CH677879A5

CH677879A5 -

Info

Publication number: CH677879A5
Application number: CH2803/88A
Authority: CH
Inventors: Roland Eichenberger; Peter Dr Ries
Original assignee: Pentapharm Ag
Priority date: 1988-07-22
Filing date: 1988-07-22
Publication date: 1991-07-15
Also published as: WO1990000898A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines oberflächenaktiven und biologisch aktiven Präparates, das geeignet ist zur medizinischen Behandlung von anomalen oder krankhaften Lungenzuständen, bei denen das natürliche "Lungensurfactantsystem" nicht vorhanden oder gestört ist.

Seit den Untersuchungen von Von Neergard und K. Wirz, die in der Z. Ges. Exp. Med. 66, 371-381 (1929) beschrieben sind, ist bekannt, dass für den geregelten Gasaustausch in der Lunge das Vorhandensein von oberflächenaktiven Substanzen auf der Oberfläche der Alveolen und der Bronchien notwendig ist. Diese physiologischen Substanzen gewährleisten die Retraktion der Alveolen in der Expirationsphase, ohne dass es zu einem totalen Kollaps der Alveolen kommt, und die leichtgängige Expansion der Alveolen in der Inspirationsphase, indem sie die Oberflächenspannung an der Grenzfläche Alveole-Luft verändern. Das Alveolarsystem weist im Zustand der Expiration eine Gesamtoberfläche von ca. 80 m<2> und im Zustand der Inspiration eine Oberfläche von ca. 120 m<2> auf. Die einzelnen Alveolen sind mit einer Schicht von Pneumozyten vom Typ I und II ausgekleidet.

Die Pneumozyten vom Typ II sind jene Zellen, die für die Synthese und die Ausschleusung der ober flächenaktiven Substanzen verantwortlich sind. Das oberflächenaktive Gemisch von Substanzen, das von den Pneumozyten freigesetzt wird, wird in der Fachliteratur als "Lungensurfactant" oder auch nur als "Surfactant" bezeichnet.

Der natürliche Surfactant sowohl des Menschen als auch der Tiere ist keine reine, einheitliche Substanz, sondern eine Mischung in Form einer Emulsion von Lipiden, vorwiegend Phospholipiden, Proteinen und Kohlehydraten. Nach K. Morgenroth in "Das Surfactantsystem der Lunge", Walter de Gruyter Verlag, Berlin, 1986, S. 10-12, setzt sich der Surfactant zusammen aus ca. 90% Lipiden, davon ca. 65% Phosphatidylcholin und 10% Phosphatidylglycerol, plus 10% Proteinen, plus eine sehr geringe Menge Kohlenhydrate. Die funktionell wichtigsten Komponenten im Surfactant sind sowohl das Dipalmitoylphosphatidylcholin, das etwa 50% des Lipidanteils ausmacht, als auch der relativ geringe Protein- oder Polypeptidanteil von ca. 10%. Der Proteinanteil wird von R. King, J. Appl. Physiol.: Respirat. Environ.

Exercise Physiol. 53, 1-8 (1982), als aus 2 Gruppen von "surfactant associated peptides" (SP) mit Molekulargewichten von 28 000-36 000 und von 5000-18 000 bestehend beschrieben. Die Anwesenheit von Kohlenhydraten wurde zwar elektronenoptisch und biochemisch nachgewiesen, konnte jedoch bisher noch nicht quantifiziert werden.

Das Atemnotsyndrom des Neugeborenen ("infantile respiratory distress syndrome" = IRDS) entwickelt sich vor allem in der Perinatalperiode von Frühgeborenen durch das Fehlen von Surfactant in den Alveolen oder durch nicht ausreichende Oberflächenaktivität des Surfactants. Dadurch bleibt die Entfaltung des Alveolarsystems der Lunge aus, was schliesslich zum Erstickungstod führt. Substitution mit biologisch aktivem, natürlichem oder künstlichem Surfactant kann in diesen Fällen lebensrettend sein.

Beim Atemnotsyndrom des Erwachsenen ("adult respiratory distress syndrome" = ARDS) liegt ebenfalls eine Störung des Lungensurfactantsystems vor, was zu einer Atelektase mit vielfach tödlichem Ausgang führt. Klinische und experimentelle Untersuchungen von B. Lachmann et al., "Adult respiratory distress syndrome", in: Robertson, Van Golde, Batenburg Eds., "Pulmonary Surfactant", Elsevier, Amsterdam 1984, S. 505-548, haben gezeigt, dass der Ver lauf des ARDS durch Surfactantsubstitution und künstliche Beatmung günstig beeinflusst werden kann.

S. O'Neill et al., Am. Ren. Respir. Dis. 130, 225-230 (1984), konnten in experimentellen Untersuchungen zeigen, dass dem Lungensurfactant eine wichtige Bedeutung bei der unspezifischen Infektabwehr zukommt, indem der Surfactant die Phagozytose von Bakterien durch die Makrophagen der Lunge steigert.

Der Surfactant hat über die Aktivierung der Phagozytose auch einen bedeutenden Einfluss auf die Abwehrreaktionen der Lunge gegen sehr feine Stäube, die mit der Atemluft ständig aufgenommen werden (= Pneumokoniosen).

Das IRDS und das ARDS wird mit wechselndem Erfolg durch Verabreichung von natürlichem Surfactant aus tierischer Lunge, von künstlichen Lipidgemischen oder von Kombinationen von natürlichem Surfactant und künstlichen Lipidgemischen in die Lunge des Patienten behandelt.

Der natürliche Surfactant wird von C.N. Morley et al., The Lancet 81/1, 64-68 (1980), wegen ungenügender oder stark wechselnder biologischer Aktivität als für den therapeutischen Einsatz ungeeignet eingestuft.

Im USP 4 312 600 wird ein synthetischer, proteinfreier Surfactant beschrieben, der aus Dipalmitoyllezithin und Hexadecanol zusammengesetzt ist.

