CH689672A5 - Katalytische Untereinheit menschlicher Telomerase. - Google Patents

Description

  
 



  Die vorliegende Erfindung betrifft neue Nucleinsäuren und Polypeptide, die die katalytische Untereinheit von Telomerase codieren. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die katalytische Untereinheit von menschlicher Telomerase. Die Erfindung stellt Verfahren und Zusammensetzungen bereit, die die Medizin, Molekularbiologie, Chemie, Pharmakologie und medizinische, diagnostische und prognostische Verfahren betreffen. 



  Die folgende Diskussion soll den Leser in das Gebiet, auf das sich die vorliegende Erfindung bezieht, einführen. Das Zitieren verschiedener Literaturstellen in diesem Abschnitt soll nicht als ein Eingeständnis einer Vorwegnahme der Erfindung verstanden werden. 



  Es ist schon lange bekannt, dass die vollständige Replikation der Enden von eukaryotischen Chromosomen spezialisierte Zellbestandteile erfordert (Watson, Nature New. Biol. 239 (1972), 197 und Olovnikov, J. Theor. Biol. 41 (1973), 181). Die Replikation eines linearen DNA-Strangs durch übliche DNA-Polymerasen erfordert einen RNA-Primer und sie kann nur in 5 min -3 min -Richtung fortschreiten. Bei Entfernung der an das äussere 5 min -Ende chromosomaler eukaryotischer DNA-Stränge gebundene RNA wird eine Lücke eingeführt, was zu einer fortschreitenden Verkürzung der Tochterstränge bei jeder Replikationsrunde führt. Diese Verkürzung von Telomeren, die die an den Enden von Chromosomen physisch lokalisierten Protein/DNA-Strukturen darstellen, scheint der Grund für das Phänomen der zellulären Seneszenz oder Alterung (siehe z.B. Goldstein, Science 249 (1990), 1129; Martin et al., Lab.

   Invest. 23 (1979), 86; Goldstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 64 (1969), 155 und Schneider und Mitsui, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 73 (1976), 3584) normaler menschlicher somatischer Zellen in vitro und in vivo zu sein. 



  Die Länge und Integrität von Telomeren steht somit mit dem Eintritt einer Zelle in einen seneszenten Status (d.h. den Verlust der Proliferationsfähigkeit) in Zusammenhang. Da rüber hinaus dürfte die Fähigkeit einer Zelle die Telomerlänge zu bewahren (oder zu steigern) es der Zelle erlauben, der Seneszenz zu entgehen, d.h. unsterblich zu werden. 



  Die Struktur von Telomeren und Telomer-DNA wurde in zahlreichen Systemen untersucht (siehe z.B. Harley und Villeponteau, Curr. Opin. Genet. Dev. 5 (1995), 249). In den meisten Organismen besteht Telomer-DNA aus einem Tandemarray von sehr einfachen Sequenzen; in Menschen und anderen Vertebraten besteht Telomer-DNA aus hunderten bis tausenden von Tandemwiederholungseinheiten der Sequenz TTAGGG. Verfahren zur Bestimmung und Modulierung der Telomerlänge in Zellen  sind in den PCT-Veröffentlichungen WO 93/23 572 und WO 96/41 016 beschrieben. 



  Die Wahrung von Telomeren ist eine Funktion einer Telomerspezifischen DNA-Polymerase, die als Telomerase bekannt ist. Telomerase ist ein Ribonucleoprotein (RNP), das einen Anteil seiner RNA-Einheit als eine Matrize für die Synthese der DNA-Telomer-Wiederholungseinheiten verwendet (Morin, Eur. J. Cancer 33 (1997), 750; Yu et al., Nature 344 (1990) 126; Singer und Gottschling, Science 266 (1994), 404; Autexier und Greider, Genes Develop. 8 (1994), 563; Gilley et al., Genes Develop. 9 (1995), 2214; Mc Eachern und Blackburn, Nature 367 (1995), 403; Blackburn, Ann. Rev. Biochem. 61 (1992), 113; Greider, Ann. Rev. Biochem. 65 (1996), 337). Die RNA-Bestandteile von menschlichen und anderen Telomerasen wurden cloniert und charakterisiert (siehe die PCT-Veröffentlichung WO 96/01835 und Feng et al., Science 269 (1995), 1236).

   Die Charakterisierung der Proteinbestandteile von Telomerase war jedoch schwierig. Dies rührt teilweise daher, dass es sich als schwierig herausgestellt hat, Telomerase-RNP zu reinigen, das in Zellen, in denen es exprimiert wird, nur in äusserst geringen Konzentrationen vorhanden ist. Beispielsweise nahm man an, dass menschliche Zellen, von denen man weiss, dass sie hohe Spiegel an Telomerase-Aktivität exprimieren, lediglich etwa 100 Enzymmoleküle pro Zelle besitzen. 



  Übereinstimmend mit der Beziehung von Telomeren und Telomerase mit der Proliferationsfähigkeit einer Zelle (d.h. der Fähigkeit einer Zelle, sich unbegrenzt zu teilen), wurde Telomerase-Aktivität in unsterblichen Zellinien und in ausgesprochen unterschiedlichen Arten von Tumorgeweben nachgewiesen, sie wurde jedoch nicht in normalen somatischen Zellkulturen oder normalen Geweben in Nachbarschaft eines Tumors (siehe US-Patente mit den Nummern 5 629 154; 5 489, 508; 5 648 215 und 5 639 613; siehe auch Morin, Cell 59 (1989) 521; Shay und Bacchetti, Eur. J. Cancer 33 (1997), 78 7; Kim  et al., Science 266 (1994), 2011; Counter et al., EMBO J. 11 (1992), 1921; Counter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994), 2900 und Counter et al., J. Virol. 68 (1994), 3410) nachgewiesen (d.h. war nicht vorhanden oder unter der Nachweisgrenze des Assays).

   Darüber hinaus wurde über einen Zusammenhang zwischen dem Spiegel an Telomeraseaktivität in einem Tumor und des wahrscheinlichen klinischen Verlaufs der Krankheit des Patienten berichtet (z.B. US-Patent Nr. 5,639,613, a.a.O., und Langford et al., Hum. Pathol. 28 (1997), 416). Telomerase-Aktivität wurde auch in menschlichen Keimzellen, proliferierenden Stammzellen oder Nachkommen davon und aktivierten Lymphocyten nachgewiesen. In somatischen Stammzellen oder den Nachkommen davon und in aktivierten Lymphocyten ist die Telomerase-Aktivität typischerweise entweder sehr gering oder nur transient exprimiert (siehe Chiu et al., Stem Cells 14 (1996), 239, Bodnar et., Exp. Cell Res. 228 (1996), 58 und Taylor et al., J. Invest. Dermatology 106 (1996), 759). 



  Menschliche Telomerase ist ein ideales Ziel für die Diagnose und Behandlung menschlicher Krankheiten, die sich auf zelluläre Proliferation und Seneszenz, wie beispielsweise Krebs, beziehen. Verfahren zur Diagnose und Behandlung von Krebs und anderen mit Telomerase in Zusammenhang stehenden Krankheiten in Menschen sind in den US-Patenten Nr. 5 489 508, 5 639 613 und 5 645 986 beschrieben. Verfahren zur Vorhersage des Fortschreitens eines Tumors durch Beobachtung von Telomerase sind in dem US-Patent Nr. 5 639 613 beschrieben. Das Auffinden und die Charakterisierung der katalytischen Protein-Untereinheit menschlicher Telomerase würde zusätzliche nützliche Assays für Telomerase und für die Diagnose und Therapie von Krankheiten bereitstellen.

   Darüber hinaus würde es die Clonierung und die Bestimmung der Primärsequenz der katalytischen Protein-Untereinheit erlauben, wirksamere Therapien für menschlichen Krebs und andere Krankheiten, die mit der Proliferationsfähigkeit und Seneszenz von Zellen zusammenhängen, bereitzustellen. 



  Die vorliegende Erfindung stellt eine isolierte, im wesentlichen reine oder rekombinante Proteinpräparation eines Telomerase-reverse Transkriptase-Proteins oder einer Variante oder eines Fragments davon bereit. In einer Ausführungsform weist das Protein folgende Aminosäuresequenz auf: 
EMI5.1
 
 



  wobei X eine beliebige Aminosäure ist und eine tiefgestellte Zahl sich auf die Anzahl von aufeinanderfolgenden Resten bezieht, R1 Leucin ist oder Isoleucin, R2 Glutamin oder Arginin, R3 Phenylalanin oder Tyrosin und R4 Lysin oder Histidin. In einer Ausführungsform hat das Protein eine Sequenz von menschlicher TRT. In anderen Ausführungsformen betrifft die Erfindung Peptide und Polypeptide, die mit einer Untersequenz solcher Proteine im wesentlich Sequenzidentität gemeinsam haben. 



  In einer verwandten Ausführungsform stellt die Erfindung eine isolierte, im wesentlichen reine oder rekombinante Nucleinsäure bereit, die ein Telomerase-reverse Transkriptase-Protein codiert. In einer Ausführungsform hat das Protein die folgende Aminosäuresequenz: 
EMI5.2
 
 



  In einer Ausführungsform hat die Nucleinsäure eine Sequenz menschlicher TRT. In weiteren Ausführungsformen betrifft die Erfindung Oligonucleotide und Polynucleotide, die mit einer Untereinheit solcher Nucleinsäuren wesentliche Sequenzidentität gemeinsam haben. 



  Ein erfindungsgemässer Aspekt betrifft menschliche Telomerase-reverse Transkriptase (hTRT). Somit stellt die Erfindung in einer Ausführungsform eine isolierte, im wesentlichen reine oder rekombinante Proteinpräration eines menschlichen Telomerase-reverse Transkriptase (hTRT)-Proteins oder einer Variante oder eines Fragments davon bereit. 



  In einer Ausführungsform ist das Protein durch eine Aminosäure gekennzeichnet mit mindestens etwa 75% oder mindestens etwa 80% Sequenzidentität zu dem hTRT-Protein von SEQ. ID. Nr. 2 (Fig. 17) oder eine Variante oder eines Fragments davon. In einer verwandten Ausführungsform hat das hTRT-Protein die Sequenz von SEQ. ID. Nr. 2. In einigen Ausführungsformen weist das Protein eine oder mehrere Telomerase-Aktivitäten auf, beispielsweise katalytische Aktivität. In einer Ausführungsform weist das hTRT-Proteinfragment mindestens 6 Aminosäurereste auf. 



  Die Erfindung stellt auch eine, ein hTRT-Protein und eine RNA umfassende Zusammensetzung bereit. Die RNA kann eine Telomerase-RNA sein, beispielsweise eine RNA menschlicher Telomerase. In einer Ausführungsform bilden das hTRT-Protein und die RNA menschlicher Telomerase einen Ribonucleoproteinkomplex mit einer Telomerase-Aktivität. 



  Ein erfindungsgemässer Aspekt betrifft die Bereitstellung isolierter menschlicher Telomerase, beispielsweise einer im wesentlichen reinen menschlichen Telomerase, die menschliche Telomerase-reverse Transkriptase (hTRT) und menschliche Telomerase RNA (hTR) umfasst. In einer Ausführungsform hat die Telomerase eine Reinheit von mindestens etwa 95%. Die Telomerase kann aus einer Zelle isoliert sein. 



  Ein weiterer erfindungsgemässer Gesichtspunkt betrifft die Bereitstellung eines isolierten, synthetischen, im wesentlichen reinen oder rekombinanten Polynucleotids, das eine ein hTRT-Protein codierende Nucleinsäuresequenz umfasst. In einer Ausführungsform hat das Polynucleotid eine Nucleotidsequenz, die ein hTRT-Protein codiert, das eine in SEQ. ID. Nr. 2 angegegebene Aminosäuresequenz hat, oder eine Sequenz, die eine oder mehrere konservative Substitutionen in dieser Aminosäuresequenz umfasst. Ein verwandter Aspekt betrifft die Bereitstellung eines Polynucleotids, das unter stringenten Bedingungen mit einem Polynucleotid mit der Sequenz von SEQ.  ID. Nr. 1 hybridisiert. In einer weiteren verwandten Ausführungsform hat die Nucleotidsequenz des Polynucleotids eine kleinste Summenwahrscheinlichkeit von weniger als etwa 0,5 im Vergleich zu einer in SEQ. ID.

   Nr. 1 angegebenen Nucleotidsequenz mittels des BLAST-Algorithmus unter Verwendung von Voreinstellungsparametern. 



  Ein weiterer erfindungsgemässer Aspekt betrifft die Bereitstellung eines Polynucleotids mit einer Promotorsequenz, die mit der das hTRT-Protein codierenden Sequenz funktionell verknüpft ist. Der Promotor kann ein Promotor sein, der nicht dem natürlich vorkommenden hTRT-Promotor entspricht. Ein verwandter erfindungsgemässer Gesichtspunkt betrifft die Bereitstellung eines Expressionsvektors, der das hTRT-Polynucleotid umfasst. 



  Die Erfindung stellt auch ein isoliertes, synthetisches, im wesentlichen reines oder rekombinantes Polynucleotid bereit, das eine Länge von mindestens 10 Nucleotiden aufweist und eine aufeinanderfolgende Sequenz von mindestens 10 Nucleotiden umfasst, die zu einer aufeinanderfolgenden Sequenz in einem natürlich vorkommenden hTRT-Gen oder hTRT-mRNA identisch oder genau komplementär ist. In einigen Ausführungsformen ist das Polynucleotid eine RNA, eine DNA, oder es enthält ein oder mehrere nicht natürlich vorkommende, synthetische Nucleotide. In einer Ausführungsform ist das Polynucleotid identisch oder genau komplementär zu der aufeinanderfolgenden Sequenz von mindestens 10 aufeinanderfolgenden Nucleotiden in einem natürlich-vorkommenden hTRT-Gen oder einer hTRT-mRNA. Beispielsweise kann das Polynucleotid ein "antisense"-Polynucleotid sein.

   In einer anderen Ausführungsform umfasst das antisense-Polynucleotid mindestens etwa 20 Nucleotide. 



  Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung rekombinanter Telomerase durch Inkontaktbringen eines rekombinanten hTRT-Proteins mit einem Telomerase-RNA-Bestandteil  unter solchen Bedingungen bereit, dass das rekombinante Protein und der Telomerase-RNA-Bestandteil zur Bildung eines Telomerase-Enzyms assoziieren, das die Hinzufügung von Nucleotiden zu einem Telomerase-Substrat katalysieren kann. In einer Ausführungsform hat das hTRT-Protein die Sequenz von SEQ. ID.    Nr. 2. Das hTRT-Protein kann in einem in vitro-Expressionssystem hergestellt und mit einer Telomerase-RNA vermischt werden; in einer anderen Ausführungsform wird die Telomerase-RNA in dem in vitro-Expressionssystem coexprimiert. In einer Ausführungsform ist die Telomerase-RNA menschliche Telomerase-RNA.

   In einer alternativen Ausführungsform geschieht das Inkontaktbringen in einer Zelle, beispielsweise einer menschlichen Zelle. In einer Ausführungsform weist die Zelle keine Telomeraseaktivität vor dem Inkontaktbringen von hTRT und der RNA eines hTRT-Polynucleotids (oder der Einführung z.B. durch Transfektion) auf. In einer Ausführungsform wird die Telomerase-RNA natürlicherweise von der Zelle exprimiert. 



  Die Erfindung stellt auch eine Zelle bereit, beispielsweise eine menschliche Zelle, Mauszelle oder Hefezelle, die die erfindungsgemässen rekombinanten Polynucleotide enthält, beispielsweise ein Polynucleotid mit einer mit einem Promotor funktionell verknüpften, ein hTRT-Protein codierenden Sequenz. Hinsichtlich bestimmter Aspekte ist die Zelle eine Vertebratenzelle, beispielsweise eine Zelle eines Säugers, z.B. eines Menschen, und weist eine erhöhte Proliferationsfähigkeit relativ zur Zelle auf, die ansonsten identisch ist, jedoch nicht das rekombinante Polynucleotid umfasst, oder sie weist einen erhöhten Telomerase-Aktivitätsspiegel auf, relativ zu einer Zelle, die ansonsten identisch ist, jedoch nicht rekombinante Polynucleotide umfasst. In einigen Ausführungsformen ist die Zelle unsterblich. 



  Verwandte erfindungsgemässe Ausführungsformen betreffen die Bereitstellung von Organismen und Zellen, die ein Polynucleotid umfassen, das ein menschliches Telomerase-reverse  Transkriptase-Polypeptid ist. Dazu zählen ein transgener nicht-menschlicher Organismus, wie beispielsweise Hefe, eine Pflanze oder Bakterium oder ein Tier, beispielsweise eine Maus. Die Erfindung stellt auch transgene Tiere und Zellen bereit, bei denen ein hTRT-Gen deletiert wurde ("knockedout") oder so mutiert wurde, dass das Gen ein natürlich vorkommendes hTRT-Genprodukt nicht exprimiert.

   Somit hat in alternativen Ausführungsformen das transgene Tier ein mutiertes Telomerasegen, ist ein hinsichtlich einer Telomerase-Aktivität defizientes Tier, ist ein Tier, dessen TRT-Defizienz das Ergebnis eines mutierten Gens ist, das eine TRT mit einem herabgesetzten Spiegel an Telomerase-Aktivität im Vergleich zu einem Wildtyp-TRT besitzt oder ein Tier mit einem mutierten TRT-Gen mit einer oder mehreren Mutationen, wozu "missense" Mutationen, "nonsense"-Mutationen, Insertionen und Deletionen zählen. 



  Die Erfindung stellt auch einen isolierten oder rekombinanten Antikörper oder ein Fragment davon bereit, die an hTRT-Protein spezifisch binden. In einer Ausführungsform bindet der Antikörper mit einer Affinität von mindestens etwa 10<8>M<-><1>. Der Antikörper kann eine monoclonale oder polyclonale Zusammensetzung, beispielsweise ein polyclonales Antiserum, sein. Ein verwandter erfindungsgemässer Aspekt betrifft die Bereitstellung einer Zelle, die den Antikörper sezernieren kann, beispielsweise ein Hybridom. 



  Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Nachweis zur Verfügung, ob eine Verbindung oder eine Behandlung ein Modulator einer reversen Transkriptase-Aktivität von Telomerase oder der hTRT-Expression ist durch den Nachweis oder die Überwachung einer Veränderung in der Aktivität oder Expression in einer Zelle, einem Tier oder einer Zusammensetzung, die ein hTRT-Protein oder entsprechendes Polynucleotid umfasst, nach Verabreichung der Verbindung oder der Behandlung. In einer Ausführungsform beinhaltet das Verfahren die folgenden Schritte: Bereitstellung einer TRT-Zusammensetzung,  Inkontaktbringen der TRT mit der Testverbindung und Messung der Aktivität der TRT, wobei eine Veränderung in der TRT-Aktivität in Gegenwart der Testverbindung ein Indikator dafür ist, ob die Testverbindung TRT-Aktivität moduliert.

   In bestimmten Ausführungsformen ist die Zusammensetzung eine Zelle, ein Organismus, ein transgener Organismus oder ein in vitro-System, beispielsweise ein Expressionssystem, das ein ein hTRT-Polypeptid codierendes rekombinantes Polynucleotid enthält. Somit kann die menschliche Telomerase-reverse Transkriptase dieses Verfahrens ein Produkt einer in vitro-Expression sein.

   In verschiedenen Ausführungsformen kann der Nachweis einer Telomerase-Aktivität oder -Expression dadurch erfolgen, dass eine Veränderung in der Häufigkeit eines hTRT-Genprodukts dadurch nachgewiesen wird, dass der Einbau einer Nucleotidmarkierung in ein Substrat für Telomerase überwacht wird, die Hybridisierung einer Sonde mit einem verlängerten Telomerase-Substrat, die Amplifikation eines verlängerten Telomerase-Substrats, die Telomerlänge einer der Testverbindung ausgesetzten Zelle und der Verlust der Fähigkeit der Telomerase an ein Chromosom zu binden oder durch die Messung der Anreicherung oder des Verlusts einer Telomerstruktur. 



  Ein erfindungsgemässer Aspekt betrifft die Bereitstellung eines Verfahrens zum Nachweis eines menschlichen Telomerase-reverse Transkriptase (hTRT)-Genprodukts in einer biologischen Probe durch Inkontaktbringen der biologischen Probe mit einer Sonde, die das Genprodukt spezifisch bindet, wobei die Sonde und das Genprodukt einen Komplex bilden, und durch den Nachweis des Komplexes, wobei das Vorhandensein des Komplexes mit dem Vorhandensein des hTRT-Genprodukts in der biologischen Probe korreliert. Das Genprodukt kann RNA, DNA oder ein Polypeptid sein. Zu den Beispielen für Sonden, die zum Nachweis verwendet werden können, zählen, jedoch ohne Beschränkung darauf, Nucleinsäuren und Antikörper. 



  In einer Ausführungsform ist das Genprodukt eine Nucleinsäure, die durch Amplifikation des Gens und Nachweis des  Amplifikationsprodukts nachgewiesen wird, wobei das Vorhandensein des Komplexes oder des Amplifikationsprodukts mit dem Vorhandensein des hTRT-Genprodukts in der biologischen Probe korreliert. 



  In einer Ausführungsform ist die biologische Probe von einem Patienten beispielsweise einem menschlichen Patienten. In einer weiteren Ausführungsform enthält die biologische Probe mindestens eine Zelle aus einer in vitro-Zellkultur, beispielsweise einer Kultur menschlicher Zellen. 



  Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins mindestens einer unsterblichen oder Telomerase-positiven menschlichen Zelle in einer menschlichen Zellen umfassenden biologischen Probe bereit, wobei die menschliche Zellen umfassende biologische Probe erhalten wird und das Vorhandensein einer Zelle mit einem hohen Spiegel eines hTRT-Genprodukts in der Probe nachgewiesen wird, wobei das Vorhandensein einer Zelle mit einem hohen Spiegel an dem hTRT-Genprodukt mit dem Vorhandensein von unsterblichen oder Telomerase-positiven Zellen in der biologischen Probe korreliert.

   Die Erfindung stellt auch ein Verfahren bereit zur Diagnose eines mit Telomerase in Zusammenhang stehenden Zustands in einem Patienten durch Gewinnung einer Zelle oder einer Gewebeprobe von dem Patienten, Bestimmung der Menge eines menschlichen Telomerase-reverse Transkriptase (hTRT)-Genprodukts in der Zelle oder dem Gewebe und dem Vergleich der Menge des hTRT-Genprodukts in der Zelle oder dem Gewebe mit der Menge in einer gesunden Zelle oder einem gesunden Gewebe des gleichen Typs, wobei eine unterschiedliche Menge des hTRT-Genprodukts in der Probe von dem Patienten im Vergleich zu der gesunden Zelle oder im gesunden Gewebe ein diagnostisches Anzeichen für einen mit Telomerase in Zusammenhang stehenden Zustand ist. In einer Ausführungsform ist der mit Telomerase in Zusammenhang stehende Zustand Krebs. 



  Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren bereit zur Diagnose von Krebs in einem Patienten durch Gewinnung einer Probe von dem Patienten und den Nachweis eines menschlichen Telomerase-reverse-Transkriptase-(hTRT)-Genprodukts in der Probe von dem Patienten, wobei der Nachweis des hTRT-Genprodukts in der Probe mit einer Diagnose von Krebs korreliert. 



  Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren bereit zur Diagnose von Krebs in einem Patienten durch Gewinnung einer Patientenprobe, Bestimmung der Menge des menschlichen Telomerase-reverse Transkriptase (hTRT)-Genprodukts in der Patientenprobe und den Vergleich der Menge des hTRT-Genprodukts mit einem normalen Wert oder Kontrollwert, wobei eine Menge des hTRT-Genprodukts in dem Patienten, die in dem Vergleich zu dem Normalwert oder Kontrollwert grösser ist, ein diagnostisches Anzeichen für Krebs ist. 



  Die Erfindung stellt auch ein Verfahren bereit zur Diagnose von Krebs in einem Patienten durch Gewinnung einer Patientenprobe, die mindestens eine Zelle enthält, Bestimmung der Menge des hTRT-Genprodukts, in einer Zelle in der Probe und den vergleich der Menge des hTRT-Genprodukts in der Zelle mit einem für die Zellen normalen Wert, wobei eine Menge des hTRT-Genprodukts die über dem Normalwert liegt, ein diagnostisches Anzeichen für Krebs ist. In einer Ausführungsform wird davon ausgegangen, dass die Probe mindestens eine maligne Zelle enthält. 



  Die Erfindung stellt ausserdem ein Verfahren zur Bereitstellung einer Prognose für einen Krebspatienten bereit, wobei die Menge des hTRT-Genprodukts in einer von dem Patienten erhaltenen Krebszelle bestimmt wird und die Menge von hTRT in der Krebszelle mit einem prognostischen Wert für hTRT pro Krebszelle, konsistent mit einer Prognose hinsichtlich Krebs ist, wobei eine hTRT-Menge pro Zelle in der Probe, die bei dem prognostischen Wert liegt, die spezielle Prognose bereitstellt. 



  Die Erfindung stellt ausserdem ein Verfahren bereit zur Überwachung der Wirksamkeit einer Antikrebsbehandlung, die Proliferationskapazität von Krebszellen in einem Patienten herabzusetzen, dadurch, dass zuerst eine Messung der Menge eines hTRT-Genprodukts in mindestens einer Krebszelle von dem Patienten durchgeführt wird, eine zweite Messung hinsichtlich des Spiegels an hTRT-Genprodukts in mindestens einer Krebszelle des Patienten durchgeführt wird, wobei die Antikrebsbehandlung dem Patienten vor der zweiten Messung oder zur gleichen Zeit verabreicht wird und durch den Vergleich der ersten mit der zweiten Messung, wobei ein niedriger Spiegel an hTRT-Genprodukt in der zweiten Messung mit der Wirksamkeit einer Antikrebsbehandlung korreliert, die Proliferationskapazität von Krebszellen in dem Patienten herabzusetzen. 



  Die Erfindung stellt auch Kits für den Nachweis eines hTRT-Gens oder Genprodukts zur Verfügung. In einer Ausführungsform enthält der Kit einen Behälter, der ein Molekül umfasst, ausgewählt aus einer hTRT-Nucleinsäure oder einer Untersequenz davon, ein hTRT-Polypeptid oder eine Untersequenz davon und einen anti-hTRT-Antikörper. Die Erfindung stellt auch Behandlungsverfahren für menschliche Krankheiten zur Verfügung. Ein erfindungsgemässer Aspekt betrifft die Bereitstellung eines Verfahrens zur Steigerung der Proliferationskapazität einer Vertebratenzelle, beispielsweise einer Säugerzelle, durch Einführung eines rekombinanten Polynucleotids in die Zelle, wobei  das Polynucleotid eine Sequenz umfasst, die ein menschliches Telomerase-reverse Transkriptase (hTRT)-Polypeptid umfasst. In einer Ausführungsform hat das hTRT-Polypeptid eine Sequenz von SEQ. ID. Nr. 2 (Fig. 17).

   In einer Ausführungsform ist die Sequenz mit einem Promotor funktionell verknüpft. In einer Ausführungsform weist die hTRT katalytische Aktivität von Telomerase auf. In einer Ausführungsform ist die Zelle menschlich, beispielsweise eine Zelle in einem menschlichen Patienten. 



  In einer alternativen Ausführungsform wird die Zelle in vitro kultiviert. In einer verwandten Ausführungsform wird die Zelle in einen menschlichen Patienten eingeführt. 



  Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren bereit zur Behandlung einer menschlichen Krankheit durch Einführung eines rekombinanten hTRT-Polynucleotids in mindestens eine Zelle in einem Patienten. In einer Ausführungsform wird ein Vektor für Gentherapie verwendet. In einer verwandten Ausführungsform besteht das Verfahren ferner in der Einführung eines Polynucleotids in die Zelle, das eine menschliche Telomerase-RNA codierende Sequenz umfasst, beispielsweise ein hTRT-Polynucleotid, das mit einem Promotor funktionell verknüpft ist. 



  Die Erfindung stellt auch ein Verfahren bereit zur Steigerung der Proliferationsfähigkeit einer Vertebratenzelle, wobei das Verfahren die Einführung einer wirksamen Menge eines menschlichen Telomerase-reverse Transkriptase (hTRT)-Polypeptids in die Zelle umfasst. In einer Ausführungsform hat das hTRT-Polypeptid katalytische Aktivität von Telomerase. Die Erfindung stellt ferner Zellen und Nachkommen der Zellen mit erhöhter Proliferationskapazität bereit. 



  Die Erfindung stellt auch Arzneimittel bereit, die einen pharmazeutisch verträglichen Träger enthalten und ein Molekül ausgewählt aus: einem hTRT-Polypeptid, einem ein hTRT-Polypeptid codierenden Polynucleotid und einer hTRT-Nucleinsäure oder einer Untersequenz davon. 



  Die Erfindung stellt auch ein Verfahren bereit zur Behandlung eines Zustands, der mit einem erhöhten Spiegel an Telomerase-Aktivität innerhalb einer Zelle assoziiert ist, wobei das Verfahren die Einführung einer therapeutisch wirksamen Menge eines Inhibitors von Telomerase-Aktivität in die Zelle umfasst, wobei der Inhibitor ein hTRT-Polypeptid oder ein hTRT-Polynucleotid ist. In einer Ausführungsform ist der In hibitor ein Polypeptid, das die Sequenz von SEQ. ID. Nr. 2 oder 4 oder eine Untersequenz davon umfasst. In weiteren Ausführungsformen hemmt das Polypeptid eine TRT-Aktivität, beispielsweise die Bindung endogener TRT an Telomerase-RNA. 



  Die Erfindung stellt auch ein Vakzin bereit, das ein hTRT-Polypeptid und ein Adjuvans umfasst. 


 Beschreibung der Figuren 
 



  Fig. 1 
 zeigt hochkonservierte Reste in TRT-Motiven von Menschen, S. pombe (tez1), S. cerevisiae (EST2) und Euplotes aediculatus (p123). Identische Aminosäuren sind mit einem Sternchen (*) gekennzeichnet, während ähnliche Aminosäurereste durch einen Punkt ( &cirf& ) gekennzeichnet sind. Motiv "0" in der Figur wird auch Motif T genannt; Motiv "3" wird auch Motiv A genannt. 



  Fig. 2 
 zeigt die Lage Telomerase-spezifischer Motive und RT-spezifischer Sequenzmotive von Telomerase-Proteinen und anderen reversen Transkriptasen. Die Lage des Telomerase-spezifischen Motivs T und der konservierten RT-Motive 1, 2 und A-E sind durch gefüllte Kästchen gekennzeichnet. Das mit einem offenen Rechteck gekennzeichnete HIV-1 RT kennzeichnet den in Fig. 3 gezeigten Anteil dieses Proteins. 



  Fig. 3
 zeigt die Kristallstruktur der p66-Untereinheit von HIV-1-reverse Transkriptase ("Brookhaven code" 1HNV). Die Ansicht ist, vom rechten Handrücken aus gesehen, dargestellt, damit alle Motive erkennbar sind. 



  Fig. 4
 zeigt mehrere Sequenzausrichtungen von Telomerase-RTs (Sp_Trt1p, S. pombe TRT (hier auch mit "tez1p" bezeichnet); bTRT, menschliche TRT; Ea_p123, Euplotes p123; Sc_Est2p, S. cerevisiae Est2P) und Mitglieder anderer RT-Familien (S_a1, Cytochrom-oxidase Gruppe II Intron I-codiertes Protein von S.  cerevisiae-Mitochondrien, Dm_TART, reverse Transkriptase von Drosophila melanogaster TART-nicht-LTR-Retrotransposon-Element); HIV-1, reverse Transkriptase von menschlichem HIV). TRT con und RT con repräsentieren "Consensus"-Sequenzen für Telomerase-RTs und nicht-Telomerase-RTs. Aminosäuren sind gekennzeichnet mit einem h, hydrophob; p, polar; c, geladen. Dreiecke bezeichnen Reste, die innerhalb der Telomerase-Proteine konserviert sind, in anderen RTs jedoch unterschiedlich sind. Die dicke Linie unter Motiv E bezeichnet den "Primergriff" ("primer grip")-Bereich. 



  Fig. 5
 zeigt die Expression von hTRT-RNA in Telomerase-negativen sterblichen Zellstämmen und Telomerase-positiven unsterblichen Zellinien, wie in Beispiel 2 beschrieben. 



  Fig. 6
 zeigt einen möglichen phylogenetischen Stammbaum von Telomerasen und Retroelementen mit RNA-abhängigen RNA-Polymerasen als Wurzel. 



  Fig. 7 
 zeigt eine Restriktionskarte des lambda-Clons G. PHI 5. 

 

  Fig. 8
 zeigt eine Karte von Chromosom Sp mit der Lage des STS-Markers D5S678 (der in der Nähe des hTRT-Gens lokalisiert ist). 



  Fig. 9
 zeigt die Konstruktion eines hTRT-Promotor-Reporterplasmids. 



  Fig. 10
 (zwei Seiten) zeigt die in vitro-Coexpression von hTRT und hTR zur Herstellung katalytisch aktiver menschlicher Telomerase. 



  Fig. 11
 (zwei Seiten) zeigt die Ausrichtung von Sequenzen von vier TRT-Proteinen und interessierende Motive sind gekennzeichnet. TRT con bezeichnet eine TRT-"Consensus"-Sequenz. RT con bezeichnet "Consensus"-Reste bei anderen reversen Transkriptasen. "Consensus"-Reste mit Grossbuchstaben kennzeichnen absolute Konservierung in TRT-Proteinen. 



  Fig. 12
 zeigt eine Topoisomerase II-Spaltstelle und NF kappa B-Bindungsstellen-Motive in einem hTRT-Intron, wobei die gezeigte Sequenz SEQ. ID. Nr. 7 (Fig. 12) entspricht. 



  Fig. 13
 (zwei Seiten) zeigt die Sequenz der DNA, die die Euplotes 123 kD-Telomerase-Proteinuntereinheit codiert (Euplotes TRT-Protein). 



  Fig. 14
 zeigt die Aminosäuresequenz der Euplotes 123 kD-Telomerase-Proteinunterheit (Euplotes TRT-Protein). 



  Fig. 15
 (vierzehn Seiten) zeigt die DNA- und Aminosäuresequenzen der katalytischen Untereinheit der S. pombe-Telomerase (S. pombe-TRT). 



  Fig. 16
 (zwei Seiten) zeigt die hTRT-cDNA-Sequenz, wobei die gezeigte Sequenz SEQ. ID. Nr. 1 entspricht. 



  Fig. 17
 zeigt das hTRT-Protein, codiert durch die cDNA von Fig. 16. Die gezeigte Proteinsequenz entspricht SEQ. ID. Nr. 2. 



  Fig. 18
 zeigt die Sequenz des Clons 712562, wobei die gezeigte Sequenz SEQ. ID. Nr. 3 entspricht. 



  Fig. 19
 zeigt ein Protein mit 259 Resten, das von dem Clon 712562 codiert wird, wobei die gezeigte Sequenz SEQ. ID. Nr. 10 entspricht. 



  Fig. 20
 (sieben Seiten) zeigt die Sequenz einer Nucleinsäure mit einem offenen Leserahmen, die eine  DELTA 182-Polypeptidvariante codiert, wobei die gezeigte Sequenz SEQ. ID. Nr. 4 entspricht. Diese Figur zeigt auch die Aminosäuresequenz dieser  DELTA 182-Polypeptidvariante, wobei die gezeigte Aminosäuresequenz SEQ. ID. Nr. 5 entspricht. 



  Fig. 21
 (sechs Seiten) zeigt die Sequenz eines genomischen hTRT-Clons, wobei die gezeigte Sequenz SEQ. ID. Nr. 6 entspricht. "Consensus"-Motive und Elemente sind angegeben, dazu gehören auch Sequenzen, die charakteristisch sind für eine Topoisomerase II-Spaltstelle, NF kappa B-Bindungsstellen, eine Alu-Sequenz und andere Sequenzelemente. 



  Fig. 22
 zeigt die Auswirkung einer Mutation des TRT-Gens in Hefe, wie in Beispiel 1 beschrieben. 



  Fig. 23
 zeigt die Sequenz von EST AA281296, die SEQ. ID. Nr. 8 entspricht. 



  Fig. 24
 zeigt die Sequenz der 182 Basenpaare, die in Clon 712562 deletiert sind, wobei die gezeigte Sequenz SEQ. ID. Nr. 9 entspricht. 



  Fig. 25
 zeigt die Ergebnisse eines Assays auf Telomerase-Aktivität von BJ-Zellen, die mit einem ein hTRT-Protein codierenden Expressionsvektor (pGRN133) oder einem Kontrollplasmid (pBBS212) transfiziert wurden, wie in Beispiel 13 beschrieben. 



  Fig. 26
 ist ein schematisches Diagramm hinsichtlich der Affinitätsreinigung von Telomerase, das die Bindungsschritte und Elutionsschritte durch Verdrängung zeigt. 



  Fig. 27
 ist ein Photo eines Northern-Blots von Telomerase-Präparationen, die während des in Beispiel 1 beschriebenen Reinigungsprotokolls erhalten wurden. Spur 1 enthielt 1,5 fMol Telomerase-RNA, Spur 2 4,6 fMol, Spur 3 14 fMol, Spur 4 41 fMol, Spur 5 nucleären Extrakt (42 fMol Telomerase), Spur 6 Affi-Gel-Heparin-gereinigte Telomerase (47 fMol Telomerase), Spur 7 affinitätsgereinigte Telomerase (68 fMol) und Spur 8 über Glyceringradienten gereinigte Telomerase (35 fMol). 



  Fig. 28
 zeigt Telomerase-Aktivitäten während eines Reinigungsprotokolls. 



  Fig. 29
 ist ein Photo eines SDS-PAGE-Gels, das die Anwesenheit eines Polypeptids mit etwa 123 kD und einer Dublette mit etwa 43 kD von Euplotes aediculatus zeigt. 



  Fig. 30
 ist eine Graphik, die den Sedimentationskoeffizienten von Euplotes aediculatus-Telomerase zeigt. 



  Fig. 31
 ist ein Photo eines Polyacrylamid/Harnstoff-Gels mit 36% Formamid, das die Substratverwertung von Euplotes-Telomerase zeigt. 



  Fig. 32
 zeigt die vermuteten Ausrichtungen von Telomerase-RNA-Matrize und Haarnadelstruktur-Primern mit Telomerase-RNA. 



  Fig. 33
 ist ein Photo der Spuren 25 bis 30 des in Fig. 31 gezeigten Gels mit geringerer Belichtung. 



  Fig. 34
 zeigt die DNA-Sequenz des Gens, das die 43 kD-Telomerase-Proteinuntereinheit von Euplotes codiert. 



  Fig. 35
 (vier Seiten) zeigt die DNA-Sequenz sowie die Aminosäuresequenzen aller drei offenen Leserahmen der 43 kD Telomerase-Proteinuntereinheit von Euplotes. 



  Fig. 36
 zeigt einen Sequenzvergleich zwischen der 123 kD-Telomerase-Proteinuntereinheit von Euplotes (obere Sequenz) und der 80 kD-Polypeptid-Untereinheit von T. thermophila (untere Sequenz). 



  Fig. 37
 zeigt einen Sequenzvergleich zwischen der 123 kD-Telomerase-Proteinunterheit von E. aediculatus (obere Sequenz) und dem 95 kD-Telomerase-Polypeptid von T. thermophila (untere Sequenz). 



  Fig. 38
 zeigt die "best-fit"-Ausrichtung zwischen einem Teil der "La-Domäne" der 43 kD-Telomerase-Proteinuntereinheit von E. aediculatus (obere Sequenz) und einem Teil der 95 kD-Polypeptiduntereinheit von  T. thermophila (untere Sequenz). 



  Fig. 39
 zeigt die "best-fit"-Ausrichtung zwischen einem Teil. der "La-Domäne" der 43 kD-Telomerase-Proteinuntereinheit von E. aediculatus (obere Sequenz) und einem Teil der 80 kD-Polypeptid-Untereinheit von T. thermophila (untere Sequenz). 



  Fig. 40
 zeigt die Ausrichtung und die Motive der Polymerase-Domäne der 123 kD-Telomerase-Proteinuntereinheit von E. aediculatus und der Polymerase-Domänen von verschiedenen reversen Transkriptasen, wozu auch ein Cytochrom-Oxidase-Gruppe II Intron 1-codiertes Protein von S. cerevisiae-Mitochondrien (al S.c. (Gruppe II)) zählen, Dong (LINE) und Hefe ESTp (L8543.12). 



  Fig. 41
 zeigt die Ausrichtung einer Domäne der 43 kD Telamerase-Proteinuntereinheit mit verschiedenen LaProteinen. 



  Fig. 42
 zeigt die Nucleotidsequenz, die T. thermophila 80 kD-Protein-Untereinheit codiert. 



  Fig. 43
 zeigt die Aminosäuresequenz der T. thermophila 80 kD-Protein-Untereinheit. 



  Fig. 44
 zeigt die Nucleotidsequenz, die die T. thermophila 95 kD-Protein-Untereinheit codiert. 



  Fig. 45
 zeigt die Aminosäuresequenz der T. thermophila 95 kD Protein-Untereinheit. 



  Fig. 46
 zeigt die Aminosäuresequenz von L8543.12 ("Est2p"). 



  Fig. 47
 zeigt die Ausrichtung der durch das Oxytricha PCR-Produkt codierten Aminosäuresequenz mit der Euplotes p123-Sequenz. 



  Fig. 48
 zeigt die DNA-Sequenz von Est2. 



  Fig. 49
 zeigt die partielle Aminogäuresequenz eines cDNA-Clons, der Peptidmotive menschlicher Telomerase codiert. 



  Fig. 50
 zeigt die partielle DNA-Sequenz eines cDNA-Clons, der Peptidmotive menschlicher Telomerase codiert. 



  Fig. 51
 zeigt die Aminosäuresequenz von tez1, das auch als S. pombe trt bezeichnet wird. 



  Fig. 52
 (zwei Seiten) zeigt die DNA-Sequenz von tez1. Intron-Bereiche und andere nicht codierende Bereiche sind in Kleinbuchstaben gezeigt und Exons (d.h. codierende Bereich) sind mit Grossbuchstaben angegeben. 



  Fig. 53
 zeigt die Ausrichtung- von EST2p, Euplotes und Tetrahymena-Sequenzen, sowie "Consensus"-Sequenzen. 



  Fig. 54
 zeigt die Sequenzen von Peptiden, die für die Herstellung von anti-hTRT-Antikörpern nützlich sind. 



  Fig. 55
 ist eine schematische Zusammenfassung der tez1<+>-Sequenzierungsexperimente. 



  Fig. 56
 zeigt zwei degenerierte Primer, die in der PCR zur Identifizierung des S. pombe-Homologen zu den E. aediculatus p123-Sequenzen verwendet wurden. 



  Fig. 57
 zeigt die vier Hauptbanden, die in der PCR mit den degenerierten Primern zur Identifizierung des S. pombe-Homologen, zu den E. aediculatus p123-Sequenzen verwendet wurden. 



  Fig. 58
 zeigt die Ausrichtung des M2-PCR-Produkts mit E. aediculatus p123, S. cerevisiae und Oxytricha-Telomerase-Proteinsequenzen. 



  Fig. 59
 ist ein Schema, das die 3 min -RT-PCR-Strategie für die Identifizierung des S. pombe-Homologen zu dem E. aediculatus p123 zeigt. 



  Fig. 60
 zeigt Merkmale der Banken, die verwendet wurden, um nach S. pombe Telomerase-Proteinsequenz zu screenen und die Ergebnisse des Screenings. 



  Fig. 61
 zeigt die positiven Ergebnisse, die mit den HindIII-gespaltenen positiven genomischen Clonen erhalten wurden, die die S. pombe-Telomerase-Sequenz enthalten. 



  Fig. 62
 ist ein Schema, das die 5 min -RT-PCR-Strategie zeigt, die zum Erhalt des S. pombe TRT-Clons mit vollständiger Länge verwendet wurde. 



  Fig. 63
 zeigt die Ausrichtung von RT-Domänen von katalytischen Untereinheiten von Telomerase für S. pombe (S.p.), S. cerevisiae (S.c.) und E. aediculatus (E.a.). 



  Fig. 64
 zeigt die Ausrichtung von Sequenzen von Euplotes ("Ea_P123"), S. cerevisiae ("Sc_Est2P") und S. pombe ("Sp_Tez1p"). In Teil A kennzeichnen die schattierten Bereiche Reste, die beide Sequenzen gemeinsam haben. In Teil B bezeichnen die schattierten Bereiche Reste, die alle drei Sequenzen gemeinsam haben. 



  Fig. 65
 zeigt die für die Telomerase-Gene in S. pombe verwendete Disruptionsstrategie. 



  Fig. 66
 zeigt die experimentellen Ergebnisse, die die Disruption von tez1 bestätigen. 



  Fig. 67
 zeigt die progressive Verkürzung von Telomeren in S. pombe aufgrund der Disruption von tez1. 



  Fig. 68
 (vier Seiten) zeigt die DNA-Sequenz und Aminosäuresequenz des ORF, der ein Telomerase-Protein von etwa 63 kD codiert oder ein Fragment davon, codiert von der EcoRI-NotI-Insertion des Genbank-Clons #AA281296. 



  Fig. 69
 zeigt eine Ausrichtung von reverser Transkriptase-Motiven aus verschiedenen Quellen. 



  Fig. 70
 ist eine Restriktionskarte und funktionelle Karte von Plasmid pGRN121. 



  Fig. 71
 (zwei Seiten) zeigt die Ergebnisse von vorläufigen Analysen der Nucleinsäure-Sequenzierung einer hTRTcDNA-Sequenz. 



  Fig. 72
 (10 Seiten) zeigt die vorläufige Nucleinsäure von hTRT und die abgeleiteten ORF-Sequenzen in den drei Leserahmen. 



  Fig. 73
 ist eine Restriktionskarte und funktionelle Karte von Plasmid pGRN121. 



  Fig. 74
 (8 Seiten) zeigt die verbesserte Nucleinsäuresequenz und abgeleitete ORF-Sequenzen von hTRT. 



  Fig. 75
 zeigt eine Restriktionskarte des lambda-Clons 25-1.1. 



  Fig. 76
 zeigt eine Karte der Restriktions-Stellen und Bereiche von DNA pGRN144.4. 


 I. Einleitung 
 



  Telomerase ist ein Ribonucleoproteinkomplex (RNP), der einen RNA-Bestandteil und einen katalytischen Protein-Bestandteil umfasst. Die vorliegende Erfindung betrifft die Clonierung und Charakterisierung des katalytischen Proteinbestandteils der Telomerase, der nachstehend "TRT" (Telomerase-reverse-Transkriptase) bezeichnet wird. Dieses Protein wird deshalb als TRT bezeichnet, weil es als eine RNA-abhängige DNA-Polymerase arbeitet, wobei der RNA-Bestandteil der Telomerase (nachstehend mit "TR" bezeichnet) zur Steuerung der Synthese der Telomer-DNA-Wiederholungssequenzen verwendet wird. Darüber hinaus ist TRT mit anderen reversen Transkriptasen evolutionär verwandt (siehe Beispiel 12). 



  Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Clonierung und Charakterisierung des katalytischen Proteinbestandteils der menschlichen Telomerase, die nachstehend als "hTRT" bezeichnet wird. Menschliche TRT ist deshalb von ausserordentlichem Interesse und Wert, da, wie nachstehend angemerkt, Telomerase-Aktivität in Menschen (und weiteren Säuger-Zellen) mit der Eigenschaft der Zellproliferation, Zellimmortalität und der Entwicklung eines neoplastischen Phänotyps korreliert. Beispielsweise ist in unsterblichen menschlichen Zellen (z.B. maligne Tumorzellen und unsterbliche Zellinien) die Telomerase-Aktivität und, wie in Beispiel 2 nachstehend gezeigt, die Menge an Genprodukten menschlicher TRT gegenüber sterblichen Zellen (z.B. den meisten menschlichen somatischen Zellen) erhöht. 



  Die vorliegende Erfindung stellt ferner Verfahren und Zusammensetzungen bereit, die zur Diagnose, Prognose und zur Behandlung von menschlichen Erkrankungen und Krankheitszuständen von Wert ist, wie dies nachstehend ausführlich beschrieben wird. Ausserdem werden Verfahren und Reagenzien zur Verfügung gestellt, die zur Immortalisierung von Zellen (in  vivo und ex vivo) von Nutzen sind, wobei transgene Tiere mit erwünschten Merkmalen hergestellt werden, sowie zahlreiche weitere Verwendungsmöglichkeiten, die zum grossen Teil nachstehend beschrieben werden. Die Erfindung stellt auch Verfahren und Agenzien bereit, die für die Herstellung, die Clonierung und Re-Clonierung von TRT-Genen und -Proteinen aus Ciliaten, Pilzen, Vertebraten, beispielsweise Säugern, und anderen Organismen von Nutzen sind. 



  Wie nachstehend ausführlich beschrieben wird, wurde TRT zuerst nach Reinigung von Telomerase aus dem Ciliaten Euplotes aediculatus charakterisiert. Die umfassende Reinigung von E. aediculatus Telomerase unter Verwendung von RNA-Affinitätschromatographie und weiterer Verfahren lieferte das Protein "p123". Überraschenderweise stellte sich heraus, dass p123 mit Proteinen, von denen bisher angenommen wurde, dass sie Proteinuntereinheiten des Telomerase-Holoenzyms darstellen (d.h. die p80- und p95-Proteine von Tetrahymena thermophila) nicht verwandt ist. Die Analyse der Sequenzen der p123-DNA und des Proteins (Genbank-Zugangsnummer U95964; Fig. 13 und 14) ergab das Vorhandensein von Motiven von reverser Transkriptase (RT) , was mit der Rolle von p123 als katalytische Untereinheit der Telomerase konsistent ist (siehe z.B. Fig. 11).

   Darüber hinaus ist p123 mit dem Est1p-Protein aus S. cerevisiae (Hefe) verwandt, von dem bekannt war, dass es eine Rolle bei der Aufrechterhaltung der Telomere in S. cerevisiae spielt (Genbank-Zugangsnummer S5396). Es wurde jedoch vor der vorliegenden Erfindung nicht erkannt, dass dieses ein Protein einer katalytischen Untereinheit von Telomerase codiert (siehe beispielsbeise Lendvay et al., Genetics 144 (1996), 1399). 



  Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft Reagenzien und Verfahren zur Identifizierung und Clonierung neuer TRTs unter Verwendung von: Nucleinsäuresonden und Primern, die von den offenbarten TRT-Polynucleotiden erzeugt oder abgeleitet sind (z.B. zur Clonierung von TRT-Genen und cDNAs);  Antikörpern, die Motive, Motivsequenzen oder andere TRT-Epitope spezifisch erkennen (z.B. zur Expressionsclonierung von TRT-Genen oder zur Reinigung von TRT-Proteinen); das Screening von Computer-Datenbanken oder weiterer Hilfsmittel. Beispielsweise wurde die in Beispiel 1 beschriebene PCR-Amplifikation (Polymerase-Kettenreaktion) von DNA von S. pombe mit Primern mit degenerierten Sequenzen, die anhand der Euplotes p123 RT Motive B min  und C entworfen wurden, ausgewählt.

   Von den vier erzeugten Hauptprodukten codierte eines eine Peptidsequenz, die homolog ist zur Euplotes p123 und S. cerevisiae Est2p. Die vollständige Sequenz des zur S. pombe TRT homologen Proteins wurde unter Verwendung dieses PCR-Produkts als Sonde durch Screenen von cDNA- und genomischen Banken von S. pombe und Amplifikation von S. pombe RNA durch reverse Transkription und PCR (RT-PCR) erhalten. Die vollständige Sequenz des S. pombe Gens (trt1 min  min ; Genbank-Zugangsnummer AF015783; Fig. 15) ergab, dass die Homologie zwischen p123 und Est2p in den Motiven für reverse Transkriptase besonders hoch war. 



  Die Amplifikation unter Verwendung von degenerierten Primern, die von den Telomerase RT-Motiven abgeleitet waren, wurde auch zum Erhalt von TRT-Gensequenzen aus Oxytricha trifallax und Tretrahymena thermophila, wie in Beispiel 1 beschrieben, verwendet. 



  Die erfindungsgemässen Sequenzen Euplotes p123, S. pombe trt1 und S. cerevisiae Est2p wurden bei der Suche in computerisierten Datenbanken von menschlichen exprimierten Sequenzen "tags" (ESTs) unter Verwendung des Programms "BLAST" (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215 (1990), 403) verwendet. Die Suche in dieser Datenbank mit der Est2p-Sequenz ergab keine Übereinstimmung, ein menschliches EST (Genbank-Zugangsnummer AA281296; siehe SEQ. ID. Nr. 8) konnte jedoch wie in Beispiel 1 beschrieben durch Suche mit p123- und trt1-Sequenzen identifiziert werden. Dieses menschliche EST codiert vermutlich ein homologes Protein. Die vollständige  Sequenzierung des cDNA-Clons, der das EST enthält (nachstehend als "Clon 712562" bezeichnet; siehe SEQ. ID. Nr. 3) zeigte das Vorhandensein von sieben RT-Motiven.

   Dieser Clon konnte jedoch ein zusammenhängendes menschliches TRT nicht codieren, da die Motive B min , C, D und E im Vergleich zu den mehr NH2-terminal gelegenen Motiven in einem unterschiedlichen offenen Leserahmen (ORF) enthalten waren. Darüber hinaus war der Abstand zwischen den Motiven A und B min  wesentlich geringer als bei den bereits charakterisierten TRTs. (Clon 712562 wurde von dem I.M.A.G.E.-Consortium erhalten; Lennon et al., Genomics 33 (1996), 151). 



  Der cDNA-Clon pGRN121, der ein funktionales hTRT codiert (SEQ. ID. Nr. 1) wurde aus einer cDNA-Bank isoliert, die von der humanen Zellinie 293 stammte (siehe Beispiel 1). Der Vergleich des Clons 712562 mit pGRN121 ergab, dass Clon 712562 zwischen den Motiven A und B min  eine Deletion von 182 Basenpaaren (SEQ. ID. Nr. 9) aufweist. Die in pGRN121 zusätzlich vorhandenen 182 Basenpaare führen dazu, dass alle TRT-Motive in einem einzigen offenen Leserahmen vorhanden sind, und dass sich der Abstand zwischen den Bereichen des Motivs A und des Motivs B min  so vergrössert, dass dies konsistent ist mit dem Abstand bei anderen bekannten TRTs. Wie nachstehend in den Beispielen beschrieben (z.B. Beispiel 7) codiert SEQ. ID. Nr. 1 ein katalytisch aktives Telomerase-Protein mit der Sequenz von SEQ. ID. Nr. 2. Das Polypeptid von SEQ. ID.

   Nr. 2 weist 1132 Aminosäuren und ein geschätztes Molekulargewicht von etwa 127 Kilodaltons (kD) auf. 



  Wie nachstehend diskutiert und in Beispiel 9 beschrieben, werden die für den Clon 712562 charakteristische Deletion von 182 Basenpaaren aufweisende TRT-cDNAs im Anschluss an die reverse Transkription von mRNA aus Telomerase-positiven Zellen (z.B. Testes- und 293-Zellen) nachgewiesen. hTRT-RNAs, denen diese Sequenz von 182 Basenpaaren fehlt, werden allgemein als " DELTA 182-Varianten" bezeichnet und diese können eine, zwei oder mehrere Spezies repräsentieren. Die hTRT-Varianten, denen die in der pGRN121-cDNA (SEQ. ID.

   Nr. 1) gefun dene Sequenz von 182 Basenpaaren fehlt, codieren zwar höchstwahrscheinlich kein Telomerase-Enzym mit vollständiger katalytischer Aktivität, sie können jedoch eine Rolle bei der Telomerase-Regulation, wie nachstehend beschrieben, spielen und/oder partielle Telomerase-Aktivität aufweisen, beispielsweise eine Aktivität für die Telomer-Bindung oder hTR-Bindung, wie nachstehend diskutiert. 



  Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht somit in der Bereitstellung eines isolierten Polynucleotids mit einer Sequenz eines natürlich vorkommenden menschlichen TRT-Gens oder einer mRNA, wobei ein Polynucleotid mit der Sequenz von SEQ. ID. Nr. 1 eingeschlossen ist, allerdings ohne jedoch darauf beschränkt zu sein. Ein verwandter Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Bereitstellung eines Polynucleotids, das ein hTRT-Protein codiert, ein Fragment, eine Variante oder ein Derivat. Ein weiterer verwandter Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Bereitstellung von "sense"- und "antisense"-Nucleinsäuren, die an ein hTRT-Gen oder mRNA binden.

   Die vorliegende Erfindung stellt ferner hTRT-Proteine bereit, die entweder synthetisiert oder von natürlichen Quellen gereinigt wurden, sowie Antikörper und weitere Agenzien, die spezifisch ein hTRT-Protein oder ein Fragment davon binden. Die vorliegende Erfindung stellt auch viele neue Verfahren bereit, zu denen Verfahren gehören, die die vorstehend erwähnten Zusammensetzungen verwenden, beispielsweise durch Bereitstellung von diagnostischen und prognostischen Assays bezüglich menschlicher Erkrankungen, Verfahren zur Entwicklung von Arzneimitteln und therapeutischen Verfahren, zur Identifizierung von Telomerase-assoziierten Proteinen und Verfahren zum Screenen nach Agenzien, die Telomerase-Aktivität aktivieren oder hemmen können. Zahlreiche weitere Aspekte und Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden nachstehend bereitgestellt. 



  Ein Aspekt der Erfindung ist die Verwendung eines Polynucleotids, das eine Länge von etwa 10 kb oder mehr aufweist, und eine aufeinanderfolgende Sequenz von mindestens 10 Nucleotiden umfasst, die zu einer aufeinanderfolgenden Sequenz in einem natürlich vorkommenden hTRT-Gen oder einer hTRT-mRNA identisch oder genau komplementär ist zum Untersuchen oder dem Screenen (nach) einer hTRT-Gensequenz oder einer hTRT-mRNA oder zur Herstellung einer rekombinanten Wirtszelle. Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist die Verwendung eines Agens, das die Expression von hTRT erhöht, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung eines Zustands, der durch die Erhöhung der Proliferationskapazität einer Vertebratenzelle behandelt wird, wobei gegebenenfalls das Arzneimittel zur Hemmung der Auswirkungen des Alterns verwendet wird. 



  Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Verwendung eines Inhibitors von Telomerase-Aktivität bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Zustands, der mit einem erhöhten Spiegel an Telomerase-Aktivität innerhalb einer menschlichen Zelle assoziiert ist. Die erfindungsgemässen Proteine, Varianten und Fragmente und die codierenden Polynucleotide oder Fragmente, werden auch in einem weiteren Aspekt dieser Erfindung zur Verwendung als Arzneimittel bereitgestellt. 



  Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung eines Proteins, einer Variante oder eines Fragments davon oder eines Polynucleotids oder Fragments, wie hier definiert, bei der Herstellung eines Medikaments, beispielsweise bei der Herstellung eines Medikaments zur Hemmung eines Effekts des Alterns oder von Krebs. 



  In bestimmten erfindungsemässen Ausführungsformen sind die hTRT-Polynucleotide nicht das Polynucleotid mit 389 Nucleotiden von SEQ. ID. Nr. 8 und/oder nicht Clon 712562, das Plasmid, das eine Insertion enthält mit der Sequenz von SEQ. ID. Nr. 3 in Fig. 18. 



  Die nachstehende Beschreibung ist nach Themen aufgebaut. Teil II beschreibt weitere für TRT-Proteine charakteristische Aminosäuremotive. Die Teile III bis VI beschreiben unter anderem Nucleinsäuren, Proteine, Antikörper und gereinigte Zusammensetzungen der Erfindung, wobei der Schwerpunkt auf mit menschlicher TRT verwandten Zusammensetzungen liegt. Teil VII beschreibt unter anderem Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung, die zur Behandlung von menschlichen Erkrankungen von Nutzen sind. Teil VIII beschreibt die Herstellung und Identifizierung von immortalisierten menschlichen Zellinien. Teil IX beschreibt unter anderem die Verwendung der erfindungsgemässen Nucleinsäuren, Polynucleotide und weiterer Zusammensetzungen zur Diagnose von menschlichen Erkrankungen. Teil X ist ein Glossar der in den Teilen I bis IX verwendeten Bezeichnungen.

   Teil XI beschreibt Beispiele, die sich auf spezifische erfindungsgemässe Ausführungsformen beziehen. Die Beschreibung der Erfindung ist nach Themen und Unterthemen gegliedert, um den Stoff verständlicher zu machen, stellt jedoch in keiner Weise eine Einschränkung dar. 


 II. TRT-Gene und Proteine 
 



  Die vorliegende Erfindung stellt isolierte und/oder rekombinante Gene und Proteine bereit, die eine Sequenz einer katalytischen Untereinheit des Telomerase-Proteins (d.h. Telomerase-reverse-Transkriptase) aufweisen, wozu, allerdings ohne Beschränkung darauf, die natürlich vorkommenden Formen solcher Gene und Proteine in isolierter oder rekombinanter Form gehören. Typischerweise sind TRTs grosse, basische Proteine mit für reverse Transkriptase (RT) und Telomerase-spezifischen Aminosäuremotiven, so wie dies hier offenbart ist. Da diese Motive innerhalb unterschiedlicher Organismen konserviert sind, könnnen TRT-Gene zahlreiche Organismen unter Verwendung der erfindungsgemässen Verfahren oder unter Verwendung erfindungsgemässer Primer, Nucleinsäuresonden und Antikörpern, beispielsweise solcher, die für ein oder mehrere der Motivsequenzen spezifisch sind, erhalten werden. 



  Die sieben in TRTs gefundenen RT-Motive ähneln zwar den in anderen reversen Transkriptasen gefundenen, weisen jedoch besondere Kennzeichen auf. Beispielsweise gibt es innerhalb der TRT-RT-Motive wie in Fig. 4 gezeigt, eine Reihe von Aminosäuresubstitutionen (mit Pfeil markiert) in Aminosäureresten, die innerhalb der anderen RTs hoch konserviert sind. Beispielsweise kommen die zwei Asparaginsäurereste (DD) im Motiv C, die die Metallionen im aktiven Zentrum koordinieren (siehe Kohlstaedt et al., Science 256 (1992), 1783; Jacobo-Molina et al., Proc. Natl. Acad. Sci.

   USA 90 (1993), 6320; Patel et al., Biochemistry 34 (1995), 5351) in dem Kontext hxDD(F/Y) in den RTs von Telomerase vor, während diese in den anderen RTs im Kontext (F/Y)xDDh vorkommen, wobei h eine hydrophobe Aminosäure ist und "x" eine beliebige Aminosäure ist; siehe Xiong et al., EMBO J. 9 (1990) 3353; Eickbush, in The Evolutionary Biology of Viruses (S. Morse Herausg. Raven-Press, NY, S. 121 (1994".

   Weitere für die TelomeraseUntergruppen charakteristische systematische Austausche kommen in dem Motiv E vor, in dem WxGxSx eine "Consensus"Sequenz darstellt oder innerhalb der Telomerase-Proteine konserviert ist, während hLGxxh für andere RTs charakteristisch ist (Xiong et al., a.a.0; Eickbush, a.a.O.) Dieses Motiv E wird als der "Primer-Griff" (primer-grip) bezeichnet und es wurde beschrieben, dass Mutationen in diesem Bereich das "RNA-Priming" beeinflussen, jedoch nicht das "DNA-Priming" (Powell et al., J. Biol. Chem. 272 (1997), 13262). Da Telomerasen einen DNA-Primer, (z.B. das 3 min -Ende des Chromosoms) benötigen, ist es nicht überraschend, dass sich Telomerase von anderen RTs im Bereich des "Primer-Griffs" unterscheidet.

   Darüber hinaus ist die Entfernung zwischen den Motiven A und B min  in den TRTs grösser wie dies typischerweise in den anderen RTs der Fall ist, wobei dies eine Insertion innerhalb des "Finger"-Bereichs der Struktur, die einer rechten Hand ähnelt, darstellen kann (Fig. 3; siehe Kohlstaedt et al., a.a.O.; Jacobo-Molina et al., a.a.O.; und Patel et al., a.a.O.). 



  Weiterhin ist das T-Motiv, wie vorstehend erwähnt, ein zusätzliches Kennzeichen von TRT-Proteinen. Das beispielsweise in der Fig. 4 gezeigte T-Motiv (W-L-X-Y-X-X-h-h-X-h-h-X-p-F-F-Y-X-T-E-X-p-X-X-X-p-X-X-X-Y-X-R-K-X-X-W, wobei X eine beliebige Aminosäure ist, h hydrophob und p polar ist) umfasst eine Sequenz, die unter Verwendung der folgenden Formel beschrieben werden kann: 
EMI31.1
 
 



  wobei X eine beliebige Aminosäure ist und die tiefgestellte Zahl sich auf eine Zahl von aufeinanderfolgenden Resten bezieht, R1 Leucin oder Isoleucin ist, R2 Glutamin oder Arginin, R3 Phenylalanin oder Tyrosin und R4 Lysin oder Histidin ist. 



  Das T-Motiv kann auch unter Verwendung der folgenden Formel beschrieben werden: 
EMI31.2
 
 



  wobei X eine beliebige Aminosäure ist und sich eine tiefgestellte Zahl auf eine Anzahl von aufeinanderfolgenden Resten bezieht, R1 Leucin oder Isoleucin ist, R2 Glutamin oder Arginin, R3 Phenylalanin oder Tyrosin, R4 Lysin oder Histidin, h eine hydrophobe Aminosäure ausgewählt als Ala, Leu, Ile, Val, Pro, Phe, Trp, und Met und p eine polare Aminosäure ausgewählt als Gly, Ser, Thr, Tyr, Cys, Asn und Gln ist. 



  In einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung isolierte, natürlich vorkommende und rekombinante TRT-Proteine bereit, die eines oder mehrere der in Fig. 11 dargestellten Motive umfassen, beispielsweise, 
EMI32.1
 
 



  Wenn das gezeigte TRT-Protein mehr als ein TRT-Motiv enthält, ist die Reihenfolge (NH2->COOH) wie in Fig. 4 gezeigt. 



  In einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung isolierte, natürlich vorkommende TRT-Proteine bereit, die folgendes Supermotiv umfassen: 
EMI32.2
 
 



  Es ist für den Fachmann, der über die hier offenbarten Reagenzien, einschliesslich der TRT-Sequenzen verfügt, offensichtlich, dass mit diesen Reagenzien und den hier bereitgestellten Verfahren und Lehren (einschliesslich spezifischer nachstehend beschriebenen Verfahrensweisen) TRT-Gene und -Proteine vom Fachmann erhalten, isoliert und in rekombinanter Form hergestellt werden können. Beispielsweise werden Primer (z.B. degenerierte Amplifikationsprimer) bereitgestellt, die mit Gensequenzen hybridisieren, die für TRT charakteristische RT- und T-Motive codieren. 

   Beispielsweise können einer oder mehrere Primer oder degenerierte Primer hergestellt werden, die mit Sequenzen hybridisieren, die den FFYXTE-Bereich des T-Motivs, weitere TRT-Motive (wie nachstehend diskutiert) oder Kombinationen von Motiven oder  "Consensus"-Sequenzen codieren, basierend auf der Codon-Verwendung des Zielorganismus, und zur Amplifikation der TRT-Gensequenz aus genomischer DNA oder cDNA, die von dem Zielorganismus hergestellt wurde, verwendet werden. Die Verwendung von degenerierten Primern ist auf dem Fachgebiet gut bekannt. Dazu gehören auch Primersätze, die mit dem Satz von Nucleinsäuresequenzen hybridisieren, die möglicherweise die Aminosäuren des Zielmotivs codieren. Dabei muss die Bevorzugung und Verwendung bestimmter Codons innerhalb des Zielorganismus in Erwägung gezogen werden. Dabei werden auch Amplifikations- (z.B.

   PCR)-Bedingungen angewandt, die geeignet sind, Fehlpaarungen von Basen bei den Anlagerungsschritten der PCR zu erlauben. Typischerweise werden zwei Primer verwendet, Amplifikationssysteme mit einem einzigen Primer (oder in diesem Fall ein Satz mit einem einzelnen degenerierten Primer) sind allgemein bekannt, und diese können auch zum Erhalt von TRT-Genen verwendet werden. 



  Tabelle 1 zeigt Beispiele von erfindungsgemässen Primern, die zur Amplifikation neuer TRT-Nucleinsäuren, insbesondere solchen aus Vertebraten (z.B. Säuger), verwendet werden können. "N" ist ein äquimolares Gemisch aller vier Nucleotide und Sequenzen in Klammern stellen äquimolare Gemische der angegebenen Nucleotide dar. 
EMI34.1
 
 



  In einer Ausführungsform wird eine amplifizierte TRT-Nucleinsäure als Hybridisierungssonde zur Kolonie-Hybridisierung mit einer Genbank (z.B. einer cDNA-Bank), die aus dem Zielorganismus hergestellt wurde, verwendet, wobei eine Nucleinsäure mit der das gesamte TRT-Protein oder einen wesentlichen Anteil davon codierende Sequenz identifiziert und isoliert oder cloniert wird. Reagenzien und Verfahren, wie beispielsweise die gerade beschriebenen, werden in Übereinstimmung mit den hier beschriebenen Verfahren zum Erhalt von TRT-Gensequenzen aus Oxytricha trifallax und Tetrahymena thermophila, wie nachstehend ausführlich beschrieben, verwendet.

   Natürlich kann im Anschluss an die Clonierung eines bisher nicht charakterisierten TRT-Gens die Sequenz durch Routineverfahren bestimmt und das codierte Polypeptid synthetisiert und auf eine TRT-Aktivität, beispielsweise der katalytischen Aktivität von Telomerase, untersucht werden (wie hier beschrieben und/oder mittels auf dem Fachgebiet bekannter Telomerase-Assays). 



  Es ist für den Fachmann auch offensichtlich, dass TRT-Gene unter Verwendung einer Vielzahl von erfindungsgemässen Clonierungsverfahren cloniert werden können, da die TRT-Motivsequenzen und die solche Sequenzen umfassenden erfindungsgemässen Nucleinsäuren in einer grossen Anzahl solcher Verfahren verwendet werden können. Beispielsweise kann Hybridisierung unter Verwendung einer Sonde, die auf der Sequenz einer bekannten TRT basiert mit DNA- oder weiteren Nucleinsäure-Banken aus dem Zielorganismus, wie in Beispiel 1 beschrieben, verwendet werden. Degenerierte PCR-Primer oder ihre Amplifikationsprodukte, beispielsweise die vorstehend beschriebenen, können selbst markiert sein und als Hybridisierungssonden verwendet werden. In einer weiteren Ausführungsform werden Expressionsclonierungs-Verfahren angewandt.

   Beispielsweise können einer oder mehrere Antikörper, die Peptide spezifisch binden, die ein TRT-Motiv oder ein anderes TRT-Epitop umspannen, beispielsweise das FFYXTE-Motiv (wobei X eine beliebige der 20 Standard-Aminosäuren darstellt) spezi fisch binden, zur Isolation eines ribosomalen Komplexes verwendet werden, der ein TRT-Protein und die dieses codierende mRNA umfasst. Zur Herstellung der erfindungsgemässen Antikörper weisen die Peptid-Immunogene typischerweise eine Länge von 6 bis 30 Aminosäuren auf, bevorzugt 10 bis 20 Aminosäuren. Die Antikörper können auch zum Absuchen einer cDNA-Expressionsbank, die von dem gewünschten Organismus stammt, zur Identifikation eines eine TRT-Sequenz codierenden Clons verwendet werden.

   In einer weiteren Ausführungsform können zur Identifikation eines eine TRT-Sequenz codierten Clons DNA-Datenbanken per Computer nach DNAs durchsucht werden, die innerhalb bekannter TRTs konservierte Sequenzen enthalten. 



  Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Bereitstellung von Zusammensetzungen, die ein isoliertes oder rekombinantes Polypeptid mit der Sequenz eines natürlich vorkommenden TRT-Proteins umfassen. Üblicherweise hat die natürlich vorkommende TRT ein Molekulargewicht zwischen etwa 80 000 Daltons (d) und etwa 150 000 d, bevorzugt zwischen etwa 95 000 d und etwa 130 000 d. Typischerweise hat die natürlich vorkommende TRT bei einem pH-Wert von 7 eine positive Gesamtladung (wobei der geschätzte pI typischerweise über 9 liegt). In einer Ausführungsform weist das Polypeptid eine wie hier definierte Telomerase-Aktivität auf. In einer verwandten Ausführungsform weist das Polypeptid eine Sequenz für einen TRT-spezifischen Bereich (T-Motiv) auf und eine Telomerase-Aktivität. Die Erfindung stellt ferner Fragmente solcher Polypeptide bereit.

   Die vorliegende Erfindung stellt ausserdem isolierte oder rekombinante Polynucleotide mit der Sequenz eines natürlich vorkommenden, ein TRT-Protein codierenden Gens bereit. Die Erfindung stellt auch isolierte TRT-Polynucleotide mit einer Sequenz einer TRT eines Nicht-Vertebraten (z.B. von Hefe) und Vertebraten, beispielsweise Säugern (z.B. Mäusen oder Menschen) bereit. Die isolierten Polynucleotide können mit anderen natürlich vorkommenden oder Vektor-Nucleinsäuresequenzen assoziiert  sein. Typischerweise liegt die Länge der isolierten Nucleinsäure unter etwa 300 kb, bevorzugt unter etwa 50 kb, mehr bevorzugt unter etwa 20 kb und am meisten bevorzugt unter etwa 10 kb. Gelegentlich liegt die Länge unter etwa 5 kb oder 2 kb.

   In einigen Ausführungsformen ist das isolierte TRT-Polynucleotid sogar noch kleiner, beispielsweise handelt es sich dabei um ein Genfragment, einen Primer oder eine Sonde mit einer Länge unter etwa 1 kb oder 0,1 kb. 


 III. Nucleinsäuren 
 


 A) Allgemeines 
 



  Die vorliegende Erfindung stellt isolierte und rekombinante Nucleinsäuren bereit mit einer Sequenz eines Polynucleotids, das eine katalytische Untereinheit des Telomerase-Proteins (TRT) codiert, beispielsweise ein rekombinantes TRT-Gen aus Euplotes, Tetrahymena, S. pombe oder Menschen. Beispiele für Polynucleotide sind dargestellt in Fig. 13 (Euplotes), Fig. 15 (S. pombe) und Fig. 16 (Mensch, Genbank-Zugangsnummer AF15950). Die vorliegende Erfindung stellt "sense" und "anti-sense"-Polynucleotide mit einer TRT-Gensequenz bereit, dazu zählen auch Sonden, Primer, TRT-Protein-codierende Polynucleotide und ähnliches. 


 B) Menschliche TRT 
 



  Die vorliegende Erfindung stellt Nucleinsäuren bereit mit einer Sequenz einer katalytischen Untereinheit einer Telomerase aus Menschen (d.h. hTRT). 



  Ein Aspekt der Erfindung betrifft die Bereitstellung eines Polynucleotids mit einer Sequenz oder Untersequenz eines menschlichen TRT-Gens oder einer RNA. In einer Ausführungsform besitzt das erfindungsgemässe Polynucleotid eine Sequenz der SEQ. ID. Nr. 1 (Fig. 16) oder eine Untersequenz davon. In einer weiteren Ausführungsform weist das Polynucleotid eine Sequenz der SEQ. ID. Nr. 3 (Fig. 18), SEQ. ID. Nr. 4  (Fig. 20) oder Untersequenzen davon auf. Die Erfindung stellt auch Polynucleotide mit im wesentlichen zu den hier offenbarten hTRT-Nucleinsäuresequenzen identischen Sequenzen bereit, beispielsweise SEQ. ID. Nr. 1 und die weiteren offenbarten Sequenzen (z.B. SEQ. ID. Nr. 4, 6 (Fig. 21) und 7  (Fig. 12)).

   Somit stellt die Erfindung natürlich vorkommende Allele der menschlichen TRT-Gene und Varianten der Polynucleotidsequenzen bereit mit einer oder mehreren Nucleotiddeletionen, Insertionen oder Substitutionen, bezogen auf eine hier offenbarte hTRT-Nucleinsäuresequenz. Wie nachstehend beschrieben, können Varianten der Nucleinsäuren unter Verwendung der nachstehend beschriebenen Rekombinationsverfahren oder synthetischer Verfahren oder durch andere Mittel hergestellt werden. 



  Die Erfindung stellt auch isolierte und rekombinante Polynucleotide mit einer Sequenz eines flankierenden Bereichs eines menschlichen TRT-Gens bereit. Zu diesen Polynucleotiden zählen solche, die von genomischen Sequenzen von untranslatierten Bereichen der hTRT-mRNA abstammen. Ein Beispiel für eine genomische Sequenz ist SEQ. ID. Nr. 6 (Fig. 21). Wie in Beispiel 4 beschrieben, wurde SEQ. ID. Nr. 6 durch Sequenzierung des Clons  lambda G PHI 5, der aus einer menschlichen Genombank isoliert wurde, erhalten.  lambda G PHI 5 enthält eine Insertion mit einer Länge von 15 Kilobasenpaaren (kbp) , die ungefähr 13 000 Basen 5 min zu den hTRT codierenden Sequenzen einschliessen. Dieser Clon enthält hTRT-Promotorsequenzen und weitere regulatorische Sequenzen des hTRT-Gens (z.B. Enhancer). 



  Die Erfindung stellt auch isolierte und rekombinante Polynucleotide mit einer Sequenz aus einem Intronbereich eines menschlichen TRT-Gens bereit. Ein Beispiel für eine Intronsequenz ist SEQ. ID. Nr. 7 (siehe Beispiel 3 und Fig. 12) . In einigen Ausführungsformen sind hTRT-Introns in "Minigenen" zur verbesserten Expression von hTRT-Proteinen in eukaryotischen Zellen eingeschlossen. 



  Ein verwandter Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Bereitstellung von Polynucleotiden, die hTRT-Proteine oder Proteinfragmente codieren, dazu zählen modifizierte und geänderte hTRT-Polypeptide und Varianten der hTRT-Polypeptide. In einer Ausführungsform weist das codierte hTRT-Protein oder Fragment eine wie in SEQ. ID. Nr. 2 (Fig. 17) gezeigte Aminosäuresequenz auf oder eine Aminosäuresequenz mit konservativen Austauschen der SEQ. ID. Nr. 2. In einer Ausführungsform weisen das codierte hTRT-Protein oder -Fragment Austausche auf, die eine Aktivität des Proteins (z.B. katalytische Aktivität von Telomerase) aufweisen.

   Natürlich müssen aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes die das hTRT-Protein codierenden Nucleinsäuren nicht die Sequenz eines natürlich vorkommenden hTRT-Gens aufweisen, d.h. eine Vielzahl von Polynucleotiden kann ein hTRT-Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz von SEQ. ID. Nr. 2 codieren. Die vorliegende Erfindung stellt jede mögliche Variation von Nucleotidsequenzen bereit, die durch die Auswahl von Kombinationen hergestellt werden, die auf der Auswahl möglicher Codons in Übereinstimmung mit dem bekannten genetischen Triplett-Code basieren. All diese Variationen sind hiermit ausdrücklich offenbart.

   Zwar sind somit in einigen Fällen hTRT-Polypeptid codierende Nucleotidsequenzen, die mit den Nucleotidsequenzen der natürlich vorkommenden Sequenz (unter entsprechend ausgewählten Bedingungen der Stringenz) hybridisieren können, bevorzugt, es kann jedoch in anderen Fällen vorteilhaft sein, hTRT-codierende Nucleotidsequenzen herzustellen, die eine im wesentlichen unterschiedliche Condonverwendung aufweisen. 



  In bestimmten Ausführungsformen stellt die Erfindung hTRT-Oligo- und -Polynucleotide bereit, die eine Untersequenz einer hier offenbarten hTRT-Nucleinsäure umfassen (z.B. SEQ. ID. Nr. 1, 4, 6 und 7). Die erfindungsgemässen Nucleinsäuren umfassen typischerweise mindestens etwa 10, bevorzugt mindestens etwa 12 oder etwa 15 aufeinanderfolgende Basen des er läuterten hTRT-Polynucleotids auf. Oft umfassen die erfindungsgemässen Nucleinsäuren auch eine längere Sequenz, beispielsweise eine Sequenz mit einer Länge von mindestens etwa 25, etwa 50, etwa 100, etwa 200 oder mindestens etwa 500 Basen, beispielsweise wenn die Expression eines Polypeptids angestrebt wird. In einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung unterscheidet sich das hTRT-Polynucleotid von einem Polynucleotid mit der Sequenz von EST AA281296 (SEQ. ID. Nr. 8). 



  Weitere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung stellen " DELTA 182hTRT"-Polynucleotide bereit mit einer Sequenz, die natürlich vorkommende oder nicht natürlich vorkommende hTRTPolynucleotide codieren, beispielsweise SEQ. ID. Nr. 3 oder SEQ. ID. Nr. 4, die nicht die in pGRN121 aufgefundene 182 Basenpaarsequenz (SEQ. ID. Nr. 9 (Fig. 24)), die in Clon 712562 ebenfalls fehlt) enthalten. Diese Polynucleotide sind teilweise von Interesse, da sie Polypeptide codieren, die Kombinationen von TRT-Motiven enthalten, die sich von dem in hTRT-Polypeptid mit vollständiger Länge gefundenen (SEQ. ID.    Nr. 2), beispielsweise dem von pGRN121 codierten Polypeptid, unterscheiden.

   Wie nachstehend diskutiert, wird davon ausgegangen, dass diese Polypeptide in der Natur eine biologische Rolle spielen können (z.B. bei der Regulation der Expression von Telomerase in Zellen) und/oder als Arzneimittel Verwendung finden können (z.B. als dominant-negative Produkte, die die Funktion des Wildtyp-Proteins hemmen) oder dass diese Polypeptide weitere Rollen und Verwendungen, beispielsweise die hier beschriebenen, aufweisen. 



  Beispielsweise codiert Clon 712562 im Gegensatz zu dem Clon pGRN121 ein Protein mit 259 Aminosäureresten und einem geschätzten Molekulargewicht von ungefähr 30 kD (nachstehend als "712562 hTRT" bezeichnet. Das 712562 hTRT-Polypeptid (SEQ. ID. Nr. 10 (Fig. 19) ) enthält die Motive T, 1, 2 und A, jedoch nicht die Motive B min , C, D und E. In ähnlicher Weise kann eine Variante des hTRT-Polypeptids mit therapeu tischen und weiteren Aktivitäten von einer Nucleinsäure exprimiert werden, die der pGRN121-cDNA gleicht, der jedoch die 182 Basenpaare fehlen, die der Clon 712562 nicht aufweist, beispielsweise mit der Sequenz SEQ. ID. Nr. 4.

