as producers, in particular various strains of Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas sp., In their composition Recombinant plasmid DNA containing the expression of heterological genes in a new genetic environment. In the case of human fibroblast interferon (IFN beta 1), in order to achieve the expression of the IFN beta 1 gene in the E. coli cells, the coding part of the mature interferon was controlled by the signals of the transcription and translation of the genes ( tuf B, rec A) and operons (lac UV 5 trp) E.coli and Koliphagen (PL lambda).
The mature beta 1-interferon (with a molecular mass of & tilde & 19,000 daltons) resulting from the microbiological synthesis is characterized by the lack of a carbohydrate component and by the presence of a formyl-methionine-N-end residue instead of the methionine residue. However, this difference does not change the biological activity of the protein product, the IFN beta 1 gene, compared to the natural glycoprotein that is produced in the fibroblast cells. The beta 1-interferon synthesized in the microbiological process mentioned can be used both for the investigation of molecular mechanisms of interaction with cell receptors and in medical practice.
Recombination plasmid DNA encoding the synthesis of human fibroblast beta 1 interferon are known, such as pC1857 and pPL c 245HFIF25 and E. coli strain SG40444, which contains the plasmids mentioned (Remaut E, Staussens P., Fiers G, 1983, Nucl. Acida Res. 11, 4677-4688).
In the composition of the recombination plasmid DNA pPLc245HFIF25, the transcription of the IFN beta 1 gene is controlled by a PLOL regulator element of the lambda bacteriophage, and the initiation of translation of the protein product of the gene is at the expense of constructing a hybrid portion of the linkage from Ribosomes based on the SD sequence of a replicase gene causes the MS2 phage. The maximum yield of human beta 1-interferon, which is ensured by cultivating the said strain, is 4%, based on the total protein content of the plasmid-containing E. coli cells.
The said strain is characterized in that the regulatable expression of the IFN beta 1 gene, which is brought about by the PL promoter, requires an additional pC1857 plasmid with a temperature-sensitive regulator gene cIts857 of the lambda phage arranged thereon. This leads to a potential instability of the recombination plasmid under the conditions of cultivation of the strain in industrial production at the expense of a recA-dependent recombination between the plasmids pC1857 and pPLc245HFIF25 according to the homology areas.
Furthermore, the use for the organization of a hybrid section of the linkage of the ribosomes of a relatively short SD sequence of the replicase gene of the MS2 phage does not make it possible to fully utilize the potential performance of the E. coli translator as a result of an insufficiently effective interaction to realize the ribosome at the initiation of translation of the fibroblast interferon. At the same time, the lack in the non-translatable 3 <1> end region of the IFN beta 1 gene on the plasmid pPLc245HFI25 from rho-independent transcription terminators, a substantial reduction in copy generation and even the eventual loss of the recombination plasmid under the conditions of the depression of the highly effective PL promoter of the lambda phage, which causes the transcription of the IFN beta 1 gene to start.
All this does not allow a high level of synthesis of the product of the IFN beta 1 gene to be achieved and can lead to a further reduction in the content of beta 1 interferons in the biomass of a producer strain in its large-scale cultivation, which leads to the isolation of the pure protein complicated and the yield of the final product is reduced.
Presentation of the invention
The recombinant plasmid DNA pPR-IFN beta 1-13, the method of constructing it and the strain of Escherichia coli VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IFN beta 1-13) containing it are new and have been published in the literature not described.
The invention has for its object a new recombination plasmid DNA which encodes the synthesis of human fibroblast beta 1 interferon, a method for its construction and a new, highly productive strain of human beta 1 interferon which contains the same , which ensures the production of beta 1-interferon in high yield.
The object was achieved by the characterizing features of claim 1.
Recombination plasmid DNApPR-IFN beta 1-13 according to the invention effects the expression of the IFN beta 1 gene under the control of the PROR regulator region of the lambda bacteri phage. The cITs857 gene, which is the regulator of initiation of transcription from the previous promoters of the lambda bacteriophage, and the IFN beta 1 gene, which is under the control of the PR promoter, are in the composition of one and the same recombination plasmid pPR -IFN beta 1-13 arranged. This fact makes it possible to avoid the potential instability when cultivating a strain with a recombination DNA molecule, because in the construction proposed by us there is no recA-dependent recombination due to the lack of an additional plasmid in the producer strain.
