Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Adenosin-triphosphat, abgekürzt als ATP, in biologischem Material, welches lebende somatische Zellen und/oder lebende mikrobielle Zellen enthält. Bei diesem Verfahren erfolgt die Extraktion des Adenosin-triphosphates aus den lebenden somatischen Zellen, beziehungsweise aus den lebenden Mikroorganismenzellen, in voneinander getrennten Verfahrensschritten, und die Menge des extrahierten ATP's wird durch seine Biolumineszenzreaktion bestimmt. Die bevorzugt angewandte biolumineszente Reaktion ist diejenige, die in der Natur bei Leuchtkäfern (englische Bezeichnung fire-fly, lateinische Bezeichnung Photinus Pyralis) anzutreffen ist.
Mit Hilfe des erfindungsgemässen Verfahrens, können in dem biologischen Material zwei Arten von lebenden Zellen unterschieden werden, nämlich
1) Mikroorganismen: z.B. Bakterien (Durchmesser 1 Mikrometer, ATP-Gehalt 10<-><1><5> g)
2) Somatische Zellen: z.B. Blutzellen (Durchmesser 10 Mikrometer, ATP-Gehalt 5 x 10<-><1><3> g).
Um in biologischen Materialien das aus den Mikroorganismen stammende ATP bestimmen zu können, muss vorgängig das ATP der allenfalls vorhandenen somatischen Zellen, beziehungsweise die somatischen Zellen selbst, zerstört werden.
Um in lebendigen Zellen enthaltenes ATP bestimmen zu können, muss dieses zuerst aus den Zellen extrahiert werden. Dies soll in einer solchen Art und Weise geschehen, dass endogene Enzyme das extrahierte ATP nicht abbauen können.
ATP kann selektiv aus somatischen Zellen extrahiert werden, indem man ein nicht-ionisches Deter- gens, welches die Mikroorganismen nicht angreift, zur entsprechend vorbereiteten Probe hinzugibt. Zur Extraktion des ATP aus Mikroorganismen muss ein stärkeres Reagenz verwendet werden, welches die allenfalls vorhandene somatische Zelle ebenfalls angreift. Dazu eignen sich vorzugsweise kationische Detergenzien, insbesondere tertiäre und quaternäre Amine.
Wenn eine Probe eines biologischen Materials sowohl somatische Zellen, d.h. Gewebszellen, als auch lebende mikrobielle Zellen enthält, so wird im allgemeinen zunächst diese Probe mit einem nicht ionischen Detergens behandelt, welches die Membranen der somatischen Zellen angreift, so dass das ATP aus dieser Zelle strömt. Um dieses ATP zu zerstören, fügt man ein Enzym, z.B. ATP-ase, zu. Damit wird ATP in eine Substanz umgewandelt, welche mit Luciferin-Luciferase nicht reagiert. Nachdem diese Behandlung beendet ist, wird eine bekaterizide Substanz, z.B. ein kationisches Detergens, in der Regel ein quaternäres Ammonium-Salz, zugegeben. Dieses Detergens perforiert die Mikroorganismen und setzt aus diesen das ATP frei. Gleichzeitig wird Luciferin-Luciferase zugegeben, und die emitierte Lichtmenge wird mittels einem Luminometer gemessen.
Das für die Zerstörung des aus somatischen Zellen stammenden ATP's verwendete Enzym, muss inaktiviert werden ehe das ATP aus den Mikroorganismenzellen freigesetzt wird.
Bisher war jedoch keine geeignete und wirksame Methode bekannt, um dieses Enzym zu zerstören.
Eine Erwärmung auf den Siedepunkt ist keine praktikable Methode. Ebenso ist eine Hinzugabe von Säuren, z.B. Trichloressigsäure, nicht geeignet, da nachfolgend die Probe neutralisiert werden müsste. Eine mögliche Verdünnung der Probe würde die Empfindlichkeit der Methode herabsetzen.
