CH681693A5 - - Google Patents
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Description
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Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Fibrinogen-haltigen Kleber, der zum Verkleben von biologischen Geweben, insbesondere menschlichen Körpergeweben, bestimmt ist.
Die physiologische Wundheilung beruht auf einer komplexen, in mehreren Phasen ablaufenden Wechselwirkung zwischen Proteinen, Zellen und Korpuskeln des Blutes einerseits und Strukturproteinen, Polysacchariden und Zellen des Gewebes andererseits und führt schliesslich zum Schluss der Oberfläche und zur Ausfüllung der Wunde mit Gewebe.
Zur Verbindung und Wiederherstellung von Gewebestrukturen, die durch chirurgische Eingriffe, traumatische oder pathologische Einflüsse unterbrochen wurden, gelangen oft mechanische Massnahmen, wie z.B. Näh-, Klemm-, Nagel- und Schraubtechniken mittels natürlicher oder synthetischer, organischer oder anorganischer Hilfsmittel, zur Anwendung.
In neuerer Zeit wurden ausser diesen mechanischen Verfahren auch synthetische chemische Klebesysteme zur Verbindung von Geweben untersucht. Es gelangten vor allem Kunstharzkleber auf Basis von Polyacrylsäureestern, wie z.B. 2-Cyanoacrylsäure-isobutylester (Bucrylat™), zur Anwendung. Polyacrylkleber ergeben jedoch eine körperfremde, starre Klebezone, die sich nicht der Plastizität und Elastizität weicher Gewebe und Organe anpasst und durch mechanische Reizung Entzündungen verursacht. Die Anwendung derartiger Kunstharzkleber beschränkt sich darum heute auf den Bereich der Zahnmedizin und wenige spezielle orthopädisch-chirurgische Indikationen.
Um die genannten Nachteile der Kunstharzkleber zu überwinden, wurde versucht, an der physiologischen Wundheilung beteiligte Proteine als Wundklebemittel einzusetzen. So setzt sich ein Handelsprodukt (Tissucol® Kit, Immuno AG, Wien, Österreich) aus A) sogenanntem Cryopräzipitat von Humanblut, einem Gemisch von plasminogenhaltigem Fibrinogen, Fibronectin und als inaktives Proenzym vorliegendem Gerinnungsfaktor XIII, B) Rinderthrombin, C) Aprotininlösung und D) Calciumchloridlösung zusammen. Die Komponenten A und B sind Lyophilisate, welche vor der Anwendung in Wasser, unter dosiertem Zusatz der Komponenten C bezw. D, gelöst werden. Die zähflüssige, 75 bis 115 mg gerinnbares Protein pro ml enthaltende Lösung A/C und die, je nach Anwendung, 4 bis 500 Einheiten Thrombin enthaltende Lösung B/D werden nun entweder simultan oder nacheinander auf die Wundfläche aufgetragen und polymerisieren gelassen. Das im System enthaltene Thrombin katalysiert die Abspaltung von Fi-brinopeptiden (A und B) aus Fibrinogen und die Bildung von Fibrinmonomeren sowie die Aktivierung des fibrinstabilisierenden Faktors XIII. Je nach eingesetzter Thrombindosis entsteht innert weniger Sekunden bis einigen Minuten eine adhäsive, den Wunddefekt verschliessende Klebezone, welche je nach beigemengter Aprotininkonzentration mehr oder weniger rasch fibrinolytisch abgebaut und aufgelöst wird.
