CH682401A5 - Immobilisierte Enzyme. - Google Patents

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CH682401A5
CH682401A5 CH2713/91A CH271391A CH682401A5 CH 682401 A5 CH682401 A5 CH 682401A5 CH 2713/91 A CH2713/91 A CH 2713/91A CH 271391 A CH271391 A CH 271391A CH 682401 A5 CH682401 A5 CH 682401A5
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enzyme
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solid enzyme
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CH2713/91A
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Volker Dr Kerscher
Hermann Dr Plainer
Bruno Dr Sproessler
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Roehm Gmbh
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Description

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CH 682 401 A5
Beschreibung
Die Erfindung betrifft Enzyme, die auf Naturstoffpartikeln von vorwiegend Cellulosecharakter immobilisiert sind und die sich insbesondere für die Anwendung in organischen Medien eignen.
Schon frühzeitig wurde erkannt, welche Vorteile eine Träger-Fixierung von Enzymen beim technischen Einsatz mit sich bringt. In erster Linie sind hier die meist problemlose Wiederverwendbarkeit bei gewöhnlich geringerem Aktivitätsverlust, die Gewinnung enzymfreier Umsetzungsprodukte und die Möglichkeit einer kontinuierlichen Verfahrensführung zu nennen. Besonders aktuell ist die Immobilisierung, wenn Enzyme in organischen Medien zur Anwendung kommen sollen (vgl. A. M. Klibanow et al. in Proc. Nat. Acad. Sei. USA 22, 3192 (1985); Kazandjian et al. Biotechnology and Bioengineering Vol. XXVill, pp. 417—421 (1986):
Dabei handelt es sich durchweg um teure Enzyme (wie z.B. Lipasen hoher Spezifität, Esterasen, Phospholipasen usw.), deren Wiederverwendbarkeit eine ökonomische Notwendigkeit darstellt. Weiter spielt dabei eine Rolle, dass bei Reaktionen im organischen Medium ein geringer Wassergehalt in der Reaktionszone notwendig ist. Ein Immobilisât erlaubt durch seine meist definierte Wasseraufnahme (überwiegend als «Quellverhalten» zu erfassen) eine genaue Einstellung des notwendigen Wassergehalts. Die Reaktionen im organischen Medium verlangen im allgemeinen eine möglichst grosse Grenzfläche zwischen dem organischen Medium, in dem sich das Substrat befindet und dem Enzym. Für solche heterogenen Reaktionsbedingungen bietet ein ausgewählter Träger mit möglichst hoher geometrischer Oberfläche den idealen Reaktionsort. Dagegen sind Enzymträger für homogene Reaktionen bei denen auf eine hohe innere Oberfläche (Porenvolumen) geachtet wird für diesen Reaktionsweg meist ungeeignet. Wie bereits erwähnt, haben sich eine Reihe von Enzymen, insbesondere vom Typ der Hy-drolasen, als wirksam im organischen Medium erwiesen.
Möglichenweise lassen sich noch weitere Enzyme bzw. Enzymgruppen erfolgreich im organischen Medium einsetzen. Als paradigmatisch für die technischen Voraussetzungen der vorliegenden Erfindung und die vorliegende Problematik sei im folgenden die Klasse der Lipasen (Glycerinester-Hydrolasen, E.C. 3.1.1.3) angeführt. (Vgl. P. Gramatica in «Chimia oggi» 1989. pg. 9; M. Schneider, E. H. Reimer-des in Forum Mikrobiologie 9/87 pg. 302.)
Mittels immobilisierter Lipasen lassen sich im organischen Medium unter geeigneten Bedingungen Umesterungen, Veresterungen, Alkohoiysen, Acidolysen und Hydrolysen durchführen. Derartige Reaktionen spielen in der Fettindustrie eine grosse Rolle. Es handelt sich dabei um ausgereifte technische Verfahren basierend auf eingehend untersuchten chemischen Prozessen.
