CH694588A5 - Menschliche intestinale Npt2B. - Google Patents

Description

  



   Das Gebiet der Erfindung betrifft Ionentransporter, insbesondere  Natriumphosphat-Co-Transporter.   Hintergrund der Erfindung   



   Phosphor spielt eine wichtige Rolle bei der Membranstruktur, dem  Transport und der Energiespeicherung. Bei dem normalen physiologischen  pH (z.B. pH von 7,4) besteht das anorganische Phosphat (Pi) im Plasma  aus einer 4:1-Mischung von HPO 4 <2-> und H 2 PO 4 <->. Von den im  Körper vorhandenen 700 g Phosphor sind 0,1% in der extrazellulären  Flüssigkeit in frei diffundierbarer Form vorhanden. Der Plasmagehalt  an Pi wird durch die Kontrolle der Pi-Absorption im Dünndarm, unter  dem Einfluss von Vitamin D, und die Pi-Ausscheidung in der Niere,  unter dem Einfluss des Hormons der Nebenschilddrüse, aufrechterhalten.                                                         



   Die Absorption von Pi erfordert einen transepithelialen Transport.  Eine kritische Stufe des transepithelialen Transports von Pi ist  die Aufnahme von Pi in Epithelzellen. Die Pi-Aufnahme wird durch  Natriumphosphat-Co-Transporter er   reicht, die auf der apikalen  Oberfläche der geeigneten Epithelzellen, z.B. Epithelzellen des Darms  und der Niere, vorhanden sind. Eine Mehrzahl von Natriumphosphat-Co-Transportern  wurde bis heute gefunden, einschliesslich: NaPi-1 (Kaninchen); NPT1  (Mensch); Npt1 (Maus); NaPi-2 (Ratte); NaPi-3 (Mensch); NaPi-4 (Opossum);  NaPi-5 (Flunder); NaPi-6 (Kaninchen); NaPi-7 (Maus) und NaPi von  NBL-1-Zellen (Rind). 



   Mehrere Krankheitszustände werden mit Störungen des Pi-Metabolismus  in Verbindung gebracht, wobei diese Krankheitszustände solche einschliessen,  die durch das Vorliegen einer Hypophosphat-ämie gekennzeichnet sind,  z.B. Osteomalazie, Hypokalziurie und Rachitis, und solche, die durch  das Vorliegen einer Hyperphosphatämie gekennzeichnet sind, z.B. Hyperparathyreoidismus,  Hypokalzämie, Vitamin-D-Mangel, Verkalkung von Weichgewebe oder metastatische  Verkalkung und dgl. Insbesondere ist Hyperphosphatämie ein Kennzeichen  für Nierenkrankheit und Nierenversagen und ist eine sehr vielen schädlichen  Symptomen, die bei solchen Nierenkomplikationen beobachtet werden,  zugrunde liegende Ursache. 



   Es gibt verschiedene Methoden, um Anomalien im Pi-Metabolismus zu  behandeln. Z.B. schliessen für Krankheitszustände, die mit dem Vorliegen  einer Hypophosphatämie verbunden sind, Behandlungsmethoden ein: Veränderungen  der Nahrung, indem phosphorreiche Nahrungsmittel zugefügt werden,  Ergänzung durch Phosphorsalze, Verwendung von therapeutischen Mitteln,  z.B. Dipyridamol und dgl. Für solche Krankheitszustände, die mit  Hyperphosphat-ämie verbunden sind, kann die Behandlung, falls keine  Niereninsuffizienz vorliegt, eine Hydratisierung und/oder die Verwendung  von Antacida auf Aluminiumbasis, die Phosphor im Darmlumen binden,  einschliessen. Wenn eine Niereninsuffizienz vorliegt, sind Phosphatbindemittel  und/oder Nahrungsmodifikationen, um die Phosphoraufnahme zu beschränken,  möglicherweise nützlich, aber typischerweise wird eine Dialyse angewendet.

                                                       



     Wegen der grossen Vielzahl von Krankheitszuständen, die durch  das Vorliegen eines anormalen Pi-Metabolismus gekennzeichnet sind,  besteht ein fortgesetztes Interesse an dem Auffinden von Molekülkomponenten,  die für den Pi-Metabolismus verantwortlich sind. Von besonderem Interesse  ist das Auffinden der intestinalen Transporter, die für die Absorption  und Aufnahme von Pi im Darm verantwortlich sind.   Relevante  Literatur  



   Hilfiker et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA (1998) 95:14564-14569  offenbart die Nucleinsäuresequenz von Npt2B der Maus. Von Interesse  ist auch: Feild et al., "Cloning and Characterization of a Sodium  Dependent Phosphate Transporter Isoform Expressed in Human Small  Intestine and Lung", veröffentlicht am 24. Dezember 1998 unter der  GenBank-Zugangsnummer 4071357 und vorgelegt von Smithkline Beecham  Pharmaceuticals, 709 Swedeland Road, King of Prussia, PA 19406 am  7. Dezember 1998). Literaturstellen, die Natriumphosphat-Co-Transporter  offenbaren, schliessen ein: Werner et al., Proc. Nat'l Acad. Sci.  USA (1991) 88: 9608-9612; Chong et al., Genomics (1993) 18:355-359;  Chong et al., Am. J. Physiol. (1995) 268: F1038-F1045; Magagnin et  al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA (1993) 90:5979-5983; Sorribas et  al., J. Biol. Chem. (1994) 269:6615-6621; Werner et al., Am. J. Physiol.

    (1995) 267:F311-F317; Verri et al., Am. J. Physiol. (1995) 268:F626-F633;  Collins et al., FASEB J. (1994) 8:862-868 und Helps et al., Eur.  J. Biochem. (1995) 228:927-930.  Von Interesse ist auch WO 98/37198.  



   Die Literaturstellen, die Hintergrundinformationen zur Rolle von  Natriumphosphat-Co-Transportern beim Phosphormetabolismus liefern,  schliessen ein: Tenenhouse, J. Bone Min. Res. (1997) 12:159 und Harrison's  Principles of Internal Medicine, 14. Ausgabe (1998) Seiten 2259-2263.                                                          



     Ein neuer menschlicher intestinaler Natriumphosphat-Co-Transporter  (d.h. Npt2B) und die damit verwandten Polypeptide ebenso wie Nucleinsäurezusammensetzungen,  die ihn codieren, werden bereitgestellt. Das vorliegende Polypeptid  und die Nucleinsäurezusammensetzungen finden Nutzen bei einer Vielzahl  von Anwendungen, einschliesslich Forschung, Diagnose und Screening  von therapeutischen Mitteln ebenso wie für Behandlungstherapien.  Es werden auch Methoden zur Behandlung von Krankheitszuständen bereitgestellt,  die mit der intestinalen Npt2B-Funktion verbunden sind, d.h. Zustände,  die durch anormale Serumphosphatpegel gekennzeichnet sind, z.B. Hypo-  und Hyperphosphatämie.      Fig. 1 liefert die Aminosäuresequenz  von menschlichem Npt2B.     Fig. 2 liefert die Sequenz einer Nucleinsäure,  die menschliches Npt2B codiert.    Detaillierte Beschreibung  der Erfindung  



   Ein neuer menschlicher intestinaler Natriumphosphat-Co-Transporter  (d.h. Npt2B) und damit verwandte Polypeptide ebenso wie Nucleinsäurezusammensetzungen,  die ihn codieren, werden bereitgestellt. Das vorliegende Peptid und/oder  die Nucleinsäurezusammensetzungen sind nützlich für eine Vielzahl  verschiedener Anwendungen, einschliesslich Forschung, Diagnose und  das Screening, die Entdeckung und die Herstellung von therapeutischen  Mitteln. Es werden auch Methoden zur Behandlung von Krankheitszuständen  bereitgestellt, die mit der intestinalen Npt2B-Funktion verbunden  sind, z.B. Zustände, die durch anormale Serumphosphatpegel entstehen,  z.B. Hypo- und Hyperphosphatämie. 



   Bevor die vorliegende Erfindung weiter beschrieben wird, wird darauf  verwiesen, dass die Erfindung nicht durch die speziellen Ausführungsformen  der Erfindung, die unten beschrieben    werden, beschränkt wird,  da Variationen der speziellen Ausführungsformen gemacht werden können  und noch im Schutzbereich der beigefügten Ansprüche liegen. Es ist  auch selbstverständlich, dass die angewendete Terminologie dem Zweck  dient, spezielle Ausführungsformen zu beschreiben und nicht als Beschränkung  anzusehen ist. Der Schutzbereich der vorliegenden Erfindung ergibt  sich aus den beigefügten Ansprüchen. 



   In dieser Beschreibung und den beigefügten Ansprüchen schliessen  die Singularformen "ein" und "der, die, das", die Pluralformen ein,  wenn der Zusammenhang nicht eindeutig dagegen spricht. Wenn nicht  anders angegeben, haben alle technischen und wissenschaftlichen Ausdrücke,  die hier verwendet werden, die gleiche Bedeutung, wie sie der Fachmann  auf diesem Gebiet, auf dem die Erfindung liegt, allgemein versteht.  Polypeptidzusammensetzungen  



   Ein neuer menschlicher Natriumphosphat-Co- Transporter, der in Darmepithelzellen  exprimiert wird, ebenso wie Polypeptidzusammensetzungen, die damit  verwandt sind, werden bereitgestellt. Der Ausdruck Polypeptidzusammensetzung,  wie er hier verwendet wird, bezieht sich sowohl auf ein menschliches  Protein voller Länge als auch Anteile oder Fragmente davon. Enthalten  in diesem Ausdruck sind Variationen des natürlich vorkommenden menschlichen  Proteins, wenn solche Variationen homolog sind oder dem natürlich  vorkommenden Protein im Wesentlichen gleich sind, wie unten im Detail  genauer beschrieben. In der folgenden Beschreibung der vorliegenden  Erfindung wird der Ausdruck Npt2B verwendet, um den Wildtyp des menschlichen  intestinalen Natriumphosphat-Co-Transporter-Moleküls der vorliegenden  Erfindung zu beschreiben. 



   Das Npt2B-Protein der vorliegenden Erfindung ist ein Membranprotein  mit einer Anzahl von Transmembranregionen, wobei die Anzahl der angenommenen  Transmembranregionen auf Basis der    Aminosäuresequenz 10 ist (vorhergesagt  unter Verwendung von TMpred (www.Ch.embnet.org) auf Basis von TMbase  (TMbase-A database of membrane spanning protein Segments. Biol. Chem.  Hoppe-Seyler 347, 166)). Npt2B ist ein Natriumphosphat-Co-Transporter  vom Typ II. In seiner nativen Umgebung ist Npt2B ein Co-Transporter  für Natriumkationen und Phosphatanionen. Npt2B wird unter anderem  auch an der Oberfläche von Darmepithelzellen exprimiert, d.h. auf  der apikalen oder intestinalen Luminalseite der Epithelzellen und  ist daher für den Transport von Natrium- und Phosphationen aus dem  Darmlumen in die Darmepithelzellen verantwortlich.

   Npt2B wird auch  in den Alveolen der Lunge vom Typ II exprimiert, wo es am Transport  von Phosphat in die Zellen beteiligt ist, um den erhöhten Bedarf  für die Mucin-Glycoprotein-Synthese zu erfüllen. Die Aminosäuresequenz  von Npt2B hat eine 23%ige Identität mit menschlichen NPT1, wie in  Chong et al., "Molecular cloning of the cDNA encoding a human renal  sodium phosphate transport protein and its assignment to chromosome  6p21.3-p23", Genomics (1993), 18:355-359 beschrieben, und eine 52,5%ige  Identität mit menschlichem Npt2a, wie in Maganin et al., "Expression  Cloning of Human and Rat Renal Cortex Na/Pi cotransport", Proc. Natl.  Acad. Sci. USA (1993), 90:5979-5983 beschrieben (gemessen mit MegAlign,  DNAstar (1998) unter Verwendung eines Cluster-Algorithmus, wie in  D.G.

   Higgins und P.M.Sharp: Fast and Sensitive multiple Sequence  Alignments on a Microcomputer (1989) -CABIOS, 5:151-153 beschrieben.  Die verwendeten Parameter sind ktuple 1, gpa penalty 3, window 5  und diagonals saved 5). Andere Npt2B-Eigenschaften schliessen ein:  Potentielle Glycosylierungsstellen an extrazellulären Schlingen. 



   Npt2B hat die in Fig. 1 gezeigte und mit SEQ ID Nr. 01 bezeichnete  Aminosäuresequenz. Npt2B hat ein Molekulargewicht auf Basis der Aminosäuresequenz  von etwa 75 kDa und genauer 75598,52 Dalton (bestimmt mit Protean/DNAstar  (1997) gemäss H. Nakashima et al., The Folding Type of a pProetin  ist Related    to the Amino Acid Composition. J. Biochem (Tokio)  99:153-162). Das genaue Molekulargewicht von Npt2B kann variieren  aufgrund der Glycosylierung und/oder anderer posttranslationaler  Modifikationen. Das tatsächliche Molekulargewicht von Npt2B liegt  wahrscheinlich im Bereich von etwa 70 bis 130 kDa. 