Ein weiteres Problem, das bisher bei der Bestimmung von Mikroorganismen in biologischem Material auftrat, war dasjenige, dass die kationischen Detergenzien, welche zur Extraktion von ATP aus Mikroorganismen verwendet werden, eine schnelle Inaktivierung des Enzyms bewirken, welches für die Biolumineszenz-Reaktion verantwortlich ist. Der zeitliche Ablauf der Bestimmung (Messung) war daher äusserst kritisch und erschwert somit den Gebrauch eines internen Standards.
Die oben beschriebenen Arbeitsweisen stellen eine kurze Zusammenfassung des nächstliegenden Standes der Technik dar, welcher in den nachfolgend genannten Dokumenten enthalten ist.
I. Die Verwendung von nicht-ionischen Detergenzien für die Extraktion von ATP aus somatischen Zellen ist beschrieben in:
US-PS Nr. 3 745 090 (Chappelle et al.)
US-PS Nr. 4 303 752 (Kolehmainen et al.)
SE Nr. 8 203 564-A (Nilsson et al.).
II. In den beiden oben zitierten US-Patentschriften wird auch die Verwendung von Apyrase für die Zerstörung von ATP, welches aus somatischen Zellen stammt, beschrieben.
III. Die Verwendung von kationischen Detergenzien (quaternäre Ammoniumsalze) ist beschrieben in:
US-PS Nr. 4 303 753 (Kolehmainen et al.)
SE Nr. 7 809 370-A (LKB Produkter AG)
Harber WO 86/07 094.
IV.
Die Verwendung von Detergenzien für die Extraktion von ATP ist beschrieben worden von:
- P.E. Stanley, Bioluminescene [2], Methods of Enzymology, Vol. 133, 1986, Seiten 14 bis 22.
- T.J. Franklin and G.A. Snow, Biochemistry of Antimicrobial Action, Second Edition, 1975, Chapman and Hall, London, Seiten 56 bis 63.
V. Die Rolle von Lipiden bezuglich der Aktivität von Luciferase ist vom theoretischen Standpunkt aus studiert worden; siehe
- N.N. Ugarova et al., Biochimica et Biophysica Acta 921 (1987), Seiten 465 bis 472.
VI. Allgemeine Literaturstellen:
- Eric Schram, XI International Congress of Clinical Chemistry, 1982, Walter de Gruyter & Co., Berlin, New York, Seiten 1013 bis 1022.
- E. Schram, Luminescent Assays: Perspectives in Endocrinology and Clinical Chemistry, edited by M. Serio and M.
Pazzagli, Raven Press, New York, 1982, Seiten 1 bis 9 in "Fundamental Aspects of Bioluminescent Reactions Used in Clinical Chemistry".
- Frans Gorus and Eric Schram, Applications of Bio- and Chemiluminescence in the Clinical Laboratory, Clinical Chemistry, 25, Seiten 512 bis 519 (1979).
- Prospekt von 3M über Biolumineszenz, Licht in der Mikrobiologie.
Mittels dieser Zitate ist der Inhalt der jeweiligen Publikation als hierin inkorporiert zu betrachten.
Ziel der vorliegenden Erfindung war es, die Nachteile bisher bekannter Verfahren zur Bestimmung von lebenden Mikroorganismenzellen in biologischen Materialien zu vermeiden, welche neben den Mikroorganismenzellen gegebenenfalls noch lebende somatische Zellen enthalten. Überraschenderweise zeigte es sich, dass man die angestrebten Ziele erreichen kann, indem man bei dem Bestimmungsverfahren die in der Folge definierten Arbeitsschritte anwendet.