Das in Klebesystemen enthaltene bovine Thrombin ist ein instabiles, hitzeempfindliches Enzym, in welchem weder durch physikalische noch durch chemische Massnahmen Viren und Prionen inaktiviert oder abgeschwächt werden können, ohne dessen Enzymaktivität zu zerstören, und welches darum Träger von boviner spongiformer Enzephalopathie (BSE) und von säugetierpathogenen Viren sein kann. Bovines Thrombin ist ausserdem ein starkes Antigen, welches anaphylaktische Reaktionen im menschlichen Organismus auslösen kann. Humanes Thrombin ist zwar nicht antigen, birgt aber die Gefahr einer Übertragung von Hepatitis- und HIV-Viren in sich, da es wegen seiner Empfindlichkeit weder durch Hitzeeinwirkung noch durch chemische Massnahmen von Viren befreit werden kann. Im Blut liegt schliesslich ein Hemmstoff für Thrombin, das sogenannte Antithrombin III vor, welches das Thrombin des Klebers neutralisieren kann. Da dieser Thrombin-hemmende Effekt von Antithrombin III durch das Antikoagulans Heparin potenziert wird, kann ein thrombinhaltiger Kleber bei Patienten, die unter Heparinbehandlung stehen, nicht oder nur unter Einsatz grosser Thrombinkonzentrationen angewendet werden. Je höher aber die Thrombinkonzentration des Klebers, desto grösser ist das Risiko anaphylaktischer und throm-boembolischer Reaktionen. Von der Klebestelle abwanderndes Thrombin löst im zirkulierenden Blut eine Aktivierung der Plättchen-Adhäsions-, Aggregations- und Freisetzungs-Reaktionen aus und wirkt deshalb thrombogen. Um ein Risiko anaphylaktischer und thromboembolischer Komplikationen auf ein Minimum zu reduzieren, muss bei der Applikation thrombinhaltiger Wundkleber sorgsam darauf geachtet werden, dass Thrombin von nicht zu versorgendem Gewebe der Wundumgebung ferngehalten wird. Keinesfalls darf Thrombin in die Blutbahn gelangen, weil es durch seine vielfältige Aktivatorwirkung auf Blutplättchen, Plasmagerinnungsfaktoren und Endothelzellen Thrombosen und Embolien auslösen kann. Auch bei sorgfältiger Applikation bildet jedoch die Klebestelle ein Thrombindepot, welches intravasale Gerinnung auslösen und gegen welches der Organismus immunologische Abwehrreaktionen richten kann. Thrombinhaltige Fibrinkleber sind aus diesen Gründen nur mit bedeutenden Einschränkungen anwendbar und eignen sich keinesfalls für einen Einsatz bei chirurgischen Eingriffen an Blutgefässen.
Schliesslich bedingt die geringe Haltbarkeit von gelöstem Thrombin dessen Verwendung in lyophilisierter Form, was zu einer beachtlichen Verteuerung des Klebesystems führt und dessen Anwendung durch einen zusätzlichen Auflösungsvorgang kompliziert.
Ein gemeinsamer Nachteil aller Kleber, deren koagulierbares Protein in Form von Cryopräzipitat eingeführt wird, liegt in ihrer zähflüssigen Konsistenz, welche eine präzise Applikation verunmöglicht. Derartig zähflüssige oder pastose Kleber eignen sich nicht für microchirurgische Anwendungen oder für Operationen, welche durch das Endoskop ausgeführt werden.
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Es wurde nun versucht, die Nachteile thrombinhaltiger Fibrinkleber dadurch zu umgehen, dass man an Stelle von Thrombin ein Fibrinogen-spaltendes Enzym aus einem Schlangengift als Polymerisationsauslöser auf eine fibrinogenhaltige Cryopräzipitat-Lösung einwirken lässt. Im Gegensatz zu Thrombin, welches aus Fibrinogen die Fibrinopeptide A und B abspaltet und dadurch eine End-zu-End und Seite-zuSeite Polymerisation von Fibrin auslöst, katalysieren aber diese Schlangengiftenzyme spezifisch die ausschliessliche Abspaltung von Fibrinopeptid A unter Bildung eines fragilen, für Klebezwecke untauglichen Fibrins.