The invention also includes a method for constructing a recombination plasmid DNA pPR-IFN beta 1-13 according to claim 2.
The application of the method for constructing the recombination plasmid pPR-IFN beta 1-13, in which the SD sequence of the cro gene of the lambda bacteriophage with the coding part, which is particularly long from the coliphages known for the matrix RNA E.coli, with the coding part of the mature human beta 1 interferon, leads to the organization of a hybrid portion of the linkage of the ribosomes of the IFN beta 1 gene with the optimal primary and spatial structure of the 5th <1> end area of the matrix RNA.
In contrast to the known method, the construction method according to the invention also ensures the presence in the third <1> Nontranslatable region of the IFN beta 1 gene on the pPR-IFN beta 1-13 plasmid of a tandem of the rho-dependent terminators of transcription, indicating the interference between the replication of the plasmid DNA and the highly effective transcription of the fibroblast gene -Interferons prevented under the conditions of depression of the PR promoter.
In addition to the above, the invention also includes a strain of the bacteria Escherichia coli VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IFN beta 1-13), the producer of the human beta 1-interferon, which produces the recombination plasmid DNA pPR-IFN beta 1-13 according to the invention contains and which was generated in the genetic engineering process by introducing the recombination plasmid DNA pPR-IFN beta 1-13 in bacteria Escherichia coli, which on January 12, 1987 in the collection of cultures of microorganisms of the Union Research Institute for Antibiotics, USSR, Moscow , Nagatinskaya ulitsa, 3a, has been deposited and registered under No. 1825.
The strain according to the invention makes it possible to ensure stable storage of the human beta 1-interferon under the conditions of large-scale cultivation and a yield of the end product of more than 2 × 10 <9> units / l to achieve, which corresponds to 5 to 10%, based on the total amount of cell protein.
Best way to carry out the invention
The method for constructing the recombination plasmid DNA pPR-IFN beta 1-13 according to the invention takes place in several stages.
In the first stage, a vector plasmid pPR124 B is constructed.
For this purpose, the deletion with the help of the exonuclease Bal 31 is carried out in the DNA of the pPR40 plasmid [Molecular Biology, 1987, Volume 21, No. 5 (Moscow), pp. 1309-1321] in the region of the recognition section of the restriction enzyme Bgl II.
This results in the plasmid pPR 100, in which the section of the BamHI recognition is immediately behind the area of the linkage of the ribosomes of the lambda page, the following sequence being formed in the area of the initiating AUG codon:
EMI7.1
Furthermore, the smaller PstI-Bam Hi fragment of the plasmid pPR100 is coupled with the larger PstI-Bam HI fragment of the plasmid pML 24 with the help of the conventional genetic engineering methods with the formation of the plasmid pPR124, into which one is integrated with the aid of an oligonucleotide linker Introduces the Bgl II restriction recognition section. The plasmid pPR 124B is obtained.
Then an intermediate plasmid pPR-IFN beta 1-123 is constructed.
The vector plasmid pPR 124B constructed is cleaved with restriction endonucleases Eco RI and Bgl II and the coupling of the larger of the resulting fragments of the vector molecule with EcoR I - Sau3A fragment, which encodes the coding part of the mature beta 1-interferon contains the plasmid pIN beta -trp 7. An intermediate recombination plasmid pPR-IFN beta 1-123 is obtained.
Then the third stage is carried out, constructing the plasmid pPR-IFN beta 1-13. For this purpose, in the intermediate plasmid pPR-IFN beta 1-123 the SD sequence of the cro gene and the first codon of the beta 1-interferon are approximated, for which the plasmid DNA is hydrolyzed with the restriction enzyme A Bam HI, one Portion of the nucleoids removed with the help of the endonuclease activity of the DNA polymerase I E. coli, which cleaves DNA with the restrictase E coRI, with the SI endonuclease with subsequent complete restoration of two-chain ends using the Klenow fragment of the DNA polymerase I treated E. coli and caused the cyclization of the linear DNA molecules formed with the DNA ligase of the T4 phage.