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Adenosin-triphosphat, ATP, in biologischem Material, welches lebende somatische Zellen und/oder lebende mikrobielle Zellen enthält, nach selektiver Extraktion aus den lebenden Zellen und mittels Biolumineszenz, wobei die erzeugte Lumineszenz zu jedem beliebigen Zeitpunkt des Verfahrens gemessen werden kann, und das Verfahren ist da- durch gekennzeichnet, dass man entweder in einer Probe des biologischen Materials sowohl den Gehalt an somatischen als auch mikrobiellen Zellen bestimmt, indem man
a) die Probe des biologischen Materials vorlegt,
b) wenigstens ein Detergens zur Extraktion des ATP's, welches in den somatischen Zellen enthalten ist, hinzugibt,
c) ein Reagenz für die biolumineszente Reaktion vor,
während oder nach der in Schritt b) genannten Extraktion des ATP's hinzugibt, die nicht mikrobiellen Zellen durch die erzeugte Lumineszenz quantifiziert,
d) wenigstens ein Lipid zur Verhinderung der Inaktivierung der biolumineszenten Reaktion und/oder der ATP-Hydrolyse-Reaktion des oder der eingesetzten Detergenzien hinzugibt,
e) dem so erhaltenen Gemisch zum Abbau des aus den nicht-mikrobiellen Zellen stammenden ATP's wenigstens ein hydrolytische Spaltungen katalysierendes Enzym hinzufügt, und anschliessend
f) zu dem so erhaltenen Gemisch ein Gemisch, enthaltend wenigstens eine bakterizide Substanz zur Freisetzung des ATP's, welches in den mikrobiellen Zellen enthalten ist, und wenigstens eine Substanz, welche die Aktivität des oben genannten Enzyms inhibiert, aber die biolumineszente Reaktion nicht beeinflusst, hinzugibt,
und
g) die mikrobiellen Zellen mittels der erzeugten Biolumineszenz quantifiziert, oder dass man in dem biologischen Material nur die mikrobiellen Zellen quantifiziert, indem man nach dem Verfahrensschritt (c) keine Bestimmung der Biolumineszenz vornimmt, sondern gleich anschliessend die Schritte d), e), (f) und (g) des Verfahrens durchführt.
Als Beispiele für biologische Materialien, in denen mit Hilfe des erfindungsgemässen Verfahrens auch in Anwesenheit von lebenden somatischen Zellen die lebenden Mikroorganismenzellen bestimmt werden können, sind biologische Flüssigkeiten, die insbesondere in Form einer Suspension, vorzugsweise in Form einer wässrigen Suspension, vorliegen, wobei das biologische Material vorzugsweise aus der Gruppe ausgewählt ist, welche die folgenden Produkte umfasst:
Urin menschlichen oder tierischen Ursprungs, Blut menschlichen oder tierischen Ursprungs, Milch menschlichen oder tierischen Ursprungs, Fruchtsäfte, Bier, Wein, Fleischextrakte, Klärschlamm, Wasser und Zellkulturen. Das entsprechende biologische Material kann jedoch auch eine Bodenprobe, ein Nahrungsmittel oder ein Textilmaterial sein.
Bevorzugte Detergentien, die bei der Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens im Verfahrensschritt (b) zur Extraktion des ATP's aus den somatischen Zellen zugegeben werden, sind nicht-ionische Detergentien, insbesondere solche auf Basis eines Äthers mit Polyoxyäthylenkette und eines längerkettigen Alkyl- oder Alkylphenylrestes, wie die Produkte, die im Handel unter den Markenbezeichnungen "Triton" und "Lubrol" erhältlich sind.
Bei der Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens wird im Verfahrensschritt (d) ein Lipid zugesetzt. Vorzugsweise wird ein Phospholipid zugesetzt, insbesondere Lecithin.
Es ist nötig, das aus den nicht-mikrobiellen Zellen stammende Enzym durch die Zugabe eines hydrolytische Spaltungen katalysierenden Enzyms zu zerstören, ehe dann anschliessend das ATP aus den mikrobiellen Zellen freigesetzt wird.
Bei bisher bekannten Bestimmungsverfahren wurde zu dieser Hydrolyse des ATP das hydrolytische Spal tungen katalysierende Enzym Apyrase verwendet, welches eine aus Kartoffeln extrahierte ATP-ase ist.
Bei der Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens wird im Verfahrensschritt (e) als hydrolytische Spaltungen katalysierendes Enzym ebenfalls vorzugsweise eine ATP-ase zugesetzt. Zu diesem Zweck wird jedoch vorzugsweise Säuger-Membranen-ATP-ase verwendet. Dieses Enzym kann neben der Hydrolyse des aus somatischen Zellen stammenden ATP's auch für die Zerstörung von Rest-ATP, welches allenfalls in den Reagenzien vorhanden ist und die Empfindlichkeit der Methode herabsetzen würde, verwendet werden.