Überraschenderweise wurde jedoch gefunden, dass die mittels des Schlangengiftenzyms Batroxobin in Anwesenheit von Calciumionen ausgelöste Abspaltung von Fibrinopeptid A in einer Lösung von gereinigtem humanem Fibrinogen zur Entstehung eines Co-polymerisates mit hervorragenden biophysikalischen Eigenschaften führt, wenn dem Gemisch aktivierter Faktor XIII (Faktor Xlila) zugesetzt wird. Unter Verwendung von gereinigtem humanem Fibrinogen, gereinigtem 30 humanem Fibronectin und gereinigtem, humanem aktiviertem Faktor XIII können Gemische mit verschiedenen Viskositäten und auch Lyophilisate, welche nach Auflösung dünnflüssige, einfach und präzis applizierbare Komponenten eines Klebesystems liefern, hergestellt werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Kleber zum Verkleben von biologischen Geweben, insbesondere menschlichen Körpergeweben, welcher
(a) Fibrinogen,
(b) ein Fibrinogen-spaltendes Enzym,
(c) einen Calciumionen liefernden Stoff und
(d) Blutgerinnungsfaktor XIII
enthält und dadurch gekennzeichnet ist, dass er den Blutgerinnungsfaktor XIII in aktivierter Form (Faktor Xllla) und als Fibrinogen-spaltendes Enzym ein Fibrinogen-spaltendes Schlangengiftenzym enthält.
Fibrinogen-spaltende Schlangengiftenzyme können aus den Giften der Schlangenfamilie Viperidae gewonnen werden. Bis heute sind 27 Fibrinogen-spaltende Enzyme aus Schlangengiften der Schlangenfamilie Viperidae isoliert und charakterisiert worden (H. Pirkle and K. Stocker, Thrombin-like enzymes from snake venoms: An inventory. Thromb. Haemostas., in press). Zwei dieser Enzyme, Ancrod und Batroxobin, werden in der Humanmedizin als antithrombotische Arzneimittel zur therapeutischen Defibrino-genierung eingesetzt. Sie sind in Lösung sehr stabil, werden durch Antithrombin III auch in Anwesenheit von Heparin nicht gehemmt, sind für den menschlichen Organismus als sehr schwache Antigene gut verträglich und wirken spezifisch nur auf Fibrinogen ein. Andere Gerinnungsfaktoren oder Thrombozyten-funktionen werden durch diese beiden Enzyme weder aktiviert noch gehemmt. Thromboembolische Nebenwirkungen sind praktisch ausgeschlossen. Ferner besteht bei diesen von Reptilienarten stammenden Enzymen keine Kontaminationsgefahr durch Säugetier-pathogene Viren oder Prionen.
Der erfindungsgemässe Kleber eignet sich darum nicht nur zur Anwendung in den herkömmlichen Indikationen für Fibrinkleber, sondern auch bei endoskopischen Operationen beispielsweise im Gelenkbereich und im besonderen bei gefässchirurgischen Eingriffen.
Die Klebekapazität des erfindungsgemässen Klebers kann durch Zugabe von Fibronectin zu der Klebermischung wesentlich erhöht werden.
Es wurde ferner gefunden, dass die Festigkeit der Gewebeverklebungen beträchtlich verstärkt werden kann, wenn der Klebermischung ein Reduktionsmittel beigemengt wird.
Geeignete Reduktionsmittel sind vorzugsweise Thiolverbindungen wie Cystein, Dithiothreitol, Di-thioerythrit, Glutathion, Thioredoxin oder ähnliche Verbindungen. Die verstärkende Wirkung dieser Thiolverbindungen beruht möglicherweise auf ihrer stabilisierenden Wirkung auf die aktive, reduzierte Form von Faktor Xllla und möglicherweise auch auf einer Auslösung von Disulfid-Austauschreaktio-nen im polymerisierten Klebermaterial. Man kann beispielsweise Dithiothreitol in Konzentrationen von 0,1-1 mM pro Liter des Gesamtklebers verwenden.
Der Gerinnungsfaktor XIII wird vor der Zugabe zum Klebergemisch mittels Thrombin, Trypsin oder dem Schlangengiftenzym Thrombocytin aktiviert. Die Aktivierung kann folgendermassen durchgeführt werden: 10 ml einer Lösung von 500 Einheiten Faktor XIII, in gepufferter (pH 7,4) 0,05 molarer Natriumchloridlösung werden mit 100 Einheiten Thrombin oder 20 Einheiten Thrombocytin inkubiert. Die zur Aktivierung von Faktor XIII verwendeten Enzyme werden vorzugsweise durch Fixierung an einen unlöslichen Träger, wie z.B. Sepharose 4B (Pharmacia, Schweden), insolubilisiert. Nach vollendeter Aktivierung können die insolubilisierten Enzyme einfach durch Zentrifugation oder Filtration vom aktivierten Fairtor XIII abgetrennt werden.