   Npt2B-Homologe oder Proteine (oder Fragmente davon), deren Sequenz  gegenüber der Wildtyp-Sequenz der vorliegenden Erfindung verändert  ist, werden auch bereitgestellt. Unter homolog wird ein Protein verstanden  mit mindestens etwa 35%, gewöhnlich mindestens etwa 40% und üblicher  mindestens etwa 60% Aminosäuresequenzidentität mit dem Npt2B-Protein  der vorliegenden Erfindung (unter Verwendung von MegAlign, DNAstar  (1998) unter Verwendung des Cluster-Algorithmus, wie von D.G. Higgins  und P.M. Sharp: Fast and Sensitive multiple Sequence Alignments on  a Microcomputer. (1989) CABIOS, 5:151-153 beschrieben. Die verwendeten  Parameter sind: ktuple 1, gpa penalty 3, window 5 und diagonals saved  5). 



   Es werden auch Npt2B-Proteine bereitgestellt, die im Wesentlichen  mit dem menschlichen Npt2B-Protein identisch sind, wobei im Wesentlichen  identisch bedeutet, dass das Protein eine Aminosäuresequenz hat,  die mit der Sequenz von Npt2B zu mindestens etwa 60%, gewöhnlich  mindestens etwa 65% und üblicher mindestens etwa 70% identisch ist.                                                            



   Die Proteine der vorliegenden Erfindung sind in einer nicht natürlich  vorkommenden Umgebung vorhanden, z.B. liegen sie abgetrennt aus ihrer  natürlich vorkommenden Umgebung vor. In bestimmten Ausführungsformen  sind die vorliegenden Proteine in einer Zusammensetzung vorhanden,  die mit dem jeweiligen Protein angereichert ist, verglichen mit der  natürlich vorkommenden Umgebung. Z.B. wird gereinigtes Npt2B bereitgestellt,  wobei gereinigt bedeutet, dass Npt2B in einer Zusammensetzung vorhanden  ist, die im Wesentlichen frei ist von    Nicht-Npt2B-Proteinen, wobei  im Wesentlichen frei bedeutet, dass weniger als 90%, gewöhnlich weniger  als 60% und üblicher weniger als 50% der Zusammensetzung aus Nicht-Npt2B-Proteinen  bestehen.

   Die Proteine der vorliegenden Erfindung können auch als  Isolat vorliegen, worunter verstanden wird, dass das Protein im Wesentlichen  frei ist von anderen Proteinen und anderen natürlich vorkommenden  biologischen Molekülen, z.B. Oligosacchariden, Polynucleotiden und  Fragmenten davon, und dgl., wobei der Ausdruck "im Wesentlichen frei"  in diesem Fall bedeutet, dass weniger als 70%, üblicher weniger als  60% und noch üblicher weniger als 50% der Zusammensetzung, die das  isolierte Protein enthält, aus anderen natürlich vorkommenden biologischen  Molekülen besteht. In bestimmten Ausführungsformen sind die Proteine  in im Wesentlichen reiner Form vorhanden, wobei unter "im Wesentlichen  reiner Form" verstanden wird, dass sie mindestens 95%, gewöhnlich  mindestens 97% und üblicher mindestens 99% rein ist. 



   Zusätzlich zu den natürlich vorkommenden Proteinen werden auch Polypeptide  bereitgestellt, die sich von den natürlich vorkommenden Proteinen  unterscheiden, z.B. Npt2B-Polypeptide. Unter Npt2B-Polypeptid wird  eine Aminosäuresequenz verstanden, die von einem offenen Leserahmen  (ORF) des Npt2B codierenden Gens codiert wird, das im Detail unten  genauer beschrieben wird, das das Npt2B-Protein vollständiger Länge  und Fragmente davon einschliesst, insbesondere biologisch aktive  Fragmente und/oder Fragmente, die funktionellen Domänen entsprechen,  z.B. der Transmembrandomäne und dgl.; und einschliesslich Fusionen  der jeweiligen Polypeptide mit anderen Proteinen oder Teilen davon.

    Die interessierenden Fragmente haben typischerweise eine Länge von  mindestens etwa 10 aa, gewöhnlich  : mindestens etwa 50 aa und können  300 aa lang sein oder länger, überschreiten gewöhnlich aber eine  Länge von etwa 1000 aa nicht, wobei das Fragment einen Strang von  Aminosäuren hat, der identisch ist mit dem vorliegenden Protein    über mindestens etwa 10 aa und gewöhnlich mindestens etwa 15 aa  und in vielen Ausführungen mindestens etwa 50 aa. 



   Die vorliegenden Proteine und Polypeptide können aus natürlich vorkommenden  Quellen erhalten werden oder synthetisch hergestellt werden. Z.B.  stammt Npt2B allgemein aus Epithelzellen des Darms, kann aber auch  aus anderen Zellarten oder Geweben, in denen eine Expression von  Npt2B nachgewiesen wurde, z.B. der Lunge etc., stammen. Die vorliegenden  Proteine können auch durch Synthese entstanden sein, z.B. durch Expression  eines rekombinanten Gens, das das interessierende Protein in einem  geeigneten Wirt codiert, wie unten im Detail genauer beschrieben.  Alle üblichen Proteinreinigungsverfahren können angewendet werden,  wobei eine geeignete Proteinreinigungsmethodik im Guide to Protein  Purrfication (Deuthser ed.) (Academic Press, 1990) beschrieben wird.

    Z.B. kann ein Lysat aus der ursprünglichen Quelle, z.B. intestinalen  Epithelzellen oder dem Expressionswirt, hergestellt werden und unter  Verwendung von HPLC, Ausschlusschromatographie, Gelelektrophorese,  Affinitätschromatographie und dgl. gereinigt werden.   Nucleinsäurezusammensetzungen  



   Es werden auch Nucleinsäurezusammensetzungen bereitgestellt, die  Npt2B-Proteine oder Fragmente davon codieren, ebenso wie Npt2B-Homologe  der vorliegenden Erfindung. Unter einer Npt2B-Nucleinsäurezusammensetzung  wird eine Zusammensetzung verstanden, die eine DNA-Sequenz umfasst  mit einem offenen Leserahmen, der Npt2B codiert, d.h. ein Npt2B-Gen,  und unter geeigneten Bedingungen Npt2B exprimieren kann. In diesem  Ausdruck enthalten sind auch Nucleinsäuren, die mit Nucleinsäuren,  die Npt2B-Proteine codieren, homolog oder im Wesentlichen gleich  oder identisch sind. Somit liefert die vorliegende Erfindung- Gene,  die menschliches Npt2B der vorliegenden Erfindung und Homologe davon  codieren. Das menschliche Npt2B-   Gen hat die in Fig. 2 gezeigte  Nucleinsäuresequenz, die als SEQ ID Nr. 02 angegeben ist. 



   Die Quelle für homologe Gene kann irgendeine Art sein, z.B. eine  Primatenart, insbesondere Mensch; Nagetier, z.B. Ratten und Mäuse,  Hunde, Katzen, Rinder, Schafe, Pferde, Hefen, Nematoden etc. Zwischen  Säugetierarten, z.B. Mensch und Maus, haben Homologe im Wesentlichen  Sequenzgleichheit, z.B. mindestens 75% Sequenzidentität, gewöhnlich  mindestens 90%, üblicher mindestens 95% zwischen den Nucleotidsequenzen.  Die Sequenzgleichheit wird berechnet auf Basis einer Referenzsequenz,  die eine Untergruppe einer grösseren Sequenz sein kann, z.B. ein  konserviertes Stück, ein codierender Bereich, eine flankierende Region  etc. Eine Referenzsequenz hat gewöhnlich eine Länge von mindestens  etwa 18 nt, gewöhnlich mindestens etwa 30 nt und kann sich über die  vollständige Sequenz, mit der sie verglichen werden soll, erstrecken.

    Algorithmen zur Sequenzanalyse sind im Stand der Technik bekannt,  z.B. BLAST, das von Altschul et al. (1990), J. Mol. Biol. 215:403-10  (Verwendung von Standard-Einstellungen) beschrieben wird. Die hier  angegebenen Sequenzen sind wichtig, um Npt2B-verwandte und homologe  Proteine und die diese codierenden Nucleinsäuren bei Recherchen in  Databanken zu erkennen. 



   Nucleinsäuren, die das Npt2B-Protein und Npt2B- Polypeptide der vorliegenden  Erfindung codieren, können cDNA oder genomische DNA oder ein Fragment  davon sein. Der Ausdruck "Npt2B-Gen" soll sowohl den offenen Leserahmen,  der spezifische Npt2B-Proteine und Polypeptide und Npt2B-Introns  codiert, ebenso wie 5'- und 3'-benachbarte nicht codierenden Nucleotidsequenzen,  die an der Regulation der Expression beteiligt sind, bis zu etwa  20 kb nach der codierenden Region und möglicherweise noch weiter  in jeder Richtung, einschliessen. Das Gen kann in einen geeigneten  Vektor eingebaut werden für die extrachromosomale Erhaltung oder  für die Integration in ein Wirtsgenom. 



     Der Ausdruck "cDNA", wie er hier verwendet wird, soll alle Nucleinsäure  einschliessen, die die Anordnung der Sequenzelemente teilen, die  in nativen reifen mRNA-Arten gefunden werden, wobei die Sequenzelemente  Exons und 5'- und 3'- nicht codierende Regionen sind. Normalerweise  haben mRNA-Moleküle aneinander grenzende Exons, wobei die dazwischen  liegenden Introns, falls vorhanden, durch Kern-RNA-Spleissen entfernt  werden, um einen kontinuierlichen offenen Leserahmen zu erzeugen,  der ein Npt2B-Protein codiert. 



   Eine interessierende Genomsequenz umfasst die Nucleinsäure, die zwischen  dem Startcodon und dem Stopcodon vorhanden ist, wie in den aufgeführten  Sequenzen definiert, einschliesslich aller Introns, die normalerweise  in einem nativen Chromosom vorhanden sind. Sie kann weiterhin 5'-  und 3'-untranslatierte Regionen, die sich in reifer nRNA finden,  enthalten. Sie kann weiterhin spezifische Transkriptions- und Translations-Steuersequenzen  enthalten, z.B. Promotoren, Enhancer etc., was etwa 1 kb, möglicherweise  aber mehr, an flankierender genomischer DNA am 5'- oder 3'-Ende der  transkribierten Region einschliesst. Die genomische DNA kann als  Fragment mit 100 kbp oder weniger isoliert werden und im Wesentlichen  frei von flankierenden chromosomalen Sequenzen sein.

   Die genomische  DNA, die den codierenden Bereich flankiert, sowohl 3' als auch 5',  oder interne Steuersequenzen, wie sie manchmal in Introns gefunden  werden, enthält Sequenzen, die für die richtige gewebe- und stufenspezifische  Expression erforderlich sind. 



   Die Nucleinsäurezusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können  das gesamte vorliegende Npt2B-Protein oder einen Teil davon codieren.  Doppel- oder einzelsträngige Fragmente können aus der DNA-Sequenz  erhalten werden, indem Oligonucleotide nach üblichen Methoden chemisch  synthetisiert werden, z.B. durch Verdau mit Restriktionsenzymen,  durch PCR-Amplifikation etc. Meistenteils haben die DNA-Fragmente  mindestens 15 nt,    gewöhnlich mindestens 18 nt oder 25 nt und können  mindestens etwa 50 nt aufweisen. 



   Die Npt2B-Gene werden isoliert und in erheblicher Reinheit erhalten,  im Wesentlichen anders als bei einem intakten Chromosom. Gewöhnlich  wird die DNA im Wesentlichen frei von anderen Nucleinsäuresequenzen,  die keine Npt2B-Sequenz oder ein Fragment davon einschliessen, erhalten,  wobei sie mindestens etwa 50%, gewöhnlich mindestens etwa 90% rein  sind und typischerweise "rekombinant" ist, d.h. flankiert von einem  oder mehreren Nucleotiden, mit denen sie auf einem natürlich vorkommenden  Chromosom nicht verbunden ist. 



   Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein  Npt2B-Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die im Wesentlichen  mit der Sequenz von SEQ ID Nr. 01 identisch, insbesondere mindestens  zu 90% identisch ist. 



   Weiterhin ist auch das obige Npt2B-Polypeptid mit der Aminosäuresequenz  von SEQ ID Nr. 01 bevorzugt. 



   Ein weiterer bevorzugter Aspekt der Erfindung ist ein Protein oder  Polypeptid wie vorher mit einer Natriumphosphat-Co-Transport-Aktivität.                                                        



   Bevorzugt ist auch ein Fragment des oben beschriebenen Npt2B-Polypeptids.                                                      



   Ein weiterer bevorzugter Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine  Nucleinsäure, die ein Protein oder Polypeptid, wie oben beschrieben,  codiert, insbesondere ein solches, bei dem die Nucleinsäure eine  Nucleinsäuresequenz hat, die im Wesentlichen identisch ist mit der  Nucleotidsequenz von SEQ ID Nr. 02. Bevorzugt ist auch ein Fragment  dieser Nucleinsäure. 



     Ein weiterer bevorzugter Aspekt ist eine isolierte Nucleinsäure  oder eine nachahmende Nucleinsäure, die unter stringenten Bedingungen  mit der Nucleinsäure, die vorher erwähnt wurde, oder ihrer komplementären  Sequenz, hybridisiert. 