   Diese Nucleinsäure (nachstehend mit "pro90hTRT" bezeichnet), die unter Verwendung von Routine-Syntheseverfahren oder rekombinanten Verfahren, wie sie hier beschrieben sind, synthetisiert werden kann, codiert ein Protein mit 807 Aminosäureresten (geschätztes Molekulargewicht etwa 90 kD), das dieselben Amino-terminalen Sequenzen wie das von SEQ. ID. Nr. 1 codierte hTRT-Protein aufweist, jedoch am Carboxy-terminalen Bereich abweicht (die ersten 763 Aminosäurereste haben beide Proteine gemeinsam, die letzten 44 Aminosäurereste von pro90hTRT unterscheiden sich von dem hTRT mit vollständiger Länge). Das pro90hTRT-Polypeptid enthält die Motive T, 1, 2 und A, nicht jedoch die Motive B, C, D und E und kann daher einige, jedoch nicht alle Telomerase-Aktivitäten aufweisen. 


 C) Herstellung von menschlichen TRT-Nucleinsäuren 
 



  Für die erfindungsgemässen Polynucleotide ergeben sich zahlreiche Anwendungen. Dazu zählen, allerdings ohne Beschränkung darauf, die Expression von Polypeptiden, die hTRT oder Fragmente davon codieren, die Verwendung als "sense"- oder "antisense"-Sonden oder Primer zur Hybridisierung und/oder Amplifikation von natürlich vorkommenden hTRT-Genen oder RNAs (z.B. für diagnostische oder prognostische Anwendungen) und als Arzneimittel (z.B. in "antisense"-, Triplex- oder Ribozym-Zusammensetzungen). Nach Lektüre dieser Offenbarung ist offensichtlich, dass diese Anwendungsmöglichkeiten eine gewaltige Auswirkung auf die Diagnose und die Behandlung von menschlichen Erkrankungen, die sich auf Alterung, Krebs und Fruchtbarkeit beziehen, und darüber hinaus auf das Wachstum, die Reproduktion und die Herstellung von Produkten, die auf Zellen basieren, haben.

   Wie in den nachstehenden Abschnitten beschrieben, können die erfindungsgemässen hTRT-Nucleinsäuren  unter Verwendung bekannter Techniken (z.B. durch Clonierung, Synthese oder Amplifikation) hergestellt werden. 


 1) Clonierung, Amplifikation und Rekombinante Herstellung 
 



  In einer Ausführungsform werden hTRT-Gene oder cDNAs unter Verwendung einer Nucleinsäuresonde cloniert, die an hTRT-mRNA, cDNA oder genomische DNA spezifisch hybridisiert. Eine für diesen Zweck geeignete Probe ist ein Polynucleotid mit der Sequenz, die in SEQ. ID. Nr. 1 bereitgestellt wird oder eine Untersequenz davon. Typischerweise wird die genomische DNA oder cDNA mit dem Ziel-hTRT in einen Vektor ligiert (z.B. ein Plasmid, Phage, Virus, künstliches Hefechromosom etc.) und sie kann in einer genomischen Bank oder cDNA-Bank (z.B. einer cDNA-Bank von menschlicher Plazenta) gefunden werden. Nachdem eine hTRT-Nucleinsäure identifiziert ist, kann sie gemäss dem Fachmann bekannten Standardverfahren isoliert werden.

   Ein das Screenen einer menschlichen cDNA-Bank nach dem hTRT-Gen veranschaulichendes Beispiel ist Beispiel 1; ein ähnliches Beispiel, das sich auf das Screenen einer menschlichen genomischen Bank bezieht, ist Beispiel 4. Clonierungsverfahren sind allgemein bekannt und beispielsweise in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989); Berger und Kimmel, Methods In Enzymology, Vol. 152: Guide To Molecular Cloning Techniques, San Diego: Academic Press, Inc. (1987); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing and Wiley-Interscience, New York (1997); Cashion et al., US-Patent Nr. 5 017 478; und Carr. EP-B1 0 246 864, beschrieben. 



  Die Erfindung stellt ferner genomische hTRT-Nucleinsäuren oder cDNA-hTRT-Nucleinsäuren zur Verfügung, die durch Amplifikationsverfahren wie z.B. die Polymerasekettenreaktion (PCR), isoliert wurde, zur Verfügung. In einer Ausführungsform wird die das hTRT-Protein codierende Sequenz aus einer RNA-Probe oder cDNA-Probe amplifiziert (z.B. doppelsträngige  Plazenta-cDNA (Clontech, Palo Alto CA" unter Verwendung der Primer 
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  In einigen Ausführungsformen kann ein dritter Primer oder ein zweites Primerpaar verwendet werden, beispielsweise für "nested PCR" zur Erhöhung der Spezifität. Ein Beispiel eines zweiten Primerpaares ist 
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  Für den Fachmann ist es offensichtlich, dass zahlreiche andere Primer und Primerkombinationen, die für die Amplifikation von hTRT-Nucleinsäuren von Nutzen sind, durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt werden. 



  Darüber hinaus stellt die Erfindung Primer zur Verfügung, die einen beliebigen spezifischen Bereich amplifizieren (beispielsweise codierende Bereiche, Promotorbereiche und/oder Introns) oder eine Untersequenz genomischer hTRTDNA, cDNA oder RNA. Beispielsweise kann das hTRT-Intron an der Position 274/275 von SEQ. ID. Nr. 1 (siehe Beispiel 3) amplifiziert werden (z.B. zum Nachweis genomischer Clone) unter Verwendung der Primer TCP1.57 und TCP1.52 (Primerpaar 1) oder der Primer TCP1.49 und TCP1.50 (Primerpaar 2). (Die Bezeichnungen für die Primer beziehen sich auf die in der nachstehenden Tabelle 2 aufgelisteten Primer). Die Primerpaare können individuell oder in einer "nested PCR" verwendet werden, in der der Primersatz 1 zuerst verwendet wird.

   Ein weiteres veranschaulichendes Beispiel bezieht sich auf Primer, die spezifisch das 5 min -Ende der hTRT-mRNA oder das Exon, das das 5 min -Ende des hTRT-Gens codiert, amplifizieren und somit nachweisen (z.B. um die Grösse oder die Vollständigkeit eines cDNA-Clons zu beurteilen). Die folgenden Primerpaare sind zur Amplifikation des 5 min -Endes von hTRT von Nutzen: Primer K320 und K321 (Primerpaar 3); Primer K320 und  TCP1.61 (Primerpaar 4); Primer K320 und K322 (Primerpaar 5). Die Primersätze können in einer "nested PCR" in der Reihenfolge Satz 5, dann Satz 4 oder Satz 3, oder Satz 4 und dann Satz 3 verwendet werden.

   Ein weiteres veranschaulichendes Beispiel betrifft Primer, die zur spezifischen Amplifikation oder zum spezifischen Nachweis des konservierten hTRT-TRT-Motivbereichs ausgewählt wurden, der etwa das mittlere Drittel der mRNA umfasst (z.B. zur Verwendung als Hybridisierungssonde zur Identifizierung von TRT-Clonen aus nicht-menschlichen Organismen). Die folgenden Primerpaare sind zur Amplifikation des TRT-Motivbereichs von hTRT-Nucleinsäuren von Nutzen: Primer K304 und TCP1.8 (Primerpaar 6), oder Primer LT1 und TCP1.15 (Primerpaar 7). Die Primersätze können in einem Experiment mit "nested PCR" in der Reihenfolge Satz 6, dann Satz 7 verwendet werden. 



  Geeignete Bedingungen für die PCR-Amplifikation sind dem Fachmann bekannt. Dazu gehören (ohne Beschränkung darauf) 1 Einheit Taq-Polymerase (Perkin Elmer, Norwalk CT), jeweils 100  mu M dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 1 x PCR-Puffer (50 mM KCl, 10 mM Tris, pH-Wert 8,3 bei Raumtemperatur, 1,5 mM MgCl2, 0,01% Gelatine) und 0,5  mu M Primer, wobei die Amplifikation etwa 30 Cyclen bei 94 DEG C für 45 Sekunden, 55 DEG C für 45 Sekunden und 72 DEG C für 90 Sekunden umfasst. Es ist für den Fachmann offensichtlich, dass andere thermostabile DNA-Polymerasen, Reaktionsbedingungen und Parameter bezüglich der Cyclen ebenfalls eine geeignete Amplifikation liefern. Weitere geeignete Verfahren für die Amplifikation in vitro, die zum Erhalt von hTRT-Nucleinsäuren verwendet werden können, umfassen, jedoch ohne Beschränkung darauf, die nachstehend beschriebenen Verfahren.

   Nach Amplifikation können die hTRT-Nucleinsäuren, falls erwünscht, unter Verwendung von Routineverfahren der Molekularbiologie in einer Vielzahl von Vektoren cloniert werden, nachgewiesen oder auf andere Art und Weise in Übereinstimmung mit den erfindungsgemässen Verfahren angewandt werden. 



  Es ist dem Fachmann bewusst, dass die wie vorstehend beschrieben erhaltenen clonierten oder amplifizierten hTRT-Nucleinsäuren unter Verwendung weiterer Verfahren hergestellt oder vermehrt werden können, beispielsweise durch chemische Synthese oder Replikation durch Transformation in bakterielle Systeme wie beispielsweise E. coli (siehe beispielsweise Ausubel et al., a.a.O.) oder eukaryotische Expressionssysteme, beispielsweise Säuger-Expressionssysteme.

   In ähnlicher Weise kann hTRT-RNA in Übereinstimmung mit den erfindungsgemässen in vitro-Verfahren oder in bakteriellen Systemen wie E. coli exprimiert werden, beispielsweise ohne Verwendung von im Handel erhältlichen Vektoren, die Promotoren enthalten, die von einer RNA-Polymerase erkannt werden, wie beispielsweise T7, T3 oder SP6 oder durch Transkription von DNA, die durch PCR-Amplifikation erzeugt wurde, unter Verwendung von Primern, die einen RNA-Polymerase-Promotor enthalten. 



  Die vorliegende Erfindung stellt ferner veränderte oder modifizierte hTRT-Nucleinsäuren bereit. Für den Fachmann ist es offensichtlich, dass die erhaltenen clonierten oder amplifizierten hTRT-Nucleinsäuren durch allgemein bekannte Verfahren (z.B. ortsgerichtete Mutagenese, "Linker-Scanning"-Mutagenese) modifiziert werden können, beispielsweise verkürzt, derivatisiert, verändert), oder einfach de novo, wie nachstehend beschrieben, synthetisiert werden können. Die veränderten oder modifizierten hTRT-Nucleinsäuren sind für eine Vielzahl von Anwendungsmöglichkeiten von Nutzen, zu denen ohne Beschränkung darauf die Erleichterung der Clonierung, die Manipulation eines hTRT-Gens oder Genprodukts oder die Expression einer Variante eines hTRT-Genprodukts gehören.

   In einer Ausführungsform wird beispielsweise die hTRT-Gensequenz so verändert, dass sie ein hTRT-Polypeptid mit veränderten Eigenschaften oder Aktivitäten codiert, wie dies ausführlich nachstehend diskutiert wird, beispielsweise durch Mutation in einem konservierten Motiv von hTRT. In einem weiteren veranschaulichenden Beispiel können die Muta tionen in dem das Protein codierenden Bereich einer hTRT-Nucleinsäure zur Veränderung des Glykosylierungsmusters, zur Veränderung von Codon-Präferenzen, zur Herstellung von Spleiss-Varianten, zur Entfernung von Protease-empfindlichen Stellen, zur Erzeugung von antigenen Domänen, zur Modifikation der spezifischen Aktivität etc. eingeführt werden.

   In weiteren Ausführungsformen wird die hTRT und seine Derivate codierende Sequenz ohne Änderung der codierten Aminosäuresequenzen verändert, beispielsweise zur Herstellung von RNA-Transkripten mit mehr erwünschten Eigenschaften, wie beispielsweise erhöhte Translationeffizienz oder eine grössere oder kürzere Halbwertszeit im Vergleich zu Transkripten, die von der natürlich vorkommenden Sequenz hergestellt wurden. In einer weiteren Ausführungsform werden zur Erhöhung der Expressionsrate des Peptids in einem speziellen prokaryotischen oder eukaryotischen Expressionswirt gemäss der Frequenz, mit der bestimmte Codons von dem Wirt verwendet werden, veränderte Codons ausgewählt.

   Nützliche in vitro und in vivo-Rekombinationsverfahren, die zur Herstellung der erfindungsgemässen hTRT-Polynucleotidvarianten verwendet werden können, können in Sambrook et al. und Ausubel et al., a.a.O., gefunden werden. 



  Wie bereits vorstehend erwähnt, stellt die vorliegende Erfindung Nucleinsäuren mit flankierenden (5 min  oder 3 min ) und Intron-Sequenzen des hTRT-Gens bereit. Die Nucleinsäuren sind u.a. deshalb von Interesse, da sie Promotoren und weitere regulatorische Elemente enthalten, die an der hTRT-Regulation beteiligt und zur Expression von hTRT und anderer rekombinanter Proteine oder RNA-Genprodukte von Nutzen sind. Es ist offensichtlich, dass zusätzlich zu den in SEQ. ID. Nr. 6 (Fig. 17) und 7 bereitgestellten Nucleinsäuresequenzen zusätzliche hTRT-Intronsequenzen und flankierende Sequenzen unter Verwendung von Routineverfahren der Molekularbiologie einfach erhalten werden können. Beispielsweise kann eine zusätzliche genomische hTRT-Sequenz durch weitere Sequenzierung des Lambda-Clons G PHI 5, der vorstehend und in Beispiel 4  beschrieben ist, erhalten werden.

   Darüber hinaus können weitere genomische hTRT-Clone und Sequenzen durch Screenen einer menschlichen genomischen Bank unter Verwendung einer hTRT-Nucleinsäuresonde mit einer Sequenz oder Untersequenz von SEQ. ID. Nr. 1 erhalten werden. Weitere Clone und Sequenzen (z.B. noch weiter stromaufwärts) können unter Verwendung von markierten Sequenzen oder Subclonen, die von  lambda G PHI 5 stammen, zum Absuchen geeigneter Genbanken erhalten werden. Andere nützliche Verfahren zur weiteren Charakterisierung von flankierenden hTRT-Sequenzen sind die allgemeinen Verfahren, die von Gobinda et al., PCR Meth. Applic. 2 (1993), 318; Triglia et al., Nucleic Acids Res. 16 (1988), 8186; Lagerstrom et al., PCR Methods Applic. 1 (1991), 111; und Parker et al., Nucleic Acids Res. 19 (1991), 3055, beschrieben werden. 



  Intron-Sequenzen können durch Routinemittel identifiziert werden, beispielsweise durch Vergleich der genomischen hTRT-Sequenz mit hTRT-cDNA-Sequenzen (siehe beispielsweise Beispiel 3), durch S1-Analyse (siehe Ausubel et al., a.a.O.; Kapitel 4), oder zahlreiche weitere auf dem Fachgebiet bekannte Mittel. Intron-Sequenzen können auch in prä-mRNA (d.h. ungespleissten oder unvollständig gespleissten mRNA-Vorläufern) gefunden werden. Diese können amplifiziert oder nach reverser Transkription von zellulärer RNA cloniert werden. 



  Falls erwünscht, kann die clonierte, amplifizierte oder anderweitig synthetisierte hTRT-Nucleinsäure oder andere TRT-Nucleinsäure bestimmt oder unter Verwendung von allgemein bekannten Verfahren für die DNA-Sequenzierung verifiziert werden (siehe beispielsweise Ausubel et al., a.a.O.) Bei den nützlichen Sequenzierungsverfahren werden Enzyme wie beispielsweise das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I, Sequenase (US Biochemical Corp., Cleveland OH), Taq DNA-Polymerase (Perkin Elmer, Norwalk CT), thermostabile T7-Polymerase (Amersham, Chicago IL), oder Kombinationen von  rekombinanten Polymerasen und Exonucleasen mit "proofreading"-Aktivität angewandt, beispielsweise das ELONGASE-Amplifikations-System, das von Gibco BRL (Gaithersburg MD) erhältlich ist. Zur Sequenzierung oder Verifizierung der Sequenz von Oligonucleotiden, (wie z.B.

   Oligonucleotiden, die durch die de novo-chemische Synthese hergestellt wurden) wird das Verfahren von Maxam und Gilbert bevorzugt (Maxam und Gilbert, Meth. Enz. 65 (1980), 499; Ausubel et al., a.a.O., Kapitel 7). 



  Die 5 min -untranslatierten Sequenzen von hTRT oder anderen TRT-mRNAs können durch Clonierung einer hTRT mit "vollständiger Länge" oder einer anderen cDNA unter Verwendung von Standardverfahren wie der reversen Transkription von mRNA und im Anschluss daran durch Clonierung und Sequenzierung der erhaltenen cDNA direkt bestimmt werden. Bevorzugte durch oligo(dT)-"priming" erhaltene Genbanken zum Screenen oder Amplifizieren von cDNAs mit vollständiger Länge, die zum Einschluss grösserer cDNAs nach Grösse selektiert wurden, werden bevorzugt. Durch "Zufalls-Priming" erhaltene Genbanken sind ebenfalls geeignet. Diese enthalten oft einen grösseren Anteil von Clonen, die 5 min -Bereiche von Genen enthalten. Es können weitere allgemein bekannte Verfahren zum Erhalt von 58-RNA-Sequenzen verwendet werden, beispielsweise das von Frohman et al., Proc. Nat. Acad. 

   Sci., USA 85 (1988), 8998, beschriebene RACE-Protokoll. Falls erwünscht, kann die Transkriptions-Startstelle einer hTRT oder einer anderen TRTmRNA durch Routineverfahren unter Verwendung der hier bereitgestellten Nucleinsäuren (z.B. solcher mit der Sequenz von SEQ. ID. Nr. 1) bestimmt werden. Ein Verfahren ist die S1-Nuclease-Analyse (Ausubel et al., a.a.O.), bei der eine markierte DNA mit einer Sequenz des 5 min -Bereichs von SEQ. IDNr. 1 verwendet wird. 


 2) Chemische Synthese von Nucleinsäuren 
 



  Die vorliegende Erfindung stellt auch hTRT-Polynucleotide (RNA, DNA oder modifiziert) bereit, die durch direkte chemische Synthese hergestellt werden. Chemische Synthese wird im allgemeinen für die Herstellung von Oligonucleotiden oder von Oligonucleotiden und Polynucleotiden, die Nicht-Standardnucleotide enthalten (z.B. Sonden, Primer und "antisense"-Oligonucleotide) bevorzugt. Die direkte chemische Synthese von Nucleinsäuren kann durch auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren erfolgen, beispielsweise durch das Phosphotriester-Verfahren von Narang et al., Meth. Enzymol. 68 (1979), 90; das Phosphodiester-Verfahren von Brown et al., Meth. Enzymol. 68 (1979), 109; das Diethylphosphoramidit-Verfahren von Beaucage et al., Tetra. Lett. 22 (1981), 1859; und das Verfahren des US-Patents Nr. 4 458 066, bei dem ein fester Träger verwendet wird.

   Durch die chemische Synthese wird typischerweise ein einzelsträngiges Oligonucleotid hergestellt, das durch Hybridisierung mit einer komplementären Sequenz oder durch Polymerisation mit einer DNA-Polymerase und eines Oligonucleotidprimers unter Verwendung des Einzelstrangs als Matrize in eine doppelsträngige DNA umgewandelt werden kann. Der Fachmann ist sich dessen bewusst, dass zwar die chemische Synthese von DNA oft auf Sequenzen von etwa 100 oder 150 Basen beschränkt ist, längere Sequenzen jedoch durch Ligierung der kürzeren Sequenzen oder durch ausgefeiltere Syntheseverfahren erhalten werden können. 



  Die erfindungsgemässen hTRT-Polynucleotide und Oligonucleotide (oder hTRT- oder weitere Polynucleotide oder Oligonucleotide) können unter Verwendung von Nicht-Standardbasen (z.B. solche, die sich von Adenin, Cytidin, Guanin, Thymin und Uridin unterscheiden) oder Nicht-Standard-Rückgratstrukturen zur Erzielung gewünschter Eigenschaften (z.B. erhöhte Nuclease-Resistenz, engere Bindung, Stabilität oder ein gewünschter TM) hergestellt werden. Zu den für die Herstellung  von Nuclease-resistenten Oligonucleotiden zählen die in der PCT-Veröffentlichung WO 94/12 633 beschriebenen Verfahren.

   Eine grosse Anzahl von nützlichen modifizierten Oligonucleotiden kann hergestellt werden, dazu zählen Oligonucleotide mit einem Peptid-Nucleinsäure (PNA)-Rückgrat (Nielsen et al., Science 254 (1991), 1497) oder der Einbau von 2 min -O-Methylribonucleotiden, Phosphorthioat-Nucleotiden, Methylphosphonat-Nucleotiden, Phosphotriester-Nucleotiden, Phosphorthioat-Nucleotiden und Phosphoramidaten.

   Weitere nützliche Oligonucleotide können Alkyl- und Halogen-substituierte Zuckeranteile enthalten, die an der 2 min -Position eine der folgenden Gruppen enthalten: OH, SH, SCH3, F, OCN, OCH3OCH3, OCH3O(CH2)nCH3, O(CH2)nNH2 oder O(CH2)nCH3, wobei n von 1 bis etwa 10 ist; C1 bis C10-Niederalkyl, substituiertes Niederalkyl, Alkaryl oder Aralkyl; Cl; Br; CN; CF3; OCF3; O-, S-, oder N-Alkyl; O-, S-, oder N-Alkenyl; SOCH3, SO2CH3; ONO2; NO2; N3, NH2; Heterocycloalkyl; Heterocycloalkaryl; Aminoalkylamino; Polyalkylamino, substituiertes Silyl; eine RNA-spaltende Gruppe, eine Cholesteringruppe, eine Folatgruppe, eine Reportergruppe, ein Intercalator, eine Gruppe zur Verbesserung der pharmacokinetischen Eigenschaften eines Oligonucleotids; oder eine Gruppe zur Verbesserung der pharmacodynamischen Eigenschaften eines Oligonucleotids und weiterer Substituenten mit ähnlichen Eigenschaften.

   Folat, Cholesterin und weitere Gruppen, die die Aufnahme des Oligonucleotids erleichtern, wie beispielsweise Lipid-Analoga, können direkt oder über einen Linker an der 2 min -Position jedes Nucleosids oder an der 3 min - oder 5 min -Position des 3 min -terminalen bzw. 5 min -terminalen Nucleosids konjugiert werden. Es können eines oder mehrere solcher Konjugate verwendet werden. Oligonucleotide können auch Zucker "mimetics" aufweisen, beispielsweise Cyclobutyle anstelle der Pentofuranosylgruppe. Weitere Ausführungsformen können mindestens eine modifizierte Basenform oder eine "universelle Base" wie Inosin beinhalten oder den Einschluss von anderen Nicht-Standardbasen wie Queosin und Wybutosin sowie Acetyl-, Methyl-, Thio- und ähnlich modifizierte Formen von Adenin, Cytidin, Guanin,  Thymin und Uridin, die von Endonucleasen nicht so leicht erkannt werden.

   Die Erfindung stellt ferner Oligonucleotide mit Rückgratanalogen bereit, dazu gehören Phosphodiester, Phosphorthioat, Phosphordithioat, Methylphosphonat, Phosphoramidat, Alkylphosphotriester, Sulfamat, 3 min -Thioacetyl, Methylen(methylimino), 3 min -N-Carbamat, Morpholincarbamat, Chiral-Methylphosphonate, Nucleotide mit kurzkettigen Alkyl- oder Cycloalkylverknüpfungen zwischen den Zuckern, kurzkettige Verknüpfungen ("Rückgratverknüpfungen") zwischen den Zuckern mit unterschiedlichen Atomen oder solche die heterocyclisch sind oder CH2-NH-OCH2, CH2-N(CH3)-OCH2, CH2(-N(CH3)-CH2, CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2 und O-N(CH3)-CH2-CH2-Rückgrate (wobei Phosphodiester O-P-O-CH2 ist), oder Mischungen dieser Verbindungen. Von Nutzen sind ausserdem Oligonucleotide mit Morpholino-Rückgrat-Struktur (US-Patent Nr. 5 034 506). 



  *Zur weiteren nützlichen Literatur zählt: Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, F. Eckstein (Herausg.) IRL Press bei Oxford University Press (1991); Antisense Strategies, Annals of the New York Academy of Sciences, Bd. 600, Baserga und Denhardt (Herausg.) (NYAS 1992), Milligan et al., J. Med. Chem. 36 (14) (9. Juli 1993), 1923-1937; Antisense Research and Applications (1993, CRC Press) die gesamte Veröffentlichung und speziell Kapitel 15 von Sanghvi, mit dem Titel "Heterocyclic base modifications in nucleic acids and their applications in antisense oligonucleotides." Antisense Therapeutics, Sudhir Agrawal (Herausgeber (Humana Press, Totowa, New Jersey, 1996). 


 D) Die Markierung von Nucleinsäuren 
 



  Es ist oft von Nutzen, die erfindungsgemässen Nucleinsäuren zu markieren, beispielsweise wenn die hTRT oder andere Oligonucleotide oder Polynucleotide als Nucleinsäuresonden verwendet werden sollen. Die Markierungen (siehe nachstehend) können durch beliebige, dem Fachmann allgemein bekannte Mit tel eingebaut werden. In einer Ausführungsform wird eine nicht-amplifizierte Nucleinsäure (z.B. mRNA, poly-A-mRNA, cDNA) markiert. Mittel zur Herstellung markierter Nucleinsäuren sind dem Fachmann allgemein bekannt. Dazu gehören beispielsweise Nick-Translation, Markierung mittels "Zufalls-Priming", Endmarkierung (z.B. unter Verwendung einer Kinase) und chemische Konjugation (z.B. Photobiotinylierung). In einer weiteren Ausführungsform wird die Markierung gleichzeitig während eines Amplifikationsschritts bei der Herstellung der Proben-Nucleinsäuren eingebaut.

   Somit liefern beispielsweise die Polymerasekettenreaktion (PCR) oder andere Nucleinsäureamplifikationsverfahren mit markierten Primern oder markierten Nucleotiden ein markiertes Amplifikationsprodukt. In einer weiteren Ausführungsform wird durch Transkriptionsamplifikation unter Verwendung eines markierten Nucleotids (z.B. Fluorescein-markiertes UTP und/oder CTP) eine Markierung in die transkribierten Nucleinsäuren eingebaut. Ein Amplifikationsprodukt kann auch oder alternativ nach Beendigung der Amplifikation markiert werden. 


 E) Beispiele für Oligonucleotide 
 



  Wie bereits vorstehend angemerkt und nachstehend ausführlich diskutiert werden Oligonucleotide für eine Vielzahl von Verwendungsmöglichkeiten verwendet, beispielsweise als Primer, Sonden, therapeutische oder andere "antisense"-Oligonucleotide und Triplex-Oligonucleotide. Zahlreiche weitere Verwendungsmöglichkeiten ergeben sich aus der vorliegenden Beschreibung. Tabelle 2 veranschaulicht bestimmte spezifische Oligonucleotide, die bei der Ausführung der Erfindung verwendet werden können. Natürlich können zahlreiche weitere nützliche erfindungsgemässe Oligonucleotide durch den Fachmann anhand der hier zur Verfügung gestellten Lehre synthetisiert werden. 



  In Tabelle 2 bedeutet "seq", dass der Primer zur Sequenzierung verwendet wurde oder dafür von Nutzen ist; "PCR" bedeu tet, dass der Primer zur PCR verwendet wurde oder dafür von Nutzen ist; "AS" bedeutet, dass der Primer zur "antisense"-Hemmung von Telomerase-Aktivität verwendet wurde oder dafür von Nutzen ist; "CL" bedeutet, dass der Primer zur Clonierung von Bereichen von hTRT-Genen oder RNA verwendet wurde oder dafür von Nutzen ist; "mut" bedeutet, dass der Primer zur Konstruktion von Mutanten von hTRT-Genen oder Genprodukten verwendet wurde oder für von Nutzen ist. "UC" bedeutet "Upper case" [Grossschreibung], und "lc" bedeutet "lower case" [Kleinschreibung]. Fehlpaarungen und Insertionen (relativ zu SEQ. ID Nr. 1) sind unterstrichen; Deletionen werden durch ein "-" angegeben.

   Selbstverständlich soll keine der Angaben in Tabelle 2 eine Einschränkung der Verwendung eines bestimmten Oligonucleotids auf irgendeine Einzelverwendung oder einen Satz von Anwendungsmöglichkeiten beschränken. 
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 IV. TRT-Proteine und Peptide 
 


 A) Allgemeines 
 



  Die Erfindung stellt eine grosse Vielzahl von hTRT-Proteinen bereit, die unter anderem zur Hemmung von Telomerase-Aktivität in einer Zelle von Nutzen sind, zur Induktion einer anti-hTRT-Immunantwort, als ein therapeutisches Reagenz, als Standard oder Kontrolle in einem diagnostischen Assay, als ein Ziel beim Screenen nach Aktivierung oder Hemmung einer Aktivität von hTRT oder Telomerase und zahlreiche weitere Anwendungsmöglichkeiten sind entweder hier beschrieben oder für den Fachmann offensichtlich.

   Zu den erfindungsgemässen hTRT-Proteinen gehören funktionell aktive Proteine (die z.B. zur Übertragung von Telomerase-Aktivität in eine Telomerase-negative Zelle von Nutzen sind) und Varianten, inaktive Varianten (die z.B. zur Hemmung von Telomerase-Aktivität in einer Zelle von Nutzen sind), hTRT-Polypeptide, Proteine und Telomerase-RNPs (z.B. die Proteine umfassenden Ribonucleoproteinkomplexe), die eine, verschiedene oder alle funktionelle Aktivitäten von natürlich vorkommender hTRT und Telomerase aufweisen, wie dies zur Veranschaulichung noch ausführlicher nachstehend diskutiert wird. 



  In einer Ausführungsform ist das erfindungsgemässe hTRT-Protein ein Polypeptid mit der Sequenz von SEQ. ID. Nr. 2 (Fig. 17) oder ein Fragment davon. In einer weiteren Ausführungsform unterscheidet sich das hTRT-Polypeptid von SEQ. ID. Nr. 2 durch interne Deletion, Insertionen oder konservative Austausche von Aminosäureresten. In einer verwandten Ausführungsform stellt die Erfindung hTRT-Polypeptide bereit, die der SEQ. ID. Nr. 2 im wesentlichen gleichen. Die Erfindung stellt ferner hTRT-Polypeptide bereit, die bezogen auf die Aminosäuresequenz von SEQ. ID. Nr. 2 modifiziert sind, d.h. beispielsweise verkürzt, mutiert, derivatisiert oder an andere Sequenzen fusioniert sind (beispielsweise zur Bildung eines Fusionsproteins).

   Darüber hinaus stellt die  vorliegende Erfindung Telomerase-RNPs bereit, die ein erf indungsgemässes hTRT-Protein umfassen, das mit einer Matrizen-RNA einen Komplex bildet (z.B. hTR). In weiteren Ausführungsformen sind eines oder mehrere Telomerase-assoziierte Proteine mit einem hTRT-Protein und/oder hTR assoziiert. 



  Die Erfindung enz ist und n 8-20 oder 60-30 ist und q 1 bis 4 ist. In einer weiteren Ausführungsform weist der DNA-Primer ein 5 min -Ende auf, das zu der RNA-Matrize nicht komplementär ist, so dass bei Anlagerung das 5 min -Ende ungebunden bleibt. Zusätzliche Modifikationen von Standard-Assays bezüglich reverser Transkription, die bei den erfindungsgemässen Verfahren angewandt werden können, sind auf dem Fachgebiet bekannt. 


 b) Nucleolytische Aktivität 
 



  Nucleolytische Aktivität von Telomerase wird beispielsweise beschrieben in Morin, 1997, a.a.0. Collins und Grieder, Genes and development 7 (1993) 1364. Telomerase besitzt eine nucleolytische Aktivität (Joyce und Steitz, Trends Biochem. Sci. 12 (1987), 288), jedoch weist die Telomerase-Aktivität besondere Merkmale auf. Telomerase entfernt Nucleotide, üblicherweise nur eines, vom 3 min -Ende, wenn das 3 min -Ende der DNA an der 5 min -Grenze der DNA-Matrize positioniert ist. In Men schen und bei Tetrahymena ist dieses Nucleotid das erste G der Telomer-Wiederholungseinheit (TTAGG im Menschen). Telomerase entfernt bevorzugt G-Reste, weist jedoch keine nucleolytische Aktivität gegenüber anderen Nucleotiden auf. Diese Aktivität kann überwacht werden. Hier werden zur Veranschaulichung zwei unterschiedliche Verfahren beschrieben.

   Ein Verfahren beinhaltet eine übliche Telomerase-Reaktion mit einem Primer, der die gesamte Matrizensequenz bindet (d.h. an der Matrizengrenze endet; -TAGGGATTAG im Menschen). Nucleolytische Aktivität wird durch Überwachung des Austauschs des letzten dG-Restes gegen ein in dem Assay zur Verfügung gestelltes radioaktiv markiertes dGTP nachgewiesen. Der Austausch wird durch Auftreten einer Bande mit der Grösse des Ausgangsprimers in der Gelelektrophorese und Autoradiographie überwacht. 



  In einem bevorzugten Verfahren wird ein DNA-Primer verwendet, der ein "blockiertes" 3 min -Ende aufweist, das durch Telomerase nicht verlängert werden kann. Der 3 min -blockierte Primer kann in Standard-Telomerase-Assays verwendet werden, er wird jedoch solange nicht verlängert, bis das 3 min -Nucleotid durch die nucleolytische Aktivität von Telomerase entfernt wird. Der Vorteil dieses Verfahrens besteht darin, dass Telomerase-Aktivität durch verschiedene Standardmassnahmen überwacht werden kann, und das Signal stark und leichter zu quantifizieren ist. Die Blockierung des 3 min -Endes des Primers kann auf verschiedene Weise erreicht werden. In einem Verfahren wird ein 3 min -Desoxy-dNTP-Rest an das 3 min -Ende des Primers unter Verwendung von Standard-Oligonucleotidsyntheseverfahren angefügt.

   Dieses Ende weist ein 2 min OH auf, jedoch nicht das für Telomerase erforderliche 3 min OH. Es gibt noch weitere Möglichkeiten zur Blockierung des 3 min -Endes, beispielsweise die Verwendung eines 3 min -Didesoxy-Endes eines 3 min -Amin-Endes etc. Ein Beispiel für einen Primer für einen Assay bezüglich einer nucleolytischen Aktivität von hTRT ist 5 min -TTAGGGTTAGGGTTA (G3 min ), wobei der letzte Rest einem 3 min -Desoxy-guanosinrest entspricht (Glen Research, Sterling,  VA). Dem Fachmann sind zahlreiche weitere Varianten bezüglich eines kleinen Primers, die auf der hier zur Verfügung gestellten Lehre basieren, bekannt. 


 c) Primer (Telomer)-Bindungsaktivität 
 



  Primer (Telomer)-Bindungsaktivität von Telomerase wird beispielsweise von Morin, 1997, a.a.O.; Collins et al., Cell 81 (1995), 667 und Harrington et al., J. Biol. Chem. 270 (1995), 8893 beschrieben. Man nimmt an, dass Telomerase zwei Stellen aufweist, die einen Telomer-DNA-Primer binden. Die mit der Primerbindung assoziierten RT-Motive zeigen, dass hTRT und/oder hTRT/hTR DNA-Primer-Bindungsaktivität aufweist. Es gibt verschiedene Möglichkeiten, Primer-Bindungsaktivität zu bestimmen. Allerdings haben die meisten Verfahren einen Schritt gemeinsam, nämlich die Inkubation eines markierten DNA-Primers mit hTRT oder hTRT/hTR oder anderen TRT/TR-Kombinationen unter geeigneten Bindungsbedingungen. Die meisten Verfahren verwenden auch ein Mittel zur Abtrennung ungebundener DNA von Protein-gebundener DNA. Diese Verfahren beinhalten folgende Schritte: 



  i) Gel-"shift"-Assays (die auch als "electrophoretic/mobility shift"-Assays bezeichnet werden) sind Assays, bei denen ungebundener DNA-Primer von Protein-gebundenem DNA-Primer durch Elektrophorese in einem nicht-denaturierenden Gel abgetrennt wird (Ausubel et al., a.a.O). 



  ii) Matrixbindungs-Assays beinhalten verschiedene Variationen hinsichtlich des Grundverfahrens. Dazu gehören die Bindung der hTRT oder des hTRT/hTR-Komplexes an eine Matrix (z.B. Nitrocellulose) entweder vor oder nach Inkubation mit dem markierten Primer. Durch die Bindung der hTRT an eine Matrix kann der ungebundene Primer von dem gebundenen Primer mechanisch abgetrennt werden. Restliche ungebundene DNA kann durch Waschen der Membran vor der Quantifizierung entfernt werden. Es ist für den Fachmann offensichtlich, dass es ver schiedene Möglichkeiten zur Kopplung von Proteinen an solche Matrices, feste Träger und Membranen gibt, dazu gehören beispielsweise chemische, photochemische und UV-Quervernetzung, Antikörper/Epitop und nicht-kovalente, hydrophobe, (elektrostatische etc.) Interaktionen. 



  Als DNA-Primer kann jede DNA mit einer Affinität für Telomerase verwendet werden, beispielsweise ein Telomer-DNA-Primer, wie (TTAGGG)n, wobei n 1 bis 10 sein kann und typischerweise 3 bis 5 ist. Die 3 min - und 5 min -Enden können an jeder Position der Wiederholungssequenz enden. Die Primer können auch 5 min - oder 3 min -Verlängerungen von Nicht-Telomer-DNA aufweisen, die eine Markierung oder einen Nachweis erleichtern können. Die Primer können auch derivatisiert sein, um beispielsweise den Nachweis oder die Isolierung zu erleichtern. 


 d) dNTP-Bindungsaktivität 
 



  dNTP-Bindungsaktivität von Telomerase wird beispielsweise in Morin, 1997, a.a.O., und Spence et al., a.a.O. beschrieben. Telomerase benötigt für die Synthese von DNA dNTPs. Das hTRT-Protein weist eine Nucleotid-Bindungsaktivität auf und es kann hinsichtlich einer dNTP-Bindung ähnlich wie andere Nucleotid-bindende Proteine untersucht werden (Kantrowitz et al., Trends Biochem. Sci. 5 (1980), 124). Typischerweise wird die Bindung eines markierten dNTPs oder eines dNTP-Analogs überwacht, so wie dies auf dem Fachgebiet für Nicht-Telomerase-RT-Proteine bekannt ist. 


 e) RNA (d.h. hTR)-Bindungsaktivität 
 



  RNA (d.h. hTR)-Bindungsaktivität von Telomerase wird beispielsweise in Morin, 1997, a.a.O., beschrieben, Harrington et al., Science 275 (1997), 973 und Collins et al., Cell 81 (1995), 677. Die RNA-Bindungsaktivität eines erfindungsgemässen TRT-Proteins kann auf ähnliche Weise wie dies vorstehend bezüglich des DNA-Primer-Bindungsassays beschrieben wurde,  unter Verwendung einer markierten RNA-Sonde nachgewiesen werden. Verfahren zur Abtrennung gebundener und nicht-gebundener RNA und zum Nachweis von RNA sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Diese können für die erfindungsgemässen Aktivitätsassays auf ähnliche Weise wie dies für den DNA-Primer-Bindungsassay beschrieben wurde, angewandt werden. Bei der RNA kann es sich um hTR mit vollständiger Länge handeln, Fragmente von hTR oder andere RNAs, für die gezeigt werden kann, dass sie eine Affinität für Telomerase oder hTRT aufweisen.

   Siehe US-Patent Nr. 5 583 016 und PCT-Veröffentlichung Nr. 96/40 868 (siehe auch USSN 08/478 352, eingereicht am 7. Juni 1995). 


 3) Telomerase-Motive als Ziele 
 



  Wie bereits vorstehend angemerkt, stellt die vorliegende Erfindung hTRT-Polypeptide bereit, die nicht den vollen Satz (wie vorstehend beschrieben) an Telomerase-Aktivitäten von natürlich vorkommender Telomerase, hTRT oder anderen TRTProteinen aufweisen. Es ist angesichts der hier vorliegenden Beschreibung von RT und von Telomerase-spezifischen Motiven von TRT offensichtlich, dass Änderungen oder Mutationen von konservierten Aminosäureresten, die in den oben diskutierten Motivsequenzen gefunden werden können, zur Entstehung von Mutanten mit Aktivitätsverlusten führen, die für therapeutische Zwecke, zum Screenen und zur Charakterisierung von Arzneimitteln und für weitere Anwendungsmöglichkeiten von Nutzen sind.

   Beispielsweise führt die Deletion der Motive B in den RT-Domänen des endogenen TRT-Gens in s. pombe, wie in Beispiel 1 beschrieben, zu haploiden Zellen, in denen eine progressive Telomerverkürzung bis zu dem Punkt, an dem eine Hybridisierung mit Telomer-Wiederholungseinheiten fast nicht mehr nachweisbar war, beobachtet werden konnte, was einen Verlust einer katalytischen Aktivität von Telomerase anzeigt. Auf ähnliche Weise können Änderungen in der WxGxS-Stelle von Motiv E die DNA-Primerbindung oder Funktion von Telomerase beeinflussen. Darüber hinaus können Änderungen  der Aminosäuren in den Motiven A, B min  und C die katalytische Aktivität von Telomerase beeinflussen. Die Mutation des DDMotivs von hTRT kann Telomerase-Aktivität erheblich verringern oder aufheben (siehe Beispiel 16). 


 C) Die Synthese von hTRT und anderen TRT-Polypeptiden 
 



  Die Erfindung stellt eine Reihe von Verfahren zur Herstellung der hier offenbarten hTRT und anderer TRT-Polypeptide bereit. In den folgenden Abschnitten wird die chemische Synthese und die rekombinante Expression von hTRT-Proteinen, einschliesslich Fusionsproteinen ausführlich beschrieben. 


 1) Chemische Synthese 
 



  Die Erfindung stellt hTRT-Polypeptide bereit, die ganz oder teilweise unter Verwendung von allgemeinen, auf dem Fachgebiet gut bekannten chemischen Verfahren synthetisiert wurden (siehe beispielsweise Caruthers et al., Nucleic Acids Res. Symp. Ser. (1980) 215-223 und Horn et al., Nucleic Acids Res. Symp. Ser. (1980), 225-232). Beispielsweise kann eine Peptidsynthese unter Verwendung verschiedener Festphasenverfahren durchgeführt werden (Roberge et al., Science 269 (1995) 202), darunter fällt auch die automatische Synthese (z.B. unter Verwendung des Peptid Synthesizers ABI 431A von Perkin Elmer gemäss den Anweisungen des Herstellers). Wenn ein Protein mit vollständiger Länge erwünscht ist, können kürzere Polypeptide durch Kondensation des Aminoterminus eines Moleküls mit dem Carboxylterminus des anderen Moleküls zur Bildung einer Peptidbindung fusioniert werden. 



  Die neu synthetisierten Peptide können wesentlich gereinigt werden, beispielsweise durch präparative HPLC (siehe beispielsweise Creighton Proteins, Structures and Molecular Principles, WH Freeman and Co., New York NY (1983). Die Zusammensetzung der synthetischen Peptide (oder beliebiger anderer erfindungsgemässer Peptide oder Polypeptide) kann durch  Aminosäureanalyse oder Sequenzierung (z.B. das Verfahren des Edman-Abbaus; Creighton, a.a.O.) bestätigt werden. Es ist wichtig anzumerken, dass die Aminosäuresequenz von hTRT oder einem beliebigen Teil davon während der Synthese verändert werden kann und/oder unter Verwendung chemischer Verfahren mit Sequenzen von anderen Proteinen kombiniert werden kann.

   Dies kann auch anderweitig durchgeführt werden und einen beliebigen Teil der Aminosäuresequenzen für jeden beliebigen Zweck zur Herstellung einer Variante der erfindungsgemässen Polypeptide umfassen. 


 2) Rekombinante Expression von hTRT und anderen Trtproteinen 
 



  Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren, Reagenzien, Vektoren und Zellen bereit, die zur Expression von hTRT-Polypeptiden und Nucleinsäuren von Nutzen sind, wobei in vitro (zellfrei), ex vivo oder in vivo (auf Zellen oder Organismen basierende) rekombinante Expressionssysteme verwendet werden. In einer Ausführungsform umfasst die Expression des hTRT-Proteins oder eines Fragments davon die Insertion der codierenden Sequenz in einen geeigneten Expressionsvektor (d.h. ein Vektor, der die erforderlichen Elemente für die Transkription und Translation der inserierten codierenden Sequenz enthält).

   Somit betrifft ein Aspekt der Erfindung die Bereitstellung eines Polynucleotids, das in der Sequenz im wesentlichen identisch ist zu einer ein hTRT-Gen codierenden Sequenz von mindestens 25 Nucleotiden und vorzugsweise für viele Anwendungsmöglichkeiten 50 bis 100 Nucleotiden oder mehr der erfindungsgemässen hTRT-cDNAs oder Gene, das zur Bildung einer Transkriptionseinheit, die ein hTRT-Polypeptid exprimieren kann, mit einem Promotor funktionell verknüpft ist. Zur Konstruktion der Expressionsvektoren, die eine durch die vorliegende Erfindung bereitgestellte hTRTSequenz und geeignete Transkriptionskontrollen oder Translationskontrollen enthalten, können dem Fachmann gut bekannte Verfahren angewandt werden (siehe beispielsweise Sambrook et  al., a.a.O., Ausubel et al., a.a.o. und die vorliegende Beschreibung). 



  Zu den erfindungsgemässen hTRT-Polypeptiden zählen Fusionsproteine, die hTRT-Polypeptide oder Fragmente des hTRTProteins enthalten. Die Fusionsproteine werden typischerweise rekombinant hergestellt, sie können jedoch auch chemisch synthetisiert werden. Fusionsproteine können zur Erzielung einer erhöhten Expression der hTRT-Polypeptidkonstrukte von Nutzen sein oder zur Herstellung von hTRT-Polypeptiden mit anderen gewünschten Eigenschaften beispielsweise eine Markierung umfassen (z.B. eine enzymatische Reportergruppe), eine bindende Gruppe oder ein Antikörper-Epitop umfassen. Ein Beispiel für ein Fusionsprotein, das hTRT und "enhanced green fluorescent protein" (EGFP)-Sequenzen umfasst, ist nachstehend in Beispiel 15 beschrieben.

   Es ist für den Fachmann offensichtlich, dass die in Beispiel 15 und an anderen Stellen hier diskutierten Verwendungen und Anwendungsmöglichkeiten nicht auf die spezifischen Fusionsproteine beschränkt sind, sondern die Verwendungsmöglichkeiten für die verschiedenen Fusionskonstrukte veranschaulichen sollen. 



  Die erfindungsgemässen Fusionsproteinsysteme können auch zur Erleichterung der effizienten Herstellung und Isolierung von hTRT-Proteinen oder Peptiden verwendet werden. Beispielsweise umfasst in einigen Ausführungsformen der Nicht-hTRT-Sequenzanteil des Fusionsproteins ein kurzes Peptid, das an ein immobilisiertes Molekül spezifisch gebunden werden kann, so dass das Fusionsprotein von nicht-gebundenen Bestandteilen (wie nicht verwandte Proteine in einem Zellysat) abgetrennt werden kann. Ein Beispiel dafür ist eine Peptidsequenz, die von einem spezifischen Antikörper gebunden wurde. Ein weiteres Beispiel ist ein Peptid, das Polyhistidin-Spuren umfasst, beispielsweise (His)6 oder Histidin-Tryptophan-Sequenzen, die durch ein Harz gebunden werden können, das Nickeloder Kupferionen enthält (d.h. Metallchelat-Affinitätschro matographie).

   Zu weiteren Beispielen zählen Protein A-Domänen oder Fragmente, die die Reinigung auf immobilisierten Immunglobulin erlauben, und die in dem "FLAGS"-Verlängerungs/-Affinitäts-Reinigungssystem verwendete Domäne (Immunex Corp., Seattle WA). In einigen Ausführungsformen enthält das Fusionsprotein eine Spaltstelle, so dass die hTRT-Sequenz oder eine andere TRT-Polypeptidsequenz von der Nicht-hTRT-Peptidsequenz oder Nicht-hTRT-Proteinsequenz leicht abgetrennt werden kann. In diesem Fall kann die Spaltung chemisch erfolgen (z.B. mit Bromcyan, 2-(2-Nitrophenylsulfonyl)-3-methyl-3 min -bromindolen, Hydroxylamin oder niedriger pH-Wert) oder enzymatisch (z.B. mit Faktor Xa, Enterokinase). Die Auswahl des Fusions- und Spaltsystems kann teilweise von dem Anteil (d.h. der Sequenz) des zu exprimierenden hTRT-Polypeptids abhängen.

   Fusionsproteine sind allgemein beschrieben in Ausubel et al., a.a.O., Kapitel 16, Kroll et al., DNA Cell. Biol. 12 (1993), 441 und in dem Invitrogen-Katalog von 1997 (Invitrogen Inc., San Diego CA). Weitere Beispiele für erfindungsgemässe Fusionsproteine mit Epitop-"tags" oder "tags" und Spaltstellen werden nachstehend in Beispiel 6 bereitgestellt. 



  Es ist für den Fachmann offensichtlich, dass sich die in diesem Abschnitt diskutierten Expressionssysteme zwar auf die Expression von hTRT-Polypeptiden konzentrieren, jedoch die gleichen oder ähnliche Zellen, Vektoren und Verfahren zur Expression von erfindungsgemässen hTRT-Polypeptiden verwendet werden können, dazu gehören auch "sense"- und "antisense"-Polynucleotide, wobei die Herstellung von hTRT-Polypeptiden nicht notwendigerweise erwünscht ist. Typischerweise erfordert die Expression eines Polypeptids ein geeignetes Initiationscodon (z.B. Methionin), einen offenen Leserahmen und Translationsregulationssignale (z.B. eine Ribosomenbindungsstelle, ein Terminationscodon), die fehlen können, wenn die Translation einer Nucleinsäuresequenz zur Herstellung eines Proteins nicht erwünscht ist. 



  Die Expression von hTRT-Polypeptiden und Polynucleotiden kann durchgeführt werden, um die Vorteile zu nutzen, die mit den der vorliegenden Erfindung bereitgestellten Vorteilen einhergehen. Ein Beispiel eines solchen Vorteils ist die Expression von hTRT-Polypeptiden, die im Anschluss daran von der Zelle, in der sie exprimiert wurden, isoliert werden (z.B. zur Herstellung grosser Mengen von hTRT zur Verwendung als ein Vakzin). Ein zweites Beispiel für einen solchen Vorteil ist die Expression von hTRT in einer Zelle zur Veränderung des Phänotyps der Zelle (wie bei Anwendungen in der Gentherapie). 

   Nicht-Säugerzellen können für die Expression von hTRT zur Reinigung verwendet werden, während eukaryotische Zellen, insbesondere Säugerzellen (z.B. menschliche Zellen) nicht nur für die Isolation und Reinigung von hTRT verwendet werden können, sondern auch zur Expression von hTRT, wenn eine Veränderung im Phänotyp in einer Zelle erwünscht ist (z.B. um eine Änderung in der Fähigkeit zur Proliferation z.B. bei Anwendungen in der Gentherapie zu erreichen). hTRT-Polypeptide mit einer oder mehreren Telomerase-Aktivitäten (z.B. der katalytischen Aktivität von Telomerase) können beispielsweise, allerdings ohne Beschränkung darauf, in einer Wirtszelle exprimiert werden, um so die Fähigkeit einer Zelle zur Proliferation zu erhöhen (z.B. um eine Zelle zu immortalisieren).

   Im Gegensatz dazu können hTRT-"antisense"-Polynucleotide oder hemmende Polypeptide typischerweise zur Herabsetzung der Fähigkeit einer Zelle zur Proliferation exprimiert werden (z.B. bei einer Telomerase-positiven malignen Tumorzelle). Zahlreiche spezifische Anwendungsmöglichkeiten werden hier beschrieben, beispielsweise bei der nachstehenden Diskussion der Verwendungen der erfindungsgemässen Reagenzien und Verfahren für therapeutische Anwendungen. 



  Zu den Beispielen von nützlichen erfindungsgemässen Expressionssystemen (Zellen, regulatorische Elemente, Vektoren und Expression) gehören eine Reihe von zell-freien Systemen, wie beispielsweise ein Retikulocytenlysat und Weizenkeim-Sy steme, die hTRT-Polynucleotide gemäss allgemeiner, auf dem Fachgebiet gut bekannter Verfahren verwenden (siehe beispielsweise Ausubel et al., a.a.O., Kapitel 10). In alternativen Ausführungsformen stellt die Erfindung Reagenzien und Verfahren zur Expression von hTRT in prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen bereit.

   Die vorliegende Erfindung stellt somit     Nucleinsäuren bereit, die hTRT-Polynucleotide codieren, Proteine, Protein-Untersequenzen oder Fusionsproteine, die in Bakterien, Pilzen, Pflanzen, Insekten und Tieren, einschliesslich Menschen, auf dem Fachgebiet bekannten Zellexpressionssystemen einschliesslich isolierter Zellen, Zellinien, Zellkulturen, Geweben und ganzen Organismen exprimiert werden können. Es ist für den Fachmann offensichtlich, dass die in eine Wirtszelle oder ein zellfreies Expressionssystem eingeführten hTRT-Polynucleotide üblicherweise mit einer geeigneten Expressionskontrollsequenz für jeden Wirt oder jedes zellfreie System funktionell verknüpft sind. 



  Zu den nützlichen bakteriellen Expressionssystemen gehören E. coli, Bacilli (wie beispielsweise Bacillus subtilis), andere Enterobacteriaceae (wie Salmonella, Serratia und zahlreiche Pseudomonasarten) oder andere bakterielle Wirte (z.B. Streptococcus cremoris, Streptococcus lactis, Streptococcus thermophilus, Leuconostoc citrovorum, Leuconostoc mesenteroides", Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus lactis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve und Bifidobacterium longum). Zu den in Prokaryoten nützlichen hTRT-Expressionskonstrukten gehören rekombinante Bakteriophagen, Plasmid- oder Cosmid-DNA-Expressionsvektoren oder ähnliche und diese beinhalten typischerweise Promotorsequenzen.

   Zu den Beispielen für Promotoren zählen induzierbare Promotoren, wie der lac-Promotor, der Hybrid-lacZ-Promotor des "Bluescript7"-Phagemids (Stratagene, La Jolla CA) oder pSport1 (Gibco BRL); Promotorsysteme vom Phagen lambda; ein Tryptophan (trp)-Promotorsystem; ptrp-lac-Hybride etc. Die bakteriellen Expressionskonstrukte enthalten gegebenenfalls eine Ribosomenbindungsstelle und regulatorische Signalse quenzen für die Termination der Transkription. Zu den veranschaulichenden Beispielen von spezifischen Vektoren, die für die Expression von Nutzen sind, zählen pTrcHis2 (Invitrogen, San Diego CA) , pThioHis A, B & C und zahlreiche andere auf dem Fachgebiet bekannte Vektoren oder solche, die entwickelt werden können (siehe beispielsweise Ausubel, a.a.O.). Zu den für Bakterien nützlichen Vektoren gehören solche, die die Herstellung von hTRT-Fusionsproteinen erleichtern.

   Zu den für die Expression von Fusionsproteinen in bakteriellen Zellen mit hohem Niveau nützlichen Vektoren zählen, allerdings ohne Beschränkung darauf, die multifunktionalen Clonierungs- und Expressionsvektoren für E. coli, beispielsweise der vorstehend erwähnte Bluescript7 (Stratagene), bei dem die ein hTRT-Protein, ein hTRT-Fusionsprotein oder ein hTRT-Fragment codierende Sequenz im Leserahmen mit Sequenzen für das aminoterminale Met und die sich daran anschliessenden 7 Reste der  beta -Galactosidase in den Vektor ligiert werden kann, so dass ein Hybridprotein hergestellt wird (z.B. pIN-Vektoren; van Heeke und Schuster, J. Biol. Chem. 264 (1989), 5503). Vektoren, wie beispielsweise pGEX-Vektoren (z.B. pGEX-2TK; Pharmacia Biotech) können auch zur Expression von Fremdpolypeptiden wie einem hTRT-Protein als Fusionsproteine mit Glutathion-S-Transferase (GST) verwendet werden.

   Solche Fusionsproteine können von lysierten Zellen durch Adsorption an Glutathion-Agarose-Kügelchen und anschliessender Elution in Gegenwart von freiem Glutathion gereinigt werden. In solchen Systemen hergestellte Proteine enthalten oft Protease-Spaltstellen für Enterokinase, Thrombin oder Faktor Xa, so dass das erwünschte clonierte Polypeptid von der GST-Einheit, falls erwünscht, freigesetzt werden kann, was bei der Reinigung oder anderen Anwendungsmöglichkeiten von Nutzen ist. Weitere Beispiele sind Fusionsproteine, die hTRT und das Maltose-bindende Protein von E. coli (MBP) oder Thioredoxin von E. coli umfassen. Veranschaulichende Beispiele von in bakteriellen Zellen nützlichen hTRT-Expressionskonstrukten werden in dem nachstehenden Beispiel 6 bereitgestellt. 



  Die vorliegende Erfindung stellt ferner hTRT-Polypeptide zur Verfügung, die in Pilzsystemen wie beispielsweise Dictyostelium und vorzugsweise Hefe wie beispielsweise Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Torulopsi holmil, Saccharomyces fragilis, Saccharomyces lactis, Hansenula polymorpha und Candida pseudotropicalis exprimiert wurden. Für die Expression von hTRT in Hefe stehen eine Reihe von geeigneten Vektoren zur Verfügung, zu denen Plasmid- und YACs-Vektoren gehören (YACs = künstliche Hefechromosomen). Die Vektoren enthalten typischerweise Expressionskontrollsequenzen, wie z.B. konstitutive oder induzierbare Promotoren (z.B. den  alpha -Faktor, Alkoholoxidase, PGH und        3-Phosphoglyceratkinase oder andere glykolytische Enzyme), einen Replikationsursprung, Terminationssequenzen etc., je nachdem, was erwünscht ist.

   Zu den zur Verwendung in Pichia geeigneten Vektoren gehören pPICZ, His6/pPICZB, pPICZalpha, pPIC3.5K, pPIC9K, pA0815, pGAP2A, B & C, pGAP2alpha A, B und C (Invitrogen, San Diego, CA) und zahlreiche weitere auf dem Fachgebiet bekannte oder noch zu entwickelnde Vektoren. In einer Ausführungsform wird der Vektor His6/pPICZB (Invitrogen, San Diego, CA) zur Expression eines His6-hTRT-Fusionsproteins in der Hefe Pichia pastoris verwendet. pYES2 (Invitrogen, San Diego, CA) ist ein Beispiel für einen in Saccharomyces nützlichen Vektor. Veranschaulichende Beispiele von in Hefe nützlichen hTRT-Expressionskonstrukten werden in dem nachstehenden Beispiel 6 bereitgestellt. 



  Die erfindungsgemässen hTRT-Polypeptide können auch in Pflanzenzellensystemen exprimiert werden, die mit Pflanzen- oder Pflanzenvirus-Expressionsvektoren (z.B. mit Blumenkohlmosaikvirus, CaMV; Tabakmosaikvirus, TMV) transfiziert oder mit bakteriellen Expressionsvektoren (Ti oder dem Plasmid pBR322) transformiert wurden. In Fällen, bei den Pflanzenvirus-Expressionsvektoren verwendet werden, kann die Expression einer hTRT-codierenden Sequenz durch eine Reihe von Promotoren gesteuert werden. Beispielsweise können virale Promotoren wie die 35S und 19S-Promotoren von CaMV (Brisson  et al. Nature 310 (1984) 511-514) allein oder in Kombination mit der Omega Leader-Sequenz von TMV verwendet werden (Takamatsu et al., EMBO J. 6 (1987) 307-311).

   In einer alternativen Ausführungsform können Pflanzenpromotoren wie der Promotor von dem Gen für die kleine Untereinheit von RUBISCO (Coruzzi et al., EMBO J. 3 (1984) 1671 bis 1680 und Broglie et al., Science 224 (1984), 838-843) oder Hitzeschockpromotoren (Winter und Sinibaldi, Results Probl. Cell Differ. 17 (1991), 85) oder Promotoren von Genen für Speicherproteine verwendet werden. Diese Konstrukte können durch direkte DNATransformation oder pathogen-vermittelte Transfektion in Pflanzenzellen eingeführt werden (zum weiteren Studium dieser Verfahren sei verwiesen auf Hobbs oder Murry (1992) in McGraw Hill Yearbook of Science and Technology, McGraw Hill New York NY, S. 191-196 (1992), oder Weissbach und Weissbach (1988), Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, New York NY, S. 421-463). 



  Ein weiteres, durch die vorliegende Erfindung bereitgestelltes Expressionssystem zur Expression eines hTRT-Proteins ist ein Insektensystem. Bei einem bevorzugten System wird ein Baculovirus-Polyhedrin-Promotor verwendet. In einem dieser Systeme wird der nucleäre Polyhedrosis-Virus von Autographa californica (AcNPV) als Vektor zur Expression von Fremdgenen in Spodoptera frugiperda-Zellen oder in Trichoplusia-Larven verwendet. Die das gewünschte Gen codierende Sequenz kann in einen nicht-essentiellen Bereich des Virus, beispielsweise das Polyhedringen, cloniert werden und unter die Kontrolle des Polyhedrinpromotors gestellt werden. Die erfolgreiche Insertion der Sequenz, die beispielsweise das hTRT-Protein codiert, führt zur Inaktivierung des Polyhedringens und es wird ein rekombinantes Virus hergestellt, dem das Hüllprotein fehlt.

   Die rekombinanten Viren werden dann zur Infektion von S. frugiperda-Zellen oder Trichoplusia-Larven verwendet, in denen dann die hTRT-Sequenz exprimiert wird (siehe bezüglich allgemeiner Verfahren Smith et al., J. Virol. 46 (1983), 584 und Engelhard et al., Proc. Natl.  Acad. Sci. 91 (1994) 3224-7). Zu den für die BaculovirusExpression nützlichen Vektoren zählen pBlueBacHis2 A, B & C; pBlueBac4.5; pMelBacB und zahlreiche andere auf dem Fachgebiet bekannte Vektoren oder noch zu entwickelnde Vektoren. Veranschaulichende Beispiele von hTRT-Expressions-Konstrukten, die in Insektenzellen von Nutzen sind, werden in dem nachstehenden Beispiel 6 bereitgestellt. 



  Die vorliegende Erfindung stellt auch Expressionssysteme in Säugern und Säugerzellen bereit. Wie bereits vorstehend angemerkt, können hTRT-Polynucleotide in Säugerzellen (z.B. menschlichen Zellen) für die Herstellung von signifikanten Mengen von hTRT-Polypeptiden (z.B. zur Reinigung) oder zur Veränderung des Phänotyps einer Zielzelle (z.B. für Zwecke der Gentherapie, Zellimmortilisation etc.) exprimiert werden. Im letzteren Fall kann das exprimierte hTRT-Polynucleotid ein Polypeptid mit einer katalytischen Aktivität von Telomerase codieren oder auch nicht. Das heisst, es kann ein "sense"- oder "antisense"-Polynucleotid, ein hemmendes oder stimulierendes Polypeptid, ein Polypeptid mit null, einer oder mehreren Telomerase-Aktivitäten exprimiert werden. weitere Kombinationen und Varianten sind für den Fachmann nach Lesen dieser Beschreibung offensichtlich. 



  Zu den für die Expression der erfindungsgemässen Nucleinsäuren geeigneten Gewebekultur-Säugerzellen gehören jede normale sterbliche, normale oder abnorme unsterbliche tierische oder menschliche Zelle. Dazu gehören: die mit SV40 transformierte Affennierenlinie CV1 (COS-7, ATCC CRL 1651), die menschliche embrionale Nierenlinie (293) (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977), 59), die Babyhamsternierenzellen (BHK, ATCC CCL 10), CHO (ATCC CCL 61 und CRL 9618), Maus-Sertolizellen (TM4, Mather, Biol.

   Reprod. 23 (1980) 243-251), Affennierenzellen (CV1, ATCC CCL 70), Nierenzellen der Afrikanischen Grünen Meerkatze (VERO-76, ATCC CRL 1587), menschliche Cervix-Karzinomzellen (HeLa, ATCC CCL 2), Hundenierenzellen (MDCK, ATCC CCL 34), Büffelrattenleberzellen  (BRL 3A,    ATCC CRL 1442), menschliche Lungenzellen (W138, ATCC CCL 75), menschliche Leberzellen     (HEP G2, HB 8065), Maus-Brusttumor (MMT 060562, ATCC CCL 51) und TRI-Zellen (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982), 44-46, MDCK (ATCC CCL 34 und CRL 6253), HEK 293 (ATCC CRL 1573), WI-38 (ATCC CCL 75) (ATCC: American Type Culture Collection Rockville, MD)). Die Verwendung von Säuger-Gewebezellkulturen zur Expression von Polypeptiden wird allgemein in Winnacker, FROM GENES TO CLONES (VCH-Verlag, N.Y., N.Y., 1987) erläutert. 



  Für Säugerwirtszellen werden auf Viren basierende und nichtvirale Expressionssysteme bereitgestellt. Zu den nicht-viralen Vektoren und Systemen gehören Plasmide, episomale Vektoren, typischerweise mit einer Expressionskassette für Expression eines Proteins oder einer RNA, und menschliche künstliche Chromosomen (siehe z.B. Harrington et al., Nat Genet 15 (1997), 345).

   Zu den für die Expression von hTRT-Polynucleotiden und Polypeptiden in Säugerzellen (z.B. menschlichen Zellen) nützlichen nicht-viralen Vektoren gehören pcDNA3.1/His, pEBVHis A, B & C (Invitrogen, San Diego CA), MPSV-Vektoren, andere in dem Invitrogen-Katalog von 1997 beschriebene Vektoren (Invitrogen Inc., San Diego CA), der aufgrund der Bezugnahme vollständig zum Offenbarungsgehalt der vorliegenden Beschreibung zählt, sowie bezüglich weiterer Proteine zahlreiche andere auf dem Fachgebiet bekannte Vektoren und Systeme. Veranschaulichende Beispiele von in Säugerzellen nützlichen hTRT-Expressionskonstrukten werden nachstehend in Beispiel 6 bereitgestellt. 



  Zu den nützlichen viralen Vektoren zählen Vektoren, die auf Retroviren basieren, Adenoviren, adeno-assoziierte Viren, Herpesviren, auf SV40 basierende Vektoren, Papilloma Viren, HBP-Epstein Barr Virus, Vaccinia Virus-Vektoren und "Semliki Forest"-Virus (SFV). SFV und Vacciniavektoren werden allgemein in Ausubel et al., a.a.O., Kapitel 16 diskutiert. Diese Vektoren sind oft aus zwei Komponenten aufgebaut, einem mo difizierten viralen Genom und einer dieses umgebenden Hüll-Struktur (siehe allgemein Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49 (1995), 807). Allerdings werden gelegentlich virale Vektoren in nackter Form oder umhüllt mit Proteinen, die nicht zu viralen Proteinen zählen, eingeführt. Die virale Nucleinsäure in einem Vektor kann jedoch auf vielfältige Weise verändert werden, beispielsweise wenn dies für die Gentherapie erwünscht ist.

   Ziele dieser Veränderungen sind das Wachstum des Virus in Zielzellen zu verhindern und Beibehaltung seiner Fähigkeit in Vektorform in verfügbaren Pack- oder Helferzellen zu wachsen, um Raum innerhalb des viralen Genoms zur Insertion von exogenen DNA-Sequenzen bereitzustellen und um neue Sequenzen einzufügen, die das gewünschte Gen codieren und eine geeignete Expression ermöglichen. Somit umfassen Vektor-Nucleinsäuren im allgemeinen zwei Bestandteile: essentielle in cis wirkende Viralsequenzen zur Replikation und Verpackung in einer Helferlinie und die Transkriptionseinheit für das exogene Gen. Andere virale Funktionen werden in einer spezifischen Verpackungs- oder Helfer-Zellinie in trans exprimiert.

   Adenovirus-Vektoren (z.B. zur Verwendung in der Gentherapie bei Menschen) sind beispielsweise in Rosenfeld et al., Cell 68 (1992), 143 und in den PCT-Veröffentlichungen Wo 94/12 650; 94/12 649 und 94/12 629 beschrieben. In Fällen, in denen als Expressionsvektor ein Adenovirus verwendet wird, kann eine hTRT codierende Sequenz in einen Adenovirus-Transkriptions/Translations-Komplex ligiert werden, der aus dem späten Promotor und der dreiteiligen Leadersequenz besteht. Die Insertion in einen nicht-essentiellen E1- oder E3-Bereich des viralen Genoms ergibt ein lebensfähiges Virus, das in infizierten Wirtszellen exprimieren kann (Logan und Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. 81 (1984), 3655). Replikations-defiziente retrovirale Vektoren, die eine therapeutische Polynucleotidsequenz als Teil des retroviralen Genoms enthalten, werden beispielsweise beschrieben in Miller et al., Mol. Cell.

   Biol. 10 (1990) 4239; Kolberg, J. NIH Res. 4 (1992), 43 und Cornette et al., Hum. Gene Ther. 2 (1991), 215. 



  In Säuger-Zellsystemen sind oft Promotoren von Säugergenen oder Säugerviren geeignet. Geeignete Promotoren können konstitutiv sein, Zelltyp-spezifisch, Stadium-spezifisch und/oder modulierbar oder regulierbar (z.B. durch Hormone, wie beispielsweise Glucocorticoide). Zu nützlichen Promotoren zählen, jedoch ohne Beschränkung darauf, der Metallothionein-Promotor, der konstitutive "Major late"-Promotor von Adenovirus, der Dexamethason-induzierbare MMTV, der SV40-Promotor, der MRP polIII-Promotor, der konstitutive MPSV-Promotor, der Tetracyclin-induzierbare CMV-Promotor (wie beispielsweise der menschliche "immediate-early" CMV-Promotor), der konstitutive CMV-Promotor und auf dem Fachgebiet bekannte Promotor-Enhancer-Kombinationen. 



  Für eine effiziente Expression eines hTRT-Polynucleotids und/oder die Translation einer hTRT-Proteine codierenden Sequenz können auch weitere regulatorische Elemente erforderlich oder erwünscht sein. Für die Translation beinhalten diese Elemente typischerweise ein ATG-Initiationscodon und eine benachbarte Ribosomen-Bindungsstelle oder andere Sequenzen. Für das hTRT-Protein codierende Sequenzen sind, falls dessen Initiationscodon und stromaufwärts gelegene Promotorsequenzen in einen Expressionsvektor inseriert sind, keine zusätzlichen Translationssignale oder andere Kontrollsignale erforderlich. In Fällen jedoch, in denen nur eine codierende Sequenz oder ein Teil davon inseriert ist, müssen oft exogene Transkriptions- und/oder Translations-Kontrollsignale (z.B. der Promotor, die Ribosomenbindungsstelle und das ATG-Initiationscodon) bereitgestellt werden.

   Darüber hinaus muss das Initiationscodon typischerweise im korrekten Leserahmen vorliegen, um die Translation des gewünschten Proteins zu gewährleisten. Exogene Transkriptionselemente und Initiationscodons können von zahlreichen Quellen, sowohl natürlichen als auch synthetischen, stammen. Zusätzlich kann die Effizienz der Expression durch die Einfügung von für das verwendete Zellsystem geeigneten Enhancern verstärkt werden  (Scharf et al., Results Probl. Cell Differ. 20 (1994), 125 und Bittner et al., Meth. Enzymol. 153 (1987), 516). Beispielsweise kann zur Steigerung der Expression in Säuger-Wirtszellen der SV40-Enhancer oder der CMV-Enhancer verwendet werden. 



  Die Expression von hTRT-Genprodukten kann auch durch Aktivierung eines hTRT-Promotors oder Enhancers in einer Zelle, wie beispielsweise einer menschlichen Zelle, z.B. einer Telomerase-negativen Zellinie, bewirkt (erhöht) werden. Die Aktivierung kann durch eine Reihe von unterschiedlichen Massnahmen erreicht werden. Dazu zählen die Verabreichung eines einen exogenen Promotor aktivierenden Agens oder die Hemmung eines zellulären Bestandteils, der die Expression des hTRT-Gens unterdrückt. Natürlich wird umgekehrt die Hemmung der Promotorfunktion, so wie dies nachstehend beschrieben ist, die hTRT-Genexpression herabsetzen. 



  Die Erfindung stellt die induzierbare und reprimierbare Expression von hTRT-Polypeptiden unter Verwendung solcher Systeme wie des Ecdyson-induzierbaren Expressionssystems (Invitrogen) und die "Tet-On and Tet-off" Tetracyclin-regulierten Systeme von Clontech bereit. Bei dem durch Ecdyson induzierbaren Expressionssystem wird ein Analogon des Steroidhormons Ecdyson, Muristeron A zur Aktivierung der Expression eines rekombinanten Proteins über einen heterodimären nucleären Rezeptor verwendet (No et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (1996), 3346). In einer Ausführungsform wird hTRT in den pIND-Vektor (Clontech) cloniert, der fünf modifizierte Ecdyson-Reaktionselemente (E/GREs) stromaufwärts eines minimalen Hitzeschockpromotors und der Mehrfachclonierungsstelle enthält. Dieses Konstrukt wird dann in den Ecdyson-Rezeptor stabil exprimierenden Zellinien transfiziert.

   Nach der Transfektion werden die Zellen zur Induktion der intrazellulären Expression von pIND mit Muristeron A behandelt. In einer anderen Ausführungsform wird das hTRT-Polypeptid unter Verwendung der "Tet-on and Tet-off"-Expres sionssysteme (Clontech) neben den beschriebenen regulierten Hochniveau-Genexpressionssystemen exprimiert (Gossen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992), 5547 und Gossen et al., Science 268 (1995), 1766). 



  Die erfindungsgemässen hTRT-Vektoren können in eine Zelle, ein Gewebe, Organ, einen Patienten oder ein Tier durch eine Reihe von Verfahren eingeführt werden. Die erfindungsgemässen Nucleinsäureexpressionsvektoren (typischerweise dsDNA) können in die gewählte Wirtszelle durch allgemein bekannte Verfahren wie die Calciumchlorid-Transformation (für bakterielle Systeme), Elektroporation, Calciumphosphat-Behandlung, Liposomen-vermittelte Transformation, Injektion und Mikroinjektion, ballistische Verfahren, Virosomen, Immunoliposomen, Polykation:Nucleinsäure-Konjugate, nackte DNA, künstliche Virione, Fusion an das Herpesvirus-Strukturprotein VP22 (Elliot und O'Hare, Cell 88, 223) durch Agens-verstärkte Aufnahme von DNA und ex-vivo-Transduktion transferiert werden.

   Nützliche Liposomen-vermittelte DNA-Transferverfahren sind in den US-Patenten Nr. 5 049 386, 4 946 787 und 4 897 355, in den PCT-Veröffentlichungen WO 91/17 424 und WO 91/16 024 beschrieben sowie in Wang und Huang, Biochem. Biophys. Res. Commun. 147 (1987), 980; Wang und Huang, Biochemistry 28 (1989), 9508; Litzinger und Huang, Biochem. Biophys. Acta 1113 (1992), 201; Gao und Huang, Biochem. Biophys. Res. Commun. 179 (1991), 280. Immunliposomen als Träger für exogene Polynucleotide wurden ebenfalls beschrieben (Wang und Huang, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 7851 und Trubetskoy et al., Biochem. Biophys. Acta 1131 (1992), 311). Diese dürften im Vergleich zu Liposomen eine verbesserte Zelltyp-Spezifität aufgrund des Einschlusses von spezifischen Antikörpern, die vermutlich an Oberflächenantigene auf spezifischen Zelltypen binden, verbesserte Zelltypenspezifität aufweisen.

   Behr et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 6982, berichten über die Verwendung von Lipopolyamin als ein Reagenz zur Vermittlung der Transfektion selbst" wobei es nicht nötig ist, zur Bildung von Liposomen  irgendein zusätzliches Phospholipid zuzugeben. Geeignete Einführungsverfahren können vom Fachmann im Hinblick auf geeignete Praktiken und Erfordernisse bezüglich der Regulation (z.B. zur Gentherapie oder zur Herstellung von Zellinien zur Expression von rekombinanten Proteinen) ausgewählt werden. Natürlich können die oben aufgezählten Einführungsverfahren auch zum Transfer von Nucleinsäuren in Zellen für die Gentherapie, den Transfer in Gewebekulturzellen etc. verwendet werden. 



  Für die langfristige Herstellung von rekombinanten Proteinen mit hoher Ausbeute ist oft eine stabile Expression erwünscht. Beispielsweise können hTRT stabil exprimierende Zellinien unter Verwendung der erfindungsgemässen Expressionsvektoren hergestellt werden, die virale Replikationsursprünge oder endogene Expressionselemente und ein selektierbares Markergen enthalten. Nach der Einschleusung des Vektors kann man die Zellen 1 bis 2 Tage in angereicherten Medien wachsen lassen, bevor man zu Selektivmedien wechselt. Der selektierbare Marker dient dazu, zur Selektion eine Resistenz zu verleihen. Seine Gegenwart erlaubt das Wachstum von Zellen, die die eingeschleusten Sequenzen in Selektivmedien erfolgreich exprimieren. Resistente und stabil transfizierte Zellen können unter Verwendung von für den entsprechenden Zelltyp geeigneten Gewebekulturverfahren vermehrt werden.

   Ein Amplifikationsschritt kann eingefügt werden, beispielsweise durch Verabreichung von Methyltrexat an mit einem DHFR-Gen transfizierten Zellen gemäss auf dem Fachgebiet allgemein bekannter Verfahren. 



  Zusätzlich kann ein Wirtszellstamm gewählt werden hinsichtlich seiner Fähigkeit, die Expression der inserierten Sequenzen zu modulieren oder das exprimierte Protein auf die gewünschte Weise zu prozessieren. Zu solchen Modifikationen des Polypeptids zählen, allerdings ohne Beschränkung darauf, Acetylierung, Carboxylierung, Phosphorylierung, Lipidierung und Acylierung. Die post-translationale Prozessierung kann  auch für die korrekte Insertion, Faltung und/oder Funktion wichtig sein. Die verschiedenen Wirtszellen verfügen über eine zelluläre Maschinerie und charakteristische Mechanismen für solche post-translationale Aktivitäten, die für jede Zelle spezifisch sind. Somit kann eine bestimmte Zelle zur Gewährleistung der korrekten Modifikation und Prozessierung des eingeschleusten Fremdproteins gewählt werden. 



  Die vorliegende Erfindung stellt auch transgene Tiere (d.h. Säuger, die bezüglich einer menschlichen oder anderen TRT-Gensequenz transgen sind), bereit, die ein hTRT- oder ein anderes TRT-Polynucleotid oder Polypeptid exprimieren. In einer Ausführungsform wird hTRT in der Milch eines transgenen Säugers, wie beispielsweise eines transgenen Rinds, einer Ziege oder eines Kaninchens, sezerniert. Verfahren zur Herstellung solcher Tiere können beispielsweise in Heyneker et al., PCT WO 91/08 216 gefunden werden. 



  Die erfindungsgemässen hTRT-Proteine und Komplexe, zu denen die durch die vorstehend beschriebenen Expressionssysteme hergestellten zählen, könnnen unter Verwendung einer Reihe von allgemeinen, auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren in Übereinstimmung mit den durch die vorliegende Erfindung bereitgestellten spezifischen Verfahren (wie beispielsweise nachstehend beschrieben) gereinigt werden. Es ist für den Fachmann offensichtlich, dass nach chemischer Synthese, biologischer Expression oder Reinigung das hTRT-Protein eine Konformation besitzen kann, die sich von der nativen Konformation von natürlich vorkommender Telomerase unterscheidet.

   In einigen Fällen mag es hilfreich oder sogar nötig sein, das Polypeptid zu denaturieren (was beispielsweise die Reduktion von Disulfid- oder anderen Bindungen beinhalten kann) und danach das Polypeptid zu einer Rückfaltung in die bevorzugte Konformation zu bringen. Eine korrekte Rückfaltung kann auch die Gegenwart von hTR (oder hTR-Fragmenten) erforderlich machen. Verfahren zur Reduktion und Denaturierung von Proteinen und zur Induktion der Rückfaltung sind  dem Fachmann bekannt (siehe beispielsweise Debinski et al. J. Biol. Chem. 268 (1993), 14065; Kreitman und Pastan, Bioconjug. Chem. 4 (1993), 581; und Buchner et al. Anal Biochem. 205 (1992), 263 und McCaman et al., J. Biotech. 2 (1985), 177). (Siehe auch USSN 08/478 352, eingereicht am 7. Juni 1995, a.a.O.). 


 D.

   Komplexe aus menschlicher TRT und menschlicher Telomeplase-RNA, Telomerase-assoziierten 
 Proteinen und anderen Biomolekülen, die durch Coexpression und andere Mittel hergestellt werden 
 



  Erfindungsgemässe hTRT-Polypeptide können in vivo und in vitro mit anderen Biomolekülen assoziieren, wozu RNAs (z.B. hTR), Proteine (z.B. Telomerase-assoziierte Proteine), DNA (z.B. Telomer-DNA, [T2AG3]N) und Nucleotide wie (Desoxy)ribonucleotid-triphosphate gehören. Diese Assoziationen können dazu verwendet werden, um die Anwesenheit oder Funktion von hTRT nachzuweisen, um hTRT oder Telomerase-assoziierte Moleküle zu identifizieren oder zu reinigen und um die Struktur oder Funktion von hTRT oder Telomerase gemäss den erfindungsgemässen Verfahren zu analysieren. 



  In einer Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung hTRT bereit, das mit einer Nucleinsäure, üblicherweise einer RNA einen Komplex bildet (z.B. damit assoziiert oder daran gebunden ist). In einer Ausführungsform kann die gebundene RNA als eine Matrize für eine Telomerase-vermittelte DNA-Synthese fungieren. Zu den Beispielen für RNAs, die mit dem hTRT-Polypeptid einen Komplex bilden können, zählen eine natürlich vorkommende Wirtszell-Telomerase-RNA, eine menschliche Telomerase-RNA (z.B. hTR; US-Patent Nr. 5 583 016), eine hTR-Untersequenz oder -Domäne, eine synthetische RNA oder andere RNAs. Der RNA-hTRT-Proteinkomplex (ein RNP) weist typischerweise eine oder mehrere Telomerase-Aktivitäten auf, beispielsweise katalytische Aktivitäten von Telomerase.