The E.coli C600 cells are transformed with the preparation prepared, and the transformants are removed from a culture medium with ampicillin when cells are cultivated at a temperature of 28 ° C. with subsequent selection for a reduced growth rate at a temperature of 42 ° C. The plasmid DNA pPR-IFN beta 1-13 is excised from the clones thus removed.
The strain of the bacteria Escherichia coli VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IFN beta 1-13) according to the invention is put into the culture medium with ampicillin by transforming the recipient strain with the recombination plasmid pPR-IFN beta 1-13 and then removing the recombination clones at a temperature of 28 ° C. and by determining the activity of the fibroblast beta 1 interferon in extracts of the transormante cells after the depression of the PR promoter, which was achieved by culturing the strain within 1 to 2 hours at a temperature of 42 ° C is reached. Strains E.coli C600 and other derivatives of E.coli K12 can also be used as recipient.
The E.coli VNIIGENETIKA VL 903 strain (pPR-INF beta 1-13) is characterized by the following features.
Morphological characteristics. Cells are straight, rod-shaped (1.2-1.6) x (2.0-6.0) µm, weakly mobile, capable of forming thread-like shapes, gram-negative and not spore-bearing.
Cultural characteristics. Cells grow well on dense and fluid, simple, synthetic, semi-synthetic and complex media. When growing on an agarized Hottinger broth or on the L broth, these cells form slimy, round, slightly matted colonies. When cultivated on liquid nutrient media of the L-broth type or M9 with casamic acid, they form a homogeneous suspension.
Physiological-biochemical characteristics. Cells are capable of growth in a temperature range of 5 to 40 ° C (optimum is 35 ° C) at a pH of 6.7 to 7.5. Amino acids and carbohydrates (for example sucrose) are used as the carbon source. Mineral salts in ammonium form and organic compounds in the form of peptone, tryptone, yeast extract and amino acids can serve as the nitrogen source.
Antibiotic resistance. The strain is resistant to ampicillin in a concentration of at most 100 mg / l when cultivated in liquid and in agarized nutrient media.
Stability of the plasmid. There is no loss in cell storage on the agarized culture medium (for up to 1 month), in a series of successive vaccinations (within at least 6 months) and in the submerged cultivation in a liquid culture medium with an antibiotic there is no conversion of the plasmid.
The E.coli VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IFN beta 1-13) strain produced is a highly effective producer of human fibroblast beta 1 interferon and can be used for the large-scale production of beta 1 interferon.
The invention is explained below using examples of the implementation of a method for constructing the plasmid according to the invention, a method for producing the strain and its cultivation and illustrated by the following figures, in which:
1 physical-genetic map of the recombination plasmid pPR-IFN beta 1-13;
Fig. 2 Scheme of the preparation of the plasmid pPR-IFN beta 1-13 according to the invention.
example 1
Recombination plasmid pPR-IFN beta 1-13 (Fig. 1) is prepared in several stages. First stage - constructing the vector plasmid pPR 124 B.
For this, the plasmid pPR 124 is constructed as follows: 3 μg DNA of the plasmid pPR 40 is cleaved with the restriction Bgl II in 60 μl buffer solution for restriction-1, the 10 mmol tris-HCl pH 8.0 6 mmol MgCl2 , 6 mmol 2-mercaptoethanol and 150 mmol NaCl contains. The DNA is reprecipitated with two volumes of ethanol. The precipitate is dissolved in 20 μl of H2O. The treatment of the DNA with the exonuclease Bal 31 is carried out within 3 min at a temperature of 30 ° C. in 30 μl of buffer solution containing 3 mmol of NaCl, 60 mmol of CaCl2, 60 mmol of MgCl2, 100 mmol of tris-HCl pH 8.0, 5 mmol contains ethylenediaminetetraacetic acid. The DNA is reprecipitated with two volumes of ethanol. The precipitate is dissolved in 10 ml of H2O. The restriction HI treatment is carried out in a sample with a volume of 30 μl, which contains the buffer solution mentioned for restriction-1.