   Ein weiterer bevorzugter Aspekt ist eine Expressionskassette mit  einer Startregion für die Transkription, die in einem Expressionswirt  funktionell ist, einer Nucleinsäure mit einer Nucleotidsequenz, die  in der vorher beschriebenen Nucleinsäure aufgefunden wird, unter  der Transkriptionsregulation der Startregion der Transkription und  eine Endregion für die Transkription, die in dem Expressionswirt  funktionell ist. Besonders bevorzugt ist eine Zelle mit einer Expressionskassette,  wie vorher, als Teil eines extrachromosomalen Elementes oder integriert  in das Genom einer Wirtszelle als Ergebnis der Einführung der Expressionskassette  in die Wirtszelle. Besonders bevorzugt sind auch die Zellnachkommen  der Wirtszelle, wie oben beschrieben. 



   Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung  ist ein Verfahren zur Herstellung von Npt2B, wobei das Verfahren  umfasst, dass man eine Zelle, wie oben beschrieben, züchtet, wobei  Npt2B exprimiert wird, und Npt2B im Wesentlichen frei von anderen  Proteinen isoliert. 



   Bevorzugt ist auch ein monoklonaler Antikörper, der spezifisch an  Npt2B bindet, insbesondere ein Antikörper, bei dem der Antikörper  die Npt2B-Aktivität hemmt und besonders bevorzugt ist der monoklonale  Antikörper, bei dem der Antikörper ein humanisierter Antikörper ist.                                                           



   Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren  zur Modulation von Npt2B bei einem Wirt, wobei das Verfahren umfasst,  dass man eine wirksame Menge eines Npt2B-modulierenden Mittels dem  Wirt verabreicht, bevorzugt, wenn    das modulierende Mittel ein  kleines Molekül ist, und insbesondere, wenn das modulierende Mittel  ein Antikörper ist. 



   Bevorzugt ist auch die Verwendung eines Npt2B-modulierenden Mittels  zur Herstellung eines Arzneimittels zur Modulation von Npt2B in einem  Wirt. 



   Ein Verfahren zum Screenen, um Npt2B-modulierende Mittel aufzufinden,  ist ein weiterer bevorzugter Aspekt, wobei das Verfahren umfasst,  dass man eine Zelle, die funktionelles Npt2B an ihrer Oberfläche  exprimiert, mit einem in Betracht kommenden Mittel in Gegenwart von  Phosphoranionen in Kontakt bringt und die Menge der Phosphoranionenaufnahme  durch die Zelle bestimmt. Besonders bevorzugt ist ein Verfahren,  bei dem das Phosphoranion mit einer nachweisbaren Markierung markiert  ist und insbesondere, wenn die Markierung ein Isotop ist. 



   Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung  ist ein nicht menschliches transgenes Tiermodell, das Npt2B-exprimieren  kann. 



   Ausserdem ist die Verwendung eines Proteins oder Polypeptids, wie  vorher definiert, zum Screenen von Npt2B-modulierenden Mitteln bevorzugt.                                                      



   Ein weiterer bevorzugter Aspekt der Erfindung ist die Verwendung  eines Npt2B-modulierenden Mittels zur Herstellung eines Arzneimittels  zur Behandlung eines Wirts, der unter einem Krankheitszustand leidet,  der mit einer Npt2B-Aktivität verbunden ist. 



   Bevorzugt ist auch ein Verfahren zur Behandlung eines Wirts, der  unter einem Krankheitszustand leidet, der mit der Npt2B-Aktivität  verbunden ist, wobei das Verfahren umfasst, dass man dem Wirt ein  Npt2B-modulierendes Mittel verabreicht, bevorzugt wenn das Npt2B-modulierende  Mittel ein Npt2B-Agonist    ist, insbesondere bevorzugt, wenn das  Npt2B-modulierende Mittel ein Npt2B-Antagonist ist. Sehr bevorzugt  ist das obige Verfahren, wenn der Krankheitszustand durch das Vorliegen  einer Hyperphosphatämie gekennzeichnet ist.   Herstellung von  Npt2B-Polypeptiden  



   Zusätzlich zu der Vielzahl von Anwendungen, die genauer in den folgenden  Abschnitten beschrieben werden, finden die vorliegenden Nucleinsäurezusammensetzungen  Anwendung zur Herstellung der vollständigen Npt2B-Polypeptide oder  eines Teils davon, wie oben beschrieben. Zur Expression kann eine  Expressionskassette angewendet werden. Der Expressionsvektor liefert  eine Startregion für Transkription und Translation, die induzierbar  oder konstitutiv sein kann, wobei die codierende Region operativ  verbunden ist. unter der Transkriptionskontrolle der Transkriptionsstartregion  und einer Transkriptions- und Translationsendregion. Diese Kontrollregionen  können nativ zu dem Npt2B-Gen gehören oder können aus exogenen Quellen  stammen. 



   Expressionsvektoren haben im Allgemeinen übliche Restriktionsstellen,  die in der Nähe der Promotorsequenz angeordnet sind, zum Einsetzen  der Nucleinsäuresequenzen, die heterologe Proteine codieren. Ein  selektierbarer Marker, der in dem Expressionswirt wirksam ist, kann  vorhanden sein. Expressionsvektoren können zur Herstellung von Fusionsproteinen  verwendet werden, wobei das exogene Fusionspeptid weitere Funktionalität  liefern kann, z.B. erhöhte Proteinsynthese, Stabilität Reaktivität  mit definierten Antiserien, einen Enzymmarker, z.B.  beta -Galactosidase  etc. 



   Expressionskassetten können hergestellt werden mit einer Transkriptionsstartregion,  dem Gen oder einem Fragment davon und einer Transkriptionsendregion.  Von besonderem Interesse ist die Verwendung von Sequenzen, die die  Expression funktioneller    Epitope oder Domänen zulassen, die gewöhnlich  eine Länge von mindestens 8 Aminosäuren, üblicher mindestens etwa  15 Aminosäuren bis etwa 25 Aminosäuren und bis zum vollständigen  offenen Leserahmen des Gens haben. Nach Einführung der DNA können  Zellen, die das Konstrukt enthalten, mit Hilfe selektierbarer Marker  selektiert werden, die Zellen expandiert werden und dann zur Expression  verwendet werden. 



   Npt2B-Proteine und Polypeptide können in Prokaryoten oder Eukaryoten  auf konventionelle Weise exprimiert werden, abhängig vom Zweck der  Expression. Für eine Produktion des Proteins in grossem Massstab  können einzellige Organismen, z.B. E. coli, B. subtilis, S. cerevisiae,  Insektenzellen in Kombination mit Baculovirusvektoren oder Zellen  höherer Organismen, z.B. Wirbeltiere, insbesondere Säugetiere, z.B.  COS-7-Zellen, HEK 293, CHO, Xenopus Oocytes etc. als Wirtszellen  für die Expression verwendet werden. In einigen Situationen ist es  wünschenswert, das Npt2B-Gen in eukaryotischen Zellen zu exprimieren,  wo das Npt2B-Protein die native Faltung und die posttranslationalen  Modifikationen erfährt. Kleine Peptide können auch im Labor synthetisiert  werden.

   Polypeptide, die Unterabschnitte der vollständigen Npt2B-Sequenz  sind, können verwendet werden, um Teile des Proteins, die wichtig  für seine Funktion sind, festzustellen und zu untersuchen.    Verwendung des vorliegenden Npt2B-Polypeptids und der Nucleinsäurezusammensetzungen  



   Das vorliegende Polypeptid und die Nucleinsäurezusammensetzungen  finden für eine Vielzahl von verschiedenen Anwendungen Nutzen, einschliesslich  Forschung, Diagnose und das Screenen, das Auffinden und die Herstellung  von therapeutischen Mitteln, ebenso wie in therapeutischen Zusammensetzungen  und Verfahren zur Anwendung derselben.    Forschungsanwendungen  



   Die vorliegenden Nucleinsäurezusammensetzungen sind nützlich für  eine Vielzahl von Forschungsanwendungen. Forschungsanwendungen von  Interesse schliessen ein: die Identifizierung von Npt2B-Homologen,  als Quelle neuer Promotorelemente, die Identifizierung von die Npt2B-Expression  regulierenden Faktoren, als Sonden und Primer in Hybridisierungsanwendungen,  z.B. PCR; die Identifikation von Expressionsmustern in biologischen  Proben, die Herstellung von Zell- oder Tiermodellen für die Npt2B-Funktion,  die Herstellung von in-vitro-Modellen für die Npt2B-Funktion etc.                                                              



   Homologe von Npt2B werden mit einer Anzahl von Methoden nachgewiesen.  Ein Fragment der bereitgestellten cDNA kann als Hybridisierungssonde  für eine cDNA-Bibliothek des interessierenden Zielorganismus verwendet  werden, wobei niedrigstringente Bedingungen verwendet werden. Die  Sonde kann ein grosses Fragment sein oder es können ein oder mehrere  kurze degenerierte Primer sein. Nucleinsäuren mit einer Sequenzähnlichkeit  werden durch Hybridisierung unter wenig stringenten Bedingungen nachgewiesen,  z.B. über 50 DEG C und 6  x  SSC (0,9 M Natriumchlorid/0,09 M Natriumnitrat)  und bleiben gebunden, wenn sie einem Waschen bei 55 DEG C in 1  x  SSC (0,15 M Natriumchlorid/0,015 M Natriumnitrat) unterzogen werden.                                                          



   Die Sequenzidentität kann durch Hybridisierung unter stringenten  Bedingungen bestimmt werden, z.B. bei 50 DEG C oder mehr und 0,1  x  SSC (15 mM Natriumchlorid/0,15 mM Natriumcitrat). Nucleinsäuren  mit einem Bereich, der im Wesentlichen identisch ist mit den bereitgestellten  Npt2B-Sequenzen, z.B. allele Varianten, genetisch veränderte Versionen  des Gens etc., binden an die bereitgestellten Npt2B-Sequenzen unter  stringenten Hybridisierungsbedingungen. Unter Verwendung von Sonden,  insbesondere markierten Sonden von DNA-Sequenzen, kann man homologe  oder verwandte Gene isolieren. 



     Die Sequenz 5'-flankierenden Region kann für Promotorelemente  einschliesslich Enhancerbindungsstellen, verwendet werden, die für  die Entwicklungssteuerung in Geweben sorgen, wo Npt2B exprimiert  wird. Die gewebespezifische Expression ist nützlich, um das Expressionsmuster  zu bestimmen und um Promotoren bereitzustellen, die das native Expressionsmuster  nachahmen. Natürlich vorkommende Polymorphismen im Promotorbereich  sind nützlich, um natürliche Variationen der Expression zu bestimmen,  insbesondere solche, die mit einer Krankheit verbunden sind. 



   Alternativ können Mutationen in dem Promotorbereich erzeugt werden,  um die Wirkung der Veränderung der Expression in experimentell definierten  Systemen zu bestimmen. Methoden zum Nachweis spezifischer DNA-Abschnitte,  die an der Bildung von Transkriptionsfaktoren beteiligt sind, sind  im Stand der Technik bekannt, z.B. Sequenzgleichheit mit bekannten  Bindungsabschnitten, Gelverzögerungsuntersuchungen etc. Siehe z.B.  Blackwell et al. (1995), Mol. Med. 1:194-205; Mortlock et al. (1996),  Genome Res. 6:327-33 und Joulin und Richard-Foy (1995), Eur. J. Biochem.  232:620-626. 



   Die regulatorischen Sequenzen können verwendet werden, um cis-wirkende  Sequenzen nachzuweisen, die für die transkriptionale oder translationale  Regulation der Npt2B-Genexpression erforderlich sind, insbesondere  in verschiedenen Geweben oder Entwicklungsstufen, und um cis-wirkende  Sequenzen und trans-wirkende Faktoren nachzuweisen, die die Npt2B-Expression  steuern oder vermitteln. Solche die Transkription oder die Translation  kontrollierenden Regionen können operativ verbunden sein mit einem  Npt2B-Gen, um die Expression von Wildtyp- oder verändertem Npt2B  oder anderen interessierenden Proteinen in Kulturzellen oder in Embryo-,  fötalen oder ausgewachsenen Geweben und für die Gentherapie zu fördern.                                                        



     Kleine DNA-Fragmente sind geeignet als Primer für die PCR, als  Hybridisierungs-Screeningsonden etc. Grössere DNA-Fragmente, d.h.  mit mehr als 100 nt sind geeignet zur Herstellung des codierten Polypeptids,  wie im vorherigen Abschnitt beschrieben. Zur Verwendung für geometrische  Amplifikationsreaktionen, z.B. geometrische PCR, wird ein Paar von  Primern verwendet. Die genaue Zusammensetzung der Primersequenzen  ist nicht kritisch für die Erfindung, aber für die meisten Anwendungen  hybridisieren die Primer mit der vorliegenden Sequenz unter stringenten  Bedingungen, wie im Stand der Technik bekannt. Es ist bevorzugt,  ein Paar von Primern auszuwählen, die ein Amplifikationsprodukt mit  mindestens etwa 50 nt, bevorzugt mindestens etwa 100 nt erzeugen.

    Algorithmen zur Auswahl von Primersequenzen sind allgemein bekannt  und in kommerziell erhältlichen Softwarepaketen verfügbar. Amplifikationsprimer  hybridisieren mit komplementären Strängen von DNA und primen sich  gegenseitig. 