In der europäischen Patentanmeldung Nr. 110 498 ist ein künstlicher, proteinfreier Surfactant beschrieben, der aus Phospholipiden, neutralen Lipiden und speziellen Fettsäuren besteht.

In der europäischen Patentanmeldung Nr. 119 056 ist eine Kombination eines synthetischen Surfactants, der Cholinphosphoglyceride, saure Phospholipide und Fettsäuren enthält, mit einem Lipoprotein aus Säugetierlunge mit einem Molekulargewicht von ca. 30 000 bis 38 000 beschrieben.

In der PCT-Patentanmeldung Nr. 0 870 237 sind Lungensurfactantproteine beschrieben, die geeignet sind, die Aktivität von Lungensurfactant zu steigern, und die Molekulargewichte von 35 000 bzw. von 5500 bis 9000 aufweisen.

Die zuvor erwähnten künstlichen proteinfreien Surfactantmaterialien haben sich als Substitute für natürlichen Lungensurfactant nicht bewährt. Man hat herausgefunden, dass ein gewisser Anteil an lipophilen Proteinen oder Polypeptiden für die biologische Wirksamkeit des Surfactants unerlässlich ist. Aus diesem Grunde werden in den beiden zuletzt erwähnten Patentanmeldungen auch Kombinationen von Lipiden mit aus Tierlunge isolierten Proteinen beschrieben, die dazu dienen sollen, die Aktivität von künstlichem oder auch natürlichem Surfactant zu steigern.

In der DE-OS Nr. 3 021 006 wird die Herstellung eines Surfactantmaterials zur Behandlung des Atemnotsyndroms beschrieben, das mit Elektrolytlösung aus Säugetierlunge extrahiert wird und zur Erreichung eines Phospholipidgehaltes von 75-95,5% mit der erforderlichen Menge an synthetischen Phospholipiden angereichert wird. Der Proteinanteil beträgt 0,5-5,0%.

Die europäische Patentanmeldung Nr. 0 145 005 beschreibt einen Lungensurfactant, ein Verfahren zu seiner Gewinnung und seine pharmazeutische Verwendung. Die Gewinnung erfolgt entweder durch Extraktion von Lungengewebe bzw. eines wässrigen isotonischen Lungenextrakts mit einem Lipidlösungsmittel, Abtrennung der ungelösten Bestandteile, Abdampfen des Lipidlösungsmittels, Abtrennung der ungelösten Bestandteile, Extraktion des Wirkstoffs mit Alkohol, Abtrennung der alkoholunlöslichen Bestandteile und Entfernung des Alkohols, oder durch Inberührungbringen eines wässrigen isotonischen Lungenextrakts mit einem unlöslichen Adsorbens, beispielsweise Kieselgur, zwecks Adsorption des Wirkstoffes, Desorption des Wirkstoffes mittels organischen Lösungsmitteln und Entfernung des Lösungsmittels.

Der grosse Nachteil dieses Verfahrens besteht darin, dass grosse Mengen toxischer halogenierter Kohlenwasserstoffe oder feuergefährlicher Petroläther als Lipidlösungsmittel verwendet werden müssen.

Weiter sind in der wissenschaftlichen Literatur Verfahren zur Gewinnung von natürlichem Lungensurfactant beschrieben, die sich nur für die Herstellung sehr kleiner Labormengen, nicht aber für grosse Mengen eignen. Bei diesen Verfahren wird der Lungensurfactant durch pervasale Ausspülung einzelner Lungen (S. Bondurant et al., J. Appl. Physiol. 17, 167 (1962)) oder durch bronchiale Spülung einzelner Lungen (J.A. Clements, Proc. Soc. exp. Biol. 95, 170 (1957)) isoliert.

Scarpelli et al., J. Appl. Physiol. 23, 880-886 (1967) gewinnen kleine Mengen Surfactant durch Extraktion von Hunde- oder Kaninchenlunge mit isotonischer NaCl-Lösung und Auftrennung der Bestandteile durch Gelfiltration an Sephadex<R> G 200. Die Gelfiltration führt jedoch zu so hohen Materialverlusten, dass das Verfahren für die Herstellung von kommerziellen Mengen an Surfactant als unbrauchbar angesehen werden muss.

Alle bisher beschriebenen Verfahren zur Herstellung technischer Mengen biologisch aktiver Surfactants zeichnen sich dadurch aus, dass zur Isolierung und Reinigung des Surfactants einerseits sehr aufwendige, vielschrittige Verfahren und andererseits gefährliche, organische Lösungsmittel, wie z.B. stark toxische und die Umwelt sehr stark belastende Chlorkohlenwasserstoffe oder der hoch feuergefährliche Petroläther, verwendet werden.

Der Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, ein industriell durchführbares, einfaches und ungefährliches, die Umwelt schonendes Verfahren zur Herstellung eines oberflächenaktiven und biologisch aktiven Präparates (Lungensurfactant), das eine Lipidkomponente und eine Proteinkomponente enthält und zur therapeutischen Behandlung des Atemnotsyndroms geeignet ist, bereitzustellen.

Bei der Lösung der vorgegebenen Aufgabe wurde überraschenderweise gefunden, dass als Rohstoffquelle zur Herstellung des oberflächenaktiven Präparates ausser Lunge auch andere Organe von Schlachttieren und ausserdem auch Geweberückstände, die bei der wässrigen Extraktion des Proteinaseinhibitors Aprotinin aus Lungengewebe anfallen, für die Extraktion des oberflächenaktiven Präparates geeignet sind. Es wurde ausserdem überraschenderweise gefunden, dass die Extraktion des oberflächenaktiven Präparates aus gemahlenen Schlachttierorganen oder aus Rückständen von bereits wässrig extrahiertem Lungengewebe einfach und sauber mit Alkanolen, z.B. Ethanol, erfolgen kann.

