CH678326A5 - Depolymerisation of natural polyanion e.g. DNA or heparin - Google Patents
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Description
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Descrizione
La presente invenzione si riferisce ad un nuovo procedimento per una depolimerizzazione chimica controllata di polianioni che si rinvengono in natura, particolarmente acidi nucleici e glicosamminoglicani. Più in particolare, il procedimento è utile per la depolimerizzazione controllata di eparina e dermatansol-fato (DS), che sono difficili da depolimerizzare. La presente invenzione abbraccia i prodotti ottenuti da depolimerizzazione di polianioni naturali, e composizioni farmaceutiche che contengono tali prodotti quando questi vengono ottenuti mediante il procedimento rivendicato.
Risultano interessanti osservazioni sperimentali secondo le quali biodisponibilità ed effetti biologici di taluni polianioni, quando somministrati per via orale a modelli sperimentali o ad esseri umani, dipendono dal peso molecolare medio (MW). A titolo di esempio, eparina commerciale è un ben noto agente anticoagulante, per le sue proprietà attivanti, come co-fattore su un potente inibitore di proteasi, antitrombina ili (AT-III). Eparina è un glieosamminoglicano solfatato, con MW = 12.000 D (dalton), corrispondente a circa 20 unità di disaccaride, ed in emocoagulazione essa inibisce cinque fattori, precisamente: FXII, FXI, FIX, FX, FU.
Per mezzo di processi dì depolimerizzazione è possibile ottenere frammenti di pesi molecolari inferiori a quelli della eparina dì partenza. Recentemente, è stato scoperto che frazioni di eparina aventi MW
= 4.000-6.000 0 (eparine di peso molecolare inferiore, LMW), influenzano l'inibizione su taluni fattori ma non su altri, e peculiarmente non su taluni fattori chiave all'inizio di trombosi venosa, come FX. Di conseguenza, eparine LMW potrebbero venire considerate efficaci agenti antitrombotici con meno rischio di emorragìa in confronto ad eparina commerciale.
E' stato anche osservato che il periodo di dimezzamento in flusso sanguigno per eparine LMW è più lungo del periodo di dimezzamento per eparina commerciale. Pertanto, può venire impostata una terapìa a lungo termine, evitando infusioni a gocciolamento e fenomeni di ricaduta.
Un altro vantaggio di eparine LMW è l'assenza di interferenza in aggregazione di piastrine, un effetto indesideràbile che nel passato causava una severa trombocitopenia in pazienti durante la somministrazione di eparina. Come altro esempio di proprietà correlate al peso molecolare di polianioni, il comportamento di acido desossiribonucleico (DNA) nei riguardi di depolimerizzazione, può venire indicato:
DNA non può venire somministrato per via parenterale a causa del suo MW (più di 106D), ma esso presenta proprietà molto interessanti quando esso è depoiimerizzato. Infatti, oligodesossiribonucleotidi con MW = 25 000-70 000 D (defibrotide) mostrano effetti anti-interfibrinoIitici ed immuno-stlmolanti, nonché attività nella profilassi contro infarto.
E" difficile effettuare la depolimerizzazione controllata dei polianioni naturali, e quindi vengono effettuate molte prove per sviluppare condizioni adatte di funzionamento per questi metodi.
In pratica, una depolimerizzazione controllata di polianioni è un compito difficile per molte ragioni:
a) agenti chimici, come attualmente adoperati (acido nitroso, beta-eliminazione, ossidazione, idrolisi acida od alcalina) modificano la struttura molecolare intorno ai legami influenzati od In altre regioni che sono focali per l'attività, e quindi producono ulteriori sostanze che potrebbero venire considerate come composti nuovi invece di oligomeri;
b) enzimi sono difficili da manipolare quando la depolimerizzazione deve venire fermata ad un livello prescelto. Inoltre, taluni polianioni, come eparina, dermatansolfato (DS) e DNA, non vengono facilmente influenzati da enzimi correnti;
c) metodi di frazionamento fisico oppure chimico-fisico, per esempio mediante setacciatola molecolare, ultrafiltrazione oppure precipitazione selettiva, non sono adatti per una produzione economica su larga scala.
