CH686830A5 - Inhibitoren der Signaluebertragung durch sekundaere Botenstoffe in Zellen. - Google Patents

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CH686830A5
CH686830A5 CH03711/94A CH371194A CH686830A5 CH 686830 A5 CH686830 A5 CH 686830A5 CH 03711/94 A CH03711/94 A CH 03711/94A CH 371194 A CH371194 A CH 371194A CH 686830 A5 CH686830 A5 CH 686830A5
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compound
cells
substituted
proliferation
basic structure
Prior art date
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CH03711/94A
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John Michnick
Gail E Underiner
J Peter Klein
Glenn C Rice
Prasad Sunkara
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Cell Therapeutics Inc
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Description

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CH 686 830 A5
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Gruppe von Verbindungen, die wirkungsvolle Stoffe zur Hemmung von oftmals durch inflammatorische Reize induzierte spezifische zelluläre Signalübertra-gungsereignise darstellen und, die als antiinflammatorische oder immunosuppressive Mittel, als zytotoxische Mittel zur Behandlung von Krebs oder die direkt oder indirekt antimikrobiell auf Hefe- oder Pilzinfektionen wirken. Insbesondere weisen die erfindungsgemässen Verbindungen mindestens einen Aminoalkohol (oder ein Derivat hiervon) als funktionelle Gruppe an einer Seitenkette einer Grundstruktur auf. Die erfindungsgemässen Verbindungen sind nützliche Antagonisten zur Steuerung intrazellulärer Gehalte von spezifischen sn-2 ungesättigten Phosphatidsäuren und korrespondierender Phosphatidsäu-re-derivatisierter Diacylglyzeride, intrazellulärer Zellsignalübermittler, welche in Verbindung mit proinflammatorischen und selektiven proliferativen Reizen auftreten.
Pentoxifyllin [1-(5-Oxohexyl)-3,7-dimethylxanthin], abgekürzt PTX ist ein Xanthin-Derivat, das medizinisch weite Venwendung zur Förderung der Durchblutung findet. PTX wird von Möhler et al. in den US-Patentschriften Nr. 3 422 107 und Nr. 3 737 433 beschrieben. Metaboliten des PTX wurden von Davis et al. in «Microbial Models of Mammalian Metabolismi Microbial Réduction and oxidation of Pentoxifyl line», Applied and Environmental Microbiology, Vol. 48, No. 2, pages 327-381, August, 1984 und Bryce et al. «Metabolism and Pharmacokinetics of 14C-Pentoxifylline in Healthy Voluteers», Arzneim.-Forsch/ Drug Res. Vol. 39, No. 4, pages 512-517, 1989 aufgeführt. Als Metabolit von PTX wurde 1-(5-Hy-droxyhexyl)-3,7-dimethylxanthin, bezeichnet als M1, bestimmt. Darüber hinaus wurde in den US-Paten-ten Nr. 4 515 795 und Nr. 4 576 947 gezeigt, dass M1 die zerebrale Durchblutung fördert. Andere Metaboliten umfassen 1-(5-Pentoyl)-3,7-dimethylxanthincarbonsäure, bezeichnet als M4, und 1 -(4-Butyl)-3,7-dimethylxanthincarbonsäure, bezeichnet als M5. Darüber hinaus wird in den US-Patenten Nr. 4 833 146 und Nr. 5 039 666 die Verwendung von tertiären Alkoholanaloga des Xanthins zur Förderung der zerebralen Durchblutung beschrieben.
Es konnte gezeigt werden, dass PTX und dessen bisher bekannte Metaboliten eine in vivo Aktivität in bestimmten biologischen Systemen entfalten. In dem US-Patent Nr. 4 636 507 wird die Fähigkeit von PTX zur Steigerung der Chemotaxis in polymorphonuclearen Leukozyten als Antwort auf chemotaktische Reize beschrieben. Des weiteren hemmen PTX und verwandte mit tertiären Alkoholen substituierte Xanthine die Aktivität von bestimmten Zytokinen zur Beeinflussung der Chemotaxis, wie in den US-Patenten Nr. 4 965 271 und Nr. 5 096 906 beschrieben. Darüber hinaus zeigen Patienten, an denen allogene Knochenmarkstransplantationen vorgenommen werden, bei der mit Verabreichung von PTX und GM-CSF verminderte Gehalte des Tumor Nécrosé Faktors (TNF). Bianco et al. «Pentoxifyllin (PTX) and GM-CSF Decrease Tumor Necrosis Factor (TNF-a) Levels in patients undergoing allogeneic Bone Mar-row Transplantation (MBT)», Blood, Vol. 76, No. 1, Suppl. 1 (522), page 133a, November 15, 1990. Eine Verringerung von TNF in nachweisbarem Ausmass wurde begleitet von abgeschwächten BMT-ver-wandten Komplikationen. Bei normalen Testpersonen werden jedoch unter PTX Rezipienten höhere TNF Gehalte gefunden. Erhöhte Gehalte von TNF sind daher nicht die primäre Ursache derartiger Komplikationen.
Wirkungsvolle therapeutische Substanzen, die sicher und wirkungsvoll bei menschlicher oder tierischer Verabreichung sind, und die eine zelluläre Homöostase angesichts einer Vielzahl von inflammatorischen Reizen erhalten, werden daher benötigt. Die vorliegende Erfindung resultiert aus Forschungsarbeiten, die mit der Suche nach derartigen Substanzen befasst ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft Substanzen, die in einem weiten Bereich von therapeutischen Indikationen zur Behandlung von Krankheiten durch intrazelluläre Signalübermittlung 1 über spezifische intrazelluläre Signalübermittlungswege einsetzbar sind. Darüber hinaus sind die erfindungsgemässen Substanzen und pharmazeutischen Zusammensetzungen für normale Wege der therapeutischen Verabreichung (z.B. parenteral, oral, topisch usw.) zur Gewährleistung einer wirksamen Dosierung von therapeutischen Substanzen geeignet.
Die Erfindung betrifft eine Klasse von Substanzen, die wirksame therapeutische Stoffe zur Hemmung spezifischer inflammatorischer und proliferativer zellulärer Signalübermittlungsvorgänge darstellt. Die Substanzen und pharmazeutischen Zusammensetzungen derselben haben die allgemeine Formel:
(X)j-(Grundstruktur),
wobei j eine ganze Zahl zwischen 1 und 3 darstellt, die Grundstruktur ist nichtzyklisch und kann ein He-teroatom enthalten, carbozyklisch oder heterozyklisch, wobei eine carbozyklische oder heterozyklische Grundstruktur zumindest einen vier- bis siebengliedrigen Ring enthält und X ein racemisches Gemisch, ein R- oder ein S-Enantiomer, ein Solvat, ein Hydrat oder ein Salz des Restes:
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R
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OR
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N (CH 2)~ C
<CH2>m
H
R
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darstellt, wobei *C ein chirales Kohlenstoffatom darstellt, n ist eine ganze Zahl von eins bis vier (vorzugsweise von eins bis drei); eines oder mehrere Kohlenstoffatome der (CH2)n-Einheit können durch eine Keto- oder eine Hydroxygruppe substituiert sind; m ist eine ganze Zahl von vier bis vierzehn (vorzugsweise acht bis vierzehn); unabhängig voneinander sind Ri und R2 Wasserstoff, Phenyl ein geradkettiges oder verzweigtes, substituiertes oder unsubstituiertes Alkyl oder Alkenyl, mit einer Länge von bis zu achtzehn Kohlenstoffatomen, oder -(CH2)W,R5, wobei w eine ganze Zahl von eins bis vierzehn und R5 eine mono-, di- oder trisubstituierte oder unsubstituierte Arylgruppe, oder eine alizyklische Struktur mit drei bis zu sechs Ringatomen, die Substituenten des Restes R5 Hydroxy-, Chlor, Fluor, Brom, Amino oder C1-6 Alkoxygruppen darstellen; oder Ri, und R2, miteinander verbunden eine substituierte oder unsubstituierte, gesättigte oder ungesättigte heterazyklische Gruppe darstellen, die vier bis acht Kohlenstoffatome enthält, wobei N ein Heteroatom darstellt; und R3 ein Wasserstoffatom oder ein C1-3 Rest oder darstellt, wobei R« ein Wasserstoffatom, ein geradkettiges oder verzweigtes Alkyl oder Alkenyl mit einer Länge von bis zu acht Kohlenstoffatomen, -(CH2)wRs, wobei w eine ganze Zahl von zwei bis vierzehn und R5 eine mono-, di- oder trisubstituierte oder unsubstituierte Arylgruppe darstellt, wobei die Substituenten von R5 Hydroxy-, Chlor, Fluor, Brom, oder Ci_6 Alkoxygruppen, oder eine substituierte oder unsubstituierte, gesättigte oder ungesättigte heterozyklische Gruppe darstellen, die vier bis acht Kohlenstoffatome aufweist, r und s unabhängige ganze Zahlen von eins bis vier sind; wobei die Summe (r+s) nicht grösser als fünf ist; t ist eine ganze Zahl von eins bis vierzehn; und ein oder mehrere Kohlenstoffatome der (CH2)s oder (CH2)rGruppe durch eine Keto- oder Hydroxygruppe substituiert sein können.
Eine nichtzyklische Grundstruktur kann beispielsweise sein: Acetamid, Amid, Amin, Aminosäure (eine oder zwei), Carboxylgruppe, Ester, Halogenatom, endständiges Wasserstoffatom, Hydroxylgruppe, Glutarsäure, derivatisiertes Glycin, Keton, Phosphat, Phosphonat, Sulfat, Sulfonat, Sulfon, Sulfoxid, einfache ionische funktionelle Gruppe, Thiol oder Thiolester. Die Aminosäuren der Grundstruktur können beispielhaft eine oder mehrere der folgenden darstellen: Alanin, Arginin, Asparagin, Asparaginsäure, Cy-stein, Glutamin, Glutminsäure, Glycin, Histidin, Isoleucin, Leucin, Lysin, Methionin, Phenylalanin, Prolin, Serin, Threonin, Tryptophan, Tyrosin und Valin, vorzugsweise eine mehr hydrophobe Aminosäure wie Leucin oder Isoleucin. Die nichtzyklische Grundstruktur kann vorzugsweise ein Dipeptid bestehend aus zwei der vorstehend exemplarisch genannten Liste von Aminosäuren darstellen. Halogenatome der Grundstruktur sind beispielsweise Brom, Chlor, Fluor und lod.
Eine Grundstruktur kann alternativ mindestens ein fünf- bis siebengliedriger Ring, vorzugsweise mit ein bis drei fünf- bis sechsgliedrigen Ringstrukturen in einer vorherrschend planaren Konfiguration sein. Vorzugsweise ist der Substituent (X) an einem Ring-N-Atom gebunden, falls ein derartiges existiert. Bei
(ch2)—
•c (CH 2) t h
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spielsweise kann die Grundstruktur eine aus der folgenden Gruppe ausgewählte substituierte oder unsubstituierte sein: Barbitursäure, Benzamid, Benzol, Biphenyl, Cyclohexan, Cyclohexandion, Cyclopen-tandion, Lactam, Glutarimid, Homophthalimid, Hydrophthalimid, Imidazol, Imidazolamid, Indomethacin, Isocarbostyril, Lumazin, Naphtalin, Phenol, Pteridin, Pthalimid, Piperidin, Pyridin, Pyrimidin, Pyrrolamid, Chinolzindion, Chinazolinon, Chinolon, Resorcin, Salicylsäure und Derivate derselben, Stilben, Succin-imid, Theobromin, Thymin, Triazin, Tricyclododecan, Harnsäure, Uracil, Vitamine A, E oder K oder Xan-thin.
Bevorzugte zyklische Grundstrukturen umfassen substituiertes oder unsubstituiertes Glutarimid, Me-thylthymin, Methyluracil, Thymin, Theobromin, Uracil und Xanthin, insbesondere bevorzugt halogensubstituiertes Xanthin. Beispielhaft stellt die bevorzugte Grundstruktur dar: 1,3-Cyclohexandion, 1,3-Cyclo-pentandion, 1,3-Dihydroxynaphthalin, 1-Methyllumazin, Methylbarbitursäure, 3,3-Dimethylglutarimid, Orotsäure, Tetra- oder Hexahydrophthalimid, Orthophenol, Prostacyclin, 2-Hydroxypyridin, Methyldihy-droxypyrazolopyrimidin, insbesondere, 1,3-Dimethyldihydroxypyrazolo[4,3-d]pyrimidin, Methylpyrrolopy-rimidin, 1-Methylpyrrolo[2,3-d]pyrimidin, 1,3-Dihydroxynapthalin, 1-Pyrrolamid, 2-Pyrrolamid, 3-Pyrrol-amid, 1,2,3,4-Tetrahydroisochinolon, 1-Methyl-2,4(1H,3H)-Chinolizindion (1-Mehtylbenzoyleneharnstoff), Chinazolin-4(3H)-on, Sulindac, Dihydrothymin, Dihydrothymin, alkylsubstituiertes (C1-6)Thymin, 2,4 Di-oxohexahydro-1,3,5-tetrazin, Methylzymin, alkylsubstituiertes (C1—6) Uracil, Uracil anneliert mit Naphthalin, 6-Aminouracil, 1 -Methyl-5,6-dihydrouracil, 1-Methyluracil, in 5- und/oder 6-Stellung substituierte Uracile (wie z.B. 5-Bromouracil), B-Ionone wie Vitamin A, 2,6,6-Methyl-1-Cyclohexen-1-Acetaldehyde wie Vitamin A, 2,6,6-Methyl-1-cyclohexen-1-acetaldehyd wie Vitamin A, Tetraion zu Vitamin K, 1,7-Di-methylxanthin, 3,7-Dimethylxanthin, 3-Methylxanthin, 3-Methyl-7-methylpivaloyl-xanthin, in 8-Stellung substituierte Xanthine (mit Substituenten wie N oder S), und 7-Methylhypoxanthin.
Vorzugsweise ist der Substituent X an ein Stickstoffatom der Grundstruktur gebunden, wobei besonders vorteilhaft die Grundstruktur Xanthin ist und X an das Stickstoffatom N, des Xanthins gebunden ist und die Stickstoffatome N1 und N7 des Xanthins unabhängig voneinander mit einem aus der Gruppe Wasserstoff, Methyl, Fluor, Chlor und Amino ausgewählten Rest substituiert sind.
Die Erfindung betrifft eine pharmazeutische Wirkstoffzusammensetzung, bestehend aus einer der erfindungsgemässen Verbindungen und einem pharmazeutisch annehmbaren Excipienten. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann für eine orale, parenterale oder topische Darreichungsform formuliert sein.
Die Erfindung schliesst die Anwendung der erfindungsgemässen Verbindungen für die Vorbereitung eines Arzneimittels zur Behandlung eines Individuums mit einer Vielzahl von Erkrankungen ein. Die Erkrankungen sind dadurch charakterisiert oder können behandelt werden durch Hemmung einer Immunantwort oder einer zellulären Antwort auf einen primären-äusseren oder in situ-Reiz, wobei die zelluläre Antwort vermittelt wird durch einen spezifischen sekundären Botenstoff auf Phospholipid-Basis, der benachbart der inneren Schicht der Zellmembran wirkt. Der sekundäre Übertragungspfad ist als Antwort auf verschiedene noxische oder proliferative Reize, die für eine Vielzahl von Krankheitszuständen kennzeichnend sind aktiviert. Die Biochemie dieses sekundären Übermittlungspfades ist im nachfolgenden beschrieben. Insbesondere schliesst die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung oder Vorbeugung klinischer Symptome verschiedener Krankheitszustände oder zur Reduzierung der Toxizität von anderen Behandlungen durch Hemmung zellulärer Signalübermittlung mittels eines sekundären Übermittlungswegs, der eine Signalübertragung durch Phosphatidsäure und durch Glyzanphosphatidylinostinol (Gly PI) beinhaltet.
Die erfindungsgemässen Verbindungen sind von besonderer Bedeutung bei der Hemmung IL-2-indu-zierter proliferativer Antwort. IL-2 Signalübermittlungshemmung ist potentiell nützlich bei der Behandlung von einer Vielzahl von Krankheitszuständen, die eine T-Zellen-Aktivierung und Hyperproliferation aufweisen. Beispiele für Autoimmunkrankheiten, die durch Hemmung der IL-2 Signalübermittlung zu behandeln sind, sind Lupus, Skleroderma, rheumatische Arthritis, Multiple Sklerose, Glomerulo Nephritis sowie potentielle Malignitäten, einschliesslich aber nicht beschränkt auf chronische myelogenische Leukämie sowie andere.
Fig. 1A und 1B zeigen Dosis-Antwort-Kurven für sowohl Cyclosporin A (CsA, Fig. 1A) und verschiedene erfindungsgemässe Verbindungen (Fig. 1B) für durch Concanavalin A (ConA) und lnterleuzin-2 alpha (IL-2) co-stimulierte murine Thymozytproliferation.
Fig. 2A und 2B zeigen die Immunmodulierungsaktivität der Verbindungen Nrn. 5 und 26 (bezüglich der entsprechenden Namen und Strukturen siehe unten) in einem Assay zur Bestimmung der proliferativen PMBC Antwort auf allogene Stimulierung mittels einer Zweiwege-gemischten Lymphozyten-Reakti-on.
Die Fig. 2C und 2D zeigen Aktivitätsdaten für die Verbindungen Nrn. 27 und 13 sowie IC50 Daten, jeweils in einer gemischten Lymphozyten-Reaktion.
Fig. 2E zeigt die prozentuale Lebenfähigkeit für fünf der erfindungsgemässen Verbindungen (entsprechend den unten stehenden chemischen Namen) in einem gemischten Lymphozyten-Assay, das die Im-munsuppressionsaktivität der getesteten Verbindung misst.
Fig. 2F zeigt Ergebnisse der prozentualen Lebensfähigkeit aus einem gemischten Lymphozyten-Re-aktions-Assay.
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Fig. 3A fasst Ergebnisse für verschiedene erfindungsgemässe Verbindungen zusammen, die hemmende Effekte auf murine Thymozytenproliferation zeigt.
Fig. 3B zeigt Vergleichsergebnisse von Hemmungs-Assays für co-stimulierte Thymozytenproliferation.
Fig. 4 fasst IC50 Werte für die Verbindungen Nrn. 27 und 28 in einer murinen Splenozytenproliferati-on (anti-Mu stimuliertes Assay) zusammen.
Fig. 5A und 5B zeigen Häufigkeitshistogramme von Messungen für 20.000 Zellen in einem Assay, das die IL-2 (alpha Kette CD25) Rezeptorexpression illustriert.
Fig. 6 zeigt Ergebnisse für die Verbindungen Nrn. 49 und 50 im Vergleich mit CsA in einem Hem-mungs-Assay zur Produktion von IL-2 in murinen Thymozyten.
Fig. 7 und 8 zeigen Dosis-Wirkungs-Ergebnisse aus einem in vitro-Test unter Hervorhebung der zellularen oder T-Zellen-Immunantwort.
Fig. 9A und 9B zeigen die Hemmungsaktivität der erfindungsgemässen Verbindungen im Vergleich mit CsA bei direkter IL-2-induzierter Proliferation in einer murinen zytotoxischen T-Zell-Linie, CT6.
Fig. 10 zeigt die Aktivität der erfindungsgemässen Verbindungen in anti-Hefe- und anti-Pilz-Assays.
Fig. 11 zeigt Aktivitätsdaten der erfindungsgemässen Verbindungen in einem zur potentiellen antigen-spezifischen Anergy-Induktion bestimmten Assay.
Fig. 12 zeigt Ergebnisse der Aktivitäten der erfindungsgemässen Verbindungen der Nrn. 28, 30, 31, 33 und 29 in einem Assay zur Vorhersage der therapeutischen Aktivität zur Vorbeugung oder Behandlung von Restenose, Atherosklerose und koronaren Herzkrankheiten.
Fig. 13 zeigt Zytotoxizitäts-Ergebnisse der erfindungsgemässen Verbindungen in einem humanen Stroma-Zelle/PDGF Stimulations Assay.
Fig. 14 zeigt Ergebnisse der Hemmungsaktivität der erfindungsgemässen Verbindungen Nrn. 27, 28, 32, 30, 31, 32 und 34 in einem Assay zur Messung von Inhibierungseffekten in einer PDGF/IL-1 Co-Sti-mulation.
Fig. 15 zeigt eine Dosis-Wirkungs-Kurve ausgewählter erfindungsgemässer Verbindungen in einer PDGF-induzierten Proliferation von Balb/3T3 Zellen.
Fig. 16 fasst Suppressionsergebnisse für ausgewählte erfindungsgemässe Verbindungen in einem murinen Thymozyten ConA/IL-2 Co-Stimulations-Assay zusammen.
Fig. 17 zeigt einen Vergleich von IC50 und ID50 Daten für verschiedene erfindungsgemässe Verbindungen.
Fig. 18 fasst Zytotoxizitäts-Ergebnisse der erfindungsgemässen Verbindung Nr. 27 für transformierte (Ras 3T3)-Zellen und nicht transformierte (normale) Zellen zusammen.
Fig. 19 zeigt Daten, die die inhibitorischen Effekte der erfindungsgemässen Verbindung Nr. 58 bei PDGF-induzierter Proliferation auf menschliche aortische glatte Muskelzellen (aortische SMC) zeigen.
Fig. 20A und 20B zeigen die Effekte der Verbindung Nr. 58 auf eine aFGF- und bFGF-induzierte Proliferation in menschlichen aortischen glatten Muskelzellen (aortische SMC).
Fig. 21A und 21B zeigen die inhibitorische Aktivität der Verbindung Nr. 35 und CsA auf murine Thymozyten, co-stimuliert mit ConA und IL-2.
Fig. 21C und 21D zeigen inhibitorische Effekte der Verbindung Nr. 35 und CsA auf IL-2 induzierte Proliferation bei zytotoxischen CT-6 Zellen.
Fig. 22 fasst Aktivitätsergebnisse der Verbindung Nr. 58 auf vasculäre endotheliale Wachstumsfaktor (VEGF)-induzierte Proliferation in einer humanen umbilikalen venösen endothelialen Zell-Linie (HUVEC) zusammen.
Fig. 23 ist eine Serie von Häufigkeitshistogrammen einer Fluss-Zytometrie-Analyse von HUVEC Zellen.
Fig. 24 zeigt Inhibierungsergebnisse für die Verbindungen Nrn. 50 und 57 auf THP-1 Zelladhäsion zu IL-1-aktivierter HUVEC.
Fig. 25A und 25B zeigen die Effekte der Verbindung Nr. 58 auf eine aFGF- und bFGF-induzierte Proliferation in pulmonalen glatten Muskelzellen.
Fig. 26A, 26B und 26C stellen Dosis-Wirkungs-Kurven für die erfindungsgemässen Verbindungen Nrn. 77, 7 und 78 in PDGF-induzierter Proliferation von Balb/3T3 Zellen dar.
Fig. 27 zeigt Dosis-Wirkungs-Kurven für die erfindungsgemässen Verbindungen Nrn. 78, 79 und 80 für murine Thymozyten Proliferation, co-stimuliert durch ConA und IL-2.
Fig. 28 stellt Ergebnisse bezüglich der erfindungsgemässen Verbindung Nr. 50 in PDGF-induzierter Proliferation von Balb/3T3 Zellen dar.
Fig. 29 zeigt die durch TNF-a wesentlich erhöhte Expression der 92 kD Matrixmetalloprotease (MMP) und die mässig erhöhte Produktion der 72 kD MMP, sowie dass die Anwesenheit der Verbindung Nr. 50 die TNF-a stimulierte Expression einer jeden MMP blockiert.
Fig. 30 zeigt die antiproliferative Aktivität und Fig. 31 die anti-Clonogenizitäts-Aktivität der erfindungsgemässen Verbindung Nr. 50 mit HT-29 Zellen.
Fig. 32 und 33 zeigen die Zytotoxizitäts- und Konzentrationsabhängigkeit der Verbindung Nr. 50 gegenüber 3LL Zellen (Lewis-Lungen-Karzinom).
Fig. 34 zeigt, dass die Verbindung Nr. 50 ihre zytotoxische Aktivität in normalen Stromalzellen des Rückenmarks fehlt.
Fig. 35 und 36 zeigen die Effekte der Verbindung Nr. 50 auf matrigele Invasion und Lebensfähigkeit in 3LL Zellen.
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Fig. 37 illustriert die VEGF induzierte Proliferation von HUVEC als vorhersagendes Adhäsions-As-say.
Fig. 38 zeigt den Effekt der Verbindung Nr. 50 auf THP-1 Adhärenz an IL-1 ß-stimulierte HUVEC.
Fig. 39 illustriert den Effekt der Verbindung Nr. 50 auf VCAM-1 Oberflächenexpression von TNFa-sti-mulierter HUVEC.
Fig. 40 illustriert den Effekt der Verbindung Nr. 50 auf ICAM-1 Oberflächenexpression von TNFa-sti-mulierter HUVEC.
Fig. 41A, 41B und 41C illustrieren die Ergebnisse einer in vivo Studie bei Mäusen mit B16 Melanom-zellen.
Fig. 42A und 42B illustrieren T- und B-Zellen Antwort-Assays von Mäusen, die mit der erfindungsgemässen Verbindung Nr. 50 in einem B16 Melanomzellen-Assay behandelt wurden.
Fig. 43 fasst Ergebnisse in einem in vivo Experiment zusammen, das zeigt, dass die Verbindung Nr. 50 das Wachstum vom Lewis-Lungen-Karzinom in Mäusen hemmen kann.
Fig. 44A und 44B illustrieren Thrombozyten und neutrophile Zählungen von in einem Lewis-Lungen-Karzinom-Assay unterworfenen Mäusen.
Fig. 45A, 45B und 45C illustrieren einen fotografischen Vergleich von Lungen von 3LL ausgesetzten Mäusen mit oder ohne Behandlung mit der erfindungsgemässen Verbindung Nr. 50.
Fig. 46 zeigt in einem Assay erhaltene Ergebnisse, die den Effekt der erfindungsgemässen Verbindung Nr. 45 auf IL-2-vermittelte Proliferation untersuchen.
Fig. 47 illustriert, dass die erfindungsgemässe Verbindung Nr. 45 die CT-6.1 Proliferation, gemessen als Zellzahl, hemmt.
Fig. 48 illustriert, dass die Verbindung Nr. 45 ebenso die mitogene Antwort auf IL-2, IL-4 und IL-7 hemmt.
Fig. 49 zeigt, dass die erfindungsgemässe Verbindung Nr. 45 ebenso die murine thymozytische Proliferation in Antwort auf Conconavalin A (conA) und IL-2 hemmt.
Fig. 50A und 50B zeigen, dass die die Verbindung Nr. 45 eine murine gemischte Tumorlymphozyten-kultur (MTLC) und eine humane gemischte Leukozyten-Reaktion (MLR) verzögert.
Fig. 51 zeigt einen Effekt einer verzögerten Zugabe der erfindungsgemässen Verbindung Nr. 45 auf eine co-stimulierte Thymozyten Proliferation.
Fig. 52 illustriert, dass die erfindungsgemässe Verbindung Nr. 45 anti-CD3-stimulierte Splenozyten Proliferation hemmt.
Fig. 53A und 53B zeigen, dass die Verbindung Nr. 45 die T-Zellen-Rezeptor (CD3) vermittelte Signal-gebung nicht hemmt.
Fig. 54A und 54B illustrieren, dass die erfindungsgemässe Verbindung Nr. 45 nicht die anti-CD3 vermittelte Regulierung der IL-2 Rezeptor Alpha Untereinheit zu höheren Werten hemmt.
Fig. 55 zeigt, dass die erfindungsgemässe Verbindung Nr. 45 die Internalisation der IL-2 Rezeptor beta (p70) Untereinheit nicht hemmt.
Fig. 56A und 56B zeigen, dass die erfindungsgemässe Verbindung Nr. 45 ebenfalls eine antigenspe-zifische T-Zellen-Anergy induziert.
Fig. 57 zeigt, dass die erfindungsgemässe Verbindung Nr. 45 die B-Zellen Proliferation hemmt.
Fig. 58A und 58B zeigen, dass die erfindungsgemässe Verbindung Nr. 45 die CD28 vermittelte IL-2 Freisetzung nicht hemmt.
Fig. 58C und 58D zeigen, dass die Verbindung Nr. 45 die IFN-y Freisetzung durch Blockierung der IL-2 Signalgebung hemmt.
Fig. 59A, 59B und 59C stellen Assay-Ergebnisse dar, die den Effekt der erfindungsgemässen Verbindung Nr. 45 auf die Zytokin-Freisetzung von anti-CD3-stimulierten Mäuse-Splenozyten untersucht.
Fig. 60A zeigt die Hemmung der Proliferation in einem MTLC-Assay mit Verbindung Nr. 45.
Fig. 60B und 60C zeigen, dass die Verbindung Nr. 45 weder die IL-2 noch die TNFa Freisetzung von MTLC hemmt.
Fig. 60D zeigt, dass die erfindungsgemässe Verbindung Nr. 45 die IFN-y Freisetzung hemmt.
Fig. 61 illustriert, dass die erfindungsgemässe Verbindung Nr. 45 keinen Effekt auf die Prostaglandin E2 Freisetzung von IL-1a-stimulierten menschlichen Vorhaut-Fibroblasten HS68 hat.
Fig. 62A und 62B (TNFa oder IL-1 ß) zeigen die Hemmung von THP-1 Adhäsion von HUVEC.
Fig. 63A und 63B zeigen, dass die erfindungsgemässe Verbindung Nr. 45 die Adhäsions-Rezeptor-Expression von HUVEC hemmt.