Das oberflächenaktive und biologisch aktive Präparat wird erfindungsgemäss hergestellt

a) durch Extraktion von Organen von Schlachttieren oder von Organrückständen, welche nach wässrigen Extraktionen von Schlachttierorganen zurückbleiben, mittels eines Alkanols mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, Abtrennung des Organrückstandes, Konzentrieren des erhaltenen Extraktes zwecks Abscheidung der Wirksubstanz, Aufnahme der letzteren in einem Alkanol mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Abtrennung von ungelöstem Material und Entfernung des Alkanols, oder
b) durch Extraktion von Organen von Schlachttieren oder von Organrückständen, welche nach wässrigen Extraktionen von Schlachttierorganen zurückbleiben, mittels einer wässrigen Elektrolytlösung oder einer wässrigen Mono- oder Disaccharidlösung, Abtrennung des Organrückstandes, Konzentrieren des Extraktes zwecks Abscheidung der Wirksubstanz,

Aufnahme der letzteren in einem Alkanol mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Abtrennung von ungelöstem Material und Entfernung des Alkanols.

Als Ausgangsmaterial für die Herstellung des erfindungsgemässen Präparates kann man insbesondere Hirn-, Leber-, Herz-, Milz- und/oder Lungengewebe von Rindern (Bovidae), Schweinen, Schafen, Kaninchen oder Geflügel verwenden. Diese Organgewebe können in frischem, gefrorenem oder getrocknetem Zustand verwendet werden. Man kann auch Geweberückstände, die nach wässrigen Extraktionen der genannten Organgewebe zurückbleiben, verwenden, z.B. den Geweberückstand, welcher bei der wässrigen Extraktion von Rinderlungengewebe zwecks Gewinnung von Aprotinin erhalten wird.

Für die alkoholische Extraktion des Organmaterials wird ein Alkanol mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise ein Alkanol mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, z.B. Methanol, Äthanol, n-Propanol, Isopropanol, n-Butanol oder Isobutanol, verwendet. Das Alkanol wird zweckmässigerweise in einem Mengenverhältnis von 4 bis 20 l pro kg Trockensubstanz des Organmaterials verwendet.

Wenn als Ausgangsmaterial ein noch wasserhaltiger Organgeweberückstand, z.B. ein aus der Aprotiningewinnung herrührender Lungengeweberückstand, verwendet wird, kann man wie folgt verfahren:

Der fein zerkleinerte Organgeweberückstand wird zusammen mit dem Alkanol, z.B. 95%igem Äthanol, im Verhältnis von ca. 8 l Alkanol pro kg Trockensubstanz des Organgeweberückstandes während 30 Minuten bis 1 Stunde gerührt. Das Extraktionsgemisch wird filtriert, um Gewebereste zu entfernen. Das Alkanol wird durch Destillation im Vakuum aus dem wässrig-alkoholischen Extrakt entfernt. Man erhält zwei Phasen, nämlich eine wässrige Phase und eine lipophile Phase. Man trennt die Phasen durch Filtration. Die wässrige Phase wird verworfen. Die lipophile Phase wird in einem Alkanol mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, z.B. Methanol, gelöst. Die Lösung wird filtriert, um verbleibendes ungelöstes Material zu entfernen. Durch Eindampfen des Filtrats im Vakuum erhält man einen Rohextrakt, der weitergereinigt werden kann.

Wenn als Ausgangsmaterial getrocknetes Organgewebematerial, z.B. Hirnpulver (erhalten durch Zerkleinern, Mahlen und Gefriertrocknen von gefrorenen Rinderhirnen), verwendet wird, kann man wie folgt verfahren:

Das fein zerkleinerte, trockene Organgewebematerial wird zusammen mit dem Alkanol, z.B. 95%igem Äthanol, im Verhältnis von 10 l Alkanol pro kg Trockenmaterial während 20-30 Minuten gerührt. Das Extraktionsgemisch wird filtriert, um Gewebereste zu entfernen. Durch Destillation im Vakuum wird das Alkanol aus dem erhaltenen alkoholischen Organextrakt entfernt. Man versetzt den Rückstand mit einem Alkanol mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, z.B. Methanol, und filtriert die Lösung, um restliches ungelöstes Material zu entfernen. Durch Eindampfen des Filtrats im Vakuum erhält man einen Rohextrakt, der weitergereinigt werden kann.

Die Extraktion von Organmaterial mit wässrigen Elektrolytlösungen kann in der nachfolgend beschriebenen Weise durchgeführt werden:

Fein zerkleinertes frisches, gefrorenes oder getrocknetes Organmaterial, z.B. fein zerkleinerte Rinderfrischlunge, oder ein bei einer wässrigen Extraktion von Organmaterial erhaltener Organrückstand, z.B. ein Lungengeweberückstand, der nach der wässrigen Extraktion von Rinderlunge zwecks Gewinnung von Aprotinin erhalten wurde, wird zusammen mit einer wässrigen Elektrolytlösung bei Raumtemperatur während 30-60 Minuten gerührt. Als wässrige Elektrolytlösung kann man eine 0,5- bis 5%ige wässrige Lösung von Natriumchlorid, Kaliumchlorid oder Natriumacetat verwenden. Vorzugsweise verwendet man eine 0,5- bis 2%ige wässrige Natriumchloridlösung. Das wässrige Extraktionsgemisch wird zentrifugiert, um nicht gelöstes Gewebematerial abzutrennen. Der wässrige Extrakt wird dann im Vakuum konzentriert, um die Abscheidung der Wirksubstanz zu bewirken.

Die Abscheidung der Wirksubstanz kann nach zwei Methoden bewirkt werden. Die eine Methode besteht darin, den wässrigen Extrakt soweit zu konzentrieren, bis der Extraktrückstand praktisch wasserfrei ist. Die zweite Methode besteht darin, den wässrigen Extrakt auf ca. 10 bis 20% seines Volumens zu konzentrieren und dem Konzentrat ein Alkanol mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, z.B. Methanol oder Äthanol, zuzusetzen, um die Abscheidung der Wirksubstanz zu bewirken. Das Alkanol wird zweckmässigerweise in einem Verhältnis von 2 Volumina Alkanol auf 1 Volumen Konzentrat verwendet. Die abgeschiedene unreine Wirksubstanz bzw. der Extraktrückstand wird in einem Alkanol mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, z.B. Methanol oder Äthanol, aufgenommen. Die Lösung wird durch Filtration von ungelöstem Material befreit. Durch Eindampfen des Filtrates erhält man einen Rohextrakt, der weitergereinigt werden kann.