   Die DNA kann auch verwendet werden, um die Expression des Gens in  einer biologischen Probe nachzuweisen. Die Art und Weise, in der  Zellen auf die Gegenwart spezieller Nucleotidsequenzen untersucht  werden, z.B. genomische DNA oder RNA, ist in der Literatur gut beschrieben.  Kurz gesagt wird DNA oder mRNA aus einer Zellprobe isoliert. Die  mRNA kann mit RT-PCR amplifiziert werden, unter Verwendung von reverser  Transkriptase, um einen komplementären DNA-Strang zu bilden, gefolgt  von einer Amplifikation durch Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung  von Primern, die für die jeweilige DNA-Sequenz spezifisch sind. Alternativ  wird die mRNA-Probe durch Gelelektrophorese abgetrennt, auf einen  geeigneten Träger überführt z.B. Nitrocellulose, Nylon etc., und  dann mit einem Fragment der jeweiligen DNA als Sonde untersucht.  Andere Techniken, z.B.

   Oligonucleotidligierungsassays, in-situ-Hybridisierungen  und die Hybridisierung mit DNA-Sonden, die auf einem festen Chip  angeordnet sind, finden auch Anwendung. 



     Der Nachweis von mRNA, die mit der jeweiligen Sequenz hybridisiert,  auf eine Npt2B-Genexpression in der Probe hin. 



   Die Sequenz eines Npt2B-Gens einschliesslich der flankierenden Promotorregionen  und der codierenden Regionen kann auf verschiedenen Wegen mutiert  werden, wie es im Stand der Technik bekannt ist, um vorgegebene Veränderungen  der Promotorstärke, der Sequenz des codierten Proteins etc. zu erzeugen.  Die DNA-Sequenz oder das Proteinprodukt einer solchen Mutation wird  gewöhnlich den hier bereitgestellten Sequenzen im Wesentlichen gleich  sein, d.h. unterscheidet sich durch mindestens ein Nucleotid bzw.  eine Aminosäure und kann sich um mindestens zwei aber nicht mehr  als etwa zehn Nucleotide oder Aminosäuren unterscheiden. Die Sequenzveränderungen  können Substitutionen, Insertionen, Deletionen oder eine Kombination  davon sein. Deletionen können weiterhin grössere Veränderungen einschliessen,  z.B. Deletionen einer Domäne oder eines Exons.

   Andere interessierende  Modifikationen schliessen eine Epitopmarkierung, z.B. mit dem FLAG-System,  HA etc. ein. Für Untersuchungen von subzellulären Lokalisationen  können Fusionsproteine mit grün fluoreszierenden Proteinen (GFP)  verwendet werden. 



   Techniken zur in-vitro-Mutagenese von klonierten Genen sind bekannt.  Beispiele für Protokolle für eine punktspezifische Mutagenese finden  sich in Gustin et al. (1993), Biotechniques 14:22; Barany (1985),  Gene 37:111-23; Colicelli et al. (1985), Mol. Gen. Genet. 199:537-9  und Prentki et al. (1984), Gene 29:303-13. Methoden zur punktspezifischen  Mutation finden sich in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory  Manual, CSH Press 1989, Seiten 15.3-15.108; Weiner et al. (1993),  Gene 126:35-41; Sayers et al. (1992), Biotechniques 13:592-6; Jones  und Winistorfer (1992), Biotechniques 12:528-30; Barton et al. (1990),  Nucleic Acids Res. 18:7349-55; Marotti und Tomich (1989), Gene Anal.  Tech. 6:67-70 und Zhu (1989), Anal. Biochem. 177:120-4.

   Solche mutierten  Gene können    verwendet werden, um Beziehungen zwischen Struktur  und Funktion von Npt2B zu untersuchen oder die Eigenschaften des  Proteins zu verändern, die die Funktion oder Regulation beeinflussen.                                                          



   Die vorliegenden Nucleinsäuren können verwendet werden, um transgene,  nicht menschliche Tiere zu erzeugen oder punktspezifische Genmodifikationen  in Zelllinien. Transgene Tiere können durch homologe Rekombination  erzeugt werden, wobei der endogene Npt2B-Locus verändert wird. Alternativ  kann ein Nucleinsäurekonstrukt statistisch in das Genom integriert  werden. Vektoren für eine stabile Integration schliessen Plasmide,  Retroviren und andere Tierviren, YACs und dgl. ein. 



   Die modifizierten Zellen oder Tiere sind geeignet zur Untersuchung  der Npt2B-Funktion und der Regulation. Von Interesse ist die Verwendung  von Npt2B-Genen, um transgene Tiermodelle für mit Npt2B in Beziehung  stehenden Krankheitszustände zu entwickeln, z.B. Hyper- oder Hypophosphatämie.  So schliessen transgene Tiermodelle der vorliegenden Erfindung endogene  Npt2B-Knockouts, bei denen die Expression von endogenem Npt2B zumindest  vermindert ist, wenn nicht ganz ausgeschaltet ist, ein, wobei diese  Tiere typischerweise auch ein Npt2B-Peptid der vorliegenden Erfindung  exprimieren, z.B. das Npt2B-Protein der vorliegenden Erfindung oder  ein Fragment davon. Wenn eine Nucleinsäure mit einer Sequenz, wie  sie im menschlichen Npt2B-Gen gefunden wird, eingeführt wird, kann  die eingeführte Nucleinsäure entweder eine vollständige oder teilweise  Sequenz des Npt2B-Gens sein.

   Ein nachweisbarer Marker, z.B. lac Z  kann in den Npt2B-Ort eingeführt werden, wobei die verstärkte Regulation  der Npt2B-Expression zu einer leicht nachweisbaren Veränderung des  Phänotyps führt. Es kann auch für die Expression des Npt2B-Gens oder  von Varianten davon in Zellen oder Geweben gesorgt werden, wo dieses  Gen normalerweise nicht exprimiert wird, in Anteilen, die normalerweise  in solchen Zellen oder Geweben nicht vorhanden sind. 



     DNA-Konstrukte für die homologe Rekombination umfassen mindestens  einen Teil des Npt2B-Gens der vorliegenden Erfindung, wobei das Gen  die gewünschte genetische Modifikation/die gewünschten genetischen  Modifikationen aufweist und Regionen mit Homologie zu dem Ziellocus  aufweist. DNA-Konstrukte für eine statistische Integration müssen  keine Homologiebereiche enthalten, um eine Rekombination zu ermöglichen.  Geeigneterweise sind Marker für positive und negative Selektion enthalten.  Methoden, um Zellen mit gezielten Genmodifikationen durch homologe  Rekombination zu erzeugen, sind im Stand der Technik bekannt. Bezüglich  verschiedener Techniken zur Transfektion von Säugetierzellen siehe  Keown et al. (1990), Meth. Enzymol. 185:527-537. 



   Für Embryostamm-(ES)-Zellen kann eine ES-Zelllinie angewendet werden  oder Embryonenzellen können frisch von einem Wirt, z.B. Maus, Ratte,  Meerschweinchen etc. erhalten werden. Solche Zellen werden in einer  geeigneten Fibroblast-Feeder-Schicht gezüchtet oder in Gegenwart  von Leukämie-hemmendem Faktor (LIF) gezüchtet. Wenn ES- oder Embryonenzellen  transformiert wurden, können sie verwendet werden, um transgene Tiere  zu erzeugen. Nach der Transformation werden die Zellen auf einer  Feeder-Schicht in einem geeigneten Medium ausplattiert. Zellen, die  das Konstrukt enthalten, können unter Anwendung eines selektiven  Mediums nachgewiesen werden. Nach einem Zeitraum, der ausreicht,  damit Kolonien wachsen können, werden sie abgenommen und auf das  Auftreten einer homologen Rekombination oder einer Integration des  Konstrukts untersucht.

   Solche Kolonien, die positiv sind, können  dann für die Embryomanipulation und die Blastozysten-Injektion verwendet  werden. Blastozysten werden von 4 bis 6 Wochen alten weiblichen Mäusen  mit Superovulation erhalten. Die ES-Zellen werden trypsinisiert und  die modifizierten Zellen werden in das Blastozoel des Blastozysten  injiziert. Nach der Injektion werden die Blastozysten in das Uterushorn  von pseudoschwangeren weiblichen Tieren eingeführt. Man lässt dann  die weiblichen    Tiere bis zum Termin kommen und der entstehende  Nachwuchs wird auf das Konstrukt gescreent. Indem ein anderer Phänotyp  des Blastozysten und der genetisch veränderten Zellen vorgesehen  wird, können die chimären Nachkommen leicht nachgewiesen werden. 



   Die chimären Tiere werden auf die Gegenwart des modifizierten Gens  gescreent und männliche und weibliche Tiere mit der Modifikation  werden zu Paarungspartnern gemacht, um homozygote Nachkommen zu erzeugen.  Wenn die Genveränderungen zu irgendeinem Entwicklungszeitpunkt Letalität  verursachen, können Gewebe, oder Organe als allogene oder kongene  Transplantate oder in in-vitro-Kultur aufrechterhalten werden. Die  transgenen Tiere können irgendwelche nicht menschlichen Säugetiere  sein, z.B. Labortiere, Haustiere etc. Die transgenen Tiere können  für funktionelle Untersuchungen, Arzneimittelscreening etc. verwendet  werden, um die Wirkung eines vorgesehenen Arzneimittels auf die Npt2B-Aktivität  zu untersuchen.  Diagnostische Anwendungen  



   Es werden auch Methoden zur Diagnose von Krankheitszuständen bereitgestellt,  die auf beobachteten Werten für Npt2B oder dem Ausmass der Expression  des Npt2B-Gens in einer interessierenden biologischen Probe basieren.  Proben, wie sie hier verwendet werden, schliessen biologische Flüssigkeiten,  wie Blut, Cerebrospinalflüssigkeit, Tränen, Speichel, Lymphe, Dialyseflüssigkeit,  Samen und dgl.; von Organ- oder Gewebekultur abgeleitete Flüssigkeiten  und Flüssigkeiten, die aus physiologischen Geweben extrahiert wurden,  ein. In dem Ausdruck enthalten sind auch Derivate und Fraktionen  solcher Flüssigkeiten. Die Zellen können abgetrennt sein, im Fall  von festen Geweben, oder es können Gewebeabschnitte untersucht werden.  Alternativ kann ein Lysat der Zellen hergestellt werden. 



     Es sind eine Anzahl von Methoden zur Bestimmung des Expressionsausmasses  eines Gens oder eines Proteins in einer speziellen Probe verfügbar.  Die Diagnose kann mit einer Anzahl von Methoden durchgeführt werden,  um die Abwesenheit oder Gegenwart oder veränderte Menge von normalem  oder anormalem Npt2B einer Patientenprobe zu bestimmen. Z.B. kann  für den Nachweis ein Anfärben von Zellen oder histologischen Abschnitten  mit markierten Antikörpern, das nach üblichen Methoden durchgeführt  wird, verwendet werden. Die Zellen werden permeabilisiert, um cytoplasmatische  Moleküle zu färben. Die Antikörper von Interesse werden der Zellprobe  zugegeben und über einen Zeitraum inkubiert, der ausreicht, damit  sie an das Epitop binden können, gewöhnlich mindestens etwa 10 Minuten.

    Der Antikörper kann mit Radioisotopen, Enzymen, fluoreszierenden,  chemilumineszierenden oder anderen Markierungen für den direkten  Nachweis markiert sein. Alternativ wird in einer zweiten Stufe ein  Antikörper oder Reagenz verwendet, um das Signal zu verstärken. Solche  Reagenzien sind im Stand der Technik wohlbekannt. Z.B. kann der erste  Antikörper mit Biotin konjugiert sein, wobei mit Meerrettichperoxidase  konjugiertes Avidin als Reagenz der zweiten Stufe zugegeben wird.  Alternativ kann der zweite Antikörper an eine fluoreszierende Verbindung,  z.B. Fluorescein, Rhodamin, Texas-Rot etc. konjugiert sein. Für den  endgültigen Nachweis wird ein Substrat verwendet, das bei Gegenwart  von Peroxidase eine Farbänderung durchmacht.

   Die Abwesenheit oder  Anwesenheit von Antikörperbindung kann mit verschiedenen Methoden  nachgewiesen werden, einschliesslich Durchflusscytometrie von dissoziierten  Zellen, Mikroskopie, Radiographie, Szintillationszählung etc. 



   Alternativ kann man sich auf die Expression von Npt2B konzentrieren.  Biochemische Untersuchungen können durchgeführt werden, um zu bestimmen,  ob ein Sequenzpolymorphismus in einer Npt2B-codierenden Region oder  in Kontrollregionen mit der Krankheit verbunden ist. Mit der Krankheit  verbundene Polymorphismen können eine Deletion oder Trunkierung des  Gens,    Mutationen, die das Expressionsausmass verändern, die die  Aktivität des Proteins verändern etc., einschliessen. 



   Veränderungen bei der Promotor- oder Enhancersequenz, die das Expressionsausmass  von Npt2B beeinflussen können, können mit dem Expressionsausmass  des normalen Allels mit verschiedenen im Stand der Technik bekannten  Methoden verglichen werden. Methoden zur Bestimmung der Promotor-  oder Enhancerstärke schliessen unter anderem die quantitative Auswertung  des exprimierten natürlichen Proteins; die Insertion des variierenden  Kontrollelements in einen Vektor mit einem Reportergen, wie  beta  -Galactosidase, Luciferase, Chloramphenicolacetyltransferase etc.  ein, das für eine geeignete quantitative Auswertung sorgt. 