The replication of the single-chain 3 min end sections of the DNA is carried out by processing with the Klenow fragment of DNA polymerase I E. coli in a sample with a volume of 20 μl, which contains 10 mmol tris-HCl (pH 8 , 0), 10 mmol of MgCl2, 2 μg of a DNA preparation, 30 μmole each of each of the deoxyribonucleoside triphosphates and 5 units of a ferment. The DNA is reprecipitated with ethanol from the reaction mixture and dissolved in 100 μl of H2O. The combination of the linearized plasmid DNA is carried out at a temperature of 16 ° C. within 12 h with the aid of the DNA ligase of the T4 phage in a sample which contains a buffer solution for ligation [60 mmol tris-HCl (pH value of 7.6), 10 mmol of MgCl2, 10 mmol of 2-mercaptoethanol, 0.4 mmol of adenosine triphosphate] and 1 μg of DNA. The E.coli C600 cells are transformed with the mixture prepared.
The effectiveness of the transformation is until 5.10 <6> Colonies of 1 µg each of the native plasmid pPR40. Clones which are resistant to ampicillin (100 μg / l) are selected, the plasmid DNA is separated from them using the modified Birboim method and the Doly method and is used for the restriction analysis. The result is the plasmid pPR100, which has a unique section of the BamHI cleavage. The plasmid pPR124 is then constructed.
For this purpose, 2 μg DNA of the plasmid pML24 are cleaved together with the restrictionases BamHI and PstI in 40 μl buffer solution for restriction-1. These are combined with the aid of the DNA ligase of the T4 phage at 0 ° C. with the fragments which were generated during the hydrolysis of the DNA of the plasmid pPR100 with the Bam HI and PstI restrictionases. With the DNA preparation prepared, the cells are transformed to E.coli C600 by selecting the transformants on a nutrient medium with ampicillin and then selecting Cm <r> clones on a culture medium with 300 μg / l chloramphenicol during the cultivation of the cells at a temperature of 42 ° C. The plasmid DNA is secreted from the clones selected thereby and examined with the aid of the restriction analysis. The result is the plasmid pPR 124, which contains a unique section of the cleavage with the BamHI restrictionase.
Then 3 μg DNK of the plasmid pPR 124 with restrictionase Xbal in 70 μl buffer solution for restriction-1, the 10 mmol tris-HCl (pH 7.9), 6 mmol MgCl2, 6 mmol 2-mercaptoethanol and 150 contains mmol NaCl. The DNA is reprecipitated with two volumes of ethanol. The precipitate is dissolved in 15 ml of H2O. The replica of the single chain-3 <1> end sections of the DNA are carried out by treatment with the Klenow fragment of DNA polymerase I E. coli in a sample with a volume of 20 μl, which contains 10 mmol of tris-HCl (pH 8.0), Contains 10 mmol MgCl2, 2 μg DNA preparation, 30 μm mol deoxyribonucleoside triphosphates and 5 units of a ferment.
The DNA is reprecipitated with ethanol from the reaction mixture and dissolved in 100 μl of H2O. The reunification of the linearized plasmid DNA with Bgl II linkers is carried out at a temperature of 16 ° C. within 12 h with the aid of the T4 phage DNA ligase in a sample which contains a buffer solution for ligation of 60 mmol tris-HCl (pH 7.6), 10 mmol MgCl2, 10 mmol 2-mercaptoethanol, and 0.4 mmol adenosine triphosphate, 2 μg plasmid DNA and 0.5 μg linker.
After the ligation has been carried out, the DNA is precipitated from the reaction mixture with ethanol, dissolved and subjected to fermentative hydrolysis with the restrictase Bgl II in a sample with a volume of 40 μl, which contains a buffer solution for restriction 2 [60 mmol tris-HCl (pH 7.6), 6 mmol MgCl2, 6 mmol 2-mercaptoethanol, 50 mmol MaCl]. The DNA is again reprecipitated with ethanol, dissolved and the DNA molecules are cyclized, for which 1 μg preparation of the plasmid DNA in 240 μl of a buffer solution for ligation is treated with the DNA ligase of the T4 phage. The E.coli C600 cells are transformed with the mixture prepared. The effectiveness of the transformation is 5.10 <6> Colonies, 1 µg each of the native plasmid pPr 124.