Für entsprechende biologische Prozesse besteht überwiegend (noch) kein Bedarf, es sei denn, es werden an das Verfahrensprodukt höhere Ansprüche (z.B. Reinheit, Farbe, Stereospezifität u.ä.) gesteilt. Zwei Produkte seien stellvertretend für derartige spezielle Enzyme genannt:
- Ein auf Ionenaustauscher adsorbierte Mucor mihei-Lipase (LIPOZYME® der Fa. Novo)
- Mittels Acetonfäliung auf Diatomeen-Erde niedergeschlagene Lipase (vgl. GB-C 1 577 933)
Ein grosstechnischer Einsatz von wertvollen Enzymen - wiederum seien als Beispiel Lipasen genannt - durch den sich die etablierten chemischen Verfahren hätten ersetzen lassen, ist bislang stets an den wirtschaftlichen Gegebenheiten - Lipasen sind auch nach der Immobilisierung viel zu teuer -und an den schwierigen Umsetzungsbedingungen - meist handelt es sich um heterogene Systeme -gescheitert. Es kann daher auch nicht überraschen, dass aus den vielerlei Vorschlägen für enzymati-sche Synthesen bislang kein industrieller Prozess hervorgegangen ist, zudem das Problem der Wiederverwendung des Enzyms grossenteils ungelöst ist. Somit bestand nach wie vor ein Bedarf an wohlfeiler, auf Trägermaterial immobilisierter Lipase. Es wurde nun gefunden, dass erfindungsgemäss immobilisierte Enzyme den Anforderungen der Technik in besonderem Masse nahekommen. Die Erfindung betrifft adsorptiv immobilisierte Enzyme E, die auf Enzymträgern ET bestehend aus unmodifizierten Naturstoffpartikeln von vorwiegend Cellulosecharakter wie Holzmehl, Cellulosefasern oder Baumwoll-Linters aufgebracht sind.
Die erfindungsgemäss anzuwendenden Naturstoffpartikel haben in der Regel eine Teilchengrösse im Bereich 0,01-1 mm. Im Stand der Technik hatte man zur Fixierung andere Wege eingeschlagen.
Cellulose und Lignin sind nach aufwendiger Modifizierung beispielsweise durch Perjodatoxidation und reduktive Aminierung als reaktive Enzymträger beschrieben worden (vgl. PCT Int. Appi. 8 102 860; Fen-gxie et al. Biotechnol. Letters Vol. 10, 221 (1988)). Kovalente Enzymbindung an Celluiose wird in sehr allgemeiner Form auch in der GB-A 1 407 488 vorgeschlagen. An Celluloseperlen kovalent gebundene ß-Maltase wird z.B. von H. Maeda et al. in Biotechnol. Bioeng. 2Q> 383 (1978) beschrieben.
Bei den erfindungsgemässen Enzymträgern ET handelt es sich im Unterschied zum Stand der Technik um nicht chemischmodifizierte Naturstoffpartikel. Die die Naturstoffpartikel bildenden Fasern sind demnach nicht chemisch-reaktiv.
Die Enzyme (siehe «Die Enzyme» im folgenden) werden vorzugsweise aus wässrigem Medium auf die Enzymträger ET aufgebracht. Vorteilhafterweise bedient man sich dabei der aus der DE-A
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3 515 252 bekannten Methode, d.h. der Kupplung in Gegenwart einer relativ hohen Salzkonzentration, gegebenenfalls auch bei leicht erhöhten Temperaturen. Sulfate und Phosphate, aber auch andere aussalzende Salze sind hierfür am besten geeignet.
Die Anwendung der erfindungsgemäss immobilisierten Enzyme findet jedoch zweckmässig im organischen Milieu OM statt, vorzugsweise in Gegenwart von Spuren von Wasser. Als Anhalt seien 0,0004-1 Gew.-% Wasser bezogen auf das organische Milieu angegeben.
Die Enzyme E
Als zu immobilisierende Enzyme E eignen sich industriell anzuwendende Enzyme, inbesondere wenn deren Einsatz in organischem Medium praktikabel ist.