Die in Lösung gut haltbaren Schlangengiftenzyme brauchen nicht lyophilisiert zu werden, was die Anwendung des Klebers vereinfacht und seine Gestehungskosten reduziert. Die Fibrinogen-spaltenden Schlangengiftenzyme können in wässrigen Eiektrolytlösungen, z.B. in Natriumchlorid- oder Calciumchlo-ridlösungen, gelöst werden. Weil die ohnehin nur wenig antigenen Schlangengiftenzyme durch Antithrombin selbst in Anwesenheit von Heparin nicht gehemmt werden, können sie sogar bei Patienten, die unter Heparinbehandlung stehen, in sehr niedriger Dosis eingesetzt werden, wodurch die Gefahr anaphylaktischer Reaktionen praktisch ausgeschlossen wird. Da schliesslich die Schlangengiftenzyme weder die
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endogene oder exogene Prothrombinaktivierung bewirken noch die Adhäsions-, Aggregations- und Freisetzungsreaktionen bei Blutplättchen auslösen, ist bei der Anwendung des erfindungsgemässen Klebers auch eine Gefahr thromboembolischer Komplikationen ausgeschlossen.
Als Ausgangsmaterial zur Gewinnung Fibrinogen-spaltender Schlangengiftenzyme eignen sich die Giftdrüsensekrete von solenoglyphen Schlangen (also solchen mit beweglichen, röhrenförmigen Giftzähnen), die der Familie der Vipern (Viperidae), insbesondere dem Tribus der Grubenottern (Crotalinae) angehören. Insbesondere eignet sich das Gift der Bothrops atrox, der Bothrops moojeni und der Callo-selasma (Agkistrodon) rhodostoma, aus welchem die bereits in der Humanmedizin anwendbaren Fibrino-gen-spaltenden Enzyme Batroxobin und Ancrod hergestellt werden (Stocker, K. Defibrinogenation with thrombin-like snake venom enzymes, in Fibrinolytics and Antifibrinolytics, Markwardt, F., Ed., Springer-Verlag, Berlin, 1978,451).
Die im erfindungsgemässen Kleber verwendeten humanen Proteine Fibrinogen und Faktor XIII werden aus Blut von kontrollierten Spendern gewonnen und durch an sich bekannte chemische und physikalische Verfahren zur Virusinaktivierung behandelt.
Der erfindungsgemässe Kleber kann im gebrauchsfertigen Zustand beispielsweise 2 bis 40 mg Fibrinogen pro ml, 0,5 bis 10 mg Fibronectin pro ml, 0,4 bis 2 Einheiten aktivierten Faktor XIII pro ml, 5 bis 20 mMol Calciumchlorid pro L, 0,1 mMol Natriumchlorid pro L, 0,05 mMol Pufferionen pro L, z.B. Tris-hy-droxymethylaminomethan (TRIS), und 1 bis 100 KIE-Einheiten Aprotinin pro ml enthalten. Unmittelbar vor der Applikation solcher Gemische auf zu verklebendes Gewebe wird die Polymerisation und Gelierung des Fibrinogens durch Zusatz einer wässrigen Batroxobinlösung ausgelöst. Die Batroxobinkonzentra-tion der Lösung wird derart eingestellt, dass der gebrauchsfertige Gesamtkleber 5-100 Einheiten Batroxobin enthält. Mit Batroxobinmengen von 10 bis 50 Einheiten pro ml Klebergemisch werden Gelierungs-zeiten von 10 bis 30 Sekunden erzielt.