Die durch die alkoholischen und wässrigen Extraktionen von Organmaterial erhaltenen Rohextrakte können durch Chromatographie an organischen Chromatographiematerialien, z.B. Polydextranen, Agarose, Polyacrylamiden oder Vinylpolymeren, oder an anorganischen Chromatographiematerialien, z.B. Siliciumdioxid, Silikaten, Aluminiumoxid oder Phosphaten, weitergereinigt werden. Als Lösungsmittel für die Chromatographie können Alkanole mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, z.B. Methanol oder Äthanol, oder Gemische dieser Alkanole mit anderen organischen Lösungsmitteln, z.B. Gemische von Methanol oder Äthanol mit Methylenchlorid oder Äthylacetat, verwendet werden. Man kann als Lösungsmittel auch wässrige Elektrolytlösungen oder Gemische derselben mit den genannten Alkoholen verwenden. Die Chromatographie wird zweckmässigerweise fraktioniert durchgeführt.

Die dabei anfallenden Vor- und Nebenfraktionen werden verworfen, während das gereinigte oberflächenaktive und biologisch aktive Präparat aus der Hauptfraktion durch Abdampfen des Lösungsmittels im Vakuum isoliert wird.

Die Rohextrakte können ferner durch Chromatographie in die Lipidkomponente und die Proteinkomponente aufgetrennt werden. Man vereinigt die beiden chromatographisch gereinigten Komponenten wieder, um ein fertiges oberflächenaktives und biologisch aktives Präparat (Lungensurfactant) zu erhalten.

Zur Herstellung eines therapeutischen Mittels zur Behandlung des Atemnotsyndroms wird das gereinigte, oberflächenaktive und biologisch aktive Präparat zweckmässigerweise in die galenische Form einer sterilen, wässrig-salinen Suspension übergeführt, die als Bolus, Spray oder Ärosol appliziert werden kann.

Die Sterilisation erfolgt am schonendsten durch Sterilfiltration unter aseptischen Bedingungen, indem die vereinigten Hauptfraktionen der zuvor beschriebenen Chromatographie durch eine 0,2 mu m Sterilmembrane filtriert werden und die nachfolgenden Verfahrensschritte unter aseptischen Bedingungen durchgeführt werden, oder indem der gereinigte und isolierte Wirkstoff in einer Trägerflüssigkeit, z.B. isotonischer Natriumchloridlösung, mittels eines Mikrofluidizers oder eines Homogenisators so fein suspendiert wird, dass Partikel mit einer Grösse von maximal 0,2 mu m Durchmesser entstehen, und die so erhaltene Mikrosuspension durch eine 0,2 mu m Sterilmembrane filtriert wird.

Die Konzentration des oberflächenaktiven und biologisch aktiven Präparates in der Trägerflüssigkeit wird so eingestellt, dass eine Konzentration von 20-500 mg gereinigten Präparates pro ml Trägerflüssigkeit erhalten wird.

Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele erläutert.

Beispiel 1

1,5 kg Rinderlungenrückstände mit einem Trockenrückstand von 25,9 Gewichts-%, die von der wässrigen Extraktion des Aprotinins aus tiefgefrorener Rinderlunge herrührten, wurden mit 3 l 95 volum-%igem Ethanol versetzt und bei Raumtemperatur während 30 Minuten intensiv gerührt. Der alkoholische Organbrei wurde auf einer groben Nutsche unter Vakuum filtriert und ergab ca. 3 l wässrig-alkoholischen Lungenextrakt. Der Geweberückstand wurde verworfen. Der Alkohol wurde im Vakuum abdestilliert, wodurch man ein zweiphasiges Gemisch erhielt, das aus einer wässrigen Phase und einer Lipidphase bestand. Die Lipidphase wurde von der wässrigen Phase getrennt, indem das Gemisch durch ein Papierfilter filtriert wurde.

Extraktion der abgetrennten wässrigen Phase mit Methylenchlorid und Eindampfen des Methylenchloridextraktes zur Trockene zeigten, dass keine lipophilen Substanzen in der wässrigen Phase zurückgeblieben waren.

Bei der Trennung der Phasen blieben 15,1 g lipophile Substanz auf dem Filterpapier zurück. Die erhaltene lipophile Substanz wurde in 150 ml Methanol aufgenommen, und die Lösung wurde klarfiltriert. Danach wurde das Methanol im Vakuum abgedampft. Man erhielt 14,6 g oberflächenaktives Rohpräparat. Das Rohpräparat wurde in 120 ml Methanol gelöst. Zur Reinigung wurde die Lösung auf eine Chromatographiesäule, die mit Sephadex<R> LH 20 (Polydextran) gefüllt war, gebracht und mittels Methanol fraktioniert. Die oberflächenaktiven Chromatographiefraktionen wurden vereinigt, worauf das Methanol im Vakuum abgedampft wurde. Es blieben 5,1 g gereinigtes, oberflächenaktives Präparat zurück. Eine Probe dieses Materials wurde nach der nachstehend beschriebenen Methode im Kaninchenfötustest auf biologische Aktivität geprüft und erwies sich als biologisch wirksam.