Clones which are resistant to ampicillin (100 mu g / l) are selected, the plasmid DNA is secreted from them by the modified pear boim and doly method and is used for the restriction analysis. The result is the plasmid pPR 124B which, in contrast to the vector starting molecule pPR 124, contains a unique section for the cleavage of Bgl II instead of the existing sequence of recognition XbaI (FIG. 2).
Second stage - construct an intermediate plasmid pPR-IFN beta 1-123. A coding sequence of the human fibroblast interferon from the plasmid pIN beta -trp 7 is integrated into the composition of the vector pPR124B. For this purpose, 10 mg DNA pIN beta -trp 7 together with the restrictionases EcoRI and Sau beta A are combined in one sample with one volume of 100 μl, which contains a buffer solution for restriction-2. The preparation prepared is applied to a gel made from 1.1% low-melting agarose and subjected to electrophoresis in a tris-acetate buffer system. A strip of the gel, which contains a DNA fragment with a length of 510 base pairs, is cut out and the DNA is eluted from the gel. The resulting DNA fragment (& tilde & 1 mu g) is integrated into the plasmid pPR124B.
For this purpose, 1 μg of DNA pPR124B is cleaved with the restrictionases E.coRI and Bgl II in a sample with a volume of 20 μl in a buffer solution for restriction-2. The preparation prepared is subjected to phenol deproteinization, the DNA is precipitated with ethanol and dissolved in 10 ml of H2O. 0.5 μg DNA of the cleaved plasmid pPR124B is combined with 1 μg of the excreted fragment of the plasmid pIN beta -trp 7 and treated with the DNA ligase of the T4 phage in a sample with a volume of 30 μl in one Buffer solution for ligation. With the preparation DNA prepared, the transformation of the E.coli C600 cells is carried out with the selection of the transformants on a nutrient medium with ampicillin with subsequent selection of the Cm <s> -clones on a culture medium with 200 μg / l chloramphenicol during the cultivation of the cells at a temperature of 42 ° C.
The plasmid DNA is secreted from the clones selected in this way and checked with the aid of the restriction analysis. In the plasmid EcoRI -Bgl II produced, the fragment encoding the C-end portion of the chloramphenicol acetyl transferase in the composition of the vector pPR124B is substituted by a coding sequence of a mature human beta 1-interferon. This plasmid is designated pPR-IFN beta 1-123 and used in the next stage of construction.
Third step - construct plasmid pPR-IFN beta 1-13.
30 μg of the DNA of the plasmid pPR-IFN beta 1-123 is cleaved with the BamHI restrictionase in 150 μl of a buffer solution for restriction-1, the DNA is subjected to phenol deproteinization and one precipitates with ethanol. The precipitate is dissolved in 40 ml of H2O. To limit DNA degradation using 3 <1> -> 5 <1> -Exonuclease activity of DNA polymerase I E. coli, the DNA preparation prepared is incubated in a sample with a volume of 150 μl, which contains 50 mmol of tris-HCl (pH 8.0), 10 mmol Contains ethylenediaminetetraacetic acid, 5 mmol MgCl2, 100 μmol deoxyadenosine triphosphate (and then deoxyguanosine phosphate) and 20 units of the DNA polymerase.
The reaction is brought to a standstill, the DNA is reprecipitated and the precipitate is redissolved in 40 μl of H2O. 10 μg of the preparation produced are treated with the restriction enzyme EcoRI in 50 μl of a buffer solution for restriction-2, the phenol deproteinization and the precipitation of the DNA with ethanol are carried out and the precipitate is dissolved in 30 μl of H2O.
The removal of the single-thread sections of the DNA preparation produced is carried out with the aid of the endonuclease SI in a sample with a volume of 100 μl, the 30 mmol CH3COONa (pH 4.4), 4.5 mmol ZnSO4, 250 Contains mmol NaCl, 10 μg DNA and 200 units SI endonuclease. The reaction is carried out at a temperature of 20 ° C., after which the mixture is subjected to the phenol treatment and to the reprecipitation of the nucleic acid with ethanol. The precipitate is dissolved in 20 μl of H2O. 4 μg of the DNA preparation produced in this way are treated with the Klenow fragment of DNA polymerase I E. coli under the conditions described above in order to simulate the possible single-chain ends of the molecules up to the two-chain ends.