Di conseguenza, l'obiettivo della presente invenzione era di riprodurre mediante reazione chimica talune condizioni osservate e studiate in tessuti animali (specificamente in umore vitreo ed in particolare cartilagine), conducenti ad una depolimerizzazione di acido ialuronico (HA). In vivo, HA, un poliamone che si trova in tessuti connettivi, viene depoiimerizzato mediante una reazione ossidativa-riduttìva indotta da radicali liberi. Radicali liberi (superossido ed ossidrile) vengono generati mediante sistemi biochimici, come xàntina/xantinossidasi in presenza di ossigeno e di portatori auto-ossidanti, come cisterna, glutatione od acido ascorbico. La scissione di macromolecole naturali, indotta da radicali liberi, viene ritenuta essere di somma importanza all'inizio e nello sviluppo di condizioni patologiche, come infiammazione locale, cataratta, artrosi e forse anche aterosclerosi. Questa scissione è una vera e propria perossido-list, che non induce alcuna modificazione nella molecola, eccetto che idrolisi di legami carbonio-ossigeno, che porta alla depolimerizzazione di HA.
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L'importanza di riprodurre la depolimerizzazione ossidativa-riduttiva in un laboratorio chimico è ovvia, come pure il fermare la reazione rapidamente e totalmente a qualsiasi livello prescelto, impiegando scavenger di radicali.
Il procedimento della presente invenzione è caratterizzato dal fatto di generazione di radicali liberi su-perossido, idroperossido e/o ossidrile, in cui i radicali liberi vengono ottenute mediante l'azione di perossido d'idrogeno, in condizioni aereate in presenza di quantità catalitiche di sali ferrassi, ad un pH acido o neutro. L'invenzione comprende ì prodotti formati da polianioni naturali depoiimerizzati, ottenuti tramite il detto procedimento. II pH operativo è neutro o leggermente acido di preferenza pH = 4,0-7,0.
Il campo di temperature operative (la temperatura può giungere fino a 100°G) [usualmente fra 20 ed 80°C] consente di stabilire la velocità allo scopo di registrare parametri di processo, principalmente il MW tramite viscosimetria.
Il presente procedimento può generalmente venire usato per controllare la depolimerizzazione chimica di polianioni naturali. Più specificamente, mediante il presente procedimento si ottiene la depolimerizzazione controliata di acidi nucleici e di giucosamminoglicani, come eparina e DS, che sono difficili da depoli-merizzare per mezzo di enzimi.
I seguenti esempi, che non sono limitativi nei riguardi delle applicazioni, illustrano il procedimento.
Esempio 1
20 g di sodio-eparina USP sono stati sciolti in 100 mi di acqua, e vi si sono aggiunti agitando 4 g di resina cationica (come Amberlite® I R-120, forma H+). Appena il pH si è abbassato a 4,0-4,5, la resina è stata filtrata ed il filtrato è stato raccolto in un pallone a fondo rotondo. Si è riscaldato ad 80°C con riflusso a bagnomaria, e poi agitando sono stati aggiunti 4,2 mi di reagente preparato mescolando 4,0 mi di H2O2 a 30% e 0,2 mi di soluzione di Fe-ll (soluzione A = 1,5 g di FeSCU * 7 H2O in 100 mi di acqua).
Si è mantenuto ad 80°C ed è stato registrato il pH. In tempi prestabiliti, dal pallone sono stati raccolti campioni da 20 ml. A ciascun campione sono state aggiunte rapidamente, agitando, alcune gocce di NaOH 0,1 M allo scopo di far salire il pH a 7,0, 0,5 mi di soluzione di NaCI, 25 mi di etanolo a gocce, e 3,3 mi di soluzione al 20% di NaCI. Il precipitato è stato raccolto, lavato in etanolo e poi in acetone. Si è essiccato per una notte in forno essiccatore sotto vuoto a 50-60°C, ed i campioni sono stati controllati mediante viscosimetria riguardo a MW ed a potenza. I risultati sono riassunti nella tabella seguente:
Tempo
PH
MW
Potenza
% di H2O2
(min.)