Des weiteren ist die bevorzugt eingesetzte Säugermembrane ATP-ase selektiv durch die Zugabe von Vanadationen inhibierbar. Vanadationen inhibieren jedoch das Reagens für die biolumineszente Reaktion nicht.
Gemäss einer bevorzugten Ausführungsart des erfindungsgemässen Verfahrens wird daher im Verfahrensschritt (f) als Substanz, welche die Aktivität des hydrolytische Spaltungen katalysierenden Enzyms inhibiert, aber die biolumineszente Reaktion nicht beeinflusst, ein Vanadat hinzugegeben.
Das für die lumineszente Reaktion verantwortliche Enzym Luciferase ist ein Lipoprotein, welches durch das Vorhandensein von anionischen Detergentien inaktiviert wird. Aber die Aktivität des Enzyms Luciferase wird zurückgewonnen durch die Zugabe von wenigstens einem Lipid, wie z.B. Phosphatidylcholin. Ein solches Lipid, z.B. Lecithin, schützt auch die Aktivität von Luciferase in Gegenwart von kationischen Detergentien. Zur Freisetzung des ATP's aus den mikrobiellen Zellen im Verfahrensschritt (f) wird als bakterizide Substanz vorzugsweise ein kationisches Detergens zugegeben, beispielsweise Hexachloridin.
Bei der Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens nach den oben erwähnten bevorzugten Ausführungs arten können die folgenden Vorteile erzielt werden:
1. Bei Verwendung von Säugermembranen ATP- ase als hydrolytische Spaltungen katalysierendes Enzym kann dieses anschliessend leicht inhibiert werden, ohne dass das biolumineszente Reagens beeinflusst wird.
2. Unter Verwendung wenigstens eines Lipides wird die Luciferase gegen Inhibierung durch Detergenzien für die Extraktion des ATP's geschützt.
3. Mit dem erfindungsgemässen Verfahren kann zu jedem beliebigen Zeitpunkt ATP bestimmt werden, resp. die Reaktion verfolgt und kontrolliert werden.
4. Mit dem erfindungsgemässen Verfahren können kleine Mengen an ATP, resp. Mikroorganismen, reproduzierbar nachgewiesen werden (ca. 10 000 Bakterien/ml).
Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung hydrolytische Spaltungen katalysierende Enzyme als Mittel zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens.
Ein bevorzugtes derartiges hydrolytische Spaltungen katalysierendes Enzym ist eine ATP-ase, vorzugsweise eine Säugermembranen ATP-ase.
Die Erfindung sei nun anhand der folgenden Beispiele näher erläutert.
In den Fig. 1 bis 3 ist auf der Ordinate die Lumineszenz in relativen Lichteinheiten in counts per minute [cpm] aufgetragen. Auf der Abszisse ist die Zeit in Sekunden angegeben.
Fig. 1 zeigt die Extraktion von E. Coli mit kommerziellem kationischem Detergens "Nucleotide Releasing Reagent for Microbial ATP" (NRB, Lumac). Konzentration gemäss NRB-Vorschrift. Volumen: 100 Mikroliter in 100 Mikroliter Suspension.
Die Zugabe des Luciferin-Luciferase-Reagenzes zeigt eine schnelle Abnahme der Lumineszenz, bedingt durch die Inhibition des Enzyms.
Fig. 2 zeigt das gleiche Experiment, wie in Fig. 1 dargestellt, mit dem Unterschied, dass zusätzlich Lecithin, extrahiert aus Sojabohnen, in einer Endkonzentration von 2 mg/ml in der Probe zur Probe hinzuge geben wurde. Man sieht, dass jetzt die Lumineszenz konstant bleibt.
Dies ist deswegen so, weil das Lecithin die Inhibition des Enzyms verhindert.
Nach ca. 300 Sekunden wurde ein interner Standard mit bekannter ATP-Konzentration (10<-><8> M/l, 10 Mikroliter) hinzugegeben. Es tritt eine rasche Zunahme der Lumineszenz wegen der Erhöhung der ATP-Konzentration in der Probe auf. Es ist ebenfalls ersichtlich, dass das Lecithin weiterhin die Inhibition des Enzyms verhindert.