Fig. 64 zeigt, dass die erfindungsgemässe Verbindung Nr. 45 die PDGF-BB-induzierte murine BALB/ 3T3 Proliferation hemmt.
Fig. 65A-65F illustrieren die Hemmung der Proliferation sowohl in human-aortischen als auch in pulmonalen glatten Muskelzellen (SMC) durch die erfindungsgemässe Verbindung Nr. 58.
Fig. 66A und 66B stellen Dosis-Wirkungs- und Zytotoxizitätskurven der Hemmung der Proliferation in Balb/3T3 Zellen durch die erfindungsgemässe Verbindung Nr. 58 dar.
Fig. 67A und 67B illustrieren, dass die Verbindung Nr. 58 die VEGF-induzierte Proliferation in HUVEC und die EGF-induzierte Proliferation in Swiss/3T3 Zellen hemmt.
Fig. 68 illustriert den Effekt einer verzögerten Zugabe der Verbindung Nr. 58 auf die Balb/3T3 Proliferation als Antwort auf PDGF-BB.
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Fig. 69 illustriert, dass die Verbindung Nr. 58 die PTGF-induzierte Proliferation in Balb/3T3 Zellen in einem grösseren Ausmass hemmt als eine Serum-induzierte Proliferation.
Fig. 70 illustriert, dass eine endotheliale Zellmigration durch die erfindungsgemässe Verbindung Nr. 58 gehemmt wird.
Fig. 71 illustriert, dass die Verbindung Nr. 58 die Chemotaxis von menschlichen glatten Muskelzellen (SMC) zu PDGF nicht hemmt.
Fig. 72A und 72B zeigen, dass die erfindungsgemässe Verbindung Nr. 58 eine THB-1 Zelladhäsion sowohl zu TNF oder IL-1-stimulierter HUVEC hemmt.
Fig. 73A und 73B zeigen die Hemmung der VCAM oder der ICAM Expression in HUVEC, aktiviert durch TNF, durch die erfindungsgemässe Verbindung Nr. 58.
Fig. 74 illustriert, dass die Verbindung Nr. 58 die TNF Freisetzung durch die erfindungsgemässe Verbindung Nr. 58 unter Verwendung eines Human-Vollblut-ex vivo-Assays hemmt.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Gattung von Verbindungen, die das zelluläre Verhalten durch eine besondere Phase eines Systems von sekundären Übertragungspfaden steuern kann (Bürsten et al. «lnterleukin-1 Rapidly Stimulâtes Lysophosphatidate Acyltransferase and Phospatidate Phosphohydrolase Activities in Human Mesangial Cells» J. Biol. Chem.. Vol. 266, No. 31, pages 20732-20743, November 5, 1991). Die sekundären Botenstoffe sind Lipide oder Phospholipide wobei die folgenden Abkürzungen gelten:
PE = Phosphatidylethanolamin
LPE = Lysophospoethanolamin
PA = Phosphatidsäure
LPA = Lysophospatidsäure
DAG = Diacylglycerin
LPLD = Lysophospholipase-D
LPAAT = Lysophosphatidsäure-Acyl-Transf erase
PAPH = Phosphatidsäure-Phosphohydrolase
PLA2 = Phospholipase A2
PLD = Phospholipase D
PAA = Phosphoarachidonsäure
PC = Phosphatidylcholin
«umgebildete» PA, zyklischer Pfad = PAA, LPA, PA und DAG Intermediate substituiert mit 1-gesättigten, 2-Linoleoyl oder 1,2-Dioleoyl, Dioleoyl/1,2-sn-Dilinoleoyl in den bezeichneten sn-1 und sn-2 Positionen.
«Klassischer PI Pfad» = PI, DAG, PA Intermediate substituiert mit 1-Stearoyl, 2-Arachidonyl Acyl-Sei-tenketten.
«PLD-generierte PA» = PE, PC, LPA, PA und DAG Intermediate substituiert mit z.B. 1,2-sn-Dioleoyl-, 1-Alkyl, 2-Linoleoyl-, und 1-Alkyl-2-Docosahexaenoyl-Seitenketten.
Lysophospatidsäure-Transferase (LPAAT) beeinflusst die Synthese von Phosphatidsäure (PA) aus Lysophosphatidsäure (LPA) durch Inkorporation einer Acylgruppe aus Acyl-CoA. Die Hydrolyse des Phosphatanteils durch PA Phosphohydrolase (PAPH) resultiert in der Bildung von DAG. Diese Teile des Pfades scheinen sofort (innerhalb einer Minute) durch Stimulation mittels eines primären Reizes (z. B. durch Zytokine wie IL-1, IL-2 oder TNF) aktiviert zu werden, die an einem Rezeptor einer zellulären Oberfläche wirken. Ein sofort detektierbarer Effekt besteht in der Anhebung der Gehalte von PA und DAG. Eine Verabreichung der erfindungsgemässen Verbindungen kehrt diese Erhöhung um.
Die Verbindungen und pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung schliessen Inhibitoren von Unterarten von LPAAT- und PAPH-Enzymen mit Substratspezifizität für Intermediate mit 1,2-zwei-fach ungesättigten und 1-Alkyl, 2-ungesättigten Unterarten ein. Jede Membran-Phospholipid Unterklasse (z.B. PA, PI, PE, PC und PS) erreicht einen stabilen Gehalt von charakteristischen Acyl-Seitenketten der Fettsäuren aufgrund der zyklischen Umbildung der Plasmamembran sowie aufgrund des Turnovers jeder Unterklasse. PA ist zumeist stabil, es liegt jedoch nur in vergleichsweise kleinen Mengen vor. In Ruhezellen vorliegendes PA besteht zumeist aus gesättigten Acyl-Seitenketten, zumeist bestehend aus Myristat, Stearat und Palmitat. In Ruhezellen bestehen die Acyl-Seitenketten des PC's zumeist aus Pal-mitat in der sn-1 Position und Oleat in der sn-2 Position. PE und PI sind vorzugsweise zusammengesetzt aus sn-1 Stearat und sn-2 Arachidonat.
Aufgrund dieses charakteristischen Vorliegens von Acylgruppen in der sn-1 und sn-2 Position, kann die Herkunft einer jeden PA-Art aus der chemischen Natur ihrer Acylgruppen in den sn-1 und sn-2 Positionen hergeleitet werden. Wird beispielsweise PA aus PC durch Aktion des Enzymes PLD erhalten, so wird das PA die charakteristischen Acyl-Seitenkette des durch den sekundären Übertragungspfad passierten PC-Substrats enthalten. Ferner wird der Ursprung einer jeden 1,2-sn-Substratart nach ihrem Ursprung differenziert. Es ist jedoch wichtig zu wissen, ob oder ob nicht jede Phospholipidart vor einer Hydrolyse zu DAG eine PA-Form durchläuft. Die Lyso-PA, die in PA und von dort aus in DAG konvertiert ist kann gezeigt werden. Die Komplexizität dieses sekundären Übertragungspfades kann durch geeignete Analyse der Chemie der Acylgruppen der entsprechenden Fettsäuren (z.B. durch Dünnschicht-
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Chromatographie, Gas-Flüssig-Chromatographie oder Hochdruckflüssigkeitschromatographie) der Intermediate in Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Stimulierung des sekundären Übertragungspfades aufgelöst werden.
In bestimmten Meseachymalzellen, wie z.B. neutrophile und Ratten- oder Humanmesangialzellen, können verschiedene Signalgebungspfade zusammen aktiviert werden, gleichzeitig oder beide zusammen. Beispielsweise stimuliert F-Met-Leu-Phe in Neurophilen die Bildung von PA durch die Wirkung von PLD, gefolgt in zeitlichem Abstand durch die Bildung von DAG durch die Wirkung von PAPH. Einige Minuten später wird DAG aus PI über den klassischen Phosphoinostid-Pfad erzeugt. In vielen Zellen wird DAG sowohl aus PA erhalten, welches über einen Zyklus umgebildet wird, in dem PA durch PLA2 in sn-2-Position hydrolisiert wird, gefolgt von einer sn-2 Transacylierung durch LPAAT, sowie durch einen PLD-Pfad aus PA, das entweder aus PE oder PC oder beide Substrate aus PLD erzeugt wird.
Der vorliegende sekundäre Übermittlungspfad bezieht Substrate mit ungesättigten Fettsäuren in der sn-2 Position ein, wobei diese nicht Arachidonat beinhalten, und derartige Unterarten von PAPH und LPAAT, die nicht in normalen zellulären Haushaltungsfunktionen involviert sind, die Teile des klassischen PI Pfades darstellen.
Die in dem vorliegenden sekundären Übertragungspfad involvierten PAPH- und LPAAT-Enzyme sind hervorragend stereospezifisch für verschiedene Acyl-Seitenketten und isomere Formen der Substrate. Daher sind die erfindungsgemässen Verbindungen vorzugsweise im wesentlichen enantiomerenrein und vorzugsweise sind die R-Enantiomere am chiralen Kohlenstoffatom an eine Hydroxylgruppe gebunden.
Ein weiterer Signalgebungspfad der mit der inflammatorischen Transduktion und Zellmembranpertur-bation verbunden ist erzeugt eine separate PA-Art, die Myristat-angereichert ist und aus GlyPI erhalten wird, wie oben beschrieben ist. Unter diesen Signalgebungsbedingungen verhindern die erfindungsgemässen Verbindungen die Aktivierung oder sie hemmen direkt PiG-PLD, welches GlyPI in PA und Gly-caninositol hydrolisiert. In einigen Tumorzellen und TNF-aktivierten Zellen (z.B. Typ Il-Rezeptoren) kann die Wirksamkeit der erfindungsgemässen Verbindungen zweifach sein, sowohl die Hydrolyse von LPAAT als auch von GlyPI hemmend. Experimentelle Ergebnisse bestätigen diesen hemmenden Effekt. Stimulierung von CT-6 Zellen mit IL-2 ergibt eine schnelle Hydrolyse der GlyPI-Arten, 15-45 Sekunden nach der Stimulation, gefolgt von einer schnellen Resynthese von GlyPI. Die erfindungsgemässen Verbindungen verhindern diese Hydrolyse und stimulieren die GlyPI Synthese, was zu einem signifikanten Anstieg von GlyPI während der Stimulation, ohne ein Anzeichen für eine Hydrolyse oder eine Bildung von aus GlyPI stammendem PA, führt. Die Stimulierung von humanen venösen umbilical-endothelial Zellen mit TNF resultiert in aus LPAAT und aus Gly-Pl stammenden PA Spezies. Die erfindungsgemässen Verbindungen hemmen die Bildung beider PA-Arten. Hieraus ergibt sich eine Akkumulierung von Lyso-PA und Gly-Pl.
Die spezifische Aktivierung und/oder Hemmung des sekundären Übertragungspfades, wie oben beschrieben, primär aktiviert durch unterschiedliche noxische Reize, legt nahe, dass die erfindungsgemässen Verbindungen bei der Behandlung eines weiten Spektrums von klinischen Indikationen einsetzbar sind. Darüber hinaus liefern hier gezeigte in vitro- und in vivo-Daten Vorhersagen dafür, dass ein weites Spektrum von klinischen Indikationen, die ähnliche Effekte auf den spezifischen sekundären Übertragungspfad aufweisen, durch die erfindungsgemässen Verbindungen zu behandeln sind, welche spezifisch den durch noxische Reize und hierdurch vermittelt z.B. inflammatorische Zytokine aktivierten sekundären Übertragungspfad hemmen. In der Tat erklärt der Aktivierungsmechanismus der erfindungsgemässen Verbindungen warum diese Verbindungen vielfältige klinische Indikationen aufweisen.
Die Aktivierung des sekundären Übertragungspfades ist ein Hauptvermittler der Antwort auf noxische Reize und resultiert in einer intrazellulären Signalgebung, die zu einer klinischen Manifestation von z.B. akuter und chronischer Entzündung, Autoimmunkrankheiten und Krebszellenwachstum führt. Alle Inhibitoren jedoch (z.B. die erfindungsgemässen Verbindungen) hemmen nicht alle Enzyme dieses sekundären Übertragungspfades. Durch den sekundären Übertragungspfad übermittelte Signale umfassen beispielsweise die zellulären Antworten von LPS direkt, T- und B-Zellen-Aktivierung durch Antigene, zelluläre Reizantworten auf primäre Botenstoffe wie IL-1- und TNF, durch Transformationen stimuliertes Wachstum, einschliesslich, aber nicht beschränkt auf, aktivierte Oncogene (z.B. ras, abl, her2-neu und dergleichen), Proliferation glatter Muskelzellen durch aus Thrombozyten erhaltenen Wachstumsfaktor (PDGF), b-FGF, epidermischer Wachstumsfaktor (EGF) vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor (VEGF) und IL-1, Stimulation des T- und B-Zell Wachstums durch IL-2, IL-4 oder IL-7; und verallgemeinert T-Zellen Rezeptor-Signalgebung.
Die erfindungsgemässen Verbindungen: (1) blockieren wie gezeigt die IL-1 Signaltransduktion über den Typ I Rezeptor, z.B. durch Verhinderung der IL-1 und IL-1 plus PDGF Induktion der Proliferation glatter Muskeln, Mesangialzellen des Endotheliums und der Niere (LPAAT Effekt); (2) unterdrücken wie gezeigt die Regulierung der Adhäsion von Molekülen zu höheren Werten, beispielsweise durch Blockierung von VCAM in Endothelialzellen; (3) hemmen TNF, LPS und IL-1 induzierte Metalloproteasen (ein Entzündungs- und Krebsmetastasenmodell); (4) blockieren LPS, TNF oder IL-1 induzierte sekundäre Zytokinproduktion (zur Unterdrückung und Behandlung septischer Schocksymptome); (5) unterdrücken T- und B-Zell-Aktivierung durch Antigene, beispielsweise IL-2 und IL-4; (6) inhibieren die Mastzellenaktivierung durch Immunoglobulin E (IgE); (7) sind für transformierte Zellen und Tumorzell-Linien zytotoxi-
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sch, jedoch nicht für normale Zellen bei gleichen Dosen; und (8) blockieren die Signalgebung durch IL-2, IL-4, IL-6 und IL-7 auf T- und B-Zellen.
Die oben genannten zellulären Ergebnisse sind die Basis für die nachfolgenden pharmakologischen Effekte einschliesslich, aber nicht beschränkt auf den Schutz und die Behandlung von durch Gram-positive oder Gram-negative Bakterien induzierter endotoxischer Schock und Sepsis, Hemmung und Prävention von Tumorzellenwachstum und Metastasenausbreitung, synergistischer Immunosuppression, Behandlung von Autoimmun-Krankheiten, Unterdrückung von Allotransplantatreaktionen, Stimulierung des Haarwachstums (z.B. Behandlung von Glatzköpfigkeit oder Vorbeugung von Haarausfall aufgrund von zytoreduktiven Therapien) und Behandlung von hyperproliferativen Unregelmässigkeiten der Haut, wie z.B. Psoriasis (z.B. zytoreduktive Therapien, IL-2 Therapie, Cyclosporin A, Amphoteracin B usw.) durch Umkehr eines apoptotischen Prozesses. Die erfindungsgemässen Verbindungen erweisen sich am wirksamsten, wenn sie zur Prävention und Behandlung septischen Schocks, zur Behandlung akuter und chronischer Entzündungen, Unterdrückung von Immunreaktionen, Behandlung oder Prävention von Autoimmun-Krankheiten und zur Stimulierung des Haarwachstums (wenn topisch angewandt) eingesetzt werden.
Die erfindungsgemässen Verbindungen sind ebenfalls nützlich als Adjuvanz zur Hemmung toxischer Nebeneffekte von Arzneimitteln, deren Nebeneffekte durch den vorliegenden sekundären Übertragungspfad vermittelt werden. Metalloproteasen vermitteln Gewebebeschädigungen wie glomeruläre Krankheiten der Niere, Gelenkzerstörung durch Arthritis, und Lungenzerstörung in Emphysemen, und spielen eine bedeutende Rolle bei Tumormetastasen. Drei Beispiele von Metalloproteasen umfassen 92 kD Typ V Gelatinase, induziert durch TNF, IL-1 und PDGF plus b-FGF, eine 72 kD Typ IV Collagenase die gewöhnlich durch TNF oder IL-1 konstituiv produziert und stimuliert wird sowie ein Stromelysin/PUMP-1, induziert durch TNF und IL-1. Die vorliegenden Verbindungen können die TNF oder IL-1 Induktion von 92 kD Typ V Gelatinase induzierbarer Metalloprotease hemmen. Darüber hinaus können die erfindungsgemässen Verbindungen die durch 100 U/ml von IL-1 induzierte PUMP-1 Aktivität reduzieren. Dementsprechend verhindern die erfindungsgemässen Verbindungen die Induktion von bestimmten durch IL-1 oder TNF induzierten Metalloproteasen und sind nicht involviert bei konstituiv produzierten Proteasen (z.B. 72 kD Typ IV Collagenase), die an normalen Gewebeumbildungen beteiligt sind.
Die erfindungsgemässen Verbindungen hemmen die IL-1 Signaltransduktion und sind daher als IL-1 Antagonisten angesehen. Ein kürzlich erschienener Übersichtsartikel mit dem Titel «Mechanisms of Disease; The Role of lnterleukin-1 in Disease» (Dinarello et al., N. Enal. J. Med.. Vol. 328, No. 2, pages 106-113, January 14, 1993) beschreibt die Rolle von IL-1 als «ein wichtiger, schneller und direkter Verursacher von Krankheiten». «Bei septischem Schock, beispielsweise, wirkt IL-1 direkt auf die Blutgefässe um eine Vasodilatation durch die schnelle Produktion des Thrombozyten-Aktivierungsfaktors und Stickoxid zu induzieren, wogegen es bei Autoimmunkrankheiten durch die Stimulierung anderer Zellen wirkt, um Zytokine oder Enzyme zu produzieren, die dann auf das Zielgewebe wirken». In dem Artikel ist eine Gruppe von Erkrankungen beschrieben, die durch IL-1 vermittelt sind, einschliesslich des septischen Syndroms, rheumatischer Arthritis, Darmentzündungen, akuter und myelogener Leukämie, insulinabhängiger Diabetes Mellitus, Atherosklerose und anderer Krankheiten einschliesslich Transplantatab-stossung, Transplantat-Wirt-Erkrankungen (GFHD), Psoriasis, Asthma, Osteoporose, Parodonthose, autoimmune Thyroiditis, alkoholische Hepatitis, Frühgeburt als Folge von Uterusinfektionen und Schlafstörungen. Da die erfindungsgemässen Verbindungen IL-1 Antagonisten darstellen, sind die erfindungsgemässen Verbindungen bei der Behandlung einer der oben genannten Krankheiten einsetzbar.
Beispielsweise scheint bei septischen Syndromen der Mechanismus des IL-1 induzierten Schocks die Möglichkeit von IL-1 zu sein, die Plasmakonzentration von kleineren Vermittlermolekülen wie Thrombo-zyten-Aktivierungsfaktoren, Prostaglandinen und Stickoxid zu erhöhen. Diese Verbindungen sind potente Vasodilatoren und sind bei Versuchstieren schockinduzierend. Die Blockierung der Wirkung von IL-1 verhindert die Synthese und die Freisetzung dieser Vermittler. Bei Tieren verringert eine einzige intravenöse Injektion von IL-1 den arteriellen Blutdruck, verringert systematisch die vaskuläre Resistenz und induziert Leukopenie und Thrombozytopenie. Bei Menschen erniedrigt die intravenöse Verabreichung von IL-1 ebenso schnell den Blutdruck, und Dosen von 300 ng oder mehr je Kilogramm Körpergewicht können schwere Hypotensionen hervorrufen. Der therapeutische Vorteil einer Blockierung der Wirkung von IL-1 liegt in der Vorbeugung von schädlichen biologischen Effekten ohne mit der Produktion von Molekülen, die eine Rolle bei der Homoöstase spielen, zu beeinträchtigen. Die vorliegenden erfindungsgemässen Verbindungen richten sich an die durch Dinarello et al. festgestellte Notwendigkeit einer Inhibierung IL-1 zellulärer Signalgebung.
Bezogen auf rheumatoide Arthritis stellen Dinarello et al. fest: «lnterleukin-1 liegt in synovialen Auskleidungen und in der Synovia von Patienten mit rheumatoider Arthritis vor, und Gewebeproben von synovialem Gewebe derartiger Patienten produzieren IL-1 in vitro. Intraartikuläre Injektionen von Inter-leukin-1 induzieren eine Leukozyteninfiltration, Knorpelschwund und periartikuläre Knochenumbildung in Tieren. In isolierten in vitro-Knorpel- und Knochenzellen triggert lnterleukin-1 den Ausstoss von Genen für Collagenase sowie auch für Phospholipase und Cyclooxygenase und eine Blockierung ihrer Wirkung reduziert die Bakterienzellwand-induzierte Arthritis in Ratten». Daher sind die erfindungsgemässen Verbindungen als IL-1 Antagonisten nützlich bei der Behandlung und Vorbeugung von rheumatoider Arthritis.
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Darmentzündungen, Colitis Ulcerosa und Crohn-Krankheit sind gekennzeichnet durch eine infiltrative Lesion des Darmes, die aktivierte Neutrophile und Makrophagen enthält. IL-1 kann die Produktion von entzündungserregenden Eicosanoiden wie z.B. Prostaglandin E2 (EGE2) und Leukotrien B4 (LTB4) und IL-8, ein entzündungserregendes Zytokin mit neutrophil-chemoattraktiven und neutrophil-stimulierenden Eigenschaften. Gewebekonzentrationen von PGE2 und LTB4 korrelieren mit der Schwere der Krankheit bei Patienten mit Colitis Ulcerosa und Gewebekonzentrationen von IL-1 und IL-8 sind hoch bei Patienten mit Darmentzündungen. Daher ist ein IL-1 Antagonist wie die erfindungsgemässen Verbindungen bei der Behandlung von Darmentzündungen wirksam.
Hinsichtlich akuter und chronischer myelogener Leukämie gibt es zunehmende Anzeichen dafür, dass IL-1 als Wachstumsfaktor für derartige Tumorzellen wirkt. Daher sind die erfindungsgemässen Verbindungen bei der Vorbeugung von Krankheitsstörungen, bei akuter und chronischer myelogener Leukämie wirksam.
IDDM wird als Autoimmunerkrankung mit einer Zerstörung von Beta-Zellen in Langerhans'schen Inseln angesehen, die durch immunkompetitive Zellen vermittelt wird. Inseln bei Tieren mit spontan auftretendem IDDM (z.B. BB-Ratten oder NOD-Mäuse) weisen inflammatorische Zellen auf, die IL-1 enthalten. Die erfindungsgemässen Verbindungen sind daher bei der Vorbeugung und der Behandlung von IDDM einsetzbar.
IL-1 spielt ebenso eine Rolle bei der Fortschreitung von Atherosklerose. Endothelial-Zellen sind dabei ein Target für IL-1. IL-1 stimuliert die Proliferation von vaskulären glatten Muskelzellen. Aus verfetteter arterieller Plaque von hypercholesterolemischen Hasen isolierte Schaumzellen enthalten IL-1 ß und IL-1 ß Messenger RNA. Die Aufnahme von peripheren Blutmonozyten führt zu einer Initiierung der IL-1 Produktion durch diese Zellen. IL-1 stimuliert ebenfalls die Produktion von PDGF. Zusammengefasst spielt IL-1 eine Rolle bei der Entwicklung von atherosklerotischen Lesionen. Daher sind IL-1 Antagonisten wie die erfindungsgemässen Verbindungen bei der Vorbeugung und Behandlung von Atherosklerose nützlich.
DAG und PA sind in Oncogen-transformierten Zellen aufreguliert. Beispielsweise führt die Aktivierung von ras-Mutationen zu einer erhöhten Erzeugung von DAG bei Stimulation mit Mitogenen. In nichttrans-formierten renalen Mesangialzellen erhöht die IL-1 ß Stimulation die PLA2 und LPAAT Aktivierung, was zur Erzeugung führt von sn-2 ungesättigtem PA und nachfolgender Hydrolyse in DAG durch Phospha-tid-Phosphorhydrolase. Die ras-Transformation in NIH/3T3-Zellen reguliert die Serum-stimulierte Erzeugung von DAG und PA zu höheren Werten. Die spezifischen durch das Serum stimulierten Arten von DAG sind Dioleoyl und für PA Dilinoleoyl und Dioleoyl. Diese Regulierung zu höheren Werten tritt über einen Zeitraum von 4 bis 12 Stunden auf, und die Vorbehandlung von Zellen mit einer der erfindungsgemässen Verbindung blockiert die Erzeugung von diesen sekundären Phospholipid-Botenstoffen. Die Hemmung erfolgt entweder durch eine Unterdrückung der Erzeugung von PA de novo aus LysoPA oder durch Hemmung von einer oder beiden Armen des Land-Zykluses. Daher vermittelt die ras-Transformation eine Regulierung spezifischer PA-Arten zu höheren Werten durch indirekte Stimulierung der PLA2 und/oder LPAAT Aktivität. Die erfindungsgemässen Verbindungen hemmen die Konversion der hochregulierten LysoPA in PA und blockieren nachfolgend die durch PA/DAG induzierte zelluläre phänotypische Umwandlung in der Membran.
Das Vermögen der erfindungsgemässen Verbindungen, die Erzeugung von ungesättigten Phosphorli-piden zu hemmen, spiegelt sich wieder durch das Vermögen der erfindungsgemässen Verbindungen, die Proliferation und Tumorgenizität von rastransformierten Zellen in vitro und in vivo zu hemmen. Diese Hemmung ist reversibel und ist nicht mit einer signifikanten Zytotoxizität verbunden.
Die Produktion überschüssiger oder unregulierter TNF (Tumor Nekrose Faktor) ist bei der Vermittlung oder Verschlimmerung einer Anzahl von Krankheiten mitinbegriffen, einschliesslich rheumatoider Arthritis, rheumatoider Spondylitis, Osteoarthritits, gichtartiger Arthritis und andere arthritische Bedingungen, Sepsis, septischer Schock, endotoxischer Schock, Gram-negative Sepsis, toxisches Schocksyndrom, Atemnotsyndrom bei Erwachsenen, cerebrale Malaria, chronische Lungenentzündung, Silikose, Lun-gensaracoidose, Knochenresorbtionserkrankungen, Reperfusionsverletzungen, Transplantat-Wirt-Reak-tionen, Allotransplantat-Abstossungen, Fieber, Myalgie aufgrund von Infektionen wie Influenza, Kachexie nachfolgend zu Infektionen, AIDS oder Malignität, andere Viralinfektionen (z.B. CMV, Influenza, Adenoviren, Herpesfamilie), Keloidbildung, Narbengewebebildung, Crohn-Krankheit, Colitis Ulcerosa oder Py-resis. Die erfindungsgemässen Verbindungen oder pharmazeutisch geeignete Salze derselben können bei der Herstellung eines Medikamentes für die prophylaktische oder therapeutische Behandlung eines jeglichen Krankheitszustandes eines Menschen oder eines anderen Säugetieres eingesetzt werden, welche verschlimmert ist oder über den vorliegenden auf zellulären Phospholipiden basierenden sekundären Signalübermittlungspfad und durch excessive oder unregulierte Produktion von «first messenger» inflammatorischen Zytokinen wie TNF oder IL-1 signalisiert wird. Im Hinblick auf TNF first messenger-Si-gnalgebung existieren verschiedene Krankheitszustände, in denen eine excessive oder unregulierte TNF Produktion durch Monozyten/Makrophagen bei der Verschlimmerung oder Verursachung der Krankheit beteiligt ist.
Diese schliessen beispielsweise neurodegenerative Krankheiten, wie z.B. Alzheimerkrankheit, Endo-toxemie oder toxische Schocksyndrome (Tracey et al., «Anti-cachectin/TNF Monoclonal Antibodies Pre-vent Septic Shock Düring Lethal Bacteraemia,» Nature. Vol. 330, pages 662-664, December 17, 1987
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and Hinshaw et al., «Survival of Primates in LD100 Septic Shock Following Therapy With Antibody to Tumor Necrosis Factor (TNFa),» Cire. Shock. Vol. 30, pages 279-292, 1990); Kachexie (Dezube et al., «Pentoxifylline and Wellbeing in Patients with Cancer,» The Lancet, page 662, March 17, 1990), und Atemnotsyndrom bei Erwachsenen (Miller et al., «Tumour Necrosis Factor in Bronchopulmonary Sécrétions of Patients with Adult Respiratory Distress Syndrome,» The Lancet, pages 712-713, September 23, 1989). Die erfindungsgemässen Verbindungen können topisch bei der Behandlung oder Prophylaxe tropischer Krankheitszustände eingesetzt werden, die durch überschüssige TNF oder IL-1 vermittelt oder verschlimmert werden, wie Viral-Infektionen (Herpes oder viruskonjunktiver), Psoriasis, Pilz- oder Hefeinfektionen (Serpigo, Epidermophytosis, Vaginitis, Schuppen usw.) oder andere dermatologische hyperproliferative Störungen. Hohe TNF-Spiegel wurden mit akuten Malariaattacken im Zusammenhang gebracht (Grau et al., «Tumor Necrosis Factor and Disease Severity in Children with Falciparum Malaria,» N. Engl. J. Med- Vol. 320, No. 24, pages 1586-1591, June 15, 1989), Krankheiten mit chronischer Lungenentzündung wie Silikose und Asbestose (Piguet et al., «Requirement of Tumour Necrosis Factor for Development of Silica-induced Pulmonary Fibrosis,» Nature, Vol. 344, pages 245-247, March 15, 1990, and Bissonnette et al., «Pulmonary Inflammation and Fibrosis in a Murine Model of Asbesto-sis and Silicosis,» Inflammation, Vol. 13, No. 3, pages 329-339, 1989), und Reperfusionsverletzungen (Vedder et al., «Inhibition of Leukocyte Adherence by Anti-CD18 Monoclonal Antibody Attenuates Re-perfusion Injury in the Rabbit Ear, Proc. Nati. Acad. Sei. USA. Vol. 87, pages 2643-2646, April 1990).