The reaction is brought to a standstill by means of deproteinization, the nucleic acids are precipitated with ethanol and dissolved in 20 μl of H2O.
The alloying of the linear DNA molecules with two chain ends is carried out at a temperature of 16 ° C. in a sample with a volume of 50 μl, the 60 mmoles of tris-HCl (pH 7.6), 10 mmoles of MgCl2 , 10 mmol of dithiothreitol, 4 mmol of adenosine triphosphate, 8% by mass of polyethylene glycol-6000, 4 μg of DNA and 100 units of DNA ligase of the T4 phage contains. After the end of the reaction, the sample is diluted four times and the nucleic acids are precipitated with ethanol, 2 μg of the DNA dissolved in H2O is treated with the restriction glucose Bgl II in 30 μl of a buffer solution for restriction-2, the DNA is carried out the reaction mixture precipitated with ethanol, dissolved in water and treated with the DNA ligase of the T4 phage in 20 μl of a buffer solution for ligation.
The DNA preparation prepared is used for the transformation of the E.coli C600 cells, as described above, with subsequent selection of the transformants on a culture medium with ampicillin in the cultivation of the cells within 24 h at a temperature of 28 ° C. From the generated transformants, one selects the variants which have a reduced ability to grow at the temperature of 42 ° C. As described above, the plasmid DNA is secreted from the clones mentioned and subjected to the restriction analysis.
To determine the primary structure of the hybrid section of the linkage of the ribosomes in front of the IFN beta 1 gene in the plasmid pPR-IFN beta 1-13 generated in this way, 30 μg of a corresponding DNA with the Hind II restrictionase in 100 μl of a buffer solution treated for restriction-2, the preparation is applied to the gradient (from 4 to 12%) polyacrylamide gel and subjected to electrophoresis in a tris-acetate buffer system. The DNA fragment with a length of 190 base pairs is eluted according to the Maxam-Hilbert method. With the help of the DNA ligase of the T4 phage, the BamHI linkers are attached to the same analogously to the method described above for the attachment of the Bgl II linkers the linearized plasmid pPR124 bound.
The DNA is reprecipitated from the reaction mixture with ethanol, the precipitate is dissolved in 20 μl of H2O and cleaved with restrictase BamHI in 30 μl of a buffer solution for restriction-1, the DNA is subjected to phenol deproteinization, precipitated again with ethanol and in H2O dissolved.
The molecular cloning of the bacteriophage M13mp 10 during the cleavage of the BamHI of the DNA fragment in the composition of the replicative form of the DNA, the selection of the recombination phage on an indicator medium, the 5th <1> -Brom-4-chloro-3 min -indolyl-beta -D-galactoside contains, the elimination of the single-chain phage DNA and the determination of the primary structure of the cloned fragment using the method of limited matrix copying (F .Senger method) are carried out in accordance with the standard methods. The nucleotide sequence of the hybrid section of the linkage of the ribosomes in the composition of the plasmid pPR-IFN beta 1-13 defined in the Senger method is as follows:
5 <1> -... TAAGGAGGTTGGATG ...- 3 <1>, where TAAGGAGGT is the SD sequence of the cro gene of phage lambda and ATG of the methionine code of beta 1-interferon.
Example 2
E. coli strain VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IFN beta 1-13) producer of human fibroblast beta 1 interferon is produced as follows.
The plasmid pPR-IFN beta 1-13, which encodes the synthesis of human fibroblast interferon, is introduced into the cells of the E.coli VNIIGENETIKA VL 903 strain (that in the Union of industrial microorganisms collection) by transformation as described in Example 1 of the All-Union Research Institute for Genetics and Selection of Industrial Organisms and registered under No. BKIIM B-3546).
The effectiveness of the transformation of the cells E.coli VNIIGENETIKA VL 903 is about 10 <6> Clones each 1 µg of the native DNA of the plasmid pPR-IFN beta 1-13. The transformants are removed from a nutrient medium which contains ampicillin (100 μg / l) after the cells have been cultivated within 24 h at a temperature of 28 ° C. The plasmid DNA is separated from the selected clones and its identity is verified with the DNA preparation pPR-IFN beta 1-13 using the restriction analysis. The E.coli VNIIGENETIKA VL 903 strain (pPR-IFN beta 1-13) is obtained.