Fig. 3 zeigt die Hydrolyse von ATP aus verdünntem Blut mit Membran-ATP-ase (0,02 mu /ml in Probe) nach der Extraktion des ATP's mit Lubrol. Nach ca. 300 Sekunden wurde ATP von bekannter Konzentration (10<-><7> M/l, 10 Mikroliter) zusammen mit Vandat hinzugegeben. Die End-Konzentration des Vanadats (Natrium-ortho-vanadat) betrug in der Probe 5.10<-><4> M.
Durch die Hinzugabe des Vanadats wird die Inhibierung der Membran-ATP-ase erreicht. Das zeigt sich deutlich, weil nach der Zugabe von zusätzlichem ATP nur eine unbedeutende Abnahme der Lumineszenz stattfindet.
The present invention relates to a method for the quantitative determination of adenosine triphosphate, abbreviated as ATP, in biological material which contains living somatic cells and / or living microbial cells. In this method, the extraction of the adenosine triphosphate from the living somatic cells, or from the living microorganism cells, takes place in separate process steps, and the amount of ATP extracted is determined by its bioluminescence reaction. The preferred bioluminescent reaction is the one found in nature in fireflies (English name fire-fly, Latin name Photinus Pyralis).
With the aid of the method according to the invention, two types of living cells can be distinguished in the biological material, namely
1) Microorganisms: e.g. Bacteria (diameter 1 micron, ATP content 10 <-> <1> <5> g)
2) Somatic cells: e.g. Blood cells (diameter 10 microns, ATP content 5 x 10 <-> <1> <3> g).
In order to be able to determine the ATP originating from the microorganisms in biological materials, the ATP of the somatic cells, if any, or the somatic cells themselves must first be destroyed.
In order to be able to determine ATP contained in living cells, this must first be extracted from the cells. This should be done in such a way that endogenous enzymes cannot degrade the extracted ATP.
ATP can be selectively extracted from somatic cells by adding a non-ionic detergent, which does not attack the microorganisms, to the appropriately prepared sample. A stronger reagent must be used to extract the ATP from microorganisms, which also attacks the somatic cell that may be present. Cationic detergents, in particular tertiary and quaternary amines, are preferably suitable for this.
If a sample of a biological material contains both somatic cells, i.e. Tissue cells, as well as living microbial cells, this sample is generally first treated with a non-ionic detergent, which attacks the membranes of the somatic cells, so that the ATP flows out of this cell. To destroy this ATP, add an enzyme, e.g. ATP-ase, too. This converts ATP into a substance that does not react with luciferin luciferase. After this treatment is finished, a catericidal substance, e.g. a cationic detergent, usually a quaternary ammonium salt, is added. This detergent perforates the microorganisms and releases the ATP from them. At the same time, luciferin-luciferase is added and the amount of light emitted is measured using a luminometer.
The enzyme used to destroy the ATP derived from somatic cells must be inactivated before the ATP is released from the microorganism cells.
So far, however, no suitable and effective method has been known for destroying this enzyme.
Heating to the boiling point is not a practical method. The addition of acids, e.g. Trichloroacetic acid, not suitable, since the sample would have to be neutralized afterwards. A possible dilution of the sample would reduce the sensitivity of the method.
Another problem that has been encountered in the determination of microorganisms in biological material has been that the cationic detergents used to extract ATP from microorganisms cause rapid inactivation of the enzyme responsible for the bioluminescence reaction. The timing of the determination (measurement) was therefore extremely critical, making it difficult to use an internal standard.
The above-described working methods represent a brief summary of the closest prior art, which is contained in the documents mentioned below.
I. The use of non-ionic detergents for the extraction of ATP from somatic cells is described in:
U.S. Patent No. 3,745,090 (Chappelle et al.)
U.S. Patent No. 4,303,752 (Kolehmainen et al.)
SE No. 8 203 564-A (Nilsson et al.).