Ul/mg residuo
-
4,6
12.000
135
100
30
4,3
6.000
82
64
60
4,0
4.000
48
58
120
3,6
<2.500
20
54
180
3,5
<2.500
<20
47
300
3,0
<2.500
<20
44
Esempio 2
20 g di sodio-eparina vengono sciolti in 100 mi di acqua al pH naturale di 5,6. La soluzione viene riscaldata a 50°C con riflusso a bagnomaria, poi si aggiungono 4,6 mi di un reagente preparato mescolando 4,0 mi di H2O2 a 30% e 0,6 mi di soluzione A (vedere esempio 1). La miscela di reazione viene mantenuta a 50°G e si registra il pH. A periodi prescelti, dal pallone vengono raccolti campioni da 20 ml. I campioni vengono poi trattati analogamente all'esempio 1.1 risultati sono riassunti nella seguente tabella:
3
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
CH 678 326 A5
Tempo (min.)
pH
MW
Potenza Ul/mg
% di H2O2 residuo
-
5,6
12.000
135
100
30
5,3
10.000
114
96
60
4,9
8.000
109
90
120
4,8
7.000
75
83
180
4,4
5.000
56
71
480
3,4
<2.500
<10
3
Esempio 3
20 g di un miscuglio di solfomucopolisaccaridi che si rivengono in natura, avente la seguente composizione:
20% di solfato di condroitina (CHS),
50% di dermatansolfato (DS),
30% di eparansolfato (HS),
(pH = 4,0 ad 80°C, 30 ppm di Fe-li),
viene sottoposto al trattamento riportato nell'esempio 1. I campioni vengono raccolti, e vengono valutate le registrazioni del pH, della viscosità intrinseca e della elettroforesi. I risultati sono riassunti nella seguente tabella:
Tempo (min.)
PH
Viscosità
intrinseca
(dl/g)
Elettroforesi CHS
DS
HS
-
4,7
0,459
20
50
30/100
30
4,9
0,365
15
40
30/85
60
4,7
-
-
120
4,5
-
-
180
4,4
-
15
30
30/75
300
3,8
0,225
5
15
15/35
Esempio 4
20 g di desossiribonucleinati di sodio da mammiferi vengono sciolti in 100 mi di acqua al pH naturale di 6,3. La soluzione viene riscaldata à riflusso e si segue la procedura dell'esempio 1. A periodi prestabiliti, dal pallone vengono raccolti campioni. Vengono eseguite registrazioni su ciascun campione riguardo a pH, H2O2 residuo' e punto di opalescenza (mi di etanolo aggiunti a gocce, necessari per la opalescenza permanente della soluzione). Poi si aggiungono 2 volumi di etanolo per precipitare i nucleinati depolimeriz-zati. I risultati sono riassunti nella seguente tabella:
Tempo (min.)
pH
% di H2O2 residuo
Punto di opalescenza, vol/vol
0
5,9
100
0,500
1
6,5
65
0,550
2
6,5
59
0,630
3
6,5
50
0,680
4
6,5
42
0,680
4
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
CH678 326 A5
Claims (8)
1. Procedimento per la depolimerizzazione controllata di polianioni che si rinvengono in natura, basata sulla generazione di radicali liberi superossido, idroperossido e/o ossidrile, in cui i radicali liberi vengono ottenute mediante l'azione di perossido d'idrogeno, in condizioni aereate in presenza di quantità catalitiche di sali ferrassi, ad un pH acido o neutro.
2. Procedimento secondo la rivendicazione 1, in cui il perossido di idrogeno è in eccesso, preferibilmente 2-5 volte rispetto alla stechiometria.
3. Procedimento secondo la rivendicazione 1, in cui polianioni sono acidi nucleici o glucosamminoglicani.
4. Procedimento secondo la rivendicazione 1, in cui la reazione viene svolta a un pH 4,0-7,0 ed una temperatura fino a 100°C, usualmente 20-80°C.
5. Procedimento secondo la rivendicazione 1, in cui là reazione viene fermata in qualsiasi momento impiegando scavengers di radicali liberi.
6. Procedimento secondo le rivendicazioni da 1 a 4 in cui lo scavenger è etanolo.
7. Prodotti di depolimerizzazione di polianioni naturali, ottenuti tramite il procedimento secondo una delle rivendicazioni 1 fino a 6.
8. Composizioni farmaceutiche, contenenti polianioni depolimerizzati, preparati secondo il procedimento rivendicato in una delle rivendicazioni 1 fino a 6.
5
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| AR86304799A AR243540A1 (es) | 1986-08-05 | 1986-08-05 | Procedimiento quimico para la depolimerizacion controlada de polianiones naturales y productos asi obtenidos, excluidos sus usos farmaceuticos. |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
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| CH678326A5 true CH678326A5 (en) | 1991-08-30 |
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