Genannt seien insbesondere die Klassen der Hydrolasen (z.B. E.C.3, insbesondere E.C.3.1., E.C. 3.2.1; E.C.3.4) der Isomerasen (z.B. E.C.5, insbesondere E.C.5.3.1), der Oxidoreductasen (E.C.1, insbesondere E.C.1.1; E.C.1.10; E.C.1.11; E.C.1.13) und der Transferasen (E.C.2, insbesondere E.C.2.1; E.C.2.4) (Enzyme Nomenclature, Elsevier Scientific Publishing Company 1973; Kirk-Othmer, Encyclope-dia of Chemical Technology, 3rd. Ed. Vol. 9, 148-240, pg. 175-178 ff, 1980). Speziell erwähnt seien beispielsweise die Esterasen (E.C.3.1.1), Proteasen (E.C.3.4.12; E.C.3.4.21; E.C.3.4.22; E.C.3.4.23; E.C.3.4.24) Dehydrogenasen (E.C.1.1.1, 1.1.3), Peroxidasen (E.C.1.11.1) Glycosyltransferasen (E.C.2.4) und insbesondere die Lipasen (E.C.3.1.1.3), die Phospholipasen vom Typ A2 (E.C.3.1.1.4), B (E.C.3.1.1.5), C (E.C. 3.1.4.3) und D (E.C.3.1.4.4), die Glucoseoxidase (E.C.1.1.3.4), Peroxidase (E.C.1.11.1.6), Lipoxidase (E.C.1.13.11.12) Hexosyltransferasen (E.C.2.4.1) und Pentoxytransferasen (E.C.2.4.2). Zu den Enzymen sei im einzelnen ausgeführt:
A) Lipasen (E.C.3.1.1.3)
Wie allgemein üblich seien als Lipasen Carboxylesterasen bezeichnet, die normalerweise Glycerin-ester in wässriger Emulsion spalten. Sie unterscheiden sich insofern von anderen Carboxylesterasen, die das Substrat in wässriger Lösung spalten.
a) Pankreas-Lipasen
Der pankreatische Enzymkomplex enthält neben Lipasen meist Esterasen sowie Proteasen und Amy-lasen als technisch wichtige Begleitenzyme. Das pH-Optimum (gegenüber Olivenöl) liegt im Bereich 7-8,5 der Aktivitätsbereich liegt bei pH 6,5-9,5.
Lipasen sind i.a. sehr instabil, insbesondere gegenüber proteolytischem Abbau durch Begleitprotea-sen.
ß) Mikrobiologische Lipasen z.B. aus Pseudomonas fragi, Aspergillus sp. (z.B. A. luchuensis) Candida cylindracea, Geotrichum candidum, Humicola lanuginosa, Mucor pusillus, Pénicillium sp. (z.B. P. chrysogenum, P. oxalicum), Rhizopus sp. (R. nigricans, R. oryzae).
Diese Lipasen weisen in der Regel mindestens ein pH-Optimum bei pH > 7,0 auf. Lipasen finden, soweit ihre Instabilität dies zulässt, Verwendung u.a. in der Abfallbeseitigung, Lederindustrie und in der Ernährungsbranche.
In herkömmlicher Weise wird die Aktivitätsbestimmung von Lipasen mit Olivenöl als Substrat durchgeführt, ferner mit Triacetin und Tributyrin. [Vgl. M. Sémériva et al. Biochemistry 10, 2143 (1971); Phar-maceutical Enzymes, edited by R. Ruyssen and A. Lauwers 1978, (FIP)].
Soweit die fettspaltende Aktivität in Kilo-Lipase-Units (Einheit = KLCA) ausgedrückt wird, wird unter den Standardbedingungen: 40 Grad C, pH = 5,5 mit Tributyrin als Substrat gearbeitet. (Vgl. M. Sémériva, oben zitierte Literaturstelle.)
B) Katalasen/Hydroperoxidasen (E.C.1.11.1.6)
a) aus tierischem Gewebe z.B. aus Leber
ß) aus Pflanzen z.B. aus Meerrettich
7) aus Mikroorganismen z.B. aus Micrococcus lysodeicticus
Katalasen finden üblicherweise Anwendung zur Peroxid-Bleichung und in der Milchindustrie.
C) Proteasen (E.C.3.4; Kirk-Othmer, loc.cit. Vol. 2, K. Aunstrup in B. Spencer Ed. Industriai Aspects of Biochemistry, Vol. 2Ü (l), PP 23-46, North Holland 1974.)
a) tierischen Ursprungs, wie beispielsweise a) Rennin (E.C. 3.4.23.4)
ß) Pankreas-Proteasen
Pancreatin, insbesondere Trypsin, Chymotrypsin (pH-Wirkungsbereich ca. 7-10)
Pepsin (E.C.3.4.23.1) (pH-Wirkungsbereich ca. 1,5-4,0)
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Kathepsin (E.C.3.4.23.5)
Wirkungsbereich ca. 4.0-5,0
b) pflanzlichen Ursprungs a) Papain (E.C.3.4.22.1) pH-Wirkungsbereich ca. 5,0-8,0
ß) Ficin (E.C.3.4.22.3) pH-Wirkungsbereich ca. 4,0-9,0.