II. The two US patents cited above also describe the use of apyrase to destroy ATP derived from somatic cells.
III. The use of cationic detergents (quaternary ammonium salts) is described in:
U.S. Patent No. 4,303,753 (Kolehmainen et al.)
SE No. 7 809 370-A (LKB Produkter AG)
Harber WO 86/07 094.
IV.
The use of detergents for the extraction of ATP has been described by:
- P.E. Stanley, Bioluminescene [2], Methods of Enzymology, vol. 133, 1986, pages 14 to 22.
- T.J. Franklin and G.A. Snow, Biochemistry of Antimicrobial Action, Second Edition, 1975, Chapman and Hall, London, pages 56 to 63.
V. The role of lipids in the activity of luciferase has been studied from a theoretical point of view; please refer
- N.N. Ugarova et al., Biochimica et Biophysica Acta 921 (1987), pages 465 to 472.
VI. General references:
- Eric Schram, XI International Congress of Clinical Chemistry, 1982, Walter de Gruyter & Co., Berlin, New York, pages 1013 to 1022.
- E. Schram, Luminescent Assays: Perspectives in Endocrinology and Clinical Chemistry, edited by M. Serio and M.
Pazzagli, Raven Press, New York, 1982, pages 1 to 9 in "Fundamental Aspects of Bioluminescent Reactions Used in Clinical Chemistry".
- Frans Gorus and Eric Schram, Applications of Bio- and Chemiluminescence in the Clinical Laboratory, Clinical Chemistry, 25, pages 512 to 519 (1979).
- 3M brochure on bioluminescence, light in microbiology.
By means of these quotations, the content of the respective publication is to be regarded as incorporated therein.
The aim of the present invention was to avoid the disadvantages of previously known methods for determining living microorganism cells in biological materials which, in addition to the microorganism cells, may also contain living somatic cells. Surprisingly, it was found that the desired goals can be achieved by using the work steps defined below in the determination procedure.
The present invention therefore relates to a method for the quantitative determination of adenosine triphosphate, ATP, in biological material which contains living somatic cells and / or living microbial cells, after selective extraction from the living cells and by means of bioluminescence, the luminescence generated can be measured at any point in the process, and the process is characterized in that both the content of somatic and microbial cells in a sample of the biological material is determined by
a) presents the sample of the biological material,
b) adding at least one detergent for extracting the ATP contained in the somatic cells,
c) a reagent for the bioluminescent reaction,
during or after the extraction of the ATP mentioned in step b), which quantifies non-microbial cells by the luminescence generated,
d) adding at least one lipid to prevent inactivation of the bioluminescent reaction and / or the ATP hydrolysis reaction of the detergent or detergents used,
e) at least one enzyme which catalyzes hydrolytic cleavages is added to the mixture thus obtained in order to break down the ATP derived from the non-microbial cells, and then
f) a mixture containing at least one bactericidal substance for releasing the ATP which is contained in the microbial cells and at least one substance which inhibits the activity of the above-mentioned enzyme but does not influence the bioluminescent reaction is added to the mixture thus obtained ,
and
g) the microbial cells are quantified by means of the generated bioluminescence, or that only the microbial cells are quantified in the biological material by not carrying out a determination of the bioluminescence after process step (c), but immediately following steps d), e), ( f) and (g) of the method.
Examples of biological materials in which the living microorganism cells can be determined with the aid of the method according to the invention even in the presence of living somatic cells are biological liquids which are present in particular in the form of a suspension, preferably in the form of an aqueous suspension, the biological Material is preferably selected from the group comprising the following products:
Urine of human or animal origin, blood of human or animal origin, milk of human or animal origin, fruit juices, beer, wine, meat extracts, sewage sludge, water and cell cultures. However, the corresponding biological material can also be a soil sample, a food or a textile material.
Preferred detergents which are added when the process according to the invention is carried out in process step (b) to extract the ATP from the somatic cells are nonionic detergents, in particular those based on an ether having a polyoxyethylene chain and a longer-chain alkyl or alkylphenyl radical, such as that Products that are commercially available under the brand names "Triton" and "Lubrol".
When carrying out the process according to the invention, a lipid is added in process step (d). A phospholipid is preferably added, in particular lecithin.