   Eine Anzahl von Methoden sind verfügbar, um Nucleinsäuren auf die  Gegenwart einer spezifischen Sequenz zu analysieren, z.B. einen mit  einer Krankheit verbundenen Polymorphismus. Wenn grosse Mengen an  DNA verfügbar sind, wird die genomische DNA direkt verwendet. Alternativ  wird die interessierende Region in einen geeigneten Vektor kloniert  und in ausreichender Menge zur Analyse gezüchtet. Zellen, die Npt2B  exprimieren, können als Quelle für mRNA verwendet werden, die direkt  untersucht werden kann oder in cDNA zur Analyse umgeschrieben werden  kann. Die Nucleinsäure kann mit üblichen Techniken amplifiziert werden,  z.B. mit der Polymerase-Kettenreaktion (PCR), was genügende Mengen  zur Analyse liefert. Die Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion  wird in Saiki et al.

   (1985), Science 239:487 beschrieben und ein  Überblick über diese Techniken findet sich in Sambrook et al., Molecular  Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press 1989, Seiten 14.2-14.33.  Alternativ sind verschiedene Methoden im Stand der Technik bekannt,  bei denen die Ligierung von Oligonucleotiden als Mittel zum Nachweis  deines Polymorphismus verwendet wird, siehe z.B. Riley et al. (1990),  Nucl. Acids Res. 18:2887-2890 und Delahunty et al. (1996), Am. J.  Hum. Genet. 58:1239-1246. 



     Eine nachweisbare Markierung kann an einer Amplifikationsreaktion  beteiligt sein. Geeignete Markierungen schliessen Fluorochrome, z.B.  Fluoresceinisothiocyanat (FITC), Rhodamin, Texas-Rot, Phyco-erythrin,  Allophycocyanin, 6-Carboxyfluorescein (6-FAM), 2',7'-Dimethoxy-4',5'-dichlor-6-carboxyfluorescein  (JOE), 6-Carboxy-X-rhodamin (ROX), 6-Carboxy-2',4',7',4,7-hexachlorfluorescein  (HEX), 5-Carboxyfluorescein (5-FAM) oder N,N,N',N'-Tetramethyl-6-carboxyrhodamin  (TAMRA), radioaktive Markierungen, z.B. <32>P, <35>S, <3>H etc. ein.  Die Markierung kann ein zweistufiges System sein, wobei die amplifizierte  DNA mit Biotin, Haptenen etc. konjugiert ist, mit einer hohen Affinität  für einen Bindungspartner, z.B. Avidin, spezifische Antikörper etc.,  wobei der Bindungspartner mit einer nachweisbaren Markierung konjugiert  ist.

   Die Markierung kann mit einem oder beiden Primern konjugiert  sein. Alternativ wird der Nucleotidpool, der für die Amplifikation  verwendet wird, markiert, damit die Markierung in das Amplifikationsprodukt  eingebaut wird. 



   Die Probennucleinsäure, z.B. ein amplifiziertes oder kloniertes Fragment,  wird mit einer der im Stand der Technik bekannten Methoden analysiert.  Die Nucleinsäure kann mit Didesoxy- oder anderen Methoden sequenziert  werden und die Basensequenz mit einer Wildtyp-Npt2B-Gensequenz verglichen  werden. Die Hybridisierung mit der Sequenzvariante kann auch verwendet  werden, um ihre Gegenwart zu bestimmen, z.B. mit Southern Blot, Dot  Blot etc. Das Hybridisierungsmuster einer Kontrolle und einer Sequenzvariante  mit einer Anordnung von Oligonucleotidsonden, die auf einem festen  Träger immobilisiert sind, wie in US 5 445 934 oder in WO 95/35505  beschrieben, kann auch als Mittel zum Nachweis der Gegenwart von  Sequenzvarianten verwendet werden.

   Die Einzelstrangkonformations-Polymorphismus-(SSCP)-Analyse,  denaturierende Gradienten-Gelelektrophores (DGGE) und Heteroduplex-analyse  in Gelmatrices werden verwendet, um Konformationsveränderungen, die  durch Variationen der DNA-Sequenz, z.B. Veränderungen der elektrophoreti   schen Beweglichkeit, erzeugt werden, nachzuweisen. Alternativ wird  die Probe, wenn ein Polymorphismus eine Erkennungsstelle für eine  Restriktionsendonuclease erzeugt oder zerstört, mit der Endonuclease  verdaut und die Produkte der Grösse nach fraktioniert, um zu bestimmen,  ob das Fragment verdaut wurde. Die Fraktionierung wird mit Gel- oder  Kapillarelektrophorese, insbesondere auf Acrylamid- oder Agarosegelen  durchgeführt. 



   Das Screenen auf Mutationen von Npt2B kann auf den funktionellen  oder antigenen Eigenschaften des Proteins basieren. Proteintrunkierungsassays  sind nützlich, um Deletionen nachzuweisen, die die biologische Aktivität  des Proteins beeinflussen können. Verschiedene Immunoassays, die  dazu entwickelt wurden, um Polymorphismen in Npt2B-Proteinen nachzuweisen,  können zum Screening verwendet werden. Wenn viele verschiedene genetische  Mutationen zu einem speziellen Krankheitsphänotyp führen, haben sich  funktionelle Proteinassays als wirksame Screeningwerkzeuge erwiesen.  Die Aktivität des codierten Npt2B-Proteins kann durch Vergleich mit  dem Wildtyp-Protein bestimmt werden. 



   Diagnosemethoden der vorliegenden Erfindung, bei denen der Anteil  der Npt2B-Genexpression von Interesse ist, beinhalten typischerweise  einen Vergleich der Npt2B-Nucleinsäurehäufigkeit in einer interessierenden  Probe mit dem Kontrollwert um relative Unterschiede zu bestimmen,  wobei der Unterschied qualitativ und/oder quantitativ gemessen werden  kann, wobei die Unterschiede dann mit der Gegenwart oder Abwesenheit  eines anormalen Npt2B-Gen-expressionsmusters in Beziehung gebracht  werden. Eine Mehrzahl verschiedener Methoden zur Bestimmung der Nucleinsäurehäufigkeit  in einer Probe sind dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt, wobei  spezielle Methoden von Interesse solche einschliessen, die in den  folgenden Literaturstellen beschrieben sind: Pietu et al., Genome  Res. (Juni 1996), 6:492-503; Zhao et al., Gene (24. April 1995),  156:207-213; Soares, Curr. Opin. Biotechnol.

   (Oktober 1997),    8:542-546.;  Raval, J. Pharmacol. Toxicol. Methods (November 1994), 32:125-127;  Chalifour et al., Anal. Biochem. (1. Februar 1994), 216:299-304;  Stolz & Tuan, Mol. Biotechnol. (Dezember 1996), 6:225-230; Hong  et al., Bioscience Reports (1982), 2:907 und McGraw, Anal. Biochem.  (1984), 143:298. Von Interesse sind auch die in WO 97/27317 offenbarten  Methoden, deren Offenbarung hier durch Bezugnahme eingeschlossen  wird.  Screeningassays  



   Die vorliegenden Npt2B-Polypeptide finden Verwendung für verschiedene  Screeningassays, die dazu entwickelt wurden, um therapeutische Mittel  aufzufinden. So kann man ein Zellmodell, wie eine Wirtszelle, z.B.  CHO, HEK293, COS7, Xenopus Oocyten etc. verwenden, die in einer Art  und Weise transfiziert wurden, die ausreicht, um Npt2B an der Oberfläche  zu exprimieren. Man kann dann die Zelle mit einem Medium, das Natrium-  und Phosphationen enthält, in Kontakt bringen und die Menge an Phosphationen  messen, die von der Zelle aufgenommen wird, wobei die Messungen sowohl  in einer Kontrollumgebung als auch einer Testumgebung durchgeführt  werden, z.B. in Gegenwart einer in Betracht gezogenen Npt2B-Modulatorverbindung,  z.B. eines Npt2B-Agonisten oder eines Npt2B-Antagonisten oder Inhibitors.

    Um den Nachweis der Pi-Aufnahme zu erleichtern, ist markierter Phosphor  im Medium vorhanden, wobei jede geeignete Markierung angewendet werden  kann, z.B. eine isotopische Markierung, z.B. <32>P oder <33>P. Alternativ  können Strommessungen unter Verwendung wohlbekannter elektrophysiologischer  Methoden (siehe z.B. Electrophysiology, A practical Approach (IRL  Press) (1993)) durchgeführt werden, aus denen die Pi-Aufnahme bestimmt  werden kann. Beispiele für Assays zur Messung der Pi-Aufnahme sind  enthalten in: Maganin et al., Proc. Nat'l Acad. Sci USA (Juli 1993),  90:5979-5983 und Helps et al., Eur. J. Biochem. (1995), 228:927-930.                                                           



     Von Interesse für Screeningassays sind auch nicht menschliche  transgene Tiere, die funktionelles Npt2B exprimieren, wobei solche  Tiere oben beschrieben wurden. In vielen Ausführungsformen fehlt  den Tieren endogenes Npt2B. Bei Verwendung solcher Tiere für Screeninganwendungen  wird eine Testverbindung/werden Testverbindungen dem Tier verabreicht  und die entstehenden Veränderungen im Phänotyp/ z.B. der Serum-Pi-Pegel,  falls vorhanden, werden mit einer Kontrolle verglichen. 



   Alternativ können in-vitro-Modelle erstellt und angewendet werden.  Z.B. kann die Npt2B-Bindungsaktivität in einer in-vitro-Umgebung  gemessen werden, in der Bindungsereignisse zwischen Npt2B und vorgesehenen  Npt2B-modulierenden Mitteln überwacht werden. In anderen in-vitro-Modellen  werden synthetische Lipid-Bilayers, die den vorgesehenen Npt2B-Co-Transporter  beinhalten, hergestellt und eine Pi-Passage von einer Seite der Lipid-Bilayer  zur anderen gemessen. Beispiele für solche synthetischen Lipid-Bilayer-Assays  finden sich in: Brutyan et al., Biochimica et Biophysica Acta (1995),  1236:339-344; Wonderlin et al., Biophys. J. (1990), 58:289-297 und  Suarez-Isla et al., Biochemistry (1983), 22:2319-2323. 



   Eine Vielzahl anderer Reagenzien kann in dem Screeningassay enthalten  sein. Diese schliessen Reagenzien wie Salze neutrale Proteine, z.B.  Albumin, Detergenzien etc. ein, die verwendet werden, um eine optimale  Protein-Protein-Bindung zu erleichtern und/oder nichtspezifische  oder Hintergrundwechselwirkungen zu reduzieren. Reagenzien, die die  Wirksamkeit des Assays verbessern, z.B. Proteaseinhibitoren, Nucleaseinhibitoren,  antimikrobielle Mittel etc., können verwendet werden. 

 Eine Vielzahl verschiedener vorgesehener therapeutischer Mittel,  die entweder als Ntp2B-Agonisten oder -Antagonisten dienen, können  mit den obigen Methoden gescreent werden.

   Vorge   sehene oder in  Betracht gezogene Mittel umfassen zahlreiche chemische Klassen, obwohl  es typischerweise organische Moleküle, bevorzugt kleine organische  Verbindungen mit einem Molekulargewicht von mehr als 50 und weniger  als etwa 2500 Dalton sind. Vorgesehene Mittel umfassen funktionelle  Gruppen, die für die strukturelle Wechselwirkung mit Proteinen notwendig  sind, insbesondere Wasserstoffbindung, und enthalten typischerweise  mindestens eine Amin-, Carbonyl-, Hydroxyl- oder Carboxylgruppe,  bevorzugt mindestens zwei funktionelle chemische Gruppen. Die in  Betracht gezogenen Mittel umfassen häufig cyclische Kohlenstoff-  oder heterocyclische Strukturen und/oder aromatische oder polyaromatische  Strukturen, die mit einer oder mehreren der obigen funktionellen  Gruppen substituiert sind.

   In Betracht gezogene Mittel finden sich  auch unter den biologischen Molekülen einschliesslich Peptiden, Sacchariden,  Fettsäuren, Steroiden, Purinen, Pyrimidinen, Derivaten, Strukturanalogen  oder Kombinationen davon. 



   Vorgesehene Mittel werden aus einer Vielzahl von Quellen erhalten,  einschliesslich Bibliotheken für synthetische oder natürliche Verbindungen.  Z.B. sind zahlreiche Mittel verfügbar für eine statistische oder  gerichtete Synthese einer grossen Vielzahl organischer Verbindungen  und biologischer Moleküle, einschliesslich der Expression von randomisierten  Oligonucleotiden und Oligopeptiden. Alternativ sind Bibliotheken  von natürlichen Verbindungen in Form von Bakterien-, Pilz-, Pflanzen-  und Tierextrakten verfügbar oder können leicht hergestellt werden.  Zusätzlich werden natürliche oder synthetisch hergestellte Bibliotheken  und Verbindungen leicht modifiziert durch übliche chemische, physikalische  und biochemische Mittel und können verwendet werden, um kombinatorische  Bibliotheken zu erzeugen.

   Bekannte pharmakologische Mittel können  direkten oder zufälligen chemischen Modifikationen unterzogen werden,  z.B. Acylierung, Alkylierung, Veresterung, Amidifizierung etc., um  Strukturanaloge zu erzeugen. 



