CH678064A5 - - Google Patents

Description

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CH 678 064 A5

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Beschreibung

Die Erfindung ist in der Biotechnologie, besonders in der technischen Mikrobiologie, Pharmazie und Lebensmittelproduktion einsetzbar.

Für die Immobilisierung von Mikroorganismen und Biokatalysatoren sind verschiedene Prinziplösungen (Trägerbindung, Vernetzung, Einhüllung und Membrantrennung) ausserdem Mischformen und Modifikationen dieser Lösungen bekannt (Hartmeier, W., Naturwissenschaften 72, 310-314,1985). Im Zusammenhang mit der Membrantrennung sind die Vorteile extrahierter pflanzlicher Zellen für die Immobilisierung von Biokatalysatoren zu erwähnen, die als technische Lösung in der DE-OS 3 347 512 dargestellt ist» Es ist auch ein Verfahren zur Einführung von Mikroorganismen in leere Pflanzenzellen bekannt (DE-OS 3 629 692). Es setzt voraus, dass die extrahierten Zellen eines Pflanzengewebes oder einer Pflanze, Zellwand-Durchbrüche aufweisen, durch die in Verbindung mit Flüssigkeitsaufnahme Mikroorganismen eingesaugt werden können. Die Immobilisierung wird durch mechanisch feste Zellwände bewirkt, die den Stoffaustausch mit dem Medium kaum einschränken. Die Gebrauchseigenschaften der in Pflanzenzellen derartig verkapselten Mikroorganismen sind stark von der Art des pflanzlichen Trägermittels abhängig. Für einen hohen Beladungsgrad ist wichtig, dass die Mehrzahl der Zellen einzelne Zellwand-Durchbrüche besitzen. Diese Durchbrüche dürfen nicht so gross oder so zahlreich sein, dass die im Inneren der Zellen vermehrten Mikroorganismen den Hohlraum leicht wieder verlassen können, da sonst die Abgabe der freien Mikroorganismen an das Medium ein störendes Ausmass erreicht. Als bedingt für den technischen Einsatz geeignet haben sich bisher die Hyalozyten bestimmter Torfmoosarten (Sphagnum-Arten) und zerkleinerte Parenchymgewebe erwiesen (DE-OS 3 629 692). Die Myalozyten bestimmter Torfmoosarten können leicht und relativ vollständig mit Mikroorganismen, beispielsweise Hefen, gefüllt werden.

Die technische Nutzung der mit Hefe gefüllten Torfmoos-Sprosse wird jedoch u.a. dadurch erschwert, dass die ästige Struktur der Sphagnum-Sprosse der Erzeugung dichter Packungen und dem Einsatz von Rührgeräten entgegensteht, dass ein lockeres Anhaften der Mikroorganismen zwischen den Blättchen unvermeidbar ist und vor allem dadurch, dass bei der Herstellung der Immobllisate auf natürliche Standorte von Sphagnum-Arten zurückgegriffen werden muss, Methoden zur Sterilkultur von Torfmoosen sind bisher nicht bekannt Dies bringt neben der umweltabhängigen Variation der Porenzahl und Porengrösse das Problem mit sich, dass die Sprosse von Hand gesäubert werden müssen und dass unkontrollierbare Kontaminationen auftreten. Die ebenfalls bekannte Möglichkeit der Verwendung zerkleinerter Parenchymgewebe (DE-OS 3 629 692) ist dadurch begrenzt, dass in den geeigneten Materialien (Apfel- und Rübenpar-enchym, Albedo der Zitrusfrüchte) eine grosse Zahl von Zellen nicht beimpfbar oder mechanisch instabil ist und dass die verletzten Zellen an den

Oberflächen zuviel Raum für eine lockere Immobilisierung der Mikroorganismen bieten. Eine technisch verwertbare Möglichkeit zur Immobilisierung zellfreier Enzyme im Lumen lokal geöffneter Pflanzenzellen ist bisher nicht bekannt.

Das Ziel der Erfindung ist ein verbesserter Biokatalysemodul auf der Grundlage denaturierter Pflanzen oder Pflanzenteile, der vielseitig in der Biotechnologie einsetzbar sein soll.