Beispiel 2

1,0 kg gefrorenes Rinderhirn wurde mit einem Messermixer zu einem feinen Brei zerkleinert, der gefriergetrocknet wurde. Die daraus erhaltenen 200 g wasserfreies Lyophilisat wurden zu einem Pulver zerstossen, in ein Extraktionsgefäss gebracht und mit 2 l 95 volum-%igem Ethanol unter intensivem Rühren extrahiert. Das Gemisch wurde anschliessend durch eine G1-Filternutsche filtriert. Der unlösliche Geweberückstand wurde verworfen, während aus den erhaltenen 1,95 l alkoholischem Hirnextraktfiltrat der Alkohol im Vakuum abdestilliert wurde. Man erhielt als Rückstand 57,4 g Rinderhirnlipide, die in 500 ml Methanol aufgenommen und während 10 Minuten gerührt wurden. Anschliessend wurde der unlösliche Anteil abfiltriert, worauf das Filtrat im Vakuum zur Trockene eingeengt wurde. Man erhielt 35 g oberflächenaktives Lipidmaterial, das zur Reinigung in 280 ml Ethanol aufgenommen wurde.

Die Mischung wurde filtriert, und das Filtrat wurde an Sephadex<R> LH 60 mit Ethanol chromatographiert. Mit einem Fraktionensammler wurden Fraktionen zu je 20 ml Eluat gesammelt. Die oberflächenaktiven Fraktionen wurden vereinigt, und der Alkohol wurde im Vakuum bei 30 DEG C abgedampft. Als Rückstand erhielt man 8,8 g oberflächenaktives Präparat, das sich im Kaninchenfötustest als biologisch wirksam erwies.

Beispiel 3

2,4 kg frische Rinderlunge wurden in einem Cutter 10 Minuten lang zu einem feinen Gewebebrei gemahlen, in einen Extraktor übergeführt, darin unter Zusatz von 3,0 l 1,5%iger NaCl-Lösung eine halbe Stunde unter intensivem Rühren bei Raumtemperatur extrahiert und anschliessend zentrifugiert. Die Zentrifugation ergab 3,1 l trüben Überstand und 2,3 kg Geweberückstand, der verworfen wurde. Der Überstand wurde im Vakuum auf 400 ml konzentriert, mit 800 ml 95 volum%igem Ethanol versetzt und filtriert. Die Filtration ergab 8,1 g lipophilen Rückstand, der in 80 ml Methanol aufgenommen, gerührt und filtriert wurde. Das Filtrat wurde im Vakuum eingedampft und ergab 1,7 g Rohpräparat, das wiederum in 14 ml Methanol aufgenommen, gerührt und filtriert wurde.

Das methanolische Filtrat wurde wie in Beispiel 1 beschrieben weitergereinigt und ergab 1 g gereinigtes oberflächenaktives Präparat, das sich im Kaninchenfötustest als biologisch aktiv erwies.

Beispiel 4

800 kg tiefgefrorene Rinderlunge wurden in 8 Portionen zu je 100 kg mit einem Messercutter zu einem feinen Brei gemahlen. Der Lungenbrei wurde in einen 2000-l-Extraktor übergeführt und mit 1220 L Wasser gemischt. Das Gemisch wurde mit Salzsäure auf einen pH-Wert von 4 eingestellt, während 1 Stunde gerührt, kurz auf 80 DEG C erhitzt und mittels einer mit Filtertüchern bestückten Filterpresse filtriert. Die Filtration ergab das Filtrat I und den Geweberückstand I. Der Geweberückstand I wurde abermals mit 800 l Wasser während 30 Minuten extrahiert. Anschliessend wurde die Mischung wie zuvor filtriert. Man erhielt das Filtrat II und 515 kg Lungengeweberückstand II. Durch Vereinigung des Filtrates II mit dem Filtrat I wurden ca. 2000 l Lösung erhalten, die keine oberflächenaktive Substanz enthielt. Die Lösung wurde zur Gewinnung von Aprotinin weiter aufgearbeitet.

Die 515 kg feuchter Lungengeweberückstand II wurden in einen 2000-l-Extraktor übergeführt, mit 1030 l 95 volum-%igem Ethanol versetzt und 1 Stunde intensiv gerührt. Das Gemisch wurde mittels einer mit Filtertüchern bestückten Filterpresse filtriert. Man erhielt einen wässrig -alkoholischen Lungenextrakt und Geweberückstand, der verworfen wurde. Aus dem erhaltenen wässrig-alkoholischen Lungenextrakt wurde der Alkohol im Vakuum abdestilliert, wodurch ein zweiphasiges Gemisch erhalten wurde, das aus einer wässrigen und einer lipophilen Phase bestand. Die Phasentrennung wurde durch Filtration durch ein Nylonfiltertuch erreicht und ergab 5,1 kg lipophile Substanz. Die lipophile Substanz wurde in 51 l Methanol aufgenommen und 30 Minuten gerührt. Anschliessend wurde durch Filtration durch eine Cellulosefilterschicht unlösliches Material abgetrennt.

Das methanolische Filtrat wurde im Vakuum eingedampft und ergab 4,3 kg Rohextrakt, der, wie im Beispiel 5 beschrieben, durch Chromatographie weitergereinigt wurde.

Beispiel 5

300 g Rohextrakt, der gemäss Beispiel 4 hergestellt worden war, wurden in 2,4 l Methanol gelöst. Diemethanolische Lösung wurde klarfiltriert und anschliessend auf eine Chromatographiesäule, die mit 100 l Sephadex<R> LH (Polydextran) gefüllt war, aufgetragen. Nach dem Auftragen wurde die Substanz mit 110 l Methanol chromatographiert. Das Eluat wurde in Fraktionen zu je 5 l aufgefangen und ergab 22 Fraktionen. Der Verlauf der Chromatographie wurde überwacht, indem die UV-Lichtabsorption des Eluats kontinuierlich aufgezeichnet wurde. Anhand der erhaltenen Chromatographiekurve wurden die erhaltenen Eluatfraktionen in 7 Vorfraktionen, 6 Hauptfraktionen und 9 Nebenfraktionen eingeteilt. Die Vor- und Nebenfraktionen wurden verworfen.

Die 6 Hauptfraktionen wurden vereinigt, im Vakuum eingeengt und ergaben 104 g gereinigtes Präparat, das sich im Kaninchenfötustest als biologisch aktiv erwies.