7) Bromelain (E.C.3.4.22.4 und 3.4.22.5) pH-Wirkungsbereich ca. 5,0-7,0
c) mikrobiellen Ursprungs (vgl. L. Keay in «Process Biochemistry», 1971, 17-21.
a) aus Bacillus-Arten wie B. subtilis, B. licheniformis, B. alkalophilus, B. cereus, B. natto, B. vulgatus, B. mycoides.
ß) aus Streptococcus-Arten
7) aus Streptomyces-Arten wie Streptomyces fradiae, S.griseus, S.rectus
8) aus Aspergillus-Arten wie Aspergillus flavus-oryzae, A.niger, A.saitoi, A.usamii e) aus Mucor- und Rhizopus-Arten wie Mucor pusillus, M.miehei
I) Endothia-Arten wie Endothia parasitica il) aus Trametes-Arten wie Trametes sanguinea
Ausser der Unterscheidung nach der Herkunft findet auch die Unterscheidung gemäss dem Angriffsort (Exo-versus Endo-Enzyme) und aufgrund der «Active Site» der Proteasen (Serin-Proteasen, die durch DFP gehemmt werden, Sulfhydryl-Enzyme) Anwendung. Weiter ist von erheblicher praktischer Bedeutung die pH-Abhängigkeit der Enzymaktivität. Man unterscheidet daher vor allem unter praktischen Gesichtspunkten i) Alkalische Proteasen, mit Wirkungsoptimum etwa im Bereich von pH 7,5 bis 13, insbesondere ali-kalische Bakterienproteasen (E.C.3.4.21.) (die zumeist dem Serin-typ angehören) und alkal. Pilzprote-asen ii) Neutrale Proteasen, mit Wirkungsoptimum im Bereich von pH 6,0-9,0 insbesondere neutrale Bakterienprotease (E.C.3.4.24.) (die zu den Metalloenzymen gehören) und Pilzproteasen, beispielsweise Bacillus-Proteasen, Pseudomonas-Proteasen, Streptomyces-Proteasen, Aspergillus-Proteasen.
iii) Saure Proteasen mit Wirkungsoptimum im Bereich von pH 2,0-5,0 (E.C.3.4.23) insbesondere saure Pilzproteasen, z.B. aus Rhizopus spp., Aspergillus spp., Pénicillium spp., Mucor spp., und Impex lacteus und Endothitia parasitica
Proteasen finden u.a. bei der Lederherstellung, in Waschmitteln und bei der Reinigung, in der Entschlichtung, bei der Käseherstellung, beim Fleischabbau und bei der Stabilisierung von Bier industrielle Anwendung.
Genannt seien als alkalische Proteasen insbesondere die Subtilisine, alkalische Bakterienproteinasen vom Serin-Typ, die im pH-Bereich 9-10 stabil und gegen Perborat einigermassen unempfindlich sind. Die proteolytische Wirksamkeit von Enzymen wird gebräuchlicherweise nach der Anson-Haemoglobin-Methode (M. L. Anson J. Gen. Physiol. 22, 79 (1939) bzw. nach der Löhlein-Volhard-Methode (die Löh-lein-Volhard'sche Methode zur Bestimmung der proteolytischen Aktivität. Gerbereichem. Taschenbuch. Dresden-Leipzig, 1955) als «LVE» (Löhlein-Volhard-Einheit) bestimmt. Unter einer Löhlein-Volhard-Ein-heit ist diejenige Enzymmenge zu verstehen, die unter den spezifischen Bedingungen der Methode 1,725 mg Casein verdaut. Weiter werden im folgenden für die Aktivitätsbestimmung der im sauren Bereich wirksamen Enzyme Einheiten verwendet, die aus der Anson-Methode abgeleitet sind. Diese werden als «Proteinase-Units (Haemoglobin)» UHb bezeichnet. Eine UHb entsprichit der Enzymmenge, welche die Freisetzung von trichloressigsäure-löslichen Bruchstücken aus Haemoglobin äquivalent 1 uMol Tyrosin pro Minute bei 37 Grad C (gemessen bei 280 nm) katalysiert. (1 mUHb = 10-3 UHb).