     Von speziellem Interesse für viele Ausführungsformen sind Screeningmethoden,  die Mittel auffinden, die selektiv das vorliegende Npt2B und nicht  andere Natriumphosphat-Co-Transporter, wie Nieren-Natriumphosphat-Co-Transporter,  z.B. Npt1, modulieren, d.h. hemmen. Um solche Mittel aufzufinden,  kann ein mehrstufiges Screeningprotokoll durchgeführt werden, wobei  Mittel, die Npt2B in einem ersten Assay hemmen, dann auf ihre Fähigkeit  untersucht werden, Nicht-Npt2B-Transporter zu hemmen. Jeder geeignete  Assay kann für diesen Assay der zweiten Stufe angewendet werden,  z.B. solche, die von Maganin et al. in Proc. Nat'l Acad. Sci USA  (Juli 1993), 90:5979-5983 und Helps et al., Eur. J. Biochem. (1995),  228: 927-930 offenbart werden.   Npt2E-Nucleinsäure und therapeutische  Polypeptidzusammensetzungen  



   Die Nucleinsäurezusammensetzungen der vorliegenden Erfindung finden  auch Verwendung als therapeutische Mittel in Fällen, in denen man  die Npt2B-Aktivität bei einem Wirt verbessern möchte, z.B. Krankheitszustände,  die mit Hypophosphatämie verbunden sind. Die Npt2B-Gene, Genfragmente  oder die codierten Npt2B-Proteine oder Proteinfragmente sind für  die Gentherapie nützlich, um Störungen zu behandeln, die mit Npt2B-Mangel  verbunden sind. Expressionsvektoren können verwendet werden, um das  Npt2B-Gen in eine Zelle einzuführen. Solche Vektoren haben im Allgemeinen  geeignete Restriktionsstellen, die in der Nähe der Promotorsequenz  angeordnet sind, für die Insertion von Nucleinsäuresequenzen. Transkriptionskassetten  können hergestellt werden, die eine Transkriptionsstartregion, das  Zielgen oder Fragment und eine Transkriptionsendregion umfassen.

    Die Transkriptionskassetten können in eine Vielzahl von Vektoren  eingeführt werden, z.B. Plasmide; Retroviren z.B. Lentivirus; Adenovirus  und dgl., wobei die Vektoren vorübergehend oder stabil in den Zellen  erhalten bleiben, gewöhnlich über einen Zeitraum von mindestens einem    Tag, üblicher über einen Zeitraum von mindestens etwa mehreren  Tagen bis mehreren Wochen. 



   Das Gen oder Npt2B-Protein kann in Gewebe oder Wirtszellen auf irgendeinem  Weg eingeführt werden, einschliesslich viraler Infektion, Mikroinjektion  oder Fusion von Vesikeln. Eine Sprühinjektion kann auch für die intramuskuläre  Verabreichung verwendet werden, wie von Furth et al. (1992) in Anal.  Biochem. 205:365-368 beschrieben. Die DNA kann auf Goldmikroteilchen  aufgetragen sein und intradermal zugeführt werden durch eine Teilchenbombardierungsvorrichtung  oder "Genkanone", wie in der Literatur beschrieben (siehe z.B. Tang  et al. (1992), Nature 356:152-154), wo Goldmikroprojektile mit der  DNA beschichtet werden und dann in die Hautzellen geschossen werden.  Methoden zur Modulation der Npt2B-Aktivität  



   Die vorliegende Erfindung liefert Methoden, um die Npt2B-Aktivität  in einer Zelle zu modulieren, einschliesslich Methoden zur Erhöhung  der Npt2B-Aktivität (z.B. Methoden zur Verbesserung des Pi-Transports),  ebenso wie Methoden zur Verminderung oder Hemmung der Npt2B-Aktivität,  z.B. Methoden, um den Pi-Transport zu stoppen oder zu begrenzen.  Bei solchen Methoden wird eine wirksame Menge eines Npt2B-modulierenden  Mittels mit der Zelle in Kontakt gebracht. 



   Es werden auch Methoden zur Modulation der Npt2B-Aktivität in einem  Wirt bereitgestellt, einschliesslich solchen zur Verbesserung und  zur Hemmung. Bei solchen Methoden wird eine wirksame Menge eines  aktiven Mittels, das die Aktivität von Npt2B in vivo moduliert, z.B.  gewöhnlich die Npt2B-Aktivität verbessert oder hemmt, dem Wirt verabreicht.  Das aktive Mittel kann in Form einer Vielzahl verschiedener Verbindungen  vorliegen, einschliesslich einer natürlich vorkommenden oder synthetischen  kleinen Molekülverbindung, einem Antikörper, Frag   ment oder Derivat  davon, einer Antisense-Zusammensetzung und dgl. 



   Von besonderem Interesse in speziellen Ausführungsformen sind Mittel,  die die Npt2B-Aktivität, z.B. den Pi-Transport, um mindestens das  etwa 10-fache, gewöhnlich mindestens etwa 20-fache und üblicher mindestens  etwa 25-fache, vermindern, was durch den Oocytentransport-Assay,  wie von Magagnin oben beschrieben, gemessen wird. Bei vielen Ausführungsformen  ist die Verwendung von Verbindungen von speziellem Interesse, die  die Npt2B-Aktivität, verglichen mit einer Kontrolle, um mindestens  das 100-fache vermindern. 



   Von Interesse ist auch die Verwendung von Mitteln, die, obwohl sie  für eine verminderte Npt2B-Aktivität sorgen, die Aktivität anderer  Natriumphosphat-Co-Transporter, z.B. Npt1 etc., nicht wesentlich,  wenn überhaupt, vermindern. Somit sind die Mittel in dieser Ausführungsform  selektive Inhibitoren von Npt2B. Ein Mittel wird dann als selektiv  angesehen, wenn es für die obige verminderte Npt2B-Aktivität sorgt,  aber im Wesentlichen keine verminderte Aktivität mindestens einer  anderen Art von Natriumphosphat-Co-Transporter erzeugt, wobei "im  Wesentlichen keine" weniger als eine 10-fache Verminderung, gewöhnlich  weniger als eine 5-fache Verminderung und in vielen Fällen weniger  als eine 1-fache Verminderung bedeutet, wobei die Aktivität, wie  bei Magagnin oben beschrieben, gemessen wird. 



   Natürlich vorkommende oder synthetische kleine Molekülverbindungen  von Interesse schliessen zahlreiche chemische Klassen ein obwohl  es typischerweise organische Moleküle sind, bevorzugt kleine organische  Verbindungen mit einem Molekulargewicht von mehr als 50 und weniger  als etwa 2500 Dalton. In Betracht kommende Mittel umfassen funktionelle  Gruppen, die für die strukturelle Wechselwirkung mit Proteinen notwendig  sind, insbesondere Wasserstoffbindung, und schliessen typis   cherweise  mindestens eine Amin-, Carbonyl-, Hydroxyl- oder Carboxylgruppe ein,  bevorzugt mindestens zwei funktionelle chemische Gruppen. Die vorgesehenen  Mittel umfassen häufig cyclische Kohlenstoff- oder heterocyclische  Strukturen und/oder aromatische oder polyaromatische Strukturen,  die mit einer oder mehreren der obigen funktionellen Gruppen substituiert  sind.

   In Betracht kommende Mittel finden sich auch bei den biologischen  Molekülen einschliesslich Peptiden, Sacchariden, Fettsäuren, Steroiden,  Purinen, Pyrimidinen, Derivaten, Strukturanalogen oder Kombinationen  davon. 



   Von Interesse als aktives Mittel sind auch Antikörper, die gezielt  die Npt2B-Aktivität in einem Wirt zumindest vermindern, wenn nicht  gar hemmen. Geeignete Antikörper werden erhalten, indem ein Wirtstier  mit Peptiden immunisiert wird, die einen Teil oder das vollständige  Zielprotein, z.B. Npt2B, umfassen. Geeignete Wirtstiere schliessen  Mäuse, Ratten, Schafe, Ziegen, Hamster, Kaninchen etc. ein. Der Ursprung  des Proteinimmunogens kann Maus, Mensch, Ratte, Affe etc. sein. Das  Wirtstier ist im Allgemeinen von einer anderen Art als das Immunogen,  z.B. wird menschliches Npt2B verwendet, um Mäuse zu immunisieren  etc. 



   Das Immunogen kann das vollständige Protein oder Fragmente und Derivate  davon umfassen. Bevorzugte Immunogene umfassen das gesamte Npt2B  oder einen Teil davon, wobei diese Reste die Posttranslationsmodifikationen  aufweisen, z.B. eine Glycosylierung, die auch das native Zielprotein  aufweist. Immunogene, die die extrazelluläre Domäne umfassen, werden  auf einer Vielzahl von Wegen erzeugt, die im Stand der Technik bekannt  sind, z.B. Expression klonierter Gene unter Verwendung üblicher rekombinanter  Methoden, Isolierung aus HEC etc. 



   Zur Herstellung von polyklonalen Antikörpern ist die erste Stufe  die Immunisierung des Wirtstiers mit dem Zielprotein, wobei das Zielprotein  bevorzugt in im Wesentlichen reiner    Form vorliegt, und weniger  als etwa 1% Verunreinigungen enthält. Das Immunogen kann das vollständige  Zielprotein, Fragmente oder Derivate davon umfassen. Um die Immunantwort  des Wirtstiers zu verstärken, kann das Zielprotein mit einem Adjuvans  vereinigt werden, wobei geeignete Adjuvantien Alaun, Dextran, Sulfat,  grosse polymere Anionen, Öl- und Wasser-Emulsionen, z.B. Freund's  Adjuvans, Freund's vollständiges Adjuvans und dgl. einschliessen.  Das Zielprotein kann auch mit einem synthetischen Trägerprotein oder  synthetischen Antigenen konjugiert sein. Eine Vielzahl von Wirten  kann immunisiert werden, um polyklonale Antikörper zu erzeugen.

   Solche  Wirte schliessen Kaninchen, Meerschweinchen, Nagetiere, z.B. Mäuse,  Ratten, Schafe, Ziegen und dgl. ein. Das Zielprotein wird dem Wirt  verabreicht, gewöhnlich intradermal, wobei sich an eine Anfangsdosis  eine oder mehrere, gewöhnlich mindestens zwei, zusätzliche Booster-Dosierungen  anschliessen. Nach der Immunisierung wird Blut von dem Wirt gesammelt  und anschliessend das Serum von den Blutzellen getrennt. Das im entstehenden  Antiserum vorhandene Ig kann weiter fraktioniert werden unter Verwendung  bekannter Methoden, z.B. Ammoniumsalzfraktionierung, DEAE-Chromatographie  und dgl. 



   Monoklonale Antikörper werden mit üblichen Techniken erzeugt. Im  Allgemeinen liefern die Milz und/oder die Lymphknoten eines immunisierten  Wirtstiers eine Quelle für Plasmazellen. Die Plasmazellen werden  durch Fusion mit Myelomazellen immortalisiert, um Hybridomazellen  herzustellen. Kulturüberstände von einzelnen Hybridomas werden gescreent  unter Verwendung von Standardtechniken, um solche zu identifizieren,  die Antikörper mit der gewünschten Spezifität erzeugen. Geeignete  Tiere zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen das menschliche  Protein schliessen Mäuse, Ratten, Hamster etc. ein. Um Antikörper  gegen das Mäuseprotein zu züchten, ist das Tier im Allgemeinen ein  Hamster, ein Meerschweinchen, ein Kaninchen etc.

   Der Antikörper kann  von den Hybridomazell-überständen oder der Ascitesflüssigkeit mit  üblichen Techniken    gereinigt werden, z.B. mit Affinitätschromatographie  unter Verwendung von Npt2B, das an einen unlöslichen Träger, Protein-A-Sepharose  etc., gebunden ist. 



   Der Antikörper kann als einzelne Kette anstatt der normalen multimeren  Struktur erzeugt werden. Einzelkettige Antikörper werden von Jost  et al. (1994), J.B.C. 269:26267-73 und anderen beschrieben. DNA-Sequenzen,  die die variable Region der schweren Kette und die variable Region  der leichten Kette codieren, werden mit einem Spacer ligiert, der  mindestens etwa vier Aminosäuren von kleinen neutralen Aminosäuren,  einschliesslich Glycin und/oder Serin, codiert. Das durch diese Fusion  codierte Protein lässt den Zusammenbau einer funktionellen variablen  Region, die die Spezifität und Affinität des ursprünglichen Antikörpers  behält, zu. 



   Für die in-vivo-Verwendung, insbesondere für die Injektion in Menschen,  ist es wünschenswert, die Antigenizität des Antikörpers zu vermindern.  Eine Immunantwort eines Empfängers gegen das Blockierungsmittel vermindert  möglicherweise den Zeitraum, über den die Therapie wirksam ist. Methoden  der Humanisierung von Antikörpern sind im Stand der Technik bekannt.  Der humanisierte Antikörper kann das Produkt eines Tiers mit transgenen  menschlichen Immunoglobulingenen der konstanten Region sein (siehe  z.B. die internationalen Patentanmeldungen WO 90/10 077 und WO 90/04  036). Alternativ kann der interessierende Antikörper mit rekombinanten  DNA-Techniken erstellt werden, um CH1-, CH2-, CH3-, Gelenkdomäne  und/oder die Rahmendomäne durch die entsprechende menschliche Sequenz  zu ersetzen (siehe WO 92/02 190). 