Beispiel 6

8g Rohextrakt, der gemäss Beispiel 4 hergestellt worden war, wurden in 64 ml Methanol gelöst. Die methanolische Lösung wurde klarfiltriert und anschliessend auf eine Chromatographiesäule, die mit 10 l Sephadex<R> LH (Polydextran) gefüllt war, aufgetragen. Nach dem Auftragen der Substanz wurde diese mit 10,5 l Methanol fraktionierend chromatographiert. Nach einem Eluatvorlauf von 3,5 l wurde das Eluat in 14 Fraktionen zu je 640 ml aufgefangen. Der Verlauf der Chromatographie wurde überwacht, indem die UV-Lichtabsorption des Eluates kontinuierlich aufgezeichnet und jeder Fraktionenwechsel markiert wurde.

Anhand sowohl der erhaltenen Chromatographiekurve als auch von Dünnschichtchromatogrammen und Proteinbestimmungen der einzelnen Fraktionen ergab sich, dass in der Fraktion 1 die Proteinkomponente und in den Fraktionen 2-5 die Lipidkomponente angereichert war, während die folgenden 9 Fraktionen nur noch Ballaststoffe enthielten. Die Fraktion 1 wurde im Vakuum eingedampft und ergab 0,5 g Proteinanteil. Die Fraktionen 2-5 wurden vereinigt, ebenfalls im Vakuum eingedampft und ergaben 2,7 g Lipidanteil. Die restlichen 9 Fraktionen wurden vereinigt, eingedampft und ergaben 4,8 g Ballaststoffe. Der so gereinigte Lipidanteil wurde mit dem gereinigten Proteinanteil gemischt. Das Gemisch erwies sich im Kaninchenfötustest als biologisch aktiv.

Beispiel 7

1,5 kg feuchter Lungengeweberückstand II mit einem Trockenrückstand von 28,7 Gewichts-%, der bei der Aprotiningewinnung anfiel und gemäss Beispiel 4 erhalten worden war, wurde mit 3 l 1,5%iger Natriumchloridlösung während 40 Minuten gerührt. Das Gemisch wurde anschliessend zentrifugiert und der Überstand wurde vom Geweberückstand abgetrennt. Die erhaltenen 2,8 l Überstand wurden im Vakuumrotationsverdampfer bei 53 DEG C praktisch zur Trockene eingedampft. Man erhielt 72,8 g Rückstand, der in 360 ml Methanol aufgenommen wurde. Das Gemisch wurde durch eine Glasnutsche filtriert. Der unlösliche Rückstand wurde mit 180 ml Methanol nachgewaschen und dann verworfen. Das methanolische Filtrat und die methanolische Waschlösung wurden vereinigt und im Vakuum eingedampft. Man erhielt 17,53 g Rohextrakt, der, wie im Beispiel 5 beschrieben, durch Chromatographie weitergereinigt wurde.

Schliesslich erhielt man 4,3 g gereinigtes oberflächenaktives Präparat, das sich im Kaninchenfötustest als biologisch aktiv erwies.

Die biologische Aktivität der gemäss den Beispielen hergestellten oberflächenaktiven Präparate wurde nach der Methode von B. Lachmann an Kaninchenföten mit unreifen Lungen geprüft (siehe B. Lachmann, "New aspects in pathophysiology and therapy of respiratory distress syndrome: criteria for characterisation of exogenous surfactant deficient animal models"; in: Selected Topics in Perinatal Medicine, CIC Edizioni Internationali, Rom, 1986, S. 177).

Unreife Kaninchenföten wurden am 27. Schwangerschaftstag durch Hysterotomie geboren. Unmittelbar nach der Geburt wurden die lebenden Föten tracheotomiert, in einen druckkonstanten Ganzkörperplethysmographen gebracht und mit reinem Sauerstoff beatmet. Die Föten eines Muttertieres wurden in 2 Gruppen I und II aufgeteilt. Die Föten der Gruppe I erhielten über eine Trachealkanüle je 300 mcl einer Suspension der oberflächenaktiven Präparatprobe in die Trachea instilliert. Die Suspension wurde durch Auflösen von 500 mg Präparatprobe in 5 ml physiologischer Kochsalzlösung hergestellt. Die Föten der Gruppe II blieben unbehandelt und dienten als Kontrolle.

Die Primärdaten, nämlich Beatmungsdruck und Atemvolumen, wurden vom Gerät während der gesamten Versuchsdauer kontinuierlich registriert. Aus den aufgezeichneten Primärdaten, 15 Minuten nach der ersten Probenverabreichung, wurde die Thorax-Lungen-Compliance nach der folgenden Formel berechnet und bewertet:
EMI15.1

Die Thorax-Lungen Compliance ist definiert als die elastische Volumendehnbarkeit der Lunge im Thorax.

Die Resultate sind in der nachfolgenden Tabelle zusammengestellt.
<tb><TABLE> Columns=3
<tb>Title: Biologische Wirksamkeit
<tb>Head Col 01 AL=L: Probe aus Beispiel Nr.
<tb>Head Col 02 AL=L: Compliance bei
einem Beatmungsdruck von 25 mbar
<tb>Head Col 03 AL=L: Beurteilung der Wirksamkeit
<tb> <SEP>1. Rohpräparat <SEP>0,8 <SEP>gut
<tb> <SEP>1. Gereinigtes Präparat <SEP>1,2 <SEP>gut
<tb> <SEP>2. Rohlipidmaterial <SEP>0,5 <SEP>ungenügend
<tb> <SEP>2. Gereinigtes lipophiles Präparat <SEP>1,0 <SEP>gut
<tb> <SEP>3. Rohsurfactant <SEP>1,5 <SEP>sehr gut
<tb> <SEP>3. Gereinigter Surfactant <SEP>1,7 <SEP>sehr gut
<tb> <SEP>Kontrolle <SEP>0,1 <SEP>ungenügend
<tb></TABLE>