D) Phospholipasen
Unter Phospholipasen sei wie üblich die Gruppe von Hydrolasen verstanden, die Phospholipide hydrolytisch spalten und zwar entweder die Carbonsäure-Esterbindung (Phospholipasen A & B) oder die Phosphorsäure-Esterbindung (Phospholipase C & D). Lecithinspaltende Phospholipasen werden auch als Lecithinasen bezeichnet.
Die Unterscheidung wird allgemein nach dem Angriffspunkt getroffen. Die Phospholipasen A trennen aus Lecithin (bzw. Kephalin) eine Fettsäure ab, wobei Lysolecithin (bzw. Lysokephalin) zurückbleibt. Phospholipase Ai spaltet endständige Fettsäuren ab. Phospholipase A2 (E.C. 3.1.1.4) mittelständige, meist ungesättigte, die im Falle von Arachidonsäure zu Prostaglandinen metabolisiert werden können.
Quellen für Phospholipase A2 sind beispielsweise Pankreas, Insektengifte und Schlangengifte. Die Phospholipase B (E.C. 3.1.1.5) spaltet aus Lysolecithin Fettsäure ab unter Bildung von Glycerophos-phorsäurecholinester. Sie kommt z.B. in Kohlehydraten wie Reiskleie, Malz, Getreide, Kartoffeln, Erbsen, sowie in Schimmelpilzen und Wespengift vor.
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Phospholipase C (E.C.3.1.4.3) greift Lecithin unter Bildung von Phosphorylcholin an. Sie kommt beispielsweise in Bacillus cereus, im Gehirn und in Schlangengift vor.
Die Phospholipase D (E.C. 3.1.4.4) macht aus Lecithin Cholin und als weiteres Spaltprodukt Phosphatidsäure frei. Sie kann z.B. aus Streptomyces chromofuscus gewonnen werden. Weitere Vorkommen sind Blattpflanzen wie Kohl, Spinat, Zuckerrübenblätter, Hevea brasiliensis aber auch Getreidekeimlinge, Gerstenmalz usw.
Im allgemeinen liegt das pH-Optimum bei den Typen C und D bei ca. 8,0, bei den anderen Typen vorwiegend bei pH 5-6.
(Vgl. E. A. Dennis, in P. D. Boyer (Ed.) The Enzymes, 3isl Ed. Vol. 16, pp. 307-353 Academic Press 1984; Zur Analytik: vgl. Vurioka & Matsuda, Anal. Biochem. 7g, 281 (1976).)
Die Enzymträger ET
Die erfindungsgemässen Enzymträger stellen - wie vorstehend definiert - unmodifizierte Naturstoffpartikel von vorwiegend Cellulosecharakter dar. Unmodifiziert sind sie in dem Sinne, dass sie keine chemische Umwandlung, insbesondere keine irgendwie geartete Aktivierung erfahren haben. Beispielhaft genannt seien insbesondere Holzmehl, Cellulosefasern, Baumwoll-Linters u.ä. Üblicherweise sind die erfindungsgemäss einzusetzenden Enzymträger daher aus Fasern aufgebaut bzw. stellen fasrige Partikel dar. In der Regel weisen die erfindungsgemäss einzusetzenden Naturstoffpartikel eine Partikelgrösse von 0,01-1 mm auf (wobei an jede Raumachse zu denken ist, die durch das Einzelpartikel gelegt werden kann).
Der Immobilisierungsvorgang
Die Enzyme werden zweckmässig aus wässriger Lösung auf die Enzymträger ET aufgebracht. Als Anhalt sei ein Verhältnis EnzymAA/asser von etwa 1:(10-20) angegeben. Die wässrige Lösung kann vorteilhaft noch an sich bekannte Zusätze zu Enzymformulierungen wie Stabilisatoren, Stellmittel wie z.B. Natriumsulfat enthalten. Als Anhalt für den Salzgehalt seien etwa 1/5-1/15 der Wassermenge angegeben. Es hat sich als zweckmässig erwiesen, zunächst das Enzym in Wasser zu lösen, dann beispielsweise Natriumsulfat zuzugeben und zuletzt die Naturstoffpartikel, beispielsweise in Form von Holzmehl. Man lässt das Enzym über einen gewissen Zeitraum, gewöhnlich ca. 20 Stunden und unter Durchmischung beispielsweise durch Rühren auf den Enzymträger aufziehen, wobei es sich - in Abhängigkeit von den verwendeten Enzymen - öfter empfiehlt, oberhalb Raumtemperatur, beispielsweise bei 40 Grad C zu arbeiten. Schliesslich wird abgesaugt und der beladene Enzymträger ET getrocknet.