   Diese hTRT-hTR-RNPs (oder andere hTRT-RNA-Komplexe) können  mittels einer Reihe von Verfahren, wie sie nachstehend zur Veranschaulichung beschrieben sind, hergestellt werden, dazu gehören in vitro-Rekonstitution und Coexpression von hTRT und hTR (und einer anderen RNA) in vitro (d.h. in einem zellfreien System) in vivo oder ex vivo. 



  Somit stellt die vorliegende Erfindung in einer Ausführungsform einen hTRT-hTR-Komplex (oder einen anderen hTRT-RNAKomplex) bereit, der in vitro durch Mischen getrennt gereinigter Bestandteile gebildet wurde ("in vitro-Rekonstitution"; siehe beispielsweise US-Patent Nr 5 583 016 bezüglich einer Beschreibung der Rekonstitution und USSN 08/478 352, eingereicht am 7. Juni 1995; siehe auch Autexier et al., EMBO J. 15; 5928). 

 

  In einer alternativen Ausführungsform stellt die Erfindung Telomerase-RNPs bereit, die duch Coexpression des hTRT-Polypeptids und einer RNA (z.B. hTR) in vitro in einem zellfreien Transkriptions/Translations-System (z.B. Weizenkeimlysat oder Kaninchen-Reticulocytenlysat) hergestellt wurden. Wie in Beispiel 7 gezeigt, führt die Coexpression eines rekombinanten hTRT-Polypeptids und von hTR in vitro zur Herstellung von katalytischer Aktivität von Telomerase (gemessen durch einen TRAP-Assay). 



  Die vorliegende Erfindung stellt darüber hinaus Telomerase-RNPs bereit, die durch Expression des hTRT-Polypeptids in einer Zelle, beispielsweise einer Säugerzelle, hergestellt werden, in der hTR natürlicherweise exprimiert wird, oder in die hTR (oder eine andere RNA, die mit dem hTRT-Protein einen Komplex bilden kann) eingeführt wird, oder durch Rekombination exprimiert wird. Somit wird in einer Ausführungsform hTRT in einer Telomerase-negativen menschlichen Zelle, in der hTR vorhanden ist (z.B. BJ- oder IMP90-Zellen) exprimiert, was die Assemblierung beider Moleküle zu einem RNP erlaubt. In einer weiteren Ausführungsform wird hTRT in einer menschlichen oder nicht-menschlichen Zelle, in der hTR  rekombinant exprimiert wird, exprimiert. Verfahren zur Expression von hTR in einer Zelle können in dem US-Patent 5,583,016 gefunden werden.

   Der Clon pGRN33, der eine die RNA-Komponente von Telomerase codierende cDNA enthält, wurde ferner hinterlegt (ATCC 75926). Die RNA-Komponente von menschlicher Telomerase codierenden genomischen Sequenzen wurden als 15 kb SauIIIA1 bis HindIII-Insertion des Clons 28-1 hinterlegt (ATCC 75925). Zur Expression in eukaryotischen Zellen wird die hTRT-Sequenz typischerweise mit einer Transkriptions-Initiationssequenz (RNA-Polymerase-Bindungsstelle) und Transkriptions-Terminationssequenzen funktionell verknüpft (siehe beispielsweise PCT-Veröffentlichung WO 96/01 835; Feng et al., Science 269 (1995), 1236). 



  Die vorliegende Erfindung stellt darüber hinaus rekombinant hergestellte oder im wesentlichen gereinigte hTRT-Polypeptide bereit, die mit sogenannten "Telomerase-assoziierten Proteinen" coexprimiert und/oder assoziiert sind. Somit stellt die vorliegende Erfindung hTRT bereit, das mit anderen Proteinen (z.B. Telomerase-assoziierten Proteinen) coexprimiert wird oder mit diesen einen Komplex bildet. Unter Telomerase-assoziierten Proteinen versteht man solche Proteine, die mit menschlicher Telomerase mit aufgereinigt werden und/oder eine Rolle bei der Modulation der Telomerasefunktion oder -Aktivität spielen können, beispielsweise dadurch, dass sie an der Assoziation von Telomerase mit Telomer-DNA beteiligt sind.

   Zu den Beispielen für Telomerase-assoziierte Proteine gehören (jedoch ohne Beschränkung darauf) die folgenden Proteine und/oder ihre menschlichen Homologe: Nucleolin (siehe die parallele US-Patentanmeldung mit der Serien-Nr. 08/833 377 und Srivastava et al., FEBS Letts. 250 (1989), 99); EF2H (das Homolog zum Elongationsfaktor 2; siehe die parallele US-Patentanmeldung Nr. 08/833 377 und Nomura et al., DNA Res. (Japan) 1 (1994), 27, GENBANK Zugangsnummer #D21163), TP1/TLP1 (Harrington et al., Science 275 (1997), 973); Nakayama et al., Cell 88 (1997), 875; das menschliche Homolog zu Tetrahymena p95 (Collins et al., Cell 81 (1995) 677); TPC2 (ein die Telomer länge regulierendes Protein; ATCC-Zugangsnummer 97708 (siehe USSN 08/710 249 und 08/713 922, beide am 13.

   September 1996 eingereicht)), TPC3 (ebenfalls ein die Telomerlänge regulierendes Protein; ATCC-Zugangsnummer 97707 (siehe USSN 08/710 249 und 08/713 922, beide eingereicht am 13. September 1996)), DNA-bindendes Protein B (dbpB; Horwitz et al., J. Biol. Chem. 269 (1994), 14130) und der die Telomer-Wiederholungseinheit bindende Faktor (TRF 1 & 2; Chang et al., Science 270 (1995), 1663; Chong et al., Hum. Mol. Genet. 6 (1997), 69; EST1, 3 und 4 (Lendvay et al., Genetics 144 (1996), 1399; Nugent et al., Science 274 (1996), 249 und Lundblad et al., Cell 57 (1989), 633) und der "End-capping"-Faktor (Cardenas et al., Genes Dev. 7 (1993), 883). 



  Telomerase-assoziierte Proteine können auf der Basis der Mitaufreinigung mit oder der Bindung an hTRT-Protein oder das hTRT-hTR-RNP identifziert werden. In einer alternativen Ausführungsform können sie auf der Basis der Bindung an ein hTRT-Fusionsprotein, beispielsweise ein GST-hTRT-Fusionsprotein etc. identifiziert werden, wie dies durch Affinitätsreinigung erfolgen kann (siehe Ausubel et al., Kapitel 20). Ein besonders nützliches Verfahren zur Bestimmung von Protein/Protein-Interaktionen und zur Identifizierung von hTR-T-assoziierten Proteinen ist das "two hybrid screen"-Verfahren von Chien et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991), 9578; siehe auch Ausubel et al., a.a.O., Kapitel 20).

   Durch dieses Screenen können Protein/Protein-Interaktionen in vivo durch Rekonstitution eines Transkriptionsaktivators, dem Hefe-Ga14-Transkriptionsprotein identifiziert werden (siehe Fields und Song, Nature 340 (1989), 245). Dieses Verfahren basiert auf den Eigenschaften des Hefe-Ga14-Proteins, das aus trennbaren Domänen besteht, die für die DNA-Bindung und transkriptionelle Aktivierung verantwortlich sind. "Two hybrid"-Proteine codierende Polynucleotide, üblicherweise Expressionsvektoren, werden konstruiert. Ein Polynucleotid umfasst die Hefe-Ga14-DNA-bindende Domäne, die an eine Polypeptidsequenz eines auf eine hTRT-Interaktion zu testenden  Proteins fusioniert ist (z.B. Nucleolin oder EF2H).

   In einer alternativen Ausführungsform ist die Hefe-Ga14-DNA-bindende Domäne an cDNAs aus einer menschlichen Zelle fusioniert, wodurch eine Bank von menschlichen Proteinen, die an die Ga14DNA-bindende Domäne fusioniert sind, zum Screenen nach Telomerase-assoziierten Proteinen hergestellt wird. Die anderen Polynucleotide umfassen die Ga14-Aktivierungsdomäne, die an eine hTRT-Polypeptidsequenz fusioniert ist. Die Konstrukte werden in eine Hefewirtszelle eingeführt. Nach Expression kann die intermolekulare Bindung zwischen hTRT und dem Testprotein die Ga14-DNA-bindende Domäne mit der Ga14-aktivierenden Domäne rekonstituieren. Dies führt zu der transkriptionellen Aktivierung eines Reportergens (z.B. lacZ, His3), das mit einer Ga14-Bindungsstelle funktionell verknüpft ist.

   Durch Auswählen oder Untersuchung können Reportergen-Zellkolonien identifiziert werden, die ein mit hTRT interagierendes Protein oder ein Telomerase-assoziiertes Protein enthalten. Für den Fachmann ist es offensichtlich, dass es zahlreiche Variationen des "2-hybrid-screen"-Systems gibt, beispielsweise das LexA-System (Bartel et al., in Cellular Interactions in Development: A Pratical Approach, Hartley (Herausg.), D.A. (Oxford Univ. Press (1993), S. 153-179)). 



  Ein weiteres nützliches Verfahren zum Identifizieren von Telomerase-assoziierten Proteinen ist ein "three-hybrid"-System (siehe beispielsweise Zhang et al., Anal. Biochem. 242 (1996), 68 und Licitra et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (1996), 12817). Die Telomerase-RNA-Komponente kann in diesem System mit der TRT oder dem hTRT-Protein und einem Testprotein verwendet werden. Ein weiteres nützliches Verfahren zur Identifizierung von interagierenden Proteinen (d.h. von Proteinen, die heterodimerisieren oder Heteromultimere höherer Ordnung bilden) ist insbesondere das E.coli/BCCP "interaktive Screening"-System (siehe Germino et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993), 933 und Guarente, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 90 (1993), 1639). 



  Die vorliegende Erfindung stellt auch Komplexe aus Telomerbindenden Proteinen bereit (bei denen es sich um Telomeraseassoziierte Proteine handeln kann oder nicht) und hTRT (die mit hTR, anderen RNAs oder einem oder mehreren Telomeraseassoziierten Proteinen komplexiert sein kann oder nicht). Zu den Beispielen von Telomer-bindenden Proteinen gehören TRF1 und TRF2 (a.a.O.) rnpA1, rnpA2, RAP1 (Buchman et al., Mol. Cell. Biol. 8 (1988), 210, Buchman et al., Mol. Cell. Biol. 8 (1988), 5086), SIR3 und SIR4 (Aparicio et al., Cell 66 (1991), 1279), TEL1 (Greenwell et al., Cell 82 (1995), 823; Morrow et al., Cell 82 (1995), 831); ATM (Savitsky et al., Science 268 (1995), 1749), "end-capping"-Faktor (Cardenas et al., Genes Dev. 7 (1993), 883) und die entsprechenden menschlichen Homologe.

   Die vorstehend erwähnten Komplexe können allgemein, so wie es vorstehend für Komplexe aus hTRT und hTR oder Telomerase-assoziierten Proteinen beschrieben wurde, hergestellt werden, beispielsweise durch Vermischen oder Coexpression in vitro oder in vivo. 


 V. Antikörper und andere bindende Agenzien 
 



  Ein verwandter Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft Antikörper, die mit hTRT spezifisch immunreaktiv sind. Dazu gehören polyclonale und monoclonale Antikörper, Antikörperfragmente, Antikörper mit einer einzelnen Kette, menschliche und chimäre Antikörper, einschliesslich Antikörper oder Antikörper-Fragmente, die an Phagenhüll- oder Zelloberflächenproteine fusioniert sind und weitere auf dem Fachgebiet bekannte und hier beschriebene. Die erfindungsgemässen Antikörper können Polypeptide spezifisch erkennen und binden, die eine Aminosäuresequenz aufweisen, die mit der Aminosäuresequenz von SEQ. ID. Nr. 2 im wesentlichen identisch ist, oder ein immunogenes Fragment davon, oder ein Epitop auf dem dadurch definierten Protein. Die erfindungsgemässen Antikörper können eine spezifische Bindungsaffinität für hTRT von mindestens etwa 10<7>, 10<8>, 10<9> oder 10<1><0> M<-><1> aufweisen.

   Sie können polyclonal oder  monoclonal sein, rekombinant oder auf andere Weise hergestellt. Die Erfindung stellt auch anti-hTRT-Antikörper bereit, die ein Konformationsepitop vonh TRT erkennen (beispielsweise ein Epitop auf der Oberfläche des hTRT-Proteins oder eines Telomerase-RNPs). Wahrscheinliche Konformationsepitope können, falls erwünscht, durch computergestützte Analyse der hTRT-Proteinsequenz identifiziert werden, durch Vergleich mit der Konformation von verwandten reversen Transkriptasen, wie beispielsweise der p66-Untereinheit von HIF-1 (siehe beispielsweise Fig. 3) oder empirisch. Anti-hTRT-Antikörper, die Konformationsepitope erkennen, sind unter anderem bei dem Nachweis und der Reinigung von menschlicher Telomerase und bei der Diagnose und der Behandlung von menschlichen Erkrankungen von Nutzen. 



  Für die Herstellung von anti-hTRT-Antikörpern können Wirte wie beispielsweise Ziegen, Schafe, Kühe, Meerschweinchen, Kaninchen, Ratten oder Mäuse durch Injektion mit einem hTRT-Protein oder einem beliebigen Anteil, einem Fragment oder Oligopeptid davon, der immunogene Eigenschaften beibehalten hat, immunisiert werden. Für die Auswahl von hTRT-Polypeptiden zur Antikörperinduktion ist es nicht nötig, dass diese biologische Aktivität beibehalten wird, das Proteinfragment oder Oligopeptid muss jedoch immunogen und vorzugsweise antigen sein.

   Die Immunogenität kann durch Injektion eines Polypeptids und eines Adjuvans in ein Tier (z.B. ein Kaninchen) und durch Untersuchung des Auftretens von Antikörpern, die gegen das injizierte Polypeptid gerichtet sind, nachgewiesen werden (siehe beispielsweise Harlow und Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1988), beispielsweise Kapitel 5, und dieses Dokument ist durch Bezugnahme in seiner Gesamtheit und für alle Zwecke Bestandteil dieser Beschreibung). Zur Induktion spezifischer Antikörper verwendete Peptide weisen typischerweise eine Aminosäuresequenz auf, die aus mindestens fünf Aminosäuren  besteht, vorzugsweise mindestens 8 Aminosäuren und mehr bevorzugt mindestens 10 Aminosäuren. Üblicherweise nehmen sie die gesamte Aminosäuresequenz des Proteins mit SEQ. ID.

   Nr. 2 oder einen Teil davon auf, oder besitzen eine dazu im wesentlichen identische Sequenz. Kurze Strecken der Aminosäure des hTRT-Proteins können mit denen anderer Proteine fusioniert werden, wie beispielsweise das "Keyhole limpet"-Hemocyanin und einen anti-hTRT-Antikörper, der gegen das chimäre Molekül hergestellt wurde. In Abhängigkeit von der verwendeten Wirtsart können verschiedene Adjuvantien zur Steigerung der Immunantwort verwendet werden. 



  Das Antigen wird dem Immunsystem auf eine Weise präsentiert, die durch für das Tier geeignete Verfahren ermittelt wurde. Diese sowie andere Parameter sind dem Immunologen im allgemeinen gut bekannt. Typischerweise werden die Injektionen in die Fussballen, intramuskulär, intradermal, in die Perilymphknoten oder intraperitoneal verabreicht. Die durch den Wirt hergestellten Immunglobuline können präzipitiert, isoliert und gemäss Routineverfahren, zu denen Affinitätsreinigung zählt, gereinigt werden. 



  Veranschaulichende Beispiele von immunogenen hTRT-Peptiden werden in Beispiel 8 bereitgestellt.- Zusätzlich beschreibt Beispiel 8 die Herstellung und die Verwendung von polyclonalen anti-hTRT-Antikörpern. 


 A) Monoclonale Antikörper 
 



  Monoclonale Antikörper gegen hTRT-Proteine und Peptide können in Übereinstimmung mit den erfindungsgemässen Verfahren unter Verwendung jedes Verfahrens, das für die Herstellung von Antikörpermolekülen durch kontinuierliche Zellinien in Kultur geeignet ist, hergestellt werden. Zu diesen Verfahren zählen, jedoch ohne Beschränkung darauf, das ursprünglich beschriebene Hybridom-Verfahren von Koehler und Milstein (Nature 256 (1975), 495), das Hybridom-Verfahren mit  menschlichen B-Zellen (Kosbor et al., Immunol. Today 4 (1983), 72 und Cote et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983), 2026), und das EBV-Hybridom-Verfahren (Cole et al. Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss Inc. New York NY, S. 77-96 (1985)). 



  In einer Ausführungsform werden geeignete Tiere ausgewählt und das geeignete anzuwendende Immunisierungsprotokoll. Die Herstellung von nicht-menschlichen monoclonalen Antikörpern, beispielsweise von der Maus, von Lagomorpha und vom Pferd ist allgemein bekannt und kann beispielsweise durch Immunisierung eines Tiers mit einer hTRT oder Fragmente davon enthaltenden Präparation erfolgen. In einem Verfahren wird nach einem geeigneten Zeitraum die Milz der Tiere herausgeschnitten und einzelne Milzzellen werden typischerweise mit immortalisierten Myelomzellen unter geeigneten Selektionsbedingungen fusioniert. Danach werden die Zellen clonal getrennt und die Überstände von jedem Clon (z.B. Hybridom) bezüglich der Herstellung eines geeigneten Antikörpers, der für den gewünschten Bereich des Antigens spezifisch ist, getestet.

   Verfahren zur Herstellung von Antikörpern sind auf dem Fachgebiet allgemein bekannt. Siehe beispielsweise Goding et al., Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2. Ausgabe), Acad. Press, N.Y., und Harlow und Lane, a.a.O., wobei beide Veröffentlichungen durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit und für alle Zwecke als Bestandteil dieser Beschreibung anzusehen sind. Zu anderen geeigneten Verfahren zählen die in vitro-Exposition von Lymphocyten gegenüber den antigenen Polypetiden oder, alternativ, eine Auswahl von Antikörperbanken in Phagenvektoren oder ähnlichen Vektoren (siehe die nachstehende Beschreibung). 


 B) Menschliche Antikörper 
 



  Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Bereitstellung von menschlichen Antikörpern gegen ein hTRT- Polypeptid. Menschliche monoclonale Antikörper gegen ein bekanntes Antigen können auch unter Verwendung von transgenen Tieren hergestellt werden, die Elemente eines menschlichen Immunsystems besitzen (siehe beispielsweise USPatent Nr. 5 569 825 und 5 545 806, wobei beide Dokumente durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit und für alle Zwecke als Bestandteil dieser Beschreibung anzusehen sind) oder unter Verwendung von menschlichen peripheren Blutzellen (Casali et al., Science 234 (1986), 476). Einige menschliche Antikörper werden durch kompetitive Bindungsexperimente ausgewählt oder so, dass sie dieselbe Epitop-Spezifität aufweisen wie ein spezieller Mausantikörper. 



  In einer weiteren Ausführungsform können menschliche Antikörper gegen ein hTRT-Polypeptid durch Screenen einer DNA-Bank aus menschlichen B-Zellen gemäss dem von Huse et al., Science 246 (1989), 1275 beschriebenen allgemeinen Protokoll hergestellt werden. Dieses Dokument ist aufgrund der Bezugnahme ebenfalls als Teil der vorliegenden Beschreibung anzusehen. An das hTRT-Polypeptid bindende Antikörper werden ausgewählt. Diese Antikörper (oder ein bindendes Fragment) codierenden Sequenzen werden dann cloniert und amplifiziert. Das von Huse beschriebene Protokoll wird oft mit der "phage-display"-Technologie verwendet. 


 C. Humanisierte oder chimäre Antikörper 
 



  Die Erfindung stellt auch anti-hTRT-Antikörper bereit, die als chimäre, menschlichen Antikörper ähnelnden oder humanisierte Antikörper hergestellt wurden, um so ihre potentielle Antigenität jedoch nicht ihre Affinität gegenüber dem Ziel herabzusetzen. Die Herstellung von chimären und humanisierten Antikörpern bzw. von den menschlichen Antikörpern ähnelnden Antikörpern wurde auf dem Fachgebiet beschrieben (siehe beispielsweise US-Patent Nr. 5 585 089 und 5 530 101; Queen et al., Proc. Natl. Acad.  Sci. USA 86 (1989), 10029 und Verhoeyan et al., Science 239 (1988), 1534, wobei diese Dokumente aufgrund der Bezugnahme in ihrer Gesamtheit und für alle Zwecke als Gegenstand dieser Beschreibung anzusehen sind).

   Humanisierte Immunglobuline weisen variable Grundgerüstbereiche auf, die im wesentlichen von einem humanen Immunglobulin stammen (mit der Bezeichnung Akzeptor-Immunglobulin) und die Komplementarität der determinierenden Bereiche, die im wesentlichen von einem nicht-menschlichen Immunglobulin (z.B. von der Maus) stammen (mit der Bezeichnung Donor-Immunglobulin). Die (Der) konstante(n) Bereich(e) stammt/stammen, falls vorhanden, auch im wesentlichen von einem menschlichen Immunglobulin. 



  Bei einigen Anwendungen, beispielsweise bei der Verabreichung an menschliche Patienten, bieten die erfindungsgemässen humanisierten (sowie die menschlichen) anti-hTRT-Antikörper eine Reihe von Vorteilen gegenüber Antikörpern von Mäusen oder anderen Spezies: (1) das menschliche Immunsystem sollte das Grundgerüst oder den konstanten Bereich des humanisierten Antikörpers nicht als fremd erkennen und daher sollte die Antikörper-Antwort gegen einen solchen injizierten Antikörper geringer ausfallen als gegen einen vollständig fremden Maus-Antikörper oder einen partiell fremden chimären Antikörper;

   (2) da der Effektorbereich des humanisierten Antikörpers menschlich ist, dürfte er mit anderen Teilen des menschlichen Immunsystems besser interagieren, und (3) injizierte humanisierte Antikörper weisen eine Halbwertszeit auf, die im wesentlichen zu der von natürlich vorkommenden menschlichen Antikörpern äquivalent ist, was es erlaubt, kleinere und weniger häufige Dosen im Vergleich zu Antikörpern anderer Spezies zu verabreichen. 


 D) "Phage Display" 
 



  Die vorliegende Erfindung stellt auch anti-hTRT-Antikörper (oder bindende Zusammensetzung) bereit, die durch "phage display"-Verfahren hergestellt wurden (siehe beispielsweise Dower et al.1 WO 91/17 271 und McCafferty et al., WO 92/01 047 sowie Vaughan et al., Nature Biotechnology 14 (1996), 309, wobei diese Dokumente aufgrund der Bezugnahme in ihrer Gesamtheit und für alle Zwecke als Bestandteil dieser Beschreibung anzusehen sind). Bei diesen Verfahren werden Phagenbanken hergestellt, in denen Mitglieder auf ihren äusseren Oberflächen unterschiedliche Antikörper präsentieren. Antikörper werden gewöhnlich als Fv- oder Fab-Fragmente präsentiert. Phagen, die Antikörper mit einer gewünschten Spezifität präsentieren, werden durch Affinitätsanreicherung mit einem hTRT-Polypeptid ausgewählt. 



  Bei einer Variation des "phage-display"-Verfahrens können humanisierte Antikörper mit der Bindungsspezifität eines ausgewählten Maus-Antikörpers hergestellt werden. Bei diesem Verfahren wird der variable Bereich entweder der schweren oder der leichten Kette des ausgewählten Maus-Antikörpers als Ausgangsmaterial verwendet. Wenn beispielsweise der variable Bereich einer leichten Kette als Ausgangsmaterial ausgewählt wird, wird eine Phagenbank hergestellt, in der Mitglieder den variablen Bereich derselben leichten Kette (d.h. des Ausgangsmaterials von der Maus) und einen variablen Bereich einer unterschiedlichen schweren Kette präsentieren. Die variablen Bereiche der schweren Kette werden von einer Bank mit menschlichen rearrangierten variablen Bereichen der schweren Kette erhalten.

   Ein Phage, der eine starke spezifische Bindung an das hTRT-Polypeptid zeigt (z.B. mindestens 10<8> und vorzugsweise mindestens 10<9> M<-><1>) wird ausgewählt. Der variable Bereich der menschlichen schweren Kette von diesem Phagen dient dann als Ausgangsmaterial für die Herstellung einer weiteren Phagenbank. In dieser Bank präsentiert jeder Phage denselben  variablen Bereich der schweren Kette, d.h. den von der ersten Präsentationsbank identifizierte Bereich, und einen unterschiedlichen Bereich der leichten Kette. Die variablen Bereiche der leichten Kette werden von einer Bank aus menschlichen rearrangierten variablen Regionen der leichten Kette erhalten. Wieder wird ein Phage, der eine starke spezifische Bindung zeigt, ausgewählt. Diese Phagen präsentieren die variablen Bereiche von vollständig menschlichen anti-hTRT-Antikörpern.

   Diese Antikörper weisen üblicherweise die gleiche oder eine ähnliche Epitopspezifität auf, wie das von der Maus stammende Ausgangsmaterial. 


 E) Hybrid-Antikörper 
 



  Die Erfindung stellt auch Hybrid-Antikörper bereit, die die Spezifität mit Antikörpern gegen ein hTRT-Polypeptid gemeinsam haben, jedoch auch eine zweite Einheit spezifisch binden können. In diesen Hybrid-Antikörpern stammt normalerweise ein Paar aus einer schweren und leichten Kette von einem anti-hTRT-Antikörper und das andere Paar von einem Antikörper, der gegen ein anderes Epitop oder Protein gerichtet ist. Dies führt zu der Eigenschaft einer multifunktionellen Valenz, d.h. der Fähigkeit, mindestens zwei verschiedene Epitope gleichzeitig binden zu können, wobei mindestens ein Epitop das Epitop ist, an das der anti-Komplex-Antikörper bindet. Solche Hybride können durch Fusion der entsprechenden Bestandteilsantikörpern herstellenden Hybridome gebildet werden oder durch Kombinationsverfahren. 



  Erfindungsgemässe Immunglobuline können auch mit funktionellen Bereichen von anderen Genen (z.B. Enzymen) zur Herstellung von Fusionsproteinen (z.B. Immuntoxinen) mit nützlichen Eigenschaften fusioniert werden. 


 F) Anti-idiotypische Antikörper 
 



  Auch anti-idiotypische Antikörper, die mittels der vorstehend beschriebenen Verfahren isoliert werden können, sind von Nutzen. Anti-idiotypische Antikörper können beispielsweise durch Immunisierung eines Tiers mit dem primären Antikörper (d.h. anti-hTRT-Antikörpern oder hTRT-bindenden Fragmenten davon) präpariert werden. Für anti-hTRT-Antikörper werden anti-idiotypische Antikörper ausgewählt, deren Bindung an den primären Antikörper durch ein hTRT-Polypeptid oder Fragmente davon gehemmt wird. Da sowohl der anti-idiotypische Antikörper als auch das hTRT-Polypeptid oder Fragmente davon, das primäre Immunglobulin binden, kann das anti-idiotypische Immunglobulin das "interne Bild" eines Epitops repräsentieren und somit in Assays das hTRT-Polypeptid ersetzen, oder es kann dazu verwendet werden, anti-hTRT-Antikörper, beispielsweise in einem Patienten, zu binden (d.h. zu inaktivieren).

   Anti-idiotypische Antikörper können auch mit Telomeraseassoziierten Proteinen interagieren. Die Verabreichung solcher Antikörper könnte eine Telomerase-Funktion durch Austitrieren hTRT-assoziierter Proteine beeinflussen. 


 G) Allgemeines 
 



  Die erfindungsgemässen Antikörper können zu einem beliebigen Isotyp gehören, beispielsweise IgM, IgD, IgG, IgA und IgE, wobei IgG, IgA und IgM oft bevorzugt sind. Humanisierte Antikörper können auch Sequenzen von mehr als einer Klasse oder eines Isotyps umfassen. 



  In einer weiteren erfindungsgemässen Ausführungsform werden Fragmente der intakten vorstehend beschriebenen Antikörper bereitgestellt. Typischerweise können diese Fragmente mit dem intakten Antikörper, von dem sie abstammen, um die spezifische Bindung an das hTRT-Polypeptid konkurrieren und sie binden mit einer Affinität von 10<7>, 10<8>, 10<9> M<-><1>, oder  10<1><0> M<-><1>. Zu den Antikörperfragmenten zählen getrennte schwere Ketten, leichte Ketten, Fab, Fab min F(ab min )2, Fabc und Fv. Fragmente können durch enzymatische oder chemische Trennung von intakten Immunglobulinen hergestellt werden. Beispielsweise kann ein F(ab min )2-Fragment aus einem IgG-Molekül durch proteolytische Spaltung mit Pepsin bei einem pH-Wert von 3,0-3,5 mit Standardverfahren, wie sie beispielsweise in Harlow und Lane, a.a.O., beschrieben sind, erhalten werden.

   Fab-Fragmente können aus F(ab min )2-Fragmenten durch limitierte Reduktion aus einem ganzen Antikörper durch Spaltung mit Papain in Gegenwart von Reduktionsmitteln erhalten werden (siehe allgemein Paul, W. (Herausg.) Fundamental Immunology 2nd Raven Press, N.Y., 1989, Kapitel 7, wobei dieses Dokument durch Bezugnahme in seiner Gesamtheit und für alle Zwecke als Bestandteil dieser Beschreibung angesehen werden kann). Fragmente können auch durch DNA-Rekombinationsverfahren hergestellt werden. Nucleinsäuresegmente, die ausgewählte Fragmente codieren, werden durch Spaltung codierender Sequenzen vollständiger Länge mit Restriktionsenzymen hergestellt oder durch de novo-Synthese. Oft werden Fragmente in Form eines Phagen-Fusionshüllproteins exprimiert. 



  Viele der vorstehend beschriebenen Immunglobuline können unkritische Aminosäuresubstitutionen, Additionen oder Deletionen sowohl in den variablen als auch in den konstanten Bereichen ohne Verlust von Bindungsspezifität oder Effektorfunktionen oder nicht tolerierbare Herabsetzung der Bindungsaktivität (d.h. unter etwa 10<7> M<-><1>) durchlaufen. Üblicherweise zeigen Immunglobuline mit solchen Änderungen eine im wesentlichen identische Sequenz, verglichen mit einem Referenzimmunglobulin von dem sie abstammen. Ein mutiertes Immunglobulin kann ausgewählt werden, das die gleiche Spezifität und eine erhöhte Affinität aufweist im Vergleich zu einem Referenzimmunglobulin, von dem es abstammt. Die "phage-display"-Technologie bietet nützliche Verfahren zur Selektion solcher Immunglobuline.

   Siehe  beispielsweise Dower et al., WO 91/17 271, McCafferty et al., WO 92/01 047 und Huse, WO 92/06 204. 



  Die erfindungsgemässen Antikörper können mit oder ohne Modifikation verwendet werden. Häufig werden die Antikörper durch entweder kovalente oder nicht-kovalente Anfügung einer nachweisbaren Markierung markiert. Als markierte Bindungseinheiten sind die erfindungsgemässen Antikörper bei diagnostischen Anwendungen von besonderem Nutzen. 



  Die erfindungsgemässen anti-hTRT-Antikörper können unter Verwendung allgemein bekannter Verfahren gereinigt werden. Die vollständigen Antikörper, ihre Dimere, individuellen leichten und schweren Ketten oder andere erfindungsgemässen Immunglobulinformen können unter Verwendung der erfindungsgemässen Verfahren und Reagenzien in Übereinstimmung mit auf dem Fachgebiet üblichen Standardverfahren, zu denen Ammoniumsulfatpräzipitation, Affinitätssäulen, Säulenchromatographie, Gelelektrophorese etc. gehören, gereinigt werden (siehe allgemein Scopes, Protein Purification: Principiesand Practice, 3. Ausgabe (Springer-Verlag, N.Y.; 1993). Bevorzugt sind im wesentlichen reine Immunglobuline mit mindestens etwa 90 bis 95% oder sogar 98 bis 99% oder darüber liegender Homogenität. 


 VI. Reinigung von menschlicher Telomerase 
 



  Die vorliegende Erfindung stellt isolierte menschliche Telomerase mit bisher nicht erreichter Reinheit bereit. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung bereit: gereinigte hTRT rekombinanten oder nicht-rekombinanten Ursprungs; gereinigte hTRT-hTR-Komplexe (d.h. RNPs), rekombinanten, nicht-rekombinanten oder gemischten Ursprungs, die gegebenenfalls ein oder mehrere Telomeraseassoziierte Proteine umfassen; gereinigte natürlich vorkommende menschliche Telomerase; etc. Darüber hinaus  stellt die Erfindung Verfahren und Reagenzien bereit, um die vorstehend beschriebenen Moleküle und Komplexe einschliesslich von Varianten, Fusionsproteinen, natürlich vorkommenden Proteinen etc. (die kollektiv als "hTRT und/oder hTRT-Komplexe" bezeichnet werden) in partiell gereinigter, im wesentlich gereinigter oder hochgereinigter Form gewinnen zu können.

   Bevor diese Erfindung gemacht wurde, wurden Versuche unternommen, den Telomerase-Enzym-Komplex bis zur Homogenität zu reinigen, jedoch mit begrenztem Erfolg (siehe beispielsweise die parallele US-Patentanmeldung mit der Serien-Nr. 08/833 377, eingereicht am 4. April 1997 und 08/510 736, eingereicht am 4. August 1995 sowie die PCT-Anmeldung Nr. 97/06 012, eingereicht am 4. April 1997. Diese Dokumente sind aufgrund der Bezugnahme als Bestandteil dieser Beschreibung hinsichtlich nützlicher Reinigungsverfahren anzusehen). Die in den vorstehend aufgeführten Anmeldungen bereitgestellten Verfahren erlauben es, Telomerase bis etwa           60 000fach oder höher im Vergleich zu Zellrohextrakten zu reinigen. 

   Die vorliegende Erfindung stellt hTRT und hTRT-Komplexe mit sogar noch höherer Reinheit bereit, teilweise dank der neuen erfindungsgemässen Immunoaffinitätsreagenzien, (z.B. anti-hTRT-Antikörper) und/oder der hier für die rekombinante Expression von hTRT zur Verfügung gestellten Reagenzien, Zellen und Verfahren. Die rekombinante Expression von hTRT und hTRT-Komplexen erleichtert die Reinigung, da die gewünschten Moleküle in wesentlich höherer Konzentration im Vergleich zu den meisten in der Natur vorkommenden exprimierenden Zellen hergestellt werden und/oder weil die rekombinanten hTRT-Moleküle so modifiziert werden können (z.B. durch Fusion mit einem Epitop-"tag"), dass sie leicht gereinigt werden können. 



  Es ist offensichtlich, dass natürlich vorkommende Telomerase aus einer Telomerase-positiven Zelle gereinigt werden kann. Rekombinante hTRT und hTRT-Komplexe können u.a. unter Verwendung beliebiger in vitro, in vivo, ex vivo, pflanzlichen oder tierischen Expressionssystemen, die  vorstehend beschrieben wurden, oder andere auf dem Fachgebiet bekannte Systeme exprimiert und gereinigt werden. 



  In einer Ausführungsform werden die hTRT, Telomerase und andere erfindungsgemässen Zusammensetzungen mittels eines Immunoaffinitätsschritts gereinigt, wobei entweder nur dieser Schritt oder eine Kombination mit weiteren  Reinigungsschritten durchgeführt wird. Typischerweise wird ein immobilisierter oder immobilisierbarer anti-hTRT-Antikörper, sowie er von der vorliegenden Erfindung bereitgestellt wird, mit einer Probe, beispielsweise einem Zellysat, das die gewünschte hTRT oder den hTRT-enthaltenden Komplex enthält, unter Bedingungen in Kontakt gebracht, bei denen ein anti-hTRT-Antikörper das hTRT-Antigen bindet. Nach Entfernung von nichtgebundenen Bestandteilen der Probe durch auf dem Fachgebiet allgemein bekannte Verfahren kann die hTRT-Zusammensetzung, falls erwünscht, von dem Antikörper in im wesentlichen reiner Form eluiert werden.

   In einer Ausführungsform werden auf dem Fachgebiet gut bekannte Immunoaffinitätschromatographieverfahren verwendet (siehe beispielsweise Harlow und Lane, a.a.O., Ausubel, a.a.O., und Hermansanetal., 1992, Immobilized Affinity Ligand Techniques(AcademicPress,SanDiego"in Übereinstimmung mit den erfindungsgemässen Verfahren. In einer weiteren veranschaulichenden Ausführungsform wird eine Immunpräzipitation von anti-hTRT-Immunglobulin-hTRT-Komplexen unter Verwendung von immobilisiertem Protein A durchgeführt. Dem Fachmann sind zahlreiche Variationen und alternative Immunoaffinitätsreinigungsprotokolle, die zur Verwendung in Übereinstimmung mit den erfindungsgemässen Verfahren und Reagenzien geeignet sind, gut bekannt. 



  In einer weiteren Ausführungsform können rekombinante hTRT-Proteine als Folge ihrer Expression mit hohem Niveau mittels Routine-Proteinreinigungsverfahren gereinigt werden, beispielsweise durch Ammoniumsulfatpräzipitation, Affinitätssäulen (z.B. Immunoaffinität), Ausschluss nach  Grösse ("size-exclusion"), Anionen- und Kationen Austauschchromatographie, Gelelektrophorese etc. (siehe allgemein R. Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y. (1982) und Deutscher, Methods in Enzymology 182: Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc. N.Y. (1990)) anstelle von Immunoaffinitätsverfahren oder zusätzlich dazu. Kationenaustauschverfahren können aufgrund des basischen pI-Werts des hTRT-Proteins besonders nützlich sein. Beispielsweise kann immobilisiertes Phosphat als eine funktionelle Kationenaustauschgruppe (z.B.

   P-11 Phosphocellulose, Whatman-Katalog #4071 oder Cellulosephosphat, Sigma-Katalog #C 3145) verwendet werden. Immobilisiertes Phosphat hat bezüglich der hTRT-Reinigung zwei vorteilhafte Merkmale - es ist ein Kationenaustauschharz und es zeigt physikalisch eine Ähnlichkeit mit dem Phosphatrückgrat von Nucleinsäuren. Daher kann auch die "Pseudo"-Affinitätschromatophie verwendet werden, da hTRT hTR und Telomer-DNA bindet. Andere nicht-spezifische Nucleinsäure-Affinitätschromatographieverfahren sind zur Reinigung ebenfalls von Nutzen (siehe beispielsweise die parellele US-Patentanmeldung mit der Serien-Nr. 08/833 377; Albers et al., Methods Enzymol. 21 (1971), 198; Arnt-Jovin et al., Eur. J. Biochem. 54(1975), 411 und den Pharmacia-Katalog #27-5575-02). Die weitere Nutzung dieser wahrscheinlichen Bindungsfunktion von hTRT würde die Verwendung von spezifischen Nucleinsäuren (z.B.

   Primer oder hTR) bei AffinitätschrSteigerung der Expression oder Aktivität von Aktivatoren der hTRT-Transkription sowie weitere Massnahmen, die für den Fachmann nach Lesen dieser Beschreibung offensichtlich sind. 


 E) Mittel für die Intervention 
 


 1) TRT-Proteine und Peptide 
 



  In einer Ausführungsform stellt die Erfindung Telomerasemodulierende Polypeptide (d.h. Proteine, Polypeptide und Peptide) bereit, die Telomerase-Aktivität steigern oder herabsetzen. Diese können in eine Zielzelle direkt (z.B. durch Injektion, Liposomen-vermittelte Fusion, Applikation eines Hydrogels auf die Tumoroberfläche (z.B. bei einem Melanom, Fusion oder Anheftung des Strukturproteins VP22 des Herpes-Virus und weitere hier beschriebene und auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren) eingeführt werden. In einer zweiten Ausführungsform werden erfindungsgemässe Telomerasemodulierenden Proteine und Peptide in einer Zelle durch Einführung einer Nucleinsäure (z.B. eines DNA-Expressionsvektors oder mRNA), die das gewünschte Protein oder Peptid in der Zelle codiert, in einer Zelle exprimiert.

   Die Expression kann entweder konstitutiv oder induzierbar sein, was von dem Vektor und der Wahl des Promotors (siehe die nachstehende Diskussion) abhängt. Präparationen von Messenger-RNA, die hTRT codieren, sind besonders dann von Nutzen, wenn lediglich eine transiente Expression (z.B. die transiente Aktivierung von Telomerase) erwünscht ist. Verfahren zur Einführung und Expression von Nucleinsäuren in eine Zelle sind auf dem Fachgebiet allgemein bekannt (siehe darüber hinaus andere Stellen in dieser Beschreibung,  beispielsweise die Abschnitte über Oligonucleotide und Gentherapieverfahren). 



  Ein Aspekt dieser Erfindung betrifft ein Telomerasemodulierendes Polypeptid, das Telomerase-Aktivität in einer Zelle erhöht. In einer Ausführungsform ist das Polypeptid ein katalytisch aktives hTRT-Polypeptid, das die Synthese von menschlicher Telomer-DNA (in Verbindung mit einer RNA-Matrize, wie beispielsweise hTR) steuern kann. Diese Aktivität kann wie vorstehend diskutiert gemessen werden, beispielsweise unter Verwendung eines Telomerase-Aktivitätsassays, wie beispielsweise einem TRAP-Assay. In einer Ausführungsform ist das Polypeptid ein hTRT-Protein mit vollständiger Länge und einer Sequenz, die der Sequenz von 1132 Resten von SEQ. ID. Nr. 2 entspricht oder im wesentlichen identisch dazu ist. In einer weiteren Ausführungsform ist das Polypeptid eine Variante des hTRT-Proteins von SEQ. ID.

   Nr. 2, beispielsweise ein Fusionspolypeptid, derivatisiertes Polypeptid, verkürztes Polypeptid, Polypeptid mit konservativen Substitutionen etc. Ein Fusions- oder derivatisiertes Protein kann eine "targeting"-Einheit enthalten, die die Fähigkeit des Polypeptids die Zellmembran zu durchdringen steigert, oder bewirkt, dass das Polypeptid einem spezifischen Zelltyp (z.B. Leberzellen oder Tumorzellen) oder Zellkompartimenten (z.B. dem nucleären Kompartiment) bevorzugt zugeführt wird. Zu den Beispielen für solche "Zielsetzungs"-Einheiten gehören Lipidschwänze, Aminosäuresequenzen, wie beispielsweise das "antennapediall-Peptid (siehe USSN 08/838,545, eingereicht am 9. April 1997) oder ein nucleäres Lokalisationssignal (NLS; z.B. Xenopus-Nucloplasmin; Robbins et al., Cell 64 (1991), 615). Natürlich vorkommendes hTRT-Protein (z.B. mit einer Sequenz, die SEQ. ID.

   Nr. 2 entspricht oder dazu im wesentlichen identisch ist) wirkt im Zellnucleus. Daher ist es wahrscheinlich, dass eine oder mehrere Untersequenzen von SEQ. ID. Nr. 2, beispielsweise die Reste 193 bis 196 (PRRR) und die Reste 235-240 (PKRPRR) als nucleäres  Lokalisationssignal wirken. Die kleinen Bereiche sind wahrscheinlich NLSs. Dies beruht auf der Beobachtung, dass viele NLSs ein Muster mit vier Resten umfassen, das aus basischen Aminosäuren (K oder R) oder drei basischen Aminosäuren (K oder R) und H oder P zusammengesetzt ist; einem Muster, das mit P beginnt, woran sich innerhalb dreier Reste ein basisches Segment anschliesst, das 3 K- oder R-Reste von vier Resten enthält (siehe beispielsweise Nakai et al., Genomics 14 (1992) 897).

   Es wird davon ausgegangen, dass die Deletion einer dieser sequenzen oder beider und/oder zusätzlicher Lokalisationssequenzen den hTRT-Transport in den Nucleus stört und/oder den hTRT-Umsatz steigert und somit zur Verhinderung des Zugangs von Telomerase zu seinen nucleären Substraten der Herabsetzung des proliferativen Potentials von Nutzen ist. Darüber hinaus könnte eine hTRT-Variante, der das NLS fehlt, sich zu einem RNP assemblieren, das nicht mehr die Telomer-Länge aufrechterhalten kann, da das daraus hervorgehende Enzym nicht in den Nucleus hineingelangen kann. 



  Die erfindungsgemässen hTRT-Polypeptide sind typischerweise in der Zielzelle mit einer Telomerase-RNA, wie beispielsweise hTR, assoziiert, wenn sie zur Steigerung von Telomerase-Aktivität in einer Zelle verwendet werden. In einer Ausführungsform assoziiert ein eingeführtes hTRT-Polypeptid mit einer endogenen hTR zur Bildung eines katalytisch aktiven RNP (z.B. eines RNPs, das die hTR und ein Polypeptid mit vollständiger Länge und einer Sequenz von SEQ. ID. Nr. 2 umfasst). Das so gebildete RNP kann auch mit weiteren, beispielsweise Telomerase-assoziierten, Proteinen assoziieren. In weiteren Ausführungsformen wird das Telomerase-RNP (das hTRT-Protein, hTR und gegebenenfalls weitere Bestandteile enthält) als Komplex in die Zielzelle eingeführt. 



  In einer ähnlichen Ausführungsform wird ein hTRT- Expressionsvektor in eine Zelle (oder die Nachkommenschaft  einer Zelle) eingeführt, in die ein Telomerase-RNA (z.B. hTR)-Expressionsvektor gleichzeitig, danach oder vorher eingeführt wird. In dieser Ausführungsform werden hTRT-Protein und Telomerase-RNA in der Zelle coexprimiert und sie assemblieren zur Bildung eines Telomerase-RNPs. Eine bevorzugte Telomerase-RNA ist hTR zusammen. Ein für die Expression von hTR in einer Zelle nützlicher Expressionsvektor wurde vorstehend beschrieben (siehe US-Patent 5 583 016). In einer weiteren Ausführungsform sind das hTRT-Polypeptid und die hTR-RNA (oder ein Äquivalent) zur Bildung eines Komplexes, der dann in die Zielzellen eingeführt wird, in vitro assoziiert.

   Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Bereitstellung von hTRT-Polypeptiden, die zur Herabsetzung der Telomerase-Aktivität in einer Zelle nützlich sind. 



  Wie vorstehend beschrieben, können diese "hemmenden" Polypeptide entweder direkt in die Zelle eingeführt werden oder durch Expression von rekombinanten Nucleinsäuren in der Zelle erzeugt werden. Peptid-"Imitatoren" oder Polypeptide, die Nicht-Standard-Aminosäuren umfassen (d.h. Aminosäuren, die nicht den durch den genetischen Code codierten 20 Aminosäuren oder deren normalen Derivaten entsprechen) werden normalerweise direkt eingeführt. 



  In einer Ausführungsform führt die Hemmung der Telomerase-Aktivität zu der Sequestrierung eines Bestandteils, der für die genaue Telomerverlängerung erforderlich ist. Beispiele für solche Bestandteile sind hTRT und hTR. Somit kann die Verabreichung eines Polypeptids, das hTR bindet, jedoch keine katalytische Aktivität von Telomerase aufweist, die endogene Telomerase-Aktivität in der Zelle herabsetzen. In einer verwandten Ausführungsform kann das hTRT-Polypeptid einen Zellbestandteil binden, bei dem es sich nicht um hTR handelt, beispielsweise ein Telomerase-assoziiertes Protein (oder mehrere), wodurch die Telomerase-Aktivität in der Zelle gestört wird. 



  In einer anderen Ausführungsform stören die erfindungsgemässen hTRT-Polypeptide die Interaktion von endogen exprimiertem hTRT-Protein und einer anderen für die Telomerase-Funktion erforderlichen zellulären Komponente, beispielsweise hTR, Telomer-DNA, Telomerase-assoziierte Proteine, Telomer-assoziierte Proteine, Telomere, den Zellcyclus kontrollierende Proteine, DNA-Reparaturenzyme, Histone oder nicht-Histon-chromosomale Proteine etc. (beispielsweise durch Kompetition). 



  Durch Auswahl von erfindungsgemässen Molekülen (Z.B. Polypeptiden), die sich auf die Interaktion von endogen exprimiertem hTRT-Protein und weiteren zellulären Bestandteilen auswirken, kann man Moleküle bevorzugen, die, wie hier beschrieben, eines oder mehrere der konservierten Motive des hTRT-Proteins enthalten. Die evolutionäre Konservierung dieser Bereiche zeigt, dass diese Motive eine wichtige Funktion in dem korrekten Arbeiten der menschlichen Telomerase beisteuern. Diese Motive sind somit allgemein nützliche Bereiche, um die Funktion des hTRT-Proteins zur Erzeugung von erfindungsgemässen hTRT-Proteinvarianten zu verwenden. somit sind hTRT-Polypeptidvarianten mit Mutationen in konservierten Motiven von besonderem Nutzen. 



  In einer weiteren Ausführungsform wird die Expression des endogenen hTRT-Gens durch Einführung einer grossen Menge an hTRT-Polypeptid in die Zelle (z.B. typischerweise mindestens etwa mehr als  2fach im Vergleich zu dem endogenen Spiegel, vorzugsweise etwa mindestens 10- bis etwa 100fach) reprimiert. Dieses wirkt über eine Prüfkopplungsschleife und hemmt so die Transkription des hTRT-Gens, die Prozessierung der hTRT-prä-m-PNA, die Translation der hTRT-mRNA oder die Assemblierung und den Transport des Telomerase-RNPs. 


 2) Oligonucleotide 
 


 a) "Antisense"-Konstrukte 
 



  Die Erfindung stellt Verfahren und "antisense"-Oligonucleotide oder Polynucleotidreagenzien zur Verfügung, die zur Herabsetzung der Expression von hTRT-Genprodukten in vitro oder in vivo verwendet werden können. Die Verabreichung der erfindungsgemässen "antisense"-Reagenzien an eine Zielzelle führt zu einer herabgesetzten TelomeraseAktivität und ist für die Behandlung von Erkrankungen besonders nützlich, die durch eine hohe Telomerase-Aktivität gekennzeichnet sind (z.B. bei Krebserkrankungen). Es wird davon ausgegangen, wobei hier keine Einschränkung auf einen bestimmten Mechanismus beabsichtigt ist, dass "antisense"-Oligonucleotide an die "sense"-hTRT-mRNA binden und deren Translation stören.

   Alternativ können die "antisense"-Moleküle die hTRT-mRNA für eine Spaltung mit Nuclease empfindlich machen, die Transkription, Prozessierung oder Lokalisierung stören oder auf andere Weise RNA-Vorläufer ("prä-mRNA") stören, die Transkription von mRNA des hTRT-Gens reprimieren oder über einige andere Mechanismen wirken. Der bestimmte Mechanismus, durch den die "antisense"-Moleküle die hTRT-Expression herabsetzen, ist jedoch nicht kritisch. 



  Die erfindungsgemässen "antisense"-Polynucleotide umfassen eine "antisense"-Sequenz mit mindestens 7 bis 10 oder mehr Nucleotiden, die mit eine Sequenz von mRNA, die humane TRT codiert, oder mRNA, die von dem hTRT-Gen transkribiert wird, spezifisch hybridisieren. Vorzugsweise weist das erfindungsgemässe "antisense"-Polynucleotid eine Länge von etwa 10 bis etwa 50 Nucleotiden oder von etwa 14 bis etwa 35 Nucleotiden auf. In weiteren Ausführungsformen handelt es sich bei den "antisense"-Polynucleotiden um Polynucleotide, die kürzer als etwa 100 Nucleotide oder kürzer als etwa 200 Nucleotide sind. Im allgemeinen sollten die "antisense"- Polynucleotide lang genug sein, um eine stabile Doppelhelix zu bilden, jedoch kurz genug (in Abhängigkeit von der Art der Zuführung) um, falls erwünscht, in vivo verabreicht werden zu können.

   Die minimale Länge eines Polynucleotids, die für eine spezifische Hybridisierung mit einer Zielsequenz erforderlich ist, hängt von verschiedenen Faktoren ab, beispielsweise vom G/C-Gehalt, der Lage von fehlgepaarten Basen (falls vorhanden), dem Ausmass der Einzigartigkeit der Sequenz im Vergleich zu der Population von Ziel-Polynucleotiden, der chemischen Natur des Polynucleotids (z.B. kann es sich um ein Methylphosphonat-Rückgrat handeln, eine Peptid-Nucleinsäure, ein Phosphorothioat) etc. Im allgemeinen ist die "antisense"-Sequenz zur Gewährleistung einer spezifischen Hybridisierung zu der Ziel-hTRT-mRNA-Sequenz im wesentlichen komplementär. In bestimmten Ausführungsformen ist die "antisense"-Sequenz genau komplementär zu der Zielsequenz.

   Die "antisense"-Polynucleotide können jedoch auch Nucleotid-Substitutionen, Additionen, Deletionen, Transitionen, Transpositionen oder Modifikationen enthalten, solange die spezifische Bindung an die relevante Zielsequenz, die hTRT-RNA oder deren Gen entspricht, als eine funktionelle Eigenschaft des Polynucleotids beibehalten wird. 



  In einer Ausführungsform ist die "antisense"-Sequenz zu relativ zugänglichen Sequenzen der hTRT-mRNA (z.B. Sequenzen, die relativ wenig Sekundärstrukturen aufweisen) komplementär. Dies kann durch Analyse der vorhergesagten RNA-Sekundärstrukturen bestimmt werden, beispielsweise mittels des MFOLD-Programms (Genetics Computer Group, Madison WI) und durch auf dem Fachgebiet bekannte in vitro- oder in vivo-Tests. Beispiele für Oligonucleotide, die hinsichtlich einer "antisense"-Suppression der hTRT-Funktion getestet werden können, sind Oligonucleotide, die mit den folgenden Positionen von SEQ. ID. Nr. 1 hybridisieren können (d.h. im wesentlichen komplementär sind): SEQ. ID. Nr. 1: 40-60; 260-280; 500-520; 770-790, 885-905; 1000-1020; 1300- 1320; 1520-1540; 2110-2130; 2295-2315; 2450-2470, 2670-2690; 3080-3110; 3140-3160; und 3690-3710.

   Bei einem weiteren nützlichen Verfahren zur Identifizierung von effektiven "antisense"-Zusammensetzungen werden kombinatorische Arrays von Oligonucleotiden verwendet (siehe beispielsweise Milner et al., Nature Biotechnology 15 (1997), 537). 



  Die Erfindung stellt auch ein "antisense"-Polynucleotid bereit, das Sequenzen zusätzlich zu der "antisense"-Sequenz aufweist (z.B. zusätzlich zu der anti-hTRT-"sense"-Sequenz). In diesem Fall ist die "antisense"-Sequenz in einem Polynucleotid mit einer längeren Sequenz enthalten. In einer weiteren Ausführungsform besteht die Sequenz des Polynucleotids im wesentlichen aus der "antisense"-Sequenz oder sie stellt diese dar. 



  Die "antisense"-Nucleinsäuren (DNA, RNA, modifizierte DNA oder RNA-Analoge etc.) können unter Verwendung jedes zur Herstellung von Nucleinsäuren geeigneten Verfahrens, beispielsweise den hier beschriebenen Verfahren, hergestellt werden. In einer Ausführungsform können erfindungsgemässe "antisense"-RNA-Moleküle beispielsweise durch chemische Synthese de novo oder durch Clonierung hergestellt werden. Beispielsweise kann eine "antisense"-RNA, die mit hTRT-mRNA hybridisiert, dadurch hergestellt werden, dass eine hTRT-DNA-Sequenz (z.B. SEQ. ID. Nr. 1 oder ein Fragment davon) in umgekehrter Orientierung funktionell mit einem Promotor verknüpft in einen Vektor (z.B. ein Plasmid) inseriert (ligiert) wird.

   Unter der Voraussetzung, dass der Promotor und vorzugsweise Terminations- und Polyadenylierungssignale korrekt positioniert sind, wird der Strang der inserierten Sequenz, der dem nicht-codierenden Strang entspricht, transkribiert, und dieser wirkt als ein erfindungsgemässes "antisense"-Oligonucleotid. 



  Die erfindungsgemässen "antisense"-Oligonucleotide können zur Hemmung der Telomerase-Aktivität in zellfreien Extrakten,  Zellen und Tieren, einschliesslich Säugern und Menschen, verwendet werden. Die Phosphorothioat-"antisense"-Oligonucleotide: 
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  können beispielsweise zur Hemmung von Telomerase-Aktivität verwendet werden. Bei einer Konzentration von 10  mu M hemmte(n) jedes Oligonucleotid; Gemische der Oligonucleotide A und B; A, B, C und D; und A, C und D die Telomerase Aktivität in 293-Zellen, wenn diese 7 Tage einmal pro Tag behandelt wurden. Eine Hemmung wurde auch mit einem "antisense"-hTR-Molekül                                   (5 min -GCTCTAGAATGAAGGGTG-3 min ) beobachtet, wenn dies mit den Oligonucleotiden A,B und C; A, B und D; und A und C kombiniert war. Zu den für solche Experimente nützlichen Kontroll- und Oligonucleotiden zählen: 
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  Um für die für eine bestimmte gewünschte Anwendung optimalen erfindungsgemässen "antisense"-Oligonucleotide bestimmen zu können, kann man ein Scanning unter Verwendung eines Satzes von erfindungsgemässen "antisense"-Oligonucleotiden durchführen. Ein Beispiel für einen solchen Satz ist der Satz von 30-mer Oligonucleotiden, die die hTRT-mRNA umspannen und wobei eines von dem nächsten um 15 Nucleotide versetzt ist, (d.h. ON1 entspricht den Positionen 1-30 und ist                             TCCCACGTGCGCAGCAGGACGCAGCGCTGC, ON2 entspricht Positionen 16-45 und ist               GCCGGGGCCAGGGCTTCCCACGTGCGCAGC, und ON3 entspricht den Positionen 31-60 und ist  GGCATCGCGGGGGTGGCCGGGGCCAGGGCT usw. bis zum Ende der mRNA). Jedes Mitglied dieses Satzes kann hinsichtlich seiner hemmenden Aktivität, wie hier beschrieben, getestet werden.

   Jene Oligonucleotide, die unter den gewünschten Bedingungen eine hemmende Aktivität zeigen, kennzeichnen dann einen gewünschten Bereich. Weitere erfindungsgemässe Oligonucleotide, die dem gewünschten Bereich entsprechen (d.h. 8-mere, 10-mere, 15-mere etc.) können zur Identifikation des Oligonucleotids mit der für die Anwendung bevorzugten Aktivität getestet werden. 



  Bezüglich allgemeiner Verfahren, die sich auf antisense-Polynucleotide beziehen, siehe Antisense RNA and DNA (1988), D.A. Melton, (Herausg., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.) und Dagle et al., Nucleic Acids Research 19 (1991), 1805. Bezüglich eines Übersichtsartikels der die "antisense"-Therapie betrifft, siehe beispielsweise Uhlmann et al., Chem. Reviews 90 (1990) 543-584. 


 b) Triplex-Oligo- und Polynucleotide 
 



  Die vorliegende Erfindung stellt Oligo- und Polynucleotide (z.B. DNA, RNA oder PNA) bereit, die an doppelsträngige oder Duplex-hTRT-Nucleinsäuren binden, (z.B. in einem gefalteten Bereich der hTRT-RNA oder im hTRT-Gen), wobei eine Nucleinsäure gebildet wird, die eine Dreifach-Helix enthält oder eine "triplex"-Nucleinsäure. Die Bildung einer Dreifach-Helix führt zur Hemmung der hTRT-Expression, beispielsweise durch die Verhinderung der Transkription des hTRT-Gens, wodurch Telomerase-Aktivität in einer Zelle herabgesetzt oder eliminiert wird. Es wird davon ausgegangen (wobei jedoch nicht beabsichtigt ist, an einen bestimmten Mechanismus gebunden zu sein), dass die Dreifach-Helixpaarung die Fähigkeit der Doppelhelix sich für die Bindung von  Polymerasen, Transkriptionsfaktoren oder regulatorischen Molekülen ausreichend zu öffnen, stört. 



  Erfindungsgemässe Triplex-Oligo- und Polynucleotide werden unter Anwendung der Basenpaarungsregeln für die Bildung von Dreifach-Helices konstruiert (siehe beispielsweise Cheng et al., i. Biol. Chem. 263 (1988), 15110; Ferrin und Camerini Otero, Science 354 (1991), 1494; Ramdas et al., J.Biol. Chem. 264 (1989), 17395; Strobel et al., Science 254 (1991), 1639 und Rigas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986), 9591, wobei durch Bezugnahme jedes dieser Dokumente als Bestandteil dieser Beschreibung anzusehen ist) und den hTRT-mRNA- und/oder Gensequenzen.

   Typischerweise umfassen die erfindungsgemässen Triplex-formenden Oligonucleotide eine spezifische Sequenz von etwa 10 bis mindestens etwa 25 Nucleotiden oder eine längere Sequenz, die zu einer spezifischen Sequenz in der hTRT-RNA oder dem Gen "komplementär" ist (d.h. lang genug, um eine stabile Dreifach-Helix bilden zu können, jedoch kurz genug, in Abhängigkeit von der Art der Zulieferung, um, falls gewünscht, in vivo verabreicht werden zu können). In diesem Zusammenhang bedeutet "komplementär" die Fähigkeit zur Bildung einer stabilen Dreifach-Helix. In einer Ausführungsform werden Oligonucleotide so entworfen, dass sie spezifisch an die regulatorischen Bereiche des hTRT-Gens (z.B. die hTRT-5 min -flankierende Sequenz, Promotoren und Enhancer) oder die Transkriptions-Initiationsstelle (z.B. zwischen -10 und +10 von der Transkriptionsinitiationsstelle) spezifisch binden.

   Bezüglich eines Übersichtsartikels neuerer therapeutischer Fortschritte, bei denen Triplex-DNA verwendet wird, siehe Gee et al.. in Huber und Carr, 1994, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co., Mt. Kisco NY und Rininsland et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997), 5854, wobei beide Dokumente durch Bezugnahme als Bestandteil dieser Beschreibung anzusehen sind. 


 c) Ribozyme 
 



  Die vorliegende Erfindung stellt auch Ribozyme bereit, die zur Hemmung von Telomerase-Aktivität von Nutzen sind. Die erfindungsgemässen Ribozyme binden, spalten spezifisch und inaktivieren hTRT-mRNA. Nützliche Ribozyme können 5 min - und 3 min -terminale Sequenzen umfassen, die zu der hTRT-mRNA komplementär sind, und diese können vom Fachmann auf der Basis der hier beschriebenen hTRT-mRNA-Sequenz konstruiert werden (siehe PCT-Veröffentlichung WO 93/23 572, a.a.O.). Zu den erfindungsgemässen Ribozymen gehören Ribozyme mit den Merkmalen der Gruppe I-Intron-Ribozyme (Cech, Biotechnology 13 (1995), 323) und "hammerhead"-Ribozyme (Edgington, Biotechnology 10 (1992), 256). 



  Zu den erfindungsgemässen Ribozymen zählen Ribozyme mit Spaltstellen wie GUA, GUU und GUC. Zu weiteren optimalen Spaltstellen für die Ribozym-vermittelte Hemmung von Telomerase-Aktivität gemäss der vorliegenden Erfindung gehören jene, die in den PCT-Veröffentlichungen WO 94/02 595 und WO 93/23 569 beschrieben sind, wobei beide Dokumente durch Bezugnahme als Bestandteil dieser Beschreibung anzusehen sind. Kurze RNA-Oligonucleotide mit einer Länge von 15 und 20 Ribonucleotiden, die einem Bereich des Ziel-hTRT-Gens entsprechen, der eine Spaltstelle enthält, können bezüglich Sekundärstrukturmerkmalen, die zu wünschenswerteren Oligonucleotiden führen, bewertet werden.

   Die Eignung der Spaltstellen kann auch durch Testen der Zugänglichkeit zur Hybridisierung mit komplementären Oligonucleotiden bewertet werden, wobei "Ribonuclease-Protection"-Assays angewandt werden, oder indem die Ribozym-Aktivität in vitro gemäss auf dem Fachgebiet bekannter Standardverfahren getestet wird. 



  Wie von Hu et al., PCT-Veröffentlichung WO 94/03 596 beschrieben, können "antisense"- und Ribozym-Funktionen in einem einzigen Oligonucleotid kombiniert werden. Dieses  Dokument ist hier ebenfalls durch Bezugnahme als Gegenstand dieser Beschreibung anzusehen. Darüber hinaus können Ribozyme eine oder mehrere modifizierte Nucleotide oder modifizierte Bindungen zwischen Nucleotiden umfassen, wie dies vorstehend im Zusammenhang mit der Beschreibung von veranschaulichenden erfindungsgemässen Oligonucleotiden beschrieben ist. 



  In einer Ausführungsform werden die erfindungsgemässen Ribozyme in vitro erzeugt und in eine Zelle oder einen Patienten eingeführt. In einer anderen Ausführungsform werden Gentherapieverfahren zur Expression von Ribozymen in einer Zielzelle ex vivo oder in vivo angewandt. 


 d) Verabreichung von Oligonucleotiden 
 



  Typischerweise gehört zu den erfindungsgemässen therapeutischen Verfahren die Verabreichung eines Oligonucleotids das so wirkt, dass es unter physiologischen Bedingungen in vivo Telomerase-Aktivität hemmen oder stimulieren kann und das unter diesen Bedingungen für einen Zeitraum, der für eine therapeutische Wirkung ausreicht, relativ stabil ist. Wie bereits vorstehend angegeben, können modifizierte Nucleinsäuren bei der Verleihung einer solchen Stabilität von Nutzen sein, aber auch für die gezielte Zulieferung des Oligonucleotids an das gewünschte Gewebe, Organ oder die gewünschte Zelle. 



  Oligo- und Polynucleotide können direkt als Arzneimittel in einer geeigneten pharmazeutischen Formulierung zugeliefert werden, oder indirekt durch Mittel zur Einführung einer Nucleinsäure in eine Zelle, wozu Liposome, Immunliposome, ballistische Verfahren, die direkte Aufnahme in Zellen etc., so wie dies hier beschrieben ist, gehören. Zur Behandlung einer Erkrankung werden die erfindungsgemässen Oligonucleotide an den Patienten in einer therapeutisch wirksamen Menge verabreicht. Eine therapeutisch wirksame  Menge ist die Menge, die ausreicht, um die Krankheitssymptome zu lindern oder die Telomerase-Aktivität in der Zielzelle zu modulieren, wie dies beispielsweise unter Verwendung eines TRAP-Assays oder anderer geeigneter Assays bezüglich der biologischen Funktion von Telomerase bestimmt werden kann.

   Für die Zulieferung von Oligonucleotiden für therapeutische Zwecke geeignete Verfahren sind in dem US-Patent 5 272 065, das hiermit durch Bezugnahme als Bestandteil dieser Beschreibung anzusehen ist, beschrieben. Weitere Details bezüglich der Verabreichung von pharmazeutisch aktiven Verbindungen sind nachstehend beschrieben. In einer weiteren Ausführungsform können Oligo- und Polynucleotide unter Verwendung von Gentherapie und der erfindungsgemässen rekombinanten DNA-Expressionsplasmide zugeliefert werden. 


 3) Gentherapie 
 

 

  Gentherapie bezieht sich auf die Einführung eines ansonsten exogenen Polynucleotids, das auf die (typischerweise) Säuger-Zelle(n), in das (die) es überführt wird, eine medizinisch nützliche phänotypische Auswirkung hat. Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Bereitstellung von Gentherapieverfahren und Zusammensetzungen für die Behandlung von Telomerase assoziierten Zuständen. In veranschaulichenden Ausführungsformen gehört zu der Gentherapie die Einführung eines Vektors in eine Zelle, der ein hTRT-Genprodukt exprimiert (z.B.ein hTRT-Protein, das im wesentlichen dem hTRT-Polypeptid mit einer Sequenz von SEQ. ID.

   Nr. 2 gleicht, beispielsweise um Telomerase-Aktivität zu steigern, oder ein inhibitorisches hTRT-Polypeptid zur Herabsetzung der Aktivität), die Expression einer Nucleinsäure mit einer Sequenz eines hTRT-Gens oder einer hTRT-mRNA (z.B. einer "antisense"-RNA, um beispielsweise Telomerase-Aktivität herabzusetzen), die Expression eines Polypeptids oder Polynucleotids, das auf andere Weise die Expression von  hTRT-Genprodukten beeinflusst (z.B. ein Ribozym, das zur Herabsetzung von Telomerase-Aktivität gegen hTRT-MRNA gerichtet ist) oder den Austausch, oder das Unterbrechen einer endogenen hTRT-Sequenz (z. B. "gene replacement" und "gene knockout"). Für den Fachmann sind nach Lesen dieser Beschreibung zahlreiche weitere Ausführungsformen offensichtlich. In einer Ausführungsform wird auch ein hTR-codierender Vektor eingeführt.

   In einer weiteren Ausführungsform werden auch Telomerase-assoziierte Proteine codierende Vektoren mit oder ohne einen Vektor für hTR eingeführt. 



  Für die hTRT-Gentherapie nützliche Vektoren können viral oder nicht-viral sein. Dazu zählen die im Zusammenhang mit den erfindungsgemässen hTRT-Expressionssystemen vorstehend beschriebenen Vektoren. Es ist für den Fachmann offensichtlich, dass Gentherapie-Vektoren Promotoren und andere regulatorische oder für die Prozessierung benötigte Sequenzen umfassen können, beispielsweise die hier beschriebenen. Üblicherweise umfassen die Vektoren einen Promotor und gegebenenfalls einen Enhancer (unabhängig von einem Enhancer, der innerhalb der Promotorsequenzen bereits vorhanden ist), die zur Steuerung der Transkription eines Oligoribonucleotids dienen, sowie weitere regulatorische Elemente, die für die Beibehaltung des Vektors als Episom oder für die chromosomale Integration und Transkription auf hohem Niveau sorgen, falls erwünscht.

   Ein für die Gentherapie nützliches Plasmid kann weitere funktionelle Elemente umfassen, beispielsweise selektierbare Marker, Identifizierungsbereiche und weitere Sequenzen. Zusätzliche Sequenzen können eine Rolle dabei spielen, sowohl ausserhalb als auch innerhalb der Zelle Stabilität zu verleihen, um für die zielgerichtete Zulieferung von hTRT-Nucleotidsequenzen ("sense" oder "antisense") zu einem gewünschten Organ, Gewebe oder einer Zellpopulation zu bewirken, oder den Eintritt in eine Zelle, in den Nucleus einer Zelle und/oder die Integration innerhalb nucleärer DNA zu vermitteln. 



  Beispielsweise können Aptamer-ähnliche DNA-Strukturen oder andere Stellen der Einheiten, die Proteine binden, dazu verwendet werden, um die Bindung eines Vektors an Zelloberflächenrezeptoren oder an Serumproteine zu vermitteln, die an einen Rezeptor binden, wodurch die Effizienz des DNA-Transfers in die Zelle erhöht wird. Andere DNA-Stellen und Strukturen können direkt oder indirekt an Rezeptoren in der nucleären Membran oder an andere Proteine, die in den Nucleus wandern, binden, wodurch die nucleäre Aufnahme eines Vektors erleichtert wird. Andere DNA-Sequenzen können direkt oder indirekt die Effizienz der Integration beeinflussen. 



  Geeignete Vektoren für die Gentherapie können einen Replikationsursprung besitzen oder auch nicht. Beispielsweise ist es nützlich für die Vermehrung des Vektors vor der Verabreichung an einen Patienten einen Replikationsursprung in einen Vektor einzubauen. Der Replikationsursprung kann jedoch oft vor der Verabreichung entfernt werden, wenn der Vektor so entworfen ist, dass er sich in die chromosomale DNA des Wirts integrieren soll oder an die mRNA oder DNA des Wirts binden soll. In einigen Situationen (z.B. bei Tumorzellen) mag es nicht notwendig sein, dass sich die exogene DNA in die transduzierte Zelle stabil integriert, da eine transiente Expression ausreichen kann, um Zellen abzutöten. 



  Wie bereits erwähnt, stellt die vorliegende Erfindung auch Verfahren und Reagenzien für die "gene replacement"-Therapie zur Verfügung (d.h. der Austausch eines endogenen hTRT-Gens gegen ein rekombinantes Gen durch homologe Rekombinaton). Es können dafür speziell für eine Integration durch homologe Rekombination entworfene Vektoren verwendet werden. Zu den für die Optimierung der homologen Rekombination wichtige Faktoren zählen das Ausmass der Sequenzidentität und die Länge der Homologie zu chromosomalen Sequenzen. Die spezifische, die homologe Rekombination vermittelnde Sequenz  ist ebenfalls wichtig, da eine Integration in transkriptionell aktive DNA wesentlich leichter stattfindet.

   Verfahren und Substanzen zur Konstruktion von Konstrukten für eine zielgerichtete homologe Rekombination sind beispielsweise beschrieben in Mansour et al., Nature 336 (1988), 348; Bradley et al., Bio/Technology 10 (1992), 534 und darüber hinaus in US-Patent Nr. 5 627 059; 5 487 992, 5  631 153 und 5 464 764. In einer Ausführungsform umfasst die "gene replacement"-Therapie die Änderung oder den Austausch aller regulatorischen Sequenzen oder eines Teils davon, die die Expression des zu regulierenden hTRT-Gens kontrollieren. Beispielsweise können die hTRT-Promotorsequenzen (z.B. solche, die in SEQ. ID. Nr. 6 (Fig. 21) vorkommen) unterbrochen werden (um so die hTRT-Expression zu verringern oder eine Kontrollstelle für die Transkription zu eliminieren) oder gegen einen exogenen Promotor ausgetauscht sein, beispielsweise um die hTRT-Expression zu erhöhen. 



  Die Erfindung stellt auch Verfahren und Reagenzien für den hTRT-"gene knockout" bereit (d.h. die Deletion oder Unterbrechung eines endogenen hTRT-Gens durch homologe Rekombination unter Verwendung eines rekombinant hergestellten Vektors). Bei diesem "gene knockout" können die als Ziel in Betracht gezogenen Sequenzen regulatorische Sequenzen sein (z.B. der hTRT-Promotor) oder RNA- oder Protein-codierende Sequenzen. Die Veränderung der Expression von endogenen Genen durch homologe Rekombination ist ausführlich beschrieben in dem US-Patent Nr. 5 272 071 (und den vorstehend zitierten US-Patenten), WO 91/09 955, wo 93/09 222, WO 96/29 411, WO 95/31 560 und WO 91/12 650. Siehe auch Moynahan et al., Hum. Mol. Genet. 5 (1996) 875. 



  Die vorliegende Erfindung stellt ferner Verfahren zur spezifischen Abtötung Telomerase-positiver Zellen oder zur Verhinderung der Transformation von Telomerase-negativen Zellen zu einem Telomerase-positiven Status bereit, wobei der hTRT-Genpromotor zur Regulation der Expression eines für  die Zelle toxischen Proteins verwendet wird. Wie in Beispiel 14 gezeigt, kann eine hTRT-Promotorsequenz mit einem Reportergen funktionell verknüpft sein, so dass die Aktivierung des Promotors zur Expression des von dem Reportergen codierten Proteins führt. Falls anstelle eines Reporterproteins das codierte Protein für die Zelle toxisch ist, führt die Aktivierung des Promotors zur Zellmorbidität oder zum Tod der Zelle.

   Bei einer erfindungsgemässen Ausführungsform wird ein Vektor, der ein ein toxisches Protein codierendes Gen umfasst, das mit einem hTRT-Promotor funktionell verknüpft ist in Zellen, wie menschliche Zellen, beispielsweise Zellen in einem menschlichen Patienten, eingeführt, was zum Zelltod bei denjenigen Zellen führt, in denen hTRT-Promotor aktivierende Faktoren exprimiert werden, wie beispielsweise Krebszellen. Bei einer verwandten Ausführungsform ist das codierte Protein selbst nicht toxisch für eine Zelle, codiert jedoch eine Aktivität, die die Zelle gegenüber einem ansonsten nicht-toxischen Wirkstoff empfindlich macht. Tumore können beispielsweise durch Einführung eines hTRT-Promotor-Herpes-Thymidinkinase (TK)-Genfusionskonstrukts in Tumorzellen und die Verabreichung von Gangcyclovir oder des Äquivalents behandelt werden (siehe beispielsweise Moolton und Wells, J. Natl. Canc.

   Inst. 82 (1990), 297). Auf dem Fachgebiet sind auch zahlreiche weitere geeignete toxische oder potentiell toxische Proteine und Systeme bekannt (wobei sich von hTRT unterscheidende Promotorsequenzen verwendet werden), die vom Fachmann nach Lesen dieser Beschreibung gemäss der vorliegenden Erfindung modifiziert und verabreicht werden können. 



  Vektoren für die Gentherapie können in Zellen oder Gewebe in vivo, in vitro oder ex vivo eingeführt werden. Für die ex vivo-Therapie können Vektoren in von dem Patienten entnommene Stammzellen eingeführt werden und für die autologe Rücktransplantation in den selben Patienten clonal propagiert werden (siehe beispielsweise die US-Patente 5 399  493 und 5 437 994, wobei durch Bezugnahme diese Dokumente als Bestandteil der Beschreibung angesehen werden können).

   Zu den Zellen, die als Ziel für die hTRT-Gentherapie mit dem Ziel der Steigerung der Telomerase-Aktivität in einer Zielzelle in Betracht kommen, zählen, allerdings ohne Beschränkung darauf, Embryonalzellen oder Keimzellen, insbesondere Primatenzellen oder menschliche Zellen, wie vorstehend angemerkt, hematopoetische Stammzellen (AIDS und nach der Chemotherapie), vaskuläre Endothelialzellen, (Erkrankungen der Herzgefässe und zerebralen Gefässe), Hautfibroblasten und Unterhautkeratinocyten (Wundheilung und Verbrennungen) Chondrocyten (Arthritis), Hirnastrocyten und Microglialzellen (Alzheimer Krankheit), Osteoblasten (Osteoporose) Retinazellen (Augenerkrankungen) und Pankreas-Inselzellen (Typ I Diabetes) sowie die in der nachstehenden Auflistung 1 aufgezählten Zellen. 



  In einer erfindungsgemässen Ausführungsform wird ein mit einer TRT-codierenden Sequenz (oder einer Variante davon) funktionell verknüpfter induzierbarer Promotor zur Modulation der Proliferationsfähigkeit von Zellen in vivo oder in vitro verwendet. In einer besonderen Ausführungsform werden beispielsweise Insulin-produzierende Pankreaszellen, die mit einem hTRT-Expressionsvektor unter der Kontolle eines induzierbaren Promotors transfiziert sind, in einen Patienten eingeführt. Die Proliferationsfähigkeit der Zellen kann dann durch Verabreichung des den Promotor aktivierenden Mittels (z.B. Tetracyclin) an den Patienten kontrolliert werden, wobei dadurch sich die Zellen stärker vermehren können, als dies ansonsten möglich gewesen wäre.

   Die Zellproliferation kann dann, je nach dem, wie es von dem behandelnden Arzt gewünscht wird, beendet, fortgesetzt oder erneut initiiert werden. 


 4) Vakzine und Antikörper 
 



  Immunogene Peptide oder Polypeptide mit einer hTRT-Sequenz können dazu verwendet werden, um eine anti-hTRT-Immunantwort in einem Patienten hervorzurufen (d.h. sie können als Vakzin wirken). Beispiele für immunogene hTRT-Peptide und Polypeptide sind nachstehend in den Beispielen 6 und 8 beschrieben. Eine Immunantwort kann auch durch Zulieferung von Plasmidvektoren, die das gewünschte Polypeptid codieren (d.h. die Verabreichung von "nackter DNA") ausgelöst werden. Die gewünschten Nucleinsäuren können durch Injektion, Liposome oder andere Verabreichungsmassnahmen zugeliefert werden. In einer Ausführungsform werden Immunosierungsarten ausgewählt, die in der Versuchsperson bzw. dem Patienten eine auf die MHC Klasse I restringierte Antwort cytotoxischer Lymphocyten gegen Telomerase exprimierende Zellen auslösen.

   Nach der Immunisierung wird in der Person oder dem Tier eine erhöhte Immunantwort gegen Zellen hervorgerufen, die hohe Konzentrationen von Telomerase exprimieren (z.B. maligne Zellen). 



  Anti-hTRT-Antikörper, beispielsweise von der Maus, vom Menschen, oder humanisierte monoclonale Antikörper können ebenfalls zur Erzielung einer Immunantwort gegen Telomeraseexprimierende Zellen verabreicht werden (z.B. passive Immunisierung). 


 F) Arzneimittel 
 



  Verwandte Aspekte der vorliegenden Erfindung beziehen sich auf die Bereitstellung von Arzneimitteln, die hTRT-Oligo- und -Polynucleotide, -Polypeptide und -Antikörper, -Agonisten, -Antagonisten oder       -Hemmstoffe, allein oder in Kombination mit mindestens einem weiteren Mittel, wie beispielsweise einer stabilisierenden Verbindung, einem Verdünnungsmittel, einem Träger oder einem anderen aktiven Bestandteil oder Agens, umfassen. 



  Die erfindungsgemässen Arzneimittel können in einem sterilen, biokompatiblen pharmazeutischen Träger, zu dem beispielsweise, jedoch ohne Beschränkung darauf, eine Kochsalzlösung, gepufferte Kochsalzlösung, Dextrose und Wasser gehören, verabreicht werden. Jedes dieser Moleküle kann dem Patienten allein verabreicht werden oder in Kombination mit anderen Mitteln, Arzneimitteln oder Hormonen, in Arzneimitteln, wo es mit einem oder mehreren geeigneten Exzipienten, Hilfsstoffen und/oder pharmazeutisch verträglichen Trägern vermischt ist. In einer erfindungsgemässen Ausführung ist der pharmazeutisch verträgliche Träger pharmazeutisch inert. 



  Die Verabreichung der Arzneimittel kann oral oder parenteral erfolgen. Zu den Verfahren für die parenterale Verabreichung gehören die topische, intra-arterielle (z.B. direkt zu dem Tumor), intramuskuläre, subkutane, intramedulläre, intrathekale, intraventrikuläre, intravenöse, intraperitoneale oder intranasale Verabreichung. Zusätzlich zu den aktiven Bestandteilen können diese Arzneimittel geeignete pharmazeutisch verträgliche Träger umfassen, die Exzipienten und andere Verbindungen umfassen, die die Verarbeitung der aktiven Bestandteile zu Zubereitungen erleichtern, die pharmazeutisch verwendet werden können. Weitere Details bezüglich Verfahren zur Formulierung und Verabreichung können in der neuesten Ausgabe von "Remington's Pharmaceutical Sciences" (Maack Publishing Co., Easton PA) gefunden werden. 