Die vorliegende Erfindung schliesst die Anwendung der erfindungsgemässen Verbindungen für die Vorbereitung eines Arzneimittels zur Behandlung oder zur Prevention klinischer Symptome verschiedener Krankheitszustände oder zur Verminderung der Toxizität von anderen Behandlungen durch Hemmung zellulärer Signalgebung über den sekundären Übermittlungspfad ein. Krankheitszustände oder be-handlungsinduzierte Toxizität sind ausgewählt aus einer Gruppe bestehend aus der Proliferation von Tumorzellen und Antwort auf ein aktiviertes Oncogen; Hematozytopenie, verursacht durch zytoreduktive Therapie; Autoimmunschwächeerkrankungen, hervorgerufen durch eine T-Zellen-Antwort oder eine B-Zellen-Antwort und Antikörperproduktion; septischer Schock; Resistenz von Mesenchymzellen bezüglich des Tumornekrosefaktors (TNF); Proliferation von glatten Muskelzellen, Endothelialzellen, Fibroblasten und anderen Zelltypen als Antwort auf Wachstumsfaktoren wie PDGF, FGF, EGF und VEGF (z.B. Atherosklerose, Restenose, Schock und coronare Arterienerkrankungen); humane Immundefekt Virusinfektionen (AIDS und AIDS verwandter Komplex); Proliferation von Mesangialzellen der Niere als Antwort auf IL-1, MIP-1a, PDGF oder FGF; Entzündungen; glomeroläre oder tubuläre Toxizität der Niere in Antwort auf Cyclosporin A oder Amphotericin B-Behandlung; Organtoxizität (z.B. gastrointenstinale oder pulmonale Epithelial) in Antwort auf eine zytoreduktive Therapie (z.B. zytotoxische Arzneimittel oder Bestrahlung); Unterstützung von Antitumoreffekten von nichtalkylierenden Antitumoragentien; Allergien als Antwort auf Entzündungsreize (z.B. TNF, IL-1 und dergleichen) gekennzeichnet durch die Produktion von Zelloberflächenmetalloproteasen oder durch Degranulierung von Darmzellen und Basophilen in Antwort auf IgE, Knochenerkrankungen hervorgerufen durch Überproduktion von Osteoklast-aktivierendem Faktor (OAF) durch Osteoklaste, CNS Krankheiten hervorgerufen durch reduzierte Signaltransduktion der Neurotransmitter Andrenalin und Acetylcholin und Kombinationen von diesen. Die erfindungsgemässen Verbindungen sind ebenso nützlich als antimikrobielle Agentien zur direkten Behandlung von Pilzoder Hefeinfektionen und zur indirekten Behandlung bakterieller- oder Virusinfektionen durch eine Immunstimulation und durch prohematopoetische Effekte.
Zusammenfassend zeigen die Verbindungen und deren pharmazeutische Zusammensetzungen folgende Merkmale: (1) Hemmung der Proliferation von Tumorzellen; (2) Unterdrückung der Aktivierung von T-Zellen durch Antigen oder IL-2 Stimulation; (3) Unterdrückung der Aktivierung von Monozyten/Ma-krophagen-Zellen durch Endotoxin, TNF, IL-1 oder GM-CSF Stimulation; (4) Unterdrückung der Antikörperproduktion von B-Zellen in Antwort auf eine Antigen, IL-4 oder CD40 Liganol; (5) Hemmung der Proliferation von glatten Muskelzellen in Antwort auf zur Stimulierung der Proliferation geeignete Wachstumsfaktoren; (6) geringere systematische Vaskulärresistenz übertragen durch Endothelialzellen; (7) geringere systematische Vaskulärresistenz induziert durch Endothelialzellen; (8) geringere Expression von Adhäsionsmolekülen induziert durch Verstärker derselben; (9) Unterdrückung der Aktivierung von T-Zellen und Makrophagen durch HIV; (10) Hemmung der Proliferation von Mesangialzellen der Niere in Antwort 1 auf eine Stimulation durch IL-1 und/oder MIP-1a und/oder PDGF und/oder FGF; (11) Verstärkung der Resistenz von Glomerulär- oder Tubularzellen der Niere gegen Cyclosporin A oder Amphotericin B; (12) Verhinderung der Freisetzung von MIP-1 durch IL-1, TNF oder Endotoxin stimulierte Monozyten und Makrophagen; (13) Verhinderung der Freisetzung des Trombozyten-Aktivierungsfaktors durch IL-1, TNF oder Endotoxin behandelte Megakaryozyten, fibroplastischen Zellen und Makrophagen; (14) Verhinderung der Regulation zu tieferen Werten von Rezeptoren für Zytokine in TNF behandelter hematopoetischen Progenitorzellen; (15) Unterdrückung der Produktion von Metalloproteasen in IL-1-sti-mulierten oder TNF-stimulierten glomerolären Epithelialzellen oder Synovialzellen; (16) Verstärkung der Resistenz von gastrointenstinal oder pulmonalen Epithelialzellen gegen zytotoxische Arzneimittel oder Bestrahlung; (17) Verstärkung des Antitumoreffektes eines nichtalkylierenden Antitumoragents; (18) Hemmung der Produktion von Osteoclast aktivierendem Faktor als Antwort auf IL-1; (19) Hemmung der Degranulation in Antwort IgE; (20) Steigerung der Freisetzung von adrenergischen Neuraltransmittern, Dopamin, Nor-Adrenalin oder Andrenalin, oder der Neurotransmitter Acetylcholin; (21) Modulierung der
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postsynaptischen «slow current» Effekte der adrenergischen Neurotransmitter Dopamin, Adrenalin oder Nor-Adrenalin oder der Neurotransmitter Acetylcholin; (22) Unterdrückung der Signalgebung durch Neurotransmitter einschliesslich Acetylcholin, Leuenkephalin und Seretonin; oder (23) Erhöhung der Iktus-Schwelle.
Die erfindungsgemässen Verbindungen sind ebenfalls einsetzbar zur Anhebung der Iktus-Schwelle, zur Stabilisierung von Synapsen gegen Neurotoxine wie Strychnin, zur Verstärkung der Wirkung von Anti-Parkinson-Arzneimitteln wie L-Dopa, zur Verstärkung der Wirkung von Schlafmitteln, zur Linderung von Bewegungsstörungen aufgrund der Verabreichung von Tranquilizern und zur Verringerung oder Vorbeugung neuronaler Überreaktionen in Verbindung mit fortgeschrittenem Neuraitod, der einem cerebralen vaskulären Ereignis wie einem Schlag folgt. Weiterhin sind die erfindungsgemässen Erfindungen bei der Behandlung von Nor-Adrenalin-Mangel Depressionen und Depressionen in Verbindung mit der Freisetzung von endogen Glucokortikoiden, zur Verhinderung der Toxizität auf das zentrale Nervensystem von Dexamethason oder Methylprednisolon und zur Behandlung chronischer Schmerzen ohne Verursachung von Arzneimittelsucht. Ferner sind die erfindungsgemässen Verbindungen bei der Behandlung von Kindern mit Lern- und Konzentrationsstörungen einsetzbar sowie allgemein zur Verbesserung des Gedächtnisses bei Patienten mit organischen Schäden, einschliesslich Alzheimer-Patienten.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Klasse von Verbindungen, die wirkungsvolle Wirkstoffe zur Hemmung spezifischer zellulärer Signalgebungsereignisse darstellen. Die erfindungsgemässen Verbindungen und erfindungsgemässen pharmazeutischen Zusammensetzungen von diesen haben die allgemeine Formel:
(X)j-(Grundstruktur),
wobei j eine ganze Zahl zwischen 1 und 3 darstellt, die Grundstruktur ist nichtzyklisch und kann ein Heteroatom enthalten, zyklisch oder heterozyklisch, wobei eine zyklische oder heterozyklische Grundstruktur zumindest einen vier- bis siebengliedrigen Ring enthält und X ein racemisches Gemisch, ein R- oder ein S-Enantiomer, ein Solvat, ein Hydrat oder ein Salz des Restes:
darstellt, wobei C ein chirales Kohlenstoffatom darstellt, n ist eine ganze Zahl von eins bis vier (vorzugsweise von eins bis drei); eines oder mehrere Kohlenstoffatome der (CH2)n-Einheit können durch eine Keto- oder eine Hydroxygruppe substituiert sein; m ist eine ganze Zahl von vier bis vierzehn (vorzugsweise acht bis vierzehn); unabhängig voneinander sind Ri und R2 Wasserstoff, ein gradkettiges oder verzweigtes Alkan oder Alken mit einer Länge von bis zu zwölf Kohlenstoffatomen, oder -(CH2)wR5, wobei w eine ganze Zahl von zwei bis vierzehn und R, eine mono-, di- oder trisubstituierte oder unsubstituierte Arylgruppe, die Substituenten des Restes R, Hydroxy-, Chlor, Fluor, Brom, oder C1-6 Alkoxygruppen darstellen; oder Ri und R2 miteinander verbunden eine substituierte oder unsubstituierte, gesättigte oder ungesättigte heterozyklische Gruppe darstellen, die vier bis acht Kohlenstoffatome enthält, wobei N ein Heteroatom darstellt; und R3 ein Wasserstoffatom oder ein C1-3 Rest oder
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(CH2)- c darstellt, wobei FU ein Wasserstoffatom, ein gradkettiges oder verzweigtes Alkan oder Alken mit einer Länge von bis zu acht Kohlenstoffatomen, -(ChfcJwRs, wobei w eine ganze Zahl von zwei bis vierzehn und R5 eine mono-, di- oder trisubstituierte oder unsubstituierte Arylgruppe darstellt, wobei die Substitu-enten von R5 Hydroxy-, Chlor, Fluor, Brom, oder C1-6 Alkoxygruppen, oder eine substituierte oder unsubstituierte, gesättigte oder ungesättigte heterozyklische Gruppe darstellen, die vier bis acht Kohlenstoffatome aufweist, r und s unabhängige ganze Zahlen von eins bis vier sind; wobei die Summe (r+s) nicht grösser als fünf ist; t ist eine ganze Zahl von eins bis vierzehn; und ein oder mehrere Kohlenstoffatome der (CH2)s oder (CH2)rGruppe durch eine Keto- oder Hydroxygruppe substituiert sein können.
Eine nichtzyklische Grundstruktur kann beispielsweise sein: Acetamid, Amid, Amin, Aminosäure (eine oder zwei), Carboxylgruppe, Ester, Halogenatom, endständiges Wasserstoffatom, Hydroxylgruppe, Glutarsäure, derivatisiertes Glycin, Keton, Phosphat, Phosphonat, Sulfat, Sulfonat, Sulfon, Sulfoxid, einfache ionische funktionelle Gruppe, Thiol oder Thiolester. Die Aminosäuren der Grundstruktur können beispielhaft eine oder mehrere der folgenden darstellen: Alanin, Arginin, Asparagin, Asparaginsäure, Cy-stein, Glutamin, Glutaminsäure, Glycin, Histidin, Isoleucin, Leucin, Lysin, Methionin, Phenylalanin, Prolin, Serin, Threonin, Tryptophan, Tyrosin und Valin, vorzugsweise eine mehr hydrophobe Aminosäure wie Leucin oder Isoleucin. Die nichtzyklische Grundstruktur kann vorzugsweise ein Dipeptid bestehend aus zwei der vorstehend exemplarisch genannten Liste von Aminosäuren darstellen. Halogenatome der Grundstruktur sind beispielsweise Brom, Chlor, Fluor und lod.
Eine Grundstruktur kann alternativ ein mindestens fünf- bis siebengliedriger Ring, vorzugsweise mit ein bis drei fünf- bis sechsgliedrigen Ringstrukturen in einer vorherrschend planaren Konfiguration sein. Vorzugsweise ist der Substituent (X) an einem Ring-N-Atom gebunden, falls ein derartiges existiert. Beispielsweise kann die Grundstruktur eine aus der folgenden Gruppe ausgewählte substituierte oder unsubstituierte sein: Barbitursäure, Benzamid, Benzol, Biphenyl, Cyclohexan, Cyclohexandion, Cyclopentandion, Lactam, Glutarimid, Homophthalimid, Hydrophthalimid, Imidazol, Imidazolamid, Indomethacin, Isocarbos-tyril, Lumazin, Naphtalin, Phenol, Pteridin, Pthalimid, Piperidin, Pyridin, Pyrimidin, Pyrrolamid, Chinolzin-dion, Chinazolinon, Chinolon, Resorcin, Salicylsäure und Derivate derselben, Stilben, Succinimid, Theobromin, Thymin, Triazin, Tricyclododecan, Harnsäure, Uracil, Vitamine A, E oder K oder Xanthin.
Bevorzugte zyklische Grundstrukturen umfassen substituiertes oder unsubstituiertes Glutarimid, Me-thylthymin, Methyluracil, Thymin, Theobromin, Uracil und Xanthin, insbesondere bevorzugt halogensubstituiertes Xanthin. Beispielhaft stellt die bevorzugte Grundstruktur dar: 1,3-Cyclohexandion, 1,3-Cyclo-pentandion, 1,3-Dihydroxynaphthalin, 1-Methyilumazin, Methylbarbitursäure, 3,3-Dimethylglutarimid, Orotsäure, Tetra- oder Hexahydrophthalimid, Orthophenol, Prostacyclin, 2-Hydroxypyridin, Methyldihy-droxypyrazolopyrimidin, insbesondere, 1,3-Dimethyldihydroxypyrazolo[4,3-d]pyrimidin, Methylpyrrolopy-rimidin, 1-Methylpyrrolo[2,3-d]pyrimidin, 1,3-Dihydroxynapthalin, 1-Pyrrolamid, 2-Pyrrolamid, 3-Pyrrol-amid, 1,2,3,4-Tetrahydroisochinolon, 1-Methyl-2,4(1 H,3H)-Chinolizindion (I-Mehtylbenzoyleneharnstoff), Chinazolin-4(3H)-on, Sulindac, Dihydrothymin, alkylsubstituiertes (Cl-6)Thymin, 2,4 Dioxohexahydro-
1.3.5-tetrazin, Methylzymin, alkylsubstituiertes (C1-6) Uracil, Uracil anneliert mit Naphthalin, 6-Amino-uracil, 1-Methyl-5,6-dihydrouracil, 1-Methyluracil, in 5- und/oder 6-Stellung substituierte Uracile (wie z.B. 5-Bromouracil), B-Ionone wie Vitamin A, 2,6,6-Methyl-1-Cyclohexen-1-Acetaldehyde wie Vitamin A,
2.6.6-Methyl-1-cyclohexen-1-acetaldehyd wie Vitamin A, Tetraion zu Vitamin K, 1,7-Dimethylxanthin, 3,7-Dimethylxanthin, 3-Methylxanthin, 3-Methyl-7-methylpivaloylxanthin, in 8-Stellung substituierte Xan-thine (mit Substituenten wie N oder S), und 7-Methylhypoxanthin.
Vorzugsweise ist der Substituent X an ein Stickstoffatom der Grundstruktur gebunden, wobei besonders vorteilhaft die Grundstruktur Xanthin ist und X an das Stickstoffatom Ni des Xanthins gebunden ist und die Stickstoffatome N3 und N7 des Xanthins unabhängig voneinander mit einem aus der Gruppe Wasserstoff, Methyl, Fluor, Chlor und Amino ausgewählten Rest substituiert sind.
Die Erfindung betrifft eine pharmazeutische Wirkstoffzusammensetzung, bestehend aus einer der erfindungsgemässen Verbindungen und einem pharmazeutisch verwendbaren Excipienten. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann für eine orale, parenterale oder topische Darreichungsform formuliert sein.
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Die Erfindung bezieht sich ferner auf eine pharmazeutische Zusammensetzung bestehend aus einer erfindungsgemässen Verbindung und einem pharmazeutisch annehmbaren Excipienten, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung für eine orale, parenterale oder topische Verabreichung an Patienten formuliert ist. Eine pharmazeutische Zusammensetzung kann ebenfalls eine oder eine Vielzahl der erfindungsgemässen Verbindungen und einen pharmazeutisch annehmbaren Carrier oder Excipienten aufweisen. Die Behandlung von Individuen mit den erfindungsgemässen Verbindungen oder pharmazeutischen Zusammensetzungen kann die Inkontaktbringung mit die erfindungsgemässen Verbindungen enthaltenden in vitro-Kulturen, in einer extrakorporalen Behandlung oder durch eine Verabreichung (oral, parenteral oder topisch) der erfindungsgemässen Verbindung oder pharmazeutischen Zusammensetzung an einen Patienten, dessen Zellen zu behandeln sind.
Die vorliegende Erfindung schliesst ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemässen Verbindungen ein. Ein beispielhaftes Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemässen Verbindungen ist nachstehend und in den folgenden Beispielen beschrieben. In einer Synthese gemäss der Erfindung wird eine Verbindung, die den gewünschten Kernbaustein (im Sinne einer «Grundstruktur» in den erfindungsgemässen Verbindungen) enthält, einer Reaktion unterworfen, um ein Anion der den Kernbaustein enthaltenden Verbindung zu erzeugen. Nachfolgend wird das erzeugte Anion mit einem substituierten Olefin zur Reaktion gebracht, um eine vorgesehene funktionelle Gruppe des Olefins zu verdrängen, was zu einem Zwischenprodukt führt. Eine vorbestimmte Menge der den Kernbaustein enthaltenden Verbindung wird mit einer geeigneten Base, einem Lösungsmittel und einem substituierten Olefin zur Reaktion gebracht, wobei das substituierte Olefin mindestens eine weitere funktionelle Gruppe aufweist, die in einer Verdrängungsreaktion durch die den gewünschten Kernbaustein enthaltende Verbindung substituiert wird.
Bevorzugte Basen sind: Natriumhydrid, Natriumamid, Natriumalkoxid, Lithiumhydrid, Kaliumhydrid, Li-thiumamid, Natriumamid und Kaliumamid, wobei dies nicht einschränkend aufzufassen ist. Insbesondere stellt Natriumhydrid eine bevorzugte Base dar. Bevorzugte Lösungsmittel können Dimethylsulfoxid, Di-methylformamid oder ein Alkohol darstellen. Beispielhaft bevorzugte Alkohole sind, ohne es auf diese einzuschränken, Methanol, Ethanol oder Isopropanol. Jedes eine Kettenstruktur der erfindungsgemässen Verbindungen aufweisende substituierte Olefin kann in der Reaktion gemäss der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. Bevorzugte Olefine stellen w-substituierte Olefine dar. Vorzugsweise zu verwendende Olefine sind, ohne hierauf beschränkt zu sein, halogen-substituierte Olefine.
Das Zwischenprodukt, das eine zusammengesetzte Struktur aus einer den Kernbaustein enthaltenden Verbindung und dem substituierten Olefin aufweist, kann anschliessend in das entsprechende Epoxid überführt werden. In dem der vorliegenden Erfindung entsprechenden Verfahren kann das Zwischenprodukt mit einer organischen Persäure umgesetzt werden, um das gewünschte Epoxid zu erhalten. Beispiele für vorzugsweise zu verwendende organische Persäuren sind 3-Chlorperoxybenzoesäure, Peressigsäure und Trifluorperessigsäure. Insbesondere stellt 3-Chlorperoxybenzoesäure eine vorteilhaft zu verwendende Persäure dar.
Alternativ kann das Zwischenprodukt zuerst in das korrespondierende Diol durch Reaktion des Zwischenproduktes mit einem geeigneten Oxidationsmittel überführt werden. Ein vorzugsweise zu verwendendes Oxidationsmittel stellt, ohne auf dieses beschränkt zu sein, Osmiumtetroxid dar. Bevorzugte Oxidationsmittel, wie z.B. Osmiumtetroxid, können katalytische Mengen des Oxidationsmittels in Anwesenheit eines Regenerierungsmittels erfordern. Beispiele für derartige Regenerierungsmittel stellen
4-Methylmorpholin-N-Oxid und Trimethylamin-N-Oxid dar. Insbesondere ist 4-Methylmorpholin-N-Oxid vorteilhaft als Regenerierungsmittel einzusetzen. In einer nachfolgenden Halogenierungsreaktion wird das resultierende Diol unter Verwendung eines Halogenierungsmittels in Gegenwart einer organischen Säure in einen halogenierten Ester überführt. So können z.B. HBr und HCl als Halogenierungsmittel verwendet werden. Bevorzugte organische Säuren sind z.B. Essigsäure und Propionsäure. Der resultierende halogenierte Ester wird nachfolgend mit einem basischen, den Ester hydrolisierenden Reagenz umgesetzt, um das gewünschte Epoxid zu erhalten. Bevorzugte Mittel zur Hydrolyse der Ester stellen Metallalkoxide und Metallhydroxide dar, ohne hierauf beschränkt zu sein. Vorzugsweise zu verwendende Metall-alkoxide sind Natriummethoxid-ethoxid, -isopropyl-Oxid und -pentoxid. Ein bevorzugtes Metallhydroxid ist Natriumhydroxid.
Die Endstufe des erfindungsgemässen Verfahrens ist die Herstellung der gewünschten erfindungsgemässen Verbindung aus einem den Kembaustein enthaltenden Epoxid, synthetisiert in der oben beschriebenen Reaktionsfolge. Die Endstufe kann nach einem von zwei bevorzugten Verfahren durchgeführt werden. Gemäss einem ersten Verfahren wird das die Kernbaueinheit enthaltende Epoxid in Anwesenheit eines substituierten oder unsubstituierten Amins erhitzt, welches funktionelle Gruppen aufweist, die in der endgültigen erfindungsgemässen Verbindung vorliegen. Bevorzugte funktionelle Gruppen der Amine sind oben dargelegt.
Ein zweites Verfahren besteht in der Reaktion der unsubstituierten oder substituierten Amine mit dem den Kernbaustein enthaltenden Epoxid und einem Reaktionsaktivator in einem Lösungsmittel. Als Reaktionsaktivator beispielsweise zu verwenden ist Lithiumperchlorat. Bevorzugte Lösungsmittel sind oben offenbart.
Vorzugsweise zu verwendende Verbindungen der Erfindung schliessen beispielsweise sowohl R- und
5-Enatiomerer und racemische Mischungen der folgenden Verbindungen ein:
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Verbindung Nr. Verbindung
1 N-(9-Octylamino-8-hydroxynonyl)phtalimid
2 N-(11-0ctylamino-10-hydroxyundecyl)homophthalimid
3 1-(5-Hydroxy-6-(N-benzyl)aminohexyl)-3-methylbenzoylenharnstoff
"'XO ^
c^>TS^ OH H
4 3-(11,10-Oxidoundecyl)chinazolin-4(3H)-on
H OH
5 N2-(5-Hydroxy-6-(N3-propyl)aminohexyl)-(N1-propyl)glutarsäure
H OH
io
6 2-(11-Octylamino-10-hydroxyundecylcarboxamido)-octylcarboxamidobenzol
7 1-Octylamino-2,11-undecadiol
M OH
8 1 -(9-Octylamino-8-hydroxynonyl)-3-methylxanthin
9 H
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9 1 -(9-T etradecylamino-8-hydroxynonyl)-3-methylxanthin
9 H
10 1-(11-Octylamino-10-hydroxyundecyl)-3-methylxanthin rr-™^54
CHj
11 7-(11 -Octylamino-10-hydroxyundecyl)-1,3-dimethylxanthin
Oh h
0 c
XX*
CH,
12 1-(11,10-Octylamino-10-hydroxyundecyl)-1-methyl-2,4-dioxotetrahydropteridin o
* ÖH
13 1 -(5-Hydroxy-6-(N-benzyl)aminohexyl)-3,7-dimethylxanthin
CH,
14 1 -(5-Hydroxy-6-(N-propyl)aminohexyl)-3,7-dimethylxanthin
» f O CH,
CH,
15 N-(11 -Octylamino-10-hydroxyundecyl)glutarimid
A OH
16 N-(11-Octylamino-10-hydroxyundecyl)-2-piperidon
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17 N-(11 -Octylamino-10-hydroxyundecyl)succinimid
18 2-(11 -Octylamino-10-hydroxyundecyl)-1,3-dimethoxybenzol
OCH,
19 3-(5-Hydroxy-6-(N-propyl)aminohexyl)-1 -methyluracil
CH,
20 3-(9-Octylamino-8-hydroxynonyl)-1 -methyluracil
21 3-(11-Octylamino-10-hydroxyundecyl)-1-methyluracil
22 3-(11-Octylamino-10-hydroxyundecyl)-1-methyldihydrouracil
23 3-(9-Octylamino-8-hydroxynonyl)-1 -methylthymin
CH,
24 3-(5-Hydroxy-6-(N-undecyl)aminohexyl)-1 -methylthymin
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25 3-(11-Octylamino-10-hydroxyundecyl)-1-methylthymin
26 3-(6-Propylamino-5-hydroxhexyl)-1 -methylthymin
27 1 -(8-Hydroxy-9-(N-benzyl)aminononyl)-3,7-dimethylxanthin
CH,
28 1 -(5-Hydroxy-6-(N-octyl)aminohexyl)-3,7-dimethylxanthin h oh o ch,
29 1-(5-Hydroxy-6-(N-(4-phenyl)butyl)aminohexyl)-3,7-dimethylxanthin
<* o c„
» *
o
30 1 -(6-Undecylamino-5-hydroxyhexyl)-3,7-dimethylxanthin h oh h oh o eu.
ch,
31 1-(5-Hydroxy-6-(IM-cyclohexylmethyl)aminohexyl)-3,7-dimethylxanthin
Si ch.
Il i *
32 1-(5-Hydroxy-6-(N-(6-hydroxy)hexyl)aminohexyl)-3,7-dimethylxanthin
MO
st'
A,'
CH,
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33 1 -(5-Hydroxy-6-(N,N-dihexyl)amiriohexyl)-3,7-dimethylxanthin
CH,
34 1-(5-Hydroxy-6-(N-(4-methoxy)benzyl)aminohexyl)-3,7-dimethylxanthiri n,po>^\ i cm,
35 1 -(8-Hydroxy-9-(N-octyl)aminononyl)-3,7-dimethylxanthin
M
36 1 -(5-Hydroxy-6-(N-tetradecyl)aminohexyl)-3,7-dimethylxanthin
H OH o o-oo
CH,
37 1[6-(Cyclopropylmethylamino)-5-hydroxyhexyl)]-3,7-dimethylxanthin h oh o ch,
CH,
38 1 -(6-Decylamino-5-hydroxyhexyl)-3,7-dimethylxanthin
M OH O CH,
CH,
39 1 -(6-Dodecylamino-5-hydroxyhexyl)-3,7-dimethylxanthin
H OH O CH,
>
40 1-(11-Benzylamino-10-hydroxundecyl)-3,7-dimethylxanthin
CH,
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41 1-(9-Decylamino-8-hydroxynonyl)-3,7-dimethylxanthin
42 1 -(9-Dodecylamino-8-hydrononyl)-3,7-dimethylxanthin
43 1-(9-Tetradecylamino-8-hydroxynonyl)-3,7-dimethylxanthin
44 1-(11-Hexylamino-10-hydroxyundecyl)-3,7-dimethylxanthin
45 1-(11-Octylamino-10-hydroxyundecyl)-3,7-dimethylxanthin
46 1 -(6-Allylamino-5-hydroxyhexyl)-3,7-dimethylxanthin
H OH
Q ÇH,
o*"-*—^
i ch,
47 1 -(11 -Allylamino-10-hydroxyundecyl)-3,7-dimethylxanthin
48 1-(6-N-Methyloctadecylamino-5-hydroxyhexyl)-3,7-dimethylxanthin
ÇH, OH
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49 1-(11-Decylamino-10-hydroxyundecyl)-3,7-dimethylxanthin o CH,
50 1-{11-Dodecylamino-10-hydroxyundecyl)-3,7-dimethylxanthin
51 1-(11-Tetradecylamino-10-hydroxyundecyl)-3,7-dimethylxanthin
52 1-[11-(4-Fluorbenzylamino)-10-hydroxyundecyl]-3,7-dimethylxanthin
H OH
O ÇH, CH,
53 1-[11-(4-Trifluormethylbenzylamino)-10-hydroxyundecyl]-3,7-dimethylxanthin
54 1-[11-(3-Diethylaminopropylamino)-10-hydroxyundecyl]-3,7-dimethylxanthin o
55 N,N'-bis[10-yl-9-hydroxydecyl)-3,7-dimethylxanthin]diaminododecan
56 1-(14-Brom-13-hydroxytetradecyl)-3,7-dimethylxarithin o« o en,
CH,
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57 1-[11-(4-Aminobenzylamino)-10-hydroxyundecyl]-3,7-dimethylxanthin
ch,
58 1-[11-(3,4,5-Trimethoxybenzylamino)-10-hydroxyundecyl]-3,7-dimethylxanthin
OCH J CH,
59 1-[11-{3-Butoxypropylamino)10-hydroxyundecyl]-3,7-dimethylxanthin
60 1 -(14-Octylamino-13-hydroxytetradecyl)-3,7-dimethylxarithin
61 1-(11-Propylamino-10-hydroxyundecyl)-3,7-dimethylxanthin
62 1-(11-Undecylamino-10-hydroxyundecyl)-3,7-dimethylxanthin
63 1-(11-Phenylamino-10-hydroxyundecyl)-3,7-dimethylxanthin h oh
CH,
64 N,N-bis[11 -yl-10-hydroxyundecyl)-3,7-dimethylxanthin]-undecylamin
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65 1-(11-Octadecylamino-10-hydroxyundecyl)-3,7-dimethylxanthin
66 1-[9-(N-Methyloctylamino-8-hydroxynonyl)]-3,7-dimethylxanthin
67 1 -(4-Tetradecylamino-3-hydroxybuty)-3,7-dimethylxanthin
68 1 -[9-(2-Hydroxydecyl-1 -amino)nonyl]-3,7-dimethylxanthin
OH H
■3Ò3
CH.