Das organische Medium OM
Das organische Medium OM ist zweckmässig den Verfahrenszwecken und -bedingungen angepasst. Es kann aus den Reaktionspartnern allein bestehen, z.B. im Fall einer Umesterung von Fetten aus dem Fettgemisch selbst. Das Substrat kann aber auch mit organ. Lösungsmitteln verdünnt werden. Bewährt haben sich Kohlenwasserstoffe, insbesondere aliphatische oder cycioaliphatische KW mit 6-18 Kohlenstoffatomen, wie z.B. Heptan, Isooctan, Hexadecan, Cyclohexan, gegebenenfalls auch Toluol. Bei Anwendung von Lipasen kommen auch Lösungsmittel vom Ether-Typ wie z.B. Diethylether oder Isopropyl-ether in Frage, insbesondere bei Pancreas-Lipasen.
Stark polare und protische organische Lösungsmittel sind dagegen weniger nützlich, was die von anderer Seite beobachtete Tendenz zu abnehmender Enzymaktivität bei steigender Wassermischbarkeit zu bestätigen scheint.
Vorteilhafte Wirkungen
Nach den vorliegenden Erfahrungen erhält man eine sehr befriedigende Beladung der Enzymträger ET mit den Enzymen. Im Falle der Beladung mit einer Lipase fanden sich z.B. im Filtrat des Immobili-sats < 1% der Ausgangsaktivität wieder, d.h. unter Praxisgesichtspunkten wurde die gesamte eingesetzte Enzymmenge fixiert.
Wie unmittelbar einzusehen eignen sich die erfindungsgemäss an den Enzymträgern ET fixierten Enzyme vorwiegend zum Einsatz im organischen Medium OM, vorteilhaft in Anwesenheit geringer Wassermengen (ca. 0,004-1 Gew.-%). Dadurch kann die Desorption effektiv vermieden werden. Die erfindungsgemässen Enzymträger sind in der Regel primär zur Anwendung in Batch-Prozessen geeignet, da das sachgerechte Packen von Säulen mit den Enzymträgern ET Schwierigkeiten bereitet.
Die erfindungsgemäss immobilisierten Enzyme sind nach vorliegenden Erfahrungen für die Durchführung enzymatisch katalysierter Reaktionen nach Massgabe ihrer bekannten Aktivitäten voll geeignet. So lassen sich beispielsweise mit immobilisierten Lipasen in an sich bekannter Weise Umesterungen, Veresterungen, Alkoholysen, Acidoiysen und Hydrolysen durchführen. Von besonderem Interesse ist u.a. die Möglichkeit zur selektiven Hydrolyse gegebenenfalls unter Erhalt bzw. Erzeugung optisch aktiver Zentren.
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BEISPIELE
A. Immobilisierung von Enzymen
A.1. Immobilisierung von Lipasen
250 g Holzmehl (Produkt der Fa. Rettenmeier) mit einer Partikelgrösse von ca. 100 um werden mit 250 g einer Lipase aus Pseudomonas (Aktivität 20 000 LCA/g, Produkt ©DEGOMMA 7101 der Fa. Röhm GmbH) in 3750 g Wasser, das 588 g Natriumsulfat enthält, gemischt und bei 40 Grad C 20 Stunden lang gerührt. Bei der Herstellung des Ansätze; hat es sich als zweckmässig erwiesen, zunächst die Lipasen in Wasser zu lösen, danach das Salz und zuletzt das Holzmehl zuzugeben. Anschliessend wird abgesaugt und getrocknet. Aktivität des Immobilisats: 6 000 LCA/g Trockengewicht. Im Filtrat des Immobilisats werden < 1 % der Aktivität wiedergefunden.
Immobilisierung auf Holzmehl
A.2. Immobilisierung von Phospholipase A2
17,5 g einer Phospholipase A2 (Lecitase 10 L der Fa. Novo-Nordisk, 10 000 internat. Units/ml (1 internat. Unit für Phospholipase A2 ist definiert als die Enzymmenge, die 1 jimol freie Fettsäure pro Minute aus Lecithin abspaltet) werden in 4000 ml Wasser gelöst, dem nachträglich 400 g Ammoniumsulfat zugesetzt wurden. In diese Lösung werden 250 g Holzmehl «Lignocel C 120» der Fa. Rettenmeier mit einer Partikelgrösse von ca. 100 um eingetragen.