Die unbehandelten Kontrolltiere wiesen im Kaninchenfötentest eine Compliance von ca. 0,1 ml/mbar pro kg auf, d.h. dass praktisch keine Lungenvolumendehnbarkeit vorhanden war. Proben, die im Test die Compliance von 0,1 auf bis 0,6 ml/mbar pro kg erhöhen, werden als ungenügend, Proben, welche die Compliance auf 0,6-1,2 ml/mbar pro kg steigern, werden als gut und Proben, welche die Compliance auf 1,3-2,4 ml/mbar pro kg oder darüber steigern, werden als sehr gut wirksam beurteilt.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines oberflächenaktiven und biologisch aktiven Präparates, welches eine Lipidkomponente und eine Proteinkomponente enthält und zur therapeutischen Behandlung des Atemnotsyndroms geeignet ist, dadurch gekennzeichnet, dass man a) Organe von Schlachttieren oder Organrückstände, welche nach wässrigen Extraktionen von Schlachttierorganen zurückbleiben, mittels eines Alkanols mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen extrahiert, den Organrückstand abtrennt, den erhaltenen Extrakt zwecks Abscheidung der Wirksubstanz konzentriert, die letztere in einem Alkanol mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen aufnimmt, ungelöstes Material abtrennt und das Alkanol entfernt, oder dass man b) Organe von Schlachttieren oder Organrückstände, welche nach wässrigen Extraktionen von Schlachttierorganen zurückbleiben,

mittels einer wässrigen Elektrolytlösung oder einer wässrigen Mono- oder Disaccharidlösung extrahiert, den Organrückstand abtrennt, den Extrakt zwecks Abscheidung der Wirksubstanz konzentriert, die letztere in einem Alkanol mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen aufnimmt, ungelöstes Material abtrennt und das Alkanol entfernt.

2. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man Hirn-, Leber-, Herz-, Milz- und/oder Lungengewebe von Rindern, Bovidae, Schweinen, Schafen, Kaninchen oder Geflügel verwendet.

3.

Verfahren nach den Patentansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass man einen fein zerkleinerten wasserhaltigen Organrückstand mit dem C1-C10 Alkanol extrahiert, ungelöste Bestandteile abtrennt, das Alkanol abdampft, die lipophile Phase des erhaltenen Extraktes von der wässrigen Phase abtrennt, die lipophile Phase in einem Alkanol mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen aufnimmt, nicht gelöste Bestandteile abtrennt und zur Gewinnung eines Rohextraktes das Alkanol abdampft.

4. Verfahren nach den Patentansprüchen 1-3, dadurch gekennzeichnet, dass man als Organrückstand einen Lungengeweberückstand, welcher nach der wässrigen Extraktion von Rinderlunge zwecks Gewinnung von Aprotinin erhalten wurde, verwendet.

5.

Verfahren nach den Patentansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass man ein fein zerkleinertes, getrocknetes Organmaterial mit dem C1-C10 Alkanol extrahiert, nicht gelöste Bestandteile abtrennt, das Alkanol abdampft, den lipophilen Rückstand in einem Alkanol mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen aufnimmt, nicht gelöste Bestandteile abtrennt und zur Gewinnung eines Rohextraktes das Alkanol abdampft.

6.

Verfahren nach den Patentansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass man ein fein zerkleinertes frisches, gefrorenes oder getrocknetes Organ oder einen Organrückstand mittels einer 0,5- bis 5%igen wässrigen Elektrolytlösung, vorzugsweise einer 0,5- bis 2%igen wässrigen Natriumchloridlösung, extrahiert, nicht gelöste Gewebeteile abtrennt, den erhaltenen wässrigen Extrakt zu einem praktisch wasserfreien Rückstand einengt, den Rückstand in einem Alkanol mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen aufnimmt, ungelöstes Material entfernt und das Alkanol zwecks Gewinnung eines Rohextraktes abdampft.

7.

Verfahren nach den Patentansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass man ein fein zerkleinertes frisches, gefrorenes oder getrocknetes Organmaterial oder einen Organrückstand mittels einer 0,5- bis 5%igen wässrigen Elektrolytlösung, vorzugsweise einer 0,5- bis 2%igen wässrigen Natriumchloridlösung extrahiert, nicht gelöste Gewebeanteile abtrennt, den erhaltenen wässrigen Extrakt auf 10-20% seines Volumens konzentriert, dem Konzentrat sein 2faches Volumen an Alkanol mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen zugibt, um die Abscheidung des Wirkstoffes zu bewirken, den letzteren abtrennt und in einem Alkanol mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen aufnimmt, nicht gelöste Bestandteile abtrennt und zur Gewinnung eines Rohextraktes das Alkanol abdampft.

8.

Verfahren nach einem der Patentansprüche 1-7, dadurch gekennzeichnet, dass man den Rohextrakt durch Chromatographie einer Lösung desselben in einem Alkanol mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder in einem Gemisch eines solchen Alkanols mit einem anderen organischen Lösungsmittel reinigt.

9. Verfahren nach Patentanspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass man Methanol oder Äthanol, oder ein Gemisch von Methanol oder Äthanol mit Äthylacetat oder Methylenchlorid als Lösungsmittel für die Chromatographie verwendet.

10. Verfahren nach den Patentansprüchen 8 und 9, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Chromatographiematerial auf Polydextran-, Agarose-, Polyacrylamid- oder Vinylpolymerbasis verwendet.

11. Verfahren nach den Patentansprüchen 8-10, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Chromatographiematerial auf Basis von Siliciumdioxid, Silikaten, Aluminiumoxid oder Phosphaten verwendet.

12.

Oberflächenaktives und biologisch aktives Präparat, welches eine Lipidkomponente und eine Proteinkomponente enthält und zur Behandlung des Atemnotsyndroms geeignet ist, hergestellt nach einem Verfahren gemäss einem der Patentansprüche 1-11.

13. Therapeutisches Mittel zur Behandlung des Atemnotsyndroms, gekennzeichnet durch einen Gehalt an oberflächenaktivem und biologisch aktivem Präparat nach Patentanspruch 12.

14. Therapeutisches Mittel nach Patentanspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass es 20 bis 500 mg des genannten Präparates pro ml einer Trägerflüssigkeit enthält.