  Arzneimittel für die orale Verabreichung können unter Verwendung von auf dem Fachgebiet gut bekannten pharmazeutisch verträglichen Trägern in Dosen, die für eine orale Verabreichung geeignet sind, formuliert werden. solche Träger erlauben die Formulierung der Arzneimittel als Tabletten, Pillen, Dragees, Kapseln, Flüssigkeiten, Gele, Sirups, Aufschlämmungen, Suspensionen etc., die für die  Aufnahme durch den Patienten geeignet sind. Siehe PCT-Veröffentlichung WO 93/23 572. 



  Arzneimittel für die orale Verwendung können durch die Kombination von aktiven Bestandteilen mit einem festen Exzipienten, gegebenenfalls durch Mahlen eines erhaltenen Gemischs, erhalten werden und Weiterverarbeitung des Granulatgemisches nach Zugabe geeigneter zusätzlichen Verbindung, umso, falls erwünscht, Tabletten oder Drageekerne zu erhalten. Geeignete Exzipienten sind Kohlenhydrat- oder Proteinfüllstoffe, dazu zählen, allerdings ohne Beschränkung darauf, Zucker, einschliesslich Lactose, Saccharose, Mannit oder Sorbit; Stärke aus Mais, Weizen, Reis, Kartoffel oder anderen Pflanzen; Cellulose, wie beispielsweise Methylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose oder Natriumcarboxymethylcellulose und Gummis, zu denen Gummi arabicum und Tragacanthharz zählen, sowie Proteine, wie beispielsweise Gelatine und Collagen.

   Falls erwünscht, können den Zerfall bewirkende oder solubisierende Agenzien zugegeben werden, beispielsweise quer vernetztes Polyvinylpyrrolidon, Agar, Alginsäure oder ein Salz davon, beispielsweise Natriumalginat. 



  Drageekerne werden mit geeigneten Überzügen versehen, beispielsweise konzentrierten Zuckerlösungen, sie können auch Gummi arabicum, Talk, Polyvinylpyrrolidon, "Carbopol"-Gel, Polyethylenglykol und/oder Titandioxid, Lacklösungen und geeignete organische Lösungsmittel oder Lösungsgemische enthalten. Zu den Überzügen für die Tabletten oder Dragees können Farbstoffe oder Pigmente zugefügt werden, um das Produkt zu kennzeichnen oder die Menge an aktivem Wirkstoff (d.h. die Dosierung) zu kennzeichnen. 



  Zu den oral zu verwendenden Arzneimitteln gehören aus Gelatine hergestellte Steckkapseln sowie weiche verschlossene Kapseln, die aus Gelatine und einem Überzug  aus Glycerin oder Sorbit hergestellt sind. Steckkapseln können die aktiven Bestandteile, vermischt mit einem Füllstoff oder Bindemitteln enthalten, dazu gehören Lactose oder Stärken, Gleitmittel, wie Talg oder Magnesiumstearat, und gegebenenfalls Stabilisatoren. In weichen Kapseln können die aktiven Verbindungen in geeigneten Flüssigkeiten gelöst oder suspendiert sein, beispielsweise in Fettsäuren, flüssigem Paraffin oder flüssigem Polyethylenglykol mit oder ohne Stabilisatoren. Zu den Arzneimitteln für die parenterale Verabreichung gehören wässrige Lösungen mit aktiven Verbindungen.

   Für die Injektion kann das erfindungsgemässe Arzneimittel in wässrige Lösungen formuliert werden, vorzugsweise in physiologisch kompatible Puffer, wie beispielsweise Hank's-Lösung, Ringer-Lösung oder in physiologisch gepufferter Kochsalzlösung. Wässrige Suspensionen für die Injektion können Substanzen enthalten, die die Viskosität der Suspension erhöhen, wie beispielsweise Natriumcarboxymethylcellulose, Sorbit oder Dextran. Zusätzlich können Suspensionen der aktiven Verbindungen als geeignete ölige Injektionssuspensionen hergestellt werden. Zu den geeigneten lipophilen Lösungsmitteln oder Vehikeln gehören Fettsäuren, wie beispielsweise Sesamöl oder synthetische Fettsäureester, wie beispielsweise Ethyloleat oder Triglyceride oder Liposome.

   Gegebenenfalls können die Suspensionen auch geeignete Stabilisatoren enthalten, oder Mittel, die die Löslichkeit der Verbindungen erhöhen, um so die Herstellung von hochkonzentrierten Lösungen zu gestatten. 



  Für die topische oder nasale Verabreichung werden in der Formulierung Penetrantien verwendet, die für die spezifische zu durchdringenden Barrieren geeignet sind. Solche Penetrantien sind auf dem Fachgebiet allgemein bekannt. 



  Die erfindungsgemässen Arzneimittel können durch Verfahren, die den auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren gleichen, hergestellt werden (z.B. durch übliche Vermischungs-,  Lösungs-, Granulierungs-, Drageeherstellungs-, Pulverisierungs-, Emulgierungs-, Einkapselungs-, Einschluss- oder Lyophilisierungsverfahren). 



  Die Arzneimittel können als ein Salz bereitgestellt werden und können mit vielen Säuren hergestellt werden, dazu zählen, allerdings ohne Beschränkung darauf, Salzsäure, Schwefelsäure, Essigsäure, Milchsäure, Weinsäure, Apfelsäure, Bernsteinsäure etc. Salze neigen dazu, in wässrigen oder anderen protonischen Lösungsmitteln löslicher zu sein als die entsprechende Form der freien Base. In anderen Fällen kann die bevorzugte Zubereitung ein lyophilisiertes Pulver in 1 mM-50 mM Histidin, 0,1% bis 2% Saccharose, und 2% bis 7% Mannit bei einem pH-Wert im Bereich von 4,5 bis 5,5 sein, das vor der Verwendung mit einem Puffer kombiniert wird. 



  Nach der Herstellung der Arzneimittel, die eine in einem verträglichen Träger formulierte erfindungsgemässe Verbindung umfassen, können sie in einen geeigneten Behälter gegeben und entsprechend der Behandlung eines angegebenen Krankheitszustands markiert werden. Bei der Verabreichung von menschlichen Telomerase-Proteinen und -Nucleinsäuren würde zu einer solchen Markierung die Angabe der Menge und Häufigkeit der Verabreichung sowie des Verabreichungsverfahrens zählen. 



  Zu den für die erfindungsgemässe Verwendung geeigneten Arzneimitteln zählen Zusammensetzungen, bei denen die aktiven Bestandteile zur Erzielung des gewünschten Zwecks in einer wirksamen Menge enthalten sind. "Therapeutisch wirksame Menge" oder "pharmakologisch wirksame Menge" sind allgemein gebräuchliche Ausdrücke und beziehen sich auf die Menge eines Agens, der das gewünschte pharmakologische Ergebnis wirksam hervorrufen kann. Somit ist eine therapeutisch wirksame Menge eine Menge, die ausreicht, um die Symptome der zu behandelnden Erkrankung zu verbessern. 



  Ein nützliches Assay zur Bestimmung einer wirksamen Menge für eine vorgegebene Anwendung (z.B. einer therapeutisch wirksamen Menge) besteht in der Messung des Effekts auf Telomerase-Aktivität in einer Zielzelle. Die tatsächlich verabreichte Menge hängt von der zu behandelnden Person ab und stellt vorzugsweise eine so optimierte Menge dar, dass der gewünschte Effekt ohne wesentliche Nebenwirkungen erzielt wird. Die Bestimmung einer therapeutisch wirksamen Dosis liegt im Bereich der Fähigkeiten des Fachmanns. 



  Für jede beliebige Verbindung kann die therapeutisch wirksame Dosis anfänglich entweder in Zellkulturassays oder mittels eines geeigneten Tiermodells bestimmt werden. Das Tiermodell wird auch dazu verwendet, um einen geeigneten Konzentrationsbereich und einen geeigneten Verabreichungsweg zu ermitteln. So gewonnene Informationen können dann dazu verwendet werden, nützliche Dosen und Verabreichungswege im Menschen zu bestimmen. 



  Eine therapeutisch wirksame Menge bezieht sich auf die Menge an Protein, Polypeptid, Peptid, Antikörper, Oligo- oder Polynucleotid, Agonist oder Antagonist, die die Symptome oder den Zustand bessert. Die therapeutische Wirksamkeit und Toxizität solcher Verbindungen kann durch pharmazeutische Standardprozeduren in Zellkulturen oder an Versuchstieren bestimmt werden (z.B. ED50, die in 50% der Population therapeutisch wirksame Dosis; und LD50, die in 50% der Population tödliche Dosis). Der therapeutische Index bezeichnet das Dosisverhältnis zwischen therapeutischen und toxischen Wirkungen und es kann als das Verhältnis ED5O/LD50 ausgedrückt werden. Pharmazeutische Zusammensetzungen, die einen grossen therapeutischen Index aufweisen, sind bevorzugt.

   Die von Zellkulturassays und Tierstudien gewonnenen Daten werden zur Bestimmung des Dosierungsbereichs für die Anwendung beim Menschen verwendet. Die Dosierung solcher Verbindungen liegt vorzugsweise innerhalb eines Bereichs von  Umlaufkonzentrationen, die die ED50 einschliessen, mit einer geringen oder keiner Toxizität. Die Dosierung variiert innerhalb dieses Bereichs in Abhängigkeit von der angewandten Dosierungsform, der Empfindlichkeit des Patienten und des Verabreichungswegs. 



  Die exakte Dosierung wird von dem jeweiligen Arzt indivduell für den zu behandelnden Patienten ausgewählt. Die Dosierung und Verabreichung werden so eingestellt, dass sie einen ausreichenden Spiegel der aktiven Einheit bereitstellen, oder den gewünschten Effekt aufrechterhalten. 



  Zu den zusätzlichen Faktoren, die beachtet werden müssen, zählen die Schwere des Krankheitszustands (beispielsweise die Tumorgrösse und -Lage; das Alter, das Gewicht und Geschlecht des Patienten; die Ernährung sowie der Zeitpunkt und die Häufigkeit der Verabreichung, die Kombination(en) von Arzneimittel, Reaktionsempfindlichkeit und Toleranz gegenüber bzw. Ansprechen auf die Therapie). Langwirkende Arzneimittel können alle 3 bis 4 Tage verabreicht werden, jede Woche, oder einmal alle 2 Wochen in Abhängigkeit von der Halbwertszeit und der "clearance"-Rate der speziellen Formulierung. Eine Anleitung bezüglich spezieller Dosierungen und Darreichungsverfahren ist in der Literatur zu finden (siehe US-Patent Nr. 4 657 760, 5 206 344 und 5 225 212, wobei diese Dokumente durch Bezugnahme als Bestandteil dieser Beschreibung angesehen werden können).

   Der Fachmann wird für Nucleotide andere Formulierungen verwenden als für Proteine oder ihre Inhibitoren. Genauso ist die Verabreichung von Polynucleotiden oder Polypeptiden spezifisch für bestimmte Zellen, Zustände, Lagen etc. 


 VIII. Die Steigerung der Proliferationsfähigkeit und die Herstellung von immortalisierten Zellen, 
 Zellinien und Tieren 
 



  Wie bereits vorstehend diskutiert, zeigen die meisten Vertebratenzellen nach einer begrenzten Anzahl von Teilungen in der Kultur (z.B. 50 bis 100 Teilungen) Seneszenz. Bestimmte Zellvarianten können sich jedoch in Kultur unbegrenzt teilen (z.B. HeLa-Zellen, 293-Zellen) und sind aus diesem Grund von Nutzen für die Forschung und industrielle Anwendung. Gewöhnlich werden solche unsterblichen Zellinien von spontan entstehenden Tumoren oder nach Transformation durch Exposition gegenüber Strahlung oder einem Tumor-induzierenden Virus oder einer Tumor-induzierenden Chemikalie erhalten. Leider steht nur eine begrenzte Auswahl von Zellinien, insbesondere von menschlichen Zellinien, die differenzierte Zellfunktion zeigen, zur Verfügung. Darüber hinaus sind die zur Zeit verfügbaren unsterblichen Zellinien durch chromosomale Anomalien gekennzeichnet (z.B.

   Aneuploidie, Gen-Rearrangements oder Mutationen). Ferner sind viele der bereits lang etablierten Zellinien relativ undifferenziert (z.B. stellen sie nicht solch hochspezialisierte Produkte her, die für bestimmte Gewebe oder Organe einzigartig sind). Es besteht somit ein Bedarf an neuen Verfahren zur Erzeugung unsterblicher Zellen, insbesondere menschlicher Zellen. Eine Verwendung von immortalisierten Zellen bezieht sich auf die Herstellung von natürlichen Proteinen und rekombinanten Proteinen (z.B. therapeutische Polypeptide) oder Antikörper, für die eine stabile genetisch normale Zellinie bevorzugt wird. Für die Herstellung einiger rekombinanter Proteine können auch spezialisierte Zelltypen bevorzugt werden (z.B. Pankreaszellen für die Herstellung von menschlichem Insulin).

   Eine weitere Verwendungsmöglichkeit für immortalisierte Zellen ist die Einführung in einen Patienten für eine Gentherapie oder für den Austausch von erkrankten oder beschädigten Zellen oder Gewebe. Beispielsweise können  autologe Immunzellen, die beispielsweise ein erfindungsgemässes rekombinantes hTRT-Gen oder Polypeptid enthalten oder exprimieren für einen Zellaustausch in einem Patienten nach einer aggressiven Krebstherapie, beispielsweise nach der Bestrahlung des gesamten Körpers, verwendet werden. Eine weitere Verwendungsmöglichkeit für immortalisierte Zellen besteht in der ex vivo-Herstellung von "künstlichen" Geweben oder Organen (z.B. Haut) für eine therapeutische Anwendung.

   Eine weitere Verwendung solcher Zellen besteht im Screenen nach Wirkstoffen oder der Bestätigung der Wirkung von Wirkstoffen, beispielsweise Telomerase-hemmenden Wirkstoffen, oder bei der Herstellung von Vakzinen. Für den Fachmann sind weitere Verwendungsmöglichkeiten der erfindungsgemässen Zellen offensichtlich. 



  Die erfindungsgemässen immortalisierten Zellen und Zellinien sowie solche mit lediglich erhöhter Replikationsfähigkeit werden durch Steigerung von Telomerase-Aktivität in der Zelle erzeugt. Es kann dabei jedes hier beschriebene Verfahren zur Steigerung von Telomerase-Aktivität angewendet werden. Somit werden in einer Ausführungsform Zellen durch Steigerung der Menge an hTRT-Polypeptid in der Zelle immortalisiert. In einer Ausführungsform wird der hTRT-Spiegel durch Einführung eines hTRT-Expressionsvektors in die Zelle (wobei gelegentlich eine stabile Transfektion bevorzugt wird) erhöht. Wie bereits vorstehend diskutiert ist die hTRT-codierende Sequenz normalerweise mit einem Promotor funktionell verknüpft, der in der Zelle induzierbar oder konstitutiv aktiv sein kann. 



  *In einer Ausführungsform umfasst ein Polynucleotid eine Sequenz, die ein Polypeptid der SEQ. ID. Nr. 2 umfasst, wobei die Sequenz mit einem Promotor (z.B. einem konstitutiv exprimierten Promotor, z.B. eine Sequenz von SEQ. ID. Nr. 6 (Fig. 6)) funktionell verknüpft ist und wobei das Polynucleotid in die Zelle eingeführt wird. In einer  Ausführungsform umfasst das Polynucleotid eine Sequenz von SEQ. ID. Nr. 1. Vorzugsweise enthält das Polynucleotid Polyadenylierungs- und Terminationssignale. In weiteren Ausführungsformen sind zusätzliche Elemente, wie Enhancer oder solche wie sie vorstehend diskutiert wurden, enthalten.

   In einer alternativen Ausführungsform enthält das Polynucleotid keine Promotorsequenz, wobei dann eine solche Sequenz durch das endogene Genom der Zielzelle nach Integration (z.B. durch Rekombination, z.B. homologe Rekombination) des eingeführten Polynucleotids bereitgestellt wird. Das Polynucleotid kann durch jedes beliebige Verfahren in die Zielzelle eingeführt werden, dazu zählen die hier beschriebenen Verfahren (wie beispielsweise Lipofektion, Elektroporation, Virosome, Liposome, Immunliposome, Polykation/Nucleinsäure-Konjugate, nackte DNA). 



  Unter Verwendung der erfindungsgemässen Verfahren kann eine beliebige Vertebraten-Zelle dazu gebracht werden, eine gesteigerte Proliferationsfähigkeit zu zeigen oder sogar immortalisiert zu sein und in Kultur unbegrenzt erhalten zu bleiben. In einer Ausführungsform sind die Zellen Säugerzellen, wobei für viele Anwendungen menschliche Zellen bevorzugt sind. Zu den menschlichen Zellen, die immortalisiert werden können, gehören die in Auflistung 1 aufgezählten Zellen. 

 

  Natürlich können die nachstehend beschriebenen erfindungsgemässen "diagnostischen" Assays dazu verwendet werden, um die erfindungsgemässen immortalisierten Zellen zu identifizieren und zu charakterisieren. 


 Auflistung 1
 Menschliche Zellen, in denen die hTRT-Expression gesteigert werden kann 
 


 Hornbildende Epithel-Zellen 
 
 



  Keratinocyten der Epidermis (sich differenzierende Epidermiszellen)
 Basalzellen der Epidermis (Stammzellen)
 Keratinocyten der Fingernägel und Zehennägel 
 Basalzellen des Nagelbetts (Stammzellen)
 Zellen des Haarschafts
 medulläre, kortikale, kutikuläre Zellen; Zellen der Haarwurzelscheide, kutikuläre Zellen, Zellen der Huxley-Schicht, externe Zellen der Henle-Schicht; Haarkeimzellen (Stammzellen) 


 Zellen der feuchten mehrschichtigen Grenzepithele 
 
 



  Oberflächen-Epithelzellen des mehrschichtigen Plattenepithels der Zunge, der Mundhöhle, der Speiseröhre, des Analkanals, der distalen Harnröhre, der Vagina
 Basalzellen dieser Epithele (Stammzellen)
 Zellen des äusseren Hornhautepithels
 Zellen des Harnepithels (das die Blase und die Harnleiter auskleidet) 


 Epithelzellen, die auf die exokrine Sekretion spezialisiert sind 
 
 



  Zellen der Speicheldrüsen
 schleimsezernierende Zellen (Sekret reich an Polysacchariden)
 seröse Drüsenzellen (Sekret reich an Glycoproteinenzymen)
 Zellen der von Ebner-Drüsen in der Zunge (Sekret umspült die Geschmacksknospen)
 Zellen der Brustdrüse, sezernieren Milch
 Zellen der Tränendrüse, sezernieren Tränen
 Zellen der Zeruminaldrüse des Ohres, sezernieren Zerumen
 Zellen der ekkrinen Schweissdrüsen, sezernieren Glycoproteine (dunkle Zellen)
 Zellen der ekkrinen Schweissdrüsen, sezernieren kleine Moleküle (helle Zellen)
 Zellen der apokrinenSchweissdrüsen (Duftsekret, Geschlechtshormon-sensitiv)
 Zellen der Moll-Drüsen im Augenlid (spezialisierte Schweissdrüse)
 Zellen der Talgdrüsen, sezernieren Lipid-reiches Sebum
 Zellen der Bowman-Drüsen in der Nase (Sekret umspült das Riechepithel)
 Zellen der Brunner-Drüsen im Duodenum,

   sezernieren alkalische Lösung bestehend aus Schleim und Enzymen
 Zellen der Samenblase, sezernieren Bestandteile der Samenflüssigkeit einschliesslich Fructose (als Treibstoff für darin schwimmende Spermien) 
 Zellen der Vorsteherdrüse, sezernieren andere Bestandteile der Samenflüssigkeit
 Zellen der Bulbourethraldrüse, sezernieren Schleim
 Zellen der Bartholin-Drüse, sezernieren Vaginalsekret
 Zellen der Littré-Drüse, sezernieren Schleim
 Zellen der Uterusschleimhaut, sezernieren vornehmlich Kohlenhydrate
 isolierte Becherzellen des Atmungs- und Verdauungstrakts,
 sezernieren Schleim
 schleimsezernierende Zellen der Magenschleimhaut
 Hauptzellen der Magendrüsen, sezernieren Pepsinogen
 Parietalzellen der Magendrüsen, sezernieren HCl
 Acinuszellen der Bauchspeicheldrüse, sezernieren Verdauungsenzyme und Bicarbonat
 Paneth-Zellen des Dünndarms,

   sezernieren Lysozym
 Typ-II-Alveolarzellen der Lunge, sezernieren Surfactant Clara-Zellen der Lunge 


 Zellen, die auf die Sekretion von Hormonenspezialisiert sind 
 
 



  Zellen des Hypophysenvorderlappens, sezernieren Wachstumshormon, Follikel-stimulierendes Hormon, luteinisierendes Hormon, Prolactin, adrenocorticotropes Hormon und thyreotropes Hormon
 Zellen des Hypophysenmittellappens, sezernieren melanocytenstimulierendes Hormon
 Zellen des Hypophysenhinterlappens, sezernieren Oxytocin, Vasopressin
 Zellen des Intestinums, sezernieren Serotonin, Endorphin, Somatostatin, Gastrin, Sekretin, Cholecystokinin, Insulin und Glucagon
 Zellen der Schilddrüse, sezernieren Schilddrüsenhormon, Calcitonin
 Zellen der Nebenschilddrüse, sezernieren Parathormon, oxyphile Zellen
 Zellen der Nebenniere, sezernieren Epinephrin, Norepinephrin und Steroidhormone 
 Mineralocorticoide 
 Glucocorticoide
 Zellen der Gonaden, sezernieren Testosteron (Leydig-Zellen der Hoden) \strogen (innere Thekazellen des Eifollikels)

   Progesteron (Gelbkörperzellen des geborstenen Eifollikels)
 Zellen des juxtaglomerulären Apparats der Niere juxtaglomeruläre Zellen (sezernieren Renin) 
 Macula-densa-Zellen
 peripolare Zellen
 Mesangialzellen 


 Absorbierende Epithelzellen im Intestinum, den exokrinen Drüsen und dem Urogenitaltrakt 
 
 



  Bürstensaumzellen des Intestinums (mit Kleinzotten)
 mehrschichtige Ductuszellen exokriner Drüsen
 Gallenblasen-Epithelzellen 
 Bürstensaumzellen des proximalen Tubulus der Niere 
 distale Tubuluszellen der Niere 
 nicht-bewimperte Zellen des Ductulus efferens
 Nebenhoden-Hauptzellen
 Nebenhoden-Basalzellen 


 Auf Stoffwechsel und Speicherung spezialisierte Zellen 
 
 



  Hepatocyten (Leberzellen) 
 Fettzellen 
 weisse Fettzellen 
 braune Fettzellen 
 Lipocyten der Leber 


 Epithelzellen,die vornehmlich eine schützende Funktion haben und die die Lunge, das Intestinum, die exokrinen Drüsen und den Urogenitaltrakt auskleiden 
 
 



  Typ-I-Pneumocyten (kleiden den Luftraum der Lunge aus)
 Pankreasgangzellen (zentroazinäre Zellen)
 nicht-mehrschichtige Ductuszellen der Schweissdrüse, der Speicheldrüse, der Brustdrüse
 Parietalzellen des Nierenglomerulus
 Podocyten des Nierenglomerulus
 Zellen des dünnen Segments der Henle-Schleife (in der Niere)
 Sammelrohrzellen (in der Niere)
 Ductuszellen der Samenblase, Vorsteherdrüse 


 Epithelzellen, die geschlossene innere Körperhöhlen auskleiden 
 
 



  vasculäre Endothelzellen der Blutgefässe und der Lymphgefässe
 fenestrierte Zellen
 kontinuierliche Zellen
 Milzzellen
 Synovialzellen (kleiden die Gelenkhöhlen aus, sezernieren vornehmlich Hyaluronsäure)
 Serosazellen (kleiden die Peritoneal-, Pleura- und Perikardhöhle aus)
 Plattenepithelzellen, die den perilymphatischen Raum des Ohrs auskleiden
 Zellen, die den endolymphatischen Raum des Ohrs auskleiden
 Plattenepithelzellen
 hochprismatische Epithelzellen des Saccus endolymphaticus 
 mit Kleinzotten
 ohne Kleinzotten
 "dunkle" Zellen
 Zellen der Reissner-Membran (die den Zellen des Plexus choroideus ähneln)
 vaskuläre Stria-Basalzellen
 vaskuläre Stria-von-Ebner-Halbmond-Zellen
 Claudius-Zellen
 Böttcher-Zellen
 Plexus-choroideus-Zellen (sezernieren Gehirn- und Rückenmarksflüssigkeit)

  
 Plattenepithelzellen der weichen Hirn- und Rückenmarkshaut
 Ziliarepithelzellen des Auges
 pigmenthaltige Zellen  nicht-pigmenthaltige Zellen 
 Zellen des inneren Korneaepithels 


 Zilientragende Zellen mit propulsiver Funktion 
 
 



  des Atmungstrakts
 der Eileiter und der Gebärmutterschleimhaut (bei der Frau)
 des Haller-Netzes und des Ductulus efferens (beim Mann)
 des zentralen Nervensystems (Ependymzellen, die die Hirnhöhle auskleiden) 


 Zellen, die auf die Sekretion extrazellulärer matrix spezialisiert sind 
 
 



  Epithelzellen:
 Ameloblasten (sezernieren den Zahnschmelz)
 Ebner-Halbmondzellen des Gleichgewichtsorgans des Ohrs (sezernieren Proteoglycan) 
 Interdentalzellen des Corti-Organs (sezernieren Membrana tectoria, die die Haarzellen des Corti-Organs bedeckt)
 Nichtepithelzellen (Bindegewebe) 
 Fibroblasten (verschiedene Fibroblasten des lockeren Bindegewebes, der Kornea, der Sehnen, des retikulären Bindegewebes des Knochenmarks etc.) 
 Pericyten der Blutkapillaren 
 Nucleus-pulposus-Zellen der Bandscheibe
 Cementoblasten/Cementocyten (sezernieren knochenartigen Zementum der Zahnwurzel) 
 Odontoblasten/Odontocyten (sezernieren das Zahndentin)
 Chondrocyten 
 Hyalinknorpel, Faserknorpel, elastische Knorpel
 Osteoblasten/Osteocyten 
 Osteoprogenitorzellen (Stammzellen der osteoblasten)

   
 Hyalocyten des Glaskörpers des Auges Sternzellen deg perilymphatischen Raums des Ohres 


 Kontraktionsfähige Zellen 
 
 



  Skelettmuskelzellen 
 rote Zellen (langsam) 
 weisse Zellen (schnell) 
 intermediäre Zellen 
 Kernhaufenzellen der Muskelspindel 
 Kernkettenzellen der Muskelspindel 
 Satellitenzellen (Stammzellen) 
 Herzmuskelzellen 
 normale Zellen 
 Knotenzellen 
 Purkinje-Faserzellen 
 Zellen der glatten Muskulatur 
 Myoepithelzellen 
 der Iris 
 der exokrinen Drüsen 


 Zellen des Blut- und Immunsystems 
 
 



  rote Blutkörperchen 
 Megakaryocyten 
 Makrophagen 
 Monocyten 
 Makrophagen des Bindegewebes (verschiedene Arten)
 Langerhans-Zellen (in der Epidermis) 
 Osteoklasten (im Knochen) 
 dendritische Zellen (im Lymphgewebe) 
 Mikrogliazellen (im zentralen Nervensystem) 
 Neutrophile 
 Eosinophile 
 Basophile 
 Mastzellen 
 T-Lymphocyten 
 T-Helferzellen 
 T-Suppressorzellen 
 zytotoxische T-Zellen 
 B-Lymphocyten 
 Igm 
 IgG 
 IgA 
 IgE 
 Killerzellen 
 Stammzellen für das Blut- und Immunsystem (verschiedene Arten) 


 Sinneszellen 
 
 



  Photorezeptorzellen
 Stäbchenzellen
 Zapfenzellen
 blau-empfindliche Zellen
 grün-empfindliche Zellen
 rot-empfindliche Zellen
 Zellen des Hörorgans
 innere Haarzelle des Corti-Organs
 äussere Haarzelle des Corti-Organs
 Zellen zur Wahrnehmung von Beschleunigung und Schwerkraft
 Typ-I-Haarzellen des Gleichgewichtsorgans des Ohrs
 Typ-II-Haarzellen des Gleichgewichtsorgans des Ohrs
 Geschmackszellen
 Typ-II-Geschmacksknospenzellen
 Zellen zur Wahrnehmung von Gerüchen
 Riechneuronen
 Basalzellen des Riechepithels (Stammzellen für Riechneuronen)
 Zellen zur Bestimmung des pH-Wertes des Bluts Karotiskörperzellen
 Typ-I-Zellen
 Typ-II-Zellen
 Zellen zur Wahrnehmung von Berührungen
 Merkelzellen der Epidermis
 primäre sensible Neuronen, auf Wahrnehmung von Berührungen spezialisiert
 Zellen zur Wahrnehmung von Temperatur
 primäre sensible Neuronen,

   auf Wahrnehmung von Temperatur spezialisiert
 Kälte-empfindliche Zellen
 Wärme-empfindliche Zellen 
 Zellen zur Wahrnehmung von Schmerz 
 primäre sensible Neuronen, auf Wahrnehmung von Schmerz spezialisiert 
 Strukturen und Kräfte im Bewegungsapparat 
 proprioceptive primäre sensible Neuronen 


 Autonome Neuronen 
 
 



  cholinerge Neuronen
 adrenerge Neuronen 
 peptiderge Neuronen 


 Zellen, die die Sinnesorgane und die peripheren Neuronen unterstützen 
 
 



  Stützzellen des Corti-Organs 
 innere Pfeilerzellen 
 äussere Pfeilerzellen 
 innere Phalangealzellen 
 äussere Phalangealzellen 
 Grenzzellen 
 Hensen-Zellen 
 Stützzellen des Gleichgewichtsorgans
 Stützzellen der Geschmacksknospen (Typ-I-Geschmacksknospenzellen)
 Stützzellen des Riechepithels
 Schwann-Zellen
 Satellitenzellen (umschliessen die peripheren Nervenzellen)
 Darm-Gliazellen 


 Neuronen und Gliazellen des zentralen Nervensystems 
 
 



  Neuronen
 Gliazellen
 Astrocyten
 Oligodendrocyten 


 Zellen der Linse 
 
 



  Epithelzellen der Vorderlinse
 Linsenfaserzellen (Kristallin-enthaltende Zellen) 


 Pigmentzellen 
 
 



  Melanocyten 
 pigmenthaltige Epithelzellen der Netzhaut 


 Keimzellen 
 
 



  Oogonium,  Oocyten
 Spermatocyten
 Spermatogonium (Stammzellen für Spermatocyten) 


 Ammenzellen 
 
 



  Eifollikelzellen
 Sertolizellen (in den Hoden)
 Thymus-Epithelzellen 


 Stammzellen 
 
 



  embryonale Stammzellen 
 embryonale Keimzellen 
 Stammzellen des Erwachsenen 
 fötale Stammzellen 


 IX. Diagnostische Assays 
 


 A. Einführung 
 


 1)TRT-Assays 
 



  Die vorliegende Erfindung stellt eine grosse Anzahl von Assays für TRT, vorzugsweise hTRT, und Telomerase bereit. Diese Assays liefern unter anderem die Basis für empfindliche, preiswerte, leicht zu handhabende und in einem weiten Bereich anwendbare Assays für die Diagnose und Prognose einer Reihe von menschlichen Erkrankungen, zu denen als veranschaulichendes Beispiel Krebs zählt. Wie bereits vorstehend angemerkt, ist die Menge an hTRT-Genprodukten (Protein und mRNA) in unsterblichen menschlichen Zellen im Vergleich zu den meisten normalen sterblichen Zellen (d.h. Telomerase-negative Zellen und die meisten Telomerasepositiven normalen somatischen Zellen von Erwachsenen) gewöhnlich erhöht.

   Somit besteht ein Aspekt der Einfügung in der Bereitstellung von Assays, die zum Nachweis unter der Bestimmung der Anwesenheit, des Fehlens oder der Menge eines hTRT-Genprodukts in einer Probe, um so die Zellen als unsterblich (beispielsweise eine maligne Tumorzelle), sterblich (wie beispielsweise die meisten somatischen Zellen in Erwachsenen), als Telomerase-positiv oder Telomerase-negativ charakterisieren zu können, wobei die Probe von menschlichen oder anderen Säugerzellen oder eukaryotischen Zellen stammt oder diese enthält. 



  Jeder Zustand, der durch die Anwesenheit oder das Fehlen eines hTRT-Genprodukts (d.h. Protein oder RNA) gekennzeichnet ist, kann unter Verwendung der hier beschriebenen Verfahren und Substanzen diagnostiziert werden. Zu diesen gehören, so wie dies ausführlicher  nachstehend beschrieben wird, Krebserkrankungen, andere mit beschleunigter Zellproliferation einhergehende Erkrankungen, immunologische Funktionsstörungen, Fruchtbarkeit, Unfruchtbarkeit etc. Da das Ausmass, in dem Telomerase Aktivität in Krebszellen erhöht ist, mit den Merkmalen des Tumors, beispielsweise dem Potential zur Metastasenbildung, korreliert, kann durch Überwachung der hTRT-, mRNA- oder Protein-Spiegel die wahrscheinliche zukünftige Entwicklung eines Tumors abgeschätzt und vorhergesagt werden. 



  In einem Aspekt gehört zu den erfindungsgemässen diagnostischen und prognostischen Verfahren die Bestimmung, ob ein menschliches TRT-Genprodukt in einer biologischen Probe (z.B. von einem Patienten) vorhanden ist. Ein zweiter Aspekt betrifft die Bestimmung der Menge eines hTRT-Genprodukts in einer biologischen Probe (z.B. von einem Patienten) und den Vergleich mit der Menge in einer Kontrollprobe (z.B. normale Zellen oder Gewebe). Ein dritter Aspekt betrifft die Bestimmung der zellulären oder intrazellulären Lokalisierung eines hTRT-Genprodukts in einer Zell- oder Gewebeprobe.

   Ein vierter Aspekt betrifft die Untersuchung von Wirtszellen (z.B. eines Patienten) zur Identifizierung von Nucleinsäuren mit Sequenzen, die charakteristisch für eine vererbbare Neigung für eine anormale hTRT-Genexpression sind (anormale Menge, Regulation oder anormales Produkt), wobei dies von Nutzen ist beim genetischen Screenen oder bei einer genetischen Beratung. Ein fünfter Aspekt betrifft die Verwendung der erfindungsgemässen Assays zum Nachweis des Vorhandenseins von anti-hTRT-Antikörpern (z.B. in Patientenserum). Die ausführlicher nachstehend beschriebenen Verfahren stellen nützliche Assays dar, die unter Verwendung der hier beschriebenen Sequenzen und Zusammenhänge ausgeführt werden können. Für den Fachmann sind natürlich zahlreiche Variationen oder weitere Anwendungsmöglichkeiten dieser Assays offensichtlich. 



  Zwar sind die vorstehend beschriebenen Assays im Zusammenhang mit diagnostischen und prognostischen Verfahren beschrieben, sie können jedoch immer dann verwendet werden, wenn ein hTRT-Gen, Genprodukt oder eine Variante nachgewiesen, quantifiziert oder charakterisiert werden soll. Somit sind beispielsweise die nachstehend beschriebenen "diagnostischen" Verfahren zur Untersuchung von hTRT oder Telomerase während der Herstellung und Reinigung von hTRT oder menschlicher Telomerase, für die Charakterisierung von Zellinien, die von menschlichen Zellen stammen (z.B. zur Identifizierung unsterblicher Linien), für die Charakterisierung von Zellen, Tieren, Pflanzen, Pilzen, Bakterien oder anderen Organismen, die ein menschliches TRTGen oder Genprodukt (oder Fragmente davon) enthalten, von Nutzen. 



  Der hier verwendete Ausdruck "diagnostisch" besitzt seine normale Bedeutung, nämlich die Identifizierung der Anwesenheit oder der Natur der Erkrankung (beispielsweise Krebs), eines Zustands (z.B. unfruchtbar, aktiviert), eines Status (z.B. fruchtbar) und der Ausdruck "prognostisch" hat ebenfalls seine übliche Bedeutung, nämlich die Prognose der wahrscheinlichen Entwicklung und/oder des Ausgangs einer Erkrankung oder eines Zustands. Zwar werden diese beiden Bezeichnungen in einem klinischen Umfeld gelegentlich auf unterschiedliche Weise verwendet.

   Jeder der nachstehend beschriebenen Assays oder Assayformate im Bezug auf "Diagnose" ist gleichermassen geeignet für das Stellen einer Prognose, da es inzwischen klar ist, dass höhere Spiegel an Telomerase-Aktivität mit einer schlechteren Prognose für Krebspatienten in Zusammenhang stehen und da die vorliegende Erfindung Nachweisverfahren bereitstellt, die für hTRT spezifisch sind, das mit Konzentrationen exprimiert wird, die mit Telomerase-Aktivität in einer Zelle eng korrelieren. 


 2) Diagnose und Prognose von Krebs 
 



  Die Bestimmung eines hTRT-Gens-, -mRNA- oder- Protein-Spiegels der über dem normalen oder Standardbereich liegt, zeigt die Anwesenheit von Telomerase-positiven Zellen oder unsterblichen Zellen an, zu denen beispielsweise bestimmte Tumorzellen zählen. Da bestimmte embryonale und fötale Zellen sowie bestimmte "erwachsene" Stammzellen Telomerase exprimieren, stellt die vorliegende Erfindung auch Verfahren zur Bestimmung anderer Zustände wie z.B. Schwangerschaft, durch den Nachweis oder die Isolierung von Telomerase positiven fötalen Zellen aus dem Blut der Mutter. Diese Werte können dazu verwendet werden, eine Diagnose zu erstellen oder sie können bei der Erstellung einer Diagnose hilfreich sein, selbst wenn die Zellen unter Verwendung traditioneller Methoden nicht als krebsartig hätten klassifiziert werden oder anderweitig nachgewiesen oder klassifiziert werden können.

   Somit erlauben die erfindungsgemässen Verfahren den Nachweis oder die Verifikation von krebsartigen oder anderen Zuständen, die mit Telomerase assoziiert sind, mit erhöhter Zuverlässigkeit und möglicherweise in einem früheren Stadium. Die erfindungsgemässen Assays erlauben die Unterscheidung zwischen Klassen und Stadien von menschlichen Tumoren oder anderen mit der Zellproliferation in Zusammenhang stehenden Erkrankungen, dadurch, dass sie quantative Assays für das hTRT-Gen und    -Genprodukte bereitstellen und damit die Wahl geeigneter Behandlungsvorgehensweisen sowie genaue Diagnosen erleichtern. Da der Spiegel an Telomerase-Aktivität dazu verwendet werden kann, um zwischen gutartigen und malignen Tumoren zu unterscheiden (z.B. US-Patent Nr. 5 489 508 und Hiyama et al., Proc. Am Ass. Cancer Res. 38 (1997), 637), um das Bevorstehen einer Invasion vorherzusagen (z.B.

   US-Patent Nr. 5 639 613 und Yashima et al., Proc. Am. Ass. Cancer Res. 38 (1997), 326) und um eine Korrelation mit dem Potential zur Metastasenbildung herzustellen (z.B. US-Patent Nr. 5 648 215 und Pandita et al., Proc. Am Ass. Cancer Res. 37  (1996), 559), werden diese Assays darüber hinaus für die Prophylaxe, den Nachweis und die Behandlung einer grossen Anzahl von menschlichen Krebsarten von Nutzen sein. 



  Für die Prognose von Krebserkrankungen (oder anderer Erkrankungen oder Zustände, die durch eine erhöhte Telomerase-Konzentration gekennzeichnet sind) wird ein prognostischer Wert für ein hTRT-Genprodukt (mRNA oder Protein) oder die Aktivität für einen bestimmten Tumortyp, Tumorklasse oder ein Tumorstadium, wie nachstehend beschrieben, bestimmt. Der Spiegel an hTRT-Protein oder -mRNA oder Telomerase-Aktivität in einem Patienten, kann beispielsweise unter Verwendung der hier beschriebenen Assays bestimmt und mit dem prognostischen Spiegel verglichen werden. 



  In Abhängigkeit von dem verwendeten Assay wird in einigen Fällen die Häufigkeit eines hTRT-Genprodukts in einer Probe als erhöht angesehen werden, wann immer es durch den Assay nachweisbar ist. Aufgrund der geringen Menge von hTRT-mRNA und Protein selbst in Telomerase-positiven Zellen und der Seltenheit oder des Fehlens dieser Genprodukte in normalen oder Telomerase-negativen Zellen sind empfindliche Assays erforderlich, um nachweisen zu können, ob die hTRT-Genprodukte überhaupt in normalen Zellen vorhanden sind. Wenn weniger empfindliche Assays ausgewählt werden, werden zwar hTRT-Genprodukte in gesundem Gewebe nicht nachweisbar sein, jedoch in Telomerase-positivem Krebs- oder bei anderen Telomerase-positiven Zellen.

   Typischerweise beträgt die Menge eines hTRT-Genprodukts in einer Probe mit einer erhöhten Konzentration mindestens etwa das 5fache, häufiger mindestens etwa das 10fache, noch häufiger mindestens das 50fache und sehr oft mindestens das etwa 100 bis 1000fache im Vergleich zum Spiegel von Telomerase-negativen Kontrollzellen oder Zellen von gesunden Geweben eines Erwachsenen, wobei der Prozentsatz von Telomerase-positiv normalen Zellen sehr gering ist. 



  Die erfindungsgemässen diagnostischen und prognostischen Verfahren können bei jeder Zelle oder jedem Gewebetyp jeden Ursprungs verwendet werden und sie können zum Nachweis einer unsterblichen oder neoplastischen Zelle, eines Tumorgewebes oder eines Krebses jeden Ursprungs verwendet werden. Zu den Krebsarten, die nachgewiesen werden können, zählen, jedoch ohne Beschränkung darauf, all jene, die hinsichtlich der Diskussion der therapeutischen Anwendung von hTRT vorstehend aufgezählt wurden. 



  Die erfindungsgemässen Assays sind darüber hinaus zur Überwachung der Wirksamkeit einer therapeutischen Intervention in Patienten, die wegen eimer Krebserkrankung behandelt werden, von Nutzen. Zu den Behandlungen von Krebs, die überwacht werden können, gehören alle gegenwärtig empfohlenen Therapieformen (einschliesslich Chemotherapie, Bestrahlungstherapie und chirurgische Massnahmen) und dazu zählen auch zukünftige Behandlungen, beispielsweise die hier beschriebenen Therapien, die sich auf die Hemmung oder Aktivierung von Telomerase beziehen (siehe beispielsweise PCT-Veröffentlichung Nr. 96/01 835 und 96/40 868 und US-Patent Nr. 5 583 016; sowie auch US-Patentanmeldungen mit der Serien Nr. 08/472 802 und 08/482 115, die beide am 7. Juni 1995 eingereicht wurden; 08/521 634, eingereicht am 1. August 1995; 08/714 482, eingereicht am 16.

   September 1996 und 08/770 564 und 08/770 565, die beide am 20. Dezember 1996 eingereicht wurden, wobei all diese Dokumente aufgrund der Bezugnahme in ihrer Gesamtheit als Bestandteil dieser Beschreibung angesehen werden können). 



  In einem weiteren Aspekt sind die nachstehend beschriebenen Assays für den Nachweis bestimmter Variationen in der hTRT-Gensequenz (Mutationen und vererbbare hTRT-Allele) von Nutzen, die eine Prädisposition für Krebserkrankungen oder andere Zustände anzeigt, die mit einer anormalen Regulation  der Telomerase-Aktivität assoziiert sind (Unfruchtbarkeit, vorzeitiges Altern). 


 3) Diagnose von Zuständen, bei denen es sich nicht um Krebs handelt 
 



  Zusätzlich zu der Diagnose von Krebserkrankungen haben die erfindungsgemässen Assays zahlreiche weitere Anwendungsmöglichkeiten. Die vorliegende Erfindung stellt Reagenzien und Verfahren zur Diagnose von Zuständen oder Erkrankungen bereit, die durch eine Unter- oder Überexpression von Telomerase oder hTRT-Genprodukten in Zellen charakterisiert sind. In Erwachsenen wird ein niedriger Spiegel an Telomerase-Aktivität normalerweise bei einer begrenzten Art von normalen menschlichen somatischen Zellen gefunden, beispielsweise Stammzellen, aktivierten Lymphocyten und Keimzellen. Die Telomerase-Aktivität fehlt bei anderen somatischen Zellen.

   Somit ist der Nachweis von hTRT oder Telomerase-Aktivität in Zellen, in denen diese normalerweise fehlen oder inaktiv sind, oder der Nachweis eines anormalen Spiegels (d.h. eines höheren oder niedrigeren im Vergleich zum normalen) in Zellen, in denen hTRT normalerweise nur mit einem niedrigen Spiegel vorhanden ist (wie beispielsweise Stammzellen, aktivierte Lymphocyten und Keimzellen) ein diagnostisches Anzeichen für eine mit Telomerase in Zusammenhang stehende Erkrankung oder einen Zustand. Dieser Nachweis kann auch zur Identifizierung oder Isolierung spezifischer Zelltypen verwendet werden. Zu den Beispielen für solche Erkrankungen und Zustände gehören: Erkrankungen bezüglich der Zellproliferation, immunologische Funktionsstörungen, Unfruchtbarkeit, Erkrankungen hinsichtlich der Immunzellfunktion, Schwangerschaft, fötale Anormalität, vorzeitige Alterung etc.

   Darüber hinaus sind die erfindungsgemässen Assays zur Überwachung der Wirksamkeit einer therapeutischen Intervention (wozu, ohne Beschränkung darauf, Wirkstoffe gehören, die Telomerase-Aktivität modulieren) bei einem Patienten oder in einem Assay, der auf  Zellen oder einem Tier basiert. Ein Aspekt der Erfindung betrifft die Bereitstellung von Assays, die zur Diagnose von Unfruchtbarkeit von Nutzen sind. Menschliche Keimzellen (z.B. Stammsamenzellen, Vorläufer oder Nachkommen) können unbegrenzt proliferieren und sind durch eine hohe Telomerase-Aktivität gekennzeichnet. Anormale oder verringerte Spiegel an hTRT-Genprodukten oder anormale Produkte können zu einer unzulänglichen oder anormalen Produktion von Spermatozoen führen, was zu Unfruchtbarkeit oder Funktionsstörungen hinsichtlich der Reproduktion führt.

   Somit stellt die Erfindung Assays (Verfahren und Reagenzien) zur Diagnose und Behandlung von auf "Telomerase-basierenden" Funktionsstörungen bezüglich der Produktion bereit. Bei einer ähnlichen Anwendung können die Assays zur Überwachung der Wirksamkeit von Empfängnisverhütungsmitteln (z.B. Empfängnisverhütungsmittel für Männer bzw. männliche Tiere) verwendet werden, die gegen die Spermaproduktion als Ziel gerichtet sind oder diese indirekt beeinflussen (und die den hTRT-Spiegel oder Telomerase-Aktivität reduzieren sollen). 



  Ein weiterer Aspekt der Erfindung webe oder Tumor entnommen. Es kann gelegentlich wünschenswert sein, eine biologische Probe für die spätere Analyse einzufrieren (z.B. wenn die Wirksamkeit von Behandlungen mit Wirkstoffen überwacht wird). 



  In einigen Fällen können die Zellen oder Gewebe vor der Analyse fraktioniert werden. Beispielsweise kann bei einer Gewebebiopsie von einem Patienten ein Zellsortierer (z.B. ein Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierer) verwendet werden, um Zellen nach Merkmalen, wie beispielsweise der Expression  eines Oberflächenantigens (z.B. eines tumorspezifischen Antigens) gemäss allgemein bekannter Verfahren zu sortieren. 



  Zwar wird die Probe üblicherweise von einem menschlichen Patienten oder Zellinie entnommen, die Assays können jedoch auch zum Nachweis von homologen hTRT-Genen oder entsprechenden Genprodukten in Proben von Tieren verwendet werden. Alternativ können hTRT-Gene und -Genprodukte in transgenen Tieren oder Organismen, die ein menschliches TRT-Protein oder entsprechende Nucleinsäuresequenz exprimieren, untersucht werden. 



  Die Probe kann, falls nötig, durch Verdünnung in einer geeigneten Pufferlösung vorbehandelt werden oder konzentriert werden, falls dies erwünscht ist. Es kann eine Reihe von wässrigen Standardpufferlösungen bei physiologischem pH-Wert verwendet werden, wobei eine Reihe von Puffern angewandt werden kann, beispielsweise Phosphat, Tris-Puffer etc. 



  Der Ausdruck "biologische Probe", die von einem Patienten erhalten wurde, kann entweder als "biologische Probe" oder "Patientenprobe" bezeichnet werden. Bei einer Analyse einer "Patientenprobe" müssen nicht unbedingt Zellen oder Gewebe von dem Patienten entnommen werden. Beispielsweise können geeignet markierte hTRT-bindende Agenzien (z.B. Antikörper oder Nucleinsäuren) in den Patienten injiziert und (nach Bindung an das Ziel) unter Verwendung von Standard-Bildgebungstechniken (z.B. CAT, NMR etc.) sichtbar gemacht werden. 


 E) Nucleinsäure-Assays 
 



  In einer Ausführungsform stellt die Erfindung Verfahren zum Nachweis und/oder der Quantifizierung der Expression von hTRT-mRNAs (einschliesslich Spleiss-Varianten oder Sequenzvarianten und alternative Allele) bereit. In einer  alternativen Ausführungsform stellt die Erfindung Verfahren zum Nachweis und der Analyse normaler oder anormaler hTRT-Gene (oder eines Fragmentsdavon) bereit. Zu den Formaten solcher qualitativer oder quantitativer Assays gehören, allerdings ohne Beschränkung darauf, auf Amplifikation basierende Assays mit oder ohne Signalamplifikation, auf Hybridisierung basierende Assays und auf der Kombination Amplifikation/Hybridisierung basierende Assays.

   Es ist für den Fachmann offensichtlich, dass die Unterscheidung zwischen Hybridisierung und Amplifikation nur aus Zweckmässigkeitsgründen durchgeführt wird: Wie in den nachstehenden Beispielen veranschaulicht, beinhalten viele Assayformate sowohl Elemente der Hybridisierung als auch Amplifikation, so dass in einigen Fällen die Kategorisierung etwas willkürlich ist. 


 1) Herstellung von Nucleinsäuren 
 



  In einigen Ausführungsformen werden Nucleinsäure-Assays mit einer Nucleinsäureprobe, die aus der zu untersuchenden Zelle, oder Zellinie oder dem zu untersuchenden Gewebe oder Organismus isoliert wurde. Die Nucleinsäure (z.B. genomische DNA, RNA oder cDNA) kann aus einer Probe gemäss einer Reihe von dem Fachmann bekannten Verfahren "isoliert" werden. In diesem Zusammenhang bezieht sich der Ausdruck "isoliert" auf jede Abtrennung der Spezies oder des Ziels, das nachgewiesen werden soll, von jeder anderen Substanz in dem Gemisch, dies bezeichnet jedoch nicht unbedingt einen wesentlichen Reinheitsgrad des Ziels. Es ist für den Fachmann offensichtlich, dass bei dem Nachweis von Änderungen in der Kopienanzahl des hTRT-Gens das nachzuweisende Ziel genomische DNA ist. 

   Umgekehrt ist in einem auf einer Nucleinsäure basierenden Assay RNA das nachzuweisende Ziel, wenn Expressionsspiegel eines Gens oder von Genen nachgewiesen werden sollen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Nucleinsäureprobe Gesamt-mRNA (d.h. poly(A)<+>RNA) in einer biologischen Probe. Verfahren zur  Isolierung von Nucleinsäuren sind dem Fachmann gut bekannt und beispielsweise beschrieben in Tijssen, P. (Herausg.) in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology:  Hybridization With Nucleic Acid Probes, Part I. Theory and Nucleic Acid Preparation, Elsevier, N.Y. (1993), Kapitel 3, wobei dieses Dokument durch Bezugnahme als Bestandteil dieser Beschreibung anzusehen ist.

   In einer Ausführungsform wird Gesamt-Nucleinsäure aus einer Probe unter Verwendung eines sauren Guanidin/Phenol/Chloroform-Extraktionsverfahrens isoliert und poly(A)<+>mRNA durch oligo-dT-Säulenchromatographie oder durch die Verwendung von magnetischen (dT)n Kügelchen (siehe z.B. Sambrook et al., und Ausubel et al., a.a.O.). 



  In alternativen Ausführungsformen ist die Isolation von Nucleinsäuren (z.B. Gesamt-RNA oder poly-A<+>RNA) aus der biologischen Probe vor der Durchführung von Amplikation, Hybridisierung oder anderen Assays nicht erforderlich. Diese Ausführungsformen haben bestimmte Vorteile im Fall, dass hTRT-RNA gemessen werden soll, da sie die Wahrscheinlichkeit verringern, dass hTRT-mRNA während der Isolation und der Handhabung verlorengeht. Beispielsweise können viele Amplifikationsverfahren, wie beispielsweise PCR und RT-PCR (reverse Transkriptase-PCR) unter Verwendung permeabilisierter Zellen (histologische Proben und FACS-Analysen) lysierter Gesamtzellen oder hoher Zellfraktionen, wie beispielsweise bestimmter Zellextrakte, durchgeführt werden.

   Vorzugsweise werden Schritte unternommen, um die Integrität der Zielnucleinsäure (z.B. mRNA), falls erforderlich, zu bewahren (z.B. durch Zugabe von RNAase-Inhibitoren). Amplifikations- und Hybridisierungs-Assays können auch in situ durchgeführt werden, beispielsweise in dünnen Gewebeabschnitten einer Biopsieprobe oder einer einlagigen Zellschicht (z.B. Blutzellen oder von einander getrennte Zellen einer Gewebekultur). Die Amplifikation kann auch in intakten ganzen Zellen oder fixierten Zellen durchgeführt werden.

   Beispielsweise können PCR-, RT-PCR-,  oder LCR-Amplifikationsverfahren, so wie dies auf dem Fachgebiet bekannt ist, in situ durchgeführt werden, beispielsweise unter Verwendung einer Polymerase oder Ligase, eines Primers oder von Primern und (Desoxy)-Ribonucleosid-Triphosphaten (wenn eine Polymerase verwendet wird) und reverser Transkriptase und einem Primer (wenn RNA transkribiert und die cDNA nachgewiesen werden soll) an fixierten, permeabilisierten oder mikroinjizierten Zellen, um so die Ziel-hTRT-RNA oder -DNA zu amplifizieren. hTRT-RNA enthaltende Zellen (z.B. Telomerase-positive Zellen) oder eine gewünschte hTRT-DNA-Sequenz können dann nachgewiesen werden.

   Dieses Verfahren ist oft dann zweckmässig, wenn Fluoreszenz-markierte dNTPs, Primer oder andere Bestandteile in Verbindung mit Mikroskopie, einer FACS-Analyse oder äquivalenten Verfahren verwendet werden. 


 2) Auf Amplifikation basierende Assays 
 



  In einer Ausführungsform sind die erfindungsgemässen Assays zum Nachweis eines hTRT-Gens oder -Genprodukts auf Amplifikation basierende Assays. In einem auf Amplifikation basierenden Assay wird ein gesamtes hTRT-Gen oder -Transkript oder ein Teil davon (z.B. mRNA oder cDNA, nachstehend als "Ziel" bezeichnet) amplifiziert und das amplifizierte Produkt wird anschliessend direkt oder indirekt nachgewiesen. Falls kein Gen oder Genprodukt vorhanden ist, das als Matrize wirken kann, wird kein Amplifikationsprodukt hergestellt (z.B. mit der erwarteten Grösse) oder die Amplifikation ist unspezifisch und es entsteht üblicherweise kein einzelnes Amplifikationsprodukt. Im Gegensatz dazu wird die Zielsequenz amplifiziert, wenn das fragliche Gen oder Genprodukt vorhanden ist, was somit die Anwesenheit und/oder die Menge an entsprechendem Gen oder an entsprechender mRNA anzeigt.

   Auf Amplifikation basierende Assays sind dem Fachmann gut bekannt. 



  Die vorliegende Erfindung stellt eine grosse Vielzahl an Primern und Sonden zum Nachweis von hTRT-Genen und Genprodukten bereit. Solche Primer und Proben sind zu dem hTRT-Gen oder Genprodukt ausreichend komplementär, um an die Zielnucleinsäure hybridisieren zu können. Primer weisen üblicherweise eine Länge von mindestens 6 Basen auf, vorzugsweise von etwa 10 bis etwa 100 Basen, mehr bevorzugt von etwa 12 bis etwa 50 Basen und am meisten bevorzugt zwischen etwa 14 und etwa 25 Basen. Der Fachmann wird nach Lesen dieser Beschreibung in der Lage sein, unter Verwendung von Routineverfahren Primer auszuwählen, mit denen das gesamte hTRT-Gen oder -Genprodukt oder ein Anteil davon amplifiziert werden kann oder mit denen zwischen Genprodukt-Varianten, hTRT-Allelen etc. unterschieden werden kann.

   In Tabelle 2 sind Beispiele von Primern aufgezählt, die für eine PCR-Amplifikation der hTRT oder spezifischer hTRT-Genprodukte oder -Bereiche von Nutzen sind. Es ist auf dem Fachgebiet bekannt, dass einzelne Oligomere (siehe beispielsweise US-Patent Nr. 5 545 522) "nested sets" von Oligomeren oder sogar ein Pool von degenerierten Oligomeren für die Amplifikation verwendet werden kann, beispielsweise, wie dies für die nachstehend beschriebene Amplifikation der Tetrahymena TRT-cDNA veranschaulicht wird. 



  Die Erfindung stellt eine Vielzahl von Verfahren zur Amplifikation und zum Nachweis eines hTRT-Gens oder -Genprodukts bereit. Dazu gehören die Polymerase-Kettenreaktion (einschliesslich aller Varianten, beispielsweise die Reverse-Transkriptase-PCR; das "Sunrise Amplification System" (Oncor, Inc., Gaithersburg MD) und zahlreiche weitere auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren.

   In einer veranschaulichenden Ausführung wird die PCR-Amplifikation in einer Lösung von 50  mu l durchgeführt, die die Nucleinsäureprobe enthält (z.B. eine durch reverse Transkription von hTRT-RNA erhaltene cDNA), jeweils 100  mu M dNTP (dATP, dCTP, dGTP und dTTP; Pharmacia LKB Biotechnology, NJ) der (die) hTRT-spezifischen PCR-Primer, 1  Einheit Taq-Polymerase (Perkin Elmer, Norwalk CT), 1 x PCR-Puffer (50 mM KCl, 10 mM Tris, pH-Wert 8,3 bei Raumtemperatur, 1,5 mM M9Cl2 und 0,01% Gelatine), wobei die Amplifikation mit etwa 30 Cyclen durchgeführt wird, jeweils 45 Sekunden bei 94 DEG C, 45 Sekunden bei 45 DEG C und 90 Sekunden bei 72 DEG C. Es können jedoch natürlich für bestimmte Reaktionen zur Optimierung der PCR-Amplifikation zahlreiche Variationen eingeführt werden. 



  Zu weiteren geeigneten Zielamplifikationsverfahren gehören die Ligase-Kettenreaktion (LCR) (siehe z.B. Wu und Wallace, Genomics 4 (1989), 560; Landegren etal., Science 241 (1988), 1077, Barany, Proc. Natl. Acad. Sci. USA88 (1991), 189 und Barringer et al., Gene 89 (1990), 117), die Strangverdrängungs-Amplifikation (SDA) (siehe z.B. Walter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA89 (1992) 392-396); die Transkriptions-Amplifikation (siehe z.B. Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 1173), "self-sustained-sequence"-Replikation (3SR) (siehe z.B. Fahyet al., PCR Methods Appl. 1 (1992) 2 und Guatelli et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 87 (1990) 1874); die Nucleinsäuresequenz basierte Amplifikation (NASBA, Cangene, Mississauga, Ontario; siehe z.B.

   Compton, Nature 350 (1991) 91); das Transkriptions-basierte Amplifikationssystem (TAS); und das "self-sustained-sequence"-Replikationssystem (SSR). Jede der vorstehenden Veröffentlichungen ist aufgrund der Bezugnahme als Bestandteil dieser Beschreibung anzusehen. Eine zweckmässige PCR-Variante ist der PCR-ELISA (z.B. Boehringer Mannheim Kat. Nr. 1 636 111), wobei Digoxigenin-dUTP in das PCR-Produkt eingebaut wird. Das PCR-Reaktionsgemisch wird denaturiert und mit einem Biotin-markierten Oligonucleotid hybridisiert, das so entworfen wurde, dass es an eine interne Sequenz des PCR-Produkts binden kann. Die Hybridisierungsprodukte werden an mit Streptavid in überzogenen Trägern immobilisiert und unter Verwendung von anti-Digoxigenin-Antikörpern nachgewiesen.

   Beispiele für in vitro-Amplifikationsverfahren, die dem Fachmann ausreichend  Anleitung geben, können in folgenden Veröffentlichungen gefunden werden: PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H. Erlich (Herausg.) Freeman Press, New York, NY (1992); PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Herausg. Innis, Gelfland, Snisky, und White, Academic Press, San Diego, CA (1990); Mattila et al., Nucleic Acids Res. 19 (1991), 4967; Eckert und Kunkel, PCR Methods and Applications 1 (1991), 17; PCR, Herausg. McPherson, Quirkes und Taylor, IRL Press, Oxford; U.S.Patent Nr. 4 683 195, 4 683 202 und 4 965 188; Barringer et al., Gene 89 (1990), 117; Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 1173; Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990) 1874; Lomell et al., J. Clin. Chem. 35 (1989), 1826.

   Jedes dieser Dokumente ist durch Bezugnahme als Bestandteil dieser Beschreibung anzusehen. 



  Amplifizierte Produkte können direkt analysiert werden (z.B. anhand der durch Gelelektrophorese bestimmten Grösse), durch Hybridisierung an einer Zielnucleinsäure, die an einem festen Träger immobilisiert ist, beispielsweise einem Kügelchen, einer Membran, einer Scheibe oder einem Chip; durch Sequenzierung; immunologisch (z.B. durch PCR-ELISA), durch Nachweis eines fluoreszierenden phosphoreszierenden oder radioaktiven Signals oder durch eine Reihe weiterer allgemein bekannter Massnahmen.

   In einem veranschaulichenden Beispiel für ein Nachweisverfahren werden beispielsweise PCR-Primer verwendet, die mit Hilfe von Haarnadelschleifen ("hairpin loops") vergrössert wurden, die mit Fluorescein verknüpft sind und einem Benzoesäure-Derivat, das als quenchende Verbindung dient, so dass nur dann eine Fluoreszenz emittiert wird, wenn sich die Primer zur Bindung ihrer Ziele entfalten und Replikation stattfindet. 



  Da hTRT-mRNA normalerweise als ein äusserst seltenes Transkript exprimiert wird, das selbst in Telomerasepositiven Zellen nur in sehr niedrigen Konzentrationen vorhanden ist, ist es oft wünschenswert, das durch einen  Amplifikationsschritt erhaltene Signal zu optimieren oder zu verstärken. Eine Möglichkeit dafür besteht in der Erhöhung der Anzahl von Amplifikationszyklen. Beispielsweise sind zwar 20 bis 25 Cyclen für die Amplifikation der meisten mRNAs mittels der Polymerasekettenreaktion unter Standardreaktionsbedingungen ausreichend, der Nachweis von hTRT-mRNA kann jedoch in vielen Proben in Abhängigkeit von dem Nachweisformat 30 bis 35 Amplifikationszyklen benötigen.

   Durch sorgfältige Auswahl der Amplifikationsbedingung einschliesslich der Anzahl von Amplifikationszyklen kann ein Assay entworfen werden, der nur dann zu einem Amplifikationsprodukt führt, wenn eine Schwellenwertmenge des Ziels in der Testprobe vorhanden ist (d.h. so dass nur Proben mit einem hohen Spiegel an hTRT-mRNA ein "positives" Ergebnis zeigen). Darüber hinaus sind Verfahren bekannt, um das durch Amplifikation der Zielsequenz erzeugte Signal zu verstärken. Zu den Verfahren zur Verbesserung der Fähigkeit ein amplifiziertes Ziel nachzuweisen, gehören Signalamplifikationssysteme, beispielsweise: Signalamplifikation mit verzweigter DNA "branched DNA signal amplification" (s. z.B.

   US-Patent Nr. 5 124 246 und Urdea, Bio/Tech. 12 (1994), 926); das "tyramide"-Signalamplifikationssystem (TSA, DuPont); Amplifikation mit einem katalytischen Signal ("catalytic signal amplification" (CSA) (Dako); Q Beta-Replicase-Systeme (Tyagi et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 93 (1996), 5395) etc. 



  Es ist für den Fachmann offensichtlich, dass unabhängig von dem verwendeten Amplifikationsverfahren eine Vielzahl von auf dem Fachgebiet bekannten quantitativen Verfahren zur Quantifizierung verwendet werden kann, falls dies erwünscht ist. Beispielsweise können, falls erwünscht, zwei oder mehr Polynucleotide in einer einzigen Probe gemeinsam amplifiziert werden. Dieses Verfahren kann als ein zweckmässiges Verfahren zur Quantifizierung der hTRT-mRNA-Menge in einer Probe verwendet werden, da sowohl die reverse Transkription als auch Amplifikationsreaktionen im gleichen  Reaktionsgemisch für ein Ziel- und Kontroll-Polynucleotid durchgeführt werden.

   Die gemeinsame Amplifikation mit dem Kontrollpolynucleotid (das normalerweise in einer bekannten Konzentration oder einer bekannten Kopienanzahl vorhanden ist) kann zur Normalisierung der Anzahl von Zellen in der Probe im Vergleich zu der Menge an hTRT in der Probe verwendet werden. Zu den geeigneten Kontroll-Polynucleotiden für Coamplifikationsreaktionen gehören DNA von "housekeeping"-Genen exprimierte RNA, konstitutiv exprimierte Gene und in vitro synthetisierte RNAs oder DNAs, die zu dem Reaktionsgemisch gegeben werden. Zu den endogenen Kontroll-Polynucleotiden zählen solche, die bereits in der Probe vorhanden sind, während exogene Kontroll-Polynucleotide einer Probe zugegeben werden, wodurch eine Reaktion "mit Schuss" ("spiked") erzeugt wird.

   Zu den Beispielen für Kontroll-RNAs zählen  beta -Actin-RNA, GAPDH RNA, snRNAs, hTR und endogen exprimierte 28S rRNA (siehe Khan et al., Neuro sci. Lett. 147 (1992), 114. Zu exogenen Kontroll-Polynucleotiden gehören eine synthetische AW106-cRNA, die von pAW106 als "sense"-Strang mittels T7-Polymerase synthetisiert werden kann. Damit das Coamplifikationsverfahren für eine Quantifizierung verwendet werden kann, müssen sowohl die Kontroll-Nucleotide als auch die Ziel-Polynucleotide üblicherweise in einem linearen Bereich amplifiziert werden. Ausführliche Protokolle für eine quantitative PCR können gefunden werden in PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Innis et al., Academic Press, Inc. N.Y. (1990) und Ausubelet al., a.a.O. (Einheit 15) und Diaco, R. (1995) Practical Considerations for the Design of Quantitative PCR Assays, in PCR Strategies, S. 84-108, Innis et al.

   Herausg. Academic Press, New York. 



  In Abhängigkeit von der Sequenz des endogenen oder exogenen Standards können unterschiedliche Primersätze für die Coamplifikationsreaktion verwendet werden. Bei einem Verfahren, der sogenannten kompetitiven Amplifikation,  beinhaltet die quantitative PCR die gleichzeitige Coamplifikation mit einer bekannten Menge einer Kontrollsequenz, wobei die gleichen Primer, die für die Zielnucleinsäure verwendet werden, benutzt werden (ein Paar mit zwei Primern). In einer alternativen Ausführungsform, die als nicht-kompetitive Amplifikation bekannt ist, werden die Kontrollsequenz und die Zielsequenz (z.B. hTRT-cDNA) unter Verwendung unterschiedlicher Primer (d.h. 2 Paare von 2 Primern) amplifiziert.

   In einer weiteren alternativen Ausführungsform, der sogenannten semi-kompetitiven Amplifikation, werden drei Primer verwendet, wobei einer hTRT-spezifisch, einer kontroll-spezifisch und einer in der Lage ist, sich sowohl an Zielsequenzen als auch Kontrollsequenzen anzulagern. Semi-kompetitive Amplifikation wird in dem US-Patent Nr. 5 629 154 beschrieben, das hiermit durch Bezugnahme als Bestandteil dieser Beschreibung angesehen werden kann. 


 3) Auf Hybridisierung basierende Assays 
 


 a) Allgemeines 
 



  Eine Vielzahl von Verfahren für die spezifische Messung von DNA und RNA mit Hilfe von Nucleinsäure-Hybridisierungsverfahren sind dem Fachmann bekannt (siehe Sambrook et al., a.a.O.). Auf Hybridisierung basierende Assays betreffen Assays, bei denen eine Nucleinsäuresonde an eine Zielnucleinsäure hybridisiert wird. Üblicherweise sind die erfindungsgemässen Nucleinsäure-Hybridisierungssonden vollständig oder im wesentlichen identisch zu einer zusammenhängenden Sequenz des hTRT-Gens oder der entsprechenden RNA-Sequenz. Vorzugsweise sind die Nucleinsäuresonden mindestens etwa 10 Basen lang, mehr bevorzugt mindestens etwa 20 Basen und am meisten bevorzugt etwa 200 Basen oder länger. Verfahren zur Auswahl von Nucleinsäuresondensequenzen zur Verwendung bei der Nucleinsäurehybridisierung werden in Sambrook et al., a.a.O.  diskutiert.

   In einigen Formaten sind entweder das Ziel oder die Sonde oder beide immobilisiert. Bei der immobilisierten Nucleinsäure kann es sich um eine DNA, RNA oder ein anderes Oligo- oder Polynucleotid handeln. Diese können natürlich oder nicht natürlich vorkommende Nucleotide, Nucleotidanaloga oder Rückgrate umfassen. Solche Assays können in verschiedenen Formaten verwendet werden, beispielsweise: Southern, Northern "dot" und "slot" Blots, Polynucleotid- oder Oligonucleotid-Arrays mit hoher Dichte (z.B. GeneChipsÖAffymetrix), Messstäbchen, Messnadeln ("pins"), Chips oder Kügelchen. All diese Verfahren sind auf dem Fachgebiet allgemein bekannt und sie stellen die Basis vieler im Handel erhältlicher diagnostischer Kits dar. Hybridisierungstechniken werden allgemein beschrieben in Hames et al., Herausg.

   Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach IRL Press (1985); Gall und Pardue, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 63 (1969), 378-383und John et al., Nature, 223 (1969) 582-587. 



  Dem Fachmann sind eine Vielzahl von Formaten für die Nucleinsäurehybridisierung bekannt. Beispielsweise stellt die direkte Hybridisierung ein übliches Format dar, wobei eine Zielnucleinsäure mit einer markierten komplementären Sonde hybridisiert wird. Gewöhnlich werden markierte Nucleinsäuren für die Hybridisierung verwendet, wobei die Markierung das nachweisbare Signal liefert. Ein Verfahren zur Beurteilung der Anwesenheit, des Fehlens oder der Menge an hTRT-mRNA besteht in der Durchführung eines Northern-Transfers von RNA aus einer Probe und der Hybridisierung mit einer markierten hTRT-spezifischen Nucleinsäuresonde, so wie dies in Beispiel 2 veranschaulicht ist. Wie bereits vorstehend angemerkt, ist hTRT-mRNA, wenn überhaupt, in den meisten Zellen nur in sehr geringen Mengen vorhanden.

   Somit ist es bei der Verwendung einer Northern-Hybridisierung oft wünschenswert, einen Amplifikationsschritt oder alternativ grosse Mengen an Ausgangs-RNA zu verwenden. Ein zweckmässiges Verfahren zur Beurteilung der Anwesenheit, des Fehlens oder  der Menge von hTRT-Proteine codierender DNA in einer Probe umfasst einen Southern-Transfer von DNA aus einer Probe und die Hybridisierung mit einer markierten hTRT-spezifischen Nucleinsäuresonde. 



  Zu weiteren üblichen Hybridisierungsformaten gehören "Sandwich"-Assays und Kompetitions- oder Verdrängungs-Assays. Bei den "Sandwich"-Assays handelt es sich um im Handel erhältliche zweckmässige Hybridisierungsassays zum Nachweis und zur Isolierung von Nucleinsäuresequenzen. In solchen Assays werden eine "Einfang"-Nucleinsäure, die kovalent an einen festen Träger immobilisiert ist, und eine markierte "Signal"-Nucleinsäure in Lösung verwendet. Die biologische oder klinische Probe liefert die Zielnucleinsäure. Die "Einfang"-Nucleinsäure- und die "Signal"-Nucleinsäuresonde hybridisieren mit der Zielnucleinsäure, wobei ein "Sandwich"-Hybridisierungskomplex gebildet wird. Für die Wirksamkeit ist es erforderlich, dass die Signalnucleinsäure mit der "Einfang"-Nucleinsäure hybridisieren kann. 


 b) Auf einem Chip und auf einer Scheibe basierende Assays 
 



  Die vorliegende Erfindung stellt ferner auf einer Sonde basierende Hybridisierungsassays für hTRT-Genprodukte bereit, wobei Arrays von immobilisierten Oligonucleotiden oder Oligonucleotiden verwendet werden, an die eine hTRT-Nucleinsäure hybridisieren kann (d.h. an einige, jedoch normalerweise nicht an alle, oder nicht einmal an die meisten der immobilisierten Oligo- oder Polynucleotide). Oligonucleotid-Arrays mit hoher Dichte oder Polynucleotid-Arrays stellen ein Mittel für den effizienten Nachweis des Vorhandenseins und der Merkmale (z.B. der Sequenz) einer Zielnucleinsäure (z.B. ein hTRT-Gen,       -mRNA oder -cDNA) dar.

   Es sind Techniken bekannt, mit denen sich Arrays herstellen lassen, die Tausende von zu definierten Sequenzen komplementäre Oligonucleotide an definierten Positionen auf  einer Oberfläche enthalten, wobei für die Synthese in situ photolithographische Verfahren verwendet werden (siehe z.B. US-Patent Nr.5 578 832, 5 556 752 und 5 510 270; F odor et al., Science 251 (1991), 767; Pease et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994), 5022 und Lockhart et al., Nature Biotech 14 (1996); 1675) oder andere Verfahren zur schnellen Synthese und Anlagerung von definierten Oligonucleotiden (Blanchard etal., Biosensors & Bioelectronics 11 (1996), 687). Bei Anwendung dieser Verfahren werden Oligonucleotide (z.B. 20-mere) mit bekannter Sequenz direkt auf einer Oberfläche, beispielsweise auf einer Scheibe mit derivatisiertem Glas synthetisiert.

   Normalerweise ist das hergestellte Array redundant mit einigen Oligonucleotidsonden auf dem Chip, die für das nachzuweisendeh TRT-Polynucleotid spezifisch sind. 



  Kombinationen von Oligonucleotidsonden können so entworfen werden, dass alternativ gespleisste mRNAs nachgewiesen werden können oder um festzustellen, welches von verschiedenen hTRT-Allelen in einer bestimmten Probe exprimiert wird. 



  In einer veranschaulichenden Ausführungsform wird durch reverse Transkription von Gesamt-RNA von einer Testzelle präparierte cDNA amplifiziert (z.B. mittels PCR). Normalerweise ist das amplifizierte Produkt markiert, beispielsweise durch Einbau eines fluoreszenzmarkierten dNTPs. Die markierten cDNAs werden dann mit einem Chip hybridisiert, der Oligonucleotidsonden umfasst, die zu verschiedenen Untersequenzen des hTRT-Gens komplementär sind. Die Hybridisierungspositionen werden bestimmt (z.B. gemäss den allgemeinen Verfahren von Shalon et al., Genome Research 6 (1996), 639 oder Schena et al., Genome Res. 6 (1996) 639) und aus dem Hybridisierungsmuster die Sequenz (oder eine andere Information) durch auf diesem Fachgebiet gut bekannte Verfahren abgeleitet. 



  In einer Ausführungsform werden zwei cDNA-Proben mit dem gleichen Chip hybridisiert, wobei jede mit einer unterschiedlichen Fluoreszenzgruppe markiert ist. Das Verhältnis der Hybridisierung jeder markierten Probe zu Stellen, die komplementär zu dem hTRT-Gen sind, wird dann untersucht. Falls beide Proben die gleiche Menge an hTRT-mRNA enthalten, beträgt das Verhältnis der beiden Fluoreszenzsignale 1:1. Dabei muss das Signal der Fluoreszenzen nicht so eingestellt werden, dass jedem Unterschied in der molaren Empfindlichkeit der Fluoreszenzsignale Rechnung getragen wird. 



  Im Gegensatz dazu wird das in der zweiten Probe verwendete Fluoreszenzsignal vorherrschen, falls die erste Probe von einem gesunden (oder Kontroll)-Gewebe stammt, und die zweite Probe von einem kanzerösen Gewebe. 


 c) In situ-Hybridisierung 
 



  Ein alternatives Verfahren zum Nachweis der Expression eines ein hTRT-Protein codierenden Gens ist in situ-Hybridisierung. In situ-Hybridisierungsassays sind gut bekannt und allgemein beschrieben in Angerer et al., Methods Enzymol. 152 (1987), 649-660 und Ausubel et al., a.a.O. In einem in situ-Hybridisierungsassay sind Zellen oder Gewebeproben an einem festen Träger fixiert, der sich typischerweise in einem permeabilisierten Zustand befindet, typischerweise auf einer Glasscheibe. Die Zellen werden dann mit einer Hybridisierungslösung bei einer moderaten Temperatur hybridisiert, um so die Anlagerung von markierten Nucleinsäuresonden zu gestatten (z.B. <3><5>S-markierte Ribosonden, Fluoreszenz-markierte Sonden), die komplementär oder im wesentlichen komplementär zu hTRT sind.

   Freie Sonde wird durch Waschen und/oder Spaltung mit Nuclease entfernt und die gebundene Sonde wird direkt auf der Scheibe durch Autoradiographie oder ein geeignetes bildgebendes Verfahren,  sowie dies auf dem Fachgebiet bekannt ist, sichtbar gemacht. 


 4) Spezifischer Nachweis von Varianten 
 



  Wie bereits vorstehend angemerkt und in den Beispielen (z.B. Beispiel 9) veranschaulicht, können Amplifikations-Primer oder -Sonden ausgewählt werden, um Amplifikationsprodukte zu liefern, die spezifische Deletion, Verkürzungen und Insertionen umspannen, wodurch der Nachweis von spezifischen Varianten oder Anormalitäten in der hTRT-mRNA erleichtert wird. Ein Beispiel eines Genprodukts einer hTRT-Variante, das nachgewiesen werden kann, ist eine hTRT-RNA, wie beispielsweise ein vorstehend und in Beispiel 9 beschriebenes Produkt (SEQ. ID. Nr. 4). Die biologische Funktion der 182-Variante(n) ist nicht bekannt, falls überhaupt eine vorhanden ist.

   Das von der Variante vermutlich codierte verkürzte hTRT-Protein könnte jedoch an einer Regulation von Telomerase-Aktivität beteiligt sein, beispielsweise durch Assemblierung eines nicht-funktionellen Telomerase-RNPs, der Telomerase-Bestandteile titriert. Alternativ könnte- eine negative Regulation von Telomerase-Aktivität durch Steuerung der hTRT-prä-mRNA (naszierende mRNA) auf eine Weise erzielt werden, die zu einer Eliminierung der mRNA und der Herabsetzung des hTRT-mRNA-Spiegels führt. Aus diesen und weiteren Gründen ist die Möglichkeit 182-Varianten entdecken zu können von Nutzen. Zusätzlich mag es gelegentlich wünschenswert sein, in Proben, in denen zwei Spezies von hTRT-RNA vorhanden sind (z.B. eine 182-hTRT-RNA und eine das hTRT-Protein mit vollständiger Länge codierende hTRT-RNA), deren relative und/oder absolute Häufigkeit zu vergleichen. 



  Die Erfindung stellt eine Vielzahl von Verfahren zum Nachweis von 182-Varianten bereit. Beispielsweise führt eine Amplifikation unter Verwendung von Primerpaaren, die die 182-Basenpaardeletion umspannen, zu Produkten  unterschiedlicher Grösse, die den deletierten und undeletierten hTRT-RNAs (falls beide vorhanden sind) entsprechen und diese können auf Grund ihrer Grösse (z.B. durch Gelelektrophorese) unterschieden werden. Zu den Beispielen für Primerpaare, die zur Amplifikation des Bereichs" der die 182 bp-Deletion umspannt, nützlich sind, gehören TCP1.14 und TCP1.15 (Primersatz 1) oder TCP1.25 und bTCP6 (Primersatz 2) (siehe Tabelle 2). Diese Primerpaare können getrennt verwendet werden oder in einem PCR-Experiment mit "nested"-Primern, wobei der Primersatz 1 zuerst benutzt wird. Es ist für den Fachmann auch offensichtlich, dass Hybridisierungsverfahren (z.B.

   NorthernHybridisierung) oder RNAse-Schutzassays zum Nachweis von hTRT-RNA-Varianten oder um solche Varianten unterscheiden zu können, unter Verwendung der erfindungsgemässen hTRTNucleinsäuresonde verwendet werden können. 



  Ein weiteres geeignetes Verfahren umfasst PCR-Amplifikation (oder ein äquivalentes Verfahren)mit drei Primern. Ein Primer ist spezifisch zu jeder hTRT-RNA-Spezies (z.B. wie in Tabelle 4 veranschaulicht) und ein Primer ist komplementär zu beiden Spezies (z.B. TCP1.25 (2270-2288)) - analog zu dem semi-kompetitiven quantitativen PCR-Verfahren, das ausführlicher vorstehend beschrieben ist. Ein Beispiel eines Primers, der spezifisch zu SEQ. ID.Nr. 1 ist, ist ein Primer, der sich innerhalb der Sequenz von 182 Nucleotiden (d.h. Nucleotide 2345 bis 2526 von SEQ. ID. Nr. 1) anlagert, z.B. TCP1.73 (2465-2445). Ein Primer, der zu SEQ. ID. Nr. 4 (eine  DELTA 182-Variante) spezifisch ist, ist beispielsweise ein Primer, der an die Nucleotide 2358-2339 von SEQ. ID. Nr. 4 anlagert (d.h. der Stelle, die der Insertion von 182 Nucleotiden in SEQ. ID. Nr. 1 entspricht).