69 1 -(6-Octadecylamino-5-hydroxyhexyl)-3,7-dimethylxanthin
70 1 -[11-(N-Octylacetamido)10-hydroxyundecyl]-3,7-dimethyxanthin
H^O*
71 11-0ctylamino-10-hydroxyundecansäureamid
CH,
H OH
73 2-(11-Octylamino-10-hydroxyundecyl)-N-methylbenzamid
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74 1-(11-(N-Methyl-N-octylamino)-10-hydroxyundecyl)-3,7-dimethylxanthin ch, oh
O CH,
M
ch,
75 11-Octylamino-10-hydroxyundecan
H OH
76 11-Octylamino-10-hydroxyundecansäuremethylester
H OH
77 1-Octylamino-10-hydroxy-11-(N-methylacetamido)undecan
H OH
A. »,
78 11-Octylamino-10-hydroxyundecansäure
79 11-Octylamino-10-hydroxyundecansäure N-methylamid o
80 11-Octylamino-10-hydroxyundecansäure N,N-dimethylamid o
81 N-(11 -Octylamino-10-hydroxyundecyl)diacetamid o
Eine geeignete Formulierung ist abhängig von der Natur der zu behandelnden Störung, der Natur des ausgewählten Medikamentes und der Beurteilung des behandelnden Arztes. Im allgemeinen sind die erfindungsgemässen Verbindungen entweder für Injektionen oder für orale Verabreichung formuliert, obwohl andere Arten der Verabreichung, wie transmuskuläre oder transdermale Arten ebenfalls anwendbar sind. Geeignete Formulierungen für diese Verbindungen sind beispielsweise zu finden in Remington's Pharmaceutical Sciences (letzte Auflage), Mack Publishing Company, Easton, PA.
Die erfindungsgemässen Verbindungen und deren pharmazeutisch verwendbare Salze sind in einem weiten Spektrum von pharmazeutischen Formen anwendbar. Die Herstellung eines pharmazeutisch verwendbaren Salzes ist bestimmt durch die chemische Natur der Verbindung als solche und kann mittels allgemein zugänglicher konventioneller Techniken hergestellt werden. Wird somit ein fester Carrier ver24
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wendet, so kann die Zubereitung tablettiert oder in Hartgelatinekapseln, in Puder- oder Pelletform oder in der Form einer kleinen Tablette oder einer Pastille plaziert werden. Die Menge des festen Carriers kann in weitem Bereich variieren, beträgt jedoch vorzugsweise zwischen ca. 25 mg bis ca. 1 g, wobei die Menge der erfindungsgemässen Verbindung je Dosis zwischen ca. 25 mg bis ca. 1 g für einen Erwachsenen variieren wird. Wird ein flüssiger Carrier verwendet, so erfolgt die Zubereitung in Form eines Sirups, einer Emulsion, einer Weichgelatinekapsel, steriler injizierbarer Flüssigkeit wie einer Ampulle oder einer nichtwässerigen flüssigen Suspension. Liegt die erfindungsgemässe Wirkstoffzusammensetzung in einer Kapsel vor, so ist jede gewöhnliche Einkapselung geeignet, beispielsweise die Verwendung der zuvor genannten Carrier in einer Hartgelatinekapselschale. Liegt das Präparat in Form einer Weichgelatineschalenkapsel vor, so kann jeder pharmazeutische Carrier, der gewöhnlich zur Herstellung von Dispersionen oder Suspensionen in Betracht kommt, z.B. wässerige Harze, Cellulosen, Silikate oder Öle und sind Weichgelatinekapselschalen inkorporiert. Eine Formulierung eines Sirups besteht im allgemeinen aus einer Suspension oder einer Lösung der Verbindung oder eines Salzes derselben in einem flüssigen Carrier (z.B. Ethanol, Polyethylenglykol, Kokosnussöl, Glyzerin oder Wasser) mit einem Geschmacks- oder Farbstoff.
Die Menge der erfindungsgemässen Verbindung, die zur Erzielung eines therapeutischen Effektes bei topischer Verabreichung erforderlich ist, variiert selbstverständlich mit der gewählten Verbindung, der Natur und der Schwere der Krankheit und dem Ermessen des behandelnden Verabreichers. Parenterale Verabreichung schliesst intravenöse, intramuskuläre, subkutane, intranasale, intrarektale, intravaginale oder intraperitoneale Verabreichungen ein. Angemessene Dosierungsformen für derartige Verabreichungen sind mittels konventioneller Techniken herzustellen. Ein typisches parenterales Präparat besteht aus einer Lösung oder einer Suspension der erfindungsgemässen Verbindung oder eines Salzes derselben in einem sterilen oder nichtwässerigen Carrier, wahlweise enthaltend ein parenteral anwendbares Öl, beispielsweise Polyethylenglykol, Polyvinylpyrrolidon, Lecithin, Arachisöl oder Sesamöl. Die Tagesdosis zur Behandlung von Sepsis oder anderen schweren Entzündungen durch parenterale Verabreichung ist geeignet von ca. 0.001 mg/kg bis ca. 40 mg/kg, vorzugsweise zwischen ca. 0.01 mg/kg bis ca. 20 mg/kg einer der erfindungsgemässen Verbindungen oder eines pharmazeutisch verwendbaren Salzes derselben, berechnet als freie Base.
Die erfindungsgemässen Verbindungen können oral verabreicht werden. Bei oraler Verabreichung ist eine Tagesdosis im Bereich von ca. 0,1 mg/kg bis ungefähr 1000 mg/kg pro Tag geeignet. Zur Verabreichung ist eine Dosierung von ca. 0,001 mg/kg bis ca. 40 mg/kg der erfindungsgemässen Verbindung oder eines pharmazeutisch verwendbaren Salzes derselben, berechnet als freie Base, geeignet. Die aktiven Bestandteile können zwischen ein- bis sechsmal je Tag verabreicht werden, was zur Erzielung einer entsprechenden Aktivität ausreichend ist.
Die erfindungsgemässen Verbindungen können durch Inhalation verabreicht werden (z.B. intranasal oder oral). Geeignete Dosierungsformen schliessen ein Aerosol oder einen dosismessenden Inhalationsapparat, hergestellt nach bekannten Verfahren, ein. Die geeignete Tagesdosis liegt zwischen 0,001 mg/kg bis ca. 40 mg/kg der erfindungsgemässen Verbindung oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes derselben, gerechnet als freie Base. Typische Präparate zur Inhalation liegen in Form von Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen vor, die als trockene Pulver oder in Form eines Aerosols unter Verwendung eines herkömmlichen Treibmittels verabreichbar sind.
Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele beschrieben, welche in keiner Weise als die Verbindung einschränkend anzusehen sind.
Beispiel 1
Das vorliegende Beispiel beschreibt die Synthese verschiedener Verbindungen, die als Zwischenprodukte bei der Synthese anderer Verbindungen einsetzbar sind.
1-(8,9-Oxidononyl)-3,7-dimethylxanthin wurde folgendermassen synthetisiert: Eine Mischung von Theobromin (17,64 g, 98 mmol) und Natriumhydrid (2,35 g, 98 mmol) in Dimethylsulfoxid (250 ml) wurden für 15 Minuten gerührt. 9-Brom-1-nonen (20,0 g, 98 mmol) wurden zugefügt und die Mischung für weitere drei Tage gerührt. Die Reaktionsmischung wurde zu Wasser (300 ml) zugegeben und mit Di-chlormethan (4 x 200 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit gesättigter wässeriger Natriumchloridlösung (2 x 150 ml) gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und anschliessend das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde kristallisiert (Dichlormethan-Ether) und ergab 1-(8-Nonenyl)-3,7-dimethylxanthin (24,34 g, 99% Ausbeute) in Form von weissen Kristallen.
Eine Lösung von 1-(8-Nonenyl)-3,7-dimethylxanthin (810 mg, 2,7 mmol), 4-Methylmorpholin-N-Oxid (340 mg, 2,9 mmol) und 2,5% Osmiumtetroxid in t-Butanol (3 Tropfen) in Aceton (20 ml) und Wasser (20 ml) wurden für 24 Stunden gerührt. Eine gesättigte wässerige Natriumdithionitlösung (5 ml) wurde hinzugefügt. Nach 15 Minuten rühren wurde das Reaktionsgemisch mit 25% Ethanol-Dichlormethan (4 x 50 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Der feste Rückstand wurde umkristallisiert (Ethanol-Chloroform) und ergab 1-(8,9-Dihydroxynonyl)-3,7-dimethylxanthin (490 mg, 54% Ausbeute).
Eine Mischung von 1-(8,9-Dihydroxynonyl)-3,7-dimethylxanthin (428 mg, 1,3 mmol) und eine 30pro-zentige Lösung von HBr in Essigsäure (0,8 ml, 3,9 mmol) wurde für 90 Minuten gerührt. Die Lösung
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wurde in eine Mischung von Wasser (10 ml), Natriumbicarbonat (1,35 g) und Dichlormethan (10 ml) gegeben. Nach 10 Minuten unter heftigem Rühren wurden die Schichten getrennt und die wässerige Phase mit Dichlormethan (3x15 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt, was 1-(8-Acetoxy-9-bromnonyl)-3,7-dime-thylxanthin (550 mg, 96% Ausbeute) als gelbes Öl ergab. Ohne weitere Reinigung wurde das Öl in Methanol (5 ml) gelöst und anschliessend eine 1 M Lösung von Natriummethoxid in Methanol (1,4 ml) hinzugefügt. Nach 30 Minuten wurde das Reaktionsgemisch in Wasser (30 ml) gegeben und mit Dichlormethan (3 x 40 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel anschliessend im Vakuum entfernt. Der feste Rückstand wurde umkristallisiert (Dichlormethan-Petrolether) und ergab 1-(8,9-Oxidononyl)-3,7-dimethylxanthin (380 mg, 91% Ausbeute).
1-(5,6-Oxidohexyl)-3,7-dimethylxanthin wurde folgendermassen synthetisiert: Eine Mischung von 1-Bromhexan (10,7 g, 66 mmol), Natriumhydrid (1,85 g, 66 mmol) und Theobromin (11,9 g, 66 mmol) in Dimethylsulfoxid (100 ml) wurden für 43 Stunden gerührt. Die Lösung wurde mit Wasser (200 ml) behandelt und anschliessend mit Dichlormethan (3 x 80 ml) extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden mit Wasser (3 x 100 ml) gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und anschliessend das Lösungsmittel unter Vakuum entfernt, was 1-(5-Hexenyl)-3,7-dimethylxanthin (17 g, 98% Ausbeute) in Form eines weissen Pulvers ergab.
Zu 1-(5-Hexenyl)-3,7-dimethylxanthin (1,07 g, 4,1 mmol) und 4-Methylmorpholin-N-Oxid (1,44 g, 12,3 mmol) in Wasser (20 ml) und Aceton (10 ml) wurde eine 2,5prozentige Lösung von Osmiumtetroxid in t-Butanol (6 Tropfen) zugefügt. Nach 48stündigem Rühren wurde die Mischung mit einer 20pro-zentigen wässerigen Lösung von Natriumdithionit (20 ml) versetzt. Nach 2 Minuten wurde die Mischung mit 25prozentigem Ethanol-Dichlormethan (3 x 30 ml) extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel anschliessend im Vakuum entfernt, was 1-(5,6-Dihydroxyhexyl)-3,7-dimethylxanthin (750 mg, 62% Ausbeute) in Form eines weissen Pulvers ergab.
Zu 1-(5,6-Dihydroxyhexyl)-3,7-dimethylxanthin (1,0 g, 3,38 mmol) wurde eine 30prozentige Lösung von HBr in Essigsäure (3,4 ml) innerhalb von 30 Sekunden zugegeben und anschliessend gerührt, bis der gesamte Feststoff gelöst war (2,5 Stunden). Die Lösung wurde sorgfältig in eine Mischung von Natriumbicarbonat (12 g) und Eiswasser (50 ml) gegeben. Nach Beendigung der C02-Freisetzung wurde die Mischung mit Dichlormethan (3 x 25 ml) extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, was 1-(5-Acetoxy-6-bromohexyl)-3,7-dimethylxanthin (1,3 g, 96% Ausbeute) in Form eines viskosen Öles ergab, welches in Methanol (5 ml) aufgenommen wurde. Eine 1M Lösung von Natriummethoxid in Methanol (3,9 ml) wurde innerhalb von 30 Sekunden zugegeben. Nach 20minütigem Rühren wurde die Lösung mit Wasser (20 ml) versetzt und anschliessend mit Dichlormethan (3 x 15 ml) extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel anschliessend im Vakuum abgetrennt, was 1-(5,6-Oxidohexyl)-3,7-dimethylxanthin (900 mg, 100% Ausbeute) in Form von weissen Kristallen ergab.
3-(5,6-Oxidohexyl)-1-methyluracil wurde folgendermassen synthetisiert: Eine Mischung von Natriumhydrid (86 mg, 3,6 mmol) und I-Methyluracil (500 mg, 4 mmol) in Dimethylsulfoxid (25 ml) wurden für 15 Minuten gerührt und anschliessend 6-Brom-1-Hexen (647 mg, 4 mmol) hinzugefügt. Nach 20stündigem Rühren wurde die Reaktionsmischung in Wasser (50 ml) gegeben und mit 20% Ethanol-Dichlormethan (3 x 50 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit gesättigter wässeriger Natriumchloridlösung (20 ml) gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum abgetrennt, was einen Rückstand ergab, welcher mittels Säulenchromatographie (Kieselgel, Ethylacetat) gereinigt 3-(5-Hexenyl)-1-methyluracil (598 mg, 72% Ausbeute) ergab.
Eine Lösung von 3-(5-Hexenyl)-1-methyluracil (598 mg, 2,9 mmol), 4-Methylmorpholin-N-Oxid (408 mg, 3,5 mmol) und eine 2,5prozentige Lösung von Osmiumtetroxid in t-Butanol (3 Tropfen) in Aceton (15 ml) und Wasser (5 ml) wurden für 3 Tage gerührt. Eine gesättigte wässerige Natriumhydrosulfidlösung (10 ml) wurde hinzugegeben und die Mischung für 15 Minuten gerührt. Wasser (50 ml) wurde hinzugefügt und die Mischung mit 20% Ethanol, Dichlormethan (4 x 40 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel anschliessend im Vakuum abgetrennt, was 3-(5,6-Dihydroxyhexyl)-1-methyluracil (461 mg, 66% Ausbeute) als farbloses Öl ergab.
3-(5,6-Dihydroxyhexyl)-1-Methyluracil (350 mg, 1,4 mmol) wurde mit einer 30prozentigen Lösung von HBr in Essigsäure (0,87 ml, 4,3 mmol) 45 Minuten gerührt. Die Lösung wurde zu einer Mischung von Natriumbicarbonat (1,6 g) Wasser (10 ml) und Dichlormethan (20 ml) hinzugefügt. Nach 15 Minuten unter heftigem Rühren wurden die Phasen getrennt und die wässerige Phase mit Dichlormethan (3 x 40 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel anschliessend im Vakuum abgetrennt, was 3-(5-Acetoxy-6-bromhexyl)-1-methyluracil (500 mg, 100% Ausbeute) ergab. Das hierbei erhaltene Bromacetat wurde in der nächsten Stufe ohne weitere Reinigung eingesetzt. 3-(5-Acetoxy-6-bromhexyl)-1-methyluracil (360 mg, 1,0 mmol) wurden in Methanol (5 ml) gelöst und mit einer Lösung von IM Natriummethoxid in Methanol (1 ml) versetzt. Nach 15minütigem Rühren wurde die Lösung in Wasser (10 ml) gegeben und anschliessend mit Dichlormethan (3 x 30 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel entfernt, was 3-(5,6-Oxidohexyl)-1-methyluracil (150 mg, 67% Ausbeute) in Form eines farblosen Öles ergab.
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3-(5,6-Oxidohexyl)-1-methylthymin wurde folgendermassen synthetisiert: Eine Mischung von Natriumhydrid (343 mg, 14 mmol) und 1-Methylthymin (2,00 g, 14 mmol) in Dimethylsulfoxid (30 ml) wurde für 40 Minuten gerührt und anschliessend 6-Brom-1 -hexen (2,30 g, 14 mmol) hinzugefügt.
Nach 69stündigem Rühren wurde die Reaktionsmischung in Wasser (100 ml) gegeben und anschliessend mit Dichlormethan (4 x 50 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit einer gesättigten wässerigen Natriumchloridlösung (40 ml) gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und anschliessend das Lösungsmittel unter Vakuum entfernt, was einen Rückstand ergab, welcher nach Umkristallisation (Dichlormethan, Ethylether) 3-(5-Hexenyl)-1-methylthymin (2,80 g, 88% Ausbeute) ergab.
Eine Lösung von 3-(5-Hexenyl)-1-methylthymin (2,00 g, 9 mmol), 4-Methylmorpholin-N-Oxid (1,17 mg, 10 mmol) und Osmiumtetroxid (0,15 ml einer 2,5prozentigen Lösung in t-Butanol) in Aceton (15 ml) und Wasser (10 ml) wurde für 20 Stunden gerührt. Eine gesättigte wässerige Natriumhydrosulfitlösung (10 ml) wurde hinzugefügt und nach 15minütigem Rühren das Reaktionsgemisch mit 20% Ethanol-Di-chlormethan (4 x 40 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel anschliessend im Vakuum abgetrennt, was einen festen Rückstand ergab. Der Feststoff wurde umkristallisiert (Ethanol) wonach man 3-(5,6-Dihydroxyhexyl)-1-methylthymin (2,00 g, 89% Ausbeute) erhielt.
3-(5,6-Dihydroxyhexyl)-1-methylthymin (1,65 g, 6,4 mmol) wurde mit einer 30prozentigen Lösung von HBr in Essigsäure (3,8 ml, 19,3 mmol) für 1,5 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde anschliessend zu einer Mischung von Natriumbicarbonat (6,7 g), Wasser (40 ml) und Dichlormethan (50 ml) hinzugefügt. Nach 15minütigem heftigem Rühren wurden die Phasen getrennt und die wässerige Phase anschliessend mit Dichlormethan (2 x 50 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum abgetrennt, was 3-(5-Acetoxy-6-brom-hexyl)-1-methylthymin (2,30 g, 100% Ausbeute) ergab. Bromacetat wurde im nächsten Schritt ohne weitere Reinigung eingesetzt. 3-(5-Acetoxy-6-bromhexyl)-1 -methylthymin (2,30 g, 6,4 mmol) wurde in Methanol (10 ml) gelöst und mit einer Lösung von 1 M Natriummethoxid in Methanol (7 ml) versetzt. Nach 15minütigem Rühren wurde die Lösung in Wasser (60 ml) gegeben und mit 20% Ethanol-Dichlor-methan (2 x 70 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Natriumsulfat getrocknet und die Lösungsmittel im Vakuum abgetrennt, was 3-(5,6-Oxidohexyl)-1-methylthymin (1,30 g, 85% Ausbeute), in Form eines weissen Feststoffes ergab.
3-(5,6-Oxidohexyl)-1-methylbenzoylharnstoff wurde folgendermassen synthetisiert: Eine Lösung von Natriumhydrid (0,76 g, 30 mmol) und Benzoylharnstoff (4,86 g, 30 mmol) in Dimethylsulfoxid (100 ml) wurden für 10 Minuten gerührt und anschliessend Methyliodid (1,87 ml, 30 mmol) hinzugefügt. Nach 14stündigem Rühren wurden 100 ml Wasser hinzugegeben und die Lösung mit Dichlormethan (3 x 100 ml) extrahiert. Die Mischung wurde filtriert und die Dichlormethan-Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet. Nach Abziehen des Lösungsmittels im Vakuum wurde der Rückstand umkristallisiert (Dichlormethan) was 1-Methylbenzoylharnstoff (1,3 g, 25% Ausbeute) als weissen Feststoff ergab.
Eine Lösung von Natriumhydrid (0,17 g, 6,8 mmol) und 1-Methylbenzoylharnstoff (1,07 g, 6,1 mmol) in Dimethylsulfoxid (50 ml) wurde für 10 Minuten gerührt und anschliessend 1-Bromhexen (0,82 ml, 6,8 mmol) hinzugefügt. Nach 14 Stunden wurden 50 ml Wasser hinzugefügt und die Lösung mit Dichlormethan (3 x 30 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit Wasser (3 x 50 ml) gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum abgezogen, was 3-(5-Hexenyl)-1-methylbenzoylharnstoff (1,51 g, 96% Ausbeute) als weissen Feststoff ergab.
Eine Lösung von 3-(5-Hexenyl)-1-methylbenzoylharnstoff (1,5 g, 5,8 mmol), 4-Methylmorpholin-N-Oxid (0,87 g, 7,4 mmol) und Kaliumosmat (IV) Dihydrat (0,021 g, 0,1 mmol) in Aceton (12,5 ml) und Wasser (4 ml) wurden gerührt. Nach 18 Stunden wurde eine 20prozentige wässerige Lösung von Hydrogensulfit (20 ml) hinzugefügt und für 30 Minuten gerührt. Die Lösung wurde mit Dichlormethan (3 x 75 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel unter Vakuum abgetrennt. Der Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie (Kieselgel, 5% Me-thanol-Dichlormethan) gereinigt, was 3-(5,6-Dihydroxyhexyl)-1-methylbenzoylharnstoff (1,59 g, 94% Ausbeute) als weissen Feststoff ergab.
Eine Mischung von 3-(5,6-Dihydroxyhexyl)-1-methylbenzoylharnstoff (0,92 g, 3,1 mmol) in einer 30prozentigen Lösung von HBr in Essigsäure (0,63 ml, 9,3 mmol) wurde für 90 Minuten gerührt. Die Reaktionsmischung wurde in eine Mischung von Natriumbicarbonat (0,78 g, 9,3 mmol), Wasser (20 ml) und Dichlormethan (20 ml) gegeben. Die Phasen wurden separiert und die wässerige Phase mit Dichlormethan (2 x 20 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit Salzwasser (20 ml) gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel unter Vakuum abgezogen, was 3-(5-Acetoxy-6-bromhexyl)-1-methylbenzoylharnstoff (1,2 g, 96% Ausbeute) ergab.
Zu einer 1 M-Lösung von Natriummethoxid in Methanol (3,1 ml) wurde 1 -(5-Acetoxy-6-bromhexyl)-3-methylbenzoylharnstoff (1,17 g, 2,9 mmol) in Methanol (25 ml) innerhalb von 5 Minuten zugegeben. Nach einstündigem Rühren wurden 50 ml Wasser hinzugefügt. Die Lösung wurde mit Dichlormethan (3 x 25 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Natriumsulfat getrocknet und die Lösungsmittel im Vakuum abgetrennt, was 3-(5,6-Oxidohexyl)-1-methylbenzoylharnstoff (0,77 g, 97% Ausbeute) als weissen Feststoff ergab.
1-(5,6-Oxidohexyl)-glutarimid wurde folgendermassen synthetisiert: Eine Mischung von Glutarimid
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(2,00 g, 7,7 mmol) und Natriumhydrid (425 mg, 17,7 mmol) in Dimethylsulfoxid (40 ml) wurde für 20 Minuten gerührt und anschliessend 6-Brom-1-hexen (2,90 g, 17,7 mmol) hinzugefügt. Nach 20stündigem Rühren wurde das Reaktionsgemisch in Wasser (100 ml) gegeben und mit Dichlormethan (4 x 50 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit Wasser (50 ml) gewaschen und anschliessend mit einer gesättigten wässerigen Lösung von NaCI (50 ml) gewaschen. Nach Trockung über Natriumsulfat wurde das Lösungsmittel im Vakuum abgetrennt, was 1-(5-Hexenyl)-glutarimid (2,92 g, 85% Ausbeute) ergab.
Zu einer Lösung von 1-(5-Hexenyl)-glutarimid (360 mg, 3,2 mmol) in Dichlormethan (10 ml) wurde Natriumbicarbonat (2,20 g, 26 mmol) in Wasser (10 ml) mit 50prozentiger m-Chlorperoxybenzoesäure (2,5 g, 7,2 mmol) hinzugefügt. Nach 17stündigem Rühren wurde Natriummetabisulfit (1,7 g, 9,0 mmol) zugefügt und anschliessend 30 Minuten gerührt. Die Mischung wurde mit Dichlormethan (3x10 ml) extrahiert und anschliessend die vereinigten organischen Phasen mit einer gesättigten wässerigen Natri-umbicarbonatlösung (10 ml) gewaschen. Nach Trocknung über Natriumsulfat und Abtrennung des Lösungsmittels unter Vakuum wurde der Rückstand mittels Säulenchromatographie (Kieselgel, 10% Ethanol-Dichlormethan) gereinigt was 1-(5,6-Oxidohexyl)-glutarimid (180 mg, 27% Ausbeute) ergab.
Beispiel 2
Das vorliegende Beispiel beschreibt ein Verfahren zur Synthese von 1-(8-Hydroxy-9-(N-benzyl)amino-noyl)-3,7-dimethylxanthin (Verbindung Nr. 27). Eine Mischung von 1-(8,9-Oxidohexyl)-3,7-dimethylxan-thin (500 mg, 1,6 mmol) aus Beispiel 1 und Benzylamin (2,0 g, 19 mmol) wurden bei 150°C für 4 Stunden erhitzt. Nach Abkühlung auf Raumtemperatur wurde Ether (30 ml) hinzugefügt. Der Niederschlag wurde mit kaltem Ether gewaschen, und ergab die Verbindung Nr. 27 (278 mg, 41% Ausbeute).
Beispiel 3
Dieses Beispiel beschreibt die Synthese von 1-(5-Hydroxy-6-(N-octyl)aminohexyl)-3,7-dimethylxanthin (Verbindung Nr. 28). Eine Mischung von 1-(5,6-Oxidohexyl)-3,7-dimethylxanthin (400 mg, 1,4 mmol) gemäss Beispiel 1 synthetisiert und 1-Octylamin (391 mg, 3 mmol) wurden für 4 Stunden bei 135°C erhitzt. Nach Abkühlung auf Raumtemperatur wurden 15 ml Ether hinzugefügt. Der Niederschlag wurde mehrere Male mit Hexan gewaschen, worauf man Verbindung Nr. 28 (537 mg, 94% Ausbeute) erhielt.
Beispiel 4
Das vorliegende Beispiel beschreibt die Synthese von 1-(5-Hydroxy-6-(N-(4-phenyl)butyl)amino)hexyl)-3,7-dimethylxanthin (Verbindung Nr. 29). Eine Mischung von 1-(5,6-Oxidohexyl)-3,7-dimethylxanthin (300 mg, 1,1 mmol) aus Beispiel 1 und 4-Phenyl-1-butylamin (322 mg, 2,2 mmol) wurden für 70 Minuten bei 130°C erwärmt. Nach Abkühlung auf Raumtemperatur wurde der Rückstand in Dichlormethan (2 ml) gelöst und zu Ether (20 ml) zugegeben. Der Niederschlag wurde mehrere Male mit Hexan gewaschen, was die Verbindung Nr. 29 (280 mg, 60% Ausbeute) ergab.
Beispiel 5
Das vorliegende Beispiel beschreibt die Synthese von 1-(5-Hydroxy-6-(N-undecyl)aminohexyl)-3,7-di-methylxanthin (Verbindung Nr. 30). Eine Mischung von 1-(5,6-Oxidohexyl)-3,7-dimethylxanthin (300 mg, 1,1 mmol) aus Beispiel 1 und 1-Undecylamin (754 mg, 4,4 mmol) wurden für 4 Stunden bei 100°C und anschliessend für eine Stunde bei 130°C erhitzt. Nach Abkühlung auf Raumtemperatur wurden 10 ml Ether hinzugefügt. Der wachsartige Niederschlag wurde mehrere Male mit Hexan gewaschen, was Verbindung Nr. 30 (403 mg, 82% Ausbeute) ergab.
Beispiel 6
Das vorliegende Beispiel beschreibt die Synthese von 1-(5-Hydroxy-6-(N-cyclohexylmethyl)amino-hexyl)-3,7-dimethylxanthin (Verbindung Nr. 31). Eine Mischung von 1-(5,6-Oxidohexyl)-3,7-dimethylxan-thin (300 mg, 1,1 mmol) aus Beispiel 1 und Cyclohexanmethylamin (249 mg, 2,2 mmol) wurden für 5 Stunden bei 100°C und anschliessend für eine Stunde bei 120°C erhitzt. Nach Abkühlung auf Raumtemperatur wurden 7 ml Ether und 10 ml Hexan hinzugefügt. Der Niederschlag wurde mehrere Male mit Hexan gewaschen, was Verbindung Nr. 31 (294 mg, 68% Ausbeute) ergab.