To determine the productivity of the strain E. coli VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IFN beta 1-13), the plasmid-containing cells are at a temperature of 28 ° C. on a slanted agarized standard Hottinger culture medium which contains 50 μg / ml ampicillin , bred within 14 h. The biomass grown on bevels is used for the production of inoculum. For this purpose, the cells are transferred into the Erlenmeyer flasks with a volume of 750 ml with 100 ml Hottinger culture medium, with 100 μg / ml ampicillin and grown at a temperature of 28 ° C. in a shaker at 240 rpm within 6 hours. The optical density of the inoculum is from 1.5 to 2.5 units.
The fermentation is carried out in a fermenter equipped with systems for regulating pH, temperature, speed of mixing and aeration. The Hottinger culture medium with 100 μg / ml ampicillin and 10 μg / l glycose is used for the fermentation. The inoculum is introduced in an amount of 5 to 10% by mass. The cultivation takes place at a pH of 6.6 to 6.8 and this level is maintained by adding ammonia water. The first part of the fermentation is carried out at a temperature of 28 ° C. until an optical density equal to 3.5 is achieved at 550 Nm and then the thermal induction takes place within 5 minutes by increasing the temperature to 42 to 45 ° C., after which the Fermentation continues for another 2 h at the same temperature.
After the end of the process, the interferon cells are precipitated from 1 ml of culture liquid by centrifugation to determine the activity, the precipitate is dissolved in 1 ml of 1% solution of sodium dodezyl sulfate in 0.02 mol of phosphate buffer solution with a pH of 7. 2 resuspended, which contains 1% 2-mer kaptoethanol, and warmed for 2 to 4 min at a temperature of 100 ° C. The precipitate is then removed by centrifugation and the activity of the interferon contained in the overflow is determined using standard methods or after protecting human diploid fibroblasts from the cytopathic effect of the vesicular stomatitis virus or using the method of immune fermentation. Analysis determined.
Preparations of beta interferon ("Torey", Japan) which were titrated according to the standard of leukocyte interferon B 69/19 (Great Britain) are used as standards.
According to the different methods of determination, the activity of the human fibroblast interferon, which is synthesized in the cells of the E.coli VNIIGENETIKA VL 903 strain (pPR-IFN beta 1-13), is over 2.10 <9> international units "1 bacterial culture.
To determine the proportion of the synthesized fibroblast interferon in the total cell protein, the cells are precipitated from 1 ml of culture liquid by centrifugation and, as described above, treated, the preparation is separated by electrophoresis in the presence of 1.0% sodium dodezyl sulfate in 15% polyacrylamide gel and dyed through in the Kumassi solution R-250 "Serva" (FRG) according to a standard method. The quantitative content of protein substances in the zones is determined after scanning in an automatic laser densitometer.
The zone which corresponds to the mature fibroblast interferon (19 kD) synthesized in the cells is identified on the basis of the comparison with the electrophoretic mobility of marker proteins and with the aid of immunobloting of divided protein fractions in nitrocellulose filters and the identification of the zone of the interferon by processing the filters in solutions containing mouse monoclonal antibodies to beta-interferon and anti-mouse rabbit antibodies conjugated to horseradish peroxidase. After completing the dyeing process, the zone of the interferon looks like a dark streak of brown hue on the non-colored background of a nitrocellulose filter.
The protein content in the zone corresponding to the beta 1 interferon is approximately 10%, based on the total protein amount of the plasmid-containing cells E.coli VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IFN beta 1-13).
Commercial usability
The recombination plasmid DNA pPR-IFN beta 1-13 according to the invention, which encodes the synthesis of the human fibroblast beta 1 interferon, is used for the production of the producer strains of the human beta 1 interferon with a high activity.
The strain of the bacteria Escherichia coli VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IFN beta 1-13) producer of the human interferon according to the invention is used in the microbiological and medical industry for the production of human beta 1-interferon, which are used in medical practice.