   Die absolute Häufigkeit der  DELTA 182-hTRT-mRNA-Spezies oder deren relative Häufigkeit im Vergleich zu der Spezies, die das hTRT-Protein mit vollständiger Länge codiert, kann bezüglich einer Korrelation mit dem Zellstatus (z.B. der Fähigkeit zur unbegrenzten Proliferation) analysiert werden. Zahlreiche  weitere Primer können ausgehend von der vorliegenden Beschreibung ausgewählt werden. 
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  Zu der weiteren hTRT-Genen von Varianten oder den entsprechenden Genprodukten, die nachgewiesen werden können, gehören solche, die durch Codons, die zu einem vorzeitigen Stop führen, Deletionen, Substitutionen oder Insertionen charakterisiert sind. Deletionen können anhand der verringerten Grösse des Gens, des mRNA-Transkripts oder der cDNA nachgewiesen werden. Auf ähnliche Weise können Insertionen anhand der gesteigerten Grösse des Gens, des mRNA-Transkripts oder der cDNA nachgewiesen werden. Insertionen und Deletionen können auch eine Verschiebung des Leserahmens hervorrufen, was zur Entstehung von Codons für einen frühzeitigen Stop oder längerer offener Leserahmen führt. Substitutionen können durch Hybridisierung mit einer Sonde nachgewiesen werden.

   Diese Veränderungen werden dadurch nachgewiesen, dass Veränderungen der Grösse der hTRT-Polypeptid-Variante untersucht werden (z.B. durch Western-Analyse) oder durch Hybridisierung oder spezifische Amplifikation, je nach dem, wie es zweckmässig erscheint. Alternativ können Mutationen durch Sequenzierung des Gens oder des Genprodukts gemäss Standardverfahren bestimmt werden. Darüber hinaus und wie bereits vorstehend angemerkt, können Amplifikationsassays und Hybridisierungssonden ausgewählt werden, um auf bestimmte Anormalitäten spezifisch  abzielen zu können. Beispielsweise können Nucleinsäuresonden oder Amplifikationsprimer ausgewählt werden, die spezifisch mit der Region hybridisieren, die die Deletion, Substitution oder Insertion enthält bzw. diese spezifisch amplifiziert. 

   An der Stelle, wo das hTRT-Gen eine solche Mutation enthält (1) hybridisiert die Sonde entweder nicht, oder die Amplifikationsreaktion liefert keine spezifische Amplifikation oder wird zu einer Veränderung der Grösse des Amplifikationsprodukts oder des Hybridisierungssignals führen; oder (2) die Sonde oder Amplifikationsreaktion umfasst die gesamte Deletion oder beide Enden der Deletion (Deletionsverbindungspunkt) oder (3) ähnlicherweise können Sonden und Amplifikationsprimer ausgewählt werden, die spezifisch auf Punktmutationen oder Insertionen abzielen. 


 5) Nachweis von HTRT-Mutantenallelen 
 



  Mutationen im hTRT-Gen könnten für die Entstehung einer Erkrankung verantwortlich sein oder könnten zu einem Krankheitszustand beitragen. Veränderungen der genomischen DNA von hTRT könnten die Spiegel der Gentranskription beeinflussen, zu Veränderungen von Aminosäureresten im hTRT-Protein führen, dazu führen, dass verkürzte hTRT-Polypeptide hergestellt werden, die Prozessierungswege der prä-mRNA ändern (was die hTRT-mRNA-Spiegel verändern kann) und auch weitere Konsequenzen zur Folge haben. 



  Änderungen der genomischen DNA in Nicht-hTRT-Loci können auch die Expression von hTRT oder Telomerase durch Veränderung der Enzyme oder zellulären Prozesse beeinflussen, die für die Regulation der Expression von hTRT, hTR und Telomerase-assoziierten Proteinen verantwortlich sind, sowie für die Prozessierung und die RNP-Assemblierung und den Transport. Änderungen, die die hTRT-Expression, die Prozessierung oder RNP-Assemblierung betrefffen, könnten auch für den Verlauf einer  Krebserkrankung, für Alterserkrankungen, für Krankheiten hinsichtlich eines DNA-Schadens etc. wichtig sein. 



  Der Nachweis von Mutationen in hTRT-mRNA oder dem entsprechenden Gen und Genkontrollelementen kann auf vielfältige Weise gemäss den hier beschriebenen Verfahren durchgeführt werden. Dazu gehören folgende veranschaulichende Beispiele: Es kann ein Verfahren, das als "Primer-Screening" bezeichnet wird, verwendet werden; es werden PCR-Primer entworfen, deren 3 min -Enden sich an Nucleotide in einer Proben-DNA (oder RNA), die möglicherweise mutiert sind, anlagern. Falls die DNA (oder RNA) durch die Primer amplifiziert wird, paaren die 3 min -Enden mit den Nucleotiden im Gen, falls die DNA nicht amplifiziert wird, dann paaren entweder eines oder beide Enden nicht mit den Nucleotiden im Gen, was die Anwesenheit einer Mutation anzeigt.

   Auf ähnliche Weise können Primer so entworfen werden, dass Punktmutationen unter Verwendung der Ligase-Kettenreaktion (LCR, vorstehend beschrieben) nachgewiesen werden können. Eine weitere Technik, die bei dem vorliegenden Verfahren angewandt werden kann, basiert auf Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus, RFLP (Pourzand, C., Cerutti, P. Mutat. Res. 288 (1993), 113-121). Dabei wird ein Southern-Blot menschlicher genomischer DNA, die mit verschiedenen Restriktionsenzymen gespalten wurde, mit einer hTRT-spezifischen Sonde hybridisiert. Unterschiede hinsichtlich der Fragmentanzahl oder Fragmentgrössen zwischen der Probe und einer Kontrolle zeigen eine Veränderung der experimentellen Probe an, normalerweise eine Insertion oder Deletion.

   Einzelstrang-Konformationspolymorphismus, SSCP, (Orrita, M. et. al., PNAS USA 86 (1989), 2766-70) ist eine weitere Technik, die für das vorliegende Verfahren angewandt werden kann. SSCP basiert auf der unterschiedlichen Wanderung von denaturierten einzelsträngigen DNAs des Wildtyps bzw. einer Mutante (die normalerweise durch PCR erzeugt wurden). Einzelsträngige DNA nimmt eine dreidimensionale Konformation ein, die sequenzspezifisch  ist. Auch Sequenzunterschiede, die lediglich eine einzelne Base betreffen, können zu einer Mobilitätsverschiebung in einem nicht-denaturierenden Gel führen. SSCP ist aufgrund seiner Einfachheit eines der am häufigsten verwendeten Verfahren zum Mutations-Screenen.

   Eine weitere Technik, die bei dem vorliegenden Verfahren angewandt werden kann, ist die denaturierende Gradientengelelektrophorese, DGGE (Myers et al., Methods in Enzymology 155 (1987), 501-527). Mittels DGGE können Mutationen aufgrund des Schmelzverhaltens doppelsträngiger DNA identifiziert werden. Zur Analyse des Schmelzprofils von experimenteller DNA und Kontroll-DNA wird eine spezielle Ausrüstung für denaturierende Elektrophorese verwendet: Eine eine Mutation enthaltende DNA besitzt eine unterschiedliche Mobilität in diesen Gelsystemen im Vergleich zur Kontrolle. Die diskutierten Beispiele veranschaulichen allgemein angewandte Verfahren, darüber hinaus gibt es zahlreiche andere Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind. 


 F. Analyse des Karyotyps 
 



  Die vorliegende Erfindung stellt ferner Verfahren und Reagenzien zur Analyse des Karyotyps oder für andere Chromosomen-Analysen bereit, wobei hTRT-Sequenzsonden verwendet werden und/oder der Nachweis oder die Lokalisierung von hTRT-Gensequenzen in Chromosomen eines Patienten, einer menschlichen Zellinie oder einer nichtmenschlichen Zelle. In einer Ausführungsform kann die Amplifikation (d.h. eine Veränderung in der Kopienanzahl), Deletion (d.h. partielle Deletion), Insertion, Substitution oder Veränderungen in der chromosomalen Lokalisierung (z.B. Translokation) eines hTRT-Gens mit dem Vorhandensein eines pathologischen Zustands oder einer Prädisposition für die Entwicklung eines pathologischen Zustands (z.B. Krebs) korreliert sein. 



  Es wurde in der vorliegenden Erfindung festgestellt, dass in normalen menschlichen Zellen das hTRT-Gen nahe dem Telomer von Chromosom 5p kartiert (siehe das nachstehende Beispiel 5). Der am nächsten benachbarte STS-Marker ist D5S678. Dessen Lage kann zur Identifizierung von Markern verwendet werden, die mit dem hTRT-Gen eng gekoppelt sind. Diese Marker können zur Identifizierung von YACs, STSs, Cosmiden, BACs, lambda-Phagen oder P1-Phagen oder anderen Clonen verwendet werden, die genomische hTRT-Sequenzen oder -Kontrollelemente enthalten. Die Marker oder die Lage des Gens können verwendet werden, um menschliche Gewebeproben hinsichtlich Veränderungen in der normalen Lage des hTRT Gens, dessen Organisation oder Sequenz, die mit dem Auftreten eines Krebstyps oder einer Krankheit assoziiert sind, zu untersuchen.

   Diese Information kann dann für die Diagnose oder Prognose hinsichtlich der beteiligten Krankheit oder des Krebses verwendet werden. Darüber hinaus kann die Art jeder Veränderung des hTRT-Gens eine Information über die Ursachen liefern, durch die Zellen unsterblich werden. Beispielsweise könnte ein Translokationsereignis anzeigen, dass die Aktivierung der hTRT-Expression in manchen Fällen durch Austausch des hTRT-Promotors gegen einen anderen Promotor geschieht, der die hTRT-Transkription auf ungünstige Weise steuert. Erfindungsgemässe Verfahren und Reagenzien dieses Typs können zur Entwicklung von Strategien verwendet werden, mit denen hTRT-Aktivierungsprozesse bekämpft werden können.

   Die Lage ist auch für die Bestimmung der Natur der hTRT-Genrepression in normalen somatischen Zellen von Nutzen, beispielsweise bei der Untersuchung, ob die Lage innerhalb eines Teils von nicht-exprimierendem Heterochromatin ist. Assays, die auf einer Nuclease-Überempfindlichkeit basieren, zur Unterscheidung zwischen Heterochromatin und Euchromatin sind beispielsweise beschrieben in Wu et al., Cell 16 (1979), 797; Groudine und Weintraub, Cell 30 (1982), 131 und Gross und Garrard, Ann. Rev. Biochem. 57 (1988), 159. 



  In einer Ausführungsform werden Veränderungen des hTRT-Gens durch Analyse des Karyotyps identifiziert, wobei zahlreiche auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren verwendet werden können. Ein zweckmässiges Verfahren ist die in situ-Hybridisierung (ISH). Wenn in situ-Hybridisierungsverfahren für die Karyotyp-Analyse verwendet werden, wird normalerweise eine nachweisbare oder nachweisbar markierte Probe mit einer chromosomalen Probe in situ zur Lokalisierung einer hTRT-Gensequenz hybridisiert. Im allgemeinen umfasst ISH einen oder mehrere der folgenden Schritte: (1) Fixierung des Gewebes, der Zelle oder der anderen zu analysierenden biologischen Struktur; (2) Vorhybridisierungsbehandlung der biologischen Struktur zur Steigerung der Zugänglichkeit der Ziel-DNA (z.B.

   Denaturierung mit Hitze oder Alkali) und zur Verringerung einer unspezifischen Bindung (z.B. durch Blockierung des Hybridisierungsvermögens repetitiver Sequenzen (z.B. mittels menschlicher genomischer DNA); (3) Hybridisierung von einer oder mehreren Nucleinsäuresonden (z.B. übliche Nucleinsäuren, PNAs oder andere Nucleinsäure-Analoge) mit der Nucleinsäure in der biologischen Struktur oder dem Gewebe; (4) Waschschritte nach der Hybridisierung zur Entfernung von Nucleinsäurefragmenten, die während der Hybridisierung nicht gebunden waren und (5) Nachweis der hybridisierten Nucleinsäurefragmente. Die in jedem dieser Schritte verwendeten Reagenzien und anzuwendenden Bedingungen hängen von der jeweiligen Anwendung ab. Natürlich können diese Schritte auf vielfältige Weise modifiziert werden, wie dies dem Fachmann bekannt ist. 



  In einer Ausführungsform der ISH wird die hTRT-Sonde mit einem Fluoreszenzmarker markiert (in situ Fluoreszenzhybridisierung; "FISH"). Normalerweise ist es wünschenswert, eine "zwei-Farben"-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung anzuwenden, bei denen zwei mit einem unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoff markierte Sonden verwendet werden. Eine Testsonde, die mit der gewünschten  hTRT-Sequenz hybridisiert, wird mit einem Farbstoff markiert, und eine Kontrollsonde, die mit einem anderen Bereich hybridisiert wird, wird mit einem zweiten Farbstoff markiert. Als Kontrollsonde kann eine Nucleinsäure verwendet werden, die mit einem stabilen Bereich des gewünschten Chromosoms, beispielsweise dem Zentromerbereich, hybridisiert. Auf diese Weise kann Unterschieden in der Effizienz der Hybridisierung, die von Probe zu Probe schwanken kann, Rechnung getragen werden. 



  Die ISH-Verfahren zum Nachweis chromosomaler Anomalien (z.B. FISH) können an Nanogrammengen der fraglichen Nucleinsäuren durchgeführt werden. Es können in Paraffin eingebettete normale Gewebe oder Tumorsektionen verwendet werden, aber auch frisches oder gefrorenes Material, Gewebe oder Sektionen. Da FISH bei diesem begrenzten Material angewandt werden kann, können auch Präparationen von nichtkultivierten primären Tumoren, die nur in Spuren hergestellt werden können ("touch"-Präparationen) verwendet werden (siehe z.B. Kallioniemi et al., Cytogenet. Cell Genet. 60 (1992) 190). Beispielsweise können kleine Biopsie-Gewebeproben von Tumoren für "touch"-Präparationen verwendet werden (siehe z.B. Kallioniemi et al., a.a.O.). Es können auch kleine Anzahlen von Zellen analysiert werden, die durch Saugbiopsie erhalten wurden oder Zellen in Körperflüssigkeiten (z.B.

   Blut, Urin, Sputum etc.) analysiert werden. Für eine pränatale Diagnose zählen Amnionflüssigkeit, Blut der Mütter etc. zu den geeigneten Proben. Zweckmässige für die hier beschriebenen Verfahren und Reagenzien anwendbare Hybridisierungsprotokolle sind beschrieben in Pinkel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 9138; EP-A1 0 430 402; Choo (Herausg. Methods in Molecular Biology Vol. 33: In Situ Hybridization Protocols, Humana Press-Totowa, New Jersey (1994) und Kallioniemi et al., a.a.O. 



  Zu weiteren für die Karyotyp-Analyse nützlichen Verfahren zählen beispielsweise Verfahren wie quantitatives Southern-Blotting, quantitative PCR oder vergleichende genomische Hybridisierung (Kallioniemi et al., Science 258 (1992), 818), wobei die erfindungsgemässen hTRT-Sonden und -Primer zur Identifikation einer Amplifikation, Deletion, Insertion, Substitution von hTRT-Sequenzen in Chromosomen in einer biologischen Probe oder andere Rearrangements von hTRT-Sequenzen verwendet werden können. 


 G. TRT-Polypeptid-Assays 
 


 1) Allgemeines 
 



  Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren und Reagenzien zum Nachweis und zur Quantifizierung von hTRT-Polypeptidenbereit. Zu diesen Verfahren zählen analytische biochemische Verfahren, beispielsweise Elektrophorese, Massenspektroskopie, "Gelshift", Kapillarelektrophorese, chromatographische Verfahren, beispielsweise Grössenausschluss, Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC), (TLC), Hyperdiffusionschromatographie etc., oder verschiedene immunologische Verfahren, beispielsweise Flüssigkeits- oder Gel-Präzipitin-Reaktion, Immundiffusion (Einzel- oder Doppel-), Immunelektrophorese, Radioimmunassay (RIA), enzymverbundene Immunabsorptionsbestimmungen (ELISAs), Immunfluoreszenz-Assays, Western-Blotting, Massenspektrometrie und weitere Verfahren, die nachstehend beschrieben werden und für den Fachmann nach Lesen dieser Beschreibung offensichtlich sind.

   


 2) Elektrophoretische Assays 
 



  In einer Ausführungsform werden die hTRT-Polypeptide durch elektrophoretische Proteinauftrennung nachgewiesen. Ein Aspekt betrifft ein zweidimensionales Elektrophoresesystem. 



  Mittel zum Nachweis von Proteinen unter Verwendung von Elektrophoreseverfahren sind dem Fachmann gut bekannt (siehe allgemein R. Scopes (1982) Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y.; Deutscher, Methods in Enzymology Vol. 182 (1990): Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc., N.Y.). 



  In einer ähnlichen Ausführungsform wird ein "mobility shift"-Assay verwendet (siehe z.B. Ausubel et al., a.a.O.). Beispielsweise assoziiert markierte hTR mit hTRT und wandert mit veränderter Mobilität bei der Elektrophorese in einem nicht-denaturierten Polyacrylamidgel etc. Somit führt beispielsweise dann, wenn eine markierte hTR-Sonde oder ein markierter Telomerase-Primer mit einer hTRT enthaltenden Probe vermischt wird oder mit hTRT coexprimiert wird, (z.B. in einem zellfreien Expressionssystem) das Vorhandensein von hTRT-Protein (oder eines hTRT codierenden Polynucleotids) in der Probe zu einer nachweisbaren Änderung der hTRT-Mobilität. 


 3) Immunassays 
 


 A) Allgemeines 
 



  Die vorliegende Erfindung stellt auch Verfahren zum Nachweis von hTRT-Polypeptiden bereit, wobei eine oder mehrere erfindungsgemässe Antikörperreagenzien verwendet werden (d.h. Immunassays). Wie hier verwendet, bezeichnet ein Immunassay einen Assay, bei dem ein Antikörper (wie hier ausführlich definiert gehören dazu auch Fragmente, chimäre und andere bindende Agenzien) verwendet wird, der spezifisch an ein hTRT-Polypeptid oder -Epitop bindet. Erfindungsgemässe Antikörper können durch eine Vielzahl von dem Fachmann bekannten Verfahren, beispielsweise den vorstehend beschriebenen, hergestellt werden. 



  Es ist eine Anzahl von gut etablierten immunologischen Bindungs-Assayformaten bekannt, die für die Durchführung der Erfindung geeignet sind (siehe z.B. US-Patente 4 366 241, 4 376 110, 4 517 288 und 4 837 168 und Methods in Cell Biology Volume 37: Antibodies in Cell Biology, Asai, Herausg. Academic Press, Inc. New York (1993); Basic and Clinical Immunology, 7. Ausgabe, Stites & Terr Herausg. (1991) Harlow und Lane, a.a.O.) z.B. Kapitel 14) und Ausubel et al., a.a.O. (z.B. Kapitel 11), wobei jedes dieser Dokumente durch Bezugnahme in seiner Gesamtheit und für alle Zwecke als Bestandteil dieser Beschreibung angesehen werden kann. Typischerweise wird in immunologischen Bindungsassays (oder Immunassays) ein "Einfang"-Agens zur spezifischen Bindung an den Analyten und oft auch dessen Immobilisierung verwendet.

   In einer Ausführungsform ist das "Einfang"-Agens eine Einheit, die an ein hTRT-Polypeptid oder eine Untersequenz spezifisch bindet, beispielsweise ein antihTRT-Antikörper. In einer alternativen Ausführungsform kann das "Einfang"-Agens unter solchen Bedingungen an hTRT assoziiertes Protein oder -RNA binden, bei denen das hTRT-assoziierte Molekül an die hTRT gebunden bleibt (so dass, falls das hTRT-assoziierte Molekül immobilisiert ist, das hTRT-Protein ähnlich immobilisiert ist). In Assays, bei denen ein hTRT-assoziiertes Molekül eingefangen wird, wird normalerweise das assoziierte hTRT-Protein, beispielsweise mittels eines anti-hTRT-Antikörpers oder ähnlichem nachgewiesen werden. Immunassays zum Nachweis von Proteinkomplexen sind auf dem Fachgebiet bekannt (siehe z.B. Harlow und Lane, a.a.O., S. 583). 



  Normalerweise wird das zu untersuchenden hTRT-Genprodukt direkt oder indirekt mittels einer nachweisbaren Markierung nachgewiesen. Die in dem Assay verwendete spezielle Markierung bzw. die nachweisbare Gruppe ist normalerweise kein kritischer Aspekt der Erfindung solange diese nicht die spezifische Bindung des in dem Assay verwendeten Antikörpers oder den Antikörper wesentlich stört.

   Die Markierung kann  mit dem "Einfang"-Agens kovalent verknüpft sein (z.B. ein anti-TRT-Antikörper) oder er kann an eine dritte Einheit angeknüpft sein, beispielsweise einem anderen Antikörper, der beispielsweise an das hTRT-Polypeptid spezifisch bindet (an ein anderes Epitop als das, das von dem "Einfang"-Agens erkannt wird, das "Einfang"-Agens (z.B. ein anti-(erster Antikörper) Immunglobulin); ein anti-TRT-Antikörper; ein Antikörper, der an einen anti-TRT-Antikörper bindet oder ein Antikörper/Telomerase-Komplex (z.B. über die Bindung an ein assoziiertes Molekül, beispielsweise ein Telomeraseassoziiertes Protein). Andere Proteine, die an dem in dem Assay verwendeten Antikörper binden können, z.B. Protein A oder Protein G, können auch markiert sein.

   In einigen Ausführungsformen kann es zweckmässig sein, mehr als ein markiertes Molekül zu verwenden (d.h. solche, die voneinander unterschieden werden können). Zusätzlich kann ein markierter Antikörper, der das Protein oder die RNA, die mit dem hTRT-Protein assoziiert ist, erkennt, verwendet werden, wenn das durch das "Einfang"-Agens (z.B. ein anti-hTRT-Antikörper) gebundene (beispielsweise immobilisierte) Ziel ein Komplex ist (d.h. ein Komplex aus hTRT und einem TRT-assoziierten Protein, hTR oder einem anderen TRT-assoziierten Molekül. Wenn es sich bei dem Komplex um einen Protein/Nucleinsäure-Komplex (z.B. TRT-hTR) handelt, kann das Reportermolekül ein Polynucleotid oder ein anderes Molekül (z.B. ein Enzym) sein, das die RNA-Komponente des Komplexes erkennt. 



  Bei einigen Immunassayformaten ist die Verwendung von markierten Bestandteilen nicht erforderlich. Beispielsweise können Agglutinationsassays zum Nachweis des Vorhandenseins der Ziel-Antikörper verwendet werden. In diesem Fall werden Antigen-geschichtete Partikel durch die Zielantikörper enthaltenden Proben agglutiniert. Bei diesem Assay-Format müssen die Bestandteile nicht markiert sein und die Anwesenheit des Ziel-Antikörpers kann durch einfache visuelle Überprüfung nachgewiesen werden. 


 b) Nicht-kompetitive Assayformate 
 



  Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren und Reagenzien für kompetitive und nicht-kompetitive Immunassays zum Nachweis von hTRT-Polypeptiden bereit. Bei nichtkompetitiven Immunassays handelt es sich um Assays, bei denen die Menge des eingefangenen Analyten (in diesem Fall hTRT) direkt gemessen wird. Ein Beispiel für einen solchen Assay ist ein auf monoclonalen Antikörpern basierender "twosite"-Immunassay, bei dem monoclonale Antikörper verwendet werden, die mit zwei nicht-interferierenden Epitopen auf dem hTRT-Protein reaktionsfähig sind. Siehe beispielsweise Maddox et al, i. Exp. Med. 158 (1983), 1211 bezüglich Hintergrundinformation. In einem bevorzugten "Sandwich"-Assay wird das "Einfang"-Agens (z.B. ein anti-TRT-Antikörper) direkt an ein festes Substrat gebunden, wo es immobilisiert wird.

   Diese immobilisierten Antikörper fangen dann jedes in der Testprobe vorhandene hTRT-Protein ein. Das so immobilisierte hTRT kann dann markiert werden, d.h. durch Bindung an einen zweiten, eine Markierung tragenden anti-hTRT-Antikörper. In einer alternativen Ausführungsform kann der zweite anti-hTRT-Antikörper zwar keine Markierung aufweisen, jedoch durch einen markierten dritten Antikörper gebunden werden, der spezifisch für Antikörper der Spezies ist, von der der zweite Antikörper stammt. In einer weiteren alternativen Ausführungsform kann der zweite Antikörper mit einer nachweisbaren Einheit modifiziert sein, beispielsweise Biotin, die ein drittes markiertes Molekül spezifisch binden kann, beispielsweise Enzym-markiertes Streptavidin. 


 c) Kompetitive Assayformate 
 



  In kompetitiven Assays wird die Menge des in einer Probe vorhandenen hTRT-Proteins indirekt durch Messung der Menge an zugegebenen (exogenen) hTRT bestimmt, das durch das in der Probe vorhandene hTRT-Protein von einem "Einfang"-Agens (z.B. einem anti-TRT-Antikörper) verdrängt, oder wegkompetitiert wurde. In einem dieser kompetitiven Assays wird eine bekannte Menge eines markierten hTRT-Proteins zu der Probe gegeben und danach die Probe mit einem "Einfang"-Agens (z.B. einem Antikörper, der hTRT-Protein spezifisch bindet) in Kontakt gebracht. Die Menge an exogenem (markiertem) an dem Antikörper gebundenem hTRT-Protein ist umgekehrt proportional zu der Konzentration an in der Probe vorhandenem hTRT-Protein. In einer Ausführungsform ist der Antikörper auf einem festen Substrat immobilisiert.

   Die Menge an hTRT-Protein, das an den Antikörper gebunden ist, kann entweder durch Messung der Menge an hTRT-Protein, die in einem TRT-Antikörper-Komplex vorhanden ist, bestimmt werden oder alternativ durch Bestimmung der Menge an übrigbleibendem nicht-komplexierten TRT-Protein. Die Menge an hTRT-Protein kann durch die Bereitstellung eines markierten hTRT-Moleküls nachgewiesen werden. 



  Ein Hapten-Hemmungsassay stellt ein weiteres Beispiel für einen kompetitiven Assay dar. In diesem Assay ist hTRT-Protein auf einem festen Substrat immobilisiert. Eine bekannte Menge an anti-TRT-Antikörper wird zu der Probe gegeben und danach die Probe mit dem immobilisierten hTRT-Protein in Kontakt gebracht. In diesem Fall ist die Menge an anti-TRT-Antikörper, der an das immobilisierte hTRT-Protein gebunden ist, umgekehrt proportional zu der Menge an hTRT-Protein, das in der Probe vorhanden ist. Die Menge an immobilisiertem Antikörper kann entweder durch Nachweis der immobilisierten Antikörperfraktion bestimmt werden, oder der Antikörperfraktion, die in Lösung bleibt.

   Dabei kann der Nachweis direkt sein, im Falle, wenn der Antikörper markiert ist, oder indirekt, im Falle, dass die Markierung an ein Molekül gebunden ist, das an den vorstehend beschriebenen Antikörper spezifisch bindet. 


 d) Andere Assayformate 
 



  Die Erfindung stellt auch Reagenzien und Verfahren zum Nachweis und zur Quantifizierung des Vorhandenseins von hTRT in der Probe mittels eines Immunblots (Westernblot)-Formats bereit. In diesem Format werden hTRT-Polypeptide in einer Probe von anderen Bestandteilen der Probe durch Gelelektrophorese (z.B. auf der Basis des Molekulargewichts), die abgetrennten Proteine auf einen geeigneten festen Träger überführt (z.B. ein Nitrocellulosefilter, ein Nylonfilter, ein derivatisierter Nylonfilter etc.) und der Träger wird mit erfindungsgemässen anti-TRT-Antikörpern inkubiert. Die anti-TRT-Antikörper binden spezifisch an hTRT oder anderem TRT auf dem festen Träger.

   Diese Antikörper können entweder direkt markiert sein oder sie können alternativ anschliessend unter Verwendung markierter Antikörper (z.B. markierten Schaf-anti-Maus-Antikörpern) nachgewiesen werden oder mittels anderer markierter Reagenzien, die spezifisch an den anti-TRT-Antikörper binden. 



  Zu weiteren Assayformaten zählen Liposom-Immunassays (LIA), bei denen Liposome verwendet werden, die so konstruiert wurden, dass sie spezifische Moleküle (z.B. Antikörper) binden und eingekapselte Reagenzien oder Marker freisetzen. Die freigesetzten Chemikalien können im Anschluss daran gemäss Standardverfahren nachgewiesen werden (siehe Monroe et al., Amer. Clin. Prod. Rev. 4 (1986), 34). 



  Wie bereits vorstehend erwähnt, besitzen Assay-Formate, die FACS (und äquivalente Instrumente oder Verfahren) verwenden, Vorteile, wenn hTRT-Genprodukte in einer heterogenen Probe (z.B. einer sowohl normale als auch maligne Zellen enthaltenden Biopsieprobe) gemessen werden. 


 e) Substrate, feste Träger, Membrane und Filter 
 



  Wie bereits vorstehend angemerkt, können in Abhängigkeit von dem Assay verschiedene Bestandteile, einschliesslich dem Antigen, Zielantikörper oder anti-hTRT-Antikörper, an eine feste Oberfläche oder einen festen Träger (d.h. ein Substrat, eine Membran oder Filterpapier) gebunden sein. Viele Verfahren zur Immobilisierung von Biomolekülen an eine Vielzahl von festen Oberflächen sind auf dem Fachgebiet bekannt. Die feste Oberfläche kann beispielsweise eine Membran sein (z.B. Nitrocellulose), eine Mikrotiterplatte (z.B. PVC, Polypropylen oder Polystyrol), ein Teströhrchen (Glas oder Plastik), ein Teststreifen (z.B. Glas, PVC, Polypropylen, Polystyrol, Latex etc.), ein Gefäss für eine Mikrozentrifuge oder ein Glas- oder Plastikkügelchen. Der gewünschte Bestandteil kann kovalent gebunden sein oder durch unspezifische Bindung nicht-kovalent angeknüpft sein. 



  Eine grosse Anzahl verschiedener organischer und anorganischer Polymere, die sowohl natürlich als auch synthetisch sein können, können als Material für die feste Obefläche verwendet werden. Zu solchen Polymeren zählen Polyethylen, Polypropylen, Poly(4-methylbuten), Polystyrol, Polymethacrylat, Poly(ethylenterephthalat), Rayon, Nylon, Poly(vinylbutyrat), Polyvinylidendifluorid (PVDF), Silikone, Polyformaldehyd, Cellulose, Celluloseacetat, Nitrocellulose etc. Zu den weiteren Materialien, die verwendet werden können, zählen Papier, Gläser, Keramiken, Metalle, Metalloide, Materialien mit Halbleitereigenschaften, Zemente etc. Zusätzlich können gelbildende Substanzen verwendet werden, beispielsweise Proteine (z.B. Gelatinen), Lipopolysaccharide, Silikate, Agarose und Polyacrylamide.

   Geeignet sind auch Polymere, die mehrere wässrige Phasen bilden, beispielsweise Dextrane, Polyalkylenglykole oder Tenside, beispielsweise Phospholipide, langkettige (12 bis 24 Kohlenstoffatome) Alkylammoniumsalze etc. Bei porösen  festen Oberflächen können in Abhängigkeit von der Art des Systems verschiedene Porengrössen verwendet werden. 



  Zur Herstellung der Oberfläche kann eine Vielfalt von verschiedenen Substanzen zum Erhalt verschiedener Eigenschaften verwendet werden, insbesondere als Laminate. Beispielsweise können zur Vermeidung einer unspezifischen Bindung, zur Vereinfachung einer kovalenten Konjugation, zur Verstärkung des Signalnachweises etc. Proteinbeschichtungen wie Gelatine verwendet werden. 



  Wenn eine kovalente Bindung zwischen einer Verbindung und der Oberfläche erwünscht ist, ist die Oberfläche normalerweise polyfunktionell oder sie kann polyfunktionell gemacht werden. Zu den funktionellen Gruppen, die auf der Oberfläche vorhanden und für eine Verknüpfung verwendet werden können, gehören Carboxylsäuren, Aldehyde, Aminogruppen, Cyangruppen, Ethylengruppen, Hydroxylgruppen, Mercaptogruppen etc. Die Art und Weise, wie solche Verknüpfungen durchgeführt werden können, ist für eine grosse Anzahl von Verbindungen an verschiedene Oberflächen allgemein bekannt und in der Literatur ausführlich beschrieben. siehe beispielsweise Immobilized Enzymes, Ichiro Chibata, Halsted Press, New York, 1978 und Cuatrecasas, J. Biol. Chem. 245 (1970) 3059. 



  Zusätzlich zur kovalenten Bindung können verschiedene Verfahren zur nicht-kovalenten Bindung eines Assaybestandteils verwendet werden. Eine nicht-kovalente Bindung ist typischerweise die unspezifische Absorption einer Verbindung an die Oberfläche. 



  Natürlich ist die Herabsetzung einer unspezifischen Bindung in Immunassays wünschenswert. Insbesondere dann, wenn der Assay ein Antigen oder einen Antikörper beinhaltet, der auf einem festen Substrat immobilisiert ist, ist die Minimierung der Menge an unspezifischer Bindung an das Substrat  wünschenswert. Mittel zur Herabsetzung einer solchen unspezifischen Bindung sind dem Fachmann gut bekannt. Dies beinhaltet typischerweise die Beschichtung des Substrats mit einer Proteinzusammensetzung. Insbesondere Proteinzusammensetzungen, die beispielsweise Rinderserumalbumin (BSA), fettfreies Milchpulver und Gelatine werden häufig verwendet, wobei gelegentlich Milchpulver bevorzugt wird. In einer alternativen Ausführungsform kann die Oberfläche so gestaltet sein, dass sie einen Bestandteil unspezifisch bindet, einen anderen jedoch nicht wesentlich bindet.

   Beispielsweise bindet eine ein Lectin, wie beispielsweise Concanavalin A, tragende Oberfläche eine Kohlenhydrat enthaltende Verbindung, jedoch nicht ein unglykosyliertes markiertes Protein. Die US-Patente Nr. 4 447 576 und 4 254 082 geben einen Überblick über verschiedene feste Oberflächen zur Verwendung bei der nicht-kovalenten Verknüpfung von Assay-Bestandteilen. 


 H. Assays für Anti-TRT-Antikörper 
 

 

  Die vorliegende Erfindung stellt auch Reagenzien und Assays zum Nachweis von-hTRT-spezifischen Immunglobulinen bereit. In einer Ausführungsform wird immobilisierte hTRT (z.B. rekombinante hTRT, die an die Vertiefung einer Mikrotiterplatte gebunden ist) mit Serum von einem Patienten unter Bedingungen inkubiert, bei denen anti-hTRT-Antikörper, wenn sie vorhanden sind, die immobilisierte hTRT binden. Nach dem Waschen zur Entfernung von unspezifisch gebundenem Immunglobulin können gebundene Serumantikörper, falls sie vorhanden sind, durch Zugabe von nachweisbar markierten anti-(menschliches Ig)-Antikörpern nachgewiesen werden (alternative Ausführungsform oder Variationen sind dem Fachmann gut bekannt; siehe beispielsweise Harlow, a.a.O., Kapitel 14).

   Diese Assays sind für den Nachweis von anti-hTRT-Antikörpern in beliebigen Quellen einschliesslich tierischem oder menschlichem Serum oder einem Träger, wie beispielsweise Kochsalzlösung, von Nutzen. In einer  Ausführungsform werden die Assays zum Nachweis oder zur Überwachung einer Immunantwort auf hTRT-Proteine in einem Patienten verwendet, insbesondere einer Autoimmunantwort (z.B. anti-Telomerase). Anti-hTRT-Antikörper können im Serum, an den Geweben oder Flüssigkeiten von einem Patienten vorhanden sein, der an einer Autoimmunkrankheit oder einem anderen Zustand leidet. 


 I) Assaykombinationen 
 



  Die hier beschriebenen diagnostischen und prognostischen Assays können in verschiedenen Kombinationen und auch in Verbindung mit anderen diagnostischen oder prognostischen Tests durchgeführt werden. Wenn beispielsweise die vorliegenden Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins von Krebszellen in einer Patientenprobe verwendet werden, kann die Anwesenheit von hTRT dazu benutzt werden, um das Krankheitsstadium zu bestimmen, ob es wahrscheinlich ist, dass ein bestimmter Tumor in angrenzendes Gewebe eindringt oder zu einem entfernten Standort metastasiert und ob ein erneutes Auftreten des Krebses wahrscheinlich ist. Zu den Tests, die zusätzliche Informationen liefern können, gehören die mikroskopische Analyse von Biopsieproben, der Nachweis von Antigenen (z.B.

   Zelloberflächenmarkern), die mit einer möglichen Tumorentstehung assoziiert sind (z.B. mittels Histocytochemie, FACS etc.), bildgebende Verfahren (z.B. nach Verabreichung eines markierten anti-Tumor-Antikörpers an einen Patienten), Telomerase-Aktivitätsassays, Telomerase-Längenassays, hTR-Assays etc. Solche kombinierten Tests können bezüglich des Fortschreitens einer Krankheit nützliche Information liefern. 



  Die Kombination von Assays kann auch nützliche Information liefern. Beispielsweise können, wie bereits vorstehend angemerkt, Assays für hTRT-mRNA mit Assays für hTR (RNA) oder Telomerase-Aktivität (d.h. TRAP) kombiniert werden, um  so Informationen über Telomerase-Assemblierung und -Funktion zu liefern. 


 J) Kits 
 



  Die vorliegende Erfindung stellt auch Kits bereit, die das Screenen, die Überwachung, Diagnose und Prognose bei Patienten mit einem mit Telomerase in Zusammenhang stehenden Zustand von Nutzen sind oder zur Bestimmung des Expressionsspiegels von hTRT in Zellen oder Zellinien. Die Kits enthalten eines oder mehrere Reagenzien zur Bestimmung des Vorhandenseins oder des Fehlens eines hTRT-Genprodukts (RNA oder Protein) oder zur Quantifizierung der Expression des hTRT-Gens. Zu den bevorzugten Reagenzien gehören Nucleinsäureprimer und Sonden, die an das hTRT-Gen, -RNA,   -cDNA oder Anteile davon binden, aber auch Proteine, Peptide, Antikörper und Kontroll-Primer, -Sonden, -Oligonucleotide, -Proteine, -Peptide und -Antikörper.

   Weitere Substanzen können aufgenommen werden, dazu gehören Enzyme (Z.B. reverse Transkriptasen, DNA-Polymerasen, Ligasen), Puffer und Reagenzien (Markierungen, dNTPs). 



  Die Kits können alternativ oder in Kombination mit irgendwelchen anderen hier beschriebenen Bestandteilen einen Antikörper enthalten, der spezifisch an hTRT-Polypeptide oder Untersequenzen davon bindet. Es kann ein monoclonaler oder polyclonaler Antikörper sein. Der Antikörper kann an eine weitere Einheit konjugiert sein, beispielsweise eine Markierung und/oder er kann auf einem festen Träger (Substrat) immobilisiert sein. Der (die) Kit(s) kann (können) auch einen zweiten Antikörper zum Nachweis von hTRT-Polypeptid/Antikörper-Komplexen oder zum Nachweis von hybridisierten Nucleinsäuresonden enthalten, sowie ein oder mehrere hTRT-Peptide oder -Proteine zur Kontrolle oder andere Reagenzien. 



  Der Antikörper oder die Hybridisierungssonde kann frei vorliegen oder an einen festen Träger immobilisiert sein, beispielsweise ein Teströhrchen, eine Mikrotiterplatte, ein Teststäbchen etc. Der Kit kann auch Anleitungen enthalten, die die Verwendung des Antikörpers oder der Hybridisierungssonde in einem Assay zum Nachweis einer Prädisposition für TRT beschreiben. Der Kit kann geeignete Reagenzien zum Nachweis von Markierungen oder zur Markierung positiver und negativer Kontrollen, Waschlösungen, Verdünnungspuffer etc. enthalten. 



  In einer Ausführungsform enthält der Kit ein Primerpaar zur Amplifikation von hTRT-mRNA. Ein solcher Kit kann auch eine Sonde für amplifizierte hTRT-DNA und/oder eine Polymerase, Puffer, dNTPs etc. enthalten. In einer weiteren Ausführungsform umfasst der Kit eine Sonde, gegebenenfalls eine markierte Sonde. In einer anderen Ausführungsform umfasst der Kit einen Antikörper. 


 X. Identifizierung von Modulatoren von Telomerase-Aktivität 
 


 A. Allgemeines 
 



  Die Erfindung stellt Verbindungen und Behandlungen bereit, die die Aktivität oder Expression einer Telomerase oder eines Telomerase-Bestandteils (z.B. hTRT-Protein) modulieren. Die Erfindung stellt auch Assays und Screening Verfahren (einschliesslich Screening-Verfahren mit hohem Durchsatz) zur Identifizierung von Verbindungen und Behandlungen bereit, die Telomerase-Aktivität oder -Expression modulieren. Zu diesen Modulatoren von Telomerase-Aktivität und -Expression (die nachstehend als "Modulatoren" bezeichnet werden) gehören Telomerase-Agonisten (die Telomerase-Aktivität und/oder   -Expression steigern) und Telomerase-Antagonisten (die Telomerase-Aktivität und/oder -Expression herabsetzen). 



  Die erfindungsgemässen Modulatoren haben eine grosse Anzahl von Anwendungsmöglichkeiten. Beispielsweise wird davon ausgegangen, dass Telomerase-Modulatoren wirksame therapeutische Mittel zur Behandlung von menschlichen Krankheiten sind. Das Screenen nach agonistischer Aktivität und Aktivatoren der Transkription oder Translation erlaubt die Bereitstellung von Zusammensetzungen, die eine Telomerase-Aktivität in einer Zelle (einschliesslich einer Telomer-abhängigen Replikationsfähigkeit oder einer "partiellen" Telomerase-Aktivität) steigern können. Solche agonistischen Zusammensetzungen erlauben auch die Bereitstellung von Verfahren zur Immortalisierung von ansonsten normalen untransformierten Zellen, wozu Zellen gehören, die nützliche Proteine exprimieren können. Solche Agonisten erlauben auch die Bereitstellung von Verfahren zur Regulierung zellulärer Seneszenz.

   Umgekehrt erlaubt das Screenen nach antagonistischer Aktivität die Bereitstellung von Zusammensetzungen, die eine Telomer-abhängige Replikationsfähigkeit herabsetzen und dadurch Zellen mortalisieren, die ansonsten unsterblich sind, beispielsweise Krebszellen. Das Screenen nach antagonistischer Aktivität erlaubt die Bereitstellung von Zusammensetzungen, die Telomerase-Aktivität herabsetzen und dadurch eine unbegrenzte Zellteilung von Zellen, die ein unreguliertes Zellwachstum zeigen, beispielsweise Krebszellen, verhindern. Beispiele von Erkrankungen und Zuständen, die mittels der Modulatoren behandelt werden können, sind hier aufgezählt, beispielsweise in den vorstehenden Abschnitten VII und IX.

   Im allgemeinen können die erfindungsgemässen Modulatoren immer dann verwendet werden, wenn eine Steigerung oder eine Herabsetzung einer Telomerase-Aktivität in einer Zelle oder einem Organismus erwünscht ist. Somit kann ein Modulator, der hTRT-Expressionsspiegel steigert, zusätzlich zur Verwendung bei der Krankheitsbehandlung zur Herstellung einer kultivierten menschlichen Zellinie verwendet werden, die Eigenschaften aufweist, wie sie allgemein in dem vorstehenden Abschnitt  VIII beschrieben sind und er weist zahlreiche andere Anwendungsmöglichkeiten auf, die für den Fachmann offensichtlich sind. 



  Eine Verbindung oder Behandlung moduliert die "Expression" von Telomerase oder eines Telomerase-Bestandteils, wenn die Verabreichung der Verbindung oder der Behandlung die Transkriptionsrate oder den Transkriptionsspiegel des einen Telomerase-Bestandteil codierenden Gens (z.B. hTRT-mRNA codierenden Gens) verändert, beeinflusst die Stabilität oder die posttranskriptionale Prozessierung von einen Telomerase-Bestandteil codierende RNA (z.B. Transport, Spleissen, Polyadenylierung oder eine andere Modifizierung), beeinflusst Translation, Stabilität,  posttranslationale Prozessierung oder die Modifizierung eines codierten Proteins (z.B. hTRT) oder verändert auf andere Art und Weise den Spiegel an funktionellem (z.B. katalytisch aktivem) Telomerase-RNP.

   Eine Verbindung oder Behandlung beeinflusst dann eineTelomerase-"Aktivität", wenn die Verabreichung der Verbindung oder Behandlung eine Telomerase verändert, beispielsweise jene, die in dem vorstehenden Abschnitt IV (B) beschrieben sind (z.B. gehören dazu eine prozessive oder nicht-prozessive katalytische Aktivität von Telomerase; Telomerase-Prozessivität, konventionelle reverse Transkriptase-Aktivität; nucleolytische Aktivität; Primer- oder Substrat-bindende Aktivität; dNTP-bindende Aktivität; RNA-bindende Aktivität; Beeinflussung der Telomerase-RNP-Assemblierung und Protein-bindende Aktivität). Es gibt nicht unbedingt eine scharfe Abgrenzung zwischen Änderung in der "Aktivität" und Veränderungen in der "Expression". Diese Ausdrücke werden zur Erleichterung der Diskussion, jedoch nicht zur Einschränkung verwendet.

   Die erfindungsgemässen Modulatoren sollten Telomerase-Aktivität oder -Expression beeinflussen (z.B. ohne allgemein die Expression von "housekeeping"-Proteinen, wie Actin, ändern) und nicht beispielsweise die Expression eines Telomerase-Bestandteils durch unspezifische Vergiftung einer Zielzelle herabsetzen. 


 B. Assays zur Identifizierung von Telomerase-Modulatoren 
 



  Die Erfindung stellt Verfahren und Reagenzien zum Screenen nach Zusammensetzungen oder Verbindungen bereit, die die Expression einer Telomerase oder eines Telomerase-Bestandteils beeinflussen können, die Replikationsfähigkeit von Telomerase bezüglich DNA modifizieren können oder anderweitig die Fähigkeit des Telomerase-Enzyms und des TRT-Proteins Telomer-DNA synthetisieren zu können ("volle Aktivität") modifizieren. Die Erfindung stellt auch Screening-Verfahren für Modulatoren einer beliebigen "partiellen Aktivität" von hTRT oder allen dieser Aktivitäten bereit.

   Somit stellt die vorliegende Erfindung Assays bereit, die zum Screenen nach Agensien verwendet werden können, die die Aktivität von Telomerase steigern, beispielsweise dadurch, dass sie dazu führen, dass hTRT-Protein oder Telomerase in einer Zelle exprimiert wird, in der diese normalerweise nicht exprimiert wird, oder durch Steigerung der Spiegel an Telomerase-Aktivität in Telomerase-positiven Zellen. 



  Telomerase oder Proteine einer Telomerase-Untereinheit, deren katalytische oder immunogene Fragmente oder Oligopeptide davon können zum Screenen nach therapeutischen Verbindungen in einer Vielzahl von Verfahren zum Screenen von Wirkstoffen verwendet werden. Das in einem solchen Test verwendete Fragment kann frei in Lösung vorliegen, an einen festen Träger fixiert sein, von einer Zelloberfläche getragen, oder intrazellulär lokalisiert sein. Die Bildung von Bindungskomplexen zwischen Telomerase oder dem Untereinheitenprotein und dem zu testenden Agens kann gemessen werden. 



  In verschiedenen Ausführungsformen zählen zu der Erfindung Verfahren zum Screenen nach Antagonisten, die an das aktive Zentrum des Enzyms binden; die Assoziierung seiner RNA- Einheit, von Telomerase-assoziierten Proteinen, Nucleotiden oder Telomer-DNA an Telomerase oder hTRT-Protein hemmen; die Dissoziierung des Enzymkomplexes fördern; die Transkription der Telomerase-RNA-Einheit (z.B. hTR) stören oder eine der hier beschriebenen "partiellen Aktivitäten" hemmen.

   Die Erfindung betrifft auch das Screenen nach Zusammensetzungen, die die Assoziierung von Nucleinsäure und/oder Telomerase-assoziierten Zusammensetzungen mit hTRT, z.B. die Assoziierung von hTR mit hTRT oder die Assoziierung von hTRT mit dem menschlichen Homolog von p80 oder einem anderen assoziierten Protein oder die Assoziierung von hTRT mit einem Telomer oder einem Nucleotid hemmen; das Screenen nach Zusammensetzung, die die Dissoziierung oder Assoziierung (d.h. Assemblierung) des Enzymkomplexes fördern, beispielsweise ein Antikörper, der gegen hTR oder hTRT gerichtet ist; das Screenen nach Agensien, die die Prozessivität des Enzyms beeinflussen und das Screenen nach Nucleinsäuren und anderen Zusammensetzungen, die Telomerase binden, wie beispielsweise eine zu hTR komplementäre Nucleinsäure.

   Die Erfindung zieht darüber hinaus auch das Screenen nach Zusammensetzungen in Betracht, die die Transkription des hTRT-Gens und/oder die Translation des hTRT-Genprodukts erhöhen oder herabsetzen. Die Erfindung zieht auch ein Screening-Verfahren in Betracht, TelomeraseModulatoren in Tieren, in einer Ausführungsform durch die Rekonstitution einer Telomerase-Aktivität oder einer anti-Telomerase-Aktivität in ein Tier, beispielsweise in einem transgenen Tier. Die Erfindung stellt auch in vivoAssaysysteme bereit, zu denen "knockout"-Modelle gehören, bei denen eine oder verschiedene Einheiten der endogenen Telomerase, der Telomerase-RNA-Einheit und/oder Telomeraseassoziierte Proteine deletiert oder gehemmt wurden. Dabei kann die endogene Telomerase-Aktivität vollständig oder partielle erhalten geblieben sein.

   In einer Ausführungsform wird eine exogene Telomerase-Aktivität voll oder partiell rekonstituiert. 



  In einer erfindungsgemässen Ausführungsform wird eine Reihe von Assays hinsichtlich einer partiellen Telomerase Aktivität bereitgestellt, die die Identifizierung einer Vielfalt verschiedener Klassen von Modulatoren von Telomerase-Aktivität erlauben. Die erfindungsgemässen "Teilaktivitäts"-Assays erlauben die Identifizierung von Modulatorklassen von Telomerase-Aktivität, die ansonsten in einem "Vollaktivitäts"-Telomerase-Assay nicht hätten nachgewiesen werden können. Bei einem Teilaktivitäts-Assay ist die nicht-prozessive Aktivität von TRT und Telomerase beteiligt. Die prozessive Natur der Telomerase wird von Morin, Cell 59 (1989), 521-529 beschrieben; siehe auch Prowse "Identification of a nonprocessive telomerase-activity from mouse cells" Proc. Natl. Acad. Sci. USA90 (1993), 1493-1497.

   Bei einem weiteren erfindungsgemässen Teilaktivitäts-Assay wird die "Reverse Transpriptase-ähnliche"-Aktivität von Telomerase genutzt. Bei diesen Assays wird die reverse Transkriptase-Aktivität des hTRT-Proteins untersucht; siehe Lingner "Reverse transcriptase motifs in the catalytic subunit of telomerase", Science 276 (1997), 561-567. Bei einem weiteren erfindungsgemässen Teilaktivitäts-Assay wird die "nucleolytische Aktivität" von hTRT und Telomerase, zu der die Entfernung von mindestens einem Nucleotid vom 3 min -Strang, typischerweise Guanosin, durch das Enzym beinhaltet, genutzt. Diese nucleolytische Aktivität wurde in Tetrahymena-Telomerase von Collins "Tetrahymena telomerase catalyzes nucleolytic cleavage and nonprocessive elongation" Genes Dev. 7 (1993), 1364-1376 beobachtet.

   Bei einem weiteren erfindungsgemässen Teilaktivitäts-Assay ist eine Analyse der Fähigkeit von hTRT und Telomerase als Teil deren Aktivität hinsichtlich der prozessiven DNA-Polymerisation bezeichnet. Ein weiterer erfindungsgemässer Teilaktivitäts-Assay beinhaltet die Analyse der Fähigkeit von hTRT oder Telomerase, deren RNA-Einheit zu binden, d.h. hTR menschliche Zellen, die als eine Matrize für die Telomer-Synthese verwendet wird. Weitere erfindungsgemässe Teilaktivitäts-Assays beinhalten die  Analyse der Fähigkeit von hTRT und Telomerase-Chromosomen in vivo zu binden oder oligonucleotid-Primer in vitro oder in rekonstituierten Systemen zu binden oder Proteine zu binden, die mit chromosomalen Strukturen assoziiert sind (siehe bezüglich eines Beispiels für ein solches Protein Harrington, J. Biol. Chem. 270 (1995), 8893-8901).

   Zu den chromosomalen Strukturen, die hTRT binden, gehören beispielsweise DNA der Telomer-Wiederholungseinheit, Telomer-Proteine, Histone, nucleäres Matrixprotein, Kontrollproteine für die Zellteilung oder den Zellcyclus etc. 



  In einer Ausführungsform umfasst ein Assay zur Identifizierung von Modulatoren das Inkontaktbringen von einer oder mehreren Zellen (d.h. "Testzellen") mit einer Testverbindung und die Bestimmung, ob die Testverbindung die Expression oder Aktivität einer Telomerase (oder eines Telomerase-Bestandteils) in der Zelle beeinflusst. Üblicherweise umfasst diese Bestimmung den Vergleich der Aktivität oder der Expression in der Testzelle mit einer ähnlichen Zelle oder Zellen (d.h. Kontrollzellen), die mit der Testverbindung nicht in Kontakt gebracht wurden. In einer alternativen Ausführungsform können anstelle von intakten Zellen Zellextrakte verwendet werden. In einer verwandten Ausführungsform wird die Testverbindung an einen multizellulären Organismus (z.B. eine Pflanze oder ein Tier) verabreicht.

   Die Telomerase oder der Telomerase-Bestandteil kann für die Zelle oder den multizellulären Organismus vollständig endogen sein (d.h. von natürlich vorkommenden endogenen Genen codiert), es kann sich auch um eine rekoNA-Substrat bindet, und da die vorliegende Erfindung hTRT- und andere TRT-Proteine in gereinigter Form in grossen Mengen bereitstellt, kann der Fachmann unter Verwendung der erfindungsgemässen Verfahren leicht nach TRT-bindenden Aptameren screenen. 



  Oligonucleotide (z.B. RNA-Oligonucleotide), die Telomerase, hTRT, HTR oder Anteile davon binden, können mittels der SELEX-Verfahren erzeugt werden (Tuerk, Methods Mol. Biol. 67  (1997), 2190). Bei diesem Verfahren wird ein sehr grosser Pool (106-109) aus Nucleinsäuren mit Zufallssequenzen unter Bedingungen an das Ziel (z.B. hTRT) gebunden, die einer sehr starken Unterscheidung zwischen Molekülen mit hoher Affinität und niedriger Affinität bezüglich der Bindung des Ziels führen. Die gebundenen Moleküle werden von nichtgebundenen abgetrennt und die gebundenen Moleküle kraft einer spezifischen Nucleinsäuresequenz, die in ihren Enden enthalten ist, und mittels geeigneter Amplifikationsreagenzien amplifiziert. Dieser Prozess wird verschiedene Male solange wiederholt, bis eine relativ kleine Anzahl von Molekülen übrig bleibt, die eine hohe Bindungsaffinität für das Ziel aufweisen.

   Diese Moleküle können im Anschluss daran auf ihre Fähigkeit Telomerase-Aktivität zu modulieren, wie hier beschrieben, getestet werden. 



  Antagonisten einer Telomerase-vermittelten DNA-Replikation können auch auf einer Hemmung von hTR (Norton, Nature Biotechnology 14 (1996) 615-619) über komplementäre Sequenz-Erkennung oder  -Spaltung, wie dies bei Ribozymen der Fall ist, basieren. 



  Die erfindungsgemässen inhibitorischen Oligonucleotide können unter Verwendung einer Vielfalt von auf dem Fachgebiet gut bekannten Verfahren in die Zelle transferiert werden. Beispielsweise können Oligonucleotide spontan ohne spezifische Modifikation in das Plasma transportiert werden. In einer alternativen Ausführungsform können sie mittels Liposomen, die mit der zellulären Membran fusionieren oder durch Endocytose aufgenommen werden, zugeliefert werden, d.h. durch die Verwendung vorn an das Liposom angehefteten Liganden oder durch direkte Anheftung an das Oligonucleotid, wobei diese dann an Oberflächenmembran-Proteinrezeptoren der Zelle binden, was zu einer Endocytose führt. In einer alternativen Ausführungsform können die Zellen zur Steigerung des Transports der Oligonucleotide in die Zelle  ohne Verletzung der Wirtszellen permeabilisiert werden.

   Es kann auch ein DNA-bindendes Protein, beispielsweise HBGF-1, von dem bekannt ist, dass es ein Oligonucleotid in eine Zelle transportieren kann, verwendet werden. 


 5) Inhibitorische Ribozyme 
 



  Ribozyme wirken durch Bindung an eine Ziel-RNA über den die Ziel-RNA bindenden Anteil eines Ribozyms, der in enger Nachbarschaft zu einem enzymatischen Anteil der RNA gehalten wird, der die Ziel-RNA spaltet. Somit erkennt und spaltet das Ribozym eine Ziel-RNA normalerweise über Paarung mit komplementären Basen und nachdem es an der richtigen Stelle gebunden ist wirkt es als Enzym, wobei es die Ziel-RNA spaltet und inaktiviert. Die Spaltung einer Ziel-RNA auf eine solche Weise zerstört deren Fähigkeit, die Synthese eines codierten Proteins zu steuern, vorausgesetzt, die Spaltung geschieht in der codierenden Sequenz. Nachdem ein Ribozym sein RNA-Ziel gebunden und gespalten hat, wird es typischerweise von der RNA freigesetzt, so dass es wiederholt neue Ziele binden und spalten kann. 


 6) Die Identifizierung von Telomerase-Assoziierten Proteinen zur Verwendung als Modulatoren 
 



  In einer erfindungsgemässen Ausführungsform wird die Telomerase zur Identifizierung von Telomerase-assoziierten Proteinen verwendet, d.h. Telomerase-assoziierten Proteinen, die Telomerase-Aktivität modulieren oder ansonsten ergänzen. Wie bereits vorstehend angemerkt, können diese Proteine oder Fragmente davon eine Funktion dadurch modulieren, dass sie die Dissoziierung des Telomerase-Enzymkomplexes bewirken oder die Assoziierung verhindern, die Assemblierung des Telomerase-Komplexes verhindern, hTRT an deren Bindung an ihre, eine ergänzende Einheit darstellende Nucleinsäure hindern oder an ihre Bindung an ihre DNA-Matrize, hTRT an der Bindung von Nucleotiden hindern, oder eine oder mehrere  oder alle der Teilaktivitäten des Telomerase-Enzyms oder des hTRT-Proteins, wie bereits vorstehend beschrieben, verhindern, steigern oder hemmen. 



  Der Fachmann kann die erfindungsgemässen Verfahren für den Nachweis dafür verwenden, welche Anteile (z.B. Domänen) dieser Telomerase-assoziierten Proteine mit Telomerase in Kontakt kommen. In einer erfindungsgemässen Ausführungsform werden diese Telomerase-assoziierten Proteine oder Fragmente davon als Modulatoren von Telomerase-Aktivität verwendet. 


 7) Telomerase-Assoziierte Proteine als Dominant-negative Mutanten 
 



  In einer erfindungsgemässen Ausführungsform werden Telomerase-assoziierte Proteine als Modulatoren von Telomerase-Aktivität verwendet. Zu Telomerase-assoziierten Proteinen zählen chromosomale Strukturen, beispielsweise Histone, Proteine der nucleären Matrix, Kontrollproteine der Zellteilung/des Zellcyclus etc. Zu weiteren Telomerase-assoziierten Proteinen, die für den erfindungsgemässen Zweck als Modulatoren verwendet werden können! zählen p80 und p95, das menschliche Protein und ihre menschlichen Homologe, beispielsweise TP1 und TRF-1 (Chong, Science 270 (1995), 1663-1667). Zusätzlich können Fragmente dieser Telomerase-assoziierten Proteine vom Fachmann gemäss den erfindungsgemässen Verfahren identifiziert und als Modulatoren von Telomerase-Aktivität verwendet werden. 


 8) Dominant-negative Mutanten 
 



  Acht hochkonservierte Motive wurden innerhalb der TRTs verschiedener nicht-menschlicher Spezies identifiziert, wie bereits vorstehend beschrieben (siehe auch Lingner, Science 276 (1997), 561-567). Fig. 4 zeigt ein Schema der menschlichen TRT (hTRT)-codierenden cDNA-Sequenz (von pGRN121) und von RT-Motiven im Vergleich zu S. pombe-Trt1p,  Euplotes p123 und S. cerevisiae Est2p. Die vorliegende Erfindung stellt rekombinante und synthetische Nucleinsäuren bereit, in denen die Codons für die konservierten Aminosäurereste in jedem der acht Motive gegen jedes der anderen Codons ausgetauscht wurden. Eine Vielzahl der erhaltenen codierten Sequenzen exprimieren eine nichtfunktionelle hTRT. Siehe beispielsweise Beispiel 16.

   Somit stellt die vorliegende Erfindung beispielsweise eine grosse Anzahl von "mutierten" Telomerase-Enzymen und TRT-Proteinen zur Verfügung, die eine Teilaktivität von Telomerase aufweisen, jedoch nicht die gesamte Aktivität. Beispielsweise kann eine solche Polymerase telomere Strukturen binden, jedoch nicht Telomerase-assoziierte RNA (d.h. hTR). Solch eine Telomerase-Mutante kann, wenn sie in ausreichend hoher Konzentration exprimiert wird, zur Verarmung eines notwendigen Telomerase-Bestandteils (z.B. hTR) führen und dadurch als ein Inhibitor von WildtypTelomerase-Aktivität fungieren. Eine auf diese Weise wirkende mutierte Telomerase stellt einen Antagonisten dar oder eine sogenannte "dominant-negative" Mutante. 


 9) Antikörper 
 



  Die erfindungsgemässen Antikörper können allgemein zur Identifizierung, Reinigung oder Hemmung irgendeiner oder aller Aktivitäten eines Telomerase-Enzyms und hTRT-Proteins verwendet werden. Antikörper können als Antagonisten von Telomerase-Aktivität auf verschiedene Weise wirken, beispielsweise dadurch, dass sie verhindern, dass der Telomerase-Komplex oder das Nucleotid an deren DNA-Substrate bindet, dadurch, dass sie verhindern, dass die Telomerase-Bestandteile einen aktiven Komplex bilden, durch Aufrechterhaltung einer funktionellen (Telomerase-Komplex) quaternären Struktur oder durch Bindung an eine der aktiven Zentren des Enzyms oder an andere Stellen, die allosterische Auswirkungen auf Aktivität haben (die unterschiedlichen  Teilaktivitäten von Telomerase sind ausführlich an anderer Stelle dieser Beschreibung beschrieben). 


 D) Das Entwerfen von Modulatoren 
 



  Die erfindungsgemässen Telomerase-Modulatoren können mittels Verfahren, die in der Pharmazie gut bekannt sind, entworfen oder hergestellt werden, dazu gehören kombinatorische Verfahren und "rational drug design"-Verfahren. 


 1) Methodik der kombinatorischen Chemie 
 



  Die Herstellung und das simultane Screenen von grossen Banken aus synthetischen Molekülen kann mittels gut bekannter Verfahren der kombinatorischen Chemie ausgeführt werden, siehe beispielsweise van Breemen, Anal. Chem. 69 (1997), 2159-2164 und Lam, Anticancer Drug Des. 12 (1997), 145-167. 



  Wie bereits vorstehend angemerkt, kann die Methodik der kombinatorischen Chemie dazu verwendet werden, eine riesige Anzahl von Oligonucleotiden zu erzeugen, die hinsichtlich spezifischer- Oligonucleotide, die geeignete Bindungsaffinitäten besitzen, sehr schnell gescreent werden können und Spezifitäten gegen ein beliebiges Ziel, wie die erfindungsgemässen TRT-Proteine, können genutzt werden (siehe für eine allgemeine Hintergrundinformation Gold, J. of Biol. Chem. 270 (1995), 13581-13584). 


 2) "Rational Drug Design" 
 



  "Rational drug design" beinhaltet einen integrierten Satz an Methoden, zu denen die Strukturanalyse von Zielmolekülen, synthetische Chemie und fortgeschrittene Computerverfahren zählen. Bei der Verwendung zum Entwurf von Modulatoren, beispielsweise Antagonisten/Inhibitoren von Proteinzielen, wie beispielsweise das Telomerase-Enzym und hTRT-Protein, besteht das Ziel von "rational drug design" in einem  Verständnis der dreidimensionalen Gestalt und der Chemie eines Moleküls. "Rational drug design" wird unterstützt von Daten, die durch Röntgenstrukturanalyse oder NMR gewonnen wurden und die nun für das hTRT-Protein und Telomerase-Enzym gemäss den durch die Erfindung bereitgestellten Verfahren und unter Verwendung der erfindungsgemässen Reagenzien bestimmt werden können.

   Hilfreich sind auch Berechnungen hinsichtlich elektrostatischer Eigenschaften, Hydrophobizitäten und der Lösungsmittelzugänglichkeit. Siehe beispielsweise Coldren, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997), 6635-6640. 


 D) Kits 
 



  Die Erfindung stellt auch Kits bereit, die zu einer Bestimmung dafür verwendet werden können, ob eine Testverbindung ein Modulator einer TRT-Aktivität ist. Der Kit beinhaltet typischerweise eine oder mehrere der folgenden Bestandteile: ein im wesentlichen gereinigtes TRT-Polypeptid oder Polynucleotid (einschliesslich Sonden und Primern), ein Plasmid, das eine TRT (z.B. hTRT) exprimieren kann, wenn es in eine Zelle oder ein zellfreies Expressionssystem eingeführt wird; ein Plasmid, das eine TR (z.B. hTR) exprimieren kann, wenn es in eine Zelle oder ein zellfreies Expressionssystem eingeführt wird;

   Zellen oder Zellinien; eine Zusammensetzung zum Nachweis einer Veränderung in einer TRT-Aktivität und eine Anleitung die zeigt, wie eine Veränderung in der TRT-Aktivität nachgewiesen und gemessen werden kann, wobei angezeigt wird, dass eine Änderung in der Telomerase-Aktivität in Gegenwart der Testverbindung ein Indikator dafür ist, ob die Testverbindung die Telomerase-Aktivität moduliert und ein Behälter. Der Kit kann auch Mittel enthalten, wie beispielsweise ein TRAP-Assay oder ein Assay, der auf einer quantitativen Polymerase-Kettenrekation beruht, um so eine Änderung in einer TRT-Aktivität messen zu können. 

   Der Kit kann auch eine Anleitung dafür enthalten, wie eine Veränderung in der TRT-Aktivität nachgewiesen und gemessen  werden kann, wobei angezeigt wird, dass eine Veränderung in der Telomerase-Aktivität in Anwesenheit der Testverbindung ein Indikator dafür ist, ob die Testverbindung die Telomerase-Aktivität moduliert. 


 XI. Transgene Organismen (Telomerase-"knockout"-Zellen und Tiermodelle) 
 



  Die Erfindung stellt auch transgene nicht-menschliche mehrzellige Organismen (z.B. Pflanzen und Tiere) oder einzellige Organismen (z.B. Hefe) bereit, die eine exogene TRT-Gensequenz enthalten, bei der es sich um eine codierende Sequenz oder eine regulatorische Sequenz (z.B. einen Promotor) handeln kann. In einer Ausführungsform exprimiert der Organismus ein exogenes TRT-Polypeptid mit einer Sequenz von einem menschlichen TRT-Protein. In einer verwandten Ausführungsform exprimiert der Organismus auch einen Telomerase-RNA-Bestandteil (z.B. hTR). 



  Die Erfindung stellt auch einzellige und mehrzellige Organismen (oder Zellen davon) bereit, bei denen mindestens ein, eine Telomerase-Untereinheit (z.B. TRT oder TR) oder ein Telomerase-assoziiertes Protein codierendes Gen mutiert oder deletiert ist (d.h. in einem codierenden oder regulatorischen Bereich), so dass keine native Telomerase exprimiert wird oder diese mit einem herabgesetzen Spiegel exprimiert oder im Vergleich zu Wildtypzellen oder Organismen mit unterschiedlichen Aktivitäten exprimiert wird. Solche Zellen und Organismen werden oft als "gene knock-out"-Zellen oder -Organismen bezeichnet. 



  Die Erfindung stellt ferner Zellen und Organismen bereit, bei denen ein endogenes Telomerase-Gen (z.B. Maus-TRT) mutiert oder deletiert ist und ein exogenes Telomerase-Gen (z.B. für menschliche TRT) eingeführt und exprimiert wird. Zellen und Organismen dieses Typs sind beispielsweise als Modellsysteme von Nutzen, um: Modulatoren von hTRT-Aktivität  oder -Expression zu identifizieren; die Auswirkungen von Mutationen in Genen für Telomerase-Bestandteile bestimmen zu können und beispielsweise das Timing im Hinblick auf den Entwicklungszustand und die Gewebelokalisierung von Telomerase-Aktivität bestimmen zu können (um beurteilen zu können, wann ein Telomerase-Modulator verabreicht werden soll und um mögliche Nebenwirkungen feststellen zu können). 



  Zu den Beispielen für mehrzellige Organismen gehören Pflanzen, Insekten und Tiere, wie beispielsweise Mäuse, Ratten, Kaninchen, Affen, Menschenaffen, Schweine und andere Säuger. Ein Beispiel für einen einzelligen Organismus ist Hefe. 



  Verfahren zur Änderung oder Unterbrechung eines spezifischen Gens (z.B. endogener TRT-Gene) sind dem Fachmann gut bekannt, siehe beispielsweise Baudin et al., Nucl. Acids Res. 21 (1993) , 3329; Wach et al. , Yeast 10 (1994) 1793; Rothstein, Methods Enzymol. 194 (1991), 281; Anderson, Methods Cell Biol. 48 (1995), 31; Pettitt et al., Development 122 (1996), 4149-4157; Ramirez-Solis et al., Methods Enzymol. 225 (1993), 855 und Thomas et al., Cell 51 (1987), 503, wobei jedes dieser Dokumente durch Bezugnahme in seiner Gesamtheit und für alle Zwecke als Bestandteil der Beschreibung anzusehen ist. 



  Zu den erfindungsgemässen "knockout"-Zellen und -Tieren gehören Zellen und Tiere, in denen eine oder mehrere Einheiten des endogenen Telomerase-Enzymkomplexes deletiert oder gehemmt sind. Die Rekonstitution von TelomeraseAktivität bewahrt die Zelle oder das Tier vor dem unvermeidlichen Zelltod, der durch dessen Unvermögen, Telomere zu bewahren, bedingt ist. Verfahren zur Änderung der Expression von endogenen Genen sind dem Fachmann gut bekannt. Typischerweise beinhalten solche Verfahren die Veränderung oder den Austausch aller regulatorischen Sequenzen, die die Expression eines bestimmten zu  regulierenden Gens kontrollieren, oder eines Anteils davon. Die regulatorischen Sequenzen, beispielsweise der native Promotor, können verändert werden.

   Das übliche Verfahren für eine zielgerichtete Mutation von Genen beinhaltet die Einfügung eines, das gewünschte Gen enthaltenden genomischen DNA-Fragments in einen Vektor, wonach sich die Clonierung von zwei genomischen Armen um eine selektierbare Neomycin-Resistenzkassette in einem Thymidinkinase enthaltenden Vektor anschliesst. Mit diesem "knock-out"-Konstrukt wird dann eine geeignete Zelle transfiziert, d.h. eine embryonale Stammzelle (ES) der Maus, wobei die Zellen danach einer positiven Selektion (mittels G418 und beispielsweise auf Neomycin-Resistenz zu selektieren) und einer negativen Selektion (wobei beispielsweise FIAU verwendet wird, um Zellen auszuschliessen, denen Thymidinkinase fehlt) unterworfen werden. Dies erlaubt die Selektion von Zellen, die mit dem "knockout"-Vektor eine homologe Rekombination eingegangen sind.

   Dieses Vorgehen führt zur Inaktivierung des gewünschten Gens. Siehe beispielsweise die US-Patente 5 464 764; 5 631 153; 5 487 992 und 5 627 059. 



  "Knocking out"-Expression eines endogenen Gens kann auch erreicht werden mittels homologer Rekombination, die zur Einführung einer heterologen Nucleinsäure in die regulatorischen Sequenzen (z.B. einen Promotor) des gewünschten Gens verwendet wird. Um die Expression von funktionellem Enzym oder Produkt zu verhindern, sind einfache Mutationen geeignet, die entweder den Leserahmen ändern oder den Promotor unterbrechen. Zur Hochregulation der Expression kann ein nativer Promotor gegen einen heterologen Promotor ausgetauscht werden, der höhere Transkriptionsspiegel induziert. Es kann auch die "gene trap insertion" verwendet werden, um ein Wirtsgen zu unterbrechen. Embryonale Stammzellen (ES) der Maus können zur Herstellung von transgenen "knockout"-Tieren verwendet werdenf wie dies beispielsweise in Holzschu Transgenic Res. 6 (1997), 97-106 beschrieben ist. 



  Die Änderung der Expression von endogenen Genen durch homologe Rekombination kann auch unter Verwendung von Nucleinsäuresequenzen erreicht werden, die das fragliche Strukturen enthalten. Stromaufwärts gelegene Sequenzen werden dafür verwendet, um Konstrukte bezüglich einer heterologen Rekombination zum Ziel zu führen. Unter Verwendung der Information hinsichtlich des TRTStrukturgens, beispielsweise SEQ. ID. Nr. 1, kann der Fachmann Konstrukte für eine homologe Rekombination herstellen, was lediglich Routineexperimente erforderlich macht. Homologe Rekombination zur Änderung der Expression von endogenen Genen ist beschrieben in US-Patent Nr. 5,272,071 und WO 91/09 955, WO 93/09 222, WO 96/29 411, WO 95/31 560 und WO 91/12 650. Homologe Rekombination in Mycobakterien ist beschrieben in Azad Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (1996), 4787; Baulard, J.

   Bacteriol. 178 (1996), 3091 und Pelicic, Mol. Microbiol. 20 (1996), 991. Homologe Rekombination in Tieren ist beschrieben von Moynahan, Hum. Mol. Genet. 5 (1996), 875 und in Pflanzen von Offringa, EMBO J. 9 (1990) 3077. 


 XI. Glossar 
 



  Die folgenden Bezeichnungen werden nachstehend definiert, um dem Fachmann bei der Ausführung der Erfindung eine zusätzliche Anleitung zu geben: Adjuvans, Allel (& Allelsequenz), Aminosäuren (einschliesslich hydrophobe, polare, geladene), konservative Substitution, Kontrollelemente (und regulatorische Sequenzen), derivatisiert, nachweisbare Markierung, erhöhter Spiegel, Epitop, günstige und ungünstige Prognose, Fusionsprotein, Genprodukt, hTR, unsterblich, Immunogen und immunogen, isoliert, Modulator, Motiv, Nucleinsäure (& Polynucleotid), Oligonucleotide (& Oligomere), funktionell verknüpft, Polypeptide, Sonde (einschliesslich Nucleinsäuresonden und Antikörpersonden), rekombinant, Selektionssystem, Sequenz,  spezifische Bindung, stringente Hybridisierungsbedingungen (& Stringenz), wesentliche Identität (& wesentliche Ähnlichkeit), im wesentlichen rein (& im wesentlichen gereinigt),

   Telomerase-negative und Telomerase-positive Zellen, katalytische Aktivität von Telomerase, Telomeraseverwandt und Testverbindung. 



  *Der hier verwendete Ausdruck "Adjuvans" betrifft in seiner normalen Bedeutung jede Substanz, die die Immunantwort gegenüber einem Antigen, mit dem es vermischt ist, erhöht. Zu den für die vorliegende Erfindung nützlichen Adjuvantien gehören, jedoch ohne Beschränkung darauf, Freund's Adjuvans, Mineralgele, wie Aluminiumhydroxid, und oberflächenaktive Substanzen, beispielsweise Lysolecithin, pluronische Polyole, Polyanionen, Peptide, \lemulsionen, "Keyhole limpet"-Hemocyanin und Dinitrophenol. BCG ("Bacillus Calmette-Guerin") und Corynebacterium parvum sind ebenfalls nützliche Adjuvantien. 



  Die hier verwendete Bezeichnung "Allel" oder "Allelsequenz" betrifft eine alternative Form einer Nucleinsäuresequenz (d.h. einer hTRT-Protein codierenden Nucleinsäure). Allele sind das Ergebnis von Mutationen (d.h. Änderungen in der Nucleinsäuresequenz) und es kommt dadurch im allgemeinen zur Herstellung veränderter und/oder unterschiedlich regulierter mRNAs oder Polypeptide, deren Struktur und/oder Funktion geändert sein kann oder nicht. Übliche auf Mutationen beruhende Änderungen, die zur Entstehung von Allelen führen, werden allgemein natürlichen Deletionen, Additionen oder Substitutionen von Nucleotiden zugeschrieben, die die codierten Aminosäuren beeinflussen können oder auch nicht. Jede Art dieser Änderung kann allein vorkommen, in Kombination mit den anderen oder einmal oder öfter innerhalb eines gegebenen Gens, Chromosoms oder einer anderen zellulären Nucleinsäure.

   Jedes gegebene Gen kann keine, eine oder viele allele Formen haben. Die hier verwendete  Bezeichnung für "Allel" bezieht sich entweder auf ein Gen oder eine von dem Gen transkribierte mRNA oder beides. 



  Die hier beschriebenen "Aminosäuren" werden gelegentlich durch den Standard-Einbuchstabencode bezeichnet: Alanin (A), Serin (S), Threonin (T), Asparaginsäure (D), Glutaminsäure (E), Asparagin (N), Glutamin (Q), Arginin (R), Lysin (K), Isoleucin (I), Leucin (L), Methionin (M), Valin (V), Phenylalanin (F), Tyrosin (Y), Tryptophan (W), Prolin (P), Glycin (G), Histidin (H), Cystein (C). Dazu zählen auch synthetische und nicht-natürlich vorkommende Aminosäure-Analoge (und/oder Peptidverknüpfungen). 



  Der hier verwendete Ausdruck "hydrophobe Aminosäuren" bezieht sich auf A, L, I, V, P, F, W und M. Der hier verwendete Ausdruck "polare Aminosäuren" bezieht sich auf G, S, T, Y, C, N und Q. Der hier verwendete Ausdruck "geladene Aminosäuren" bezieht sich auf D, E, H, K und R. 



  Der hier verwendete Ausdruck "konservative Substitution" bezieht sich bei der Beschreibung eines Proteins auf eine Veränderung in der Aminosäurezusammensetzung des Proteins, die die Aktivität des Proteins nicht wesentlich verändert. Somit bezieht sich der Ausdruck "konservativ modifizierte Variationen" einer bestimmten Aminosäuresequenz auf Aminosäuresubstitutionen, bei denen Aminosäuren ausgetauscht sind, die für die Proteinaktivität nicht kritisch sind, oder auf die Substitution von Aminosäuren gegen andere Aminosäuren mit ähnlichen Eigenschaften (sauer, basisch, positiv oder negativ geladen, polar oder nicht-polar etc.), so dass die Substitutionen selbst von kritischen Aminosäuren die Aktivität nicht wesentlich ändern. Tabellen hinsichtlich konservativer Substitution, die funktionell ähnliche Aminosäuren aufzählen, sind auf dem Fachgebiet gut bekannt.

   Die folgenden sechs Gruppen enthalten jeweils Aminosäuren, die gegenüber einander konservative Substitutionen darstellen: 1) Alanin (A), Serin (S), Threonin (T); 2)  Asparaginsäure (D) Glutaminsäure (E) 3) Asparagin (N), Glutamin (Q); 4) Arginin (R), Lysin (K), 5) Isoleucin (I), Leucin (L) Methionin (M); Valin (V); und 6) Phenylalanin (F), Tyrosin (Y), Tryptophan (W) (siehe auch Creighton, Proteins, (1984), W.H. Freeman and Company). Für den Fachmann ist es offensichtlich, dass die vorstehend angegebenen Austausche nicht die einzigen möglichen konservativen Substitutionen darstellen. Beispielsweise könnte man den Austausch einer geladenen Aminosäure gegen eine andere geladene Aminosäure als konservative Substitution erachten, unabhängig davon, ob sie positiv oder negativ geladen ist.

   Zusätzlich sind individuelle Substitutionen, Deletionen oder Additionen, die eine einzelne Aminosäure oder einen kleinen Prozentsatz von Aminosäuren in einer codierten Sequenz ändern, hinzufügen oder deletieren, ebenfalls "konservativ modifizierte Variationen". Eine "konservative Substitution" kann in ein rekombinantes Protein dadurch eingeführt werden, dass ein oder mehrere Codons verwendet werden, die sich von den Codons unterscheiden, die von dem nativen Gen oder Wildtyp-Gen verwendet werden. In diesem Fall beinhaltet eine konservative Substitution auch die Substitution eines Codons für eine Aminosäure gegen ein anderes Codon für dieselbe Aminosäure. 



  Die hier verwendeten Bezeichnungen "Kontrollelemente" oder "regulatorische Sequenzen" beinhalten Enhancer, Promotoren, Transkriptionsterminatoren, Replikationsursprünge, chromosomalintegrierte Sequenzen, 5 min - und 3 min - nicht translatierte Bereiche, mit denen Proteine oder andere Biomoleküle zur Durchführung von Transkription und Translation interagieren. Bei eukaryotischen Zellen enthalten die Kontrollsequenzen einen Promotor und vorzugsweise einen Enhancer, der beispielsweise von Immunglobulingenen, SV40, Cytomegalovirus stammt, und eine Polyadenylierungssequenz. Sie können auch Donor- und Akzeptor-Sequenzen für die Spleissung enthalten. Je nach  verwendetem Vektorsystem und verwendetem Wirt kann eine beliebige Anzahl von geeigneten Transkriptions- und Translationselementen zu denen auch konstitutive und induzierbare Promotoren gehören, verwendet werden. 