Beispiel 7
Das vorliegende Beispiel beschreibt die Synthese von 1-(5-Hydroxy-6-(N-(6-hydroxy)hexyl)amino-hexyl)-3,7-dimethylxanthin (Verbindung Nr. 32). Eine Mischung von 1-(5,6-Oxidohexyl)-3,7-dimethylxan-thin (300 mg, 1,1 mmol) aus Beispiel 1 und 6-Amino-1-hexanol (754 mg, 2,6 mmol) wurden für 2 Stunden bei 120°C erhitzt. Nach Abkühlung auf Raumtemperatur wurden 20 ml Ether hinzugefügt. Der Nie28
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Beispiel 8
Das vorliegende Beispiel beschreibt die Synthese von 1-(5-Hydroxy-6-(N,N-dihexyl)aminohexyl)-3,7-di-methylxanthin(Verbindung Nr. 33). Eine Mischung von 1-(5,6-Oxidohexyl)-3,7-dimethylxanthin (300 mg, 1,1 mmol) aus Beispiel 1 und Dihexylamin (556 mg, 3,0 mmol) wurden für 5 Stunden bei 135°C und anschliessend für 2 Stunden bei 170°C erhitzt. Nach Abkühlung auf Raumtemperatur wurden 20 ml Pe-trolether hinzugefügt. Nach Abkühlung in einer Gefriermaschine wurde der Niederschlag mehrere Male mit Petrolether gewaschen, worauf man Verbindung Nr. 33 (263 mg, 52% Ausbeute) erhielt.
Beispiel 9
Das vorliegende Beispiel beschreibt die Synthese von 1-(5-Hydroxy-6-(N-(4-methoxy)benzyl)amino-hexyl)-3,7-dimethylxanthin (Verbindung Nr. 34). Eine Mischung von 1-(5,6-Oxidohexyl)-3,7-dimethylxan-thin (300 mg, 1,1 mmol) aus Beispiel 1 und 4-Methoxybenzylamin (0,7 g, 5 mmol) wurden für 4 Stunden bei 100°C erhitzt. Nach Abkühlung auf Raumtemperatur wurden 10 ml Ether hinzugefügt. Der Niederschlag wurde mehrere Male mit Petrolether gewaschen, was Verbindung Nr. 34 (355 mg, 78% Ausbeute) ergab.
Beispiel 10
Das folgende Beispiel beschreibt die Synthese von 3-(5-Hydroxy-6-(N-propyl)aminohexyl)-1 -methyluracil (Verbindung Nr. 19). Eine Mischung von 3-(5,6-Oxidohexyl)-1-methyluracil (100 mg, 0,4 mmol) aus Beispiel 1 und n-Propylamin (10 ml) wurden in einem verschlossenen Druckgefäss bei 80-90°C für 69 Stunden erhitzt. Nach Verflüchtigung des unreagierten n-Propylamins erhielt man ein gelbes Öl, welches in Ether-Dichlormethan kristallisiert, wodurch man Verbindung Nr. 19 (80 mg, 71% Ausbeute) als weissen Feststoff erhielt.
Beispiel 11
Das vorliegende Beispiel beschreibt die Synthese von 3-(5-Hydroxy-6-(N-benzyl)aminohexyl)-1 -methylbenzoylharnstoff (Verbindung Nr. 3). Eine Mischung von 3-(5,6-Oxidohexyl)-1-methylbenzoylharnstoff (0,1 g, 0,4 mmol) aus Beispiel 1 und Benzylamin (0,13 g, 1,2 mmol) wurden unter Argon bei 115"C gerührt. Nach 3 Stunden wurde das überschüssige Benzylamin unter Vakuum abgedampft. Der Rückstand kristallisierte beim Stehen, wodurch man Verbindung Nr. 3 (0,14 g, 93% Ausbeute) als weissen Feststoff erhielt.
Beispiel 12
Das vorliegende Beispiel beschreibt die Synthese von 1-(5-Hydroxy-6-(N-propyl)aminohexyl)-3,7-dime-thylxanthin (Verbindung Nr. 14). Eine Mischung von 1-(5,6-Oxohexyl)-3,7-dimethylxanthin (238 mg, 0,86 mmol) aus Beispiel 1 in n-Propylamin (5 ml) wurden bei 100°C in einem verschlossenen Druckgefäss für 23 Stunden erhitzt. Nach Abkühlung auf 4°C wurde das Druckgefäss geöffnet und überschüssiges n-Propylamin unter Vakuum abgezogen, wodurch man Verbindung Nr. 14 (190 mg, 64 % Ausbeute) als viskoses Öl erhielt.
Beispiel 13
Das vorliegende Beispiel beschreibt die Synthese von 1-(5-Hydroxy-6-(N-benzyl)aminohexyl)-3,7-di-methylxanthin (Verbindung Nr. 13). Eine Mischung von 1-(5,6-Oxidohexyl)-3,7-dimethylxanthin (500 mg, 1,8 mmol) aus Beispiel 1 und Benzylamin (1,7 g, 15,8 mmol) wurden für 4 Stunden bei 150°C erhitzt. Nach Abkühlung auf Raumtemperatur wurden 20 ml Ether hinzugefügt. Der Niederschlag wurde mit kaltem Ether gewaschen, wodurch man Verbindung Nr. 13 (470 mg, 70% Ausbeute) erhielt.
Beispiel 14
Das vorliegende Beispiel beschreibt die Synthese von N2-(5-Hydroxy-6-(N3-Propyl)Aminohexyl)-(N1-Propyl)glutarsäure (Verbindung Nr. 5). Eine Lösung von 1-(5,6-Oxidohexyl)glutarimid (60 mg, 0,3 mmol) aus Beispiel 1 in n-Propylamin (5 ml) wurden bei 80-90°C in einem verschlossenen Druckgefäss für 30 Stunden erhitzt. Unreagiertes n-Propylamin wurde unter Vakuum abgedampft, und der so erhaltene Rückstand mit Ether zerrieben, wodurch man Verbindung Nr. 5 (100 mg, 100% Ausbeute) erhielt.
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Beispiel 15
Das vorliegende Beispiel beschreibt die Synthese von 3-(5-Hydroxy-(N-undecyl)aminohexyl)-1-me-thylthymin (Verbindung Nr. 24). Eine Mischung von 3-(5,6-Oxidohexyl)-1 -methylthymin (250 mg, 1,1 mmol) aus Beispiel 1 und 1-Undecylamin (0,7 ml) wurden für 4 Stunden bei 110°C erhitzt. Nach Abkühlung auf Raumtemperatur wurden Ether (5 ml) und Petrolether (10 ml) hinzugefügt. Nach Abkühlung auf -10°C für 2 Stunden wurde der Niederschlag mehrere Male mit Petrolether gewaschen, worauf man Verbindung Nr. 24 (361 mg, 80% Ausbeute) erhielt.
Beispiel 16
Das vorliegende Beispiel beschreibt die Synthese von 3-(6-Propylamin-5-hydroxyhexyl)-1 -methylthymin (Verbindung Nr. 26). Eine Lösung von 3-(5,6-Oxidohexyl)-1-methylthymin (200 mg, 0,8 mmol) aus Beispiel 1 in n-Propylamin (10 ml) wurden bei 100-105°C in einem verschlossenen Druckgefäss für 24 Stunden erhitzt. Nach Verflüchtigung von unreagiertem n-Propylamin wurde der Rückstand in Ether kristallisiert, wordurch man Verbindung Nr. 26 (162 mg, 68% Ausbeute) erhielt.
Beispiel 17
Das vorliegende Beispiel beschreibt die Synthese von 1-(8-Hydroxy-9-(N-octyl)aminononyl)-3,7-dime-thylxanthin (Verbindung Nr. 35). Eine Mischung von 1-(8,9-Oxidohexyl)-3,7-dimethylxanthin (300 mg, 0,9 mmol) aus Beispiel 1 und Octylamin (1 ml) wurden für 3 Stunden bei 110°C erhitzt. Nach Abkühlung auf Raumtemperatur wurden 10 ml Ether hinzugefügt. Der Niederschlag wurde mehrere Male mit Petrolether gewaschen, wodurch man Verbindung Nr. 35 (342 mg, 85% Ausbeute) erhielt.
Beispiel 18
Das vorliegende Beispiel beschreibt die Synthese von 1-(5-Hydroxy-6-(N-tetradecyl)aminohexyl)-3,7-dimethylxanthin (Verbindung Nr. 36). Eine Mischung von 1-(5,6-Oxohexyl)-3,7-dimethylxanthin (300 mg, 1,1 mmol) aus Beispiel 1 und 1-Tetracylamin (604 mg, 2,8 mmol) wurden für 3 Stunden bei 110°C erhitzt. Nach Abkühlung auf Raumtemperatur wurden 6 ml Ether hinzugefügt. Der Niederschlag wurde mehrere Male mit Petrolether gewaschen, wodurch man Verbindung Nr. 36 (356 mg, 66% Ausbeute) erhielt.
Beispiel 19
Dieses Beispiel beschreibt ein Verfahren zur Synthese von 1-(9-Tetradecylamino-8-hydroxynonyl)-3,7-dimethylxanthin (Verbindung Nr. 43). Eine Mischung von 1-(8,9-Oxidononyl)-3,7-dimethylxanthin (synthetisiert gemäss Beispiel 1, 1,00 g, 3,1 mmol) und wasserfreies Lithiumperchlorat (329 mg, 3,1 mmol) wurden in wasserfreiem Actonitril (30 ml) gerührt. Nach Zugabe von 1-Tetradecylamin (Aldrich, 722 mg, 3,4 mmol) wurde das Reaktionsgemisch bei 60°C für 4 Stunden gerührt. Nach Abkühlung wurden 50 ml Wasser hinzugefügt und das Reaktionsgemisch mit Dichlormethan (3 x 50 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit Wasser (30 ml) und einer gesättigten wässerigen Salzlösung (30 ml) gewaschen und anschliessend über Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum entfernt, was einen weissen Rückstand ergab. Chromatographische Reinigung (neutralaktives II Alumina, Dichlormethan/5% Methanol) des weissen Rückstandes ergab Verbindung Nr. 73 (860 mg, 53% Ausbeute).
Beispiel 20
Dieses Beispiel beschreibt ein Verfahren zur Synthese von Verbindung Nr. 63. Natriumhydrid (95pro-zentig) (1,26 g, 50 mmol) wurde zu einer Lösung von Theobromin (7,2 g, 40 mmol) in Dimethylsulfoxid (300 ml) hinzugefügt. Nach 20minütigem Rühren wurde Undecenylmesylat (7,95 g, 30 mmol) hinzugegeben und nachfolgend für 12 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das auf 70-80°C erwärmte Reaktionsgemisch wurde für weitere 4 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde in einen Scheidetrichter gegeben, der 1 Liter Wasser enthielt, und anschliessend mit Dichlormethan (5 x 200 ml) extrahiert. Die organischen Extrakte wurden vereinigt, mit Wasser (100 ml) und einer Salzlösung (100 ml) gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und unter reduziertem Druck eingeengt. Das erhaltene Rohprodukt wurde anschliessend mittels Flash-Chromatographie über Silikagel mittels eines Eluenten aus 20% Hexan/Dichlormethan gereinigt, was 4,6 g von 1-(10-Undecenyl)-3,7-dimethylxanthin (Ausbeute 46,3%) ergab.
Eine Lösung des oben synthetisierten 1-(10-Undecenyl)-3,7-dimethylxanthins (4,3 g, 13 mmol), 4-Me-thylmorpholin-N-Oxid (1,942 g, 16,6 mmol) und Kaliumosmat-Dihydrat (9,5 mg, 0,026 mmol) in Aceton (45 ml) und Wasser (10 ml) wurden für 6 Stunden gerührt. Eine 20prozentige wässerige Lösung von Natriumsulfit (12 ml) wurde hinzugefügt und nachfolgend für 30 Minuten gerührt. Das Reaktionsgemisch
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wurde mit 25% Ethariol/Dichlormethan (4 x 100 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, unter reduziertem Druck eingeengt und mittels Flash-Chromatographie über Silikagel unter Verwendung von Methanol/5% Dichlormethan als Eluenten gereinigt, wodurch man 3,6 g von 1 -{10,11-Dihydroxyundecanyl)-3,7-dimethylxanthin (Ausbeute 76%) erhielt.
1-(10,11-Dichydroxyundecanyl)-3,7-dimethylxanthin, wie oben synthetisiert (3,6 g, 10 mmol) wurden mit Bromwasserstoff (6,2 ml, 8,4 g einer 30prozentigen Lösung in Essigsäure, 31,1 mmol) für 90 Minuten gerührt. Das Gemisch wurde in einen Kolben gegeben, der 100 ml einer wässerigen Natriumbicar-bonatlösung und 75 ml Dichlormethan enthielt. Nach 10 Minuten unter heftigem Rühren wurden die Phasen getrennt und der wässerige Anteil mit Dichlormethan (3 x 75 ml) gewaschen. Die organischen Phasen wurden vereinigt, über Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt, was 1-(10-Acetoxy-11-bro-moundecanyl)-3,7-dimethylxantin (3,6 g) ergab. Ohne weitere Reinigung wurde das Bromacetat in Methanol (25 ml) aufgenommen und mit einer Lösung von Natriummethoxid (hergestellt aus 0,28 g, 12,2 mmol Natrium und 25 ml Methanol) versetzt. Nach 30 Minuten wurde der grösste Anteil des Lösungsmittels unter reduziertem Druck abgetrennt und der Rückstand mit Dichlormethan (3 x 75 ml) extrahiert. Die organischen Phasen wurden vereinigt, über Magnesiumsulfat getrocknet und unter reduziertem Druck eingeengt, was einen grau-weissen Feststoff ergab, der mittels Säulenchromatographie über Silikagel unter Verwendung von Dichlormethan/3% Methanol als Eluenten gereinigt wurde, wodurch man 2,0 g von 1-(10,11-Oxidoundecanyl)-3,7-dimethylxanthin (Ausbeute 57,5%) erhielt.
Ein Gemisch von 1 -(10,11-Oxidoundecyl)-3,7-dimethylxanthin, wie oben dargestellt (500 mg, 1,4 mmol) und Lithiumperchlorat (Aldrich, 149 mg, 1,4 mmol) wurden in wasserfreiem Acetonitril (Al-drich, 20 ml) gerührt, bis eine homogene Phase erhalten wurde. Anilin (Aldrich, 670 mg, 7,2 mmol) wurde hinzugefügt, das Reaktionsgemisch bei Raumtemperatur für 16 Stunden gerührt und anschliessend für 3 Stunden unter Rückfluss erhitzt. Der Rückstand wurde direkt auf einer Silika-Säule aufgebracht. Die chromatographische Reinigung unter Verwendung eines Dichlormethan/10% Methanol-Gradienten ergab 0,45 g der Verbindung Nr. 63 (73% Ausbeute).
Beispiel 21
Das folgende Beispiel zeigt Daten der proliferativen Aktivität verschiedener erfindungsgemässer Verbindungen zur Induzierung der CMV-Promotoraktivität. Das CMV-Promotor Assay misst die Gentranskriptions- und -translationsaktivität, wobei jede aktive Verbindung zytotoxische Aktivität zur Hemmung der zellulären Proteinsynthese in transformierten (Adenovirus) Zellen aufweist. Jede der Verbindungen wurde getestet, wobei die Daten in Tabelle I aufgeführt sind. Verbindung Nr. 30 zeigte sich als die am meisten zytotoxische der getesteten Verbindungen.
Tabelle I
Verbindung
IC5o(|iM)
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> 500
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> 500
Beispiel 22
Dieses Beispiel zeigt die Effekte von 5 der erfindungsgemässen Verbindungen auf die Hemmung der Mastzellendergranulation durch ein Serotonin-Release-Assay. Dieses Assay stellt ein in vitro-Modell für ein allergie- und asthmatherapeutisches Produkt dar. Tabelle II zeigt die bei 5 der erfindungsgemässen Verbindungen (bezüglich der chemischen Namen und Strukturen siehe unten) erhaltenen Ergebnisse.
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Tabelle II
Verbindung
% Hemmung
Konzentration (nM)
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zu toxisch zu toxisch inaktiv
28% 29%
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Beispiel 23
Dieses Beispiel zeigt Dosis-Wirkungs-Kurven, die zur Ermittlung einer 50% Hemmungskonzentration (ICso) sowohl für Cyclosporin A (CsA, Fig. 1A) und verschiedene erfindungsgemässe Verbindungen (Fig. 1B) auf die Proliferation muriner Thymozyten, kostimuliert durch Concanavalin A (ConA) und Inter-leukin-2 (IL-2), Verwendung finden. Zur Aktivierung von CD3 verwendetes ConA induziert eine T-Zellen-proliferation und Differenzierung. Thymi, erhalten von normalen weiblichen Balb/C Mäusen, wurden abgetrennt und auf einer Platte mit 96 Vertiefungen mit einer Dichte von 2 x 105 Zellen/Vertiefung aufgebracht. ConA (0,25 mg/ml) und IL-2 (15 U/ml) wurden den Vertiefungen hinzugefügt. Die Zellen wurden für 4 Tage bei 37°C inkubiert. Am 4. Tag wurden die Zellen mit tritiiertem Thymidin gepulst und für weitere 4 Stunden inkubiert. Die Menge von durch die so erhaltenen Zellen inkorporiertem tritiiertem Thymidinfarbstoff wurde in einem Flüssigszintillationszähler bestimmt. Wirkstoffdosen (wie in Fig. 1A und 1B gezeigt) wurden 2 Stunden vor der ConA und IL-2 Aktivierung zugefügt. Untergrundzählraten betrugen kleiner als 100 cpm. Sowohl CsA als auch die getesteten erfindungsgemässen Verbindungen inhibieren die Thymozytenproliferation und Aktivierung.
Dieses Beispiel zeigt das therapeutische Potential der erfindungsgemässen Verbindungen bei verschiedenen Autoimmun- und Entzündungskrankheiten durch Vergleich der Potenz (Inhibierungsaktivität) mit zytotoxischen Daten, die unter Verwendung der nachfolgend beschriebenen indikativen Assay-Pro-zedur erhalten wurden. In einem gemischten Lymphozyten-Reaktions-Assay der Verbindungen Nrn. 5, 13, 26 und 27 zeigt eine Zwei-Wege gemischte Lymphozytenreaktion eine proliferative PMBC-Antwort auf allogene Stimulation. Die Verbindung Nrn. 5 und 26 zeigen die geringste Assay-Aktivität in diesem spezifischen immunmodulierenden Aktivitätsassay, mit IC50 Werten oberhalb 250 jiM, wie in Fig. 2A und 2B gezeigt. Beide Verbindungen Nrn. 27 und 13 zeigen in diesem Assay eine Dosis-Wirkungs-Aktivität, mit IC5o-Werten von 40 bzw. 55 nM, wie in Fig. 2C gezeigt.
Fig. 2D zeigt ein Balkendiagramm von ICso-Werten von 5 erfindungsgemässen Verbindungen (bezüglich entsprechender chemischer Namen siehe oben) in einem gemischten Lymphozyt-Assay, der die Im-munsuppressionsaktivität der Verbindungen misst. Die Verbindung Nr. 27 zeigte keine signifikante Suppressionsaktivität. Verbindung Nr. 28 erwies sich als die potenteste Verbindung der im Assay getesteten.
Die prozentuale Zell-Lebensfähigkeit in einer gemischten Lymphozytenreaktion-Assay-Kultur wurde nach 6 Tagen der Kultivierung bestimmt. Fig. 2E zeigt als Balkendiagramm die prozentuale Lebensfähigkeit. Nicht Wirkstoffen ausgesetzte Kontrollzellen sind allgemein unter diesen Kulturbedingungen 78-85% lebensfähiger. In diesem Assay lagen alle erfindungsgemässen Verbindungen in einer Konzentration von 100 nM vor, im allgemeinen deutlich oberhalb der entsprechenden ICso-Werte in diesem Assay (siehe Fig. 2D). Die potenteste Verbindung, Verbindung Nr. 28, war zugleich die zytotoxischste bei 100 nM, diese Konzentration liegt jedoch deutlich oberhalb des ICso-Wertes, weshalb ein signifikanter therapeutischer Bereich anzunehmen ist. Die Verbindungen Nrn. 13 und 27 zeigten geringe oder keine Zytotoxizität bei Konzentrationen deutlich oberhalb ihrer entsprechenden ICso-Werte.
10 weitere Vertreter der erfindungsgemässen Verbindungen, die eindrückliche biologische Aktivitäten zeigen, wurden in einer Prozedur, vergleichbar der in Beispiel 21 angewandten, getestet. ICso-Werte der getesteten erfindungsgemässen Verbindungen wurden, wie oben beschrieben, in dem Thymozyten ConA/IL-2 Co-Stimulations-Assay erhalten. 50% Letaldosis-Konzentrationen (LD50) für diese 10 Verbindungen wurden mittels des nachfolgenden Zytotoxizitäts-Assay erhalten.
Aus menschlichem Knochenmark erhaltene Stromal-Zellen (frühe Passage) wurden mit 104 Zellen/ Probe ausgebreitet und ermöglicht eine Konfluenz 3 Tage nach erneuter Nährstoffzufuhr zu erreichen. Die Stromal-Zellen wurden mit den erfindungsgemässen Verbindungen für zwei Stunden vor dem Waschen behandelt und mittels eines lebensverträglichen Farbstoffes, BCECF, anhand ihrer Fluoreszenz analysiert. Die höchste verwendete Konzentration betrug 50 nM (ein LDso-Wert grösser als 50 jiM würde dementsprechend keinen Effekt bei 50 fiM anzeigen). Fig. 2F zeigt Ergebnisse, die sowohl von dem Thymozyten-Co-Stimulations-Assay (ICso-Werte) und dem Zytotoxizitäts-Assay (ID50) der erfindungsge-
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mässen Verbindung Nrn.: 10, 35, 39, 42, 43, 45, 49, 50, 51 und 60 erhalten wurden. Wie zu sehen ist, sind die meisten der Verbindungen bezüglich Stromal-Zellen nicht zytotoxisch und sind sehr wirksame Proliferationsinhibitoren in dem Thymozyten-IL-2-Co-Stimulations-Assay.
Beispiel 25
Dieses Beispiel zeigt die Effekte verschiedener erfindungsgemässer Verbindungen, die hemmende Effekte auf die murine Thymozytenproliferation zeigen. Die gezeigten und diskutierten Daten lassen darauf schliessen, dass die erfindungsgemässen Verbindungen über einen zuvor unbekannten Mechanismus wirken. Im ersten Teil dieses Beispiels zeigten die Verbindungen Nrn. 30, 33, 28 und 27 (bezüglich der chemischen Namen und Strukturen siehe oben) eine wirksame Hemmung der murinen Thymozytenproliferation, die durch ConA und lnterleukin-1 alpha (IL-1 a) stimuliert sind. Die Verbindung Nrn. 30, 33, 28 und 27 wurden zwei Stunden vor der Aktivierung mit ConA und IL-1 a in einer Thymozyten-Co-Stimulationsprozedur, ähnlich der in Beispiel 21 gezeigten, zu den Zellkulturen gegeben. Sämtliche in dem Assay getesteten Verbindungen zeigten gemäss des Dosis-Wirkungs-Prinzips inhibierende Eigenschaften und Dosis-Wirkungskurven für jede der Verbindungen wurden ermittelt. ICso-Werte, die für jede der getesteten erfindungsgemässen Verbindung bestimmt wurden, sind wie folgt: Verbindung Nr. 30 weist einen ICso von 0,94 nM auf, Verbindung Nr. 33 einen ICso von 8,6 nM, Verbindung Nr. 28 einen ICso von 4,6 *iM und Verbindung Nr. 27 einen ICso von weniger als 12,5 nM. Untergrundzählraten in dem Assay betrugen weniger als 200 cpm.
Die aus ergänzenden Untersuchungen erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass die erfindungsgemässen Verbindungen unterschiedliche immunosupressive Mechanismen nutzen als die bekannten Mechanismen der zwei vielfach untersuchten Immunosupressoren CsA und oder FK506. In einem proliferativen Assay wurden Mäusethymozyten über Nacht mit ConA (in einem «Priming-Schritt») präinkubiert, gewaschen und mit IL-2 in Abwesenheit der erfindungsgemässen Verbindungen restimuliert. Nach 4 Tagen wurden die Zellen mit tritiiertem Thymidin gepulst und eine Inkubation für weitere 4 Stunden ermöglicht. Die Zellen wurden entnommen und der von den entnommenen Zellen inkorporierte Gehalt von tritiiertem Thymidin mittels eines Flüssigszintillationszählers bestimmt. Fig. 3A zeigt die erhaltenen Ergebnisse. In Kontrollzellen «primt» eine Präinkubation mit ConA Thymozyten durch Stimulierung des CD3 Rezeptors in einer Weise ähnlich der Antigen-Erkennung. Untersuchungen haben gezeigt, dass CD3-Anti-körper durch ConA ersetzt werden können. Wird nachfolgend IL-2 zugegeben, so proliferieren die Thymozytenzellen. Während der ConA Inkubation zugegebenes CsA, als «Primer» wirkend, inhibierte die Thymozytenproliferation als Antwort auf die IL-2 Stimulation. Wurden jedoch die Thymozyten mit ConA und der erfindungsgemässen Verbindung Nr. 35 präinkubiert, fand ein «Primen» statt, wie sich durch die nachfolgend beobachtete, normale Thymozytenproliferation als Antwort auf die IL-2 Stimulation zeigt (Fig. 3). Die erfindungsgemässen Verbindungen hemmen nicht die Proliferation durch Überlagerung mit diesem «Priming-Schritt», der für die nachfolgende Proliferation als Antwort auf die IL-2 Stimulation notwendig ist.
Darüber hinaus wurden die Zellen über Nacht mit ConA präinkubiert, gewaschen und mit IL-2 (mit oder ohne Zugabe von CsA oder der erfindungsgemässen Verbindung) stimuliert. Am 4. Tag wurden die Zellen mit tritiiertem Thymidin gepulst und für weitere vier Stunden eine Inkubation erstattet. Die Zellen wurden entnommen und die Menge an inkorporiertem tritiiertem Thymidin in einem Flüssigszintil-lationszähler bestimmt. Mit ConA vorbehandelte Zellen proliferieren als Antwort auf eine IL-2 Addition. Fig. 3B zeigt in diesen Assays erhaltene Ergebnisse. CsA (50 nM) zeigte eine sehr geringe Inhibition der Thymozytenproliferation (angezeigt durch die Menge von inkorporiertem registriertem Farbstoff). In scharfem Kontrast hierzu inhibierte die erfindungsgemässe Verbindung Nr. 35 (bei weit geringeren Konzentrationen, 1 jiM) dramatisch die Thymozytenprolifertion.
Zusammenfassend lassen diese Experimente darauf schliessen, dass CsA und FK506 (CD3 in ähnlicher Weise inhibierend) im Vergleich zu den erfindungsgemässen Verbindungen einen unterschiedlichen Wirkungsmechanismus aufweisen. CsA inhibiert, im Gegensatz zu den erfindungsgemässen Verbindungen, ConA. Die erfindungsgemässen Verbindungen inhibieren die IL-2 Stimulation, CsA dagegen nicht. Die gezeigten Ergebnisse weisen darauf hin, dass die erfindungsgemässen Verbindungen bei der Reduzierung oder Vorbeugung von Nebeneffekten bei Bedingungen, die zelluläre Stimulanzien erfordern, nützlich sind.
Beispiel 26
Dies Beispiel zeigt den inhibierenden Effekt der Verbindung Nr. 27 und 28 auf murine Splenozyten-proliferation, die durch anti-Mu (10 mg/ml) und lnterleukin-4 (IL-4, 12,5 ng/ml) stimuliert ist. Dieses in vi-tro-Assay, wie oben beschrieben, weist auf ein Immunsupressiv/Autoimmun-Behandlungs-Assay, betonend die humorale oder B-Zellen Immunantwort. Die erfindungsgemässe Verbindung wurde zu den Zellen in der erforderlichen Dosis zwei Stunden vor der Aktivierung mit anti-Mu und IL-4 hinzugefügt. Beide Verbindungen Nr. 27 und 28 hemmten die Splenozytenproliferation nach Art einer Dosis-Wirkung-Beziehung. ICso-Werte für die Verbindung Nrn. 27 und 28 betrugen 3,3 fiM und 5,2 nM, wie in Fig. 4 gezeigt. Untergrundzählraten betrugen weniger als 200 cpm.
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Beispiel 27
Diese Untersuchung zeigt die IL-2 (Alpha-Kette CD25) Rezeptorexpression auf Mäusesplenozyten. Der IL-2 Rezeptor wurde auf ruhenden T-Zellen nicht expremiert, aber wird durch bestimmte Stimulanzien wie z.B. Antigen-Erkennung oder Behandlung mit ConA oder Antikörpern zu CD3 (anti-CD3) schnell induziert. IL-2 abhängige Proliferation erfordert IL-2 eine Rezeptorexpression. Splenozyten wurden durch anti-DC3 Antikörper (10 ng/ml) mit oder ohne Zugabe von CsA (20 nM) oder Verbindung Nr. 49 (1 nM) stimuliert. Nachfolgend zu einer Inkubation über Nacht wurden die Splenozyten mit einem fluo-reszinbehandelten anti-IL-2 Rezeptor Antikörper versehen und die Fluoreszenz mittels Fluss-Zytometrie gemessen. Fig. 5A und 5B stellen Häufigkeitshistogramme von Messungen mit 20.000 Zellen je Probe dar. Das Kontrollmedium weist einen niedrigen Fluoreszenzlevel auf, während die Stimulation mit anti-CD3 einen grossen relativen Anstieg in der IL-2 Rezeptorexpression (mit anti-CD3 bezeichneter Peak in Figs. 5A und 5B) stimuliert. Co-Inkubation mit CsA inhibiert CD3-stimuiierte IL-2 Rezeptorexpression, wohingegen eine Inkubation mit der erfindungsgemässen Verbindung Nr. 49 bei einer Konzentration, die 90 % der Splenozyten IL-2 stimulierten Proliferation blockiert, keinen Effekt auf die Rezeptorexpression hat. Diese Daten bestätigen, dass CsA und die Verbindung Nr. 49 Immunzellen durch unterschiedliche Mechanismen beeinflussen.