Die Suspension wird 2 Std. bei Raumtemperatur gerührt.
Anschliessend wird abgesaugt (aber nicht nachgewaschen) und schonend getrocknet (bei 40 Grad C im Vakuumtrockenschrank über Nacht).
Im Filtrat des Immobilisats wird praktisch keine Enzymaktivität wiedergefunden. Der Träger selbst wird auf Aktivität nach der «Eigelbmethode» geprüft (Eigelb als Substrat, 40 Grad C, pH = 8). Er hat 212 internat. Units/g, was einer Aktivitätsausbeute von 30,3% entspricht.
Dieses Enzym ist z.B. zur Lecithinspaltung nach Zusatz von geringen Wassermengen in Öl (z.B. Soja-Rohöl) geeignet.
A.3. Immobilisierung von Glucoseoxidase (GOD) / Katalase
Es wird wie in Beispiel A2 vorgegangen, nur werden als Enzym 10 ml Glucoseoxidase/Katalase aus Aspergillus einer GOD-Aktivität von 850 Units*/ml (* 1 GOD-Unit/ml ist definiert als die Enzymmenge, die pro Minute 1 umol Gluconsäure freisetzt. (37 Grad C, pH = 5.5) eingesetzt.
Im Filtrat nach Kupplung des Enzyms werden nur Spuren des Enzyms wiedergefunden. Die Aktivität des Trägers betrug 20 Units, was einer Aktivitätsausbeute von 59% entspricht.
Durch seinen Gehalt an Katalase kann der Träger zur Entfernung von H2O2 in einer verdünnten Desinfektionslösung verwendet werden. Dazu wird er in einem Fliessbett in einer Säule (Fliessrichtung von unten nach oben) eingesetzt. Die Zerstörung von H2O2 ist an der Bildung von Gasbläschen (Sauerstoff) gut erkennbar.
A.4. Immobilisierung von alkalischer Proteinase auf Cellulosepulver
4 g einer alkalischen Proteinase aus B. licheniformis (Alcalase 2.0 T von Novo Nordisk) werden in 4 I 1 m Phosphatpuffer von pH = 8.0 gelöst. Dann werden 400 g Cellulosepulver fein mit einem Schüttvolumen von 3 l/hg (Fa. Rettenmeier) zugesetzt und 1 Std. bei 40 Grad C gerührt. Dann wird die Cellulo-sepulver-Suspension, ohne zu waschen abgesaugt und schonend getrocknet (40 Grad C, Vakuumtrok-kenschrank).
Im Filtrat werden < 7% der ursprünglichen Enzymaktivität wiedergefunden. Die Hauptmenge ist am Cellulosepulver adsorbiert (81% des eingesetzten Enzyms)
Gemessen wurde hier in Löhlein-Vollhard-Einheiten (LVE)*.
Alcalase 2.0 T .... 140 000 LVE/g 0,1 %ige Lösung ... 140 LVE/g
Filtrat nach Kupplung ... < 10 LVE/g ( = < 7% der Ausgangsaktivität)
Aktivität am Träger... 113 LVE/g ( = 81% Aktivitätsausbeute)
Dieses Enzym ist z.B. für stereospezifische Estersynthesen im organischen Medium geeignet.
A.5. Immobilisierung des Pankreasenzymkomplexes
Es wird wie in Beispiel A2 vorgegangen, nur werden als Enzym 10g Pankreasenzyme (Corolase PP Röhm Enzymtechnologie, Leitaktivität 220 000 LVE) eingesetzt.
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CH 682 401 A5
Im Filtrat nach Kupplung des Enzyms werden nur Spuren des Enzyms wiedergefunden. Die Aktivität des Trägers wurde mit 4000 LVE gemessen, was einer Aktivitätsausbeute von 45% entspricht.
Durch seinen Chymotrypsingehalt (~ 10% der Proteinasen) ist dieses immobilisierte Enzym für Estersynthesen im organischen Medium gut geeignet.
B. Anwendung der immobilisierten Enzyme
B.1. Umesterung
1 g immobilisierter Lipase (Beispiel A.1.) werden 2 Stunden bei 50 Grad C in einer Mischung aus 0,8 g Tristearin in 40 g Myristinisopropylester gerührt. Der Wassergehalt ist gering: 8,3% im Immobilisât; das Substrat wurde vorher getrocknet.