Die Aufgabe der Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Biokatalysemoduls auf der Grundlage denaturierter Pflanzen oder Pflanzenteile, in dem Fremdzellen oder Fremdenzyme nach dem Prinzip der Membrantrennung immobilisiert vorliegen, wobei die Immobilisierung der Fremdzellen oder -enzyme nicht vom Vorhandensein einzelner Zellwand-Durchbrüche in den Pflanzenzeilen abhängt, und eines Verfahrens zur Herstellung des Moduls. Die Aufgabe wird erfindungsgemäss nach Patentanspruch 1 gelöst. Das Aerenchym ist das ursprünglich in der lebenden Pflanze als extrazeüu-lärer Gasraum vorliegende Hohlraumsystem miteinander verbundener Interzellularen oder ein Hohlraumsystem von Luftkammern, das Wasserpflanzen einen Auftrieb verleiht. Es ist nach aussen nicht allein durch eine Zellwand, sondern durch mindestens eine, dicht geschlossene, mechanisch sehr stabile Zellschicht (die Epidermis) oder ein mehrschichtiges Abschlussgewebe begrenzt. Die wirksame Trennmembran ist ein pflanzliches Abschlussgewebe.

Die scharfe Ausschlussgrenze dieser Membran bewirkt, dass eingeführte zellfreie Enzyme oder hochmolekulare Ausscheidungsprodukte eingeführter Fremdzellen wie Dextrane, Enzyme oder Antikörper im Inneren des pflanzlichen Hohlträgers gehalten werden. Für den Stoffaustausch steht die gesamte, für niedermolekulare Verbindungen hoch-permeable Oberfläche des Hohlträgers zur Verfügung. Zur Herstellung des Biokatalysemoduls werden nur solche Pflanzen oder Pflanzenteile eingesetzt, die eine schnelle Einstellung des Diffusionsgleichgewichtes für die Nährstoffe der Mikroorganismen bzw. Fremdzellen oder die Produkte und Substrate von Enzymen zwischen dem inneren Hohtraumsystem und dem Medium ermöglichen. Der pflanzliche Hohlträger besteht vorzugsweise aus besonders permeablen pflanzlichen Strukturen mit weitgehend unverletzter Epidermis und hohem Volumenanteil des Aerenchyms. Geeignete Ausgangsmaterialien sind wegen der geringen Diffusionsstrecken und der nicht oder wenig entwickelten Cuticule die Sprossglieder der Lem-naceen, submers gewachsene Wurzeln von Hygrophyten, bandförmige Blätter untergetauchter Pflanzen oder Schwimmthalli des Lebermooses Riccia flui-tans. In den genannten pflanzlichen Strukturen wachsen die in das Aerenchym eingeführten Fremdzellen, z.B. Hefen, sehr schnell, wenn das denaturierte beimpfte Pflanzenmaterial in einem geeigneten Medium inkubiert wird. Die eingeführten Biokatalysatoren werden um so sicherer immobilisiert, je geringer der Oberflächenanteil offener Verbindungen zwischen dem Aerenchym und dem Medium ist, je weiter entfernt sie sich von diesen offenen

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Verbindungen befinden und je geringer ihre Beweglichkeit im Aerenchym ist. Die Sicherheit der Immobilisierung kann im Bedarfsfall dadurch verbessert werden, dass die Viskosität oder der Strömungswiderstand im Aerenchym durch Koagulate oder Kristalle vergrössert bzw. die Beweglichkeit der Zellen durch Anwendung von Flockungsmitteln verringert wird, ausserdem dadurch, dass offene Verbindungen zwischen dem Aerenchym und dem Medium durch ein Gel, Kristalle oder eine undurchlässige Haut unterbrochen werden.

Die immobilisierten Fremdzellen, z.B. Hefen, Pilze, Bakterien, tierische und pflanzliche Zellen) können im lebenden oder permeabilisierten Zustand als Biokatalysatoren, z.B. für die Herstellung von Ethanol, ethanolhaltigen Getränken, Antibiotika, Antikörpern und pflanzlichen Sekundärstoffen eingesetzt werden. Daher ist der Erfindungsanspruch nicht auf die in den Anwendungsbeispielen genannten Organismenarten und Stoffwandelungsprozes-se begrenzt.

Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemässen Bio-katalysemoduls nach Anspruch 6. Die in das Hohlraumsystem der Interzellularen eingeführten Zellen und Enzyme breiten sich auch dann im gesamten Hohlträger aus, wenn die zur Einführung genutzte Öffnung im Abschlussgewebe sehr klein ist.