Beispiel 28
Dies Beispiel zeigt, dass die Verbindungen Nrn. 49 und 50 nicht die Produktion von IL-2 in murinen Thymozyten hemmen, im Gegensatz zu dem Effekt von CsA. Thymozyten wurden mit ConA und IL-1 für vier Tage mit oder ohne Zugabe der erfindungsgemässen Verbindungen zu den Kulturmedien stimuliert. Die Überstände wurden entfernt und mittels ELISA auf IL-2 Gehalte in einer kommerziell erhältlichen Anordnung getestet. Die Ergebnisse, siehe Fig. 6, zeigen, dass die CsA Inkubation bei 20nM die IL-2 Produktion und Sekretion hemmt. Ebenso ist gezeigt, dass die getesteten exemplarischen erfindungsgemässen Verbindungen IL-2 nicht inhibieren. Diese Daten zeigen, dass CsA und die getesteten erfindungsgemässen Verbindungen mit der Immunzellenfunktion über unterschiedliche Mechanismen wechselwirken.
Beispiel 29
Dies Beispiel zeigt die Aktivität der stellvertretenden erfindungsgemässen Verbindungen Nrn. 27, 49, 50, 45, 43 oder 41 (siehe oben) in Assays, die die Aktivität als Antwort auf zelluläre Reize detektieren. Ein Assay, murine Lymphknoten-Zellproliferation (durch Antigene stimuliert), wurde benutzt, um die inhibierende Aktivität der Verbindung Nr. 27 auf die Proliferation der Lymphknotenzellen zu bestimmen. Dieses in vitro-Assay ist ein immunsupressives/autoimmunes Behandlungs-Vorhersage-Assay unter Betonung der zellulären oder T-Zellen Immunantwort. Das Assay benutzt murine T-Zellen, die in vitro in Antwort auf ein lösliches Proteinantigen proliferieren, benutzt zur Vorbehandlung der T-Zellen in vivo. Die Verbindung wurde zu den Zellen in Dosen, wie den Fig. 7 und 8 (die Assay-Ergebnisse zeigen) zu entnehmen, zwei Stunden vor der Aktivierung mit Alloantigen hinzugefügt. Verbindung Nr. 27 inhibierte die T-Zellenproliferation in Art und Weise einer Dosis-Wirkungsbeziehung. ICso-Werte für die Verbindung Nr. 27 waren 23,1 nM in einem ersten Experiment (Ergebnisse siehe Fig. 7) und 19 jiM für ein zweites Experiment (Ergebnisse siehe Fig. 8).
Ein weiteres Assay in diesem Beispiel wird zur Bestimmung der inhibierenden Aktivität der erfindungsgemässen Verbindungen bei direkt IL-2-induzierter Proliferation in einer murinen zytotoxischen T-Zell-Linie, CT6 benutzt. Die CT6 Zell-Linie ist eine IL-2 abhängige Zell-Linie. IL-2 wurde von dem Medium für 24 Stunden vor der Stimulation entfernt. Eine Stunde vor der IL-2 Stimulation wurden entweder CsA oder die Verbindungen Nrn. 49, 50, 45, 43 oder 41 in verschiedenen Konzentrationen zugegeben. Die Zellen wurden mit IL-2 stimuliert und die Menge von inkorporiertem tritiierten Thymidin wurde 48 Stunden später gemessen. Untergrundzählraten betrugen weniger als 5000 cpm. Assay-Ergebnisse sind graphisch in den Fig. 9A und 9B dargestellt. Die zwei Graphen zeigen, dass CsA und die erfindungsgemässen Verbindungen divergierende Effekte auf die IL-2 induzierte Proliferation zeigen. CsA inhibierte die Proliferation, selbst bei sehr hohen Konzentrationen nicht. In besonderem Gegensatz hierzu inhibierten die erfindungsgemässen Verbindungen direkt die IL-2 induzierte CT6 Proliferation.
Beispiel 30
Dieses Beispiel zeigt die Effekte einer Referenzverbindung «X» und der erfindungsgemässen Verbindungen Nrn. 29, 30, 31, 32 und 33 (bezüglich der Namen und Strukturen siehe oben) auf das Hefewachstum (Saccharomyces cervisiae) - bei Konzentrationen von 100 nM - im Vergleich mit der Hefeaktivität in Abwesenheit von jeglicher zugegebener Verbindung (Kontrollmessung). Dieses Assay misst die gegen Hefe und Pilze gerichtete Aktivität der getesteten erfindungsgemässen Verbindungen. Wie in Fig. 10 gezeigt, zeigen die Verbindungen Nrn. 30 und 33 eine das Hefewachstum hemmende Aktivität,
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was anzeigt, dass die getesteten erfindungsgemässen Verbindungen topische und systemische antimi-krobielle Verbindungen darstellen.
Beispiel 31
Dieses Beispiel zeigt eine potentielle antigenspezifische Anergie-Induktion der erfindungsgemässen Verbindungen. Anergie stellt einen anhaltenden Zustand der T-Zellen-«Unansprechbarkeit» aufgrund der T-Zellen Antigen-Erkennung (ohne Co-Stimulation) oder einer induzierten Blockade der Proliferation dar. Diese spätere T-Zellen-Anergie kann auftauchen, wenn das T-Zellen-Proliferationsvermögen als Antwort auf IL-2 durch ein Agens blockiert ist. Anergie ist allgemein als ein Typ von Toleranz auf eine Antigen-Aktivierung aufzufassen. Daher stellt in vitro-Anergie ein Mittel zur Vorhersage von in vivo toleranzsteigernden Agentien dar. Toleranz ist bei der Verhinderung von Organabstossungen bei Transplantationen von Bedeutung, ebenso bei anderen Autoimmunerkrankungen, wie Skleroderma, rheumatoide Arthritis, Lupus und diabetesverwandter Autoimmunität.
Ein B-Zellen-Tumor 2PK3 (H-2d) wurde als eine stimulierende Zelle für C57BL/6 Splenozyten (H-2b) als reizantwortende Zelle benutzt. Gemischte Kulturen von B-Zellen-Tumor und Splenozyten wurden für 5 Tage mit und ohne 1 jiM der Verbindung Nr. 45 inkubiert. Nach 5 Tagen wurden die Zellen gewaschen und entweder mit Medium, dem ursprünglichen Antigen (2PK3) oder anti-CD3 resuspendiert. Tri-tiiertes Thymidin wurde zu der resultierenden Suspension hinzugegeben und die Thymidininkorporation 24 Stunden später gemessen (Ergebnisse siehe Fig. 11). Wie gezeigt, zeigen mit der erfindungsgemässen Verbindung Nr. 45 behandelte Zellkulturen und unbehandelte Kulturen äquivalente Reizantworten auf anti-CD3. Kulturen, die mit der Verbindung Nr. 45 für 5 Tage inkubiert wurden, zeigen eine abgeschwächte Antwort auf das primäre Antigen 2PK3. Daher wurden C57BL/6 Splenozyten in ihrer Reizantwort auf ein ursprüngliches Antigen durch die erfindungsgemässe Verbindung, welche in dem Präinkubationsschritt verwendet wurde, gehemmt. Eine normale Antwort der Kultur auf eine anti-CD3 Stimulation lässt jedoch darauf schliessen, dass die erfindungsgemässen Verbindungen eine antigenspezifische Anergie-Induktion erfindungsgemässen Zellen zeigten.
Beispiel 32
Dieses Beispiel zeigt hemmende Effekte der erfindungsgemässen Verbindungen auf humane Stro-mal- und Balb/3T3-Zellproliferation in Antwort auf eine PDGF-Stimulation. Dieses Assay ist geeignet zur Vorhersage therapeutischer Aktivität zur Vorbeugung oder Behandlung von Restenose, Atherosklerose und koronaren Arterienkrankheiten. Humane Stromalzellen wurden in serumfreien Medien für einen Tag behandelt und anschliessend mit 50 ng/ml PDGF-BB stimuliert. Die erfindungsgemässen Verbindungen wurden in unterschiedlichen Konzentrationen eine Stunde vor der PDGF-Stimulation zugegeben. PDGF und tritiiertes Thymidin wurden zugefügt und den Zellen für einen Tag ermöglicht zu inkubieren, gefolgt von einer Zugabe von PDGF und Thymidin. Nach 24 Stunden wurden die Zellen entnommen und mittels Flüssigszintillationszählungen gezählt. Ergebnisse für die Verbindungen Nrn. 28, 30, 31, 33 und 29 sind in Fig. 12 gezeigt. Untergrundzählraten (d.h. behandelte Zellen) betrugen ungefähr 1% des Kon-trollevels. Die Ergebnisse zeigen, dass die Wirkstoffe in diesem prädiktiven in vitro-Modell mit ICso-Wer-ten (in jiM) von 0,9; 3,2; 40; > 50 und > 50 für die Verbindungen Nrn. 30, 28, 29, 32 und 31 aktiv sind.
In Verbindung mit dem Human-Stromalzellen/PDGF Stimulations-Assay wurde ebenfalls die Zytotoxizität der getesteten erfindungsgemässen Verbindungen auf Stromalzellen bestimmt. Fig. 13 zeigt Ergebnisse für dieses Zytotoxizitäts-Assay. Lediglich Vebindung Nr. 30, welche die am stärksten hervortretende Hemmungsaktivität der getesteten Verbindungen zeigt, zeigt zytotoxische Effekte bei Konzentrationen oberhalb 0,9 nM als ICso-Wert.
In einem Assay, welches den inhibierenden Effekt in einer PDGF/IL-I Co-Stimulation misst, das heisst einem Proliferations-Assay, zeigt eine Gruppe der erfindungsgemässen Verbindung inhibierende Eigenschaften. Das PDGF/IL-1 Assay ist nützlich bei der Messung der in vitro-Aktivität, hinweisend auf ein therapeutisches Potential zur Behandlung oder Vorbeugung von Restenose und Reperfusion. Die Fig. 14 zeigt als Balkendiagramm ICso-Ergebnisse für eine Gruppe der erfindungsgemässen Verbindungen Nrn. 27, 28, 32, 30, 31, 32 und 34. In diesem Vorhersage-in vitro-Modell zeigen die Verbindungen Nrn. 28 und 30 eine wirksame Inhibierungsaktivität, die auf eine therapeutische Anwendung bei Resto-nose und Reperfusion schliessen lässt.
Die erfindungsgemässen Verbindungen besitzen inhibitorische Effekte auf PDGF-induzierte Proliferation von Balb/3T3-Zellen. Balb/3T3-Zellen reagieren heftig auf eine PDGF-Stimulation und sind in in vitro-Mo-dellen für weitere Studien der PDGF-induzierten Proliferation nützlich. Eine disregulierte PDGF-prolifera-tive Antwort wurde mit einer Vielzahl von Erkrankungen verbunden, einschliesslich zum Beispiel Restenose, Atherosklerose, Fibrosis und Tumorzellenangiogenese. Die Zellen wurden in einem wenig Serum enthaltenden Medium für 24 Stunden vor der Stimulation mit unterschiedlichen Konzentrationen der erfindungsgemässen Verbindung Nr. 45 behandelt. PDGF-BB wurde konstant in einer 10 fiM Konzentration zugefügt. Tritiiertes Thymidin wurde hinzugefügt und die Zellen zur Szintillationszählung 24 Stunden später entnommen. Fig. 15 zeigt eine Dosis-Wirkungskurve dieses Assays, einschliesslich einem ICso-Wert von ungefähr 0.08 nM, welcher die inhibitorische Aktivität der getesteten Verbindung veranschaulicht.
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Beispiel 33
In den oben beschriebenen und ähnlich den in Beispiel 32 verwendeten Assays sowie in anderen Beispielen wurde das Vermögen verschiedener erfindungsgemässer Verbindungen auf die Unterdrük-kung muriner Thymozyten und Balb/3T3-Zellen-Proliferation als Antwort auf ausgewählte Reize untersucht. In einem murinen Thymozyten ConA/IL-2 Co-Stimulationsassay gemäss Beispiel 23 wurden ICso-Werte für die erfindungsgemässen Verbindungen Nrn. 13, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 5 und 26 erhalten. Fig. 16 zeigt vergleichende Ergebnisse für verschiedene der getesteten Verbindungen in diesem in vi-tro-Modell. Die Verbindungen Nrn. 28, 30 und 27 zeigen die wirksamsten immunsupressiven Effekte in diesen in vitro-Modellen.
In einer weiteren Untersuchung ähnlich dem Balb/3T3 Proliferationsassay von Beispiel 32 wurden IC50 und IDso-Werte der erfindungsgemässen Verbindungen Nrn. 70, 45, 59 und 58 bestimmt. LD50-Werte wurden mittels eines zytotoxischen Assay, wie in Beispiel 32, bestimmt. In diesen Assays wurden Balb/3T3-Zellen, die mit PDGF stimuliert und mit einer der oben genannten erfindungsgemässen Verbindungen in identischer Weise zu der oben genannten tritiierten Thymidinprozedur behandelt wurden, anstatt mit einem Farbstoff BCECF mit einem fluoreszierenden Farbstoff inkubiert. Die Fluoreszenz wurde mittels eines Fluoreszenz-Platten-Lesers gemessen. Die höchste verwendete Konzentration betrug 50 nM, daher zeigt ein LDso-Wert grösser als 50 nM keinen Effekt bei 50 nM an. Abbildung 17 zeigt Assay-Ergebnisse durch Vergleich von LCso-Werten gegen LDso-Werten für getestete erfindungsgemässe Verbindungen. Die meisten der getesteten Verbindungen waren nicht zytotoxisch, jedoch signifikante Inhibitoren der Proliferation.
Beispiel 34
Dieses Beispiel vergleicht zytotoxische Ergebnisse der erfindungsgemässen Verbindung Nr. 27 für transformierte Zellen und nicht-transformierte Zellen. In transformierten Zellen (Ras 3T3) und in normalen 3T3-Zellen wurde die Zytotoxizität der Verbindung Nr. 27 bei Konzentrationen von 1, 10 und 100 nM bestimmt. Fig. 18 zeigt mit diesem Assay erhaltene Ergebnisse. Bei jeder der oben genannten Konzentrationen erwies sich Verbindung Nr. 27 für Krebszellen stärker zytotoxisch als für normale Zellen. Diese Ergebnisse zeigen, dass die getesteten Verbindungen unterschiedliche Toxizität für Tumorzellen aufweisen, was eine potentielle Einsetzbarkeit bei der chemotherapeutischen Krebsbehandlung anzeigt.
Beispiel 35
Dieses Beispiel demonstriert einen inhibierenden Effekt auf die Proliferation der erfindungsgemässen Verbindung Nr. 58. Ein Assay wurde zur Untersuchung von Effekten der PDGF-induzierten Proliferation auf menschliche aortische glatte Muskelzellen (aortische SMC) eingesetzt. Zellen, bezogen von einem kommerziellen Anbieter (Cell Systems, Inc., Seattle, WA), wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen von PDGF-BB mit und ohne Zugabe der Verbindung Nr. 58 (5 jiM) kultiviert. Wie in Fig. 19 gezeigt, inhibierte die Verbindung Nr. 58 PDGF-induzierte Proliferation selbst bei hohen PDGF-Konzentrationen, was eine maximale proliferative Stimulation liefert. Darüber hinaus wurden einige Kulturen eine Stunde vor der PDGF-Stimulation mit der erfindungsgemässen Verbindung Nr. 58 behandelt. Wie gezeigt, stimuliert PDGF die Proliferation in dieser Zell-Linie. Eine Zugabe von 5 nM der Verbindung Nr. 58 blok-kiert die PDGF-stimulierte Proliferation und keine toxischen Effekte der Verbindung Nr. 58 wurden beobachtet.
Ein weiteres Assay wurde für die Untersuchung inhibitorischer Effekte der erfindungsgemässen Verbindung Nr. 58 auf entweder basische oder saure FGF-induzierte Proliferation in menschlichen aortischen glatten Muskelzellen (aortische SMC) eingesetzt. Disregulierte bFGF- oder aFGF-induzierte Proliferation ist mit der SMC-Proliferation und der neointimalen Occlusion in Ahterogenese und Restenose verknüpft und spielt eine Rolle bei der autokrinen und parakrinen Stimulation von Tumorzellen und tu-morzelleninduzierter Angiogenese. In diesem Assay wurden Zellen in einem reduzierten Serum (0,5% Kalb-Fetus-Serum) für 24 Stunden vor der Stimulation mit unterschiedlichen Konzentrationen von PDGF vermehrt. Die Zellen wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen über Nacht entweder mit aFGF oder bFGF stimuliert, in dem 5 nM der Verbindung 58 ausgewählten Kulturen zugegeben wurde. Verbindung Nr. 58 erwies sich als potenter Inhibitor von sowohl aFGF- als auch von bFGF-induzierter Proliferation in diesen Zelltypen, welche stellvertretend für andere der untersuchten Zelltypen stehen. In Fig. 20A (aFGF) und Fig. 20B (bFGF) gezeigte Ergebnisse illustrieren das Ausmass der Inhibition. Für die Verbindung Nr. 58 wurden bei diesem Zelltyp in diesem Assay keinerlei toxische Effekte beobachtet.
Beispiel 36
Dieses Beispiel illustriert eine Untersuchung der Proliferation von murinen Thymozyten, welche mit ConA und IL-2 unter Verwendung einer zu der in Beispiel 23 gezeigten ähnlichen Prozedur co-stimuliert wurden. In einem anderen verwandten Assay wurde der hemmende Effekt auf die CT6-Zellen-Prolifera-
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tion untersucht. CT6-Zellen sind eine murine IL-2-abhängige, zytotoxische T-Zell-Linie, die in Antwort auf die murine IL-2 (15 U/ml) proliferiert. Die Figuren 21A, 21B, 21C und 21D illustrieren experimentelle Ergebnisse für die Verbindung Nr. 35 und CsA in jedem Assay. Fig. 21A illustriert das Ausmass der Hemmungsaktivität der Verbindung Nr. 25 auf murine Thymozyten Co-Stimulation und Fig. 21B zeigt vergleichend die Hemmungsaktivität von CsA. Sowohl die erfindungsgemässe Verbindung Nr. 35 als auch CsA zeigen eine signifikante Inhibition der Thymozytenproliferation mit ICso-Werten im unteren mikromolaren und nanomolaren Bereich. Fig. 21C und 21D illustrieren inhibitorische Effekte der Verbindung Nr. 35 und CsA. Sowohl die Verbindung Nr. 35 als auch CsA zeigen in diesem Assay keine Aktivität, was anzeigt, dass keine derselben die IL-2 induzierte Proliferation von zytotoxischen CT6-Zellen inhibiert.
Beispiel 37
Dieses Beispiel illustriert eine Untersuchung der inhibitorischen Effekte der Verbindung Nr. 58 auf die durch den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF)-induzierte Proliferation in einer humanen umbilikalen venösen Endothelialzell-Linie (HUVEC). In dieser Assayprozedur wurden Zellen in einem reduzierten Serum (0,5% Kalb-Fetus-Serum) für 24 Stunden vor der Stimulation mit unterschiedlichen Konzentrationen von VEGF vermehrt. Es wurde gezeigt, dass VEGF in durch Tumorzellen vermittelter Angiogenese von Bedeutung ist. Die Verbindung Nr. 58, bei 5 uM, inhibiert die VEGF-induzierte Proliferation bei allen getesteten Konzentrationen von VEGF, siehe Fig. 22.
Beispiel 38
Dieses Beispiel illustriert eine Untersuchung zur Inhibierung der Vaskulärzellen-Adhäsionsmolekül (VCAM)-Expression auf HUVEC durch Verbindung Nr. 58. Die VCAM-Expression durch Endothelialzellen ist ein frühes Ereignis in der Pathogenese von Atherogenese und Multipler Sklerose, unter anderen verschiedenen Autoimmunkrankheiten. Fig. 23 stellt eine Reihe von Häufigkeitshistogrammen dar, die in diesem exemplarischen Assay erhalten wurden. Das oberste Feld zeigt ein Häufigkeitshistogramm, welches durch Flusszytometrieanalyse von HUVEC-Zellen erhalten wurde, welche mit einem gegen VCAM gerichteten Antikörper und einem Sekundärstamm-Ziege-anti-Maus-FITC-Antikörper versehen sind. In Abwesenheit von TNF war die VCAM-Expression auf HUVEC sehr niedrig. Das mittlere Feld zeigt ein Häufigkeitshistogramm von Zellen, die mit TNF für 6 Stunden vor der flusszytometrischen Analyse stimuliert wurden. Der durchschnittliche Anstieg der Zell-Fluoreszenz war ungefähr zehnfach. Im unteren Feld ist ein Häufigkeitshistogramm von TNF-stimulierten Zellen in der Anwesenheit der Verbindung Nr. 58 dargestellt. Die Anwesenheit der erfindungsgemässen Verbindung reduziert die mittlere Fluoreszenz um einen Faktor 8, verglichen mit der mittleren Fluoreszenz von TNF-stimulierten Zellen in der Abwesenheit der Verbindung Nr. 58.
Beispiel 39
Dieses Beispiel zeigt die inhibierende Aktivität der Verbindungen Nrn. 50 und 57 auf THP-1 Zelladhäsion an IL-1-aktivierte HUVEC. In einem Untersuchungs-Assay wurden HUVEC mit IL-1 (10 ng/ml) stimuliert, sowohl in Abwesenheit und in Anwesenheit verschiedener Konzentrationen von Wirkstoffen für 8 Stunden in einer 96-Proben-Mikrotiterplatte. In der Mikrotiterplatte wurden THP-1 Zellen der menschlichen monozytischen Leukämie-Zell-Linie mit 50 000 Zellen je Probe zugegeben. Die THP-1 Zellen wurden mit BCECF präinkubiert, einem Fluoreszenzfarbstoff, der zur Messung der Zellzahl mittels eines Fluoreszenz-Platten-Lesers verwendbar ist. Nach 10 Minuten bei 37°C wurde die Mikrotiterplatte invertiert und mit 900 rpm zentrifugiert. Die zurückbleibenden anhaftenden THP-1 Zellen wurden anschliessend analysiert. Wie in Fig. 24 gezeigt, betrug die nicht-stimulierte Untergrundadhärenz ungefähr 1500 relative Einheiten, welche unter TNF Stimulierung auf ungefährt 6500 anstieg. Die untersuchten erfindungsgemässen Verbindungen inhibierten signifikant die THP-1 Adhäsion, sogar bei niedrigen Konzentrationen.
Beispiel 40
Dieses Beispiel zeigt den inhibierenden Effekt der erfindungsgemässen Verbindung Nr. 58 auf entweder aFGF- oder bFGF-induzierte Proliferation in humanen pulmonalen glatten Muskelzellen. Zellen wurden in einem reduzierten Serum (0,5% Kalb-Fetus-Serum) für 24 Stunden vor der Stimulierung mit unterschiedlichen Konzentrationen von PDGF vermehrt. Mit entweder aFGF oder mit bFGF stimulierte Zellen wurden in Anwesenheit und in Abwesenheit der Verbindung Nr. 58 (5 uM) analysiert. Assay-Ergebnisse sind in den Fig. 25A und 25B (für aFGF und bFGF) zusammengefasst. Wie den Ergebnissen zu entnehmen ist, war die Verbindung Nr. 58 ein potenter Inhibitor sowohl für aFGF- als auch für bFGF-induzierte Proliferation in diesen Zelltypen, wobei die pulmonalen glatten Muskelzellen stellvertretend für andere Zelltypen untersucht wurden. Keinerlei toxische Effekte der Verbindung Nr. 58 konnten in diesem Assay gefunden werden.
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Beispiel 41
Dieses Beispiel illustriert die Synthese von 1-Octylamino-10-hydroxy-ll-(N-methylacetamido)undecan (Verbindung Nr. 77). Natriumhydrid (0,56 g, 23 mmol) wurde zu einer Lösung von 1-Brom-10-undecen (5,4 g, 23 mmol) und N-Methylacetamid (91,7 g, 23 mmol) in DMSO (40 ml) hinzugefügt. Nach 8 Stunden war die Reaktion beendet. Das Reaktionsgemisch wurde zu 100 ml Wasser gegeben und mit Dichlormethan (3 x 100 ml) extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden mit Wasser (70 ml) und gesättigter wässeriger Salzlösung (70 ml) gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum abgetrennt, was einen gelben Rückstand ergab, welcher chromatographisch (Kieselerde/ Ethylacetat) gereinigt wurde, was 2,95 g von 1-(N-Methylacetamido)-10-undecen als farbloses Öl (57% Ausbeute) ergab.
Eine Lösung von 1-(N-Methylacetamido)-10-undecen (2,0 g, 8,9 mmol), N-Methylmorpholin-N-Oxid (4 ml einer 60prozentigen wässerigen Lösung in Wasser, 18 mmol) und Kaliumosmat-Dihydrat (10 mg) in Aceton (50 ml), Wasser (30 ml) und t-Butanol (10 ml) wurden bei Raumtemperatur 17 Stunden gerührt. Natriumdithionit (200 mg) wurde hinzugefügt, um den Osmiumkatalysator zu reduzieren. Nach 30 Minuten wurde das Reaktionsgemisch zu Dichlormethan (50 ml) gegeben und die Phasen separiert. Die wässerige Phase wurde mit Dichlormethan (3 x 50 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit einer gesättigten wässerigen Salzlösung (50 ml) gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet, das Lösungsmittel wurde anschliessend unter Vakuum abgetrennt und so ein dickflüssiger Rückstand erhalten. Der Rückstand wurde chromatographisch unter Verwendung von Kieselerde und eines Dichlormethan/15% Methanol-Eluenten gereinigt, was 1,61 g von 1,2-Dihydroxy-11-(N-methylacetami-do)undecan (70% Ausbeute) ergibt. Das erhaltene Diol (1,61 g, 6,2 mmol) wurde in einer 30prozentigen Lösung von Bromwasserstoff in Essigsäure (3,7 ml) für 1 Stunde gerührt. Die Lösung wurde zu einer Mischung von Natriumbicarbonat (7 g) in Wasser (50 ml) und Dichlormethan (25 ml) zugefügt. Nach Beendigung der Gasentwicklung wurden die Schichten separiert und die wässerige Phase mit Dichlormethan (2 x 70 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit Wasser (30 ml) und einer gesättigten wässerigen Salzlösung (30 ml) gewaschen und anschliessend über Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum entfernt, wodurch 2,16 g von I-(N-Methylacetamido)-10-acetoxy-11-bromundecan als farbloses Öl (96% Ausbeute) erhalten wurden. Natriummethoxid (351 mg, 6,5 mmol) wurde zu einer Lösung von Bromacetat (2,16 g, 5,9 mmol) in Methanol (15 ml) hinzugefügt. Nach einstündigem Rühren wurde das Reaktionsgemisch in Wasser (25 ml) gegeben und mit Dichlormethan (3 x 25 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit einer gesättigten wässerigen Salzlösung (25 ml) gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum entfernt und der Rückstand chromatographisch unter Verwendung von Kieselerde und Ethylacetat als Eluenten gereinigt, was 831 mg von 1,2-Oxido-11-(N-methylacetamido)undecan (58 Ausbeute) ergibt.
Eine Lösung von 1,2-Oxido-11-(N-methylacetamido)undecan (400 mg, 1,7 mmol), Octylamin (0,26 g, 2 mmol) und Lithiumperchlorat (181 mg, 1,7 mmol) in trockenem Acetonitril (10 ml) wurden 16 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde zu 20 ml Wasser gegeben und mit Dichlormethan (3 x 30 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit einer gesättigten Salzlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum entfernt. Chromatographische Reinigung des so erhaltenen Rückstandes über Kieselerde mit Dichlormethan/5% Methanol/5% Triethylamin als Eluenten ergeben 416 mg der Verbindung Nr. 77 (56% Ausbeute).
Beispiel 42
Dieses Beispiel illustriert die inhibierenden Effekte der erfindungsgemässen Verbindungen auf die Balb/3T3 Zellproliferation als Antwort auf die PDGF-Stimulierung. Untersuchungen zeigen, dass die erfindungsgemässen Verbindungen inhibierende Effekte auf PDGF-induzierte Proliferation von Balb/3T3-Zellen besitzen. Balb/3T3-Zellen reagieren heftig auf eine PDGF-Stimulierung und sind in in vitro-Model-len für weitergehende Studien der PDGF-induzierten Proliferation von Nutzen. Disregulierte PDGF-proli-ferative Reizantwort wurde mit einer Vielzahl von Erkrankungen in Verbindung gebracht, einschliesslich z.B. Restenose, Atherosklerose, Fibrose und Tumorzellenangiogenese. Zellen wurden in ein Medium mit niedrigem Serumgehalt, für 24 Stunden vor der Stimulation mit unterschiedlichen Konzentrationen der erfindungsgemässen Verbindungen Nrn. 77, 7 und 78 vermehrt.
Die erfindungsgemässen Verbindungen Nrn. 77, 7 und 78 wurden in unterschiedlichen Konzentrationen 1 Stunde vor der PDGF Stimulation zugegeben. PDGF-BB wurde in einer konstanten 10 uM Konzentration zusammen mit tritiiertem Thymin zugefügt. Den Zellen wurde ermöglicht, für einen Tag zu inkubieren, gefolgt von einer Zugabe von PDGF und tritiiertem Thymidin. Nach 24 Stunden wurden die Zellen entnommen und mittels eines Flüssigszintillationszählers gezählt. Entsprechende Ergebnisse für die Verbindungen Nrn. 77, 7 und 78 sind in den Fig. 26A, 26B und 26C gezeigt. Der Untergrund betrug ungefähr 1% des Kontrollevels. Die Ergebnisse veranschaulichen, dass die getesteten Arzneimittel die Balb/3T3 Proliferation in diesem Voraussage-in vitro-Modell inhibieren.