Der erfindungsgemässe Kleber kann beispielsweise aus drei separaten, bei Gebrauch des Klebers zu mischenden ampullierten Komponenten zusammengesetzt sein. Ampulle 1 enthält 20 mg Fibrinogen, 1 mg Fibronectin, 1 Einheit (KIE) 5 Aprotinin und 1 Einheit aktivierten Faktor XIII in lyophilisierter Form. Ampulle 2 enthält 1 ml 0,02 molare Calciumchloridlösung, die als Lösungsmittel für den Inhalt der Ampulle 1 dient. Ampulle 3 enthält 0,2 ml einer wässrigen Lösung, die 50 Batroxobin-Einheiten und 4 (ig Dithiothreitol per ml enthält. Bei Gebrauch des Klebers wird der Inhalt der Ampulle 1 im Inhalt der Ampulle 2 gelöst. Die Lösung wird in eine sterile Injektionsspritze aufgesogen. In eine zweite Injektionsspritze wird die Lösung aus Ampulle 3 aufgenommen. Man trägt die Inhalte beider Spritzen simultan auf die zu 15 verklebenden Gewebeflächen und vereinigt die letzteren unter angemessener Kraftanwendung.
Die Eigenschaften der erfindungsgemässen Klebergemische können einerseits durch chemische und physico-chemische Prüfungen des erzeugten Fibrins und andererseits durch Messungen mechanischer Parameter, wie Steifheit, Zugfestigkeit und Adhäsivität des Klebers gegenüber verschiedenen Geweben untersucht werden.
Chemische Methoden zur Untersuchung der Klebereigenschaften beinhalten die Bestimmung der Proteinmasse durch Aminosäurenanalyse und des Quervernetzungsgrades durch elektrophoretische Prozeduren. Durch turbidometrische Messungen und durch Bestimmung der Permeabilität nach Blombäck et al. (Biochim. Biophys. Acta 997. 96-110, 1989) können die Porosität und die mittlere Dicke der Fibrinfasern in Polymerisaten verschiedener Klebergemische ermittelt werden.
Zur Messung der mechanischen Eigenschaften von Klebergemischen wurde die nachfolgend beschriebene neue Methode entwickelt: Eine kreisförmige Scheibe eines ausgewählten biologischen Gewebes wird auf das eine Ende eines Metallzylinders montiert. Dieses Zylinderende ist mit einem Metallnetz von definierter Maschenweite bedeckt, um die aufgebrachte Gewebeprobe daran zu hindern, in den Zylinder hineinzugleiten. Das andere Zylinderende ist mit einer dichten Metaliplatte hermetisch verschlossen. Auf die gleiche Weise wird eine zweite kreisförmige Scheibe desselben biologischen Gewebes auf einen zweiten Metallzylinder montiert. Der zu prüfende Kleber wird nun auf die freiliegende Oberfläche der einen Gewebescheibe appliziert, worauf die beiden auf ihren Metalizylindern montierten Gewebescheiben fest gegeneinander gepresst werden. Nach erfolgter Polymerisation des Fibrinogens werden beide Zylinder unter Vakuum gesetzt, wodurch die beiden Gewebeproben mit bekannter Kraft gegen die auf den Zylinderenden angebrachten Metallnetze gesogen werden. Dann wird auf beide Metallzylinder eine Zugkraft bei konstanter Geschwindigkeit ausgeübt und die Zugbewegung über eine mit dem System verbundene Kraftmesszelle digital und graphisch registriert. Diese Aufzeichnungen objektivieren die mechanischen Eigenschaften der zwischen dem biologischen Gewebe und dem Kleber entstandenen mechanischen Verbindung. Zur Bestimmung der mechanischen Eigenschaften des Klebers selbst gelangt das selbe Testprinzip zur Anwendung, jedoch werden die Gewebeproben durch kreisförmige Scheiben aus polymerisiertem Kleber ersetzt.