It is necessary to destroy the enzyme originating from the non-microbial cells by adding an enzyme that catalyzes hydrolytic cleavages before the ATP is then released from the microbial cells.
In previously known determination methods, the hydrolysis of the ATP was used to catalyze the hydrolytic cleavage enzyme apyrase, which is an ATP-ase extracted from potatoes.
When carrying out the process according to the invention, an ATP-ase is preferably also added in process step (e) as the enzyme catalyzing hydrolytic cleavages. However, mammalian membrane ATP-ase is preferably used for this purpose. In addition to the hydrolysis of the ATP derived from somatic cells, this enzyme can also be used for the destruction of residual ATP, which is at most present in the reagents and would reduce the sensitivity of the method.
Furthermore, the preferably used mammalian membrane ATP-ase can be selectively inhibited by adding vanadations. Vanadations, however, do not inhibit the reagent for the bioluminescent reaction.
According to a preferred embodiment of the process according to the invention, a vanadate is therefore added in process step (f) as a substance which inhibits the activity of the enzyme catalyzing hydrolytic cleavages but does not influence the bioluminescent reaction.
The luciferase enzyme responsible for the luminescent reaction is a lipoprotein which is inactivated by the presence of anionic detergents. But the activity of the luciferase enzyme is recovered by the addition of at least one lipid, e.g. Phosphatidylcholine. Such a lipid, e.g. Lecithin also protects the activity of luciferase in the presence of cationic detergents. To release the ATP from the microbial cells in process step (f), a cationic detergent, for example hexachloridine, is preferably added as the bactericidal substance.
The following advantages can be achieved when carrying out the method according to the invention according to the preferred embodiments mentioned above:
1. When using mammalian membranes ATPase as a catalyzing hydrolytic cleavage enzyme, this can then be easily inhibited without affecting the bioluminescent reagent.
2. Using at least one lipid, the luciferase is protected against inhibition by detergents for the extraction of the ATP.
3. With the method according to the invention, ATP can be determined at any time, or the response is tracked and controlled.
4. With the inventive method small amounts of ATP, respectively. Microorganisms can be detected reproducibly (approx. 10,000 bacteria / ml).
Furthermore, the present invention relates to enzymes catalyzing hydrolytic cleavages as means for carrying out the method according to the invention.
A preferred enzyme of this type catalyzing hydrolytic cleavage is an ATP-ase, preferably a mammalian membrane, ATP-ase.
The invention will now be explained in more detail with reference to the following examples.
1 to 3, the luminescence is plotted on the ordinate in relative light units in counts per minute [cpm]. The time in seconds is shown on the abscissa.
1 shows the extraction of E. coli with the commercial cationic detergent "Nucleotide Releasing Reagent for Microbial ATP" (NRB, Lumac). Concentration according to the NRB regulation. Volume: 100 microliters in 100 microliter suspension.
The addition of the luciferin-luciferase reagent shows a rapid decrease in luminescence due to the inhibition of the enzyme.
FIG. 2 shows the same experiment as shown in FIG. 1, with the difference that lecithin extracted from soybeans was additionally added to the sample in a final concentration of 2 mg / ml in the sample. You can see that the luminescence now remains constant.
This is because the lecithin prevents the inhibition of the enzyme.
After approximately 300 seconds, an internal standard with a known ATP concentration (10 <-> <8> M / l, 10 microliters) was added. There is a rapid increase in luminescence due to the increase in the ATP concentration in the sample. It can also be seen that the lecithin continues to inhibit the inhibition of the enzyme.
Fig. 3 shows the hydrolysis of ATP from diluted blood with membrane ATP-ase (0.02 mu / ml in sample) after the extraction of the ATP with Lubrol. After about 300 seconds, ATP of known concentration (10 <-> 7 M / l, 10 microliters) was added together with Vandat. The final concentration of the vanadate (sodium ortho vanadate) in the sample was 5.10 <-> <4> M.
The addition of the vanadate inhibits the membrane ATP ase. This is clearly shown because after the addition of additional ATP there is only an insignificant decrease in luminescence.