  Die hier verwendete Bezeichnung "derivatisierte(s)" Polynucleotid, Oligonucleotid oder Nucleinsäure bezieht sich auf ein Oligo- oder Polynucleotid, das einen derivatisierten Substituenten umfasst. In einigen Ausführungsformen ist der Substituent im wesentlichen hinsichtlich der Hybridisierung mit komplentären Polynucleotiden nicht störend. Derivatisierte Oligo- oder Polynucleotide, die mit hinzugefügten chemischen Substituenten modifiziert wurden (z.B. durch Modifikation eines bereits synthetisierten Oligo- oder Polynucleotids oder durch Einbau einer modifizierten Base oder eines Rückgrat-Analogen während der Synthese) können in eine metabolisch aktive eukaryotische Zelle eingeführt werden, um mit einer hTRT-DNA, -RNA oder einem hTRT-Protein zu hybridisieren, wobei sie eine Veränderung oder chemische Modifikation an einer dortigen DNA, RNA oder einem dortigen Protein erzeugen.

   In einer alternativen Ausführungsform können die derivatisierten Oligo- oder Polynucleotide mit hTRT-Polypeptiden, Telomerase-assoziierten Proteinen oder anderen Faktoren, die mit hTRT-DNA oder hTRT-Genprodukten interagieren, in Wechselwirkung treten und diese ändern, oder die Expression oder Funktion von hTRT-DNA oder -RNA oder -Proteinen ändern oder modulieren. Zu den Beispielen für angeknüpfte chemische Substituenten zählen: Europium (III) texaphyrin, quervernetzende Mittel, Psoralen, Metallchelate (z.B. Eisen/EDTA-Chelat für eine Eisen-katalysierte Spaltung), Topoisomerasen, Endonucleasen, Exonucleasen, Ligasen, Phosphodiesterasen, photodynamische Porphyrine, chemotherapeutische Wirkstoffe (z.B. Adriamycin, Doxirubicin), interkalierende Mittel, Basen-modifizierende Mittel, Immunglobulinketten und Oligonucleotide.

   Eisen/EDTA-Chelate sind chemische Substituenten, die oft dann verwendet  werden, wenn eine lokale Spaltung einer Polynucleotidsequenz erwünscht ist (Hertzberg et al., J. Am. Chem. Soc. 104 (1982), 313; Hertzberg und Dervan, Biochemistry 23 (1984), 3934; Taylor et al., Tetrahedron 40 (1984), 457 und Dervan, Science 232 (1986), 464). Zu Beispielen von chemischen Verfahren zur Anknüpfung zählen: direkte Verbindung z.B. über eine angehängte reaktive Aminogruppe (Corey und Schultz, Science 238 (1988), 1401, wobei dieses Dokument durch Bezugnahme als Bestandteil dieser Beschreibung anzusehen ist) und andere chemische Verfahren für direkte Verbindungen, wobei allerdings auch Verbindungsverfahren für Streptavidin/Biotin und Digoxigenin/anti-Digoxigenin-Antikörper verwendet werden können.

   Verfahren zur Kopplung chemischer Substituenten werden bereitgestellt in den US-Patenten 5 135 720, 5 093 245, und 5 055 556, die aufgrund der Bezugnahme als Bestandteil dieser Beschreibung angesehen werden können. Andere chemische Kopplungsverfahren liegen im Ermessen des Fachmanns. 



  Die hier verwendete Bezeichnung "nachweisbare Markierung" besitzt die auf dem Fachgebiet übliche Bedeutung und betrifft ein Atom (z.B. ein Radionuclid), Molekül (z.B. Fluorescein) oder einen Komplex, der dafür verwendet wird oder dafür verwendet werden kann, um die Anwesenheit eines Moleküls nachzuweisen (z.B. aufgrund einer physikalischen oder chemischen Eigenschaft) oder anzuzeigen, oder um die Bindung eines anderen Moleküls zu ermöglichen, an das es kovalent gebunden oder eng assoziiert ist. Die Bezeichung "Markierung" bezieht sich auch auf kovalent gebundene oder eng assoziierte Moleküle (z.B. ein Biomolekül, beispielsweise ein Enzym), das auf ein Substrat zur Erzeugung eines nachweisbaren Atoms, Moleküls oder Komplexes einwirkt.

   Zu den für die erfindungsgemässe Verwendung geeigneten nachweisbaren Markierungen zählen alle Zusammensetzungen, die durch spektroskopische, photochemische, biochemische, immunchemische, elektrische, optische oder chemische Mittel nachweisbar sind. Zu den für  die vorliegende Erfindung nützlichen Markierungen gehören Biotin zur Anfärbung mit markiertem Streptavidin-Konjugat, magnetische Kügelchen (z.B. DynabeadsÖ), Fluoreszenzfarbstoffe (z.B. Fluorescein,Texas-rot, Rhodamin, grün-fluoreszierendes Protein ("greenfluorescent protein"), verstärktes grün-fluoreszierendes Protein ("enhanced green fluorescent protein"), Lissamin, Phycoerythrin, Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7, "FluorX" (Amersham), "SyBR Green I & II" (Molecular Probes), etc.), radioaktive Markierungen (z.B. <3>H, <1><2><5>I, <3><5>S, <1><4>C oder <3><2>P), Enzyme (z.B.

   Hydrolasen, insbesondere Phosphatasen, wie beispielsweise alkalische Phosphatase, Esterasen und Glycosidasen oder Oxidoreductasen, insbesondere Peroxidasen, wie beispielsweise Meerrettichperoxidase und andere üblicherweise in einem ELISA verwendete Enzyme), Substrate, Cofaktoren, Inhibitoren, chemiluminescente Gruppen, chromogene Mittel und colorimetrische Markierungen, wie beispielsweise kolloidales Gold oder gefärbte Glas- oder Plastik (z.B. Polystyrol, Polypropylen, Latexetc.) Kügelchen. Zu denen Patenten, deren Lehre die Verwendung solcher Markierungen betrifft, zählen US-Patent 3 817 837; 3 850 752; 3 939 350; 3 996 345; 4 277 437; 4 275 149 und 4 366 241. Mittel zum Nachweis solcher Markierungen sind dem Fachmann gut bekannt.

   Somit können beispielsweise radioaktive Markierungen und chemilumineszente Markierungen mittels eines photographischen Films oder Szintillationszählern nachgewiesen werden und Fluoreszenzmarker können zum Nachweis von emitiertem Licht mit einem Photodetektor (z.B. bei der Fluoreszenz aktivierten Zellsortierung) nachgewiesen werden. Enzymatische Markierungen werden typischerweise dadurch nachgewiesen, dass das Enzym mit einem Substrat versehen wird und dass durch die Wirkung des Enzyms auf das Substrat das erzeugte Reaktionsprodukt nachgewiesen wird. Colorimetrischen Markierungen werden einfach durch Sichtbarmachung der gefärbten Markierung nachgewiesen. Somit ist eine Markierung jede Zusammensetzung, die durch  spektroskopische, photochemische, biochemische, immunchemische, elektrische, optische oder chemische Mittel nachweisbar ist.

   Die Markierung kann an den gewünschten Assay-Bestandteil gemäss auf dem Fachgebiet gut bekannter Verfahren direkt oder indirekt gekoppelt werden. Nicht radioaktive Markierungen werden oft durch indirekte Mittel angebracht. Im allgemeinen ist ein Ligandenmolekül (z.B. Biotin) kovalent an das Molekül gebunden. Der Ligand bindet dann ein anti-Ligandenmolekül (z.B. Streptavidin), das entweder inhärent nachweisbar ist oder an ein ein Signal erzeugendes System kovalent gebunden ist, wie beispielsweise ein nachweisbares Enzym, eine fluoreszierende Verbindung oder eine chemilumineszierende Verbindung. Es kann eine Reihe von Liganden und anti-Liganden verwendet werden. In den Fällen, in denen ein Ligand einen natürlichen anti-Liganden aufweist, beispielsweise Biotin, Thyroxin oder Cortison, kann er in Verbindung mit den markierten, natürlich vorkommenden anti-Liganden verwendet werden.

   Alternativ kann jedes Hapten oder jede antigene Verbindung in Kombination mit einem Antikörper verwendet werden. Die Moleküle können auch direkt an signalerzeugende Verbindungen konjugiert sein, beispielsweise durch Konjugation mit einem Enzym oder Fluorophor. Mittel zum Nachweis von Markierungen sind dem Fachmann gut bekannt. Somit zählen beispielsweise dann, wenn die Markierung eine radioaktive Markierung ist, zu den Nachweismitteln ein Szintillationszähler, photographischer Film, wie bei der Autoradiographie, oder eine Bildgebung mittels gespeichertem Phosphor ("storage phosphor imaging"). Eine Fluoreszenzmarkierung kann durch Anregung des Fluorchroms mit Licht einer geeigneten Wellenlänge und dem Nachweis der erhaltenen Fluoreszenz nachgewiesen werden.

   Die Fluoreszenz kann visuell nachgewiesen werden, mit Hilfe eines photographischen Films, mittels eines elektronischen Detektors, wie beispielsweise ladungsgekoppelte Vorrichtungen (CCDs) oder Sekundärelektronenvervielfacher etc. Auf ähnliche Weise können enzymatische Markierungen dadurch nachgewiesen  werden, dass für das Enzym die geeigneten Substrate bereitgestellt werden, und das erhaltene Reaktionsprodukt nachgewiesen wird. Auch können einfache colorimetrische Markierungen durch die Beobachtung der mit der Markierung assoziierten Farbe nachgewiesen werden. Wenn Paare von Fluorophoren in einem Assay verwendet werden, wird es oft bevorzugt, dass diese unterschiedliche Emissionsmuster (Wellenlängen) besitzen, so dass sie leicht unterschieden werden können. 



  Die Bezeichnung "erhöhter Spiegel" bezieht sich auf eine Menge an hTRT-Genprodukt (oder einer anderen angegebenen Substanz oder Aktivität) in einer Zelle, die erhöht ist, oder höher im Vergleich mit dem Spiegel in einem Referenzstandard, zu dem Spiegel in normalen Telomerasenegativen Zellen in einer Person oder in anderen Personen, die nicht an dem entspechenden Zustand leiden, beispielsweise für eine Diagnose, und für eine Prognose, zum Spiegel in Tumorzellen von einer Reihe von Stadien, oder Klassen von beispielsweise Tumoren. 



  Der hier verwendete Ausdruck "Epitop" hat seine übliche Bedeutung, d.h. er bezieht sich auf eine Stelle auf einem Antigen, die von einem Antikörper erkannt wird. Epitope sind typische Abschnitte von Aminosäuren, die einen kleinen Anteil des Gesamtproteins darstellen. Epitope können die Konformation betreffen (d.h. diskontinuierlich). Das heisst, sie können durch Aminosäuren gebildet werden, die von nichtzusammenhängenden Teilen an Primersequenz codiert werden, und die aufgrund der Proteinfaltung nebeneinander zu liegen kommen. 



  Die Bezeichnungen "günstige Prognose" und "ungünstige Prognose" sind auf dem Fachgebiet bekannt. Im Zusammenhang mit Krebs bedeutet "günstige Prognose", dass sich ein Tumor wahrscheinlich zurückbilden wird, oder längere Überlebenschancen für Patienten mit einer günstigen Prognose  bestehen im Vergleich zu denen mit einer ungünstigen Prognose, während der Ausdruck "ungünstige Prognose" bedeutet, dass der Tumor wahrscheinlich aggressiver ist, was zu einem schlechten Krankheitsverlauf für den Patienten führt oder einem schnellerem Fortschreiten der Krankheit. 



  Der hier verwendete Ausdruck "Fusionsprotein" bezieht sich auf ein zusammengesetztes Protein, d.h. eine einzelne zusammenhängende Aminosäuresequenz, die aus zwei (oder mehreren) unterschiedlichen heterologen Polypeptiden aufgebaut ist, die normalerweise nicht in einer einzigen Aminosäuresequenz zusammen fusioniert sind. Somit kann ein Fusionsprotein eine einzelne Aminosäuresequenz beinhalten, die zwei vollkommen verschiedene Aminosäuresequenzen enthält oder zwei ähnliche oder identische Polypeptidsequenzen, vorausgesetzt, dass diese Sequenzen normalerweise nicht zusammen in einer einzigen Aminosäuresequenz aufgefunden werden.

   Fusionsproteine können allgemein unter Verwendung entweder von Nucleinsäure-Rekombinationsverfahren hergestellt werden, d.h. als das Ergebnis von Transkription und Translation eines rekombinanten Genfusionsprodukts, wobei die Fusion einen Abschnitt umfasst, der ein erfindungsgemässes Polypeptid codiert und einen Abschnitt, der ein heterologes Protein codiert, oder durch auf dem Fachgebiet allgemein bekannte chemische Syntheseverfahren. Der (Die) nicht-hTRT-Bereich(e) des Fusionsproteins können an den Aminoterminus des hTRT-Polypeptids, den Carboxy-Terminus oder beide fusioniert werden. 



  Der hier verwendete Ausdruck "Genprodukt" bezieht sich auf ein von einem Gen transkribiertes RNA-Molekül oder ein Protein, das von dem Gen codiert oder von der RNA translatiert wird. 



  Der hier verwendete Ausdruck "hTR" (menschliche Telomerase-RNA) bezieht sich auf den RNA-Bestandteil von menschlicher Telomerase und aller natürlich vorkommender Allele und  Varianten oder rekombinate Varianten. hTR wird ausführlich in dem US-Patent Nr. 5 583 016 beschrieben, das durch Bezugnahme in seiner Gesamtheit und für alle Zwecke als Bestandteil dieser Beschreibung angesehen werden kann. 



  Der hier verwendete Ausdruck "unsterblich" hat, wenn er sich auf eine Zelle bezieht, seine normale Bedeutung auf dem Telomerase betreffenden Fachgebiet und bezieht sich auf Zellen, die ein offensichtlich unbegrenztes replikatives Potential besitzen. Der Ausdruck "unsterblich" kann sich auch auf Zellen mit erhöhter Proliferationsfähigkeit im Vergleich zu ihren unmodifizierten Gegenstücken beziehen. Beispiele für unsterbliche menschliche Zellen sind maligne Tumorzellen, Keimbahnzellen und bestimmte transformierte menschliche Zellinien, die in vitro kultiviert sind (z.B. Zellen, die nach Transformation durch virale Oncogene unsterblich wurden). Im Gegensatz dazu sind die meisten normalen menschlichen somatischen Zellen sterblich, d.h. sie besitzen ein begrenztes replikatives Potential und werden nach einer ähnlichen Zahl von Zellteilungen senescent. 



  Die hier verwendeten Ausdrücke "Immunogen" und "immunogen" haben die auf diesem Fachgebiet übliche Bedeutung, d.h. ein Immunogen ist ein Molekül, beispielsweise ein Protein oder ein anderes Antigen, das eine adaptive Immunantwort nach Injektion in eine Person oder ein Tier auslöst. 



  Der hier verwendete Ausdruck "isoliert" bedeutet, wenn er sich auf ein Molekül oder eine Zusammensetzung bezieht, beispielsweise auf ein RNP (z.B. mindestens ein Protein und mindestens eine RNA), dass das Molekül oder die Zusammensetzung von mindestens einer weiteren Verbindung (z.B. ein Protein, andere RNAs oder andere Verunreinigungen mit denen es in vivo oder in seinem natürlich vorkommenden Status assoziiert ist, abgetrennt wurde. Somit wird ein RNP dann als "isoliert" angesehen, wenn er beispielsweise von einer Zellmembran, beispielsweise aus einem Zellextrakt,  isoliert wurde. Eine isolierte Zusammensetzung kann jedoch auch im wesentlichen rein sein. 



  Der hier verwendete Begriff "Modulator" bezieht sich auf jede synthetische oder natürliche Verbindung oder Zusammensetzung, die auf beliebige Weise sowohl die "volle" oder jede "Teilaktivität" einer Telomerase-reversen Transkriptase (TRT) verändern kann. Ein Modulator kann ein Agonist oder ein Antagonist sein. Ein Modulator kann, allerdings ohne Beschränkung darauf, eine beliebige organische oder anorganische Verbindung sein. Dazu gehören beispielsweise kleine Moleküle, Peptide, Proteine, Zucker, Nucleinsäure, Fettsäuren etc.

   Die hier verwendete Bezeichnung "Motiv" bezieht sich auf eine Sequenz von aufeinanderfolgenden Aminosäuren (oder auf eine Nucleinsäuresequenz, die eine Sequenz von aufeinanderfolgenden Aminosäuren codiert), die ein Merkmal oder eine Struktur in einem Protein definiert, die allen Proteinen einer definierten Klasse oder eines definierten Typs gemeinsam ist, oder innerhalb dieser Proteine konserviert ist. Das Motiv oder die "Konsensus"-Sequenz können sowohl konservierte als auch nicht-konservierte Reste enthalten, die konservierten Reste in der Motivsequenz zeigen jedoch an, dass der konservierte Rest oder die Klasse von Resten (d.h. hydrophob, polar, nicht-polar oder eine andere Klasse) typischerweise an der angegebenen Position in jedem Protein (oder Gen oder mRNA) der Klasse von Proteinen, die durch das Motiv definiert sind, vorhanden ist. 

   Motive können sich entsprechend der Proteinklasse unterscheiden. Somit bilden beispielsweise die reverse Transkriptase-Enzyme eine Klasse von Proteinen, die durch eines oder mehrere Motive definiert sein kann und zu dieser Klasse gehören auch Telomerase-Enzyme. Die Telomerase-Enzyme können jedoch als die Klasse von Enzymen mit Motiven definiert werden, die für diese Klasse charakteristisch sind. Es ist für den Fachmann offensichtlich, dass die Identifizierung eines Restes als konservierter Rest in einem Motiv nicht bedeutet, dass jedes  Mitglied der durch das Motiv definierten Klasse diesen angegebenen Rest (oder Klasse von Resten) an der angegebenen Position aufweist und dass eines oder mehrere Mitglieder der Klasse einen unterschiedlichen Rest an der konservierten Position besitzen kann (können). 



  Die hier verwendeten Ausdrücke "Nucleinsäure" und "Polynucleotid" werden gegenseitig austauschbar verwendet. Bei der Verwendung des Ausdrucks "Polynucleotid" ist der Ausschluss von Oligonucleotiden (d.h. kurzen Polynucleotiden) nicht beabsichtigt und dieser Ausdruck kann sich auch auf synthetische und/oder nicht-natürlich vorkommende Nucleinsäuren beziehen (d.h. Nucleinsäure-Analoge oder modifizierte Rückgratreste oder Bindungen umfassen). 



  Die hier verwendeten Ausdrücke "Oligonucleotide" oder "Oligomere" beziehen sich auf eine Nucleinsäuresequenz aus etwa 7 Nucleotiden oder mehr und bis zu etwa 700 Nucleotiden, die als eine Sonde oder "Amplimer" verwendet werden können. Oligonucleotide weisen vorzugsweise eine Länge von zwischen etwa 10 und etwa 50 Nucleotiden auf, mehr bevorzugt von etwa 14 bis etwa 35 Nucleotiden und am meisten bevorzugt von etwa 15 bis etwa 25 Nucleotiden und dieser Ausdruck kann sich auch auf synthetische und/oder nicht natürlich vorkommende Nucleinsäuren beziehen (d.h. Nucleinsäure-Analoge oder modifizierte Rückgratreste oder Bindungen umfassen). 



  Der hier verwendete Ausdruck "funktionell verknüpft" bezieht sich auf eine funktionelle Beziehung zwischen zwei oder mehr Nucleinsäuresegmenten (z.B. DNA): Beispielsweise ist ein Promotor oder Enhancer mit einer codierenden Sequenz funktionell verknüpft, wenn er die Transkription der Sequenz in einer geeigneten Wirtszelle oder einem anderen Expressionssystem stimuliert. Sequenzen, die funktionell verknüpft sind, sind im allgemeinen aufeinanderfolgend und im Fall einer Signalsequenz sowohl aufeinanderfolgend und im  Leserahmen. Enhancer müssen jedoch nicht in enger Nachbarschaft zu den codierenden Sequenzen, deren Transkription sie erhöhen sollen, gelegen sein. 



  Der hier verwendete Ausdruck "Polypeptid" und die Bezeichnung "Protein" werden gegenseitig austauschbar verwendet und beziehen sich auf ein Polymer, das aus Aminosäureresten zusammengesetzt ist, wozu synthetische, natürlich vorkommende und nicht natürlich vorkommende Analoge davon zählen. Peptide sind Beispiele für Polypeptide. 



  Der hier verwendete Ausdruck "Sonde" bezieht sich auf ein Molekül, das ein anderes Molekül spezifisch bindet. Ein Beispiel einer Sonde ist eine "Nucleinsäuresonde", die an eine im wesentlichen komplementäre Nucleinsäure spezifisch bindet (d.h. sich anlagert oder hybridisiert). Ein weiteres Beispiel einer Sonde ist eine "Antikörper-Sonde", die an ein entsprechendes Antigen oder Epitop spezifisch bindet. 



  Der hier verwendete Ausdruck "rekombinant" bezieht sich auf ein Polynucleotid, das in vitro synthetisiert oder auf andere weise manipuliert wurde (z.B. ein "rekombinantes Polynucleotid"), auf Verfahren, die sich auf die Verwendung rekombinanter Polynucleotide zur Herstellung von Genprodukten in Zellen oder anderen biologischen Systemen beziehen oder auf ein Polypeptid ("rekombinantes Protein"), das von einem rekombinanten Polynucleotid codiert wird. 



  Der hier verwendet Ausdruck "Selektionssystem" bezieht sich im Zusammenhang mit stabil transformierten Zellinien auf ein Verfahren zur Identifizierung und/oder Selektion von Zellen, die eine gewünschte rekombinante Nucleinsäure enthalten. Eine grosse Vielzahl von Selektionssystemen zur Identifizierung von transformierten Zellen ist bekannt und diese sind zur Anwendung bei der vorliegenden Erfindung geeignet.

   Beispielsweise können durch Plasmide oder andere  Vektoren transformierte Zellen durch die Resistenz gegen Antibiotika selektiert werden, die durch auf den Plasmiden enthaltene Gene verliehen wird, beispielsweise die gut bekannten Gene amp, gpt, neo und hyg oder andere Gene, wie beispielesweise die Herpes simplex-Virus-Thymidinkinase-Gene (Wigler et al., Cell 11 (1977), 223-32 und das Adeninphosphoribosyltransferasegen (Lowy et al., Cell 22 (1980), 817), die in tk<->- bzw. aprt<->-Zellen verwendet werden können. Auch die Resistenz gegen einen Antimetaboliten, ein Antibiotikum oder Herbizid kann als Basis für eine Selektion verwendet werden; beispielsweise dhfr, das Resistenz gegen Metotrexat verleiht und auch für eine Genamplifikation von Nutzen ist (Wigler et al. Proc. Natl. Acad.

   Sci., 77 (1980), 3567); npt, das Resistenz gegen die Aminoglykoside Neomycin und G-418 verleiht (Colbere-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150 (1981), 1) und als oder pat, die Resistenz gegen Chlorsulfuron bzw. Phosphinotricin-Acetyltransferase verleihen (Murry, in McGraw Hill Yearbook of Science and Technology, McGraw Hill, New York NY, Seiten 191-196 (1992)). Es werden weitere selektierbare Gene beschrieben, beispielsweise trpB, ein Gen das Hygromycin-Resistenz verleiht und Zellen erlaubt anstelle von Tryptophan Indol zu verwenden, oder hisD, das es Zellen erlaubt anstelle von Histidin Histinol zu verwenden (Hartman und Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci., 85 (1988), 8047).

   Erst kürzlich hat dieVerwendung von sichtbaren Markern grosse Popularität erreicht, wobei solche Marker wie Anthocyanine,  beta -Glucuronidase und dessen Substrat, GUS und Luciferase und dessen Substrat, Luciferin, nicht nur zur Identifizierung von Transformanten beide Verwendung finden sondern auch zur Quantifizierung der Menge von transienter oder stabiler Proteinexpression, die einem spezifischen Vektorsystem zugeschrieben werden kann (Rhodes et al., Meth. Mol. Biol 55 (1995), 121). 



  Der hier verwendete Ausdruck "Sequenz" eines Gens, einer Nucleinsäure, eines Proteins oder Peptids bezieht sich  (falls nicht spezifisch anders angegeben) auf die Anordnung von Nucleotiden entweder in einem Strang oder beiden Strängen eines doppelsträngigen DNA-Moleküls, beispielsweise auf die Sequenz sowohl des codierenden Strangs als auch des dazu komplementären Strangs, oder in einem einzelsträngigen Nucleinsäuremolekül, oder auf die Anordnung von Aminosäuren in einem Peptid oder Protein. 



  Der hier verwendete Ausdruck "spezifisch bindend" bezieht sich auf die Fähigkeit eines Moleküls, typischerweise eines Antikörpers oder Polynucleotids, mit einem anderen spezifischen Molekül selbst in Gegenwart von vielen anderen unterschiedlichen Molekülen in Kontakt zu kommen und zu assoziieren. Beispielsweise kann ein einzelsträngiges Polynucleotid spezifisch an ein einzelsträngiges Polynucleotid, das in seiner Sequenz komplementär ist, spezifisch binden, und ein Antikörper bindet spezifisch an sein korrespondierendes Antigen (oder "ist spezifisch immunreaktiv damit"). 



  Der hier verwendete Ausdruck "stringente Hybridisierungsbedingungen" oder "Stringenz" bezieht sich auf Bedingungen im Bereich von etwa 5 DEG C bis etwa 20 DEG C oder 25 DEG C unter der Schmelztemperatur (Tm) der Zielsequenz und einer Sonde mit einer exakten oder fast exakten Komplementarität zum Ziel. Der hier verwendete Ausdruck "Schmelztemperatur" bezieht sich auf die Temperatur, bei der eine Population von doppelsträngigen Nucleinsäuremolekülen halb in Einzelstränge dissoziiert. Verfahren zur Berechnung des Tm von Nucleinsäuren sind auf dem Fachgebiet allgemein bekannt (siehe z.B. Berger und Kimmel (1987) Methods in Enzymology, Bd. 152: Guide to Molecular Cloning Techniques, San Diego: Academic Press, Inc. und Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2.

   Ausgabe, Bände 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory (nachstehend als "Sambrook" bezeichnet), wobei beide Dokumente aufgrund der Bezugnahme als Bestandteil dieser Beschreibung angesehen werden  können). Wie in Standardreferenzen angegeben, kann eine einfache Bestimmung des Tm-Wertes anhand der Gleichung: Tm = 81,5 + 0,41 (% G + C) berechnet werden, wenn eine Nucleinsäure sich in wässriger Lösung bei 1 M NaCl befindet (siehe z.B. Anderson und Young, Quantitative Filter Hybridization in: Nucleic Acid Hybridization (1985)). Andere Referenzen enthalten verfeinerte Berechnungen, wobei sowohl strukturellen Merkmalen als auch Sequenzmerkmalen bei der Berechnung des Tm Rechnung getragen wird.

   Die Schmelztemperatur eines Hybrids (und somit die Bedingungen für eine stringente Hybridisierung) werden durch verschiedene Faktoren beeinflusst, beispielsweise die Länge und Art (DNA, RNA, Basenzusammensetzung) der Sonde und der Art des Ziels (DNA, RNA, Basenzusammensetzung, in Lösung vorhanden oder immobilisiert etc.) und der Konzentration von Salzen und anderen Bestandteilen (z.B. das Vorhandensein oder Fehlen von Formamid, Dextransulfat, Polyethylenglykol). Die Auswirkungen dieser Faktoren sind allgemein bekannt und werden in Standardreferenzen bezüglich dieses Fachgebiets diskutiert; siehe z.B. Sambrook, a.a.O., und Ausubel et al., a.a.O.

   Typischerweise entsprechen stringente Hybridisierungsbedingungen Salzkonzentrationen unter etwa 1,0 M Natriumionen, typischerweise etwa 0,01 bis 1,0 M Natriumionen bei einem pH-Wert von 7,0 bis 8,3 und Temperaturen von mindestens etwa 30 DEG C für kurze Sonden (z.B. 10 bis 50 Nucleotide) und mindestens etwa 60 DEG C für lange Sonden (z.B. über 50 Nucleotide). Wie bereits angemerkt, können stringente Bedingungen auch durch die Zugabe von destabilisierenden Mitteln wie beispielsweise Formamid erreicht werden, wobei in diesem Fall niedrigere Temperaturen angewandt werden können. 



  Der hier verwendete Ausdruck "wesentliche Sequenzidentität" im Zusammenhang mit Nucleinsäuren bezieht sich auf das Ausmass von Sequenzähnlichkeit zwischen zwei Polynucleotiden. Wesentliche Sequenzidentität kann durch Hybridisierung unter stringenten Bedingungen, durch direkten Vergleich oder  andere Massnahmen bestimmt werden. Beispielsweise können zwei Polynucleotide als wesentliche Sequenzidentität aufweisend identifiziert werden, wenn sie miteinander unter stringenten Hybridisierungsbedingungen spezifisch hybridisieren können. Andere Grade an Sequenzidentität (z.B. weniger als "wesentlich" können durch Hybridisierung unter unterschiedlichen Stringenz-Bedingungen charakterisiert werden. Alternativ kann wesentliche Sequenzidentität als ein Prozentsatz an Identität zwischen zwei Nucleotidsequenzen (oder Polypeptidsequenzen) beschrieben werden.

   Zwei Sequenzen werden dann als wesentlich identisch erachtet, wenn sie zu mindestens etwa 60% identisch sind, bevorzugt mindestens etwa 70%, mindestens etwa 80%, mindestens etwa 90% oder mindestens etwa 95 oder 98 bis 100%. Die prozentuale Sequenzidentität (Nucleotid oder Aminosäure) wird typischerweise durch Bestimmung der optimalen Ausrichtung zwischen zwei Sequenzen oder durch Vergleichen der zwei Sequenzen berechnet. Beispielsweise kann ein für eine "sense"-Suppression verwendetes exogenes Transkript als ein bestimmter Prozentsatz an Identität oder Ähnlichkeit im Vergleich zu einer Referenzsequenz (z.B. der korrespondierenden endogenen Sequenz) aufweisen, beschrieben werden. Die optimale Ausrichtung von Sequenzen kann unter Verwendung des Algorithmus von Smith und Waterman, Adv. Appl.

   Math. 2 (1981), 482, der sich auf die lokale Homologie bezieht ("local homology algorithm") durchgeführt werden, durch den Algorithmus, der sich auf die Homologie-Ausrichtung bezieht, ("homology alignment algorithm") von Needleman und Wunsch, J. Mol. Biol. 48 (1970), 443, durch das "search for similarity"-Verfahren von Pearson und Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 2444, durch Ausführung dieser Algorithmen mittels Computer (GAP, BESTFIT, FASTA und TFASTA in dem Software-Paket von Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) oder durch Betrachtung. Die beste Ausrichtung (die den höchsten Prozentsatz an Identität ergibt), die durch die verschiedenen Verfahren erzeugt  wurde, wird ausgewählt.

   Typischerweise vergleichen diese Algorithmen zwei Sequenzen über ein "Vergleichsfenster" (normalerweise mit einer Länge von mindestens 18 Nucleotiden) um so lokale Bereiche an Sequenzähnlichkeit identifizieren und vergleichen zu können, wobei kleine Additionen oder Deletionen (d.h. Lücken) erlaubt sind. Additionen und Deletionen betragen typischerweise 20% oder weniger der Länge der Sequenz relativ zu der Referenzsequenz, die keine Additionen oder Deletionen enthält. Es ist gelegentlich wünschenswert, Sequenzidentität zwischen zwei Sequenzen im Bezug auf eine bestimmte Länge oder einen bestimmten Bereich zu beschreiben (z.B. können zwei Sequenzen als mindestens 95% Identität über eine Länge von mindestens 500 Basenpaaren aufweisend beschrieben werden). Normalerweise beträgt die Länge mindestens etwa 50, 100, 200, 300, 400 oder 500 Basenpaare, Aminosäuren oder andere Reste.

   Der Prozentsatz an Sequenzidentität wird durch Vergleich zweier optimal ausgerichteter Sequenzen über den Vergleichsbereich berechnet, die Bestimmung der Anzahl an Positionen, an denen die identischen Nucleinsäurebase (z.B. A, T, C, G oder U) in beiden Sequenzen vorkommt, um so die Anzahl an gepaarten Positionen zu ermitteln, und durch Bestimmung der Anzahl (oder des Prozentsatzes) an gepaarten Positionen im Vergleich zu der Gesamtanzahl von Basen in der Referenzsequenz oder der Vergleichsregion. Ein zusätzlicher Algorithmus, der für die Bestimmung von Sequenzähnlichkeit geeignet ist, ist der BLAST-Algorithmus, der beschrieben ist in Altschul, J. Mol. Biol. 215 (1990), 403-410 und Shpaer, Genomics 38 (1996), 179-191. Software zur Durchführung von BLAST-Analysen ist öffentlich erhältlich bei National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).

   Dieser Algorithmus beinhaltet zuerst die Identifizierung von Sequenzpaaren mit denen viele Treffer erreicht werden ("high scoring sequence pairs, HSPs)") durch die Identifizierung kurzer Wörter mit der Länge W in der Abfragesequenz, die mit einem positiv bewerteten Punkt T übereinstimmen oder diesen erfüllen, wenn  sie gegen ein Wort derselben Länge in einer Datenbanksequenz ausgerichtet werden. T bezieht sich auf die "neighborhood word score threshold" (Altschul et al., a.a.O.). Diese anfänglichen Treffer des Nachbarschaftsworts wirken als Ausgangspunkte für die Initiierung von Suchvorgängen, die zur Auffindung von längeren, diese enthaltenden HSPs führen sollen. Die Worttreffer werden in beiden Richtungen entlang jeder Sequenz verlängert, soweit der Treffer bezüglich der kumulativen Ausrichtung erhöht werden kann.

   Die Verlängerung der Worttreffer in jeder Richtung kommt zum Stillstand, wenn: der Treffer bezüglich der kumulativen Ausrichtung verringert sich um die Menge X von dem maximal erreichbaren Wert; der kumulative Treffer geht gegen 0 oder darunter aufgrund der Akkumulation von einer oder mehreren Ausrichtungen von negative Treffer erzielenden Resten; oder das Ende jeder Sequenz ist erreicht. Die Parameter W, T und X des BLAST-Algorithmus bestimmen die Empfindlichkeit und die Schnelligkeit der Ausrichtung. Das BLAST-Programm verwendet als Voreinstellung eine Wortlänge (W) von 11, die "BLOSUM62 scoring matrix" (siehe Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992), 10915-10919), Ausrichtungen (B) von 50, Erwartung (E) von 10, M = 5, N = -4, und eines Vergleichs beider Stränge.

   Der Ausdruck BLAST bezieht sich auf den BLAST-Algorithmus, der eine statistische Analyse der Ähnlichkeit zwischen zwei Sequenzen durchführt; siehe beispielsweise Karlin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993), 5873-5787. Eine durch den BLAST-Algorithmus gelieferte Ähnlichkeitsmessung ist die kleinste Wahrscheinlichkeit der Summe ("smallest sum probability") (P(N)), die die Wahrscheinlichkeit anzeigt, mit der eine Paarung zwischen zwei Nucleotiden oder Aminosäuresequenzen zufällig vorkommen würde. Beispielsweise kann eine Nucleinsäure als zu einer TRT-Nucleinsäure ähnlich erachtet werden, wenn die kleinste Wahrscheinlichkeit der Summe ("smallest sum probability") beim Vergleich der Test-Nucleinsäure mit einer TRT-Nucleinsäure weniger als etwa 0,5, 0,2, 0,1, 0,01 oder 0,001 ist.

   Alternativ ist ein anderes Anzeichen dafür, dass zwei  Nucleinsäuresequenzen ähnlich sind, dass das Polynucleotid, das die erste Nucleinsäure codiert, mit dem von der zweiten Nucleinsäure codierten Polypeptid immunologisch kreuzreagiert. 



  Die hier verwendeten Ausdrücke "wesentliche Identität" oder "wesentliche Ähnlichkeit" im Zusammenhang mit einem Polypeptid bezieht sich auf den Grad an Ähnlichkeit zwischen zwei Polypeptiden, bei denen ein Polypeptid eine Sequenz mit mindestens 70%, 80%, 85% oder bis zu 100% Sequenzidentität umfasst, bezogen auf eine Referenzsequenz oder am meisten bevorzugt 90% Identität über ein Vergleichsfenster von etwa 10 bis 20 Aminosäureresten. Aminosäuresequenzähnlichkeit oder Sequenzidentität wird durch Optimierung der Paarung der Reste bestimmt, falls nötig durch die Einführung von Lücken, soweit dies erforderlich ist. Siehe Needleham et al., J. Mol. Biol 48 (1970), 443-453; Sankoff et al.

   (1983) Time Warps, String Edits, and Macromolecules: The Theory and Practice of Sequenze Comparison, Kapitel Eins, Addison-Wesley, Reading, MA; und Software-Pakete von IntelliGenetics, Mountain View, CA und der University of Wisconsin Genetics Computer Group, Madison, WI. Es ist für den Fachmann offensichtlich, dass die Bezeichnungen "wesentliche Identität", "wesentliche Ähnlichkeit" und "wesentliche Sequenzidentität" bezüglich Polypeptiden oder Polynucleotiden gegenseitig austauschbar verwendet werden können. 



  Der hier verwendete Ausdruck "wesentlich rein" oder "wesentlich gereinigt" bedeutet dann, wenn er sich auf eine Zusammensetzung bezieht, die ein angegebenes Reagens enthält, beispielsweise einen Antikörper (z.B. einen anti-hTRT-Antikörper), dass das angegebene Reagens mindestens etwa 75%, mindestens etwa 90%, mindestens etwa 95%, mindestens etwa 99% oder mehr der Zusammensetzung (ohne beispielsweise Puffer) darstellt. Somit ist beispielsweise eine bevorzugte  erfindungsgemässe Immunglobulin-Präparation, die spezifisch ein hTRT-Polypeptid bindet, im wesentlichen gereinigt. 



  Wie hier verwendet, ist eine "Telomerase-negative" Zelle eine Zelle, in der Telomerase nicht exprimiert wird, d.h. es kann keine katalytische Aktivität von Telomerase unter Verwendung eines üblichen Assays oder eines TRAP-Assays für katalytische Aktivität von Telomerase nachgewiesen werden. Wie hier verwendet, ist eine "Telomerase-positive" Zelle eine Zelle, in der Telomerase exprimiert wird (d.h. Telomerase-Aktivität kann nachgewiesen werden). 



  Wie hier verwendet, ist eine "mit Telomerase in Zusammenhang stehende" Krankheit oder ein Zustand eine Krankheit oder ein Zustand in einem Versuchsobjekt, die (der) mit einem anormal hohen Spiegel an Telomerase-Aktivität in Zellen des Versuchsobjekts korreliert, wobei dies jede Telomerase Aktivität für die meisten normalen somatischen Zellen umfassen kann, oder die (der) mit einem niedrigen Spiegel an Telomerase-Aktivität korreliert, der zu einer Beeinträchtigung einer normalen Zellfunktion führt. Zu den Beispielen für mit Telomerase in Zusammenhang stehende Zustände gehören beispielsweise Krebs (hohe Telomerase-Aktivität in malignen Zellen) und Unfruchtbarkeit (geringe Telomerase-Aktivität in Keimbahnzellen). 



  Der hier verwendete Ausdruck "Testverbindung" bezieht sich auf jede synthetische oder natürliche Verbindung oder Zusammensetzung. Zu diesem Ausdruck zählen alle organischen und anorganischen Verbindungen einschliesslich beispielsweise kleine Moleküle, Peptide, Proteine, Zucker, Nucleinsäuren, Fettsäuren etc. 


 XII. Beispiele 
 



  Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung und sollen keine Einschränkung darstellen. 



  In den folgenden Abschnitten werden die folgenden Abkürzungen verwendet: eq (Äquivalente); M (Molar);  mu M (Mikromolar); N (Normal), Mol (Mole), mMol (Millimole)  mu Mol (Mikromole); nMol (Nanomole); g (Gramm), mg (Milligramm);  mu g (Mikrogramm), ng (Nanogramm); l oder L (Liter), ml (Milliliter),  mu l (Mikroliter); cm (Zentimeter); mm (Millimeter);  mu m (Mikrometer), nm (Nanometer);  DEG C (Grad Celsius); RPN (Ribonucleoprotein); remN(2 min -O-Methylribonucleotide); dNTP (Desoxyribonucleotid); dH2O (destilliertes Wasser); DDT (Dithiothreitol); PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid); TE (10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA, pH-Wert etwa 7,2); KGlu (Kaliumglutamat); SSC (Salz- und Natriumcitratpuffer); SDS (Natriumdodecylsulfat); PAGE (Polyacrylamidgelelektrophorese); Novex (Novex, San Diego, CA);

   BioRad (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), Pharmacia (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), Boehringer-Mannheim (Boehringer-Mannheim Corp., Concord, CA); Amersham (Amersham, Inc., Chicago, IL); Stratagene (Strategene Cloning Systems, La Jolla, CA); NEB (New England Biolabs, Beverly, MA); Pierce (Pierce Chemical Co., Rockford IL); Beckman (Beckman Instruments, Fullerton, CA), Lab Industries (Lab Industries, Inc., Berkeley, CA), Eppendorf (Eppendorf Scientific, Madison, WI); und Molecular Dynamics (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA). 


 Beispiel 1 
 


 Isolierung von Telomerase-Proteinen und -Clonen 
 



  Das folgende Beispiel beschreibt ausführlich die Isolierung von Telomerase-Proteinen und -Clonen von verschiedenen Organismen, einschliesslich der hTRT- und S. pombe-Telomerasec-DNA-Clone 


 A. Hintergrund 
 


 i) Einführung 
 



  Der Abschnitt gibt einen Überblick über die Reinigung und Clonierung, die in nachfolgenden Abschnitten dieses Beispiels ausführlicher beschrieben werden. Telomerase-RNA-Untereinheiten wurden zwar in Ciliaten, Hefe und Säugern identifiziert, vor der vorliegenden Erfindung wurden jedoch Protein-Untereinheiten des Enzyms als solche nicht identifiziert. Die Reinigung von Telomerase von dem Protozoan Euplotes aediculatus ergab zwei Proteine, die mit p123 und p43 bezeichnet werden (siehe nachstehend; Lingner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (1996) 10712). Euplotes aediculatus ist ein hypotricher Ciliat mit einem Macronucleus, der etwa 8 x 10<7> Telomere und etwa 3 x 10<5> Telomerasemoleküle enthält.

   Nach der Reinigung zeigte der aktive Telomerase-Komplex ein Molekulargewicht von etwa 230 kD, was einer RNA-Untereinheit von 66 kD und zwei Proteinen von etwa 123 kD und 43 kD entspricht (siehe vorstehend Lingner (1996)). Experimente mit Photo-Quervernetzung zeigten an, dass das grössere p123-Protein an der spezifischen Bindung des Telomer-DNA-Substrats beteiligt war (Lingner (1996), a.a.O.). 



  Die p123- und p43-Proteine wurden sequenziert und die diese Proteine codierenden cDNA-Clone isoliert. Es stellte sich heraus, dass diese Euplotes-Sequenzen mit den Telomerase-assoziierten Proteinen von Tetrahymena p80 und p95 nicht ver wandt sind. Die Sequenzanalyse des Euplotes-p123 ergab die Anwesenheit von Motiven von reverser Transkriptase (RT). Weiterhin wurde durch die Sequenzanalyse des Euplotes p123 ein homologes Hefeprotein gefunden, das als Est2-Protein bezeichnet wird (Lingner, Science 276 (1997), 561). Es konnte kürzlich gezeigt werden, dass das Hefe-Est2 für die Aufrechterhaltung von Telomeren in vivo essentiell ist (Lendvay, Genetics 144 (1996), 1399), es wurde jedoch nicht als ein katalytisches Telomerase-Protein identifiziert.

   Ortsgerichtete Mutagenese zeigte, dass die RT-Motive von Hefe-Est2 für die Synthese von Telomer-DNA in vivo und in vitro essentiell sind (Lingner (1997) a.a.O.). 


 ii) Identifizierung und Charakterisierung von S. pombe-Telomerase 
 



  Die PCR-Amplifikation von S. pombe-DNA wurde mit degenerierten Sequenzprimern, die nach den Euplotes-p123-RT-Motiven, wie nachstehend beschrieben, entworfen wurden, durchgeführt. Eines der erzeugten vier Haupt-PCR-Produkte war eine Bande von 120 Basenpaaren, die eine zu p123 und Est2 homologe Peptidsequenz codierte. Dieses PCR-Produkt wurde als Sonde bei Koloniehybridisierung verwendet und damit konnten zwei überlappende Clone aus einer genomischen Bank von S. pombe und drei von einer cDNA-Bank von S. pombe identifiziert werden. Die Sequenzanalyse ergab, dass keiner der drei S. pombe-cDNAClone eine vollständige Länge auswies, deshalb wurde zum Erhalt von Sequenzen, die den N-Terminus des Proteins codieren, reverse Transkriptase (RT)-PCR verwendet. 



  Die vollständige Sequenzierung dieser Clone zeigte ein vermutliches S. pombe-Telomerase-RT-Gen, trt1. Die vollständige Nucleotidsequenz von trt1 wurde bei GenBank mit der Zugangsnummer AF015783 hinterlegt. Die Analyse der Sequenz ergab, dass trt1 ein basisches Protein mit einem geschätzten Molekulargewicht von 116 kD codiert. Es zeigte sich, dass die Homologie zu p123 und Est2 in den sieben reverse Transkriptase- Motiven aussergewöhnlich hoch war. Diese Motive sind unterstrichen und als Motive 1, 2, A, B, C, D und E bezeichnet (siehe Fig. 1). Es wurde ein zusätzliches Telomerase-spezifisches Motiv gefunden, das als das T-Motiv bezeichnet wurde. 15 Introns im Grössenbereich von 36 bis 71 Basenpaaren unterbrachen die codierende Sequenz. 



  Um S. pombe-trt1 als eine katalytische Untereinheit zu testen, wurden zwei Deletionskonstrukte erzeugt. Bei einem wurden nur die Motive B bis D in den RT-Domänen entfernt. Bei dem zweiten wurden 99% des offenen Leserahmens entfernt. 



  Haploide Zellen, die aus S. pombe-Sporen von beiden Mutanten gewachsen waren, zeigten fortschreitende Telomer-Kürzung bis zu dem Punkt, an dem eine Hybridisierung an Telomer-Wiederholungseinheiten praktisch nicht mehr nachweisbar war. Ein trt1<+>/trt1<->-Diploid wurde sporulieren gelassen und die erhaltenen Tetraden wurden gegliedert und auf einem Hefeextrakt-Medium, das mit Aminosäure supplementiert war, auskeimen gelassen (eine YES-Platte, Alfa, (1993) Experiments with Fission Yeast, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Die von jeder Spore erhaltenen Kolonien wurden 3 Tage bei 32 DEG C gezüchtet und alle drei Tage auf frischen YES-Platten ausgestrichen. Eine Kolonie aus jeder Runde wurde bei 32 DEG C in 6 ml einer YES-Flüssigkultur gegeben und bis zur stationären Phase gezüchtet. Es wurde genomische DNA präpariert.

   Nach der Spaltung mit ApaI wurde die DNA auf einem 2,3%igem Agarosegel elektrophoretisiert, zur Bestätigung, dass in jeder Spur etwa gleiche Mengen gegeben wurden, mit Ethidiumbromid angefärbt, danach auf eine Nylon-Membran transferiert und mit einer Telomer-DNA-Sonde hybridisiert. 



  Seneszenz wurde angezeigt durch den verzögerten Beginn der Unfähigkeit auf Agar wachsen zu können (typischerweise beim vierten Ausstreichen nach der Keimung), durch Kolonien mit Rändern, die in zunehmendem Masse ausgefranst waren (die Ko loniemorphologie ist in Fig. 22B gezeigt) und durch eine hohe Anzahl von Fraktionen verlängerter Zellen, die immer mehr zunahmen (wie in Fig. 22C gezeigt). Zellen wurden auf Minimalmedium (Alfa, (1993), a.a.O.), wobei Glutaminsäure gegen Ammoniumchlorid ausgetauscht war, 2 Tage bei 32 DEG C vor dem Photographieren ausplattiert. 



  Bei der Trennung einzelner vergrösserter Zellen unter dem Dissektions-Mikroskop zeigte sich, dass die Mehrheit der Zellen keiner weiteren Teilung unterlag. Die gleiche Telomerase-negative (trt1<->) Zellpopulation enthielt immer Zellen mit normaler Grösse, die fortfuhren sich zu teilen, jedoch häufig sich nicht teilende Nachkommen hervorbrachten. Die Telomerase-negativen überlebenden Zellen könnten einen Rekombinationsmodus der Telomer-Bewahrung verwenden, wie dies für knospende Hefestämme dokumentiert wurde, mit denen verschiedene Gene für die Telomer-Replikation deletiert sind (Lendvay (1996) a.a.O. und Lundblad Cell 73 (1993), 347. 


 iii) Die Identifizierung und Charakterisierung von menschlicher Telomerase 
 



  Ein von menschlicher Telomerase-reverse Transkriptase (hTRT)-cDNA stammendes EST (exprimerte Sequenz-"tag") wurde durch eine BLAST-Suche der dbEST (exprimierte Sequenz-"tag") Gen-Bank-Datenbank identifiziert und als Genbank AA28196 bezeichnet, wobei die Euplotes-123 kD Peptid und die entsprechenden Nucleinsäuresequenzen sowie das Schizosaccharomyces-Protein und korrespondierende cDNA (tez1)-Sequenzen verwendet wurden. Das AA281296 EST weist eine Länge von 389 Nucleotiden auf und die Positionen seiner Reste in dem hTRTcDNA-Clon (Fig. 16) liegen zwischen den Resten 1679 bis 2076. Ein die EST-Sequenz enthaltender Clon, der die Bezeichnung Clon #712562 (Fig. 18) trägt, wurde von dem I.M.A.G.E.-Consortium (Human Genome Center, DOE, Lawrence Livermore National Laboratory, Livermore, CA) erhalten. 

   Dieser Clon wurde aus einer cDNA-Bank von aufkeimenden B-Zellen erhalten, die aus einer Fliesssortierung ("flow sorting") von  Mandelzellen stammten. Die vollständige Sequenzierung dieses hTRT-cDNA-Clons ergab die Anwesenheit aller acht Telomerase-RT(TRT)-Motive, wie dies in Fig. 1 gezeigt ist. Dieser hTRT-Clon codierte keinen aneinandergrenzenden Bereich von TRT, da die RT-Motive B min , C, D und E im Vergleich zu den mehr N-terminal gelegenen RT-Motiven in einem anderen offenen Leserahmen enthalten waren. Zusätzlich war die Entfernung zwischen den RT-Motiven A und B wesentlich geringer als die der drei bereits bekannten (nicht-menschlichen) TRTs. 



  Um einen cDNA-Clon mit vollständiger Länge isolieren zu können, wurde eine cDNA-Bank, die von der menschlichen Zellinie 293 (die vorstehend beschrieben wurde) stammt, die hohe Spiegel an Telomerase-Aktivität exprimiert, gescreent. Eine lambda-cDNA-Bank von der Zellinie 293 wurde in 25 Pools aufgeteilt, die jeweils etwa 200 000 Plaques enthielten. Jeder Pool wurde mittels PCR mit den Primerparen 5 min -CGGAAGAGTGTCTGGAGCAA-3 min und 5 min -GGATGAAGCGGAGTCTGGA-3 min  gescreent. Sechs Sub-Pools eines positiven primären Pools wurden mittels PCR unter Verwendung desselben Primerpaars weiter gescreent. Sowohl bei dem Screenen des primären Pools und des sekundären Sub-Pools wurde hTRT mit insgesamt 31 Cyclen amplifiziert, 45 Sekunden bei 94 DEG C, 45 Sekunden bei 60 DEG C und 90 Sekunden bei 72 DEG C.

   Als Kontrolle wurde RNA des "house-keeping"-Enzyms GAPDH mittels der Primerpaare 5 min -CTCAGACACCATGGGGAAGGTGA-3 min  und 5 min -ATGATCTTGAGGCTGTTGTCATA-3 min  mit insgesamt 16 Cyclen amplifiziert, jeweils 45 Sekunden bei 94 DEG C, 45 Sekunden bei 55 DEG C und 90 Sekunden bei 72 DEG C. 



  Ein hTRT-positiver Sub-Pool aus dem sekundären Screenen wurde dann mittels Plaque-Hybridisierung mit einer Sonde von dem 5 min -Bereich von Clon #712562 gescreent. Ein Phage konnte als positiv identifiziert werden (mit der Bezeichnung Lambda-Phage 25-1.1, ATCC 209024, hinterlegt am 12. Mai 1997). Er enthielt eine Insertion von etwa 4 Kilobasen, diese wurde ausgeschnitten und in die EcoRI-Stelle des "Bluescript II SK+"-Vektors (Stratagene, San Diego, CA) als  ein EcoRI-Fragment subcloniert. Dieses den cDNA-Clon enthaltende Plasmid erhielt die Bezeichnung pGRN121. Die cDNA-Insertion weist insgesamt eine Länge von etwa 4 Kilobasenpaaren auf. Die vollständige Nucleotidsequenz der menschlichen hTRT-cDNA (pGRN121) wurde bei Genbank hinterlegt (Zugangsnummer AF015950) und bei der ATCC mit der Zugangsnummer ATCC 209016 am 6. Mai 1997. 


 B. Züchtung von Euplotes aediculatus 
 



  Die in diesem Beispiel verwendeten Kulturen von E. aediculatus wurden von Dr. David Prescott, MCDB, University of Colorado, erhalten. Dr. Prescott isolierte diese Kultur ursprünglich aus Wasser eines Teichs, dieser Organismus ist aber auch von der ATCC erhältlich (ATCC #30859). Kulturen wurden wie von Swanton et al., (Swanton et al., Chromosoma 77 (1980), 203) in 15-Liter-Glasbehältern gezüchtet, die Chlorogonium als eine Nahrungsquelle enthielten. Die Organismen wurden nach Erreichen einer Dichte von etwa 10<4>Zellen/ml von den Kulturen geerntet. 


 C. Präparation von nucleären Extrakten 
 



  In diesem Beispiel wurden nucleäre Extrakte von E. aediculatus mittels des Verfahrens von Lingner et al., (Lingner et al., Genes Develop. 8 (1994) 1984) mit den nachstehend beschriebenen geringen Modifikationen präpariert. Zusammengefasst wurden Zellen, die wie in Teil B beschrieben gezüchtet wurden, mit 15  mu m Nytex-Filtern konzentriert und auf Eis gekühlt. Das Zellpellet wurde zu einem Endvolumen von 110 ml TMS/PMSF/Spermidinphosphat-Puffer resuspendiert. Der TMS/PMSF/Spermidinphosphat-Vorratspuffer wurde durch Zugabe von 0,075 g Spermidinphosphat (USB) und 0,75 ml PMSF (aus einer in Ethanol hergestellten 100 mM Vorratslösung) zu 150 ml TMS hergestellt. TMS enthielt 10 mM Tris-Acetat, 10 mM MgCl2, 85,5752 g Saccharose/Liter und 0,33297 g CaCl2/Liter, pH-Wert 7,5. 



  Nach Resuspendierung in TMS/PMSF/Spermidinphosphat-Puffer wurden 8,8 ml 10% NP-40 und   94,1 g Saccharose zugegeben. Das Gemisch wurde in einen silikonisierten Glasbecher mit einem Rührstab aus rostfreiem Stahl, der an einem darüber befindlichen Motor angebracht war, gegeben. Das Gemisch wurde gerührt, bis die Zellen vollständig lysiert waren (etwa 20 Minuten). Das Gemisch wurde dann 10 Minuten bei 7500 UpM (8950 x g) bei 4 DEG C mittels eines Beckman JS-13-Ausschwingrotors zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und das Pellet aus Nuclei in TMS/PMSF/Spermidinphosphat-Puffer resuspendiert, danach erneut 5 Minuten bei 7500 UpM (8950 x g) bei 4 DEG C mittels eines Beckman JI-D-13-Ausschwingrotors zentrifugiert. 



  Der Überstand wurde entfernt und das Pellet aus Nuclei in einem Puffer resuspendiert, der 50 mM Tris-Acetat, 10 mM MgCl2, 10% Glycerin, 0,1% NP-40, 0,4 M KGlu, 0,5 mM PMSF, pH-Wert 7,5 enthielt, wobei ein Puffervolumen von 0,5 ml pro 10 g geernteter Zellen verwendet wurde. Die resuspendierten Nuclei wurden danach in einem "dounced"-Glashomogenisator mit etwa 50 Auf- und Abbewegungen homogenisiert und danach 25 Minuten mit 14 000 UpM bei 4 DEG C in einer Eppendorf-Zentrifuge zentrifugiert. Der den nucleären Extrakt enthaltene Überstand wurde gesammelt, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bis zu seiner Verwendung bei -80 DEG C aufbewahrt. 


 D. Reinigung von Telomerase 
 



  In diesem Beispiel wurden wie in Teil C beschrieben, präparierte nucleäre Extrakte zur Reinigung von E. aediculatus-Telomerase verwendet. Bei diesem Reinigungsprotokoll wurde Telomerase zuerst durch Chromatographie auf einer Affi-Gel-Heparinsäule angereichert und danach ausgiebig durch Affinitätsreinigung mit einem "antisense"-Oligonucleotid gereinigt. Da der Matrizenbereich von Telomerase-RNA in dem Telomerase RNP-Partikel einer Hybridisierung zugänglich ist,  wurde ein "antisense"-Oligonucleotid (d.h. das "Affinitätsoligonucleotid") als ein "Affinitätsköder" für die Telomerase synthetisiert, wobei dieses Oligonucleotid zu diesem Matrizenbereich komplementär war. Ein Biotinrest wurde an das 5 min -Ende des Oligonucleotids angefügt, damit dieses an einer Avidinsäule immoblisiert werden konnte. 



  Nach der Bindung der Telomerase an das Oligonucleotid und gründlichem Waschen wurde die Telomerase mittels eines Verdrängungsoligonucleotids eluiert. Das Affinitätsoligonucleotid enthielt DNA-Basen, die zu der 5 min  zu der Telomerase-spezifischen Sequenz gelegenen Telomerase-RNA nicht komplementär war. Da das Verdrängungs-Oligonucleotid zu dem Affinitäts-Oligonucleotid über seine gesamte Länge komplementar war, konnte es eine thermodynamisch stabilere Duplex bilden als die Telomerase, die an das Affinitäts-Oligonucleotid gebunden war. Somit führte die Zugabe des Verdrängungs-Oligonucleotids zu der Elution der Telomerase von der Säule. 



  In diesem Beispiel wurden aus 45 Liter-Kulturen präparierte nucleäre Extrakt gefroren, bis eine Gesamtmenge von 34 ml an nucleärem Extrakt gewonnen werden konnte. Dies entsprach 630 Liter Kultur (etwa 4 x 10<9> Zellen). Der nucleäre Extrakt wurde mit einem Puffer auf 410 ml verdünnt, wobei Endkonzentrationen von 20 mM Tris-Acetat, 1 mM MgCl2, 0,1 mM EDTA, 33 mM KGlu, 10% (Vol./Vol.) Glycerin, 1 mM Dithiothreitol (DTT) und 0,5 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) bei einem pH-Wert von 7,5 erhalten wurden. 



  Der verdünnte nucleäre Extrakt wurde auf eine Affi-Gel-Heparin-Gelsäule (Bio-Rad) mit einem Endvolumen von 230 ml und einem Durchmesser von 5 cm gegeben, mit dem gleichen Puffer äquilibriert und mit einem 2 Liter-Gradienten von 33 bis 450 mM KGlu eluiert. Die Säule wurde mit einer Fliessgeschwindigkeit von einem Säulenvolumen/Stunde bei 4 DEG C betrieben. Fraktionen von jeweils 50 ml wurden gesammelt und nach einer Telomerase-Aktivität wie in Teil D beschrieben, untersucht. 



  Telomerase eluierte von der Säule bei etwa 170 mM KGlu. Telomerase enthaltende Fraktionen (etwa 440 ml) wurden vereinigt und eingestellt auf 20 mM Tris-Acetat, 10 mM M9Cl2, 1 mM EDTA,    300 mM KGlu, 10% Glycerin, 1 mM DTT und 1% Nonidet P-40. Dieser Puffer wurde mit "WB" bezeichnet. 



  Zu dieser Präparation wurden jeweils 1,5 mMol der zwei kompetitorischen DNA-Oligonucleotide      (5 min -TAGACCTGTTAGTGTACATTTGAATTGAAGC-3 min ) und 
 (5 min -TAGACCTGTTAGGTTGGATTTGTGGCATCA-3 min ), 50  mu g Hefe-RNA (Sigma) und 0,3 nMol Biotin-markiertes Telomerase-spezifisches Oligonucleotid 
 (5 min -Biotin-TAGACCTGTTTA-(rmeG)2-(rmeU)4-(rmeG)4-rmeG-3 min )) pro ml des Pools gegeben. Die 2-O-Methylribonucleotide der Telomerase-spezifischen Oligonucleotide waren zu dem Matrizenbereich der Telomerase-RNA komplementär; die Desoxyribonucleotide waren nicht komplementär.

   Der Einschluss von kompetitorischen, nicht-spezifischen DNA-Oligonucleotiden erhöhte die Wirksamkeit der Reinigung, da die Auswirkungen von Nucleinsäure-bindenden Proteinen und anderen Bestandteilen in dem Gemisch, die entweder an das Affinitätsnucleotid binden oder die Telomerase aus dem Gemisch entfernen würden, minimiert wurden. 



  Dieses Material wurde dann zu einem "Ultralink"-immobilisierten "Neutravidin plus" (Pierce)-Säulenmaterial bei einem Volumen von 60  mu l Suspension pro ml Pool gegeben. Das Säulenmaterial wurde zweimal jeweils 15 Minuten vorblockiert, wobei eine Präparation von WB verwendet wurde, die 0,01% Nonidet P-40, 0,5 mg BSA, 0,5 mg/ml Lysozym, 0,05 mg/ml Glycogen und 0,1 mg/ml Hefe-RNA enthielt. Die Blockierung wurde mittels einer sich drehenden Scheibe durchgeführt, um so das Säulenmaterial gründlich zu blockieren. Nach dem ersten und vor dem zweiten Blockierungsschritt wurde das Säulenmaterial 2 Minuten bei 200 x g zur Pelletierung der Matrix zentrifugiert. 



  Das Gemisch aus Pool und Säule wurde auf einer rotierenden Scheibe (etwa 10 UpM; Labindustries) 8 Minuten bei 30 DEG C und im Anschluss daran nochmals 2 Stunden bei 4 DEG C inkubiert, um so die Bindung zu erlauben. Das Gemisch aus Pool und Säule wurde dann 2 Minuten bei 200 x g zentrifugiert und der ungebundenes Material enthaltende Überstand wurde entfernt. Das Gemisch aus Pool und Säule wurde danach gewaschen. Dieser Waschprozess umfasste folgende Schritte: Spülen des Gemischs aus Pool und Säule bei 4 DEG C mit WB, 15 Minuten Waschen des Gemisches bei 4 DEG C mit WB, Spülen mit WB, 5 Minuten Waschen bei 30 DEG C mit 0,6 M KGlu und kein Nonidet P-40 enthaltendem WB, 5 Minuten Waschen bei 25 DEG C mit WB und zuletzt wiederum Spülen mit WB. Das nach dem letzre Belichtung der Spuren 25-30 von Fig. 31.

   Die geringere Belichtung von Fig. 33 wurde deshalb durchgeführt, um die Sichtbarmachung der Nucleotide  zu erlauben, die zugegeben wurden, und der Verzögerungspositionen in verlängertem Produkten. Der Prozentsatz an verlängerten Substrat wurde für jede dritte Linie eines Satzes auf einem "PhosphorImager", wie dies in der   Fig. 31 unten gezeigt ist, quantifiziert. 



  Die Wirksamkeit dieser Haarnadelstrukturen als Substrat wurde mit doppelsträngigen Telomer-ähnlichen Strukturen mit Überhängen unterschiedlicher Länge verglichen. Ein Modellsubstrat, das mit vier G-Resten endete (siehe die Spuren 1 bis 15 von Fig. 31), wurde dann nicht verlängert, wenn es ein glattes Ende enthielt (siehe Spuren 1-3). Es wurde jedoch eine leichte Verlängerung mit einer Überhanglänge von zwei Basen beobachtet. Die Verlängerung wurde jedoch effizient, wenn der Überhang etwa 4 Basen lang war. Die Telomerase wirkte auf ähnliche Weise mit einem doppelsträngigen Substrat, das mit vier T-Resten endete, wobei ein Überhang von 6 Basen für eine hocheffiziente Verlängerung erforderlich war. Die schwachen Banden unter den Primern in den Spuren 10-15 von Fig. 31, die unabhängig von Telomerase sind, stellen kürzere Oligonucleotide in den Primerpräparationen dar. 



  Durch die schwächere Belichtung der Spuren 25-30 in Fig. 33 zeigt sich eine Leiter von verlängerten Produkten, wobei die dunkelsten Banden mit der vermutlichen 5 min -Grenze der Matrize korrelieren (wie von Lingner et al., Genes Develop. 8 (1994), 1984 beschrieben). Das häufige Auftreten von Produkten, die anderen Positionen in der Matrize entsprechen, legte nahe, dass ein "Innehalten" und/oder eine "Dissoziierung" mit der gereinigten Polymerase an Stellen vorkommt, die nicht der Translokationsstelle entsprechen. 



  Wie in Fig. 31 gezeigt, waren doppelsträngige, mit glatten Enden versehene Oligonucleotide keine Substrate für Telomerase. Um herauszufinden, ob diese Moleküle an Telomerase binden können, wurde ein Kompetitionsexperiment durchge führt. In diesem Experiment wurden 2 nM 5 min -endmarkiertes Substrat mit der Sequenz (G4T4)2 bzw. ein Haarnadelsubstrat mit einem Überhang von sechs Basen mit 0,125 mM Telomerase verlängert (Fig. 31, Spuren 25-27). Obwohl die gleichen unmarkierten Oligonucleotidsubstrate effizient mit dem markierten Substrat bezüglich der Verlängerung konkurrierten, wurde keine Herabsetzung an Aktivität beobachtet, wenn die doppelsträngigen, mit glatten Enden versehenen Haarnadel-Oligonucleotide als Kompetitoren verwendet wurden, selbst in Gegenwart eines 100fachen Überschusses von Haarnadelstrukturen. 



  Diese Ergebnisse zeigten an, dass doppelsträngige, mit glatten Enden versehene Oligonucleotide bei dem in diesem Beispiel getesteten Konzentrationen Telomerase nicht binden können, d.h. ein einzelsträngiges 3 min -Ende ist für eine Bindung erforderlich. Wahrscheinlich wird dieses 3 min -Ende für eine Basenpaarung mit der Telomerase-RNA-Matrize benötigt. 


 J. Clonierung & Sequenzierung des 123 kD-Polypeptids 
 



  In diesem Beispiel wird die Clonierung des 123 kD-Polypeptids von Telomerase, (d.h. die 123 kD-Protein-Untereinheit) beschrieben. In dieser Untersuchung wurde ein internes Fragment des Telomerasegens mittels PCR amplifiziert. Es wurden Oligonucleotid-Primer verwendet, die so konstruiert waren, dass sie mit den von dem im vorstehenden Teil D erhaltenen gereinigten Polypeptid erhaltenen Peptidsequenzen übereinstimmten. Die Polypeptidsequenz wurde mittels des "nanoES-Tandem"-Massenspektroskopieverfahrens bestimmt, das auf dem Fachgebiet bekannt und von Calvio et al., RNA 1 (1995), 724-733 beschrieben ist. Die in diesem Beispiel verwendeten Oligonucleotidprimer hatten die folgenden Sequenzen, wobei degenerierte Positionen in Klammern gezeigt sind: 
EMI280.1
 
 



  Eine 50  mu l-Reaktion enthielt 0,2 mM dNTPs, 0,15  mu g E. aediculatus chromosomale DNA, 0,5  mu l Taq (Boehringer Mannheim), jeweils 0,8  mu g Primer und 1 x Reaktionspuffer (Boehringer Mannheim). Die Reaktion wurde in einem "Thermocycler" (Perkin-Elmer) inkubiert, wobei 5 Minuten bei 95 DEG C inkubiert wurde, danach folgten 30 Cyclen von jeweils 1 Minute bei 94 DEG C, 1 Minute bei 52 DEG C und 2 Minuten bei 72 DEG C. Die Reaktion wurde durch 10minütige Inkubation bei 72 DEG C vervollständigt. 



  Eine genomische DNA-Bank wurde aus der chromosomalen DNA von E. aediculatus durch Clonierung von DNA mit glatten Enden in die SmaI genannte Stelle des "pCR-Script"-Plasmidvektors (Stratagene) präpariert. Diese Bank wurde durch Koloniehybridisierung mit dem radioaktiv markierten gel-gereinigten PCR-Produkt gescreent. Die Plasmid-DNA von positiven Clonen wurde präpariert und gemäss dem Didesoxy-Verfahren sequenziert (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 74 (1977), 5463) oder manuell mittels eines automatischen Sequenziergeräts (ABI). Die DNA-Sequenz des Gens, das dieses Polypeptid codiert, ist in Fig. 13 gezeigt. Das von der DNA-Sequenz abgeleitete Startcodon liegt in dieser Sequenz bei dem Nucleotid an der Position 101 und der offene Leserahmen endet an Position 3193.

   Der genetische Code von Euplotes unterscheidet sich von anderen Organismen dadurch, dass das "UGA"-Codon einen Cystein-Rest codiert. Die von der DNA-Sequenz abgeleitete Aminosäuresequenz des Polypeptids ist in Fig. 14 gezeigt. Dabei wurde angenommen, dass keine ungewöhnlichen Aminosäuren während der Translation eingebaut werden und keine posttranslationalen Modifizierungen vorkommen. 


 K. Clonierung und Sequenzierung des 43 kD-Polypeptids 
 



  In diesem Beispiel wird die Clonierung des 43 kD-Polypeptids von Telomerase (d.h. der 43 kD-Protein-Untereinheit) beschrieben. Bei dieser Untersuchung wurde ein internes Fragment des Telomerase-Gens mittels PCR amplifiziert, wobei Oligonucleotidprimer verwendet wurden, die so entworfen wurden, dass sie zu den Peptidsequenzen passen, die von dem im vorstehenden Teil D erhaltenen gereinigten Polypeptid erhalten wurden. Die Polypeptidsequenz wurde mittels der auf dem Fachgebiet bekannten und von Calvio et al., RNA 1 (1995), 724-733 beschriebenen "nanoES-Tandem"-Massenspektroskopieverfahren bestimmt. Die in diesem Beispiel verwendeten oligonucleotidprimer hatten die folgenden Sequenzen: 
 5 min -NNNGTNAC(C/T/A)GG(C/T/A)AT(C/T/A)AA(C/T)AA-3 min und 
 5 min -(T/G/A)GC(T/G/A)GT(C/T)TC(T/C)TG(G/A)TC(G/A)TT(G/A)TA-3 min . 



  In dieser Sequenz bedeutet "N" die Anwesenheit eines von vier Nucleotiden (d.h. A, T, G oder C). 



  Eine 50  mu l-Reaktion enthielt 0,2 mM dNTPs, 0,2  mu g E. aediculatus chromosomale DNA, 0,5  mu l Taq (Boehringer Mannheim), jeweils 0,8  mu g Primer und 1 x Reaktionspuffer (Boehringer Mannheim). Die Reaktion wurde in einem "Thermocycler" (Perkin-Elmer) inkubiert, wobei 5 Minuten bei 95 DEG C inkubiert wurde, danach folgten 30 Cyclen von jeweils 1 Minute bei 94 DEG C, 1 Minute bei 52 DEG C und 1 Minute bei 72 DEG C. Die Reaktion wurde durch 10minütige Inkubation bei 72 DEG C vervollständigt. 



  Eine genomische DNA-Bank wurde aus der chromosomalen DNA von E. aediculatus durch Clonierung von DNA mit glatten Enden in die SmaI genannte Stelle des "pCR-Script"-Plasmidvektors (Stratagene) präpariert. Diese Bank wurde durch Koloniehybridisierung mit den radioaktiv markierten gel-gereinigten PCR-Produkten gescreent. Die Plasmid-DNA von positiven Clonen wurde präpariert und gemäss dem Didesoxy-Verfahren sequenziert (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 74 (1977),  5463) oder manuell mittels eines automatischen Sequenziergeräts (ABI). Die DNA-Sequenz des Gens, das dieses Polypeptid codiert, ist in Fig. 34 gezeigt. Drei mögliche Leserahmen sind für diese Sequenz gezeigt, wie dies in Fig. 35 dargestellt ist. Aus Gründen der Übersichtlichkeit ist die Aminosäuresequenz unter der Nucleotidsequenz für alle drei Leserahmen angegeben.

   Diese Leserahmen tragen die Bezeichnungen "a", "b" und "c". Ein mögliches Startcodon wird an der Nucleotidposition 84 im Lesenrahmen "c" codiert. Der codierende Bereich könnte an Position 1501 in Leserahmen "b" enden. Codons für einen vorzeitigen Stop, die in dieser Figur mit Sternchen bezeichnet sind, kommen in allen drei Leserahmen zwischen den Nucleotidpositionen 337-350 vor. 



  Die "La-Domäne" ist durch fette Buchstaben gekennzeichnet. Weiter stromabwärts scheint die Proteinsequenz durch unterschiedliche Leserahmen codiert zu sein, da keiner dieser Leserahmen durch Stopcodons unterbrochen ist. Darüber hinaus sind Peptidsequenzen von dem gereinigten Protein in allen drei Leserahmen codiert. Somit scheint dieses Gen Intronsequenzen zu enthalten, oder, alternativ, die RNA wird editiert. Zu weiteren Möglichkeiten zählen ribosomale Leserahmenverschiebung oder Sequenzierungsfehler. Die Homologie zu der Sequenz des La-Proteins bleibt jedoch von grossem Interesse. Es soll nochmals angemerkt werden, dass in Euplotes das "UGA"-Codon einen Cystein-Rest codiert. 


 L. Vergleiche von Aminosäuren und Nucleinsäuren 
 



  In diesem Beispiel werden Vergleiche zwischen veröffentlichten Sequenzen und den Sequenzen der 123 kD- und 43 kD-Telomerase-Polypeptid-Untereinheiten durchgeführt. 


 i) Vergleiche mit der 123 kD-Telomerase-Untereinheit von E. aediculatus 
 



  Die Aminosäuresequenz des 123 kD-Polypeptids von Euplotes aediculatus wurde mit der Sequenz der 80 kD-Telomerase-Protein-Untereinheit von Tetrahymena thermophila (GenBank-Zugangsnummer #U25641) zur Untersuchung ihrer Ähnlichkeit verglichen. Die dieses Protein codierende Nucleotidsequenz, die von GenBank erhalten wurde ist in Fig. 42 gezeigt. Die Aminosäuresequenz dieses Proteins, so wie es von GenBank erhalten wurde, ist in Fig. 43 gezeigt. Der Sequenzvergleich zwischen dem 123 kD-Protein von E. aediculatus und dem 80 kD-Protein von T. thermophila ist in Fig. 36 gezeigt. In dieser Figur stellt die Sequenz von E. aediculatus die obere Sequenz dar und die Sequenz von T. thermophila die untere Sequenz.

   In dieser sowie in den Fig. 37-39 sind Identitäten durch vertikale Balken angezeigt, während einzelne Punkte zwischen den Sequenzen Aminosäuren mit etwas Ähnlichkeit anzeigen und Doppelpunkte zwischen den Sequenzen Aminosäuren mit grösserer Ähnlichkeit anzeigen. Die nachgewiesene Identität lag bei etwa 19%, während der Prozentsatz an Ähnlichkeit etwa 45% betrug. Diese Werte ähneln denen, die mit einer beliebigen Zufallsproteinsequenz beobachtet werden. 



  Die Aminosäuresequenz des 123 kD-Polypeptids von Euplotes aediculatus wurde auch mit der Sequenz der 95 kD-TelomeraseProtein-Untereinheit von Tetrahymena thermophila (GenBank-Zugangsnummer #U25642) zur Untersuchung der Ähnlichkeiten verglichen. Die von GenBank erhaltene, dieses Protein codierende Nucleotidsequenz ist in Fig. 44 gezeigt. Die Aminosäuresequenz des von Gen-Bank erhaltenen Proteins erhaltenen Proteins ist in Fig. 45 gezeigt, und der Sequenzvergleich in Fig. 37. In dieser Figur ist die Sequenz von E. aediculatus die obere Sequenz und die Sequenz von T. thermophila die untere Sequenz. Identitäten sind durch vertikale Balken angezeigt. Die beobachtete Identität betrug etwa 20%, während der Prozentsatz an Ähnlichkeit etwa 43%  betrug. Diese Werte ähneln den Werten, die man mit einer beliebigen Zufallsproteinsequenz beobachtet. 



  Es ist auffallend, dass die Aminosäuresequenz des 123 kD-Proteins von E. aediculatus die fünf Motive enthält, die charakteristisch für reverse Transkriptasen sind. Das 123 kDPolypeptid wurde auch mit den Polymerase-Domänen von verschiedenen reversen Transkriptasen verglichen. Fig. 40 zeigt die Ausrichtung des 123 kD-Polypeptids mit dem vermutlichen Hefe-Homologen (L8543.12 oder ESTp) . Die Aminosäuresequenz von L8543.12 (oder ESTp), die von GenBank erhalten wurde, ist in Fig. 46 gezeigt. 



  Vier Motive (A, B, C und D) waren Bestandteil dieses Vergleichs. In Fig. 40 sind hochkonservierte Reste durch weisse Buchstaben auf schwarzem Hintergrund gekennzeichnet. Reste der Sequenzen von E. aediculatus, die in der anderen Sequenz konserviert sind, sind durch Fettdruck gekennzeichnet. Das "h" bezeichnet das Vorhandensein einer hydrophoben Aminosäure. Die Ziffern zwischen den Aminosäureresten der Motive bezeichnen die Menge von Lücken innerhalb der Sequenzen. Beispielsweise betrifft die "100" zwischen den Motiven A und B eine Lücke von 100 Aminosäuren in der Sequenz zwischen den Motiven. 



  Durch das Absuchen der Genbank konnte ein Hefeprotein (GenBank Zugangsnummer #u20618) und das Gen "L8543.12" (Est2) identifiziert werden, das etwas Homologie zu der 123 kD-Telomerase-Untereinheit von E. aediculatus zeigt. Anhand der Beobachtung, dass beide Proteine reverse TranskriptaseMotive in ihren C-terminalen Bereichen enthalten; dass beiden Proteinen gemeinsam ist, dass sie Ähnlichkeit in Bereichen ausserhalb des reverse Transkriptase-Motivs zeigen; dass die Proteine ähnlich basisch sind (pI = 10,1 für E. aediculatus und pI = 10,0 für Hefe) ; und beide Proteine gross sind (123 kD für E. aediculatus und 103 kD für Hefe) kann gefolgert werden, dass diese Sequenzen den katalytischen Kern ihrer  entsprechenden Telomerasen umfassen.

   Aufgrund dieser Beobachtung bezüglich der Homologie zwischen zwei phylogenetisch entfernten Organismen wie E. aediculatus und Hefe wird davon ausgegangen, dass menschliche Telomerase ein Protein enthält, das dieselben Merkmale aufweist (d.h. reverse Transkriptase-Motive aufweist, basisch ist und gross (> 100 kD)). 


 ii) Vergleiche mit der 43 kD-Telomerase-Untereinheit von E. aediculatus 
 



  Die Aminosäuresequenz der "La-Domäne" des 43-kD-Polypeptids von Euplotes aediculatus wurde mit der Sequenz der 95 kD-Telomerase-Protein-Untereinheit von Tetrahymena thermophila (vorstehend beschrieben) zur Untersuchung deren Ähnlichkeit verglichen. Der Sequenzvergleich ist in Fig. 38 gezeigt. In dieser Figur ist die E. aediculatus-Sequenz die obere Sequenz und die Sequenz von T. thermophila ist die untere Sequenz. Identitäten sind mit vertikalen Balken gekennzeichnet. Die beobachtete Identität betrug etwa 23%, während der Prozentsatz an Ähnlichkeit etwa 46% betrug. Diese Werte ähneln denen, die man mit beliebigen Zufallsproteinsequenzen beobachten würde. 



  Die Aminosäuresequenz der "La-Domäne" des 43 kD-Polypeptids von Euplotes aediculatus wurde mit der Sequenz der 80 kD-Telomerase-Protein-Untereinheit von Tretrahymena thermophila (vorstehend beschrieben) zur Untersuchung deren Ähnlichkeit verglichen. Der Sequenzvergleich ist in Fig. 39 gezeigt. In dieser Figur ist die Sequenz von E. aediculatus die obere Sequenz und die Sequenz von  T. thermophila die untere Sequenz. Identitäten sind mit vertikalen Balken gekennzeichnet. Die beobachtete Identität betrug etwa 26%, während der Prozentsatz an Ähnlichkeit etwa 49% betrug. Diese Werte ähneln denen, die man mit beliebigen Zufallsroteinsequenzen beobachten würde. 



  Die Aminosäuresequenz einer Domäne des 43 kD-Polypeptids von E. aediculatus wurde auch mit La-Proteinen von zahlreichen anderen Organismen verglichen. Diese Vergleiche sind in Fig. 41 gezeigt. In dieser Figur sind hochkonservierte Reste durch weisse Buchstaben auf schwarzem Hintergrund gekennzeichnet. Reste der Sequenzen von E. aediculatus, die in der anderen Sequenz konserviert sind, sind durch Fettdruck gekennzeichnet. 


 M. Identifizierung von Telomerase-Protein-Untereinheiten in einem anderen Organismus 
 



  In diesem Beispiel wurden die in den vorstehenden Beispielen identifizierten Sequenzen zur Identifizierung der Telomerase-Protein-Untereinheiten von Oxytricha trifallax verwendet. Dies ist ein Ciliat, der mit E. aediculatus nur sehr entfernt verwandt ist. In diesem Beispiel wurden basierend auf dem konservierten Bereich des 123 kD-Polypeptids von E. aediculatus Primer ausgewählt, die die Motive der reversen Transkriptase-Domäne umfassten. Geeignete Primer wurden synthetisiert und in einer PCR-Reaktion mit Gesamt-DNA von Oxytricha verwendet. Oxytricha-DNA wurde gemäss auf dem Fachgebiet bekannter Verfahren präpariert. Die PCR-Produkte wurden danach unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannter Verfahren cloniert und sequenziert. 



  Die für die Primer verwendeten Oligonucleotidsequenzen waren: 
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  Positionen, die degeneriert waren, sind in Klammern gezeigt, wobei die alternativen Basen in den Klammern gezeigt sind. "N" entspricht einem beliebigen Nucleotid aus den vier Nucleotiden. 