Beispiel 1
Es wurde eine aus 3 separaten Komponenten bestehende Kleberkombination in der nachfolgend beschriebenen Weise hergestellt:
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Komponente I:
2 g plasminogenfreies, menschliches Fibrinogen, 0,1 g menschliches Fibronectin, 100 Einheiten Faktor Xllla und 100 Kallikreininhibitor-Einheiten (KIE) Aprotinin wurden in 100 ml einer wässrigen, sterilen, py-rogenfreien Pufferlösung, die 0,05 Mol pro L Tris-hydroxymethylaminomethan, 0,1 Mol pro L Natriumchlorid und 1 mMol pro L Ethylendiamintetraessigsäure enthielt und ein pH von 7,4 aufwies, aufgelöst. Die Lösung wurde durch einen Membran-Bakterienfilter mit einer Porengrösse von 0,2 n sterilfiltriert, unter sterilen Bedingungen in Portionen von je 1,0 ml in 10 ml-Ampullen abgefüllt und unter sterilen Bedingungen lyophilisiert. Die Ampullen wurden anschliessend verschweisst.
Komponente II:
Ais Lösungsmittel für die lyophilisierte Komponente I wurde eine wässrige 0,02 molare Calciumchlorid-lösung zubereitet. Die Lösung wurde durch einen Membranfilter faserfrei filtriert, in Ampullen zu je 1 ml abgefüllt und während 30 Minuten im Autoklaven bei 120°C sterilisiert.
Komponente III:
Zur Aktivierung der durch Auflösung von Komponente I in Komponente II erhaltenen, Calciumionen enthaltenden Proteinlösung wurden zwei Batroxobinlösungen (lila und lllb) mit zwei die Polymerisation des Fibrinogens unterschiedlich schnell katalysierenden Batroxobinkonzentrationen verwendet. Zur Erzielung einer langsamen Polymerisation bestand die Komponente lila aus 0,2 ml einer sterilen wässrigen Lösung von 10 Einheiten Batroxobin und 4 ng Dithiothreitol pro ml und zur Erzielung einer schnellen Polymerisation enthielt Komponente lllb 0,2 ml einer Lösung von 50 Einheiten Batroxobin und 4 ng Dithiothreitol pro ml. Die Batroxobin/Dithiothreitol-Lösungen lila und lllb wurden durch Sterilfiltration sterilisiert und unter aseptischen Bedingungen in Ampullen mit je 0,2 ml abgefüllt.
Bei Gebrauch des Klebers löste man die Komponente (Lyophilisat) in der Komponente II (Lösungsmittel) und gab der Lösung die Komponente III zu. Der gebrauchsfertige Kleber enthielt pro ml 0,0167 g Fibrinogen, 0,0008 g Fibronectin, 0,833 Einheit Faktor Xllla, 0,833 KIE Aprotinin, 0,0018 g CaCb, 8,333 bzw. 33,333 Einheiten Batroxobin und 0,66 |ig Dithiothreitol.
Beispiel 2
Es wurde die Wirkung von Thrombin und Batroxobin auf Fibrinogen in Anwesenheit bzw. Abwesenheit von Faktor Xllla untersucht.
Eine Lösung von Faktor Xllt-haltigem Fibrinogen (1,5 mg/ml in TNE-Puffer enthaltend 0,05 Mol TRIS, 0,1 Mol NaCI und 1 mMol EDTA pro L) wurde in Gegenwart von Calciumchlorid (20 mMol pro L Reaktionsgemisch) während 15 Stunden mit Thrombin bzw. Batroxobin inkubiert. Das entstandene Gerinnsel wurde durch Turbiditäts- und Viskositätsmessungen geprüft. Die Porosität, (ix), das Verhältnis Fasermasse zu Faserlänge und Faserdurchmesser, wurde berechnet. In denjenigen Experimenten, in welchen die Gerinnung mittels Batroxobin ausgelöst wurde, setzte man dem Reaktionsgemisch aktivierten Faktor XIII (FXIIIa) zu. Die Ergebnisse der Turbiditäts- und Viskositätsmessungen, ausgedrückt durch die errechnete Gerinnselporosität (n) sind in Tabelle I zusammengestellt.