   Die Verwendung von Ig cDNA zur Konstruktion von chimären Immunoglobulingenen  ist im Stand der Technik bekannt (Liu et al. (1987), P.N.A.S., 84:3439  und (1987), J. Immunol. 139:3521). mRNA wird aus einem Hybridom oder  einer anderen Zelle, die den Antikörper produziert, isoliert und  verwendet,    um cDNA zu erzeugen. Die interessierende cDNA kann  mit der Polymerase-Kettenreaktion amplifiziert werden unter Verwendung  spezifischer Primer (U. S.-Patente Nr. 4 683 195 und 4 683 202).  Alternativ wird eine Bibliothek erstellt und gescreent, um die interessierende  Sequenz zu isolieren. Die DNA-Sequenz, die die variable Region des  Antikörpers codiert, wird dann mit menschlichen Sequenzen für die  konstante Region fusioniert. Die Sequenzen für menschliche Gene für  konstante Regionen finden sich bei Kabat et al. (1991), Sequences  of Proteins of Immunological Interest, N.I.H.

   Veröffentlichung Nr.  91-3242. Gene der menschlichen C-Region sind leicht erhältlich aus  diesen Klonen. Die Auswahl des Isotyps wird geleitet von den gewünschten  Effektorfunktionen, z.B. Komplementfixierung oder Aktivität bei Antikörper-abhängiger  Zellcytotoxizität. Bevorzugte Isotypen sind IgG1, IgG3 und IgG4.  Eine der menschlichen konstanten Regionen der leichten Kette, kappa  oder lambda, kann verwendet werden. Der chimäre humanisierte Antikörper  wird dann mit üblichen Methoden exprimiert. 



   Antikörperfragmente, wie Fv, F(ab') 2  und Fab können hergestellt  werden durch Spaltung des intakten Proteins, z.B. mit Protease oder  chemischer Spaltung. Alternativ wird ein trunkiertes Gen entwickelt.  Z.B. würde ein chimäres Gen, das einen Teil des F(ab') 2 -Fragmentes  codiert, DNA-Sequenzen enthalten, die die CH1-Domäne und die Gelenkregion  der H-Kette codieren, gefolgt von einem Translationsstopcodon, was  das trunkierte Molekül liefert. 



   Konsensus-Sequenzen der Regionen H und LJ können verwendet werden,  um Oligonucleotide zur Verwendung als Primer zu entwickeln, um geeignete  Restriktionsstellen in die J-Region einzuführen für eine nachfolgende  Verbindung von Segmenten der V-Region mit menschlichen Segmenten  der C-Region. cDNA der C-Region kann modifiziert werden durch punktgerichtete    Mutagenese, um eine Restriktionsstelle an analoger Position in  der menschlichen Sequenz zu platzieren. 



   Expressionsvektoren schliessen Plasmide, Retroviren, YACs, von EBV  abgeleitete Episomen und dgl. ein. Ein geeigneter Vektor ist einer,  der eine funktionell vollständige menschliche CH- oder CL-Immunglobulinsequenz  codiert mit geeigneten Restriktionsstellen, die so vorgesehen werden,  dass irgendeine VH-oder VL-Sequenz leicht insertiert und exprimiert  werden kann. In solchen Vektoren tritt ein Spleissen gewöhnlich zwischen  der Spleiss-Donor-Stelle in der insertierten J-Region und der Spleiss-Akzeptor-Stelle  der vorhergehenden humanen C-Region auf und es treten auch Spleiss-Bereiche  auf innerhalb der menschlichen CH-Exons. Eine Polyadenylierung und  das Transkriptionsende erfolgen an nativen Chromosomenstellen stromabwärts  der codierenden Bereiche.

   Der entstehende chimäre Antikörper kann  mit irgendeinem starken Promotor verbunden werden, einschliesslich  retroviralen LTRs, z.B. der frühe Promotor von SV-40 (Okayama et  al. (1983), Mol. Cell. Bio., 3:280), Rous-Sarkoma-Virus-LTR (Gorman  et al. (1982), P.N.A.S. 79:6777) und Moloney-Mäuse-Leukämievirus-LTR  (Grosschedl et al. (1985), Cell 41:885); native Ig-Promotoren etc.                                                             



   In weiteren Ausführungsformen der Erfindung ist das aktive Mittel  ein Mittel, das die Expression des Gens, das das Zielprotein in dem  Wirt codiert, moduliert und im Allgemeinen verringert oder nach unten  reguliert. Z.B. können Antisense-Moleküle verwendet werden, um die  Expression von Npt2B in Zellen herunterzufahren. Das Antisense-Reagenz  können Antisense-Oligonucleotide (ODN), insbesondere synthetische  ODN mit chemischen Modifikationen aus nativen Nucleinsäuren oder  Nucleinsäurekonstrukte sein, die solche Antisense-Moleküle exprimieren,  z.B. RNA. Die Antisense-Sequenz ist komplementär zu der mRNA des  Zielgens und hemmt die Expression der in Betracht gezogenen Genprodukte.

    Antisense-Moleküle hemmen die Genexpression über verschiedene Mechanismen,  z.B. indem sie    die Menge an mRNA, die für die Translation verfügbar  ist, reduzieren, durch Aktivierung von RNAse H oder sterische Hinderung.  Ein Antisense-Molekül oder eine Kombination von Antisense-Molekülen  kann verabreicht werden, wobei eine Kombination mehrere verschiedene  Sequenzen umfassen kann. 



   Antisense-Moleküle können durch Expression eines Teils oder der gesamten  Zielgensequenz oder eines Teils davon in einem geeigneten Vektor  erzeugt werden, wobei der Transkriptionsstart so orientiert ist,  dass ein Antisense-Strang als RNA-Molekül erzeugt wird. Alternativ  ist das Antisense-Molekül ein synthetisches Oligonucleotid. Antisense-Oligonucleotide  sind im Allgemeinen mindstens etwa 7, gewöhnlich mindestens etwa  12, üblicher mindestens etwa 20 Nucleotide lang und nicht länger  als etwa 500, gewöhnlich nicht länger als etwa 50, üblicher nicht  länger als etwa 35 Nucleotide, wobei die Länge durch die Effizienz  der Hemmung, die Spezifität, einschliesslich der Abwesenheit einer  Kreuzreaktivität, und dgl. bestimmt wird.

   Es wurde gefunden, dass  kurze Oligonucleotide mit einer Länge von 7 bis 8 Basen starke und  selektive Inhibitoren der Genexpression sein können (siehe Wagner  et al. (1996), Nature Biotechnol., 14:840-844). 



   Eine spezifische Region oder Regionen der endogenen Sense-Strang-mRNA-Sequenz  werden ausgewählt, um durch die Antisense-Sequenz vervollständigt  zu werden. Die Auswahl einer spezifischen Sequenz für das Oligonucleotid  kann durch Verwendung einer empirischen Methode erfolgen, wobei verschiedene  in Betracht, kommende Sequenzen auf die Hemmung der Expression des  Zielgens in einem in-vitro-Modell oder einem Tiermodell untersucht  werden. Eine Kombination von Sequenzen kann auch verwendet werden,  wenn verschiedene Regionen der mRNA-Sequenz für die Antisense-Ergänzung  ausgewählt werden. 



   Antisense-Oligonucleotide können chemisch synthetisiert werden mit  Methoden, die im Stand der Technik bekannt sind (sie   he Wagner  et al. (1993), oben, und Milligan et al., oben). Bevorzugte Oligonucleotide  sind chemisch modifiziert gegenüber der nativen Phosphodiesterstruktur,  um ihre intrazelluläre Stabilität und Bindungsaffinität zu erhöhen.  Eine Anzahl solcher Modifikationen, die die Chemie des Gerüstes der  Zucker oder der heterocyclischen Basen verändern, wurde in der Literatur  beschrieben. 



   Zu den nützlichen Veränderungen der Gerüstchemie gehören Phosphorthioate;  Phosphordithioate, bei denen beide nicht verbrückenden Sauerstoffe  durch Schwefel ersetzt sind; Phosphoramidite; Alkylphosphotriester  und Boranophosphate. Achirale Phosphatderivate schliessen 3'-0'-5'-S-Phosphorthioat,  3'-S-5'-O-Phosphorthioat, 3'-CH 2 -5'-O-Phosphonat und 3'-NH-5'-O-Phosphoramidat  ein. Peptidnucleinsäuren ersetzen das gesamte Ribosephosphodiestergerüst  durch eine Peptidbindung. Zuckermodifikationen werden auch verwendet,  um die Stabilität und Affinität zu verbessern. Das  GAMMA -Anomer  der Desoxyribose kann verwendet werden, wenn die Base im Hinblick  auf das natürliche  GAMMA -Anomer invertiert ist.

   Die 2'-OH-Gruppe  des Ribosezuckers kann unter Bildung von 2'-O-Methyl- oder 2'-0-Allylzuckern  verändert werden, was eine Beständigkeit gegenüber einem Abbau liefert,  ohne die Affinität zu beeinflussen. Die Modifikation der heterocyclischen  Basen muss die richtige Basenpaarung erhalten. Einige nützliche Substitutionen  schliessen Desoxyuridin statt Desoxythymidin, 5-Methyl-2'-desoxycytidin  und 5-Brom-2'-desoxycytidin statt Desoxycytidin ein. 5-Propinyl-2'-desoxyuridin  und 5-Propinyl-2'-desoxycytidin zeigten eine erhöhte Affinität und  biologische Aktivität, wenn sie Desoxythymidin bzw. Desoxycytidin  ersetzten. 



   Als Alternative zu Antisense-Inhibitoren können katalytische Nucleinsäureverbindungen,  z.B. Ribozyme, Antisense-Konjugate etc. verwendet werden, um die  Genexpression zu hemmen. Ribozyme können in vitro synthetisiert werden  und dem Patienten    verabreicht werden oder können in einem Expressionsvektor  codiert werden, aus dem das Ribozym in der in Betracht gezogenen  Zelle synthetisiert wird (siehe z.B. internationale Patentanmeldung  WO 9 523 225 und Beigelman et al. (1995), Nucl. Acids Res., 23:4434-42).  Beispiele für Oligonucleotide mit katalytischer Aktivität werden  in WO 9 506 764 beschrieben. Konjugate von Antisense-ODN mit einem  Metallkomplex, z.B. TerpyridylCu(II), die die mRNA-Hydrolyse vermitteln  können, werden von Bashkin et al. (1995), Appl. Biochem. Biotechnol.,  54:43-56 beschrieben. 



   Wie oben erwähnt, wird eine wirksame Menge des aktiven Mittels dem  Wirt verabreicht, wobei "wirksame Menge" eine Dosierung bedeutet,  die ausreicht, um das gewünschte Ergebnis zu erzielen. Im Allgemeinen  ist das erwünschte Ergebnis die Verstärkung oder Verminderung der  intestinalen Phosphatanionenabsorption, die durch Plasma-Pi-Pegel  im Vergleich mit einer Kontrolle gemessen wird. 



   Bei den vorliegenden Methoden kann das aktive Mittel/die aktiven  Mittel an den Wirt verabreicht werden unter Verwendung irgendeiner  geeigneten Einrichtung, die die gewünschte Modulation der Npt2B-Aktivität  liefern kann, z.B. die gewünschte Reduktion der Pi-Absorption und  der Plasma-Pi-Gehalte. Somit kann das Mittel in eine Vielzahl von  Präparaten für die therapeutische Verabreichung eingearbeitet werden.  Genauer können die Mittel der vorliegenden Erfindung zu pharmazeutischen  Zusammensetzungen formuliert werden durch Kombination mit geeigneten,  pharmazeutisch annehmbaren Trägern oder Verdünnungsmitteln und können  zu Präparaten in fester, halbfester, flüssiger oder Gasform formuliert  werden, z.B. Tabletten, Kapseln, Pulver, Körnchen, Salben, Lösungen,  Zäpfchen, Injektionen Inhalationsmitteln und Aerosolen. 



     Die Verabreichung der Mittel kann auf verschiedenen Wegen erreicht  werden, einschliesslich einer oralen, buccalen, rektalen, parenteralen,  intraperitonealen, intradermalen, transdermalen, intrachealen etc.  Verabreichung. 



   Bei pharmazeutischen Dosierungsformen können die Mittel in Form ihrer  pharmazeutisch annehmbaren Salze verabreicht werden oder sie können  alleine verwendet werden oder in geeigneter Zusammensetzung, ebenso  wie in Kombination mit anderen pharmazeutisch aktiven Verbindungen.  Die folgenden Methoden und Hilfsstoffe sind nur beispielhaft und  in keiner Weise beschränkend. 



   Für orale Präparate können die Mittel allein oder in Kombination  mit geeigneten Additiven verwendet werden, um Tabletten, Pulver,  Körnchen oder Kapseln herzustellen, z.B. mit üblichen Additiven,  wie Lactose, Mannit, Maisstärke oder Kartoffelstärke; mit Bindemitteln,  wie kristalliner Cellulose, Cellulosederivaten, Gummi arabicum, Maisstärke  oder Gelatine; mit Sprengmitteln, wie Maisstärke, Kartoffelstärke  oder Natriumcarboxymethylcellulose; mit Gleitmitteln, wie Talkum  oder Magnesiumstearat und, falls erwünscht, mit Verdünnungsmitteln,  Puffermitteln, Feuchthaltemitteln, Konservierungsmitteln und aromatisierenden  Mitteln. 