  Die PCR-Reaktion (50  mu l) enthielt 0,2 mM dNTPs, 0,3  mu g chromosomale DNA von Oxytricha trifallax, 1  mu l Taq-Polymerase (Boehringer Mannheim), jeweils 2  mu M Primer, 1 x Reaktionspuffer (Boehringer Mannheim). Das Reaktionsgemisch wurde in einem "Thermocycler" (Perkin-Elmer) unter den folgenden Bedingungen inkubiert: 1 x 5 Minuten bei 95 DEG C, 30 Cyclen jeweils 1 Minute bei 94 DEG C, 1 Minute bei 53 DEG C und 1 Minute bei 72 DEG C, danach 1 x 10 Minuten bei 72 DEG C. Das PCR-Produkt wurde gelgereinigt und mittels des Didesoxy-Verfahrens (siehe z.B. Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 74 (1977), 5463-5467) oder anderer auf dem Fachgebiet bekannter Verfahren sequenziert. 



  Von dem PCR-Produkt wurde die Aminosäuresequenz abgeleitet und mit der Sequenz von E. aediculatus verglichen. Fig. 47 zeigt die Ausrichtung dieser Sequenzen, wobei die Sequenz von 0. trifallax in der oberen Reihe gezeigt ist und die E. aediculatus-Sequenz in der unteren Reihe gezeigt ist. Wie aus dieser Figur ersichtlich ist, besteht ein grosser Grad an Homologie zwischen der in diesem Beispiel identifizierten 0. trifallax Polypeptidsequenz und der Polypeptidsequenz von E. aediculatus. Somit ist es klar, dass die in der vorliegenden Erfindung identifizierten Sequenzen für die Identifizierung von homologen Telomerase-Protein-Untereinheiten in anderen eukaryotischen Organismen von Nutzen sind. Tatsächlich konnten aufgrund der erfindungsgemässen Entwicklung homologe Telomerase-Sequenzen in zahlreichen unterschiedlichen Spezies identifiziert werden. 


 N.

   Identifizierung von Telomerase-Sequenzen von Tetrahymena 
 



  In diesem Beispiel wurde ein Tetrahymena-Clon erzeugt, der Homologie mit den Euplotes-Sequenzen und EST2p aufweist. 

 

  Bei diesem Experiment wurde eine PCR mit degenerierten Oligonucleotidprimern verwendet, die gegen konservierte Motive gerichtet waren, um so Homologiebereiche zwischen Tetra hymena-, Euplotes- und EST2p-Sequenzen identifizieren zu können. Das in diesem Beispiel verwendete PCR-Verfahren stellt ein neues Verfahren dar, das zur spezifischen Amplifikation von seltenen DNA-Sequenzen aus komplexen Gemischen entworfen wurde. Bei diesem Verfahren wird das Problem der Amplifikation von DNA-Produkten mit dem gleichen PCR-Primer an beiden Enden (d.h. Produkte, eines einzelnen Primers), dem man in PCR-Clonierungsverfahren üblicherweise begegnet, vermieden. Durch diese Produkte eines einzelnen Primers wird ein unerwünschter Hintergrund erzeugt und dies kann oft die Amplifikation und den Nachweis des gewünschten Produkts von zwei Primern erschweren.

   Bei diesem in diesen Experimenten verwendeten Verfahren wird bevorzugt auf Produkte von zwei Primern selektiert. Das Besondere ist, dass ein Primer biotinyliert ist und der andere nicht. Nach mehreren PCR-Amplifikationsrunden werden die Produkte unter Verwendung von magnetischen Streptavidin-Kügelchen gereinigt und Produkte von zwei Primern werden mittels Hitzedenaturierung spezifisch eluiert. Dieses Verfahren findet auch im Rahmen anderer Experimente, die in diesen Beispielen nicht beschrieben wurden, seine Verwendung. Tatsächlich ist dieses Verfahren bei Anwendungen in Gebrauch, bei denen es wünschenswert ist, seltene DNA-Sequenzen zu amplifizieren, wozu die einleitenden Schritte bei Clonierungsverfahren, beispielsweise 5 min und 3, gehören, RACE und jedes Verfahren, das in der PCR degenerierte Primer verwendet. 



  Ein erster PCR-Lauf wurde unter Verwendung von macronucleärer DNA von Tetrahymena als Matrize durchgeführt, die gemäss auf dem Fachgebiet bekannter Verfahren isoliert wurde. Es wurde ein 24-mer-Vorwärts-Primer verwendet mit der Sequenz 
 5 min -Biotin-GCCTATTT(TC)TT(TC)TA(TC)(GATC)(GATC)(GATC)AC(GATC)GA-3 min , die als "K231" bezeichnet wird, und dem FFYXTE-Bereich entspricht und der 23-mer-Rückwärts-Primer mit der Sequenz 
 5 min -CCAGATAT(GATC)A(TGA)(GATC)A(AG)(AG)AA(AG)TC(AG)TC-3 min , der als "K220" bezeichnet wird und dem DDFL(FIL)I-Bereich ent spricht. Diese PCR-Reaktion enthielt 2,5  mu l DNA (50 ng), jeweils 4  mu l Primer (20  mu M), 3  mu l 10 x PCR-Puffer, 3  mu l 10 x dNTPs, 2  mu l Mg, 0,3  mu l Taq und 11,2  mu l dH2O. Mit dem Gemisch wurden 8 Cyclen durchgeführt, jeweils 45 Sekunden bei 94 DEG C 45 Sekunden bei 37 DEG C und      1 Minute bei 72 DEG C. 



  Das Gemisch der PCR-Reaktion wurde an 200  mu l magnetische Streptavidin-Kügelchen gebunden, mit 200  mu l TE gewaschen, in 20  mu l dH2O resuspendiert und danach durch 2minütiges Kochen bei 100 DEG C hitzedenaturiert. Die Kügelchen wurden heruntergezogen und das Eluat wurde entfernt. Danach wurden 2,5  mu l dieses Eluats erneut unter den vorstehenden Bedingungen amplifiziert, mit der Ausnahme, dass 0,3  mu l  alpha -<3><2>P dATP enthalten war und 33 PCR-Cyclen durchgeführt wurden. Das Reaktionsgemisch wurde auf einem denaturierendem 5%igen Polyacrylamidgel aufgetrennt und der geeignete Bereich aus dem Gel ausgeschnitten. Diese Produkte wurden mit weiteren 34 Cyclen unter den vorstehend aufgezählten Bedingungen erneut amplifiziert, ausser, dass die Anlagerungstemperatur 42 DEG C betrug. 



  Ein zweiter PCR-Lauf wurde unter Verwendung von makronucleärer DNA von Tetrahymena, die unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren isoliert wurde, als Matrize durchgeführt, wobei der 23-mer-Vorwärts-Primer mit der Sequenz 5 min 
EMI290.1
 
 



  mit der Bezeichnung "228" verwendet wurde, der nach dem Bereich R(LI) (LI)PKK entspricht und eines reversen Primers mit der Sequenz 5 min = 
EMI290.2
 
 



  mit der Bezeichnung "K224", der dem CYDSIPR-Bereich entspricht. Diese PCR-Reaktion enthielt 2,5  mu l DNA (50 ng), jeweils 4  mu l Primer (20  mu M) , 3  mu l 10 x PCR-Puffer, 3  mu l 10 x dNTPs, 2  mu l Mg, 0,3  mu l  alpha -<3><2>P-dATP, 0,3  mu l Taq und 10,9  mu l  dH2O. Das Reaktionsgemisch wurde auf einem denaturierendem 5%igen Polyacrylamidgel aufgetrennt und der geeignete Bereich aus dem Gel ausgeschnitten. Diese Produkte wurden mit 34 zusätzlichen Cyclen erneut unter den vorstehend angegebenen Bedingungen amplifiziert, ausser dass die Anlagerungstemperatur 42 DEG C betrug. 



  10  mu l des Reaktionsprodukts aus Lauf 1 wurden an magnetische Streptavidin-beschichtete Kügelchen in 200  mu l TE gebunden. Die Kügelchen wurden mit 200  mu l TE gewaschen und danach in 20  mu l dH2O resuspendiert, hitzedenaturiert und das Eluat wurde entfernt. Das Reaktionsprodukt aus Lauf 2 wurde danach zu den Kügelchen gegeben und mit 30  mu l 0,5 x SSC verdünnt. Das Gemisch wurde auf 94 DEG C erhitzt und auf 50 DEG C abkühlen gelassen. Das Eluat wurde entfernt und die Kügelchen wurden dreimal in 0,5 x SSC bei 55 DEG C gewaschen. Die Kügelchen wurden danach in 20  mu l dH2O resuspendiert, hitzedenaturiert, und das Eluat mit der Bezeichnung "Runde 1-Eluat" entfernt und aufbewahrt. 



  Zur Isolierung der Tetrahymena-Bande wurde das Runde 1-Eluat mit dem Vorwärts-Primer K228 und den reversen Primer K227 mit der Sequenz 5 min = 
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  was dem DIKSCYD-Bereich entspricht, erneut amplifiziert. Die PCR-Reaktionen wurden wie vorstehend beschrieben durchgeführt. Die Reaktionsprodukte wurden auf einem 5%igen Polyacrylamidgel aufgetrennt, die etwa 295 Nucleotide entsprechende Bande aus dem Gel ausgeschnitten und sequenziert. 



  Der Clon mit der Bezeichnung 168-3 wurde sequenziert. Es wurde folgende DNA-Sequenz (einschliesslich der Primersequenzen) gefunden: 
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  Eine zusätzliche Sequenz dieses Gens wurde mittels PCR erhalten, wobei ein neuer Primer verwendet wurde, der so konstruiert war, dass er mit der Sequenz von 168-3 ("K2-97" mit der Sequenz 5 min -GAGTGACATAATATACGTGA-3 min ; paart und der Primer K231 (FFYXTE). Die Sequenz des aus dieser Reaktion erhaltenen Fragments, zusammen mit 1683 ist wie folgt (ohne die Primersequenzen): 
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  Die diesem DNA-Fragment entsprechende Aminosäuresequenz ist: 
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  Diese Aminosäuresequenz wurde gegen andere Telomerase-Gene (EST2p und Euplotes) ausgerichtet. Die Ausrichtung ist in Fig. 53 gezeigt. Eine "Consensus"-Sequenz ist in dieser Figur ebenfalls gezeigt. 


 P. Identifizierung von Telomerase-Sequenzen von Schizosaccharomyces pombe 
 



  In diesem Beispiel wurde die tez1-Sequenz von S. pombe als ein Homologes von p123 von E. aediculatus und Est2p von S. cerevisiae identifiziert. 



  Fig. 55 zeigt eine Zusammenfassung dieser Experimente. In dieser Figur zeigt der obere Bereich (Teil A) die Beziehung zwischen den beiden überlappenden genomischen Clonen und den Bereich von 5825 bp, der sequenziert wurde. Die mit "tez1" bezeichnete Region entspricht dem Protein codierenden Bereich, wobei auch die flankierenden Sequenzen gezeigt sind. Die Box unterhalb des Bereichs von 5825 bp ist ein HindIII-Fragment von etwa 2 kb, das zur Herstellung des tez1-Disruptionskonstrukts, wie nachstehend beschrieben, verwendet wurde. 



  Die untere Hälfte von Fig. 55 (Teil B) ist ein "aufgeschlüsseltes" Schema des gleichen DNA-Bereichs. Die als "Original-PCR" bezeichnete Sequenz ist das ursprüngliche degenerierte PCR-Fragment, das mit dem degenerierten Oligonucleotid-Primerpaar erzeugt wurde, das auf der Basis der Sequenz von Motiv 4 (B min ) und Motiv 5 (C) von Euplotes, wie in den vorstehenden Beispielen beschrieben, entworfen worden war. 


 i) PCR mit degenerierten Primern 
 



  Eine PCR unter Verwendung der genetischen Primer wurde verwendet, um in S. pombe das zu p123 von E. aediculatus homo loge Protein zu finden. Fig. 56 zeigt die Sequenzen der in dieser Reaktion verwendeten degenerierten Primer (bezeichnet als "poly 4" und "poly 1"). Die PCR-Läufe wurden unter den gleichen Pufferbedingungen wie in den vorstehenden Beispielen beschrieben durchgeführt (siehe beispielsweise den vorstehendenTeil K) mit einer 5minütigen "ramp"-Zeit von 94 DEG C,wonach sich Cyclen für jeweils 30 Sekunden bei 94 DEG C, 45 Sekunden bei 50 DEG C und Sekunden bei 72 DEG C anschlossen, dann 7 Minuten bei 72 DEG C, und anschliessend wurde das Reaktionsgemisch bei 4 DEG C aufbewahrt. Die PCR-Läufe wurden unterunterschiedlichen Bedingungen durchgeführt (d.h. verschiedene Konzentrationen an DNA von S. pombe und verschiedene MgCl2-Konzentrationen).

   Die PCR-Produkte wurden auf Agarosegelen aufgetrennt und mit Ethidiumbromid wie vorstehend beschrieben angefärbt. Verschiedene PCR-Läufe ergaben die Produktion von 3 Banden (mit "T", "M1" und "B") bezeichnet). Diese Banden wurden unter den gleichen Bedingungen wie vorstehend beschrieben erneut amplifiziert und auf Gelen aufgetrennt. Nach dieser erneuten Amplifikation wurden vier Banden beobachtet ("T", "M1", "M2" und "B"), wie in Fig. 57 gezeigt. Diese vier Banden wurden dann unter den gleichen Bedingungen wie vorstehend beschrieben erneut amplifiziert. Die dritte Bande von dem oberen Bereich der Spur in Fig. 57 wurde als eine Bande identifiziert, die die richtige Sequenz für ein Telomerase-Protein enthielt. Es zeigte sich, dass das mit M2 bezeichnete PCR-Produkt zu anderen Telomerase-Proteinen relativ gut passt, wie dies in Fig. 58 gezeigt ist.

   Zusätzlich zu der gezeigten Ausrichtung zeigt diese Figur auch die tatsächliche Sequenz von tez1. In dieser Figur bezeichnen Sternchen Reste, die alle vier Sequenzen gemeinsam haben (Oxytricha "OT"; E. aediculatus "Ea_p123", S. cerevisiae "Sc_p103" und M2), und die Kreise (d.h. Punkte) kennzeichnen ähnliche Aminosäurereste. 


 ii) 3 min -RT-PCR 
 



  Um eine zusätzliche Sequenzinformation zu erhalten, wurden 3 min - und 5 min -RT-PCR an dem in Fig. 58 angegebenen Telomerase-Kandidaten durchgeführt. Fig. 59 zeigt ein Schema der verwendeten 3 min -RT-PCR-Strategie. Zuerst wurde mittels des Oligonucleotidprimers "QT" (5 min -CCA GTG AGC AGA GTG ACG AGG ACT CGA GCT CAA GCT TTT TTT TTT TTT TT-3 min ; aus mRNA cDNA präpariert, danach diese cDNA als eine Matrize für OCR mit "QO" (5 min -CCA GTG AGC AGA GTG ACG-3 min ; verwendet und ein Primer auf der Basis der ursprünglichen degenerierten PCRReaktion entworfene, (d.h. "M2-T" mit der Sequenz 5 min -G TGT CAT TTC TAT ATG GAA GAT TTG ATT GAT G-3 min ).

   Die zweite PCR-Reaktion (d.h. "nested" PCR) wurde mit "QI" (5 min -GAG GAC TCG AGC TCA AGC-3 min ); und einem weiteren PCR-Primer, der mit einer Sequenz entworfen wurde, die von der ursprünglichen degenerierten PCR-Reaktion stammte oder "M2-T2" mit der Sequenz 5 min -AC CTA TCG TTT ACG AAA AAG AAA GGA TCA GTG-3 min ; durchgeführt. Die in dieser PCR verwendeten Puffer entsprachen den vorstehend beschriebenen, wobei die durchgeführte Amplifikation mit einem 5minütigem "ramp up" bei 94 DEG C begann, wonach sich 30 Cyclen von jeweils 30 Sekunden bei 94 DEG C, 30 Sekunden bei 55 DEG C und 3 Minuten bei 72 DEG C anschlossen, danach wurde 7 Minuten bei 72 DEG C inkubiert. Die Reaktionsprodukte wurden bis zu ihrer Verwendung bei 4 DEG C aufbewahrt. 


 iii) Screenen von genomischen und cDNA-Banken 
 



  Nach Erhalt dieser zusätzlichen Sequenzinformation wurden verschiedene genomische und cDNA-Banken gescreent, um somit alle Banken identifizieren zu können, die diesen Kandidaten für das Telomerase-Gen enthielten. Die verwendete Vorgehensweise sowie die Genbanken und Ergebnisse sind in Fig. 60 gezeigt. In dieser Figur werden in Teil A die in diesem Experiment getesteten Genbanken aufgezählt; Teil B zeigt die verwendeten Bereiche; die Teile C und D zeigen die mit die sen Banken erhaltenen Ergebnisse der Dot-Blot-Hybridisierung. Positive Banken wurden dann zum Erhalt des genomischen tez1-Gens und einer cDNA-Version des tez1-Gens durch Koloniehybridisierung gescreent. In diesem Experiment wurden etwa 3 x 10<4> Kolonien von der genomischen HindIII-Bank gescreent und es konnten sechs positive Clone identifiziert werden (etwa 0,01%).

   Danach wurde DNA von zwei unabhängigen Clonen (A5 und B2) präpariert. Fig. 61 zeigt die mit den HindIII-gespaltenen positiven genomischen Clone A5 und B2 erhaltenen Ergebnisse. 



  Zusätzlich wurden cDNA-REP-Banken verwendet. Es wurden etwa 3 x 10<5> Kolonien gescreent und es konnten 5 positive Clone (0,002%) identifiziert werden. Von drei unabhängigen Clonen (2-3, 4-1 und 5-20) wurde DNA präpariert. In späteren Experimenten wurde herausgefunden, dass 2-3 und 5-20 identische Insertionen enthielten. 


 iv) 5 min -RT-PCR 
 



  Da die cDNA-Version des Genprodukts bis zu diesem Punkt nicht vollständig war, wurde zum Erhalt eines Clons vollständiger Länge eine 5 min -RT-PCR durchgeführt. Die Strategie ist schematisch in Fig. 62 gezeigt. Bei diesem Experiment wurde cDNA präpariert mittels des DNA-Oligonucleotid-Primers "M2-B" (5 min -CAC TGA TCC TTT CTT TTT CGT AAA CGA TAG GT-3 min ); und "M2-B2" (5 min -C ATC AAT CAA ATC TTC CAT ATA GAA ATG ACA3 min ); die anhand von bekannten und bereits früher identifizierten Bereichen von tez1 entworfen worden waren. Ein Oligonucleotid-Linker "PCR Adapt SfiI" mit einem phosphorylierten 5 min -Ende ("P") (p-GGG CCG TGT TGG CCT AGT TCT CTG CTC3 min ); wurde danach mit dem 3 min -Ende dieser cDNA ligiert und dieses Konstrukt wurde als die Matrize für eine "nested"-PCR verwendet. In der ersten PCR-Runde wurden PCR Adapt SFI und M2-B als Primer verwendet.

   In der zweiten Runde wurde PCR Adapt SfiII (5-GAG GAG GAG AAG AGC AGA GAA CTA GGC CAA CAC GCC CC-3 min ); und M2-B2 (5 min -ATC AAT CAA ATC TTC CAT ATA GAA  ATG ACA-3 min ); als Primer verwendet.         "Nested"-PCR wurde zur Steigerung der Spezifität der Reaktion verwendet. 


 v) Sequenzausrichtungen 
 



  Nachdem die Sequenz von tez1 bestimmt war, wurde sie mit bereits früher beschriebenen Sequenzen verglichen. Fig. 63 zeigt die Ausrichtung von reverser Transkriptase (RT)-Domänen von katalytischen Telomerase-Untereinheiten von S. pombe ("S.p. Tez1p"), S. cerevisiae "S.c. Est2p"), und E. aediculatus p123 (E.a. p123"). In dieser Figur bezeichnet "h" hydrophobe Reste, "p" kleine polare Reste und "c" geladene Reste. Die über der Ausrichtung angegebenen Aminosäurereste zeigen das "Consensus"-RT-Motiv von Y. Xiong und T.H. Eickbush (Y. Xiong und T.H. Eickbush, EMBO J. 9 (1990) 3353-3362). Die Sternchen bezeichnen die Reste, die in allen drei Proteinen konserviert sind. "Motiv 0" wurde hier als ein Motiv identifiziert, das spezifisch für diese Telomerase-Untereinheit ist und im allgemeinen in reversen Transkriptasen nicht gefunden wird.

   Es ist somit wertvoll, um andere Aminosäuresequenzen als gute Kandidaten für katalytische Telomerase-Untereinheiten identifizieren zu können. 



  Fig. 64 zeigt die Ausrichtung der gesamten Sequenzen von Euplotes ("Ea_P123"), S. cerevisiae ("Sc_Est2P") und S. pombe ("Sp_Tez1p"). In Teil A kennzeichnen schattierte Bereiche Reste, die beide Sequenzen gemeinsam haben. In Teil B bezeichnen schattierte Bereiche Reste, die alle drei Sequenzen gemeinsam haben. 


 vi) Genetische Disruption von tez1 
 



  In diesem Beispiel wurden die Auswirkungen einer Disruption von tez1 untersucht. Da Telomerase an der Telomer-Beibehaltung beteiligt ist, wurde davon ausgegangen, dass, falls tez1 tatsächlich ein Telomerase-Bestandteil ist, die Disruption  von tez1 zu einer graduellen Telomer-Verkürzung führen sollte. 



  In diesen Experimenten wurde zur spezifischen Disruption des tez1-Gens in S. pombe homologe Rekombination verwendet. Diese Vorgehensweise ist schematisch in Fig. 65 gezeigt. Wie in Fig. 65 angegeben, wurde Wild-Typ-tez1 gegen ein Fragment, das den ura4- oder LEU2-Marker enthielt, ausgetauscht. 



  Die Disruption des tez1-Gens wurde durch PCR bestätigt (Fig. 66) und ein Southern-Blot wurde zur Überprüfung der Telomer-Länge durchgeführt. Fig. 67 zeigt die Southern-Blot-Ergebnisse dieses Experiments. Da eine ApaI-Restriktionsenzymstelle im unmittelbaren Anschluss zu einer Telomer-Sequenz in S. pombe vorhanden ist, erlaubt die Spaltung von genomischen DNA-Präparationen von S. pombe die Analyse der Telomer-Länge. Somit wurde DNA von S. pombe mit ApaI geschnitten, die Spaltprodukte wurden auf einem Agarosegel aufgetrennt und diese dann mit einer für eine Telomer-Sequenz spezifischen Sonde hybridisiert, um so herauszufinden, ob die Telomere der disruptierten S. pombe-Zellen verkürzt waren. Die Ergebnisse sind in Fig. 67 gezeigt. Aus diesen Ergebnissen konnte geschlossen werden, dass eine Disruption des tez1-Gens eine Verkürzung der Telomere bewirkte. 


 Q.

   Clonierung und Charakterisierung von menschlichem Telomerase-Protein und -cDNA 
 



  In diesem Beispiel wurde die Information bezüglich der Nucleinsäuresequenz und Aminosäuresequenz für menschliche Telomerase ermittelt. Partiell homologe Sequenzen wurden zuerst mittels einer BLAST-Suche identifiziert, die mittels der Euplotes 123 kD-Peptid- und Nucleinsäuresequenzen sowie der Sequenzen des Schizosaccharomyces-Proteins und der korrespondierenden cDNA (tez1)-Sequenz. Die menschlichen Sequenzen (auch mit "hTCP1.1" bezeichnet) wurden von einem  partiellen cDNA-Clon ermittelt (Clon 712562). Sequenzen von diesem Clon wurden gegen die wie in vorherigen Beispielen beschrieben bestimmten Sequenzen ausgerichtet. 



  Fig. 1 zeigt die Sequenzausrichtung von Euplotes ("p123") Schizosaccharomyces ("tez1"), Est2p (d.h. das von der Est2-Nucleinsäuresequenz codierte Protein von S. cerevisiae, das hier auch mit "L8543.12" bezeichnet wird) und dem in dieser Vergleichssuche identifizierten menschlichen Homologen. Fig. 51 zeigt die Aminosäuresequenz von tez1 und Fig. 52 die DNA-Sequenz von tez1. In Fig. 52 sind die Introns und andere nicht codierende Bereiche mit kleinen Buchstaben dargestellt und die Exons (d.h. codierenden Bereiche) in Grossbuchstaben. 



  Wie in Fig. 75 gezeigt, gibt es Bereiche, die unter diesen Proteinen hochkonserviert sind. Beispielsweise zeigt sich in dieser Figur, dass es Identitätsbereiche "Motiv 0", "Motiv 1", "Motiv 2" und "Motiv 3" gibt. Die identischen Aminosäuren sind durch ein Sternchen (*) gekennzeichnet und die ähnlichen Aminosäurereste durch einen Kreis ( &cirf& ). Dies zeigt, dass es Bereiche innerhalb der Telomerase-Motive gibt, die innerhalb einer grossen Anzahl von Eukaryoten, die von der Hefe über Ciliate bis zum Menschen reichen, konserviert sind. Es wird davon ausgegangen, dass weitere Organismen ebenso solche konservierten Sequenzbereiche enthalten. Fig. 49 zeigt die partielle Aminosäuresequenz des Clons, der menschliche Telomerase-Motive codiert und Fig. 50 die korrespondierende DNA-Sequenz des Genbank-Clons #AA281296. 



  Um die Information über die Sequenz des Genbank-Clons #AA281296 zu vervollständigen wurden die Sanger-Didesoxy-Sequenzierung und andere auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren angewandt. Einige der bei der Sequenzierung verwendeten Primer sind in Tabelle 7 gezeigt. Diese Primer wurden so entworfen, dass sie mit dem Clon (GenBank-Zugangsnummer #AA281296) hybridisieren; dies basierte auf Sequenzkomple mentarität entweder zu der Sequenz des Plasmidrückgrats oder der Sequenz der Insertion der menschlichen cDNA im Clon. 
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  Anhand dieser Experimente wurde herausgefunden, dass die EcoRI-NotI-Insertion des Genbank-Clons #AA281296 nur einen partiellen offenen Leserahmen für das menschliche Telomerase-Protein enthält, allerdings könnte er ein aktives Fragment dieses Proteins codieren. Der offene Leserahmen im Clon codiert ein Protein von etwa 63 kD. Die Sequenz des längsten ermittelten offenen Leserahmens ist in Fig. 68 gezeigt. Der offene Leserahmen (ORF) beginnt an dem ATG-Codon mit dem in der Figur gekennzeichneten "met". Der poly-A-Schwanz am 3 min -Ende der Sequenz ist ebenfalls gezeigt. Fig. 69 zeigt eine vorläufige Ausrichtung von reverser Transkriptase-Proteinen von Telomerase von der menschlichen Sequenz (menschliches Telomerase "Core Protein 1", "HS TCP1"), E. aediculatus p123 ("Ep p123"), S. pombe tez1 ("Sp Tez1"), S. cerevisiae EST2  ("Sc Est2") und der "Consensus"-Sequenz.

   In dieser Figur sind verschiedene Motive angegeben. 



  Um einen vollständigen Clon zu erhalten, wurden die Hybridisierung einer cDNA-Bank und 5 min -RACE durchgeführt, um so Clone zu erhalten, die Bereiche von bisher nicht clonierten Bereichen codieren. In diesen Experimenten wurde zur Erzeugung von Material für eine Sequenzanalyse RACE angewandt (schnelle Amplifikation von cDNA-Enden, "Rapid Amplification of cDNA Ends"; siehe z.B. M. A. Frohman, "RACE: Rapid Amplification of cDNA Ends", in Innis et al. (Herausg.) PCR-Protocols: A Guide to Methods and Applications (1990) S. 2838, und Frohman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 85 (1988) 8998-9002). Vier solcher Clone wurden erzeugt und zur Bereitstellung zusätzlicher 5 min -Sequenzinformation (pFWRP5, 6, 19 und 20) verwendet. 



  Zusätzlich wurden menschliche cDNA-Banken (in lambda inseriert) mit dem EcoRI-NotI-Fragment des Clons (#AA281296) hybridisiert. Ein lambda-Clon mit der Bezeichnung "lambda 25-1.1" (ATCC-Zugangsnummer #209024) wurde gefunden, der komplementäre Sequenzen enthielt. Fig. 75 zeigt eine Restriktionskarte dieses lambda-Clons. Die Insertion von humaner cDNA wurde von diesem Clon als ein EcoRI-Restriktionsfragment in die EcoRI-Stelle des im Handel erhältlichen "phagemids"             pBluescriptIISK+ (Stratagene) subcloniert, wodurch das Plasmid "pGRN121" erzeugt wurde, das bei der ATCC hinterlegt wurde (ATCC-Zugangsnummer #209016). Vorläufige Ergebnisse zeigten, dass das Plasmid pGRN121 die vollständige Sequenz des offenen Leserahmens (ORF) enthält, der das menschliche Telomerase-Protein codiert. 



  Die cDNA-Insertion von Plasmid pGRN121 wurde unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannter Verfahren sequenziert. Fig. 70 zeigt eine Karte des Plasmids pGRN121 bezüglich Restriktionsstellen und Funktion, deren Bestimmung auf dieser vorläufigen Arbeit basiert. Die Ergebnisse dieser vorläufi gen Sequenzanalyse sind in Fig. 71 gezeigt. Aufgrund dieser Analyse, und wie in Fig. 70 gezeigt, wurde eine vermutliche Startstelle für den codierenden Bereich bei einer Position, die etwa 50 Nucleotide von der EcoRI-Stelle entfernt liegt, gefunden (bei Position 707 gelegen) und die Lage der Telomerase-spezifischen Motive "FFYVTE", "PKP", "AYD", "QG" und "DD". Zusätzlich wurde eine vermutliche Stopstelle bei Nucleotid #3571 gefunden (siehe Fig. 72). Fig. 72 zeigt die DNA-Sequenzen und entsprechenden Aminosäuresequenzen für die offenen Leserahmen in der Sequenz ("a", "b" und "c").

   Aufgrund der vorläufigen Natur dieser frühen Sequenzierungsarbeiten stellte sich jedoch heraus, dass die Leserahmen für die verschiedenen Motive nicht richtig ausgerichtet sind. 



  Eine zusätzliche mit pGRN121 durchgeführte Analyse ergab, dass das Plasmid signifikante Bereiche des 5 min -Endes der codierenden Sequenzen enthielt, die auf dem Genbank-Clon mit der Zugangsnummer #AA281296 nicht vorhanden sind. Es stellte sich weiterhin heraus, dass pGRN121 eine Variante der codierenden Sequenz enthält, die eine Insertion von etwa 182 Nucleotiden enthält. Es zeigte sich, dass diese Insertion in dem Genbank-Clon mit der Zugangsnummer #AA281296 fehlt. Solche Varianten können wie die E. aediculatus-Sequenzen in funktionellen Assays getestet werden, beispielsweise Telomerase-Assays, um so das Vorhandensein einer funktionellen Telomerase in einer Probe nachweisen zu können. 



  Durch eine weitere Sequenzanalyse konnte die cDNA-Sequenz von pGRN121 bestimmt werden, wobei ein zusammenhängender offener Leserahmen gefunden wurde, der ein Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 127 000 Dalton und 1132 Aminosäuren, wie in Fig. 74 gezeigt, codiert. Eine auf dieser Analyse basierende verbesserte Karte von pGRN121 ist in Fig. 73 gezeigt. Die Ergebnisse der zusätzlichen Sequenzanalyse der hTRT-cDNA sind in Fig. 16 gezeigt. 


 Beispiel 2 
 


 Die Korrelation von hTRT-Häufigkeit und Zellunsterblichkeit 
 



  Die relative Häufigkeit von hTRT-mRNA wurde in sechs Stämmen von Telomerase-negativen sterblichen Zellen und sechs Zellinien von Telomerase-positiven unsterblichen Zellen bewertet (Fig. 5). Der Fliessgleichgewicht kleinere Spiegel von hTRT-mRNA war in unsterblichen Zellen, für die früher gezeigt werden konnte, dass sie aktive Telomerase besitzen, signifikant erhöht. Niedrigere Spiegel der hTRT-mRNA wurden in einigen Stämmen Telomerase-negativer Zellen entdeckt. 



  Es wurde RT-PCR für hTRT, hTR, TP1 (Telomerase-assoziiertes Protein, das mit Tetrahymena p80 verwandt ist (Harrington et al., Science 275 (1997) 973 und Nakayama et al., Cell 88 (1997), 875)) und GAPDH (um für gleiche Mengen an RNA-Matrize zu normalisieren) mit RNA ausgeführt, die von den folgenden Zellen stammte: (1) Menschliche fötale Lungenfibroblasten GFL, (2) menschliche fötale Hautfibroblasten GFS, (3) erwachsene Prostata Stromal-Fibroblasten 31 YO, (4) menschliche fötale Kniesynovial-Fibroblasten HSF, (5) neonatale Vorhaut-Fibroblasten Bi, (6) menschliche fötale Lungenfibroblasten IMR90 und die immortalisierten Zellinien: (7) Melanom LOX IMVI, (8) Leukämie U251, (9) Lungenkrebs NCI H23, (10) Colon-Adenocarcinom SW620, (11) Brusttumor MCF7, (12) 293 Adenovirus-E1-transformierte menschliche embryonale Nierenzellinie. 



  hTRT-Nucleinsäure wurde von cDNA mittels der Oligonucleotid-primer LT5 und LT6 amplifiziert (Tabelle 2) mit insgesamt 31 Cyclen (94 DEG C 45 s, 60 DEG C 45 s, 72 DEG C 90 s). GAPDH wurde mittels des Primers K136 (CTCAGACACCATGGGGAAGGTGA) und K137 (ATGATCTTGAGGCTGTTGTCATA) mit insgesamt 16 Cyclen amplifi ziert (94 DEG C 45 s, 55 DEG C 45 s, 72 DEG C 90 s). hTR wurde mit den Primern F3B    (TCTAACCCTAACTGAGAAGGGCGTAG) und R3c (GTTTGCTCTAGAATGAACGGTGGAAG) mit insgesamt 22 Cyclen amplifiziert  (94 DEG C 45 s, 55 DEG C 45 s, 72 DEG C 90 s). TP1-mRNA wurde mit den Primern TP1.1 und TP1.2 in 28 Cyclen (die Cyclen waren die gleichen wie für hTRT) amplifiziert. Die Reaktionsprodukte wurden auf einem 8%igen Polyacrylamidgel aufgetrennt, mit "SYBR Green" (Molecular Probes) angefärbt und durch Scannen auf einem "Storm 860" (Molecular Dynamics) sichtbar gemacht.

   Die in Fig. 5 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass hTRT-mRNA-Spiegel direkt mit den Spiegeln an Telomerase-Aktivität in den getesteten Zellen korrelieren. 


 Beispiel 3 
 


 Charakterisierung einer hTRT-Intron-Sequenz 
 



  Ein vermutetes Intron wurde zuerst durch PCR-Amplifikation menschlicher genomischer DNA, wie in diesem Beispiel beschrieben, identifiziert und das Ergebnis wurde im Anschluss daran durch Sequenzierung des genomischen Clons  lambda G PHI 5 (siehe Beispiel 4) bestätigt. PCR-Amplifikation wurde mittels des Vorwärts-Primers TCP1.57 durchgeführt, der in Kombination mit den einzelnen reversen Primern TCP1.46, TCP1.48, TCP1.50, TCP1.52, TCP1.54, TCP1.56 und TCP1.58 kombiniert wurde (siehe Tabelle 2). Die Produkte von genomischer DNA der Amplifikation mit TCP1.57/TCP1.46, TCP1.48, TCP1.50, TCP1.52, TCP1.54 oder TCP1.56 waren etwa 100 Basenpaare länger als die Produkte der pGRN121-Amplifikationen. Die Amplifikation mit TCP1.57/TCP1.58 war bei Verwendung genomischer DNA und pGRN121-DNA gleich.

   Dies zeigte, dass die genomische DNA eine Insertion zwischen den Stellen für TCP1.58 und TCP1.50 enthielt. Die PCR-Produkte von TCP1.57/TCP1.50 und TCP1.57/TCP1.52 wurden ohne Subclonierung mit den Primern TCP1.39, TCP1.57 und TCP1.49 direkt sequenziert. 



  Wie nachstehend gezeigt, ist die Intron-Sequenz von 104 Basen (SEQ. ID. Nr. 7) (Fig. 12) in der hTRT-mRNA (in Fettdruck gezeigt) an der Verbindung, die den Basen 274 und 275 von SEQ. ID. Nr. 1 entspricht, inseriert: 
EMI305.1
 
 



  "/" kennzeichnet die Spleisspunkte, die Sequenz zeigt gute Übereinstimmungen mit den "Consensus"-5 min - und 3 min -Spleisspunktsequenzen, die typisch für menschliche Introns sind. 



  Dieses Intron enthält Motive, die charakteristisch für eine Spaltstelle für Topoisomerase II sind und eine NFKB-Bindungsstelle (siehe Fig. 21). Diese Motive sind teilweise deshalb von Interesse, da die Expression von Topoisomerase II in den meisten Tumoren hoch reguliert ist. Topoisomerase II bewirkt eine Relaxierung von DNA durch Schneiden und erneutes Auffinden der DNA, wodurch die Expression bestimmter Gene erhöht wird. Es konnte gezeigt werden, dass Inhibitoren von Topoisomerase II als anti-Tumor-Agenzien wirken. Im Falle von NFKB könnte dieser Transkriptionsfaktor eine Rolle bei der Regulation von Telomerase während der terminalen Differenzierung spielen.

   NFKB könnte eine Rolle spielen bei der frühen Repression von Telomerase während der Entwicklung und stellt somit ein weiteres Ziel für eine therapeutische Intervention hinsichtlich der Regulierung von Telomerase-Aktivität in Zellen dar. 


 Beispiel 4 
 


 Clonierung des Lambda-phagen G PHI 5 und Charakterisierung von genomischen hTRT-Sequenzen 
 


 a) Lambda G PHI 5 
 

 

  Eine menschliche genomische DNA-Bank wurde mittels PCR und Hybridisierung gescreent, wobei ein hTRT-RNA codierende Sequenzen enthaltender genomischer Clon gefunden wurde. Bei  der Bank handelt es sich um eine genomische Bank von menschlichen Fibroblasten, die mittels DNA von W138 Lungenfibroblastenzellen hergestellt wurde (Stratagene, Katalog #946204). In dieser Bank sind partielle Sau3AI-Fragmente in die XhoI-Stelle des Lambda-Vektors FIXRII (Stratagene) mit einer Insertionsgrösse von 9-22 kb inseriert. 



  Diese genomische Bank wurde in Pools von jeweils 150 000 Phagen aufgeteilt und jeder Pool durch "nested" PCR gescreent (äusseres Primerpaar TCP1.52 & TCP1.57; inneres Primerpaar TCP1.49 & TCP1.50, siehe Tabelle 1). Diese Primerpaare umspannen ein vermutetes Intron (siehe das vorstehende Beispiel 3) in der genomischen DNA von hTRT und sie gewährleisten, dass das PCR-Produkt von einer genomischen Quelle stammte und nicht von einer Verunreinigung durch den hTRTcDNA-Clon. Positive Pools wurden weiter aufgeteilt, bis ein Pool von 2000 Phagen erhalten wurde. Dieser Pool wurde mit niedriger Dichte ausplattiert und durch Hybridisierung mit einem DNA-Fragment, das die Basenpaare 1552-2108 von SEQ. ID. Nr. 1 umfasst (Restriktionsstellen SphI bzw. EcoRV) gescreent. 



  Zwei positive Clone wurden isoliert und erneut über "nested" PCR wie vorstehend beschrieben gescreent. Beide Clone waren am Rande der PCR positiv. Einer der Clone ( lambda G PHI 5) wurde mit NotI gespalten, wobei sich eine Insertionsgrösse von etwa 20 kb zeigte. Die nachfolgende Kartierung (siehe unten) ergab eine Insertionsgrösse von 15 kb und zeigte, dass der Phage G PHI 5 etwa 13 kb an DNA stromaufwärts von der Startstelle der cDNA-Sequenz enthält. 



  Der Phage G PHI 5 wurde mittels Restriktionsenzymspaltung und DNA-Sequenzierung kartiert. Die erhaltene Karte ist in Fig. 7 gezeigt. Die Phagen-DNA wurde mit NcoI gespalten und die Fragmente in pBBS167 cloniert. Die erhaltenen Subclone wurden durch PCR gescreent, um jene zu identifizieren, die Sequenzen enthalten, die dem 5 min -Bereich der hTRT-cDNA entspre chen. Ein Subclon (pGRN140), der ein NcoI-Fragment von 9 kb (mit der hTRT-Gensequenz und 4 bis 5 kb der lambda-Vektor-Sequenz) enthielt, wurde partiell sequenziert, um die Orientierung der Insertion zu bestimmen. pGRN 140 wurde zur Entfernung von lambda-Vektor-Sequenzen mit SalI geschnitten, wobei pGRN144 erhalten wurde. pGRN144 wurde danach sequenziert. Vorläufige Ergebnisse der Sequenzierung sind in Fig. 76 gezeigt und die Ergebnisse einer weiteren Sequenzierung sind in SEQ. ID. Nr. 6 (Fig. 21) bereitgestellt.

   Das  5 min -Ende der hTRT-mRNA entspricht der Base 2441 von SEQ. ID. Nr. 6 (Fig. 21). Wie in Fig. 7 gezeigt, liegen zwei Alu-Sequenzelemente 1700 Basenpaare stromaufwärts von dem 5 min -Ende der hTRT-cDNA und diese liefern wahrscheinlich die stromaufwärts gelegene Grenze hinsichtlich des Promotorbereichs von hTRT. Die Sequenz besitzt auch ein Intron, das bei der Base 4173 (SEQ. ID. Nr. 6) (Fig. 21) liegt, 3 min  gelegen zu dem in dem vorstehenden Beispiel 3 beschriebenen Intron. 


 b) Zusätzliche genomische Clone 
 



  Zusätzlich zu dem vorstehend beschriebenen genomischen Clon werden zwei P1-Bacteriophagenclone und ein menschlicher BAC-Clon als veranschaulichende erfindungsgemässe Ausführungsformen bereitgestellt. Die P1-Insertionen haben gewöhnlich eine Länge von 75 bis 100 kb und die BAC-Insertionen üblicherweise von mehr als 100 kb. 



  Die P1-Clone (DMPC-HFF#1-477(F6) -GS#15371 und DMPC-HEF#1-1103(H6) -GS#15372) wurden durch PCR-Screenen einer menschlichen P1-Bank erhalten, die von menschlichen Vorhaut-Fibroblastenzellen stammte (Shepherd et al., PNAS USA 91 (1994) 2629) wobei die Primer TCP1.12 und UTR2 verwendet wurden, die das 3 min -Ende von hTRT amplifizieren. Diese Clone waren beide negativ mit Primern, die das 5 min -Ende von hTRT amplifizieren (d.h. es fand keine Amplifikation statt). 



  Der menschliche BAC-Clon (326 E 20) wurde mittels eines Hybridisierungs-Screenings einer menschlichen genomischen BAC-Bank mittels eines 1143 bp SphI/XmnI-Fragments von SEQ. ID. Nr. 1 (Basen 1552-2695) erhalten, das den RT-Motivbereich umfasst. Es wird davon ausgegangen, dass dieser Clon das 5 min  enthält. Es wird davon ausgegangen, dass die genomischen hTRT-Clone in diesem Beispiel das gesamte hTRT-Gen umfassen. 


 Beispiel 5 
 


 Chromosomale Lage des hTRT-Gens 
 



  Das hTRT-Gen wurde auf dem Chromosom 5p durch "radiation hybrid"-Kartierung lokalisiert    (Boehnke et al., Am. J. Hum. Genet. 49 (1991) 1174 und Walter et al., Nature Genet. 7 (1994) 22) unter Verwendung des "medium resolution Stanford G3 panel" von 83 RH-Clonen des gesamten menschlichen Genoms (erzeugt am Stanford Human Genome Center). Eine menschliche Lymphoblastoid-Zellinie (Donor; rM) wurde gegen 10 000 rad Röntgenstrahlen exponiert und dann mit nicht bestrahlten Hamster-Rezipientenzellen (A3) fusioniert. 83 unabhängige Hybridclone aus somatischen Zellen wurden isoliert, wobei jeder Clon ein Fusionsereignis zwischen einer bestrahlten Donorzelle und einer Hamster-Rezipientenzelle darstellt. Die DNA von Tafel G3 wurde zum Ordnen von Markern in dem gewünschten Bereich sowie zur Etablierung der Entfernung zwischen diesen Markern verwendet. 



  Die für die RH-Kartierung verwendeten Primer waren TCP1.12 und UTR2, wobei 45 Cyclen mit Taq-Puffern von Boehringer Mannheim und Taq-Polymerase von Perkin-Elmer verwendet wurden, jeweils 45 Sekunden 94 DEG C, 45 Sekunden 55 DEG C und 45 Sekunden 72 DEG C. Die 83 Pools wurden unabhängig voneinander amplifiziert und 14 (17%) waren positiv hinsichtlich hTRT (durch Auftreten einer Bande von 346 bp). Die Amplifikationsergebnisse wurden dem "Stanford RH server" eingegeben,  der dann die Kartenposition 5p und den nächsten Marker, STS D5S678 lieferte. 



  Durch Abfragen der "Genethon genom mapping" - web site konnte bei der Kartierung ein YAC identifiziert werden, das den STS-Marker D5S678 enthält: CEPH YAC 780_C_3, Grösse: 390 660 kb. Dieses YAC enthielt auch Marker für das Chromosom 17. Dieses Ergebnis zeigte an, dass sich das hTRT-Gen auf Chromosom 5 befindet, nahe dem Telomer-Ende. In einer Reihe von Tumoren gibt es erhöhte Kopienanzahlen für 5p. Das Katzenschrei-Syndrom wurde auch zu Deletionen in diesem Bereich kartiert. 


 Beispiel 6 
 


 Entwurf und Konstruktion von Vektoren zur Expression von hTRT-Proteinen und -Polynucleotiden 
 


 Expression von hTRT in Bakterien 
 



  Das folgende Beispiel beschreibt ausführlich den Entwurf von hTRT-exprimierenden bakteriellen Expressionsvektoren, mit denen grosse Mengen an biologisch aktivem hTRT mit vollständiger Länge (SEQ. ID. Nr. 2) hergestellt werden können. Die Erzeugung von biologisch aktivem hTRT-Protein auf diese Weise ist von Nutzen für die Telomerase-Rekonstitutionsassays, für die Untersuchung von Modulatoren von Telomerase-Aktivität, für die Analyse der Aktivität von neu isolierten Spezies von hTRT, zur Identifizierung und Isolierung von Verbindungen, die spezifisch mit hTRT assoziieren, für die Analyse der Aktivität einer hTRT-Proteinvariante, die, wie vorstehend beschrieben, ortsspezifisch mutiert wurde, und als ein Immunogen, um nur einige Beispiele zu nennen. 


 Der bakterielle Expressionsvektor pThioHis A/hTRT 
 



  Um grosse Mengen an hTRT (SEQ. ID. Nr. 2) mit vollständiger Länge herstellen zu können, wurde der bakterielle Expressionsvektor pThioHis A (Invitrogen, San Diego, CA) als Expressionssystem ausgewählt. Die hTRT-codierende Insertion enthält die Nucleotide 707 bis 4776 der hTRT-Insertion im Plasmid pGRN121 (SEQ. ID. Nr. 1). Diese Nucleotidsequenz enthält die vollständige codierende Sequenz des hTRT-Proteins (SEQ. ID. Nr. 2). 



  Dieser erfindungsgemässe Expressionsvektor kann für induzierbare Expressionen in Bakterien entworfen werden. Die Induktion der Expression kann erfolgen, um in E. coli hohe Spiegel eines Fusionsproteins zu codieren, das aus einer spaltbaren, "HIS-tagged" Thioredoxineinheit und dem hTRT-Protein mit vollständiger Länge zusammengesetzt ist. Die Verwendung des Expressionssystems erfolgte im wesentlichen gemäss den Anleitungen des Herstellers. Die Aminosäuresequenz des von dem erfindungsgemässen erhaltenen Vektor-codierten Fusionsproteins wird nachfolgend gezeigt: (-*-) kennzeichnet eine Spaltstelle für Enterokinase; 
EMI310.1
 
 
EMI311.1
 
 



   


 pGEX-2TK mit den hTRT-Nucleotiden 3272 bis 4177 von pGRN121 
 



  Dieses erfindungsgemässe Konstrukt wird für die Herstellung von Fusionsprotein verwendet, beispielsweise um polyclonale und monoclonale Antikörper gegen das hTRT-Protein erhalten zu können. Fragmente von hTRT können auch für andere Zwecke verwendet verwendet werden, beispielsweise zur Modulation von Telomerase-Aktivität, z.B. als eine dominant-negative  Mutante oder um die Assoziierung von Telomerase mit anderen Proteinen oder Nucleinsäuren zu verhindern. 



  Zur Produktion grosser Mengen eines hTRT-Proteinfragments wurde der E. coli-Expressionsvektor pGEX-2TK (Pharmacia Biotech, Piscataway N.J.) ausgewählt und im wesentlichen nach den Anleitungen des Herstellers verwendet. Damit wurde ein erfindungsgemässes Expressionssystem hergestellt. Das erhaltene Konstrukt enthält eine Insertion, die von den Nucleotiden 3272 bis 4177 der hTRT-Insertion im Plasmid pGRN121 stammt. Der Vektor steuert die Expression von hohen Spiegeln eines Fusionsproteins in E. coli, das aus der Glutathion-S-Transferase-Sequenz (nachstehend unterstrichen), der Spalt-Sequenz für Thrombin (doppelt unterstrichen), der Erkennungssequenz für Herzmuskel-Proteinkinase (kursiv), durch Clonierung eingeführte Reste (in Klammern, GSVTK) und dem hTRT-Proteinfragment (in Fettdruck) (SEQ. ID. Nr. 38) wie nachfolgend gezeigt, zusammengesetzt ist: 
EMI312.1
 
 



  Bei der Expression dieses Fusionsproteins wurden unlösliche Aggregate gebildet. Es wurde allgemein wie vorstehend im Abschnitt "Reinigung von Proteinen aus Einschlusskörperchen" behandelt. Dabei wurden induzierte Zellen in PBS (20 mM Natriumphosphat, pH-Wert 7,4 und 150 mM NACl) suspendiert und durch Ultraschallbehandlung aufgebrochen. NP-40 wurde bis zu 0,1% zugegeben und das Gemisch 30 Minuten bei 4 DEG C unter leichtem Mischen inkubiert. Das unlösliche Material wurde durch 30minütige Zentrifugation mit 25 000 g bei 4 DEG C gewon nen. Das unlösliche Material wurde einmal in 4 M Harnstoff in PBS gewaschen, durch Zentrifugation gewonnen und dann erneut in PBS gewaschen. Es wurde geschätzt, dass das gewonnene Pellet mehr als 75% Fusionsprotein enthielt.

   Dieses Material wurde in einem Vakuum schnell getrocknet, danach für die Injektion in Mäuse und Kaninchen zur Erzeugung von Antikörpern in einem Adjuvans suspendiert. Die Abtrennung des rekombinanten Proteins von der Glutathion-S-Transferase-Einheit wird durch ortsspezifische Proteolyse mittels Thrombin gemäss den Anleitungen des Herstellers durchgeführt. 


 pGEX-2TK mit den Nucleotiden 2426 bis 3274 von pGRN121 mit einem "HIS-8-Tag" 
 



  Zur Herstellung grosser Mengen eines Fragments von hTRT wurde ein weiteres E. coli-Expressionsvektor pGEX-2TK (Pharmacia Biotech, Piscataway N.J.)-Konstrukt hergestellt. Dieses Konstrukt enthält eine Insertion, die von den Nucleotiden 2426 bis 3274 der hTRT-Insertion im Plasmid pGRN121 (SEQ. ID. Nr. 1) und eine Sequenz, die acht aufeinanderfolgende Histidinreste codiert (HIS-8-Tag). Um dieses "HIS-8-Tag" zu inserieren, wurde der Vektor pGEX-2TK mit den hTRT-Nucleotiden 2426 bis 3274 von pGRN121 mit BamHI linearisiert. Dadurch wird das Plasmid an der Verbindung zwischen GST-Thrombin-Herzmuskelproteinase und der hTRT codierenden Sequenz geöffnet.

   Zu dem linearisierten Plasmid wurde ein doppelsträngiges Oligonucleotid mit BamHI-kompatiblen Enden, wie dies in der nachstehend gezeigten Sequenz zu sehen ist, ligiert, was die Einführung von acht Histidin-Resten stromaufwärts der hTRT-Sequenz im Leserahmen ergab. 



  Der Vektor steuert in E. coli die Expression von hohen Spiegeln eines Fusionsproteins, das zusammengesetzt ist aus der Glutathion-S-Transferase-Sequenz (unterstrichen); der Spaltsequenz für Thrombin (doppelt unterstrichen); der Erkennungssequenz für Herzmuskel-Proteinkinase (kursiv); einem Satz von drei und einem Satz von fünf Resten, die durch Clo nierung eingeführt wurden (GSV und GSVTK) acht auf einanderfolgenden Histidinen (auch doppelt unterstrichen) und dem hTRT-Proteinfragment (in Fettdruck) (SEQ. ID. Nr. 39): 
EMI314.1
 
 



  Dieser Vektor kann zur Herstellung von Fusionsprotein zur Erzeugung von polyclonalen und monoclonalen Antikörpern gegen ein hTRT-Protein verwendet werden. Dieses Fusionsprotein kann ausserdem dazu verwendet werden, um gegen hTRT-Peptide, die innerhalb des Fusionsproteins enthalten sind, gerichtete Antikörper einer Affinitätsreinigung zu unterwerfen. Die Abtrennung des rekombinanten Proteins von der Glutathion-S-Transferase-Einheit kann durch ortsspezifische Proteolyse mittels Thrombin gemäss den Anweisungen des Herstellers erzielt werden. 


 pGEX-2TK mit den hTRT-Nucleotiden 2426 bis 3274 von pGRN121 ohne "HIS-8-TAG" 
 



  Zur Herstellung grosser Mengen eines hTRT-Fragments wurde ein anderes E. coli-Expressionsvektor pGEX-2TK (Pharmacia Biotech, Piscataway N.J.)-Konstrukt hergestellt. Dieses Vektorkonstrukt kann zur Herstellung von Fusionsprotein für die Erzeugung von polyclonalen und monoclonalen Antikörpern gegen das hTRT-Protein verwendet werden. Dieses Fusionsprotein kann ausserdem dazu verwendet werden, gegen hTRT-Peptide, die  in dem Fusionsprotein enthalten sind, gerichtete Antikörper einer Affinitätsreinigung zu unterwerfen. 



  Dieses Konstrukt enthält eine Insertion, die von den Nucleotiden 2426 bis 3274 der hTRT-Insertion im Plasmid pGRN121 (SEQ. ID. Nr. 1) stammt, jedoch ohne das "His-8-tag". Der Vektor steuert in E. coli die Expression von hohen Spiegeln eines Fusionsproteins, das zusammengesetzt ist aus Glutathion-S-Transferase (unterstrichen), einer Spaltsequenz für Thrombin (doppelt unterstrichen), einer Erkennungssequenz für die Herzmuskel-Proteinkinase (kursiv), durch Clonierung eingeführte Reste (in Klammern, GSVTK) und das hTRT-Proteinfragment (in Fettdruck) (SEQ. ID. Nr. 40): 
EMI315.1
 
 



  Die Abtrennung des rekombinanten Proteins von der Glutathion-S-Transferase-Einheit kann durch ortsspezifische Proteolyse mittels Thrombin gemäss den Angaben des Herstellers erzielt werden. 


 pGEX-2TK mit den hTRT-Nucleotiden 1625 bis 2458 von gPRN121 
 



  Zur Herstellung grosser Mengen eines hTRT-Proteinfragments wurde ein weiteres E. coli-Expressionsvektor pGEX-2TK (Pharmacia Biotech, Piscataway N.J.)-Konstrukt hergestellt. Dieses Vektorkonstrukt kann zur Herstellung von Fusionsprotein zur Erzeugung polyclonaler und monoclonaler Antikörper gegen ein hTRT-Protein verwendet werden. Darüber hinaus kann dieses Fusionsprotein dazu verwendet werden, gegen hTRT-Pep tide, die in dem Fusionsprotein enthalten sind, gerichtete Antikörper einer Affinitätsreinigung zu unterwerfen. 



  Dieses Konstrukt enthält eine Insertion, die von den Nucleotiden 1625 bis 2458 der hTRT-Insertion im Plasmid pGRN121 (SEQ. ID. Nr. 1) stammt. Der Vektor steuert in E. coli die Expression von hohen Spiegeln eines Fusionsproteins, das zusammengesetzt ist aus Glutathion-S-Transferase (unterstrichen), einer Spaltsequenz für Thrombin (doppelt unterstrichen), einer Erkennungssequenz für Herzmuskel-Proteinkinase (kursiv), durch Clonierung eingeführte Reste (in Klammern, GSVTK) und dem hTRT-Proteinfragment (in Fettdruck) (SEQ. ID. Nr. 41): 
EMI316.1
 
 



  Die Abtrennung des rekombinanten Proteins von der Glutathion-S-Transferase-Einheit wird durch ortsgerichtete Proteolyse mittels Thrombin gemäss den Anweisungen des Herstellers erzielt. 


 pGEX-2TK mit den hTRT-Nucleotiden 782 bis 1636 von pGRN121 
 



  Zur Herstellung grosser Mengen eines hTRT-Proteinfragments wurde ein weiteres E. coli-Expressionsvektor pGEX-2TK (Pharmacia Biotech, Piscataway N.J.)-Konstrukt hergestellt. Dieses Vektorkonstrukt kann zur Herstellung von Fusionsprotein zur Erzeugung polyclonaler und monoclonaler Antikörper gegen ein hTRT-Protein verwendet werden. Darüber hinaus kann dieses Fusionsprotein dazu verwendet werden, gegen hTRT-Pep tide, die in dem Fusionsprotein enthalten sind, gerichtete Antikörper einer Affinitätsreinigung zu unterwerfen. 



  Dieses Konstrukt enthält eine Insertion, die von den Nucleotiden 782 bis 1636 der hTRT-Insertion im Plasmid pGRN121 (SEQ. ID. Nr. 1) stammt. Der Vektor steuert in E. coli die Expression von hohen Spiegeln eines Fusionsproteins, das zusammengesetzt ist aus Glutathion-S-Transferase (unterstrichen), einer Spaltsequenz für Thrombin (doppelt unterstrichen), einer Erkennungssequenz für Herzmuskel-Proteinkinase (kursiv), durch Clonierung eingeführte Reste (in Klammern, GSVTK) und einem hTRT-Proteinfragment (in Fettdruck) (SEQ. ID. Nr. 42): 
EMI317.1
 
 



  Die Abtrennung des rekombinanten Proteins von der Glutathion-S-Transferase-Einheit wird durch ortsspezifische Proteolyse mittels Thrombin gemäss den Anleitungen des Herstellers erzielt. 


 pT7FLhTRT mit hTRT-cDNA, der die 5 min -nicht-codierende Sequenz fehlt 
 



  Wie bereits vorstehend beschrieben, stellt die Erfindung in einer Ausführungsform ein hTRT bereit, das zur Erleichterung der Clonierung in bakterielle, Säuger-, Hefe- und Insekten-Expressionsvektoren auf ortsgerichtete Weise modifiziert ist und keine 5 min -untranslatierte hTRT-Sequenz enthält. Unter manchen Umständen erlaubt die Minimierung der Menge an  nicht-Protein-codierender Sequenz die verbesserte Proteinherstellung (Ausbeute) und führt zu einer erhöhten mRNA-Stabilität. In dieser erfindungsgemässen Ausführungsform wurde vor der Clonierung in dem bakteriellen Expressionsvektor der 5 min -nicht-codierende Bereich von hTRT entfernt. 



  Dies wurde durch Erzeugung einer zusätzlichen Restriktionsschnittstelle unmittelbar stromaufwärts (5 min ) von dem Startcodon (ATG) der hTRT-codierenden Sequenz (Fig. 16) bewirkt. Die Erzeugung einer Restriktionsschnittstelle unmittelbar 5 min  zum codierenden Bereich des Proteins gestattet die effiziente Herstellung einer grossen Anzahl von Vektoren, die Fusionsproteine codieren, beispielsweise Fusionsproteine, die Markierungen und Peptid-"TAGs" enthalten zum Immunnachweis und zur Reinigung. 



  In diesem Fall wurde das Oligonucleotid 5 min -CCGGCCACCCCCCATATGCCGCGCGCTCCC-3 min , wie oben beschrieben, zur Modifikation der hTRT-cDNA-Nucleotide 779 bis 781 der hTRT-cDNA (Fig. 16) von GCG zu CAT verwendet. Diese 3 Nucleotide sind die letzten Nucleotide vor dem ATG-Startcodon, somit führt diese Änderung nicht zur Modifikation der Proteinsequenz. Die Sequenzänderung führt zur Erzeugung einer einzigen NdeI-Restriktionsstelle in der hTRT-cDNA. Einzelsträngige hTRT-DNA wurde als eine DNA-Quelle für die ortsgerichtete Mutagenese verwendet. Das erhaltene Plasmid wurde zur Bestätigung einer erfolgreichen Mutagenese sequenziert. 



  *Diese Modifikation erlaubte die Konstruktion des nachfolgend beschriebenen erfindungsgemässen Plasmids mit der Bezeichnung pT7FLhTRT. Die ortsspezifisch modifizierte hTRT-Sequenz (Hinzufügung der NdeI-Restriktionsstelle) wurde mit NdeI und NotI gespalten, wobei ein hTRT-Fragment erzeugt wurde. Dieses Fragment wurde danach in ein pSL3418-Plasmid cloniert, das vorher mit NdeI und SmaI (auch ein Restriktionsenzym bei dessen Spaltung glatte Enden entstehen) geschnitten worden  war, cloniert. pSL 3418 ist ein modifziertes paED4-Plasmid, in das eine FLAG-Sequenz (Immunex Corp. Seattle WA) und eine Enterokinase-Sequenz unmittelbar stromaufwärts von der vorstehend erwähnten NdeI-Stelle inseriert wurden.

   Dieses Plasmid mit der Bezeichnung pT7FLhTR erlaubt die Expression von hTRT mit vollständiger Länge (mit einem "Flag-Tag" an ihrem 5 min -Ende) in einem E. coli Stamm, der T7-RNA-Polymerase exprimiert. 


 Vektor, in dem eine hTRT-codierende Sequenz durch den MPSV-Promotor gesteuert wird 
 



  Die Erfindung stellt auch einen Säuger-Expressionsvektor bereit, in dem hTRT so orientiert ist, dass die hTRT-codierende Sequenz durch den MPSV-Promotor (nachstehend beschrieben) gesteuert wird. Ein EcoRI-Restriktionsfragment von pGRN137, das den hTRT-ORF enthält, wurde in die EcoRI-Stelle von pBBS212 (siehe nachstehend) cloniert, wodurch der 5 min -untranslatierte Bereich (5 min -UTR) von hTRT entfernt wurde (pGRN137 wurde durch Ausschneiden eines SalI-Sse8387 I-Fragments von pGRN130 (nachstehend beschrieben), das die Kozak-Mutation von hTRT.

   In den SalI-SSE 83871-Stellen von pGRN136 enthält, konstruiert, wodurch ein Säuger-Expressionsplasmid entsteht, das hTRT (eine "Kozak-Consensus"-Sequenz enthält) von dem MPSV-Promotor exprimiert) (pGRN136 wurde durch Ausschneiden eines HindIII-SalI-Fragments von pGRN126 konstruiert, das den hTRT-ORF enthält und Clonierung in die HindIII-SalI-Stellen von pBBS242. Dadurch entsteht ein Säugerexpressionsplasmid, das hTRT vom MPSV-Promotor exprimiert). Dadurch wurde ein Säuger-Expressionsplasmid mit der Bezeichnung pGRN145 erhalten, das hTRT mit einer "Kozak-Consensus"-Sequenz unter Verwendung des MPSV-Promotors exprimiert. Siehe auch den pGRN152-MPSV-Promotor gesteuerten Säuger-Expressionsvektor, der nachstehend beschrieben wird. 


 Plasmide mit hTRT-cDNA, der die 3 min -nicht-codierende Sequenz fehlt 
 



  Wie bereits vorstehend diskutiert, stellt die Erfindung TRTcodierende Nucleinsäuren enthaltende Expresionsvektoren bereit, in denen einige oder alle nicht-codierenden Sequenzen deletiert wurden. Unter manchen Umständen erlaubt die Minimierung der Menge an nicht-Protein-codierender Sequenz die verbesserte Proteinproduktion (Ausbeute) und sie erhöht die mRNA-Stabilität. In dieser erfindungsgemässen Ausführungsform wurde vor der Clonierung in das bakterielle Expressionsplasmid der 3 min -nicht-translatierte Bereich von hTRT deletiert. 



  Das Plasmid pGRN121, das hTRT-cDNA mit vollständiger Länge, wie vorstehend diskutiert, enthält, wurde zuerst hinsichtlich aller APAI-Stellen deletiert. Danach folgte die Deletion des MscI-HincII-hTRT-Restriktionsfragments, das den 3- min UTR enthält. Das NcoI-XbaI-Fragment, das das Stopcodon von hTRT enthält, wurde dann in die NcoI-XbaI-Stelle von pGRN121 inseriert, wobei ein Plasmid mit der Bezeichnung pGRN124 erhalten wurde, das äquivalent zu pGRN121 ist, ausser dass ihm der 3 min -UTR fehlt. 


 Bakterielle Expressionsvektoren mit Antibiotika-Selektionsmarkern 
 



  Die Erfindung stellt auch bakterielle Expressionsvektoren bereit, die Selektionsmarker zur Verleihung eines selektierbaren Phänotyps in transformierten Zellen enthält, und Sequenzen, die für die Beibehaltung des Vektors als Episom und Replikation codieren, so dass die Integration in das Wirtsgenom nicht erforderlich ist. Beispielsweise kann der Marker die Biotikaresistenz codieren, beispielsweise Resistenz gegen Chloramphenicol (siehe Harrod, Nucleic Acids Res. 25 (1997), 1720-1726), Kanamycin, G418, Bleomycin und Hygromycin, was die Selektion der Zellen erlaubt, die mit den gewünschten DNA-Sequenzen transformiert wurden; siehe bei spielsweise Blondelet-Rouault, Gene 190 (1997), 315-317 und Mahan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995), 669-673. 



  In einer erfindungsgemässen Ausführungsform wurde die hTRT mit vollständiger Länge (SEQ. ID. Nr. 1) in einen modifizierten "BlueScript"-Plasmidvektor (Stratagene, San Diego, CA) cloniert, der die Bezeichnung pBBS235 trägt, und in dem ein Resistenzgen für das Antibiotikum Chloramphenicol inseriert worden war. Das NotI-Fragment von pGRN124 (vorstehend diskutiert), das den hTRT-ORF enthält, wurde in die NotI-Stelle von pBBS235 cloniert, so dass der TRT-ORF in der umgekehrten Richtung bezogen auf den lac-Promotor des Vektors vorliegt. Dadurch entsteht ein Plasmid, das für die Mutagenese von Plasmidinsertionen geeignet ist, beispielsweise den erfindungsgemässen TRT-Nucleinsäuren. Dieses Plasmidkonstrukt mit der Bezeichnung pGPN125 wird in den erfindungsgemässen Verfahren verwendet, die Mutagenese von Telomerase-Enzym und TRT-Protein codierenden Sequenzen beinhalten.

   Es kann auch für die in vitro-Transkription von hTRT mittels des T7-Promotors und die in vitro-Transkription von "antisense"-hTRT mittels des T3-Promotors verwendet werden. 



  In einer weiteren erfindungsgemässen Ausführungsform wurden die hTRT-ORF enthaltenden NotI-Restriktionsfragmente von pGRN124 in die NotI-Stelle von pBBS235 (nachstehend beschrieben) subcloniert, so dass der TRT-ORF die gleiche Orientierung hat wie der lac-Promotor des Vektors. Dadurch entsteht ein Plasmid mit der Bezeichnung pGRN126, das zur Expression von hTRT mit vollständiger Länge in E. coli verwendet werden kann. Das exprimierte Produkt enthält 29 Aminosäuren, die von dem Vektor pBBS235 codiert werden, woran sich 18 Aminosäuren anschliessen, die von dem 5 min -UTR von hTRT codiert werden und danach folgt das hTRT-Protein mit vollständiger Länge. 



  In einer weiteren erfindungsgemässen Ausführungsform wurde zur Konvertierung des ATG-Initiationscodons von hTRT in einem "Kozak-Consensus"-Sequenz und zur Erzeugung von EcoRI- und BglII-Restriktionsschnittstellen zur Erleichterung der Clonierung in die bakteriellen Expressionsvektoren eine in vitro-Mutagenese von pGRN125 durchgeführt. 



  Bei dieser Mutagenese-Prozedur wurde das Oligonucleotid 
EMI322.1
 
 



  (SEQ. ID. Nr. 43) verwendet. Dieser neue Expressionsvektor erhielt die Bezeichnung pGRN127. 



  In einer weiteren erfindungsgemässen Ausführungsform wurde das zweite Asp des TRT-"DD-Motivs" (vorstehend beschrieben) zu einem Alanin umgewandelt, um ein nicht-funktionelles Telomerase-Enzym zu erzeugen und damit ein Mutanten-TRT-Protein zur Verwendung in Experimenten mit dominant/negativen Mutanten. hTRT (SEQ. ID. Nr. 1) wurde in vitro mutagenisiert mit dem Oligonucleotid 
EMI322.2
 
 



  (SEQ. ID. Nr. 44), um das Asparagin bei dem Rest 869 (Asp869) (von SEQ. ID. Nr. 2) zu einem Alanin (Ala)-Codon umzuwandeln. Dadurch wurde auch eine MluI-Restriktionsschnittstelle erzeugt. Dieses Expressionsplasmid erhielt die Bezeichnung pGRN130 und enthält auch die "Kozak-Consensus"-Sequenz wie für pGRN127 beschrieben. 



  Die Erfindung stellt auch einen Vektor bereit, der zur Expression eines "antisense"-Sequenzfragments von hTRT entworfen wurde. Das Plasmid pGRN126 wurde mit den Restriktionsenzymen MscI und SmaI vollständig gespalten und erneut ligiert, wobei über 95% des hTRT-ORF in Säugerzellen deletiert wurden. Ein SmaI-MscI-Fragment wurde während dieses Prozesses, um wieder CAT-Aktivität zu erzeugen, erneut inse riert. Dieses ungereinigte Plasmid wurde dann erneut mit SalI und EcoRI geschnitten und das Initiationscodon von hTRT enthaltende Fragment in die SalI-EcoRI-Schnittstellen von pBBS212 (vorstehend beschrieben) inseriert. Dadurch entstand ein "antisense"-Expressionsplasmid, das die "antisense"-Sequenz exprimiert, die den 5 min -UTR und 73 Basenpaarreste des hTRT-ORF umspannt. Dieses Plasmid erhielt die Bezeichnung pGRN135. 


 Expression von hTRT-Telomerase in Hefe 
 



  Im folgenden Beispiel wird im Detail die Konstruktion der erfindungsgemässen hTRT-exprimierenden Hefe-Expressionsvektoren zur Produktion grosser Mengen an biologisch aktiver hTRT (SEQ. ID. Nr. 2) mit vollständiger Länge dargestellt. Die Verwendung von biologisch aktiver hTRT in vielen erfindungsgemässen Ausführungen ist vorstehend beschrieben. 


 Pichia pastoris-Expressionsvektor pPICZ B und hTRT mit vollständiger Länge 
 



  Zur Produktion grosser Mengen an biologisch aktivem hTRT wurde der Pichia pastoris-Expressionsvektor PPICZ B (Invitrogen, San Diego, CA) ausgewählt. Die Insertion für die hTRT-codierende Sequenz stammte von den Nucleotiden 659 bis 4801 der hTRT-Insertion im Plasmid pGRN121 (SEQ. ID. Nr. 1). Diese Nucleotidsequenz enthält die hTRT codierende Sequenz in voller Länge (SEQ. ID. Nr. 2). Dieser Expressionsvektor wurde für die induzierbare Expression von hohen Mengen an unmodifiziertem hTRT-Protein (SEQ. ID. Nr. 2) mit vollständiger Länge in P. pastoris entworfen. Die Expression wird von einem Hefepromotor gesteuert, die exprimierte Sequenz verwendet jedoch die hTRT-Initiations- und Terminationscodons. Keine exogenen Codons wurden durch die Clonierung eingeführt.

   Der erhaltene Vektor PPICZ B/hTRT (Invitrogen, San Diego, CA) wurde zur Transformation der Hefe verwendet. 


 Pichia pastoris-Expressionsvektor hTRT-His6/pPICZ B 
 



  Ein zweiter erfindungsgemässer Pichia pastoris-Expressionsvektor, der von pPICZ B (Invitrogen, San Diego, CA) abgeleitet war, enthält auch die hTRT codierende Sequenz mit vollständiger Länge (SEQ. ID. Nr. 2), die von den Nucleotiden 659 bis 4801 der hTRT-Insertion im Plasmid pGRN121 (SEQ. ID. Nr. 1) stammt. Dieser Expressionsvektor hTRT-His6/pPICZ B codiert das hTRT-Protein (SEQ. ID. Nr. 2) mit vollständiger Länge und fusioniert mit dem Myc-Epitop- und His6-Reportersequenzen an seinem C-Terminus. Das hTRT-Stopcodon wurde entfernt und durch Vektorsequenzen ersetzt, die das Myc-Epitop und das His6-Reporter-"tag" sowie ein Stopcodon codieren. 

   Dieser Vektor wurde zur Steuerung der induzierbaren Expression des nachfolgenden Fusionsproteins mit hohen Spiegeln in Hefe entworfen, wobei dieses Fusionsprotein aus hTRT-Sequenz (unterstrichen), Vektorsequenzen (in Klammern L und NSAVD) dem Myc-Epitop (doppelt unterstrichen) und dem His6-"tag" (kursiv) (SEQ. ID. Nr. 45) besteht: 
EMI324.1
 
 


 Expression von hTRT in Insektenzellen 
 



  Im folgenden Beispiel ist ausführlich die Konstruktion von hTRT-Telomerase exprimierenden Expressionsvektoren für Insektenzellen zur Herstellung grosser Mengen an biologisch aktivem hTRT mit vollständiger Länge (SEQ. ID. Nr. 2 und SEQ. ID. Nr. 4) beschrieben. 


 Baculovirus-Expressionsvektor pVL1393 und hTRT mit vollständiger Länge 
 



  Die gewünschte Telomerase codierende Sequenz wurde in den Baculovirus-Expressionsvektor        pVL1393 (Invitrogen, San Diego, CA) cloniert. Dieses Konstrukt wurde danach in Spodoptera fungupeida (sf-9)-Zellen mit linearisierter DNA des Autograph California-nucleäre-Polyhedrosis-Virus (Baculogold-AcMNPV) cotransfiziert. Die erhaltenen rekombinanten Baculoviren wurden im Anschluss daran plaque-gereinigt und gemäss veröffentlichter Protokolle expandiert. 



  Dieser Expressionsvektor erlaubt die Expression von hohen Spiegeln an hTRT-Protein mit vollständiger Länge in Insektenzellen. Die Expression wird von einem Baculovirus-Polyhedrin-Genpromotor gesteuert. Keine exogenen Codons wurden durch die Clonierung eingeführt. 


 Baculovirus-Expressionsvektor pBlueBacHis2 B und hTRT mit vollständiger Länge 
 



  Zur Herstellung grosser Mengen an biologisch aktivem hTRT mit vollständiger Länge (SEQ. ID. Nr. 2) wurde der Baculovirus-Expressionsvektor pBlueBacHis2 B (Invitrogen, San Diego, CA) als eine Quelle für Kontrollelemente ausgewählt. Die hTRT-codierende Insertion bestand aus den Nucleotiden 707 bis 4776 von der hTRT-Insertion im Plasmid pGRN121 (SEQ. ID. Nr.  1), die die hTRT codierende Sequenz mit vollständiger Länge (SEQ. ID. Nr. 2) enthält. 