Tabelle I
Probe
Thrombin Einheiten/ml
Batroxobin Einheiten/ml
FXIIIa
Einheiten/ml (zugesetzt)
V
Dalton/cmx 10"12
Fbg + Ba
0
0,9
0
10,0
Fbg + Ba + FXIIIa
0
0,9
0,4
3,0
Fbg+ Ba +FXIIIa
0
0,9
0,4
3,0
Fbg + Thr
1
0
0
4,5
Fbg = Fibrinogen Ba = Batroxobin Thr = Thrombin
Fibrinogen enthielt 0,4 Einheiten FXIII pro ml
Die in Tabelle I zusammengestellten Versuchsergebnisse zeigen, dass die Porosität (ji = Verhältnis Fasermasse zu Faserlänge und Faserdurchmesser) der mittels Batroxobin erhaltenen Gele kleiner ist als diejenige der mittels Thrombin erhaltenen Gele und dass durch Zugabe von Faktor Xllla die Porosität der mittels Batroxobin erhaltenen Gele wesentlich verringert wird und dadurch die Gele verdichtet sind.
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Beispiel 3
Verklebuna von Endotheloberflächen - Einfluss von Fibrinogen. Fibronectin und Faktor Xllla auf die maximale Zugfestigkeit
Endothelproben wurden aus Schweineaorta gewonnen. Scheiben von 1 cm2 Durchmesser wurden aus der Aortawand herausgeschnitten. 100 jd von mit Batroxobin aktiviertem Kleber (Tabelle II) wurden auf die Endotheloberfläche einer Scheibe aufpipettiert, worauf sofort eine zweite Aortascheibe auf die Kleberschicht derart aufgebracht wurde, dass deren Endotheloberfläche dem Kleber zugekehrt war. Nachdem der auf diese Weise zubereitete Aorta-Kleber-Aorta-«Sandwich» während einer Stunde bei Raumtemperatur aufbewahrt worden war, wurde die Zugfestigkeit (N/cm2) der Klebestelle gemessen. Die spezifische Zusammensetzung der Kleberproben bezüglich Fibrinogen, Fibronectin, FXIIIa und aktivierendes Enzym ist in Tabelle II angegeben. In allen Fällen (mit Ausnahme des Kontrollversuches) wurden dem Kleber Calciumchlorid in einer Endkonzentration von 20 mMol pro L und Dithiothreitol in einer Konzentration von 0,5 mMol pro L zugesetzt. Für den Kontrollversuch wurden Aortascheiben ohne Kleber vereinigt. Bei der Prüfung des Verklebungsvermögens (N/cm2) wurde nachgewiesen, dass Fibrinogen, Fibronectin und FXIIIa wesentliche Komponenten des mittels Batroxobin polymerisierten Klebers darstellen und dass das Endothel-Verklebungsvermögen dieser Mischung mindestens ebenso gut ist wie dasjenige des mittels Thrombin aktivierten Klebers.
Tabelle II
Versuch
Zusammensetzung des Klebers Fbg FN FXIIIa mg/ml mg/ml Einheiten/ml
Ba
Einheiten/ml
Thr
Einheiten/ml
Max. Zugfestigkeit (N/cm2)
1
20
2
1,6
5,4
0
8,8
2
20
0
1,6
5,4
0
<2,0
3
20
2
0
5,4
0
<2,0
4
20
2
1,6
0
4
3,6
Kontrolle
0
0
0
0
0
<2,0
Fbg = Fibrinogen FN = Fibronectin Ba = Batroxobin Thr = Thrombin
Beispiel 4
Verklebuno von Haut - Einfluss der Variation der Fibrinogen und Dithiothreitol-Konzentration auf die maximale Zugfestigkeit
Zur Durchführung dieser Versuche wurde Schweinehaut verwendet. Anästhesierten Schweinen wurden mittels eines Dermatoms 1 mm dicke Hautlappen entnommen, aus welchen Scheiben ausgeschnitten wurden. Die Scheiben wurden wie in Beispiel 3 beschrieben zusammengeklebt, wobei mittels Batroxobin aktivierte Klebergemische mit unterschiedlicher Fibrinogen- und Fibronectinkonzentration, ohne bzw. mit Dithiothreitol (DTT, Endkonzentration 0,5 mM) zu Prüfung gelangten. Bei den in Tabelle III zusammen-gefassten Versuchen betrug die Gerinnungszeit des aktivierten Klebers 30 bis 40 Sekunden. Die Klebefestigkeit, ausgedrückt als maximale Zugfestigkeit (N/cm2), wurde geprüft.