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Beispiel 43
Dieses Beispiel zeigt Dosis-Wirkungs-Kurven, die zur Bestimmung der 50% Inhibierungskonzentration (ICso) für die erfindungsgemässen Verbindungen Nrn. 78, 79 und 80 für murine Thymozytenproliferation, co-stimuliert durch ConA und IL-2, benutzt wurden. Thymuszellen von normalen, weiblichen Balb/ C-Mäusen wurden abgetrennt und in Vertiefungen von Mikrotiterplatten mit einer Dichte von 2 x 105 Zellen je Vertiefung gegeben. ConA (0,25 mg/ml) und IL-2 (15 U/ml) wurden den Proben zugefügt. Die Zellen wurden für 4 Tage bei 37°C inkubiert. Am 4. Tag wurden die Zellen mit tritiiertem Thymidin gepulst und für weitere 4 Stunden inkubiert. Die Menge des von den abgetrennten Zellen inkorporierten tritiierten Thymidin-Farbstoff wurde in einem Flüssigszintillationszähler bestimmt. Dosen (gezeigt in Fig. 26A, 26B und 26C) wurden 2 Stunden vor der ConA und IL-2 Aktivierung zugegeben. Untergrundmessungen zeigten weniger als 200 cpm. ICso-Werte der getesteten erfindungsgemässen Verbindungen betrugen 12,4; 10,6 und 3,8 (iM für die Verbindungen Nrn. 78, 79 und 80. Alle getesteten Verbindungen inhibierten die Thymozytenproliferation und Aktivierung.
Beispiel 44
Dieses Beispiel zeigt schlüssig anhand der Daten, welche von verschiedenen in vitro und in vivo Assay Ergebnissen zusammengestellt wurden, dass die erfindungsgemässen Verbindungen, repräsentiert durch eine Spezies der offenbarten Gattung (Verbindung Nr. 50), Anti-Krebstherapeutika darstellen.
Im allgemeinen werden durch das Wachstum und die Verbreitung von malignen Tumoren (schnelles Zellwachstum, unkontrolliert durch normale Regulationsmechanismen) Krebskrankheiten charakterisiert. Die genauen Krebsursachen bleiben unbekannt. Vorklinische und klinische Tests mit den erfindungsgemässen Verbindungen zeigen an, dass das Krebszellenwachstum möglicherweise durch den sekundären Übertragungspfad reguliert wird. Oncogene Mutationen resultieren in abnormaler kontinuierlicher Stimulation des Pfades, was zu unreguliertem und undifferenziertem Wachstum (d.h. maligner Transformation) führt. Krebszellen metastasieren (d.h. Durchbruch durch Blutgefässe und Wanderung zu unterschiedlichen Körperzellen) und sondern Enzyme ab, sogenannte Metalloproteasen, welche Blutge-fässwände «zusammenbrechen lassen» und dadurch Krebszellen ermöglichen, in den Blutstrom einzutreten und entfernte Tumore (Proteolyse) zu bilden. Eine derartige Metalloprotease ist die Typ IV Collagenase. Darüber hinaus beeinflussen Tumorzellen-Adhäsionrezeptoren (Integrine) die Anbindung - offensichtlich notwendig für das Auftreten von Tumoren in Organen - von Tumorzellen an Wänden von Blutgefässen und normalen Organen. Krebszellen sondern des weiteren gewisse Proteine wie z.B. bFGF ab, die die Neubildung von Blutgefässen stimulieren (Angiogenese oder Neovascularisation), diese neuen Blutgefässe führen Nährstoffe zu, die das Wachstum maligner Tumore fördern. Neuere Forschungsergebnisse legen nahe, dass der sekundäre Übertragungspfad für die Typ IV Collagenase-Pro-duktion, Adhäsion-Rezeptor-Expression und bFGF-Sekretion unerlässlich erscheint.
Im Gegensatz zur herkömmlichen Antikrebstherapie verringern die erfindungsgemässen Verbindungen durch Inhibierung des sekundären Übertragungspfades: Krebszellenwachstum durch Blockierung oncogen-induzierter Ereignisse; metastatisches Potential durch Blockierung der Metalloproteaseproduk-tion; Tumoradhäsion an normale Organe durch Blockierung der Adhäsion-Rezeptor-Expression und ein Vermögen der Tumore, nährstofführende Blutgefässbildung durch Blockierung von bFGF oder anderen tumorabhängigen Wachstumsfaktorsignalen zu induzieren.
Die erfindungsgemässen Verbindungen zeigen Anti-Krebseigenschaften gegen verschiedene maligne Bedingungen, einschliessich Lungen-, Brust- und Dickdarmkrebs, und entgegen der konventionellen Krebschemotherapie sind die erfindungsgemässen Verbindungen in vitro bezüglich normaler Zellen bei Konzentrationen, die letal auf Krebszellen wirken, nicht toxisch. In vitro-Daten, die stellvertretend für die Verbindung Nr. 50 erhalten wurden, sind folgende:
Ergebnisse für Verbindung Nr. 50 in der PDGF-induzierten Proliferation von Balb/3T3 Zellen (Beispiel 32), siehe Fig. 28, zeigen die inhibierenden Eigenschaften dieser Verbindung auf durch PDGF-induzier-te Proliferation, was eine signifikante Inhibierung bei so niedrigen Konzentrationen wie 2 jiM zeigt. Dieses Vermögen zur Blockierung der Proliferation (Repräsentant eines oncogen-induzierten Ereignisses beim Tumorzellenwachstum) legt nahe, dass die erfindungsgemässen Verbindungen, insbesondere Verbindung Nr. 50, in der Lage sind, das Tumorzellenwachstum durch Blockierung oncogen-induzierter Ereignisse zu reduzieren.
Ein weiteres Assay misst das Vermögen der erfindungsgemässen Verbindungen, wie durch Verbindung Nr. 50 repräsentiert, um die Metalloproteinaseproduktion in Krebszellen zu inhibieren. In dem As-say-Protokoll wurden THP-1 menschliche Leukämiezellen (1-2 x 106/35 mm2 Probe) in RPMI-Medium mit 0,5% Serum aufgebracht. Die Verbindung Nr. 50 wurde mit 2,5 nM zugefügt. Nachfolgend zur Inkubation von einer Stunde wurde TNF-a hinzugefügt und für 18 Stunden inkubiert. Die Überstände von Kontroll- und behandelten Platten wurden gesammelt und die Proteaseaktivität in Gelatinegel (Zymo-gramm) nach elektrophoretischer Proteintrennung bestimmt. Wie in Fig. 29 gezeigt erhöht TNF-a merklich die Expression der 92 kD-Matrixmetalloprotease (MMP) und erhöht moderat die Produktion der 72 kD MMP. Die Anwesenheit der Verbindung Nr. 50 blockiert die TNF-a stimulierte Expression sowohl von 92 als auch von 72 kD MMP. Die Verbindung Nr. 50, stellvertretend für die erfindungsgemäss vor39
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liegenden Verbindungen, ist in der Lage, das metastatische Potential von Krebszellen durch Blockierung der Metalloproteaseproduktion merklich zu reduzieren.
Andere in vitro- und in vivo-Anzeichen für diese merkliche Aktivität der erfindungsgemässen Verbindungen zeigt sich in den folgenden experimentellen Ergebnissen.
Fig. 30 zeigt die anti-proliferative Aktivität und Fig. 31 die anti-clonogenetische Aktivität der erfindungsgemässen Verbindung Nr. 50 mit HT-29 Zellen. HT-29 Zellen (1 x 105 Zellen/35 mm Probe) wurden in McCoy's Medium mit 10% Serum gegeben und über Nacht inkubiert. Die Konzentrationen von 3 und 6 nM der Verbindung Nr. 50 wurden hinzugefügt und die lebensfähigen Zellen zu den ausgeführten Zeiten gezählt. Für klonogene Assays wurden behandelte Zellen und Kontrollzellen (300/Platte) aufgegeben und ermöglicht sich zu Kolonien zu vermehren. Nach 7 Tagen wurden die Kolonien fixiert und ausgezählt. Die in Fig. 31 gezeigten Werte entsprechen Mittelwerten von 3 Platten.
Fig. 32 und 33 zeigen die Zytotoxizitäts- und Konzentrationsabhängigkeit der Verbindung Nr. 50 gegen 3LL-Zellen (Lewis-Lungen-Karzinoma). 3LL-Zellen (3 x 103 Zellen/Probe) wurden aufgebracht und über Nacht in 10% Serum enthaltendes RPMI-Medium inkubiert. Verbindung Nr. 50 wurde in unterschiedlichen Konzentrationen hinzugefügt und die Zellzahl zu verschiedenen Zeitpunkten mittels einer Vital-Farbstoff-Aufnahmemethode bestimmt. Die gezeigten Werte sind Triplikate der Proben.
Fig. 34 zeigt dass der Verbindung Nr. 50, die auch bei wesentlich höheren Konzentrationen als den gezeigten eine Zytotoxizität gegenüber Tumorzellen aufweist, eine zytotoxische Aktivität in normalen Knochenmark-Stromal-Zellen fehlt. Menschliche Knochenmark-Stromal-Zellen (1 x 104 Zellen/Probe) wurden in einer Mikrotiterplatte in McCoy's Medium mit Serum aufgegeben und über Nacht inkubiert. Verschiedene Verdünnungen der Verbindung Nr. 50 wurden hinzugefügt und eine Zählung lebensfähiger Zellen durch Vital-Farbstoff-Aufnahme durchgeführt.
Die Fig. 35 und 36 zeigen die Effekte der Verbindung Nr. 50 auf die matrigele Invasion und Lebensfähigkeit in 3LL-Zellen. 3LL-Zellen (4,5 x 105 Zellen/Probe) werden in die innere Membran von Matrigelkammern eingebracht. Verschiedene Konzentrationen der Verbindung Nr. 50 wurden in die Kammer gegeben und für 48 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Zellen auf dem oberen Teil der Membran wurden entfernt und Zellen, die zum Boden wanderten, mit Diff-Quick-Lösungen gefärbt und zur Bestimmung einer relativen Invasion gezählt. Der Effekt der Verbindung Nr. 50 auf die Lebensfähigkeit von 3LL-Zellen bei verschiedenen Konzentration wurde separat bestimmt.
Fig. 37 zeigt die VEGF-induzierte Proliferation auf HUVEC als ein Vorhersage-Adhäsion-Assay. HUVEC wurden in ein EBM-Medium mit Serum gegeben und für 4 Tage ermöglicht sich zu vermehren. Verschiedene Verdünnungen der Verbindung Nr. 50 wurden zu den Platten hinzugefügt, gefolgt von VEGF (50 ng/ml) zusammen mit tritiiertem Thymindin (1 mCi/ml). Die Proliferation wurde vierfach gemessen und diese Daten zeigen den Effekt der Verbindung Nr. 50 die Adhäsion zu inhibieren.
Fig. 38 zeigt den Effekt der Verbindung Nr. 50 auf die THP-1 Adhärenz zu IL-1 ß-stimulierter HUVEC. HUVEC (4 x 103 Zellen/Probe) wurden in RPMI-Medium mit 10% Serum eingebracht und für 48 Stunden inkubiert. Verschiedene Konzentrationen der erfindungsgemässen Verbindung Nr. 50 wurden zugefügt und für 1 Stunde inkubiert. IL-1 ß (15 ng/ml) wurden zugefügt und für 6 Stunden inkubiert. Exponen-tiell Wachstums THP-1 Tumorzellen, vorgefärbt mit Farbstoff BCECF, wurden zugefügt (1,5 x 105 Zellen/Probe) und für 20 Minuten eine Adhärenz gestattet. Die Zahl von adhärierenden Tumorzellen wurde nach Waschen, um die nicht anhaftenden Zellen zu entfernen, bestimmt.
Fig. 39 zeigt den Effekt der Verbindung Nr. 50 auf die VCAM-1 Oberflächenexpression von TNFa-sti-mulierter HUVEC. Dieses Assay ist ein Vorhersagemodell der Adhäsion. HUVEC wuchsen bis zur 90%-Konfluenz in Platten mit 6 Vertiefungen in RPMI-Medium mit 10% Serum. Verbindung Nr. 50 wurde in unterschiedlichen Konzentrationen zugefügt und für 30 Minuten inkubiert. TNFa (20 ng/ml) wurde zugefügt und die Zellen wurden für 5 Stunden inkubiert. Die Zellen wurden gesammelt und von VCAM-1 durch indirekte Immunfärbung, gefolgt von einer Analyse mittels fluoreszenzaktivierter Zellauslese (FACS) bestimmt. Die mittlere Fluoreszentintensität von TNFa-stimulierten Zellen wurde mit wirkstoffbehandelten Proben auf 100% normalisiert, ausgedrückt in Prozent der Kontrollmessung.
Fig. 40 zeigt den Effekt der erfindungsgemässen Verbindung Nr. 50 auf ICAM-1 Oberflächenexpression von TNFa-stimulierter HUVEC. Dieses Assay ist ein Vorhersagemodell der Adhäsion. Die durchgeführten Prozeduren waren die gleichen wie diejenigen des unmittelbar vorhergehenden Assays, ausgenommen, dass die Zellen mit einem ICAM-1 Antikörper angefärbt wurden.
Fig. 41A, 41B und 41C zeigen die Ergebnisse einer in vivo-Studie in Mäusen, in der B16 Melanom-zellen durch eine Schwanzvene am Tage 0 intravenös injiziert wurden und die Verbindung Nr. 50 wurde interparenteral mit 10 mg/kg QD oder 20 mg/kg QOC, beginnend mit den Tagen 1-14, verabreicht. Die Mäuse wurden am 15. Tag getötet und die Lungen entfernt und in Formalin fixiert. Die Zahl der schwarzen metastatischen Foci wurden gezählt und in den drei in Fig. 41A, 41B und 41C gezeigten Lungen veranschaulicht. Darüber hinaus wurde die Knochenmarkstoxizität durch Messung der Neutro-phil- und Thrombozytenzahlen in Mäusen am 15. Tag gemessen. Diese Daten sind graphisch unterhalb der Lungenfotografien in den jeweiligen Figuren gezeigt. Diese Daten zeigen, dass jede der verabreichten Dosen der Verbindung Nr. 50 nicht toxisch auf das Knochenmark wirkt (im Gegensatz zu jedem der bekannten Krebs-Chemotherapie-Bereiche) und in der Tat stiegen die Zahlen der nicht behandelten Kontrolltiere.
Fig. 42A und 42B zeigen T- und B-Zellen-Reizantwort-Assays von Mäusen, die mit Verbindung
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Nr. 50 in dem unmittelbar vorangehendem Assay-Protokoll behandelt wurden. Die Milz dieser behandelten Mäuse wurde in Einzel-Zell-Suspensionen in RPMI-Medium, nachgefolgt von 10% Serum, überführt und in einer flachbodigen Mikrotiterplatte (200 000 Zellen/Probe) plaziert. Anti-CD3 (Fig. 42A) oder eine Mischung von anti-Mu/IL-4 (Fig. 42B) wurden zu den Proben bis zu Endkonzentrationen von 1 mg/ml und 1 mg/ml/12,5 ng/ml zugefügt. Geeignete positive und negative Kontrollproben wurden auf jeder Platte aufgebracht und alle Proben in vierfacher Anzahl getestet. Die Platten wurden für 2 Tage inkubiert und die Proliferation durch tritiierte-Thymidin-lnkorporation gemessen.
Fig. 43 zeigt die Ergebnisse aus einem in vivo-Experiment, welches zeigt, dass die Verbindung Nr. 50 das Wachstum von Lewis-Lungen-Karzinom in Mäusen aufhalten kann. BDFI-Mäuse wurden subkutan mit 1 x 106 3LL Zellen am Tage 0 injiziert und anschliessend mit der Verbindung Nr. (20 mg/kg i.p.), Zyclophosphamid (20 mg/kg) oder Vehikel an abwechselnden Tagen beginnend mit dem Tag 7 behandelt. Die Tiere wurden am Tag 20 getötet und die Lungentumore entnommen und gewogen. Fig. 43 veranschaulicht, dass die Verbindung Nr. 50 verbesserte Ergebnisse gegenüber einem existierenden Krebs-Chemotherapeutischen Agens aufweist.
Fig. 44A und 44B zeigen Thrombozyten- und Neutrophilzählungen der getöteten Mäuse in dem unmittelbar vorangehenden Assay. Des weiteren wurden Thrombozyten- und Neutrophilzählungen nicht mit dem Vehikel verändert, was anzeigt, dass das Knochenmark kein Target für eine Toxizität der Verbindung Nr. 50 darstellt.
Fig. 45A, 45B und 45C veranschaulichen einen fotografischen Vergleich von Lungen der 3LL-ausge-setzten Mäuse mit oder ohne Behandlung unter Verwendung der Verbindung Nr. 50. In die Lungen wurde India-Tinte injiziert, so dass normales Lungengewebe schwarz gefärbt und Tumorgewebe weiss erscheint. Die Unterschiede in den Lungen, die 7 Tage nach der Tumorzellenverabreichung behandelt wurden, war visuell sichtbar. Diese in vivo-Daten weisen deutlich auf eine signifikante klinische Aktivität und eine reduzierte Knochenmarkstoxizität der erfindungsgemässen Verbindungen hin.
Beispiel 45
Dieses Beispiel zeigt schlüssig in vitro- und in vivo-Anzeichen, welche darauf hinweisen, dass die erfindungsgemässen Verbindungen, repräsentiert durch eine Spezies der offenbarten Gattung (Verbindung Nr. 45), wirkungsvolle Therapeutika für Autoimmun-Krankheiten darstellen und eine Immunantwort unterdrücken.
Eine solche Autoimmunerkrankung, rheumatoide Arthritis, wird durch unbekannte umgebungsspezifische oder endogene Ereignisse in einem genetisch anfälligen Individuum getriggert. Eine Fehlregulation von B-Lymphozyten führt zu einer Produktion von Immun-Komplexen. Aktivierte T-Zellen fördern die Auto-Antikörperproduktion in den betroffenen Gelenken (vorzugsweise des CD4-Helfer-Typs). Makrophagen und dendritische Zellen produzieren eine grosse Anzahl von entzündungsfördernden Zytokinen und stimulieren des weiteren Lymphozyten. Des weitern produzieren sowohl Lymphozyten als auch Makrophagen andere Zytokine, welche die Proliferation von synovialen Zellen stimulieren, was zu einer «pan-nus»-Bildung und einer Gelenk-Deformität führt. Degradative Enzyme, wie Typ IV-Collagenase werden in dem Gelenkspalt freigesetzt und zerstören das Bindegewebe, einschliesslich der Knorpel auf artikularen Oberflächen. Von Lymphozyten und Makrophagen befreite Zytokine spielen verschiedene Rollen bei der Patogenese von Gelenkmissbildungen und systemischen Symptomen bei rheumatoider Arthritis. Verbindungen, die lediglich eine Komponente dieses komplexen Prozesses beeinflussen sind wahrscheinlich nicht wirksam oder krankheitsbeeinflussend, wenn nicht diese Verbindungen auf einen Prozess zielen, der sowohl proximal in der Kaskade und fundamental bei dem entzündlichem Prozess selbst ist. Da biologische Systeme invariabel redundant erscheinen, zielen herkömmliche Behandlungen auf einen einzigen Aspekt einer komplexen Reaktion und sind daher lediglich teilweise wirksam.
Die erfindungsgemässen Verbindungen unterbrechen viele Schlüsselkomponenten der Kaskade der Ereignisse, die sowohl zu einer Gelenkmissbildung als auch zu systemischen Komplikationen der rheumatoiden Arthritis führen. Insbesondere in den folgenden in vitro- und in vivo-Assays inhibiert die erfindungsgemässe Verbindung Nr. 45 (als stellvertretende Verbindung der vorliegenden Erfindung): T- und B-Zellproliferation und daher eine abnormale Auto-Antikörperproduktion inhibierend; Makrophagenakti-vierung, Zytokin-Produktion und, was am bedeutensten ist, Signalgebung durch multiple Zytokine (zum Beispiel T- und B-Zellen angetriebene Proliferation als Antwort auf eine IL-2, IL-4, IL-7, TNFa und T-Zell-Rezeptoraktivierung durch Antigene); proliferative Signale an Synovialzellen als Antwort auf PDGF, FGF, EGF und insulinartige Wachstumsfaktoren (IGF); Adhäsion-Molekül-Expression (einschliesslich VCAM und ICAM), stimuliert durch lokale Entzündungen, eine Unterdrückung dieser Adhäsion-Moleküle führt wahrscheinlich zu einer Verringerung des Lymphozyten- und Makrophagentransportes zu den entzündeten Stellen und verringert daher die Verstärkung des Entzündungsprozesses. Die erfindungsgemässen Verbindungen, vertreten durch Verbindung Nr. 45, hemmen auf vielfältige Weise die entzündungserregende und fehlregulierende Immunantwort, die zu akuter und chronischer Symptomatologie von Krankheiten wie rheumatoider Arthritis führt.
In vitro- und in vivo-Daten bestätigen die Aktivität der erfindungsgemässen Verbindungen als immunosupressive Therapeutika, wie durch die folgenden Ergebnisse gezeigt wird.
CT-6.1-Zellen wurden über Nacht ausgehungert und mit IL-2 (20 ng/ml) stimuliert. Nach 20 Stunden
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wurden die Zellen für 4 Stunden mit 3H-TdR markiert und mittels Flüssigszintillation gezählt. Die Untergrundzählrate betrug ungefähr 2000 CPM. Der ICso-Wert zur Hemmung in dieser Zell-Linie betrug ungefähr 0,8 nM. CsA, zur negativen Kontrolle verwendet, zeigte keinen Effekt auf die IL-2-vermittelte Proliferation. Fig. 46 zeigt mit diesem Assay erhaltene Ergebnisse und zeigt die Inhibierung der Proliferation durch die Verbindung Nr. 45, wie durch die 3H-TdR-lnkorporation durch Zellzählung gemessen wurde.
CT-6.1-Zellen wurden mit IL-2 mit oder ohne Zugabe der Verbindung Nr. 45 (2 nM) kultiviert und wachstumsfähige Zellen für bis zu 8 Tage gezählt. Am 4. Tag wurden zwei zuvor mit Verbindung Nr. 45 inkubierte Kulturen gewaschen und mit frischem IL-2 mit oder ohne Verbindung Nr. 45 (2 nM) rekultiviert. Die in Fig. 47 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass die Verbindung Nr. 45 die Proliferation, gemessen durch die Zellzahl, hemmt, wobei der Effekt selbst nach vier Tagen der Zellkultur reversibel ist.
Die in Fig. 48 gezeigten Ergebnisse veranschaulichen, dass die Verbindung Nr. 45 ebenso mitogene Reizantworten auf IL-2, IL-4 und IL-7 inhibiert. CT-6.1-Zellen wurden über Nacht ausgehungert und entweder mit IL-2 (20 ng/ml), IL-4 (50 ng/ml) oder IL-7 (25 ng/ml) stimuliert. 3H-TdR wurde nach 20 Stunden zugegeben, die Zellen wurden 4 Stunden später entnommen und die Inkorporation von 3H-TdR wurde bestimmt. Die Verbindung Nr. 45 zeigte ICso-Werte < 1,0 nM für IL-2, IL-4 oder IL-7 stimulierte Proliferation von CT-6.1-Zellen. Sämtliche Inkorporationsstudien wurden durch parallele Zellzählungsexperimente bestätigt (Daten sind nicht gezeigt). Diese Daten zeigen an, dass die erfindungsgemässen Verbindungen eine Immunsupression ähnlich einer X-gelinkten SCID-artigen Bedingung induzieren.
In einem weiteren in vitro-Protokoll wurde die Thymozyten-Proliferation durch submitogene Dosen von ConA (0,25 ng/ml) und IL-2 (20 ng/ml) induziert. Die Zellen wurden vor einer Zugabe von 3H-TdR für vier Stunden zuvor 96 Stunden stimuliert. Die Zellen wurden entnommen und die 3H-TdR-lnkorpora-tion bestimmt. Die Untergrundzählrate betrug ungefähr 2000 cpm. In den in Fig. 49 gezeigten Resultaten inhibierte die erfindungsgemässe Verbindung Nr. 45 ebenso die murine Thymozytenproliferation in Antwort auf ConA und IL-2 mit einem ICso-Wert von ungefähr 0,35 nM.
Fig. 50A und 50B zeigen, dass Verbindung Nr. 45 eine murine gemischte Tumorlymphozyten-Kultur (MTLC) und eine human gemischte Leukozyten-Reaktion (MLR) inhibiert. In der MTLC wurden Splenozyten mit einem Alloantigen, B-Zellen Tumor-Target-Zell-Linie (2PK3) in Anwesenheit oder Abwesenheit der Verbindung Nr. 45 stimuliert (Ko-Kultur). Die Zellen wurden 3 Tage stimuliert, 3H-TdR hinzugefügt und die Zellen nach 4 Stunden entnommen. Die 3H-TdR-lnkorporation wurde mittels Flüssigszintillation bestimmt. Die Untergrundzählrate betrug 1000 bis 1200 CPM. Für die Human-MLR wurden gereinigte pheripherale Lymphozyten von zwei HLA-disperaten Individuen für sechs Tage mit oder ohne Verbindung Nr. 45 ko-kultiviert. Nach 7 Tagen wurden die Kulturen mit 3H-TdR für 24 Stunden gepulst und durch Szintillation ausgezählt. Wie in Fig. 52A und 52B gezeigt, betrugen die ICso-Werte für die MTLC und MLR beide ungefähr 0,5 nM.
Fig. 51 veranschaulicht den Effekt der verzögerten Zugabe der Verbindung Nr. 45 auf die co-stimu-lierte Thymozytenproliferation. In einer Assay-Prozedur wurden murine Thymozyten mit ConA und IL-2 mit 1 nM der Verbindung Nr. 45 zugefügt, entweder 1 Stunde vor der IL-2 (-1) Zugabe, gleichzeitig mit IL-2 (O) oder zu unterschiedlichen Zeiten nachfolgend der IL-2 Zugabe (1-92 Stunden) stimuliert. Nach 92 Stunden wurden die Thymozyten mit 3H-TdR gepulst, entnommen und durch Szintillation nach 4 Stunden gezählt. Die in Fig. 53 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass die Erfindung Nr. 45 die Thymozytenproliferation maximal inhibiert, selbst wenn die Zugabe 24 Stunden nach der IL-2 Stimulation erfolgt. Des weiteren verbleibt eine signifikante Inhibierung sogar 72 und 92 Stunden nach der Zugabe von IL-2.
Fig. 52 zeigt, dass die erfindungsgemässe Verbindung Nr. 45 die anti-CD3 stimulierte Splenozyten-proliferation inhibiert. In dem Assay wurden murine Splenozyten mit einem gegen CD3 (1 ng/ml) gerichteten monoklonalen Antikörper aktiviert, was zu einer IL-2 vermittelten proliferativen Antwort führt. Die Untergrundzählrate betrug ungefähr 2000 cpm. Wie in Fig. 52 gezeigt, betrug der ICso-Wert zur Hemmung in Splenozyten um ca. 0,85 nM.
Fig. 53A und 53B zeigen, dass die Verbindung Nr. 45 die T-Zellen Rezeptor (CD3) vermittelte Signalgebung nicht inhibiert. Murine Splenozyten wurden über Nacht mit anti-CD3 in Anwesenheit oder Abwesenheit von CsA (0,1 nM) oder Verbindung Nr. 45 (1 nM inkubiert) - Fig. 53A. Nach der Über-Nacht-Inkubation wurden die Zellen gewaschen und mit IL-2 20 Stunden lang ohne Zugabe von CsA oder der erfindungsgemässen Verbindung restimuliert. Die Zellen wurden mit 3H-TdR für 4 Stunden gepulst, entnommen und die 3H-TdR-lnkorporation bestimmt. Die Präinkubation von Splenozyten mit CsA zusammen mit anti-CD3 blockiert das Vermögen der Zellen, auf IL-2 zu reagieren. Dies ist der Fall, da CsA eine TCR-vermittelte Regulation des IL-2 Alpha-Ketten-Rezeptors (CD25) zu höheren Werten inhibiert. Im Gegensatz hierzu blockiert eine Präinkubation der Splenozyten mit der erfindungsgemässen Verbindung und anti-CD3 nicht das Vermögen der Splenozyten auf IL-2 anzusprechen. Werden die Zellen zuerst mit anti-CD3 über Nacht behandelt, gewaschen und und unter Verwendung von IL-2 mit CsA (0,1 nM) rekultiviert, so wird die Proliferation verglichen mit der Alleinkontrolle durch IL-2 nicht inhibiert (Fig. 53B). CsA blockiert nicht IL-2 vermittelte Signalgebungsereignisse. Wurden jedoch anti-CD3 «ge-primte» Splenozyten mit IL-2 in Anwesenheit von CT-2576 (1 nM) stimuliert, so wurde die Proliferation gehemmt. Diese Daten demonstrieren, dass die Verbindung Nr. 45 die IL-2 induzierte Proliferation von anti-CD3 aktivierten Splenozyten spezifisch hemmt, ohne dass die TCR-vermittelte Aktivierung blockiert
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wird, was einen deutlich unterschiedlichen Mechanismus der Wirkungsweise im Vergleich zu CsA anzeigt.