  Ein hTRT mit vollständiger Länge mit einem His6- und "anti-Xpress tags" (Invitrogen) wurde ebenfalls konstruiert. Dieser Vektor enthält eine Insertion, die aus den Nucleotiden 707 bis 4776 der hTRT-Insertion von Plasmid pGRN121 (SEQ. ID. Nr. 1) besteht. Dieser Vektor steuert die Expression von hohen Spiegeln an hTRT-Protein mit vollständiger Länge, das an ein spaltbares 6-Histidin und "anti-Xpress tags" fusioniert ist in Insektenzellen. Die Aminosäuresequenz des Fusionsproteins ist nachstehend gezeigt; (-*-) kennzeichnet eine Spaltstelle für Enterokinase: 
EMI326.1
 
 


 Baculovirus-Expressionsvektor pBlueBac4.5 und hTRT-Protein mit HE1> 



  Das NotI-Fragment von pGRN121, das die den hTRT-ORF (offenen Leserahmen) codierende Sequenz enthält, inseriert in die NotI-Stelle von pEBVHisA, so dass die codierende Sequenz mit dem RSV-Promotor funktionell verknüpft ist. Dieses Plasmid exprimiert ein Fusionsprotein, das aus einem mit dem N-Terminus des hTRT-Proteins fusionierten "His6-flag" zusammengesetzt ist. Der verwendbare Marker, der mit diesem Vektor verwendet wird, ist Ampicillin oder Hygromycin. 


 pGRN123 
 



  Das NotI-Fragment von pGRN121, das die den hTRT-ORF (offener Leserahmen) codierende Sequenz enthält, inseriert in die NotI-Stelle von pEBVHisA, so dass die codierende Sequenz im Vergleich zu dem RSV-Promotor in der entgegengesetzten Richtung orientiert ist, so dass "antisense"-hTRT exprimiert wird. 


 pGRN124 
 



  Alle APAI-Stellen in pGRN121 deletiert und danach erfolgte die Deletion des den 3 min -UTR ("untranslatierten Bereich") enthaltenden MscI-HincII-Fragments. Das das Stopcodon der hTRT codierenden Sequenz enthaltende Nco-XbaI-Fragment wurde danach in die Nco-XbaI-Stellen von pGRN121 inseriert, wodurch ein Plasmid entstand, das äquivalent zu pGRN121 ist, ausser dass ihm der 3 min -UTR fehlt. Dieses Plasmid kann vorzugsweise für gesteigerte Expressionsspiegel in einigen Zellen verwendet werden. 


 pGRN125 
 



  Das die hTRT codierende Sequenz enthaltende NotI-Fragment von pGRN124 inseriert in die NotI-Stelle von pBBS235, so dass der offene Leserahmen im Vergleich zu dem lac-Promotor in  der gegenläufigen Orientierung ist. Der nachweisbare Marker, der mit diesem Vektor verwendet wird, ist Chloramphenicol. 


 pGRN126 
 



  Das die hTRT codierende Sequenz enthaltende NotI-Fragment von pGRN124, inseriert in die NotI-Stelle von pBBS235, so dass die hTRT codierende Sequenz in der gleichen Orientierung wie der lac-Promotor inseriert ist. 


 pGRN127 
 



  Das Oligonucleotid 
EMI339.1
 
 



  wurde für die in vitro-Mutagenese von pGRN125 zur Umwandlung des Initiationscodons ATG der hTRT codierenden Sequenz in eine "Kozak-Consensus"-Sequenz verwendet und zur Erzeugung von EcoRI- und BglII-Stellen für die Clonierung. COD2866 wurde auch zur Umwandlung von AmpS zu AmpR (Ampicillin-Resistenz) verwendet und COD1941 wurde zur Umwandlung von CatR (Chloramphenicol-Resistenz, zu CatS (Chloramphenicol-Empfindlichkeit) umgewandelt. 


 pGRN128 
 



  Das Oligonucleotid 
EMI339.2
 
 



  wurde für die in vitro-Mutagenese verwendet, um so das Initiationscodon ATG von hTRT in einem "Kozak-Consensus"-Sequenz umzuwandeln und EcoRI und BglII-Stellen für die Clonierung zu erzeugen. Es wurde auch das Oligonucleotid 
EMI339.3
 
 



  zur Insertion des "IBI Flag" (International Biotechnolgies Inc. (IBI) Kodak, New Haven, CT) am C-Terminus verwendet und zur Erzeugung von EcoRI- und BglII-Stellen für die Clonierung. COD2866 wurde auch zur Umwandlung von AmpS zu AmpR verwendet und COD1941 zur Umwandlung von CatR zu CatS. 


 pGRN129 
 



  Das Oligonucleotid 
EMI340.1
 
 



  wurde zur in vitro-Mutagenese zur Umwandlung von Asp869 in ein Ala-Codon verwendet (d.h. das zweite Asp des DD-Motivs wurde für dominant/negative Experimente in ein Alanin umgewandelt). Dadurch wurde auch eine MluI-Stelle erzeugt. Auch das Oligonucleotid 
EMI340.2
 
 



  wurde zur Insertion des "IBI Flag" (IBI, New Haven, CT) am C-Terminus verwendet und zur Erzeugung von EcoRI- und BglII-Stellen für die Clonierung. Auch COD2866 wurde zur Umwandlung von AmpS zu AmpR verwendet und COD1941 zur Umwandlung von CatR zu CatS. 


 pGRN130 
 



  Das Oligonucleotid 
EMI340.3
 
 



  wurde bei einer in vitro-Mutagenese zur Umwandlung des Asp869-Codons in ein Ala-Codon verwendet (d.h. das zweite Asp des DD-Motivs wurde zur Erzeugung einer dominant/negativen Proteinvariante in ein Alanin umgewandelt). Dadurch wurde auch eine MluI-Stelle erzeugt. Auch das Oligonucleotid 
EMI340.4
 
 



  wurde bei einer in vitro-Mutagenese zur Umwandlung des Initiationscodons ATG der hTRT-codierenden Sequenz in eine "Kozak-Consensus"-Sequenz verwendet und zur Erzeugung von EcoRI und BglII-Stellen für die Clonierung. Auch COD2866 wurde zur Umwandlung von AmpS zu AmpR (Ampicillin-Resistenz) verwendet und COD1941 zur Umwandlung von CatR (Chloramphenicol-Resistenz) zu CatS (Chloramphenicol-Empfindlichkeit). 


 pGRN131 
 



  Das EcoRI-Fragment von pGRN128, das die hTRT-ORF mit einer "Kozak"-Sequenz und "IBI Flag" (IBI, New Haven, CT)-Mutationen enthält, inseriert in die EcoRI-Stelle von pBBS212, so dass der hTRT-ORF von dem MPSV-Promotor exprimiert wird. 


 pGRN132 
 



  Das EcoRI-Fragment von pGRN128, das den hTRT-ORF mit einer "Kozak"-Sequenz und "IBI Flag" (IBI, New Haven, CT)-Mutationen enthält, inseriert in die EcoRI-Stelle von pBBS212, so dass die "antisense"-Sequenz des hTRT-ORF vom MPSV-Promotor exprimiert wird. 


 pGRN133 
 



  Das EcoRI-Fragment von pGRN121, das die hTRT-codierende Sequenz enthält, inseriert in die EcoRI-Stelle von pBBS212, so dass das hTRT-Protein unter der Kontrolle des MPSV-Promotors exprimiert wird. 


 pGRN134 
 



  Das EcoRI-Fragment von pGRN121, das die hTRT-codierende Sequenz enthält, inseriert in die EcoRI-Stelle von pBBS212, so dass die "antisense"-Sequenz der hTRT codierenden Sequenz unter der Kontrolle des MPSV-Promotors exprimiert wird. Die  mit diesem Vektor verwendeten selektierbaren Marker sind Chlor/HygB/PAC. 


 pGRN135 
 



  pGRN126 wurde vollständig mit MscI und SmaI geschnitten und zur Deletion von mehr als 95% der inserierten hTRT codierenden Sequenz erneut ligiert. Ein SmaI-MscI-Fragment wurde während dieses Prozesses erneut inseriert, um so für die Selektion die Cat-Aktivität wieder zu erzeugen. Dieses ungereinigte Plasmid wurde dann erneut mit SalI und EcoRI geschnitten und das das Initiationscodon der hTRT codierenden Sequenz enthaltende Fragment in die SalI-EcoRI-Stellen von pBBS212 inseriert. Danach entstand ein "antisense"-Expressionsplasmid, das die "antisense"-Sequenz des 5 min -UTR und von 73 Basen der codierenden Sequenz exprimiert. Die mit diesem Vektor verwendbaren selektierbaren Marker sind Chlor/HygB/PAC. 


 pGRN136 
 



  Das HindIII-SalI-Fragment von pGRN126, das die hTRT codierende Sequenz enthält, inseriert in die HindIII-SalI-Stellen von pBBS242. 


 pGRN137 
 



  Das SalI-Sse8387I-Fragment von pGRN130, das die "Kozak"-Sequenz enthält, inseriert in die SalI-Sse8387I-Stellen von pGRN136. 


 pGRN138 
 



  Das EcoRI-Fragment von pGRN124, das hTRT ohne den 3 min -UTR enthält, inseriert in die EcoRI-Stelle von pEGFP-C2, so dass die Orientierung von hTRT dieselbe ist wie für die EGFP-Domäne. 


 pGRN139 
 



  Das Oligonucleotid 
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  wurde zur Insertion des "IBI Flag" (IBI, New Haven, CT) am C-Terminus von hTRT in pGRN125 mittels in-vitro-Mutagenese verwendet und zur Erzeugung von EcoRI- und BglII-Stellen für die Clonierung. Auch COD2866 wurde zur Umwandlung von AmpS zu AmpR (Ampicillin-Resistenz) verwendet und COD1941 zur Umwandlung von CatR (Chloramphenicol-Resistenz) zu Cats (Chloramphenicol-Empfindlichkeit). 


 pGRN140 
 



  Das NcoI-Fragment, das die stromaufwärts gelegene Sequenz von genomischer hTRT und das erste Intron von hTRT von lambdaG55 enthält, inseriert in die NcoI-Stelle von pBBS167. Das Fragment ist so orientiert, dass hTRT sich in derselben Richtung befindet wie der lac-Promotor. 


 pGRN141 
 



  Das NcoI-Fragment, das die stromaufwärts gelegenen Sequenzen der genomischen hTRT und das erste Intron von hTRT von lambdaG55 enthält, inseriert in die NcoI-Stelle von pBBS167. Dieses Fragment ist so orientiert, dass hTRT im Vergleich zu dem lac-Promotor in der gegenläufigen Richtung ist. 


 pGRN142 
 



  Das NotI-Fragment vom lambdaG45, das die vollständige genomische  &tilde& 15 kbp-Insertion, einschliesslich des hTRTGenpromotorbereichs enthält, wurde in die NotI-Stelle von Plasmid pBBS185 inseriert. Das Fragment ist so orientiert,  dass der hTRT-ORF sich in einer zu dem lac-Promotor gegensätzlichen Orientierung befindet. 


 pGRN143 
 



  Das NotI-Fragment vom lambdaG45, das die vollständige genomische  &tilde& 15 kbp-Insertion, einschliesslich des hTRTGenpromotorbereichs enthält, wurde in die NotI-Stelle von Plasmid pBBS185 inseriert. Das Fragment ist so orientiert, dass der hTRT-ORF sich in einer zu dem lac-Promotor selben Orientierung befindet. 


 pGRN144 
 



  SalI-Deletion von pGRN140 zur Entfernung von lambda-Sequenzen. 


 pGRN145 
 



  Dieser Vektor wurde zur Expression von hTRT-Sequenzen in Säugerzellen konstruiert. Das EcoRI-Fragment von pGRN137, das die hTRT-codierende Sequenz enthält, inseriert in die EcoRI-Stelle von pBBS212 zur Entfernung des Anteils der Sequenz, der dem 5 min -UTR von hTRT-mRNA entspricht. Die hTRT codierende Sequenz ist so orientiert, dass sie unter der Kontrolle des MPSV-Promotors exprimiert wird. Die mit diesem Vektor verwendeten selektierbaren Marker sind Chlor/HygB/PAC. 


 pGRN146 
 



  Dieser Vektor wurde für die Expression von hTRT-Sequenzen in Säugerzellen konstruiert. Das Sse8387I-NotI-Fragment von pGRN130, das die D869A-Mutation von hTRT enthält, inseriert in die Sse8387I-NotI-Stellen von pGRN137. Die mit diesem Vektor verwendeten selektierbaren Marker sind Ampicillin/HygB/PAC. 


 pGRN147 
 



  Das Sse8387I-NotI-Fragment von pGRN139, das das "IBI Flag" (IBI, New Haven, CT) enthält, inseriert in die Sse8387I-NotI-Stellen von pGRN137. 


 pGRN148 
 



  Das BglII-Eco47III-Fragment von pGRN144, das den Promotorbereich von hTRT enthält, inseriert in BglII-NruI-Stellen von pSEAP2, wobei ein hTRT-Promotor/Reporter-Konstrukt entstand. 


 pGRN149 
 



  Dieser Vektor ist ein Zwischenvektor für die Konstruktion eines Expressionsvektors für ein hTRT-Fusionsprotein. Das mutagene Oligonucleotid 



  3 min  wurde zur Anfügung einer Csp45I-Stelle an den C-Terminus von hTRT durch in vitro-Mutagenese von pGRN125 verwendet. Das "Stop"-Codon von hTRT wurde deletiert und gegen eine Csp451-Stelle ausgetauscht. 



  Der mit diesem Vektor verwendete selektierbare Marker ist Ampicillin. 


 pGRN150 
 



  Das GblII-FspI-Fragment von pGRN144, das den Promotorbereich von hTRT enthält, inseriert in die BglII-NruI-Stellen von pSEAP2, wodurch ein hTRT-Promotor/Reporter-Konstrukt entstand. 


 pGRN151 
 



  Dieser Vektor wurde zur Expression von hTRT-Sequenzen in Säugerzellen konstruiert. Das EcoRI-Fragment von pGRN147, das die hTRT codierende Sequenz enthält, inseriert in die EcoRI-Stelle von pBBS212, um so den Anteil der Sequenz zu entfernen, der dem 5 min -UTR der hTRT-mRNA entspricht. Die hTRT codierende Sequenz ist so orientiert, dass sie unter der Kontrolle des MPSV-Promotors exprimiert wird. Die mit diesem Vektor verwendeten Marker sind Chlor/HygB/PAC. 


 pGRN152 
 



  Das EcoRI-Fragment von pGRN146, das die hTRT codierende Sequenz enthält, inseriert in die EcoRI-Stelle von pBBS212 zur Entfernung des Anteils der Sequenz, der dem 5 min -UTR von hTRT entspricht. Die hTRT codierende Sequenz ist so orientiert, dass sie unter der Kontrolle des MPSV-Promotors exprimiert wird. 


 pGRN153 
 



  Das StyI-Fragment von pGRN130, das die D869->A-Mutation von hTRT enthält (eine hTRT-Variante codierende Sequenz) wurde in die StyI-Stellen von pGRN158 inseriert, wodurch ein Plasmid erhalten wurde, das die hTRT codierende Sequenz mit einer "Kozak-Consensus"-Sequenz an seinem 5 min -Ende, eine "IBI FLAG"-Sequenz an seinem 3 min -Ende der den C-Terminus codierende Bereich und die D869->A-Mutation enthält. 


 pGRN154 
 



  Das das hTRT-Gen enthaltende EcoRI-Fragment von pGRN153, wurde in die EcoRI-Stelle von Plasmid pBS212 so inseriert, dass der hTRT-ORF sich in derselben Orientierung befindet wie der MPSV-Promotor. Dadurch ensteht ein MPSV-gesteuertes Expressionsplasmid, das das hTRT-Protein mit einer "Kozak-Con sensus"-Sequenz an seinem aminoterminalen Ende eine "IBI FLAG" an seinem C-Terminus und die D869->A-Mutation exprimiert. 


 pGRN155 
 



  Dieser Vektor wurde zur Expression von hTRT-Sequenzen in Säugerzellen konstruiert. Die Insertion enthielt cDNA von hTRT in vollständiger Länge ohne 5 min - und 3 min -UTR und "Kozak"-Sequenzen. Das EcoRI-Fragment von pGRN145, das die hTRT-cDNA mit der "Kozak-Consensus"-Sequenz jedoch keine 3 min - oder 5 min -UTR enthält, wurde in die EcoRI-Stelle von p91023(B) inseriert, so dass das hTRT in derselben Orientierung ist wie der DHFR-ORF. Dadurch entsteht ein Expressionsvektor für die transiente Expression von hTRT. Der mit diesem Vektor verwendete selektierbare Marker ist Tetracyclin. 


 pGRN156 
 



  Dieser Vektor wurde zur Expression von hTRT-Sequenzen in Säugerzellen konstruiert. Das EcoRI-Fragment von pGRN146, das die D869A-Mutation der hTRT-cDNA mit der "Kozak-Consensus"-Sequenz ohne 3 min - oder 5 min -UTR enthält, inseriert in die EcoRI-Stelle von p91023(B), so dass hTRT in der gleichen Orientierung ist wie der DHFR-ORF. Dadurch entsteht ein Expressionsvektor für die transiente Expression von hTRT. Die Insertion enthielt cDNA von hTRT mit vollständiger Länge ohne 5 min - und 3 min -UTR, D869A und "Kozak"-Sequenzen. Der mit diesem Vektor verwendete selektierbare Marker ist Tetracyclin. 


 pGRN157 
 



  Dieser Vektor wurde für die Expression von hTRT-Sequenzen in Säugerzellen konstruiert. Das EcoRI-Fragment von pGRN147, das die hTRT-cDNA mit dem "Kodak flag" am C-Terminus enthält, und die "Kozak-Consensus"-Sequenz ohne 3 min - oder 5 min -UTR, inseriert in die EcoRI-Stelle von p91023(B), so dass  hTRT in der gleichen Orientierung ist wie der DHFR-ORF. Dadurch entsteht ein Expressionsvektor für die transiente Expression von hTRT. Die Insertion enthielt cDNA von hTRT mit vollständiger Länge ohne 5 min - und 3 min -UTR eine "FLAG"-Sequenz (Immunex Corp., Seattle, WA) und "Kozak"-Sequenzen. Der mit diesem Vektor verwendete selektierbare Marker ist Tetracyclin. 


 pGRN158 
 



  Dieser Vektor wurde für die Expression und Mutagenese von TRT-Sequenzen in E. coli konstruiert. Das EcoRI-Fragment von pGRN151, das den hTRT-ORF enthält, inseriert in die EcoRI-Stelle von pBBS183, so dass der hTRT-ORF im Vergleich zu dem lac-Promotor in der gegenläufigen Orientierung vorliegt. Die Insertion enthielt cDNA von hTRT mit vollständiger Länge ohne 5 min - und 3 min -UTR, eine "FLAG"-Sequenz (Immunex Corp., Seattle, WA) und "Kozak"-Sequenzen. Die codierende Sequenz wird von einem T7-Promotor gesteuert. Der mit diesem Vektor verwendete selektierbare Marker ist Ampicillin. 


 pGRN159 
 



  Dieser Vektor wurde zur Expression und Mutagenese von TRT-Sequenzen in E. coli konstruiert. Das HeI-KpnI-Fragment von pGRN138, das die Fusion von EGFP an hTRT enthält, inseriert in die XbaI-KpnI-Stellen von pBlueScriptIIKS+. Dies ergibt einen T7-Expressionsvektor für das Fusionsprotein (die codierende Sequenz wird von einem T7-Promotor gesteuert). Diese Insertion enthält hTRT-cDNA mit vollständiger Länge ohne den 3 min -UTR als ein Fusionsprotein mit EGFP. Der mit diesem Vektor verwendete selektive Marker ist Ampicillin. 


 pGRN160 
 



  Dieser Vektor wurde zur Expression von "antisense"-hTR-Sequenzen in Säugerzellen konstruiert. Die codierende Sequenz wird von einem MPSV-Promotor gesteuert. Das XhoI-NsiI-Fragment von pGRN90, das hTR mit vollständiger Länge enthält inseriert in die SalI-SSE/8387I-Stellen von pBBS295. Dies ergibt einen transienten stabilen Vektor, der hTR in der "antisense"-Orientierung exprimiert. Ein GPT-Marker wurde in den Vektor eingebaut. Die mit diesem Vektor verwendeten selektierbaren Marker sind Chlor/gpt/PAC. 


 pGRN161 
 



  Dieser Vektor wurde zur Expression von "sense"-HT-Sequenzen in Säugerzellen konstruiert. Ein XhoI-NsiI-Fragment von pGRN89, das hTR mit vollständiger Länge enthält, inseriert in die SalI-SSE8387I-Stellen von pBBS295. Dies ergibt einen transienten/stabilen Vektor, der hTR in der "sense"-Orientierung exprimiert. Die codierende Sequenz wird von einem MPSV-Promotor gesteuert. Ein GPT-Marker wurde in den Vektor eingebaut. Die mit diesem Vektor verwendeten Marker sind Chlor/gpt/PAC. 


 pGRN162 
 



  Ein XhoI-NsiI-Fragment von pGRN87, das hTR mit vollständiger Länge enthält, inseriert in die SalI-SSE8387I-Stellen von pBBS295. Dies ergibt einen transienten/stabilen Vektor, der verkürzte hTR (von Position +108 bis +435) in der "sense"-Orientierung exprimiert. 


 pGRN163 
 



  Dieser Vektor wurde zur Expression und Mutagenese von TRT-Sequenzen in E. coli konstruiert. Die codierende Sequenz wird von einem T7-Promotor gesteuert. RA45 
EMI349.1
 
 



  wird in einer in vitro-Mutagenese zur Überführung des Initiations-Met in hTRT zu Leu verwendet und zur Einführung einer XhoI-Stelle in den beiden nächsten Codons nach dem Leu. Auch COD 1941 wurde zur Überführung von CatR nach CatS und Einführung einer BSPHI-Stelle verwendet und COD 2866 zur Überführung vom AmpS zu AmpR, wobei eine FspI-Stelle eingeführt wurde. Der mit diesem Vektor verwendete selektierbare Marker ist Ampicillin. 


 pGRN164 
 



  Dieser Vektor wurde für die Expression von hTR-Sequenzen in E. coli konstruiert. Die Primer hTR+1 
EMI350.1
 
 



  wurden zur Amplifikation eines Fragments von pGRN33 mittels PCR verwendet, das hTR mit vollständiger Länge und dem T7-Promotor an seinem 5 min -Ende (wie in hTR+l) enthält. Eine BamHI-HindIII-Spaltung des PCR-Produkts wurde in die BamHI-HindIII-Stellen von pUC119 inseriert. Die codierende Sequenz wird von einem T7-Promotor gesteuert. Der mit diesem Vektor verwendete selektierbare Marker ist Ampicillin. 


 pGRN165 
 



  Dieser Vektor wurde für die Expression und Mutagenese von hTRT-Sequenzen in E. coli verwendet. Die codierende Sequenz wird von einem T7-Promotor gesteuert. Ein EcoRI-Fragment von pGRN145, das den hTRT-orf mit einer "Kozak"-Sequenz am vorderen Ende enthält, inseriert in die EcoRI-Stelle von pBluescriptIISK+, so dass hTRT in derselben Orientierung vorliegt wie der T7-Promotor. Der mit diesem Vektor verwendete selektierbare Marker ist Ampicillin. 


 pGRN166 
 



  Dieser Vektor wurde zur Expression und Mutagenese von TRTSequenzen in Säugerzellen konstruiert. Die codierende Sequenz wird von einem T7-Promotor gesteuert. Das EcoRI-Fragment von pGRN151, das den hTRT-ORF mit einer "Kozak"-Sequenz am vorderen Ende enthält und ein "IBI flag" am hinteren Ende, inseriert in die EcoRI-Stelle von pBluescriptIISK<+> so dass hTRT in der gleichen Orientierung vorliegt wie der T7-Promotor. Die Insertion enthielt hTRT-cDNA mit vollständiger Länge ohne 5 min - und  3 min -UTR, eine "FLAG"-Sequenz (Immunex Corp. Seattle, WA) und "Kozak"-Sequenzen. Der mit diesem Vektor verwendete selektierbare Marker ist Ampicillin. 


 pGRN167 
 



  Ein AvrII-StuI-Fragment von pGRN144, das das 5 min -Ende des hTRT-ORF enthält, inseriert in die XbaI-StuI-Stellen von pBES161. 


 pGRN168 
 



  Das die optimierte hTRT-Expressionskassette enthaltende EcoRI-Fragment von pGRN145 wurde in die EcoRI-Stelle von pIND so inseriert, dass die hTRT codierende Sequenz in derselben Orientierung ist wie der miniCMV-Promotor. 


 pGRN169 
 



  Das die optimierte hTRT-Expressionskassette enthaltende EcoRI-Fragment von pGRN145 wurde so in die EcoRI-Stelle von pIND inseriert, dass das hTRT in der umgekehrten Orientierung ist, bezogen auf den miniCMV-Promotor. 


 pGRN170 
 



  Das die optimierte hTRT-Expressionskassette enthaltende EcoRI-Fragment von pGRN145 wurde so in die EcoRI-Stelle von pIND(sp1) inseriert, dass das hTRT in der gegenläufigen Orientierung vorliegt, bezogen auf den miniCMV-Promotor. 


 pGRN171 
 



  Das Eco47II-NarI-Fragment von pGRN163 inseriert in die Eco47111-NarI-Stellen von pGRN167. Damit wird die M1L-Mutation in ein Fragment der genomischen hTRT-DNA eingeführt. 


 pGRN172 
 



  Das BamHI-StuI-Fragment von pGRN171, das in hTRT die Mutation Met zu Leu enthält, inseriert in die BglII-NruI-Stellen von pSEAP2-"Basic". 


 pGRN173 
 



  Das EcoRV-Eco47III-Fragment von pGRN144, das das 5 min -Ende des hTRT-Promotorbereichs enthält, wurde in die SrfI-Eco47III-Stellen von pGRN172 inseriert. Dadurch entstand ein Promotor/Reporter-Plasmid, das den Promotorbereich von hTRT von etwa 2,3 kb stromaufwärts des Starts des hTRT-ORF bis unmittelbar nach dem ersten Intron im codierenden Bereich mit der Met1->Leu-Mutation enthält. 


 pGTN174 
 



  Das die "optimierte" hTRT-Expressionskassette enthaltende EcoRI-Fragment von pGRN145 wurde in die EcoRI-Stelle von pIND(sp1) so inseriert, dass das hTRT dieselbe Orientierung hat wie der miniCMV-Promotor. 


 Beispiel 7 
 


 Rekonstitution von Telomerase-Aktivität 
 


 a) Co-Expression von hTRT und hTR in vitro 
 



  In diesem Beispiel wird die Co-Expression von hTRT und hTR mittels eines zellfreien in vitro-Expressionssystems beschrieben. Die Ergebnisse zeigen, dass das von pGRN121 codierte hTRT-Polypeptid ein katalytisch aktives Telomerase-Protein codiert, und dass die in vitro-Rekonstitution (IVR) des Telomerase-RNPs unter Verwendung rekombinant exprimierter hTRT und hTR erzielt werden kann. 



  Telomerase-Aktivität wurde durch Zugabe linearisierter Plasmide mit hTRT (pGRN121; 1  mu g DNA, gespalten mit XbaI) und hTR (pHTR+1; 1  mu g, gespalten mit FspI) zu einem gekoppelten Transpriptions/Translations-Reticulocyten-Lysat (Promega TNT< TM >) rekonstituiert. pHTR+1 ist ein Plasmid, das nach Linearisierung mit FspI und anschliessender Transkription durch T7-RNA-Polymerase ein Transkript mit 445 Nucleotiden erzeugt, das mit dem Nucleotid +1 beginnt und sich bis zu dem Nucleotid 446 von hTR erstreckt (Autexier et al., EMBO J. 15 (1996), 5928). Für eine 50  mu l-Reaktion wurden die folgenden Bestandteile zugegeben: 2  mu gl TNT< TM >-Puffer, 1  mu l TNT< TM >-T7-RNA-Polymerase, 1  mu l 1 mM Aminosäuregemisch, 40 Einheiten Rnasin< TM > RNase-Inhibitor, jeweils 1  mu g linearisierte Matrizen-DNA und 25  mu l TNT< TM >-Reticulocytenlysat.

   Die Bestandteile wurden in dem vom Hersteller empfohlenen Verhältnis zugefügt und 90 Minuten bei 30 DEG C inkubiert. Die Transkription wurde durch den T7-Promotor gesteuert und sie konnte auch vor der Zugabe von Reticulocytenlysat mit ähnlichen Ergebnissen durchgeführt werden. Nach der Inkubation wurden 5 und 10  mu l der programmierten Transkriptions/Translations-Reaktion hinsichtlich Telomerase-Aktivität mittels des vorstehend beschriebenen TRAP-Assays (Autexier et al., a.a.O.) unter Ver wendung von 20 PCR-Cyclen zur Signalamplifikation untersucht. 



  Die Ergebnisse der Rekonstitution sind in Fig. 10 gezeigt. Für jede Transkriptions-Translations-Reaktion gibt es drei Spuren. Die ersten zwei Spuren sind Duplikat-Assays und die dritte Spur ist eine zum Ausschluss PCR-erzeugter Artefacte vor der TRAP-Phase hitzedenaturierte (95 DEG C, 5 Minuten) Duplikatprobe. 



  Wie in Fig. 10 gezeigt, hat das Reticulocytenlysat keine nachweisbare Telomerase-Aktivität (Spur 6). In ähnlicher Weise wird keine nachweisbare Aktivität beobachtet, wenn entweder hTR allein (Spur 1) oder das hTRT-Gen mit vollständiger Länge (Spur 4) zu dem Lysat gegeben werden. Wenn beide Komponenten zugegeben werden (Spur 2), wird Telomerase-Aktivität erzeugt, wie dies anhand des charakteristischen Musters von Wiederholungsleitern gezeigt wird. Wenn der carboxyterminale Bereich des hTRT-Gens durch Spaltung des Vektors mit NcoI entfernt wird ("verkürztes hTRT") wird Telomerase-Aktivität aufgehoben (Spur 3). Spur 5 zeigt, dass die Translation der verkürzten hTRT allein keine Telomerase-Aktivität erzeugt.

   Spur "R8" zeigt eine positive Kontrolle für eine Telomerase-Produktleiter, die durch "TRAP" von TSR8 (einem synthetischen Telomerase-Produkt mit einer Nucleotidsequenz des Standards für Quantifizierung) erzeugt wird 
EMI354.1
 
 


 B) Mischen von hTRT und hTR in vitro 
 



  Die in vitro-Rekonstitution von Telomerase-Aktivität wurde auch durch Vermischen erzielt. hTRT wurde, wie vorstehend beschrieben, transkribiert und translatiert, jedoch ohne die Zugabe des hTR-Plasmids. Die Rekonstitution des TelomeraseRNP wurde dann durch Vermischen des hTRT-Translationsgemisches mit hTR (vorher durch die Transkription mit T7-RNA-Polymerase von phTR+1-Fsp erzeugt) im Verhältnis von 2 Al hTRT-Translationsgemisch zu 2  mu l hTR (1  mu g) und anschliessen der 90minütiger Inkubation bei 30 DEG C erzielt. Dieses Verfahren der hTRT-hTR-Rekonstitution wird als "verbundene Rekonstitution" oder "verbundene IVR" bezeichnet. In diesem Gemisch ist Telomerase-Aktivität vorhanden (d.h. kann nachgewiesen werden). Ein verbessertes Signal wurde nach partieller Reinigung der Aktivität durch DEAE-Chromatographie beobachtet.

   In diesem Fall wurde eine "Millipore Ultrafree- MC DEAE Zentralfilter"-Vorrichtungen gemäss Standardverfahren (d.h. gemäss den Anweisungen des Herstellers) verwendet. Die verwendeten Puffer waren: hypo0.1, hypo0.2 und hypo1.0, wobei hypo 20 mM Hepes-KOH, pH-Wert 7,9, 2 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 10% Glycerin, 0,1% NP-40, 1 mM DTT, 1 mM Natriummetabisulfit, 1 mM Benzamidin und 0,2 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) ist und wobei sich 0.1, 0.2 und 1.0 auf 0,1, 0,2 oder 1,0 M KCl beziehen. Die Filter wurden mit hpyo1.0 vorkonditioniert, mit hypo0.1 gewaschen, danach wurde die rekonstituierte Telomerase aufgeladen, die Säule mit hypoo.1 und im Anschluss daran hypo0.2 gewaschen und die rekonstituierte Telomerase wurde mit hypo 1.0 mit dem halben Volumen im Vergleich zu dem Aufladvolumen eluiert.

   Diese Zubereitung konnte bei -70 DEG C in gefrorenem Zustand aufbewahrt werden und sie behält Aktivität. 



  Telomerase-Aktivität wurde in einem zweistufigen Verfahren untersucht. Im ersten Schritt wurde ein üblicher TelomeraseAssay wie von Morin, Cell 59 (1989), 521 beschrieben durchgeführt, ausser dass keine radioaktive Markierung verwendet wurde. Bei dem zweiten Schritt wurde ein Aliquot mittels des "TRAP"-Verfahrens für 20 bis 30 Cyclen (wie vorstehend beschrieben) untersucht. Der übliche Telomerase-Assay wurde so durchgeführt, dass 1 bis 10  mu l rekonstituierte Telomerase untersucht wurden in 25 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,3, 50 mM Kaliumacetat, 1 mM EGTA, 1 mM MgCl2, 2 mM DATP, 2 mM TTP, 10  mu M dGTP und 1  mu M Primer (üblicherweise M2, AATCCGTCGAGCAGAGTT) in einem Endvolumen von 40 bis 50  mu l bei 30 DEG C und für 60 bis 180 Minuten. 

   Die Reaktion wurde durch 5minütiges Erhitzen auf 95 DEG C gestoppt und mit 1-10  mu l des  Gemisches des ersten Schritts wurde der zweite Schritt, die "TRAP"-Reaktion (50  mu l) durchgeführt. 



  In zusätzlichen Experimenten wurde die Synthese von hTRT und hTR während einer in vitro-Rekonstitution anhand des Einbaus von 35S-Methionin bzw. Northern blotting überwacht. Proteine mit etwa der vorhergesagten Grösse wurden für hTRT (127 kD), hTRT-Nco (85 kD) und pro90hTRT (90 kD) in etwa äquimolaren Mengen (relativ zueinander) synthetisiert. Die Northern-Analyse zeigte, dass die hTR-Synthese die korrekte Grösse (445 Nucleotide) aufwies und vorherrschend intakt war. 



  Für den Fachmann sind Variationen des oben beschriebenen Rekonstitutionsprotokolls offensichtlich. Beispielsweise können folgende Parameter variiert werden: Rekonstitutionszeit und Temperatur, das Vorhandensein oder die Konzentration von Bestandteilen wie monovalente Salze (z.B. NaCl, KCl, Kaliumacetat, Kaliumglutamat etc.), divalente Salze (MgCl2, MnCl2, MgSO4, etc.), Denaturierungsmittel (Harnstoff, Formamid etc.), Detergenzien (NP-40, Tween, CHAPS, etc.). Es können auch alternative verbesserte Reinigungsverfahren (z.B. Immunpräzipitation, Affinitätschromatographie oder Standardchromatographie) angewandt werden. Diese und andere Parameter können auf systematische Weise variiert werden, um so die Bedingungen für bestimmte Assays oder andere Rekonstitutionsprotokolle zu optimieren. 


 C) Die Rekonstitution mittels hTRT-Varianten und Fusionsproteinen 
 



  Rekonstitution von katalytischer Telomerase-Aktivität trat auf, wenn EGFP-hTRT eine Fusion des "enhanced green fluorescent-Protein an hTRT (siehe Beispiel 15) oder "Epitop-tagged" hTRT (IBI FLAG, siehe Beispiels 6) mit hTR coexprimiert wurden, wobei beide Telomerase-Aktivität auf ungefähr Wildtyp-Spiegel rekonstituierten. 



  Im Gegensatz dazu wurde Telomerase-Aktivität nicht rekonstituiert, wenn die hTRT-Variante pro90hTRT (der die RT-Motive B min , C, D und E fehlen) verwendet wurde. Dies zeigt, dass pro90hTRT keine katalytische Telomerase-Aktivität besitzt, wobei diese andere Aktivitäten besitzen könnte (z.B. die Fähigkeit zur RNA (d.h. hTR)-Bindung und sie könnte auch als dominant-negativer Regulator von Telomerase in vivo, wie vorstehend beschrieben, wirken. 


 D) Die Untersuchung von in vitro-rekonstituierter Telomerase-Aktivität mittels des Gel-Blots und des üblichen Telomerase-Assays 
 



  Das folgende Beispiel zeigt, dass in vitro-rekonstituierte Telomerase (IVR) zusätzlich zu auf Amplifikation basierenden Assays, (d.h. TRAP) mittels üblicher Telomerase-Assays untersucht werden kann. Telomerase wurde in vitro rekonstituiert (IVR) wie in Teil (B) vostehend beschrieben (das "verbundene Rekonstitutions"-Verfahren) wonach sich eine DEAE-Reinigung, wie vorstehend beschrieben, anschloss. Die IVR-Telomerase wurde mittels des Gel-Blot-Assays unter den folgenden Reaktionsbedingungen untersucht: 1 bis 10  mu l IVR-Telomerase in 25 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,3, 50 mM Kaliumacetat, 1 mM EGTA, 1 mM MgCl2, 0,8 mM dATP, 0,8 mM TTP, 1,0 mM dGTP und 1  mu M Primer (M2, AATCCGTCGAGCAGAGTT; oder H3.03, TTAGGGTTAGGGTTAGGG) für 180 Minuten bei 30 DEG C und einem Endvolumen von 40  mu l.

   Die synthetisierte Telomer-DNA wurde anhand von Standard-Verfahren isoliert, auf einem Gel mit 8%igem Polyacrylamid und 8 M Harnstoff aufgetrennt, auf eine Nylon-Membran transferiert und unter Verwendung der in dem Dot-Blot-Assay verwendeten <3><2>P-(CCCTAA)n-Ribonucleotidsonde abgesucht. Mittels dieser Sonde konnte eine Leiter von sechs Nucleotiden in der Spur identifiziert werden, die 10  mu l IVR-Telomerase repräsentiert, was äquivalent war zu der Leiter, die für 5  mu l nativer nucleärer, mit "mono Q" und Heparinchromatographie gereinigter Telomerase beobachtet wurde. Die Ergebnisse zeigen, dass IVR-Telomerase äquivalent zu nativer  Telomerase eine prozessive katalytische Telomerase-Aktivität aufweist. 



  Die IVR-Telomerase ("verbundene Rekonstitution") wurde auch anhand des üblichen, auf dem Einbau von <3><2>P-dGTP basierenden Telomerase-Assays untersucht. Die so rekonstituierte Telomerase, die danach über DEAE-Reinigung, wie vorstehend beschrieben, gereinigt wurde, wurde sowohl unter prozessiven als auch nicht-prozessiven Reaktionsbedingungen untersucht. Die Assay-Bedingungen waren: 5-10  mu l rekonstituierte Telomerase ("verbundene Rekonstitution") in 25 mM Tris-HCl, pHWert 8,3,     50 mM Kaliumacetat, 1 mM EGTA, 1 mM MgCl2, 2 mM dATP, 2 mM TTP mit 10  mu M <3><2>P-dGTP (72 Ci/mMol) (für den Assay hinsichtlich prozessiver Bedingungen) oder 1  mu M <3><2>P-dGTP (720 Ci/mMol) (für nicht-prozessive Bedingungen) und 1  mu M Primer (d.h.

   H3.03 TTAGGGTTAGGGTTAGGG) bei 30 DEG C (für die prozessive Reaktion) oder 37 DEG C für die nicht-prozessive Reaktion für 180 Minuten in einem Endvolumen von 40  mu l. Die synthetisierte Telomer-DNA wurde mittels Standardverfahren isoliert und auf einem Sequenzierungsgel mit 8%igem Polyacrylamid und 8 M Harnstoff aufgetrennt.

   Die prozessive Reaktion zeigte eine schwächere Leiter von sechs Nucleotiden, was mit einer prozessiven Telomerase-Reaktion übereinstimmt und bei der nicht-prozessiven Reaktion wurde eine Wiederholungseinheit hinzugefügt, ein Muster, das äquivalent zu der Kontrollreaktion mit einer Präparation nativer Telomerase ist. Übliche Assays unter Verwendung von Telomerase "verbundene Rekonstitution" sind bei der Suche nach Telomerase-Modulatoren, wie hier beschrieben, nützlich, sowie auch bei anderen Anwendungen, wie beispielsweise der Aufklärung von strukturellen und funktionellen Eigenschaften von Telomerase. 


 E) In vitro rekonstituierte Telomerase erkennt 3 min -Enden von Primern 
 



  Dieses Experiment zeigt, dass durch "verbundene Rekonstitution" hergestellte Telomerase 3 min -Enden von Primern erkennt, äquivalent zu nativer (gereinigter) Telomerase. Telomerase bildet eine Basen-gepaarte Duplex zwischen dem 3 min -Ende eines Primers und dem Matrizenbereich von hTR und fügt das nächste vorgesehene Nucleotid an (Morin, 1989, a.a.O.). Um zu verifizieren, dass (rekombinante) IVR-Telomerase ("verbundene Rekonstitution") die gleiche Eigenschaft aufweist, wurden die Reaktionen von Primern mit ---GGG oder ---TAG-3 min -Enden (AATCCGTCGAGCAGAGGG bzw. 
 AATCCGTCGAGCAGATAG) mit einem Primer verglichen mit einem ---GTT 3 min -Terminus (M2; 
 AATCCGTCGAGCAGAGTT; der Standard-"TRAP"-Primer), wobei in vitro rekonstituierte und native Telomerase verwendet wurden, die durch den Zwei-Stufen Assay (üblich/TRAP), der vorstehend ausführlich beschrieben wurde, untersucht wurden.

   Die Produktleitern der Primer ---GGG und ---TAG verschoben sich um +4 bzw. +2 im Vergleich zu dem Standardprimer (--GTT 3 min -Ende); derselbe Effekt wurde mit nativer Telomerase beobachtet. Dieses Experiment zeigt, dass in vitro-rekonstituierte ("verbundene Rekonstitution") und native Telomerase Primerenden auf die gleiche Weise erkennen. 



  Diese Ergebnisse (zusammen mit den vorstehenden Ergebnissen, die zeigen, dass IVR-Telomerase sowohl prozessive als auch nicht-prozessive katalytische Aktivität besitzt) zeigen an, dass IVR-Telomerase eine ähnliche Struktur und ähnliche Eigenschaften im Vergleich zu nativer oder gereinigter Telomerase besitzt. 


 Beispiel 8 
 


 Herstellung von Anti-hTRT-Antikörpern 
 


 A) Die Herstellung von anti-hTRT-Antikörpern gegen hTRT-Peptide 
 



  Zur Herstellung von anti-hTRT-Antikörpern wurden die folgenden Peptide von hTRT mit der Hinzufügung von C (Cystein) als der Amino-terminale Rest (siehe Fig. 54) synthetisiert: 
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  Die Cystein-Einheit wurde zur Immobilisierung (d.h. kovalente Verknüpfung) der Peptide an BSA- und KLH- ("Keyhole limpet" Hämocyanin)-Trägerproteine verwendet. Die KLH-Peptide wurden als Antigen verwendet. Die BSA-Peptidkonjugate dienten als Material für ELISAs zum Testen der Spezifität von Immunantiseren. 



  Die KLH-Peptidkonjugate wurden in "New Zealand White"-Kaninchen injiziert. Die einleitenden Injektionen wurden proximal zu den Lymphknoten der Achselhöhle und der Leisten verabreicht. Nachfolgende Injektionen wurden intramuskulär gegeben. Für einleitende Injektionen war das Antigen mit vollständigem Freund'schen Adjuvans emulgiert, für nachfolgende Injektionen wurde unvollständiges Freund'sches Adjuvans verwendet. Bei den Kaninchen folgte ein Auffrischungs-Impfcyclus von 3 Wochen, wobei 50 ml Blut, die 20 bis 25 ml Serum lieferten, 10 Tage nach jeder Auffrischungsimpfung entnommen wurden. Antiseren gegen jedes der vier Peptide erkannten die hTRT-Einheit von rekombinantem hTRT-Fusionsprotein (GST-HIS8-hTRT-Fragment 2426 bis 3274) auf WesternBlots (siehe Beispiel 6). 



  Unter Verwendung einer partiell gereinigten Telomerase-Fraktion von menschlichen 293-Zellen (eine etwa 1000fache Reinigung im Vergleich zum nucleären Rohextrakt), die gemäss der Beschreibung in der parallelen US-Patentanmeldung mit der Serien-Nr. 08/833,37 (siehe auch PCT-Anmeldung Nr. 97/06012) hergestellt und mit anti-S-2-Antikörpern affinitätsgereinigt worden war, konnte auf einem Western-Blot eine 130 kD-Proteindublette nachgewiesen werden. Es wurde ein empfindliches Chemilumineszenz-Nachweisverfahren angewandt ("SuperSignal"-Chemilumineszenzsubstrate, Pierce), das Signal auf dem Blot war jedoch schwach, was darauf hindeutet, dass hTRT in diesen unsterblichen Zellen in geringer oder sehr geringer Häufigkeit vorhanden ist. Das Auftreten einer Dublette ist konsistent mit einer posttranslationalen Modifizierung von hTRT, d.h. Phosphorylierung oder Glykosylierung. 



  Zur Affinitätsreinigung wurde das S-2-Peptid an "SulfoLink" (Pierce, Rockford, IL) über seinen N-terminalen Cysteinrest gemäss dem Protokoll des Herstellers immobilisiert. Erstes Blutserum von einem mit dem KLH-S-2-Peptid an die genimmunisierten Kaninchen wurde über eine S-2-"SulfoLink" geladen und spezifisch an das S-2-Peptid gebundene Antikörper wurden eluiert. 


 B) Herstellung von anti-hTRT-Antikörpern gegen hTRT-Fusionsproteine 
 



  GST-hTRT-Fusionsproteine wurden in E. coli als das GST-hTRT-Fragment #4 (Nucleotide 3272-4177) und das GST-His8-hTRTFragment #3 (Nucleotide 2426 bis 3274), wie in Beispiel 6 beschrieben, exprimiert. Die Fusionsproteine wurde als unlösliches Protein gereinigt und die Reinheit des Antigens wurde über SDS-Polyacrylamidgele untersucht und auf etwa 75% Reinheit bezüglich des rekombinanten Proteins GST-hTRTFragment #4 und über 75% Reinheit für das rekombinante Protein GST-His8-hTRT-Fragment #3 geschätzt. (Routineverfahren  können zur Gewinnung dieser und anderer Fusionsproteine mit einer Reinheit über 90% verwendet werden). Diese rekombinanten Proteine wurden zur Immunisierung sowohl von "New Zealand White"-Kaninchen als auch weiblichen Balb/c-Mäusen verwendet.

   Für einleitende Injektionen wurde das Antigen mit vollständigen Freund'schem Adjuvans emulgiert, für nachfolgende Injektionen wurde unvollständiges Freund'sches Adjuvans verwendet. Für die Kaninchen und Mäuse erfolgte ein 3-wöchiger Auffrischungsimpfcyclus, wobei Blut 10 Tage nach jeder Auffrischungsimpfung entnommen wurde. 



  Die erste und zweite Blutentnahme sowohl von den Mäusen als auch den Kaninchen wurde hinsichtlich der Anwesenheit von anti-hTRT-Antikörpern nach Entfernung von anti-GST-Antikörpern unter Verwendung einer immobilisiertes GST enthaltenden Matrix getestet. Die Antiseren wurden auf anti-hTRT-Antikörpern durch Western-Blots unter Verwendung eines immobilisierten rekombinanten GST-hTRT-Fusionsproteins getestet und mittels Immunpräzipitation unter Verwendung des partiell gereinigten nativen Telomeraseenzyms. Bei diesen frühen Blutentnahmen konnte kein Signal beobachtet werden; es wird davon ausgegangen, dass sich die Titer von anti-hTRT-Antikörpern bei nachfolgenden Blutentnahmen erhöhen. 


 Beispiel 9 
 


 Nachweis einer HTRT-MRNA die der RNA der  DELTA 182-Variante entspricht 
 



  Poly-A<+>-RNA von menschlichen Hoden und der 293-Zellinie wurde hinsichtlich hTRT-mRNA mittels RT-PCR und "nested"-Primern analysiert. Der erste Primersatz war TCP1.1 und TCP1.15, der zweite Primersatz TCP1.14 und billTCP6. Die Amplifikation mit beiden Primersätzen ergab zwei Produkte, die sich um 182 bp unterschieden. Die grösseren und kleineren Produkte von RNA aus Hoden wurde sequenziert und es stellte sich heraus, dass sie genau pGRN121 (Fig. 16) bzw. dem Clon  712562 (Fig. 18) entsprachen. Das hTRT-RNA-Produkt der Variante wurde in mRNA von SW39i, OVCAR4, 293 und Hoden beobachtet. 



  Zusätzliche Experimente wurden durchgeführt, um zu zeigen, dass die  DELTA 182 cDNA nicht ein Artefact der reversen Transkription war. Kurz zusammengefasst, hTRT-RNA (d.h. ohne Deletion) wurde durch in vitro-Transkription von pGRN121 zur Verwendung als Matrize für RT-PCR hergestellt. Getrennt davon wurden cDNA-Synthese-Reaktionen mittels der "Superscript< TM >" reverser Transkriptase (Bethesda Research Laboratories, Bethesda MD) bei 42 DEG C oder 50 DEG C mit Zufallsprimern oder einem spezifischen Primer durchgeführt. Nach 15 PCR-Cyclen war das längere Produkt nachweisbar, jedoch nicht das kleinere Produkt (d.h. das der Deletion entsprechende, selbst nicht nach 30 oder mehr Cyclen. Dieses zeigt an, dass das RTPCR-Produkt kein Artefact ist. 


 Beispiel 10 
 


 Sequenzierung von Hoden-hTRT-mRNA 
 



  Die Sequenz der in Hoden vorzufindenden Form von hTRT-RNA wurde durch direkte Manuell-Sequenzierung von DNA-Fragmenten bestimmt, die mittels PCR von Hoden-cDNA ("Marathon"-Hoden- cDNA, Clontech, San Diego, CA) unter Verwendung eines "ThermoSequenase radiolabeled terminator cycle"-Sequenzierungskits (Amersham Life Science) erzeugt. Die PCR-Reaktionen wurden mittels "nested"-PCR, wie in Tabelle 7 gezeigt, durchgeführt, soweit nicht anders angegeben. In allen Fällen wurde eine negative Kontrollreaktion mit Primern, jedoch ohne cDNA durchgeführt. Das Fehlen eines Produkts in der Kontrollreaktion zeigte, dass die von der Reaktion mit cDNA stammenden Produkte nicht aufgrund einer Kontamination mit hTRT von pGRN121 oder anderen Zellquellen (z.B. 293-Zellen) vorhanden waren. Die DNA-Fragmente wurden zur Reinigung der DNA vor der Sequenzierung aus Agarosegelen ausgeschnitten. 



  Die Sequenz der Hoden-mRNA, die den Basen 27 bis 3553 der Insertionssequenz von pGRN121 (SEQ. ID. Nr. 1) entspricht und den gesamten hTRT-ORF (Basen S6 bis 3451) wurde erhalten. In diesem Bereich zeigten sich keine Unterschiede zwischen den Hoden- und pGRN121-Sequenzen. 
EMI365.1
 
 



  Beispiel 11 


 Nachweis von hTRT-mRNA durch RNase-Schutzreaktion 
 



  RNase-Schutzassays können zum Nachweis, zur Überwachung oder zur Diagnose hinsichtlich der Anwesenheit einer hTRT-mRNA oder der mRNA einer Variante verwendet werden. Eine veranschaulichende Sonde für einen solchen Assay ist eine in vitro-synthetisierte RNA, die Sequenzen umfasst, die komplementär zu hTRT-mRNA-Sequenzen sind, und zusätzliche, nicht komplementäre Sequenzen. Die letzteren Sequenzen sind deshalb von Vorteil, um die Sonde mit vollständiger Länge von dem Fragment der Sonde unterscheiden zu können, das von einem positiven Ergebnis in dem Assay herrührt. In einem positiven Assay werden die komplementären Sequenzen der Sonde vor einer Spaltung mit RNase geschützt, da sie mit der hTRTmRNA hybridisiert sind. Die nicht-komplementären Sequenzen werden von der Sonde in Gegenwart von RNase und komplementärer Zielnucleinsäure abgespalten. 



  Zwei Sonden für die RNase-Schutzassays sind zur Veranschaulichung beschrieben, wobei jede in dem Assay verwendet werden kann. Die Sonden unterscheiden sich in ihren zu hTRT komplementären Sequenzen, enthalten jedoch identische nichtkomplementäre Sequenzen, die in dieser Ausführungsform von der späten Leadersequenz der mRNA von SV40 stammen. In 5 min -3 min -Richtung umfasst die erste Sonde 33 Nucleotide einer nicht-komplementären Sequenz und 194 Nucleotide einer Sequenz, die komplementär zu den hTRT-Nucleotiden 2513 bis 2707 ist für eine Grösse der Sonde mit vollständiger Länge von 227 Nucleotiden. In 5 min -3 min -Richtung umfasst die zweite Sonde 33 Nucleotide einer nicht komplementären Sequenz und 198 Nucleotide einer Sequenz, die komplementär zu den hTRT-Nucleotiden 2837 bis 3035 ist für eine Grösse der Sonde mit vollständiger Länge von 231 Nucleotiden.

   Zur Durchführung des Assays kann jede der beiden Sonden mit RNA d.h. PolyA<+>-RNA von einer Testprobe hybridisiert werden und im Anschluss  daran werden T1-Ribonuclease und RNase A zugegeben. Nach der Spaltung wird die Sonden-RNA gereinigt und durch Gelelektrophorese analysiert. Der Nachweis eines 194 Nucleotide langen Fragments der Nucleotidsonde mit einer Länge von 227 Nucleotiden oder eines 198 Nucleotide langen Fragments der Sonde mit einer Länge von 231 Nucleotiden ist ein Zeichen für die Anwesenheit von hTRT-mRNA in der Probe. 



  Die in diesem Beispiel beschriebenen veranschaulichenden Sonden für den RNase-Schutzassay können durch in vitro-Transkription mittels T7-RNA-Polymerase erzeugt werden. Radioaktive oder anderweitig markierte Ribonucleotide können für die Synthese von markierten Sonden eingeschlossen werden. Die Matrizen für die in vitro-Transkriptionsreaktion zur Herstellung der RNA-Sonden sind PCR-Produkte. Diese illustrativen Sonden können nach PCR-Amplifikation von pGRN121-DNA mittels Primern, die den entsprechenden komplementären Bereich des hTRT-Gens oder der hTRT-mRNA umspannen, mit T7-Polymerase synthetisiert werden. Ausserdem enthält der Stromabwärts-Primer T7-RNA-Polymerase-Promotorsequenzen und die nicht-komplementären Sequenzen. 



  Für die Erzeugung der ersten Sonde für den RNase-Schutzassay wird das PCR-Produkt von dem folgenden Primer-Paar T701 und reverse 01) verwendet: 
EMI367.1
 
 



  und reverse 01 
EMI367.2
 
 



  Zur Erzeugung der zweiten Sonde für den RNase-Schutzassay wird das PCR-Produkt von dem folgenden Primerpaar (T702 und reverse 02) verwendet: 
EMI367.3
 
 



  und reverse 02 
EMI368.1
 
 


 Beispiel 12 
 


 Konstruktion eines phylogenetischen Stammbaums durch Vergleich von hTRT mit anderen reversen Transkriptasen 
 



  Ein phylogenetischer Stammbaum (Fig. 6) wurde durch Vergleich der sieben von Xiong und Eickbush (EMBO J. 9 (1990), 3353) RT-Domänen konstruiert. Nach Sequenzausrichtung der Motive 1, 2 und A-E von 4 TRTs, 67 RTs und 3 RNA-Polymerasen wurde der Stammbaum unter Verwendung des "NJ ("Neighbor joining")-Verfahrens (Saitou und Nei, Mol. Biol. Evol. 4 (1987), 4406) konstruiert. Elemente von der gleichen Klasse, die auf dem gleichen Zweig des Stammbaums lokalisiert sind, sind vereinfacht als Kästchen wiedergegeben. Die Länge jedes Kästchens entspricht dem am meisten divergenten Element innerhalb des Kästchens. 



  Die TRTs scheinen mit den RTs, die mit msDNA, Gruppe II-Introns und nicht-LTR (lange terminale Wiederholungseinheiten)-Retrotransposons enger verwandt zu sein als mit dem LTR-Retrotransposon und viralen RTs. Die Verwandtschaft der Telomerase-RTs zu dem nicht-LTR-Zweig von Retroelementen ist sehr interessant, geht man davon aus, dass diese letzteren Elemente Telomerase für die Telomer-Beibehaltung in Drosophila ausgetauscht haben. Die auffallendste Beobachtung ist jedoch, dass die TRTs eine diskrete Untergruppe bilden, die mit den RNA-abhängigen RNA-Polymerasen von +-strängigen RNA-Viren, wie beispielsweise Poliovirus, beinahe genau so eng verwandt ist wie mit einem der bereits bekannten RTs.

   Wenn man in Erwägung zieht, dass die vier Telomerasegene von evolutionär entfernten Organismen stammen, - Protozoen, Pilze und Säuger - kann diese getrennte Gruppierung nicht durch das Fehlen von phylogenetischer Vielfalt in dem Daten satz erklärt werden. Diese frühzeitige Aufgabelung legt statt dessen nahe, dass die Telomerase-RTs eine sehr alte Gruppe sind, die vielleicht mit dem ersten Eukaryoten entstand. 



  GenBank-Protein-Identifizierungsnummern oder Zugangsnummern, die für phylogenetische Analyse verwendet wurden, sind: 



  msDNAs (94535, 134069, 134074, 134075, 134078), Gruppe II Introns (483039, 101880, 1332208, 1334433, 1334435, 133345, 1353081), mitochondriales Plasmid/RTL (903835, 134084), nicht-LTR Retrotransposons (140023, 84806, 103221, 103353, 134083, 435415, 103015, 1335673, 85020, 141475, 106903, 130402, U0551, 903695, 940390, 2055276, L08889), LTR-Retrotransposons (74599, 85105, 130582, 99712, 83589, 84126, 479443, 224319, 130398, 130583, 1335652, 173088, 226407, 101042, 1078824), Hepadnaviren (1 18876, 1706510, 118894), Caulimoviren (331554, 130600, 130593, 93553), Retroviren (130601, 325465, 74601, 130587, 130671, 130607, 130629, 130589, 130631, 1346746, 130651, 130635, 1780973, 130646). Die Ausrichtung wurde mittels "ClustalW 1.5" (J.D. Thompson, D.G. Higgins, T.J.Gibson, Nucleic Acids Res. 22, (1994), 4673) und "PHYLIP.3.5" (J.

   Felsenstein, Cladisfics 5 (1989), 164) analysiert. 


 Beispiel 13 
 


 Transfektion von kultivierten menschlichen Fibroblasten (BJ) mit einem Kontrollplasmid und einem hTRT codierenden Plasmid 
 



  Dieses Beispiel zeigt, dass die Expression eines rekombinanten hTRT-Proteins in einer Säugerzelle zur Erzeugung einer aktiven Telomerase führt. 



  Subkonfluente Bi-Fibroblasten wurden trypsinisiert und in frischem Medium (DMEM/199, 10% fötales Kälberserum enthaltend) bei einer Konzentration von 4 x 10<6> Zellen/ml resuspendiert. Die Zellen wurden mittels Elektroporation mit dem  "Gene Pulser<TM>"-Elektroporator von BioRad transfiziert. Gegebenenfalls kann man auch Zellen unter Verwendung des "Superfect<TM>"-Reagenz (Quiagen) gemäss den Anleitungen des Herstellers transfizieren. Für die Elektroporation wurden 500  mu l Zellsuspension in eine Elektroporationsküvette (BioRad, 0,4 cm Elektrodenabstand) gegeben. Plasmid-DNA (2  mu g) wurden zu den Küvetten gegeben und die Suspension vorsichtig gemischt und auf Eis 5 Minuten inkubiert. Das Kontrollplasmid (pBBS212) enthielt keine Insertion hinter dem MPSV-Promotor und das experimentelle Plasmid (pGRN133) exprimierte hTRT vom MPSV-Promotor.

   Die Zellen wurden bei 300 V und 960  mu FD einer Elektroporation unterworfen. Nach Abgabe des Impulses wurden die Küvetten vor der Plattierung auf 100 mm-Gewebekulturplatten in Medium etwa 5 Minuten auf Eis gehalten. Nach 6 Stunden wurde das Medium gegen neues Medium ausgetauscht. 72 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen trypsinisiert, einmal mit PBS gewaschen, pelletiert und in gefrorenem Zustand bei -80 DEG C aufbewahrt. Zellextrakte wurden bei einer Konzentration von 25 000 Zellen/ mu l durch ein modifiziertes Lyseverfahren mittels Detergentien präpariert (siehe Bodnar et al., Exp.

   Cell Res. 228 (1996), 58 und Kim et al., Science 266 (1994) 2011 und die Beschreibung in Patenten und Publikationen, die sich auf den vorstehenden TRAP-Assay beziehen) und Telomerase-Aktivität in den Zellextrakten wurde mittels eines modifizierten auf PCR basierenden TRAP-Assays bestimmt (Kim et al., 1994, Bodnar et al., 1996). Kurz zusammengefasst, 5 x 10<4> Zelläquivalente wurden für den Telomerase-Primer Verlängerungsteil der Reaktion verwendet. Während der Extrakt typischerweise direkt von der Telomerase-Verlängerungsreaktion zu der PCR-Amplifikation gegeben wird, kann man auch einmal mit Phenol/Chloroform und einmal mit Chloroform vor der PCR-Amplifikation extrahieren. Ein Fünftel des Materials wurde in dem PCR-Amplifikationsanteil der TRAP-Reaktion verwendet (etwa 10 000 Zelläquivalente).

   Die Hälfte der TRAP-Reaktion wurde zur Analyse auf ein Gel geladen, so dass jede Spur in Fig. 25 Reaktionsprodukte von 5000 Zelläquivalenten repräsentiert. Extrakte von  mit pGRN133 transfizierten Zellen waren hinsichtlich Telomerase-Aktivität positiv, während Extrakte von nicht-transfizierten Zellen (nicht gezeigt) oder mit dem Kontrollplasmid transfizierten Zellen keine Telomerase-Aktivität zeigten. Ähnliche Experimente mit RPE-Zellen ergaben das gleiche Ergebnis. 



  Rekonstitution in BJ-Zellen wurde auch mittels anderer hTRT-Konstrukte durchgeführt (d.h. pGRN145, pGRN155 und pGRN138). Die Rekonstitution unter Verwendung dieser Konstrukte schien zu einer stärkeren Telomerase-Aktivität zu führen im Vergleich zu mit pGRN133 transfizierten Zellen. 



  Der höchste Spiegel an Telomerase-Aktivität wurde mit pGRN155 erzielt. Wie bereits vorstehend diskutiert ist pGRN155 ein Vektor, der den späten Hauptpromotor von Adenovirus als ein Kontrollelement für die Expression von hTRT enthält und es zeigte sich, dass damit Telomerase-Aktivität rekonstituiert werden konnte bei Transfektion in BJ-Zellen. Bemerkenswerterweise ergab die Rekonstitution unter Verwendung mit dem hTRT-GFP-Fusionsprotein pGRN138 (das im Nucleus lokalisiert wird, siehe das nachstehende Beispiel 15) entweder in vitro (siehe Beispiel 7) oder mit in vivo-Rekonstitutionssystemen (Transfektion in Bi-Zellen), ergab Telomerase-Aktivität. Wenn in BJ-Zellen, wie beispielsweise vorstehend beschrieben, transfiziert wurde, war die Telomerase-Aktivität mit der vergleichbar, die sich aus der Rekonstitution mit pGRN133 oder pGRN145 ergab. 



  Ähnliche Ergebnisse wurden nach Transfektion von normalen menschlichen pigmenthaltigen retinalen Epithelzellen (RPE) mit den erfindungsgemässen hTRT-Expressionsvektoren erhalten. Es wird davon ausgegangen, dass die Seneszenz von RPE-Zellen zu der Erkrankung der mit dem Alter zusammenhängenden Macula-Degeneration führt oder dazu beiträgt. Gemäss den erfindungsgemässen Verfahren mit den erfindungsgemässen hTRT-Expressionsvektoren behandelte RPE-Zellen sollten eine verzö gerte Seneszenz aufweisen im Vergleich zu unbehandelten Zellen und so von Nutzen sein bei Transplantationstherapien zur Behandlung oder zur Verhinderung der mit dem Alter zusammenhängenden Macula-Degeneration. 


 Beispiel 14 
 


 Promotor-Reporter-Konstrukt 
 



  Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion von Plasmiden, bei denen Reportergene mit stromaufwärts gelegenen hTRT-Sequenzen, die Promotorelemente enthalten, funktionell verknüpft sind. Diese Vektoren weisen zahlreiche Anwendungsmöglichkeiten auf, wozu die Identifizierung von in cis und trans wirkenden Regulationsfaktoren der Transkription in vivo und das Screening nach Agenzien, die die hTRT-Expression modulieren können (z.B. Aktivierung oder Hemmung) zählen (beispielsweise das Screenen von Wirkstoffen). Es können zwar eine Reihe von Reportergenen verwendet werden (beispielsweise Leuchtkörperchen-Luciferase,  beta -Glucuronidase,  beta -Galactosidase, Chloramphinicolacetyltransferase und GFP), für einleitende Experimente wurde jedoch die sezernierte menschliche alkalische Phosphatase (SEAP; CloneTech) verwendet.

   Das SEAP-Reportergen codiert eine verkürzte Form des Enzym aus Plazenta, dem die Domäne für die Membran-Verankerung fehlt, wodurch die effiziente Sekretion des Proteins aus transfizierten Zellen ermöglicht wird. Es konnte gezeigt werden, dass die Spiegel an SEAP-Aktivität, die in dem Kulturmedium nachgewiesen werden, direkt proportional zu Veränderungen in intrazellulären Konzentrationen von SEAP-mRNA und -Protein sind (Berger et al., Gene 66 (1988), 1 und Cullen et al., Meth. Enzymol 216 (1992), 362). 



  Vier Konstrukte (pGRN148, pGRN150, "pSEAP2 basic" (keine Promotorsequenz = negative Kontrolle) und "pSEAP2 control" (das den frühen SV40-Promotor und Enhancer enthält) wurden  in dreifacher Ausfertigung in sterblichen und unsterblichen Zellen transfiziert. 



  Plasmid pGRN148 wurde wie in Fig. 9 veranschaulicht konstruiert. Kurz zusammengefasst wurde ein BglII-Eco47III-Fragment von pGRN144 gespalten und in die BglII-NruI-Stelle von pSEAp2Basic (Clontech, San Diego, CA) cloniert. Ein zweiter Reporterpromotor, das Plasmid pGRN150, enthält die Sequenzen von dem in Beispiel 3 beschriebenen hTRT-Intron, um so regulatorische Sequenzen, die in dem Intron vorhanden sein können, verwenden zu können. Das Initiationscodon Met ist zu Leu mutiert, so dass das zweite dem Promotorbereich folgende ATG das Initiations-ATG des SEAP-ORF ist. 



  Die Konstrukte pGRN148 und pGRN150, die den hTRT-Promotor enthalten, wurden in sterbliche (BJ-Zellen) und unsterbliche (293)-Zellen transfiziert. Alle Transfektionen wurden parallel mit zwei Kontrollplasmiden durchgeführt. Ein Plasmid als negative Kontrolle (pSEAP basic) und ein Plasmid als positive Kontrolle ("pSEAP control", das den frühen SV40-Promotor und den SV4O-Enhancer enthält). 



  In unsterblichen Zellen scheinen die Konstrukte pGRN148 und pGRN150 die SEAP-Expression genauso effizient zu steuern, wie die positive "pSEAP2 control" (die den frühen SV40-Promotor und -Enhancer enthält). Im Gegensatz dazu ergab in sterblichen Zellen nur die "pSEAP2 control" nachweisbare Aktivität. Diese Ergebnisse zeigen, dass, wie erwartet, hTRT-Promotorsequenzen in Tumorzellen-aktiv sind, jedoch nicht in sterblichen Zellen. 

 

  Ähnliche Ergebnisse wurden mit einer weiteren normalen Zellinie (RPE), (pigmenthaltige, retinale Epithelzellinie) erhalten. In RPE-Zellen, die mit pGRN150 (das 2,2 kb an stromaufwärts gelegener genomischer Sequenz enthält) transfiziert sind, war der hTRT-Promotorbereich inaktiv, während das Plasmid "pSEAP2 control" aktiv war. 



  Wie bereits vorstehend angemerkt, sind Plasmide, bei denen Reportergene zur stromaufwärts gelegenen hTRT-Sequenz, die Promotorelemente enthalten, funktionell verknüpft sind, ausgesprochen nützlich für die Identifizierung und das Screening von Telomerase-Aktivität modulierende Agenzien, wobei sowohl Verfahren der transienten als auch der stabilen Transfektion verwendet werden können. Bei einer Vorgehensweise werden beispielsweise stabile Transformanten von pGRN148 in Telomerase-negativen und Telomerase-positiven Zellen durch Cotransfektion mit einem eukariotischen selektierbaren Marker (wie z.B. neo) gemäss Ausubel et al., 1997, a.a.O.) hergestellt.

   Die erhaltenen Zellinien werden dann für das Screenen von vermuteten Telomerase-modulierenden Agenzien verwendet, beispielsweise durch Vergleich der hTRTPromotor-gesteuerten Expression in Gegenwart oder Abwesenheit einer Testverbindung. 



  Die erfindungsgemässen Promotor-Reporter-Vektoren (und andere) werden auch zur Identifizierung von in trans und in cis wirkenden Regulationselementen für die Transkription und Translation verwendet. Zu den Beispielen für in cis wirkenden regulatorischen Elementen der Transkription zählen Promotoren und Enhancer des Telomerasegens. Die Identifizierung und Isolierung von in cis und in trans wirkenden regulatorischen Agenzien führt zur Bereitstellung weiterer Verfahren und Reagenzien zur Identifizierung von Agenzien, die die Transkription und Translation von Telomerase modulieren. 


 Beispiel 15 
 


 Subzelluläre Lokalisation von hTRT 
 



  Ein Fusionsprotein mit hTRT und "enhanced green fluorescent protein" (EGFP; Cormack et al., Gene 173 (1996), 33)-Bereichen wurde wie nachstehend beschrieben konstruiert. Die EGFP-Einheit liefert ein nachweisbares "tag" oder Signal,  womit das Vorhandensein oder die Lage des Fusionsproteins leicht bestimmt werden kann. Da EGFP-Fusionsproteine in den korrekten zellulären Kompartimenten lokalisiert sind, kann dieses Konstrukt zur Bestimmung der subzellulären Lage des hTRT-Proteins verwendet werden. 


 A. Konstruktion von pGRN138 
 



  Ein Vektor zur Expression eines hTRT-EGFP-Fusionsproteins in Säugerzellen wurde konstruiert durch Integration der EcoRI-Insertion von pGRN124 (siehe Beispiel 6) in die EcoRI-Stelle von pEGFP-C2 (Clontech, San Diego, CA). Die Aminosäuresequenz des Fusionsproteins ist nachstehend gezeigt. EGFP-Reste sind in Fettdruck, durch den 5 min -untranslatierten Bereich von hTRT-mRNA codierte Reste sind unterstrichen und die hTRT-Proteinsequenz ist in normaler Schrift angegeben. 
EMI375.1
 
 



  Weitere EGFP-Fusionskonstrukte wurden unter Verwendung einer partiellen (z.B. verkürzten) hTRT codierenden Sequenz hergestellt, und, wie nachstehend beschrieben, zur Identifizierung von Aktivitäten bestimmter Bereiche des hTRT-Polypeptids verwendet. 


 B. Nucleäre Lokalisierung und Verwendungsmöglichkeiten für DGRN138 
 



  Die Transfektion von NIH 293- und BJ-Zellen mit pGRN138 erlaubte die Bestätigung der nucleären Lokalisation von rekombinant exprimierter hTRT. Zellen wurden mit pGRN138 (EGFPhTRT) und einem Kontrollkonstrukt (nur EGFP exprimiert) transfiziert. Die nucleäre Lokalisation der EGFP-hTRT ist in beiden Zelltypen offensichtlich (bestimmt durch Fluoreszenzmikroskopie). Wie bereits vorstehend angemerkt, unterstützt das pGRN138 hTRT-GFP-Fusionsprotein die Rekonstitution von Telomerase-Aktivität sowohl in einem in vitro-Transkriptions/Translationssystem als auch in vivo, wenn es in BJ-Zellen transfiziert wird. 



  hTRT-EGFP-Fusionsproteine (oder ähnliche nachweisbare Fusionsproteine) werden für eine Vielzahl von Anwendungen verwendet. Beispielsweise wird das in diesem Beispiel beschriebene Fusionskonstrukt oder ein EGFP-Konstrukt und eine verkürzte Form von hTRT zur Beurteilung der Fähigkeit von hTRT und Varianten, in einen Zellnucleus einzutreten und/oder an die Chromosomenenden anlagern zu können, verwendet. Ausserdem werden stabil oder transient mit pGRN138 transfizierte Zellen für das Screenen nach vermuteten Telomerase-modulierenden Wirkstoffen oder Verbindungen verwendet. Agenzien, die die nucleäre Lokalisation oder Telomer-Lokalisation stören, werden als Telomerase-Inhibitoren identifiziert. Für diesen Zweck sind Tumorzellinien, die EGFP-hTRT stabil exprimieren, verwendet.

   Potentielle Modulatoren von Telomerase werden diesen transfizierten Zellen verabreicht und die Lokalisation der EGFP-hTRT kann bewertet werden. Ausserdem werden  FACS oder andere auf Fluoreszenz basierende Verfahren verwendet, um hTRT exprimierende Zellen selektieren zu können, womit homogene Populationen für das Screenen von Wirkstoffen bereitgestellt werden, insbesondere wenn die transiente Transfektion von Zellen angewandt wird. 



  Bei anderen Anwendungen können Bereiche der hTRT zur Identifikation von Bereichen (z.B. Reste 193-196 (PRRR) und Reste 235-240 (PKRRRR)) mutagenisiert werden, die für die nucleäre Lokalisation erforderlich sind, wobei diese Bereiche Ziele für anti-Telomerase-Wirkstoffe (Modulatoren von Telomerase-Aktivität) sind. Zu den weiteren Anwendungen gehören: 



  Verwendung des Fusionsproteins als Fluoreszenzmarker für die effiziente Zelltransfektion, sowohl für Experimente hinsichtlich transienter Transfektion als auch für die Etablierung EGFP-hTRT-exprimierender stabiler Zellinien; 



  Expression eines hTRT-EGFP-Fusionsproteins mit mutierten Signalen für nucleäre Lokalisation (defizient für nucleäre Lokalisation) in unsterblichen Zellen, damit das hTRT-Mutanten-EGFP alle hTR der unsterblichen Zellen einfängt, sie im Cytoplasma zurückhält und die Telomer-Aufrechterhaltung verhindert; 



  Das GFP kann auch als ein "tag" für Immunpräzipitation verwendet werden. 


 Beispiel 16 
 


 Die Auswirkung einer Mutation auf eine katalytische Aktivität von Telomerase 
 



  Dieses Beispiel beschreibt Experimente hinsichtlich der Veränderung von hTRT-Aminosäuren, sowie die Auswirkung von Aminosäureaustauschen in hTRT auf katalytische Aktivität von Telomerase. Der Austausch von Aminosäuren und im Anschluss  daran die funktionelle Analyse ist ein Standardverfahren zur Bewertung der Bedeutung und Funktion einer Polypeptidsequenz. Dieses Beispiel zeigt, dass Veränderungen in den reverse-Transkriptase (RT)- und Telomerase-T-Motiven katalytische Aktivität von Telomerase beeinflussen und es liefert eine zusätzliche Bestätigung der katalytischen Natur des hTRT-Polypeptids. 



  Die übliche Nomenklatur wird zur Beschreibung der Mutanten verwendet: Der Zielrest im nativen Molekül (hTRT) wird durch den Ein-Buchstaben-Code und die Position angegeben, und der entsprechende Rest in dem Mutantenprotein ist durch den Ein-Buchstaben-Code angegeben. Somit kennzeichnet beispielsweise der Ausdruck "K626A" eine Mutante, bei der das Lysin an Position 626 (d.h. im Motiv 1) voh hTRT gegen ein Alanin ausgetauscht ist. 


 A) Mutagenese des FFYxTE-Motivs von hTRT 
 



  In einleitenden Experimenten wurde ein mutiertes hTRT-Protein codierender Vektor, "F560A" hergestellt, bei dem die Aminosäure 560 von SEQ. ID. Nr. 2 von Phenylalanin (F) zu Alanin (A) durch ortsgerichtete Mutagenese von pGRN121 mittels Standardverfahren geändert wurde. Diese Mutation unterbricht das TRT FFYxTE-Motiv. Es konnte gezeigt werden, dass das erhaltene mutierte F560A-Polynucleotid die Synthese eines hTRT-Proteins mit vollständiger Länge steuert, wie dies unter Verwendung eines zellfreien Reticulocytenlysat-Transkriptions/Translationssystem in Gegenwart von <3><5>S-Methionin bestimmt werden konnte. 



  Bei Translation des mutierten Polypeptids zusammen mit hTRT, wie in Beispiel 7 beschrieben, wurde mittels des TRAP-Assays unter Verwendung von 20 PCR-Cyclen keine Telomerase-Aktivität entdeckt, während die Kontroll-Cotranslation von hTRT-hTR-Aktivität rekonstituierte. Bei Verwendung von 30 PCR-Cyclen im TRAP-Assay war Telomerase-Aktivität mit der mu tierten hTRT nachweisbar, sie war jedoch beträchtlich geringer im Vergleich zu der Kontroll (Wildtyp)-hTRT. 


 B) Zusätzliche ortsgerichtete Mutagenese von hTRT-Aminosäureresten 
 



  Konservierte Aminosäuren in sechs RT-Motiven wurden zu Alanin abgeändert, um ihren Beitrag zur katalytischen Aktivität zu beurteilen, wobei Standardverfahren für die ortsgerichtete Mutagenese verwendet wurden (siehe beispielsweise Ausubel, a.a.0.). Die Mutanten wurden mittels IVR-Telomerase untersucht, wobei der in Beispiel 7 ausführlich beschriebene Zwei-Schritt-Assay (üblich/TRAP) verwendet wurde. 



  Die Mutanten K626A (Motiv 1), R631A (Motiv 2), D712A (Motiv A), Y717A (Motiv A) und D868A (Motiv C) zeigten stark herabgesetzte oder nicht-nachweisbare Telomerase-Aktivität, während die Mutanten Q833A (Motiv B) und G932A (Motiv E) mittlere Aktivitätsspiegel aufwiesen. Zwei Mutationen ausserhalb der RT-Motive (R688A und D897A) zeigten Aktivität, die äquivalent zu der Aktivität von Wildtyp-hTRT war. Diese Ergebnisse waren konsistent mit analogen Mutationen in reverser Transkriptase (Joyce et al., Ann. Rev. Biochem. 63 (1994), 777), und ähnlich zu dem mit Est2P erhaltenen Ergebnissen (siehe Lingner, Science 276 (1997), 561). Durch diese Experimente konnten Reste in den RT-Motiven identifiziert werden, die für enzymatische Aktivität kritisch sind. Diese Experimente zeigen auch das hTRT, das das katalytische Protein von menschlicher Telomerase ist.

   Durch die Mutationen werden hTRT-Polypeptidvarianten erzeugt, die als dominant-negative Regulatoren von Telomerase-Aktivität verwendet werden können. 



  Durch Aminosäureausrichtung der bekannten TRTs konnte das Telomerase-spezifische Motiv T (siehe vorstehend) identifiziert werden. Um die katalytische Rolle dieses Motivs in hTRT zu bestimmen, wurde eine Deletion von sechs Aminosäuren  in diesem Motiv ( DELTA 560-565; FFYxTE) unter Verwendung von Standardverfahren für die ortsgerichtete Mutagenese konstruiert (Ausubel, a.a.O.). Die Deletion wurde unter Verwendung von IVR-Telomerase mittels in Beispiel 7 ausführlich beschriebener Zwei-Schritt-Assays (üblich/TRAP) untersucht. Die Mutante  DELTA 560-565 zeigte keine nachweisbare Telomerase-Aktivität nach 25 PCR-Cyclen, während Wildtyp-hTRT-IVR-Telomerase ein starkes Signal erzeugte. Jeder Aminosäurerest in Motiv T wurde auf ähnliche Weise unabhängig untersucht.

   Die Mutanen FS6OA, Y562A, TS64 und E565A behielten mittlere Spiegel an Telomerase-Aktivität bei, während die Kontrollmutante F487A eine minimale Auswirkung auf die Aktivität hatte. Bemerkenswerterweise zeigte die Mutante F561A eine stark herabgesetzte oder nicht nachweisbare Telomerase-Aktivität, während in ihrer "Revertante" F561A561P Aktivität voll wiederhergestellt war. Bei der F561A561F befindet sich an der mutierten Position wieder das ursprüngliche Phenylalanin. Dies stellt eine Kontrolle dar, die zeigt, dass keine weiteren Aminosäureaustausche in dem Plasmid vorkamen, die die beobachtete verringerte Aktivität hätten erklären können. Somit ist das T-Motiv das erste Nicht-RT-Motiv, für das gezeigt werden konnte, dass es für Telomerase-Aktivität erforderlich ist. 



  Motiv T ist von Nutzen für die Identifizierung von TRTs von anderen Organismen und als ein potentieller dominant/negativ-Regulator von Telomerase-Aktivität. Im Gegensatz zu den meisten anderen RTs assoziierte Telomerase stabil mit einem kleinen Anteil einer einzelnen RNA (d.h. hTR) und kopiert diesen prozessiv, somit könnte das Motiv T an der Vermittlung der hTR-Bindung, der Prozessivität der Reaktion oder anderen Funktionen beteiligt sein, die für die Telomerase-RT einzigartig sind. 


 Beispiel 17 
 


 Screenen nach Modulatoren von Telomerase-Aktivität mittels rekombinant exprimierter Telomerase-Bestandteile 
 



  In diesem Beispiel wird die Verwendung von in vitro-rekonstituierter Telomerase zum Screenen und zur Identifizierung von Modulatoren von Telomerase-Aktivität beschrieben. Der beschriebene Assay kann leicht für Verfahren mit hohem Durchsatz adaptiert werden (z.B. mittels Platten mit vielfachen Vertiefungen und/oder Robotertechniksystem). Für den Fachmann sind die zahlreichen Variationsmöglichkeiten hinsichtlich der Assayschritte offensichtlich. 



  Rekombinante Clone für Telomerase-Bestandteile (z.B. hTRT und hTRR) werden in einer in vitro-Reaktion wie folgt und in dem vorstehend beschriebenen Beispiel 7 mittels des TNT< TM > T7gekoppelten Reticulocytenlysat-Systems (Promega; das in US-Patent Nr. 5 324 637 beschrieben ist und gemäss den Angaben des Herstellers verwendet wurde) transkribiert und translatiert (nur hTRT): 
<tb><TABLE> Columns=2 
<tb>Head Col 1: Reagenz 
<tb>Head Col 2: Mengepro Reaktion 
 ( mu l)
<tb><SEP>TNT-Kaninchen-Reticulocytenlysat<SEP>25
<tb><SEP>TNT-Reaktionspuffer<SEP>2
<tb><SEP>TNT T7-RNA-Polymerase<SEP>1
<tb><SEP>AA-Gemisch (vollständig)<SEP>1
<tb><SEP>"Prime" RNase-Inhibitor<CEL AL=L>1
<tb><SEP>Nuclease-freies Wasser<SEP>16
<tb><SEP>XbaI-geschnittenes pGRN121 (hTRT, 0,5  mu g)<CEL AL=L>2
<tb><CEL AL=L>FspI-geschnittenes pGRN164 (hTR, 0,5  mu g)<SEP>2 
<tb></TABLE> 



  Die Reaktion wird 2 Stunden bei 30 DEG C inkubiert. Danach wird das Produkt auf einem "ultrafree-MC" DEAE-Filter (Millipore) gereinigt. 



  Das rekombinante Telomerase-Produkt (IVRP) wird in Gegenwart oder Abwesenheit vielfacher Konzentrationen an Testverbindungen, die in DMSO (z.B. 10  mu M bis 100  mu M) solubilisiert wurden, untersucht. Die Testverbindungen werden 30 Minuten bei Raumtemperatur in einem Gesamtvolumen von   25  mu l vorinkubiert, in der Gegenwart von 2, 5  mu l IVRP, 2,5% DMSO und 1 x TRAP-Puffer (20 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,3, 1,5 mM MgCl2, 63 mM KCl, 0,05% Tween 20, 1,0 mM EGTA und 0,1 mg/ml Rinderserumalbumin) vorinkubiert. Nach der Vorinkubation werden zu jeder Probe 25  mu l TRAP-Assay-Reaktionsgemisch zugegeben. Das TRAP-Assay-Reaktionsgemisch besteht aus 1 x TRAP-Puffer, 50  mu l dNTP,     2,0  mu g/ml Primer ACX, 4  mu g/ml Primer U2, 0,8 Attomol/ml TSU2, 2 Einheiten 50  mu l Taq-Polymerase (Perkin Elmer) und 2  mu g/ml [<3><2>P]5 min -endmarkierter Primer TS (3000 Ci/mMol).

   Die Röhrchen mit dem Reaktionsgemisch werden dann in den PCR-Thermocycler (MJ Research) gestellt und die PCR wird wie folgt durchgeführt: 60 Minuten bei 30 DEG C, 20 Cyclen von jeweils 30 Sekunden bei 94 DEG C, 30 Sekunden bei 60 DEG C und 30 Sekunden bei 72 DEG C, dann 1 Minute bei 72 DEG C und Abkühlen auf 10 DEG C. Der TRAP-Assay ist, wie bereits vorstehend erwähnt, in dem US-Patent Nr. 5 629 154 beschrieben. Die verwendeten Primer und Substrate haben die Sequenzen: 
EMI382.1
 
 



  Nach Beendigung des PCR-Schritts werden zu jedem Reaktionsröhrchen 4  mu l 10 x Bromphenolblau enthaltender Auftragspuffer zugegeben und die Produkte (20  mu l) auf einem 12,5%igen nicht-denaturierenden PAGE-Gel in 0,5 x TBE bei 400 V laufen gelassen. Nach Beendigung des Gellaufs wird das Gel getrocknet und die TRAP-Produkte werden mittels des "Phosphorimager" oder durch Autoradiographie sichtbar gemacht. Die Telomerase-Aktivität in Gegenwart der Testverbindung wird dadurch gemessen, dass der Einbau der Markierung in  das Reaktionsprodukt mit einer Parallelreaktion ohne das Agens verglichen wird. 



  Die folgenden in den Beispielen beschriebenen Clone wurden bei der American Type Culture Collection, Rockville, MD20852, USA hinterlegt. 
<tb><TABLE> Columns=2 
<tb><SEP>Lambda-Phage  lambda  25-1.1<SEP>ATCC-Zugangsnummer 209024
<tb><SEP>pGRN121<SEP>ATCC-Zugangsnummer 209016
<tb><SEP>Lambda-Phage  lambda G PHI 5<SEP>ATCC-Zugangsnummer 98505 
<tb></TABLE> 



  Diese Hinterlegungen unter dem Budapester Vertrag erfolgten für ATCC 209024 am 12. Mai 1997, für ATCC 209016 am 6. Mai 1997 und für ATCC 98505 am 14. August 1997. 



  Die vorliegende Erfindung stellt neue Verfahren und Substanzen zur Diagnose und der Behandlung von mit Telomerase in Zusammenhang stehenden Krankheiten bereit. Es wurden spezifische Beispiele bereitgestellt, die vorstehende Beschreibung dient jedoch nur zur Veranschaulichung und soll keine Einschränkung darstellen. Für den Fachmann sind nach Lesen der Beschreibung viele Variationsmöglichkeiten hinsichtlich der Erfindung offensichtlich. Der Umfang der Erfindung wird somit nicht durch die vorstehende Beschreibung bestimmt, sondern soll durch die nachstehenden Patentansprüche zusammen mit dem vollen Umfang ihrer Äquivalente bestimmt werden. 



  Alle in dieser Anmeldung zitierten Publikationen und Patentdokumente sind aufgrund der Bezugnahme und für alle Zwecke als Bestandteil der Beschreibung anzusehen und zwar in dem gleichen Ausmass als wenn jede einzelne Veröffentlichung oder jedes einzelne Patentdokument individuell bezeichnet worden wäre.