6
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
CH 681 693 A5
Tabelle III
Versuch
Fbg
DTT
FN
FXIIIa
Ba
Max. Zugfestigkeit
mg/ml mM
mg/ml
Einheiten/ml
Einheiten/ml
(N/cm2)
1
20
0
2
1,6
22
>9,0
2
20
0
2
1,6
22
>9,0
3
20
0,5
2
1,6
22
>9,0
4
20
0,5
2
1,6
22
>9,0
5
10
0
1
1,6
22
5,0
6
10
0
1
1,6
22
5,0
7
10
0,5
1
1,6
22
>9,0
8
10
0,5
1
1,6
22
>9,0
Fbg = Fibrinogen DTT = Dithiothreitol
FN = Fibronectin Ba = Batroxobin
Claims (10)
1. Kleber zum Verkleben von biologischen Geweben, insbesondere menschlichen Körpergeweben, welcher
(a) Fibrinogen,
(b) ein Fibrinogen-spaltendes Enzym,
(c) einen Calciumionen liefernden Stoff und
(d) Blutgerinnungsfaktor XIII
enthält, dadurch gekennzeichnet, dass er den Blutgerinnungsfaktor XIII in aktivierter Form, Faktor Xllla, und als Fibrinogen-spaltendes Enzym ein Fibrinogen-spaltendes Schlangengiftenzym enthält.
2. Kleber gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass er als Fibrinogen-spaltendes Schlangengiftenzym ein aus den Giften der Schlangenfamilie Viperidae gewonnenes Fibrinogen-spaltendes Enzym enthält.
3. Kleber gemäss Patentanspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass er das aus Bothrops atrox oder Bothrops moojeni gewonnene Schlangengiftenzym Batroxobin enthält.
4. Kleber gemäss Patentanspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass er das aus Agkistrodon rhodo-stoma gewonnene Schlangengiftenzym Ancrod enthält.
5. Kleber gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass er einen seine Klebekapazität erhöhenden Stoff, z.B. Fibronectin, enthält.
6. Kleber gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass er als Calciumionen liefernden Stoff Calciumchlorid oder Calciumgluconat enthält.
7. Kleber gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass er einen die Fibrinoiyse hemmenden Stoff, z.B. Aprotinin, Antiplasmin oder einen synthetischen Plasmin-Inhibitor, z.B. 2-Tosylamino-4-(4'-amidinophenyl)-buttersäureanilid, enthält.
8. Kleber gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass er ein die Festigkeit der Verklebung erhöhendes Reduktionsmittel, z.B. eine Thiolverbindung, insbesondere Cystein, Dithiothreitol, Di-thioerythrit, Glutathion oder Thioredoxin, enthält.
9. Kleber gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass er als Lösungsmittel eine gepufferte wässrige Elektrolytlösung enthält.
10. Kleber gemäss Patentanspruch 1, welcher aus 3 separaten, bei Gebrauch des Klebers zu mischenden Komponenten zusammengesetzt ist, dadurch gekennzeichnet, dass die Komponente I Fibrinogen, Fibronectin, Faktor Xllla und Aprotinin enthält, die Komponente II eine wässrige Calciumchloridlösung ist und die Komponente III eine wässrige Lösung von Batroxobin und Dithiothreitol ist.
7
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Applications Claiming Priority (1)
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| CH606/91A CH681693A5 (de) | 1991-02-28 | 1991-02-28 |
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| CN1091315A (zh) * | 1992-10-08 | 1994-08-31 | E·R·斯奎布父子公司 | 血纤维蛋白封闭剂组合物及其使用方法 |
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1991
- 1991-02-28 CH CH606/91A patent/CH681693A5/de not_active IP Right Cessation
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1992
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- 1992-02-21 WO PCT/CH1992/000036 patent/WO1992015341A1/de not_active Ceased
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Also Published As
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| WO1992015341A1 (de) | 1992-09-17 |
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