Nach 2 Stunden ist der Gehalt des Tristearins auf 5% des Ausgangswertes abgesunken. Das entspricht einem Umsatz von 95%. Laut GC-Analyse sind ca. 40% Umesterungsprodukte, wie z.B. Trimyri-stin, 55% Hydrolyseprodukte wie verschiedene Mono- und Diglyceride.
B.2. Enantioselektive Umesterung
Zu einer schwach gerührten Lösung von 1.11 g 2-0-Benzylglycerin (6,1 mmol) in 20 ml tert.-Butylme-thylether (= 0,3 mol/l) gibt man bei Raumtemperatur 2 ml Vinylacetat (1,82 g; 18,2 mmol) und 100 mg immobilisierter Lipase (Beispiel 1) hinzu. Der Verlauf der Reaktion wird durch Dünnschichtchromatographie (Cyclohexan/Essigester = 1/1 auf Kieselgel-Platten \\ (Diol) = 0,10; n (Acetat) = 0,32) verfolgt. Bei erstmaliger Anwendung des Enzyms erreicht man nach 6 Stunden vollständigen Umsatz (bei achtmaliger Anwendung steigt die benötigte Reaktionszeit kontinuierlich auf ca. 12 Stunden). Nach beendigter Reaktion filtriert man das Enzym ab, wäscht dieses mit tert.-Butylmethylester und engt die vereinigten Filtrate mit Hilfe eines Rotationsverdampfers ein. Man erhält sehr sauberes (S)-1-Acetyloxy-2-benzyloxy-propan-3-ol als Öl.
(S)-1-Acetyloxy-2-benzyloxy-propan-3-ol
C12H16O4 MG: 224,26 g/mol
Drehwerte (c = 2 T = 20 Grad C)
CHCI3
Ethanol
H
M
589 nm
-17,3°
+12,2°
578 nm
-18,1°
+12,7°
546 nm
-20,3°
+14,6°
436 nm
-34,6°
+25,1°
365 nm
-54,1°
+39,6°
Aus dem Vergleich mit Literaturdrehwerten (Y. Terao, M. Murata, K. Achiwa, T. Nishio, M. Akamtsu, M. Kamimura, Tetrahedron Lett. 29 (1988) 5173) liegt das Material mit einem Enantiomerenüberschuss (ee) von 86% vor.

Claims (1)

  1. Patentansprüche
    1. Auf festen Enzymträgern adsorptiv immobilisierte Enzyme, dadurch gekennzeichnet, dass die Enzyme auf Enzymträgern ET bestehend aus unmodifizierten Naturstoffpartikeln von vorwiegend Cellulosecharakter adsorptiv immobilisiert sind.
    2. Auf festen Enzymträgern adsorptiv immobilisierte Enzyme gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Enzymträger ET ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Holzmehl, Cellulo-sefasern und Baumwoll-Linters.
    3. Auf festen Enzymträgern adsorptiv immobilisierte Enzyme gemäss Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Naturstoffpartikel eine Teilchengrösse im Bereich 0,01-1 mm besitzen.
    4. Auf festen Enzymträgern adsorptiv immobilisierte Enzyme gemäss den Ansprüchen 1-3, dadurch gekennzeichnet, dass die Enzyme ausgewählt sind aus der Klasse der Hydrolasen, der Isomerasen, der Oxidoreduktasen und der Transferasen.
    5. Auf festen Enzymträgern adsorptiv immobilisierte Enzyme gemäss Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Enzyme Lipasen E.C.3.1.1.3 darstellen.
    6. Auf festen Enzymträgern adsorptiv immobilisierte Enzyme gemäss Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Enzyme Proteasen E.C.3.4 darstellen.
    7. Auf festen Enzymträgern adsorptiv immobilisierte Enzyme gemäss Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Enzyme Katalasen E.C.1.11.1.6 darstellen.
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    8. Verfahren zur Herstellung von adsorptiv an festen Enzymträgern ET immobilisierten Enzymen, dadurch gekennzeichnet, dass man die Enzyme aus wässrigem Milieu auf unmodifizierte Naturstoffpartikel mit vorwiegend Cellulosecharakter aufziehen lässt.
    9. Verfahren gemäss Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das wässrige Milieu zu 1/5 bis 1/15 seines Gewichts an Stellsalz enthält.
    10. Verfahren gemäss Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass als Stellsalz Natriumsulfat verwendet wird.
    8
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