Die aerenchymreichen bandförmigen oder zylindrischen Pflanzenkörper ermöglichen auch die bisher nicht bekannte Einführung zelifreier Enzyme in einem pflanzlichen Hohlträger, z.B. in aerenchymreichen lyophilisierte Wurzeln. Ein hoher Immobilisierungsgrad von im Aerenchym lokalisierten Enzymen wird bei ausreichender Länge eindimensional ausgedehnter Hohlträger selbst bei offenen Schnittflächen deshaib möglich, weil die Diffusion der Kolloide im Zentimeterbereich vernachiässigbar ist.

Die Vorteile des Biokatalysemoduls ergeben sich allgemein aus der Struktur (glatte, dehnungsfeste und mechanisch belastbare, hochpermeable Hautschicht mit idealen Ultrafiltereigenschaften) und speziell aus der Vielfalt der einsetzbaren Pflanzen und Pflanzenteile sowie aus der axenischen in vitro-Kultivierbarkeit der pflanzlichen Ausgangsmaterialien. Die axenische Kultur der erfindungsgemäss eingesetzten Pflanzen gewährleistet eine reproduzierbare Qualität hinsichtlich der stofflichen Zusammensetzung, absolute Freiheit von Kontaminationen des natürlichen Standortes und im Fall der Lem-naceen auch die Möglichkeit der saisonabhängigen Produktion in Fermentoren. Die Vielfalt der einsetzbaren Pflanzen macht es möglich, je nach Bedarf zylindrische, bandförmige, diskoide oder rundliche Biokatalysemodule mit geringem Diffusionswiderstand, hohem Gehalt an Biokatalysatoren, guter Raumausnutzung und hoher mechanischer Festigkeit herzustellen.

Beispiel 1

Wasserlinsen der Gattungen Lemna, Spirodela oder Wolffia (mit Ausnahme von Lemna trisulca) werden mit heissem Ethanol entfärbt und auf der

Fritte vom beweglichen Teil des Ethanols befreit. Die Extraktionsprodukte werden im Vakuumrotationsverdampfer nur soweit getrocknet, wie es ohne starke Schrumpfung der Sprossglieder möglich ist und anschliessend im Volumenverhältnis 1 zu 4 in einer konzentrierten Suspension aus lebenden, kurz zuvor in der Wachstumsphase geernteten Hefezellen in Wasser (ca. 50 g Frischmasse/I) geschüttelt. Als Hefen können beispielsweise Saccha-romyces- oder Candida-Arten eingesetzt werden. Die Wasserlinsen werden nach einer Stunde mit Wasser kurz gespült. Die in das Aerenchym durch Spaltöffnungen und den Wurzelansatz eingedrungenen Hefezellen werden vermehrt, indem die beimpften Sprossglieder in einem geeigneten Medium (z.B. Melasse-Medium mit 0,1% Hefe-Extrakt und Ammonium als Stickstoffquelle) belüftet werden. Es ist darauf zu achten, dass die Nährlösung durch frische Nährlösung ersetzt wird, wenn die ausserhalb der Hohlträger wachsenden freien Zellen die stationäre Wachstumsphase erreicht haben. Nach mehrmaligem Wechsel der Nährlösung ist ein grosser Teil der Wasserlinsen im Inneren vollkommen mit immobilierter Hefe gefüllt. Das Verfahren lässt sich vorteilhaft mit Wasserlinsen durchführen, die in vitro axenisch in definierten Medien angezogen wurden. Ihre Epidermis ist in keinem Fall verletzt oder mikrobiell angegriffen.

Beispiel 2

Das Lebermoos Riccis fluitans wird nach Ernte aus der axenischen in vitro-Kultur mit 50%igem Ethanol extrahiert und wie in Beispiel 1 am Beispiel der Wasserlinsen beschrieben, mit Hefezeilen beimpft. Die Schwimmthalli mit den grossen Luftkammern zerfallen in etwa 1 cm lange, dichotom gegabelte bandförmige Stücke. Um die Beweglichkeit der Zellen in diesen Luftkammern und damit die Gefahr des Herausspülens zu verringern, werden die Hefe enthaltenden Hohlträger auf einem Sieb gesammelt und mit 2%iger Natriumphosphatlösung pH 6 gesättigt. Nach dem Abtropfen der Phosphatlösung wird das Material im kalten Luftstrom unter ständigem Schütteln oder im Vakuumrotationsverdampfer partiell getrocknet (Gewichtsverlust etwa 50%). Anschliessend wird eine der verdunsteten Flüssigkeitsmenge entsprechende Menge von 1%igem Aluminiumsulfat zugesetzt. Das ausserhalb der Hohlträger gefällte Aluminiumphosphat wird mit Wasser abgewaschen. Durch das im Inneren der Hohlträger gefällte Aluminiumphosphat wird die Beweglichkeit der Hefezellen herabgesetzt. In einer phosphathaltigen Lösung ist der Niederschlag unter physiologischen Bedingungen stabil. In ähnlicher Weise kann die Beweglichkeit der Hefezellen im inneren des Hohlträgers herabgesetzt werden, indem zu der partiell getrockneten Masse der mit Hefe gefüllten Thallusabschnitte von Riccia fluitans etwas geschmolzene Gelatine-Lösung oder 1%iger flüssiger Agar bei einer Temperatur von 40°C beigemischt wird. Es ist auch möglich, die mit Hefe gefüllten Thallusabschnitte mit einer Galciumchloridlö-sung (2%) zu sättigen, partiell wie oben dargestellt zu entwässern und ein Verstopfen der Öffnungen