In einem weiteren Assay zeigte die Verbindung Nr. 45 keine Hemmung der anti-CD3-vermittelten Up-Regulation der IL-2 Rezeptor Alpha-Untereinheit. Diese Daten sind den in Fig. 54A und 54B gezeigten Histogrammen zu entnehmen. Murine Splenozyten wurden für 24 Stunden mit anti-CD3 (1 ng/ml) aktiviert, mit einem Fluoreszenz-Antikörper zu CD25 gefärbt und mittels Fluss-Zytometrie analysiert. Fig. 54A zeigt ein Histogramm für mit oder ohne 100 nM CsA behandelte Zellen oder des Kontrollmediums. CsA inhibiert die CD-25-Rezeptor Up-Regulation durch Hemmung der TCR-Signalgebung. In Fig. 54B ist ein ähnliches Experiment gezeigt, mit dem Unterschied, dass die Zellen mit der Verbindung Nr. 45 (1 nM) anstelle von CsA behandelt wurden. Die Ergebnisse bestätigen, dass die Verbindung Nr. 45 die CD-25 (p55) Rezeptor Up-Regulation durch anti-CD3 nicht hemmt.
In einem weiteren Assay hemmte die Verbindung Nr. 45 nicht die IL-2 Rezeptor Beta (p70) Unterein-heit-lnternalisation und Zelloberflächen-down-Regulierung, die der IL-2 Stimulation folgt. In diesem As-say-Protokoll wurden CT-6.1-Zellen über Nacht ausgehungert und mit 20 ng/ml IL-2 stimuliert. Nachfolgend der IL-2 Stimulation wurden zu verschiedenen Zeiten Zellen schnell in eiskalter PBS suspendiert, mittels einem fluoreszinierten Monoklonal, welches die Beta-Untereinheit des IL-2 Rezeptors erkennt angefärbt und die Zelloberflächenexpression durch Fluss-Zytometrie analysiert.
In Fig. 55 ist die mittlere Fluoreszenz gegen die Zeit (Minuten) nachfolgend der IL-2 Zugabe aufgetragen, was veranschaulicht, dass die IL-2r Beta-Untereinheit nach der IL-2 Zugabe schnell internalisiert wurde, wobei die Zelloberflächenexpression sechs Stunden lang klein blieb. Die Verbindung Nr. 45 inhibierte nicht diese Rezeptor-Internalisation-Aktivität.
Wie in den Fig. 56A und 56B gezeigt, induziert die Verbindung Nr. 45 ebenso eine antigenspezifi-sche T-Zellen-Anergie. Murine Splenozyten wurden mit einer alloantigenen Target-Zell-Linie 2PK3 in Anwesenheit oder Abwesenheit der Verbindung Nr. 45 (1 nM; ungefährer ICso-Wert) stimuliert. Nach 5 Tagen in Kultur wurden die Zellen gewaschen, rekultiviert und mit dem ursprünglich startenden Antigen und anti-CD3 monoclonalem Antikörper stimuliert. Die sekundäre Reizantwort auf das Primer-Antigen wurde gehemmt, wenn die Zellen mit der Verbindung Nr. 45 während der 5tägigen Primärkultur kultiviert wurden. Die polyclonale T-Zellen-Antwort auf anti-CD3 wurde nicht beeinflusst, was anzeigt, dass die erfindungsgemässe Verbindung während der 5tägigen Primer-Periode nicht zytotoxisch wirkte. Obwohl mit der Verbindung Nr. 45 vorbehandelte Zellen normal auf eine polyclonale Stimulation ansprechen können, konnten diejenigen, welche mit dem Alloantigen beansprucht wurden, dies nicht. Daher induzierte Verbindung Nr. 45 einen spezifischen Zustand von Unansprechbarkeit oder Anergie auf das Alloantigen.
In Fig. 57 gezeigte Resultate veranschaulichen, dass die erfindungsgemässe Verbindung Nr. 45 die B-Zellen-Proliferation hemmt. Murine Splenozyten wurden mit anti-IgM-Antikörpern (10 ng/ml) und murinem IL-4 (12,5 ng/ml) stimuliert. Die Zellen wurden mit 3H-TdR für 44 Stunden gepulst, 4 Stunden später entnommen und die 3H-TdR-lncorporation wurde durch Flüssigszintillation bestimmt. Wie in Fig. 59 gezeigt, inhibierte die erfindungsgemässe Verbindung die Proliferation mit einem ICso von 1,2 nM.
Fig. 58A und 58B zeigen, dass die erfindungsgemässe Verbindung Nr. 45 eine CD28-vermittelte IL-2-Freisetzung nicht hemmt. Murine Splenozyten wurden mit einer Mischung von anti-CD3 und anti-CD28 monoclonalen Antikörpern stimuliert. Die Verbindung Nr. 45 inhibiert T-Zellen-Proliferation in diesem System (Fig. 60A), inhibierte jedoch nicht die CD28-vermittelte Freisetzung von IL-2 (Fig. 60B).
Die Fig. 58C und 58D zeigen, dass die Verbindung Nr. 45 die IFN-y-Freisetzung durch Blockierung der IL-2 Signalgebung inhibiert. Hierzu wurden murine Splenozyten mit einer Mischung von anti-CD3/ CD28 Antikörpern stimuliert. Die Verbindung Nr. 45 hemmt die Freisetzung von IFN-y (Fig. 60C). Zugabe eines anti-IL-2 Rezeptor alpha Untereinheit Antikörpers und eines anti-IL-2 Rezeptor beta Untereinheit Antikörpers zu den Kulturen hemmte sowohl die Proliferation als auch die Freisetzung von IFN-y (Fig. 60D). Dieses zeigt, dass die Hemmung von IFN-y-Freisetzung nach einer Stimulierung mit anti-CD28/CD3 aufgrund der Blockierung eines IL-2 Signals erfolgte.
Fig. 59A, 59B und 59C zeigen Assay-Ergebnisse der Untersuchung des Effektes der Verbindung Nr. 45 auf Zytokin-Freisetzung von anti-CD3-stimulierten Mäuse-Splenozyten. Die Zellen wurden mit anti-CD3 mit oder ohne entweder CsA (50 nM) oder Verbindung Nr. 45 (1 nM) stimuliert. Die gewählten Konzentrationen waren ungefähr gleich den ICso-Werten. Die Uberstände wurden entnommen und bezüglich der Zytokin-Gehalte mittels kommerziellen ELISA für die Proliferation getestet. Anti-CD3 stimulierte Freisetzung von IL-2, IFN-y und IL-4 (die Untergrundlevel für das Kontrollmedium waren vernachlässigbar). Wie in Fig. 59A gezeigt hemmte Verbindung Nr. 45 nicht signifikant die IL-2 Freisetzung im Gegensatz zu CsA. Verbindung Nr. 45 hemmte jedoch drastisch die IFN-y-Freisetzung ähnlich der zu CsA (Fig. 59B), was anzeigt, dass die erfindungsgemässe Verbindung einen unterschiedlichen Effekt auf die Th-2-Zellzytokin-Freisetzung hat, welche sowohl IL-2 als auch IFN-y absondern. Verbindung Nr. 45 hemmt nur teilweise die IL-4-Freisetzung, welche durch Th-2-Zellen hervorgerufen ist (Fig. 59C).
In einem Assay, verwandt dem MTLC Assay, wurden Zytokin-Gehalte durch ELISA von den Überständen einer MTLC-Kultur gemessen. Fig. 60A zeigt eine Hemmung der allgemeinen Proliferation durch Verbindung Nr. 45. Fig. 60B und 60C zeigen, dass die Verbindung Nr. 45 weder die IL-2- noch die TNFa-Freisetzung aus der MTLC hemmte. Im Gegensatz hierzu ist in Fig. 60D gezeigt, dass die Verbindung Nr. 45 die IFN-y-Freisetzung hemmte.
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Fig. 61 zeigt, dass die Verbindung Nr. 45 keinen Effekt auf die Prostaglandin E2 Freisetzung von IL-1a-stimulierten menschlichen Vorhaut-Fibroblasten HS68 hatte. Zellen wurden mit 100 pg/ml IL-1 a stimuliert. Die Verbindung Nr. 45 wurde eine Stunde vor der Stimulation zugegeben. Die Überstände wurden 24 Stunden später entnommen und die PGE2-Spiegel durch ein kommerzielles Immunoassay analysiert. Die Ergebnisse sind in Fig. 61 dargestellt und bestätigen, dass kein Effekt auf die PGE2-Freisetzung auftritt.
Die erfindungsgemässe Verbindung Nr. 45 hemmt die Adhäsion von monozytischen Leukämie-Zellen (THP-I) auf IL-1 ß oder TNFa-aktivierte HUVEC. HUVEC wurden mit 20 ng/ml IL-1 ß oder 15 ng/ml TNFa für 6 Stunden stimuliert. Fluoreszenz-markierte (BCECF-AM) THP-1-Zellen wurden für 20 Minuten ermöglicht an die HUVEC zu adhärieren, einmal gewaschen und der Anteil der verbleibenden Fluoreszenz mittels eines Fluoreszenz-Plättchen-Lesers analysiert. Die Ergebnisse, siehe Fig. 62A und 62B (TNFa oder lL-1 ß), zeigen eine Hemmung der THP-1 Adhäsion an HUVEC.
In Fig. 63A und 63B gezeigte Assay-Ergebnisse illustrieren, dass die Verbindung Nr. 45 die Adhäsi-on-Rezeptor-Expression an HUVEC hemmt. HUVEC wurden mit TNF-a (20 ng/ml) für 5 Stunden stimuliert und mittels fluoreszierenden Antikörpern zu ICAM-1 oder VCAM-1 gefärbt. Die Zelloberflächen-Expression wurde durch Fluss-Zytometrie analysiert. Alle Werte wurden auf den mittleren Fluoreszenz-Peak der positiven Kontrolle (=100%) normalisiert. Mittlere Induktions-Levels, die TNFa-Stimulation nutzend, waren 20fach höher für ICAM-1 und mehr als 50mal höher für VCAM-1 als der der nicht stimulierten Kontrolle, wie in Fig. 63A und 63B gezeigt.
Fig. 66 zeigt, dass die erfindungsgemässe Verbindung Nr. 45 die PDGF-induzierte murine Balb/3T3-Proliferation hemmte. Hierzu wurden Zellen über Nacht in einem 0,2% Serum ruhengelassen und mit 25 ng/ml PDGF stimuliert. Verbindung Nr. 45 wurde eine Stunde vor der Stimulation hinzugefügt. Die Zellen wurden 24 Stunden später mit 3H-TdR gepulst und zur Szintillationszählung 4 Stunden später entnommen. Wie in Fig. 64 gezeigt, hemmte Verbindung Nr. 45 die Proliferation in diesem Assay bei Konzentrationen kleiner als 30 ^M.
Zusammenfassend gesagt, ergeben die oben genannten Daten eine wesentliche Stütze für die Schlussfolgerung, dass Verbindung Nr. 45, stellvertretend für die hier offenbarten erfindungsgemässen Verbindungen, ein gutes immunosuppressives und entzündungshemmendes Therapeutikum darstellt, welches auf viele der kaskadenartigen Ereignisse, die für Krankheiten wie rheumatoide Arthritis charakteristisch sind, Einfluss hat.
Beispiel 46
Dieses Beispiel zeigt in vitro-Hinweise, die anzeigen, dass die erfindungsgemässen Verbindungen, repräsentiert durch einen Vertreter der offenbarten Gattung (Verbindung Nr. 58) wirkungsvolle Therapeutika für Atherosklerose und Restenose darstellen.
Die pathologischen Mechanismen, die zu Restenose führen, ahmen bei Atherosklerose beobachtete Prozesse nach, jedoch mit einem beschleunigten Ablauf. Sich aus Atherosklerose ergebende Arterienverengung ist das Endergebnis eines komplexen Prozesses, der eine Verletzung der Blutgefässe ein-schliesst, die durch subintimale Akkumulation von Lipiden eingeleitet, eine Kaskade von zellulär und Zytokin vermittelten Ereignissen triggern. Derartige Ereignisse schliessen eine Akkumulation von Thrombozyten und entzündungsfördernden Zellen am Ort der Verletzung ein. Zytokine werden freigesetzt, welche die Proliferation von glatten Muskelzellen stimulieren. Die beobachtete Arterienverengung erfolgt überwiegend aufgrund der lokalisierten Akkumulation von Makrophagen und der Proliferation von glatten Muskelzellen innerhalb der Arterienwand. Im Unterschied zu der langsamen chronischen Verengung bei Atherosklerose sind die Krankheitsprozesse nach arteriellen Verletzungen, die durch Angioplaste oder Vasculärchirugie hervorgerufen wurden, stark beschleunigt. Die zusammengefassten Ergebnisse der folgenden Assay-Daten zeigen, dass die Verbindung Nr. 58, stellvertretend für die erfindungsgemässen Verbindungen, eine Vielzahl der zellulär- und zytokin-vermittelten Ereignisse, die zu Atherosklerose und Restenose führen, hemmt.
Fig. 65A-65F illustrieren die Hemmung der Proliferation sowohl in human-aortischen als auch in pulmonalen glatten Muskelzellen (SMC) durch die erfindungsgemässe Verbindung Nr. 58. Zur Durchführung der Versuche wurden Zellen in 0,5% Serum enthaltendem Medium 24 Stunden vor der Stimulation mit unterschiedlichen Konzentrationen von PDGF (Fig. 65A und 65B), saurer FGF (Fig. 65C und 65D) oder basischer FGF (Fig. 65E und 65F) kultiviert. Die Zellen wurden 24 Stunden vor der Markierung mit 3H-TdR 4 Stunden stimuliert, abgetrennt und anhand der Szintillation gezählt. Verbindung Nr. 58 wurde eine Stunde vor der Stimulation in einer Konzentrationvon 5 ^M zugegeben. Selbst an Punktem maximaler Stimulation des Wachstumsfaktors inhibierte Verbindung Nr. 58 vollständig die zelluläre Proliferation sowohl in aortischer als auch in pulmonaler SMC. Darüber hinaus wurden Zellzahlen bestimmt und diejenigen, die mit Verbindung Nr. 58 behandelt wurden, zeigten keinen Anstieg der Zellzahl nach der Wachstumsfaktor-Stimulation.
Fig. 66A und 66B zeigen Dosis-Wirkungs- und Zytotoxizitäts-Kurven der Inhibierung der Proliferation in Balb/3T3-Zellen durch die Verbindung Nr. 58. In dem Assay-Protokoll wurden die Zellen über Nacht in einem 0,5% Serum enthaltenden Medium ausgehungert, gefolgt von einer Stimulation mit 20 ng/ml PDGF für 24 Stunden. Die Zellen wurden mit 3H-TdR für 4 Stunden markiert, entnommen und anhand
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der Szintillation gezählt. Der ICso-Wert der Inhibition in dieser Zell-Linie betrug ca. 200-500 nM, siehe Fig. 66A. Fig. 66B zeigt, dass die Verbindung Nr. 58 nicht zytotoxisch auf Balb/3T3-Zellen wirkte.
Wie in Fig. 67A und 67B gezeigt, hemmte die Verbindung Nr. 58 die VEGF-induzierte Proliferation in HUVEC und EGF-induzierter Proliferation in Swiss/3T3-Zellen. Zur Durchführung wurden HUVEC in einem 0,5% Serum enthaltenden Medium vor der Stimulation mit unterschiedlichen Konzentrationen von VEGF eingebracht, mit oder ohne der Verbindung Nr. 58 (5 nM). Nach 20 Stunden wurden die Zellen mit 3H-TdR gepulst, nach 4 Stunden entnommen und anhand der Szintillationsmessung gezählt. ICso der Inhibition betrug ungefähr 50-100 nM. Swiss/3T3-Zellen wurden mit mit 20 ng/ml EGF stimuliert, nach 24 Stunden entnommen und anhand der Szintillation gezählt. Der ICso der Inhibition betrug ungefähr 20 nM.
Fig. 68 veranschaulicht einen Effekt auf die verzögerte Zugabe der Verbindung Nr. 58 auf die Balb/ 3T3-Proliferation als Antwort auf PDGF-BB. Die Zellen wurden mit PDGF (20 ng/ml) stimuliert und die Verbindung Nr. 58 entweder gleichzeitig mit PDGF (O) oder zu verschiedenen Zeiten nach der Zugabe von PDGF, bis zu nach 6 Stunden, zugegeben. Nach 24 Stunden wurden die Zellen mit 3H-TdR gepulst und durch Szintillation nach 4 Stunden gezählt. Weitere Experimente zeigten nahezu eine vollständige Hemmung der Proliferation, selbst dann, wenn Verbindung Nr. 58 erst 20 Stunden nach der PDGF-Zugabe zugefügt wurde.
Fig. 69 zeigt, dass die erfindungsgemässe Verbindung Nr. 58 die PDGF-induzierte Proliferation in Balb/3T3-Zellen in einem grösseren Ausmass hemmte, als die Serum-induzierte Proliferation. Nach dem Assay-Protokoll wurden Zellen durch Serumentzug für 24 Stunden ausgehungert, bevor entweder 20 ng/ml PDGF oder 10% Serum zugegeben wurden. Die Zellen wurden nach 24 Stunden mit 3H-TdR gepulst. Die erfindungsgemässe Verbindung Nr. 58 zeigte keinen signifikanten Effekt auf die Serum-in-duzierte Balb/3T3-Proliferation.
Wie in Fig. 70 gezeigt, wird die Endothelial-Zellenmigration durch die Verbindung Nr. 58 gehemmt. HUVEC werden in einem Matrigel-Invasions-Assay-System (Becton Dickinson) eingebracht und VEGF-induzierte Migration mit oder ohne variierende Konzentrationen der Verbindung Nr. 58 getestet. Die Ma-trigel-Migration von HUVEC auf 50 ng/ml VEGF wurde in einer Dosis-abhängigen Art und Weise mit einem ICso-Wert von ungefähr 100-200 nM gehemmt.
Fig. 71 zeigt, dass die Verbindung Nr. 58 die Chemotaxis von humanen glatten Muskelzellen (SMC) auf PDGF nicht hemmte. In dem Assay wurden Zellen in eine Boyden-Kammer mit oder ohne unterschiedliche Konzentrationen der Verbindung Nr. 58 eingebracht. Nach 8 Stunden wurde die Zahl der gewanderten Zellen visuell gezählt. Die Verbindung Nr. 58 zeigte keinen Effekt auf die PDGF-gerichtete SMC-Chemotaxis.
Fig. 72A und 72B zeigen, dass die erfindungsgemässe Verbindung Nr. 58 die THP-1 Zelladhäsion an entweder TNF oder IL-1-stimulierte HUVEC hemmte. Zur Durchführung wurden HUVEC mit TNF oder IL-1 für 8 Stunden stimuliert und THP-1-Zellen für 20 Minuten zugegeben. Die HUVEC wurden anschliessend gewaschen und bezüglich der Adhärenz analysiert. Die Verbindung Nr. 58 hemmte die Adhäsion von THP-1-Zellen an HUVEC mit einem ICso-Wert von ungefähr 1 nM, sowohl für TNF als auch für IL-1.
Die Fig. 73A und 73B veranschaulichen die Hemmung der erfindungsgemässen Verbindung Nr. 58 auf die VCAM oder ICAM-Expression in durch TNF aktivierter HUVEC. Die Zellen wurden für 8 Stunden in Gegenwart oder in Abwesenheit der erfindungsgemässen Verbindungen stimuliert, mit fluoreszierenden Antikörpern auf VCAM oder ICAM gefärbt und durch Fluss-Zytometrie analysiert.
Fig. 74 zeigt, dass die erfindungsgemässe Verbindung Nr. 58 die TNF-Freisetzung unter Verwendung eines human-Vollblut-exvivo-Assays hemmte. In diesem Assay wurde humanes Vollblut mit Mäuse-TNFa und human IL-1 a mit oder ohne unterschiedliche Konzentrationen der Verbindung Nr. 58 stimuliert. Nach 6 Stunden wurde das Plasma bezüglich des Human-TNFa-Spiegels mittels kommerzieller ELISA analysiert. Die Ergebnisse sind in Fig. 74 gezeigt.

Claims (14)

Patentansprüche 1. Verbindung mit der Formel: (X)j - (Grundstruktur), j ist eine ganze Zahl von 1 bis 3 und die Grundstruktur nicht zyklisch, carbozyklisch oder heterozyklisch, wobei eine carbozyklische oder heterozyklische Grundstruktur zumindest einen vier- bis sieben-gliedrigen Ring enthält und X ein racemisches Gemisch, ein R- oder ein S-Enantiomer, ein Solvat, ein Hydrat oder ein Salz des Restes: 45 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 CH 686 830 A5 r 2 or3 n •c <CH2>m r
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ist, wobei *C ein chirales Kohlenstoffatom darstellt, n eine ganze Zahl von eins bis vier ist; eines oder mehrere Kohlenstoffatome der (CH2)n-Einheit durch eine Keto- oder eine Hydroxygruppe substituiert sein können; m ist eine ganze Zahl von vier bis vierzehn; unabhängig voneinander sind Ri und R2 Wasserstoff, Phenyl, geradkettiges oder verzweigtes substituiertes oder unsubstituiertes Alkyl oder Alkenyl, mit einer Länge von bis zu achtzehn Kohlenstoffatomen, oder -(CH2)wRs, wobei w eine ganze Zahl von eins bis vierzehn und Rs eine mono-, di- oder trisubstituierte oder unsubstituierte Arylgruppe oder alizyklinsche Struktur mit drei bis zu sechs Ringatomen ist, wobei die Substituenten des Restes R5 Hydroxy-, Chlor, Fluor, Brom, Amino oder C1-6 Alkoxygruppen darstellen; oder Ri und R2, miteinander verbunden eine substituierte oder unsubstituierte, gesättigte oder ungesättigte heterozyklische Gruppe darstellen, die vier bis acht Kohlenstoffatome enthält; R3 ist ein Wasserstoffatom oder ein Ci-3-Rest oder wobei R4 ein Wasserstoffatom, geradkettiges oder verzweigtes Alkyl oder Alkenyl mit einer Länge von bis zu acht Kohlenstoffatomen, -(CH2)wRs, wobei w eine ganze Zahl von zwei bis vierzehn und Rs eine mono-, di- oder trisubstituierte oder unsubstituierte Arylgruppe darstellt, wobei die Substituenten von Rs Hydroxy-, Chlor, Fluor, Brom, oder C1-6 Alkoxygruppen, oder eine substituierte oder unsubstituierte, gesättigte oder ungesättigte heterozyklische Gruppe darstellen, die vier bis acht Kohlenstoffatome aufweist; r und s unabhängige ganze Zahlen von eins bis vier darstellen; wobei die Summe (r+s) nicht grösser als fünf ist; t eine ganze Zahl von eins bis vierzehn darstellt; und ein oder mehrere Kohlenstoffatome der (CH2)s- oder (CH2)r- Gruppe durch eine Keto- oder Hydroxygruppe substituiert sein können.
2. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die nichtzyklische Grundstruktur ein Rest aus der nachfolgenden Gruppe von Verbindungen ist; Acetamid, Amid, Amin, eine oder zwei Aminosäuren, Ester, Glutarsäure, Glycinderivaten, Keton, Phosphat, Phosphonat, Sulfat, Sulfonat, Sul-fon, Sulfoxid oder Thiolester oder folgender Rest: eine einfache ionische funktionelle Gruppe, Thiol, Carboxyl, Halogenatom, endständiges Wasserstoffatom oder Hydroxyl.
3. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Grundstruktur ein bis drei fünf-bis sechsgliedrige Ringstrukturen in einer vonwiegend planaren Struktur aufweist.
4. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Grundstruktur ein Rest aus der nachfolgenden Gruppe von Verbindungen ist, bestehend aus substituierter oder unsubstituierten Bar-bitursäure; Benzamid; Benzol; Biphenyl; Cyclohexadion; Cyclopentadion; Delta-Lactam; Flutarimid; Glutarimid; Homophthalimid; Imidazolamid; Isocarbostyril; Lumazin; Naphthalin; Pteridin; Phthalimid; Pi-peridin; Pyridin; Pyrimidin; Pyrrolamid; Chinazolindion; Chinazolinon; Chinoloni Resorcin; Stilben; Succi-nimid; Theobromin; Thymin, Triazin und Tricyclododekan.
5. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Grundstruktur ein Rest aus einer Gruppe von Verbindungen bestehend aus substituiertem oder unsubstituiertem Glutarimid, Methylthymin, Methyluracil, Thymin, Theobromin, Uracil und Xanthin ausgewählt ist.
(CH2)—>*C
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6. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Grundstruktur ein Rest von Xanthin ist, X an das NrStickstoffatom des Xanthins gebunden ist und die N3- und NyStickstoffatome des Xanthins unabhängig voneinander mit einem Mitglied ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Methyl, Fluor, Chlor und Amino, substituiert sind.
7. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Grundstruktur ein Rest aus der folgenden Gruppe von Verbindungen ausgewählt ist, bestehend aus: 1,3-Cyclohexandion, 1,3-Cyclopen-tandion, 1,3-Dihydroxynaphthalin, 1-Methyllumazin, Methylbarbitursäure, 3,3-Dimethylflutarimid, 2-Hy-droxypyridin, Methyldihydroxypyrazolpyrimidin, Methylpyrrolpyrimidin, 2-Pyrrolamid, 3-Pyrrolamid, 1,2,3,4-Tetrahydro-isochinolon, 1-Methyl-2,4(1 H,3H)-Chinazolindion(1-Methylbenzoylenharnstoff), Chinazolin-4(3H)-on, alkylsubstituiertes (Ci-6)Thymin, Methylthymin, alkyl-substituiertes (Ci_e) Uracil, 6-Aminouracil, 1-Methyl-5,6-dihydrouracil, 1-Methyluracil, in 5- und/oder 6-Stellung substituierte Uracile, 1,7-Dimethyl-xanthin, 3,7-Dimethylxanthin, 3-Methylxanthin, 3-Methyl-7-Methyl-pivaloylxanthin, 8-Amino-3-methylxant-hin und 7-Methyl-hypoxanthin.
8. Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung eine der folgenden Verbindungen darstellt:
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CH,
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H OH O CH,
CH,
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I
h oh o en ch,
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SV 008 989 HO
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9. Pharmazeutische Zusammensetzung bestehend aus einer Verbindung nach Anspruch 1 und einem pharmazeutisch annehmbaren Excipienten, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung für eine orale, parenterale, oder topische Verabreichung an einen Patienten oder in der Form einer ex vivo-Kultur formuliert ist.
10. Verwendung der Verbindung nach Anspruch 1 für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Vorbeugung von Autoimmunerkrankungen, wobei die Autoimmunerkrankung aus der nachfolgenden Gruppe ausgewählt ist: insulinabhängiger Diabetes Mellitus (IDDM), Erwachsenendiabetes, Atherosklerose, Multiple Sklerose, Psoriasis, Asthma, periodontale Erkrankung, Osteoporosis, alkoholische Hepatitis, Frühgeburt als Folge von Uterusinfektionen, Autoimmunthyroiditis, Alzheimer Krankheit, rheumatoide Arthritis, glomerulare Nephritis, Darmentzündung und Lupus.
11. Verwendung der Verbindung nach Anspruch 1 für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Vorbeugung akuter oder chronischer Entzündungskrankheiten, AIDS und AIDS verwandter Komplex, alkoholische Hepatitis, Allergien aufgrund einer Degranulation von Mastzellen und Basophilen, Angiogenese, Asthma, Atherosklerose, Autoimmunthyroiditis, coronare Arterienerkrankungen, glomeruläre Nephritis, Haarausfall oder Glatzenbildung, HlV-assoziierte Dementia, Darmentzündungen, insulinabhängiger Diabetes Mellitus, Lungenhypoxie, Lupus, Malignität, Multiple Sklerose, myelogeni-sche Leukämie, Organ- oder Hematopoese in Antwort auf zytotoxische Therapien, Osteoarthritis, Osteoporosis, Peridontalerkrankungen, Frühgeburten als Folge von Uterusinfektionen, Psoriasis, Restenosis, rheumatoide Arthritis, Schlafstörungen, septischer Schock, Sepsis-Syndrom, Skleroderma, Iktus- und Transplantatabstossungen in Säugetieren.
12. Verwendung nach Anspruch 10 oder 11, zur Herstellung eines Arzneimittels das für eine orale, parenterale oder topische Verabreichung an einen Patienten, oder in der Form einer ex vivo-Kultur formuliert ist und wobei eine orale Dosis 50 mg bis 1500 mg der Verbindung nach Anspruch 1 eine parenterale Dosis 1,0 g bis 5,0 g der Verbindung nach Anspruch 1 aufweist, eine topische Formulierung eine Konzentration zwischen 1%-Gew. bis 4%-Gew. aufweist und die Konzentration der ex vivo-Kultur zwischen 10 jiM und 500 beträgt.
13. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach Anspruch 1, wobei n in der angegebenen Teilform gleich 1 ist, dadurch gekennzeichnet, dass eine die Grundstruktur aufweisende Verbindung mit einer geeigneten Base, Lösungsmittel und substituiertem Olefin der Formel CH2=CH- (CH2)m-R, worin R ein mit der Verbindung mit der Grundstruktur reaktionsfähiger Rest ist, zu einem Zwischenprodukt umgesetzt wird, wobei das Zwischenprodukt eine zusammengesetzte Struktur bestehend aus der Grundstruktur und dem substituierten Olefin aufweist, das Zwischenprodukt einer Reaktion mit einer organi53
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sehen Persäure zu einem die Grundstruktur enthaltenden Epoxid umgesetzt wird und das die Grundstruktur enthaltende Epoxid mit einem entsprechenden substituierten oder unsubstituierten Amin zur Reaktion gebracht wird, wodurch eine Verbindung nach Anspruch 1, wobei j gleich 1 ist, erhalten wird.
14. Verbindung nach der Formel
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