15. Therapeutisches Mittel nach den Patentansprüchen 13 und 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Trägerflüssigkeit eine wässrige isotonische Elektrolytlösung ist. 1. Verfahren zur Herstellung eines oberflächenaktiven und biologisch aktiven Präparates, welches eine Lipidkomponente und eine Proteinkomponente enthält und zur therapeutischen Behandlung des Atemnotsyndroms geeignet ist, dadurch gekennzeichnet, dass man a) Organe von Schlachttieren oder Organrückstände, welche nach wässrigen Extraktionen von Schlachttierorganen zurückbleiben, mittels eines Alkanols mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen extrahiert, den Organrückstand abtrennt, den erhaltenen Extrakt zwecks Abscheidung der Wirksubstanz konzentriert, die letztere in einem Alkanol mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen aufnimmt, ungelöstes Material abtrennt und das Alkanol entfernt, oder dass man b) Organe von Schlachttieren oder Organrückstände, welche nach wässrigen Extraktionen von Schlachttierorganen zurückbleiben,

mittels einer wässrigen Elektrolytlösung oder einer wässrigen Mono- oder Disaccharidlösung extrahiert, den Organrückstand abtrennt, den Extrakt zwecks Abscheidung der Wirksubstanz konzentriert, die letztere in einem Alkanol mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen aufnimmt, ungelöstes Material abtrennt und das Alkanol entfernt. 2. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man Hirn-, Leber-, Herz-, Milz- und/oder Lungengewebe von Rindern, Bovidae, Schweinen, Schafen, Kaninchen oder Geflügel verwendet. 3.

Verfahren nach den Patentansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass man einen fein zerkleinerten wasserhaltigen Organrückstand mit dem C1-C10 Alkanol extrahiert, ungelöste Bestandteile abtrennt, das Alkanol abdampft, die lipophile Phase des erhaltenen Extraktes von der wässrigen Phase abtrennt, die lipophile Phase in einem Alkanol mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen aufnimmt, nicht gelöste Bestandteile abtrennt und zur Gewinnung eines Rohextraktes das Alkanol abdampft. 4. Verfahren nach den Patentansprüchen 1-3, dadurch gekennzeichnet, dass man als Organrückstand einen Lungengeweberückstand, welcher nach der wässrigen Extraktion von Rinderlunge zwecks Gewinnung von Aprotinin erhalten wurde, verwendet. 5.

Verfahren nach den Patentansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass man ein fein zerkleinertes, getrocknetes Organmaterial mit dem C1-C10 Alkanol extrahiert, nicht gelöste Bestandteile abtrennt, das Alkanol abdampft, den lipophilen Rückstand in einem Alkanol mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen aufnimmt, nicht gelöste Bestandteile abtrennt und zur Gewinnung eines Rohextraktes das Alkanol abdampft. 6.

Verfahren nach den Patentansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass man ein fein zerkleinertes frisches, gefrorenes oder getrocknetes Organ oder einen Organrückstand mittels einer 0,5- bis 5%igen wässrigen Elektrolytlösung, vorzugsweise einer 0,5- bis 2%igen wässrigen Natriumchloridlösung, extrahiert, nicht gelöste Gewebeteile abtrennt, den erhaltenen wässrigen Extrakt zu einem praktisch wasserfreien Rückstand einengt, den Rückstand in einem Alkanol mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen aufnimmt, ungelöstes Material entfernt und das Alkanol zwecks Gewinnung eines Rohextraktes abdampft. 7.

Verfahren nach den Patentansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass man ein fein zerkleinertes frisches, gefrorenes oder getrocknetes Organmaterial oder einen Organrückstand mittels einer 0,5- bis 5%igen wässrigen Elektrolytlösung, vorzugsweise einer 0,5- bis 2%igen wässrigen Natriumchloridlösung extrahiert, nicht gelöste Gewebeanteile abtrennt, den erhaltenen wässrigen Extrakt auf 10-20% seines Volumens konzentriert, dem Konzentrat sein 2faches Volumen an Alkanol mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen zugibt, um die Abscheidung des Wirkstoffes zu bewirken, den letzteren abtrennt und in einem Alkanol mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen aufnimmt, nicht gelöste Bestandteile abtrennt und zur Gewinnung eines Rohextraktes das Alkanol abdampft. 8.

Verfahren nach einem der Patentansprüche 1-7, dadurch gekennzeichnet, dass man den Rohextrakt durch Chromatographie einer Lösung desselben in einem Alkanol mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder in einem Gemisch eines solchen Alkanols mit einem anderen organischen Lösungsmittel reinigt. 9. Verfahren nach Patentanspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass man Methanol oder Äthanol, oder ein Gemisch von Methanol oder Äthanol mit Äthylacetat oder Methylenchlorid als Lösungsmittel für die Chromatographie verwendet. 10. Verfahren nach den Patentansprüchen 8 und 9, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Chromatographiematerial auf Polydextran-, Agarose-, Polyacrylamid- oder Vinylpolymerbasis verwendet. 11. Verfahren nach den Patentansprüchen 8-10, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Chromatographiematerial auf Basis von Siliciumdioxid, Silikaten, Aluminiumoxid oder Phosphaten verwendet. 12.

Oberflächenaktives und biologisch aktives Präparat, welches eine Lipidkomponente und eine Proteinkomponente enthält und zur Behandlung des Atemnotsyndroms geeignet ist, hergestellt nach einem Verfahren gemäss einem der Patentansprüche 1-11. 13. Therapeutisches Mittel zur Behandlung des Atemnotsyndroms, gekennzeichnet durch einen Gehalt an oberflächenaktivem und biologisch aktivem Präparat nach Patentanspruch 12. 14. Therapeutisches Mittel nach Patentanspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass es 20 bis 500 mg des genannten Präparates pro ml einer Trägerflüssigkeit enthält. 15. Therapeutisches Mittel nach den Patentansprüchen 13 und 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Trägerflüssigkeit eine wässrige isotonische Elektrolytlösung ist.