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durch Zugabe verdünnter calciumfreier Alginatlö-sung (0,5%) zu erreichen.

Beispiel 3

Gewaschene aerenchamreiche Wurzeln von Hygrophyten, z.B. von Oryza sativa, werden in 3 cm lange Segmente unterteilt, mit Ethanol extrahiert, lyophilisiert und in einer Lösung von Glucoamylase infiltriert. Anschliessend werden die Schnittflächen der Segmente durch Eintauchen in geschmolzenes Paraffin verschlossen. Das Material wird sorgfältig gewaschen. Die in dieser Weise hergestellte im-mobiliserte Glucoamylase wird benutzt, um aus einem Präparat löslicher Stärke selektiv niedermolekulare Bestandteile zu verzuckern. Stärkemoleküle mit Molekulargewichten über 20 kD werden nicht abgebaut.

Claims (10)

Patentansprüche

1. Biokatalysemodul auf der Grundlage denaturierter Pflanzen oder Pflanzenteile, dadurch gekennzeichnet, dass er aus einem aerenchymreichen Pflanzenteil oder einer aerenchymreichen Pflanze und Fremdzellen oder Fremdenzymen aufgebaut ist, die Fremdzellen oder -enzyme im Aerenchym lokalisiert sind und das Aerenchym durch ein dichtes Abschtussgewebe mit hydrophilen Zellwänden begrenzt wird.

2. Biokatalysemodul nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sich die Fremdzellen oder -enzyme im Innern der Sprossglieder von Lem-naceen und/oder im Inneren denaturierter Wurzeln von Gefässpflanzen befinden.

3. Biokatalysemodul nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sich die Fremdzellen oder -enzyme im Inneren der Blätter von Wasserpflanzen befinden.

4. Biokatalysemodul nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sich die Fremdzellen oder -enzyme im Inneren eines Kryptogamen, vorzugsweise im Schwimmthallus von Riccia fluitans befinden.

5. Biokatalysemodul nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass er aus unzerkleinerten aerenchymreichen Pflanzen oder Pflanzenteilen und Fremdzellen oder Fremdenzymen aufgebaut ist.

6. Verfahren zur Herstellung eines Biokatalysemoduls nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man aerenchymreiche Pflanzenteile oder Pflanzen Fremdzellen oder -enzyme in das Aerenchym aus einer Flüssigkeit durch eine Öffnung im Abschlussgewebe aufnehmen Iässt oder Fremdzellen oder -enzyme mittels Injektion in das Aerenchym von Pflanzenteilen oder Pflanzen der angegebenen Art einführt.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die denaturierten Pflanzen oder Pflanzenteile mit den Fremdzellen in einem für die Vermehrung der Zellen geeigneten Medium inku-biert werden.

8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass in den Hohlräumen des Aerenchyms nach der Einführung der Fremdzellen oder -enzyme ein Gel auf dem Wege der Koagulation oder Polymerisation oder ein anorganischer Niederschlag auf dem Wege der Fällung hergestellt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass nach der Einführung der Fremdzellen oder -enzyme offene Verbindungen zwischen dem Aerenchym und der äusseren Flüssigkeit durch Verfestigung einer Flüssigkeit wie z.B. durch Abkühlen von Paraffin oder Agarsol, durch Polymerisation - beispielsweise von Acrylamid, durch Koagulation - beispielsweise von Alginat oder durch Kristallisation - beispielsweise von Aluminiumphosphat, unterbrochen werden.

10. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass man unzerkleinerte aerenchymreiche Pflanzenteile oder Pflanzen verwendet.

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