   Die Mittel können zu Präparaten zur Injektion formuliert werden,  indem sie in einem wässrigen oder nichtwässrigen Lösungsmittel gelöst,  suspendiert oder emulgiert werden, z.B. pflanzlichen oder anderen  ähnlichen Ölen, synthetischen aliphatischen Säureglyceriden, Estern  von höheren aliphatischen Säuren oder von Propylenglycol und, falls  erwünscht, mit üblichen Additiven, wie Solubilisatoren, isotonischen  Mitteln, Suspensionsmitteln, Emulsionsmitteln, Stabilisatoren und  Konservierungsmitteln. 



     Die Mittel können in Aerosolform verwendet werden, die durch Inhalation  verabreicht wird. Die erfindungsgemässen Verbindungen können mit  unter Druck gesetzten annehmbaren Treibmitteln formuliert werden,  z.B. Dichlordifluormethan, Propan, Stickstoff und dgl. 



   Weiterhin können die Mittel zu Zäpfchen verarbeitet werden, indem  sie mit einer Vielzahl von Basen, z.B. emulgierenden Basen oder wasserlöslichen  Basen, gemischt werden. Die erfindungsgemässen Verbindungen können  rektal über ein Zäpfchen verabreicht werden. Das Zäpfchen kann Träger  enthalten, wie Kakaobutter, Carbowachse und Polyethylenglycole, die  bei Körpertemperatur schmelzen, sich aber bei Raumtemperatur verfestigen.                                                      



   Einheitsdosierungsformen für die orale oder rektale Verabreichung,  z.B. Sirupe, Elixiere und Suspensionen können vorgesehen werden,  wobei jede Dosierungseinheit, z.B. ein Teelöffel, ein Esslöffel,  eine Tablette oder ein Zäpfchen, eine vorbestimmte Menge der Zusammensetzung  enthält, die einen oder mehrere Inhibitoren enthält. In ähnlicher  Weise können Einheitsdosierungsformen für die Injektion oder intravenöse  Verabreichung den Inhibitor/die Inhibitoren in einer Zusammensetzung  als Lösung in sterilem Wasser, normaler Kochsalzlösung oder einem  anderen pharmazeutisch annehmbaren Träger enthalten. 



   Der Ausdruck "Einheitsdosierungsform", wie er hier verwendet wird,  bezieht sich auf physikalisch diskrete Einheiten, die als Einheitsdosierungen  für menschliche und tierische Patienten geeignet sind, wobei jede  Einheit eine vorbestimmte Menge der erfindungsgemässen Verbindungen  enthält, die so berechnet ist, dass die Menge ausreicht, um die gewünschte  Wirkung zu erzielen, zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren  Verdünnungsmittel, Träger oder Trägermittel. Die genauen Angaben  für die neuen Einheitsdosierungsformen der vorliegenden Er   findung  hängen von der jeweiligen angewendeten Verbindung und zu erreichenden  Wirkung ab und von den pharmakodynamischen Eigenschaften, die jede  Verbindung in dem Wirt liefert. 



   Die pharmazeutisch annehmbaren Hilfsstoffe, wie Träger, Adjuvantien,  Trägermittel oder Verdünnungsmittel sind für die Öffentlichkeit leicht  verfügbar. Ausserdem sind pharmazeutisch annehmbare Hilfssubstanzen,  wie pH-einstellende und puffernde Mittel, die Tonizität einstellende  Mittel, Stabilisatoren, Benetzungsmittel und dgl. für die Öffentlichkeit  leicht verfügbar. 



   Wenn das Mittel ein Polypeptid, Polynucleotid, Analog oder eine nachahmende  Verbindung davon ist, z.B. eine Antisense-Zusammensetzung, kann sie  in Gewebe oder Wirtszellen auf einer Vielzahl von Wegen eingeführt  werden, einschliesslich einer Vireninfektion, Mikroinjektion oder  Fusion von Vesikeln. Eine Sprühinjektion kann auch für die intramuskuläre  Verabreichung verwendet werden, wie von Furth et al. (1992), Anal.  Biochem., 205:365-368 beschrieben. Die DNA kann auf Goldmikroteilchen  aufgetragen werden und intradermal mit einer Teilchenbombardierungsvorrichtung  oder "Genkanone", wie in der Literatur beschrieben, zugeführt werden  (siehe z.B. Tang et al. (1992), Nature, 356:152-154), wo Goldmikroprojektile  mit der therapeutischen DNA beschichtet werden und dann in Hautzellen  geschossen werden. 



   Der Fachmann auf diesem Gebiet erkennt leicht, dass Dosishöhen variieren  können als Funktion der spezifischen Verbindung, der Schwere der  Symptome und der Empfindlichkeit des Patienten für Nebenwirkungen.  Bevorzugte Dosierungen für eine gegebene Verbindung können leicht  bestimmt werden von einem Fachmann auf diesem Gebiet mit einer Vielzahl  von Mitteln. 



   Die vorliegenden Methoden finden Anwendung zur Behandlung einer Vielzahl  von verschiedenen Krankheitszuständen, an denen    die Npt2B-Aktivität  beteiligt ist. Die Krankheitszustände, die mit den vorliegenden Methoden  behandelt werden können, schliessen Krankheiten ein, die durch eine  abnorm hohe Pi-Absorption gekennzeichnet sind, und Krankheitszustände,  die durch eine abnorm niedrige Pi-Absorption gekennzeichnet sind.  Kranheitszustände, die durch eine anormal niedrige Npt2B-Aktivität  entstehen, sind solche, die durch das Vorliegen einer Hypophosphat-  ämie gekennzeichnet sind und schliessen Osteomalazie, Hypokalziurie,  Rachitis und dgl. ein.

   Krankheitszustände, die durch eine anormal  hohe Npt2B-Aktivität gekennzeichnet sind, sind solche, die durch  das Vorliegen einer Hyperphosphatämie gekennzeichnet sind und schliessen  Hyperparathyreoidismus, Hypokalzämie, Vitamin-D-Mangel, Verkalkung  von Weichgewebe oder metastatische Verkalkung und dgl. ein. Von besonderem  Interesse ist die Verwendung der vorliegenden Methoden, um Hyperphosphatämie  zu behandeln, die durch Niereninsuffizienz entsteht, die z.B. durch  eine Nierenkrankheit verursacht wird, die zu einer mindestens eingeschränkten  Nierenfunktion führt, und dgl. 



   Unter Behandlung wird mindestens eine Verbesserung der mit dem pathologischen  Zustand, der den Wirt befallen hat, verbundenen Symptome verstanden,  wobei eine Verbesserung in einem breiten Sinn verwendet wird und  sich mindestens auf eine Verminderung der Grösse eines Parameters,  z.B. eines Symptoms, das mit dem zu behandelnden pathologischen Zustand  verbunden ist, bezieht, z.B. Hyperphosphatämie. Eine solche Behandlung  schliesst auch Situationen ein, bei denen der pathologische Zustand  oder zumindest die Symptome, die damit verbunden sind, vollständig  gehemmt wird, d.h. nicht mehr auftritt oder gestoppt wird, d.h. beendet  wird, so dass der Wirt nicht mehr unter dem pathologischen Zustand  leidet oder zumindest nicht unter den Symptomen, die den pathologischen  Zustand kennzeichnen. 



     Eine Vielzahl von Wirten können mit den vorliegenden Methoden  behandelt werden. Im Allgemeinen sind solche Wirte "Säugetiere",  wobei dieser Ausdruck breit verwendet wird, um Organismen zu beschreiben,  die zu der Klasse der Säugetiere gehören, einschliesslich der Ordnungen  Raubtiere (z.B. Hunde und Katzen), Nagetiere (z.B. Mäuse, Meerschweinchen  und Ratten) und Primaten (z.B. Menschen, Schimpansen und Affen).  In vielen Ausführungsformen sind die Wirte Menschen. 



   Kits mit Einheitsdosierungen des aktiven Mittels, gewöhnlich in oraler  oder injizierbarer Dosis, werden bereitgestellt. Solche Kits enthalten  zusätzlich zu Behältern, die die Einheitsdosierung enthalten, eine  Packungsbeilage zur Information, die die Verwendung und die damit  erreichten Vorteile der Arzneimittel bei der Behandlung des interessierenden  pathologischen Zustandes beschreibt. Bevorzugte Verbindungen und  Einheitsdosen sind die hier beschriebenen. 



   Die folgenden Beispiele dienen nur der Erläuterung. Es ist für den  Fachmann leicht erkennbar, dass die Präparate, Dosierungen, Verabreichungsmethoden  und anderen Parameter der Erfindung weiter modifiziert oder auf verschiedenen  Wegen ersetzt werden können, ohne vom Sinn und Zweck der Erfindung  abzuweichen.   Versuche     A. Identifizierung der Npt2B-Sequenz  



   Ein Vergleich von Natriumphosphat-Co-Transporterproteinsequenzen  vom Typ II aus verschiedenen Arten, die in öffentlichen Datenbanken  erhältlich sind, ergab, dass während die meisten sehr eng verwandt  waren, die Sequenzen von Rind und Flunder eine getrennte Unterfamilie  zu bilden schienen. Die Incyte LifeSeq Datenbank wurde daher auf  Npt2-artige Klone untersucht, die der Rindersequenz näher kamen als  der mensch   lichen. Eine Anzahl von Klonen wurde identifiziert und  drei davon wurden erhalten und die DNA-Sequenz der gesamten Inserts  bestimmt. Die DNA-Sequenzierung wurde mit einem Sequenzautomaten  (PE/Applied Biosystems, Modell 373A, Foster City, CA) durchgeführt  unter Verwendung des Farbstoff-Dides-oxyabbruch-Sequenzierkits des  Anbieters.

   Ein Vergleich der Sequenzen zeigte, dass sie die gleiche  cDNA wiedergaben und dass die längste nur ein Teilklon war, dem ungefähr  150 Aminosäuren vom N-Ende fehlten, auf Basis der Homologie mit dem  Rinderprotein. Die Konsensussequenz wurde verwendet, um die LifeSeq  Datenbank weiter zu screenen und eine grosse Anzahl von Klonen wurde  aufgefunden, einschliesslich einem, der die codierende Sequenz voller  Länge zu enthalten schien. Letztere wurde von Incyte erhalten und  sequenziert. Diese zeigte die Gegenwart eines offenen Leserahmens  mit 689 Aminosäuren, der ein menschliches Mitglied der Rinder/Flunder-Typ-II-Co-Transporter-Unterfamilie  zu sein schien.

   Die Mehrzahl der in der LifeSeq Datenbank identifizierten  Klone stammte von Bibliotheken, die von aus der Lunge stammenden  Gewebeproben abgeleitet waren, jedoch stammten einige der Klone aus  Bibliotheken des Dünndarms und aus dem Eierstock. Dies deutete darauf  hin, dass diese cDNA ein Kandidat für den menschlichen Natriumphosphat-Co-Transporter  des Darms sein könnte. Versuche unter Verwendung von RT-PCR bestätigten  die Expression dieses Gens in cDNA, die aus menschlichen Dünndarmproben  stammte (erhalten von Clontech Corporation, Palo Alto, CA). Anschliessend  wurde die Zuordnung dieser Sequenz als menschlicher Darmtransporter  verstärkt durch einen hohen Grad an Homologie mit veröffentlichten  Sequenzen für intestinale Transporter von Xenopus (A. Ishizuya-Oka  et al.

   (1997), Temporal and Spatial Expression of an Intestinal Na<+>/PO  4 <3->Cotransporter Correlates With Epithelial Transformation During  Thyroid Hormone-Dependent Frog Metamorphosis. Development Genetics  20:53-66) und Maus (H. Hilfiker et al., Characterization of a murine  type II sodium-phosphate cotransporter expressed in mammalian small  intestine. PNAS 1998, 95:14564-14569).   B. Expression in Säugetierzellen  und Assayprotokoll für Na/Pi-Transporter  



   Menschliche Npt2B-cDNA wird in einen geeigneten konstitutiven Säugetierexpressionsvektor,  wie pcDNA3.1 oder pREP9 (beide von Invitrogen, Carlsbad, Kalifornien)  kloniert. Falls erforderlich, wird die cDNA in einen induzierbaren  Vektor, wie pLK-neo, einen mit Glucocorticoid induzierbaren Vektor  (von Prof. Nicholas Fasel, Institute of Biochemistry, Universität  von Lausanne, Schweiz, wie in Gene, 111, 199-206 (1992) beschrieben)  kloniert. Eine Anzahl von Säugetierzelllinien, z.B. HEK 293, CHO,  MDCK, BHK und NIH 3T3 werden mit den Expressions-konstrukten transfiziert  und auf eine stabile Expression der rekombinanten Transporter gescreent  unter Verwendung einer Version des unten beschriebenen Assays. 



   Zellen, die den Transporter exprimieren, werden in 96-Napf-Gewebekulturplatten  mit 50 000 bis 100 000 Zellen pro Napf in 200  mu l geeigneten Medien  plattiert und 3 bis 16 Stunden lang anhaften gelassen. Direkt vor  dem Test werden die Zellen dreimal mit natrium- und phosphatfreiem  Waschpuffer (137 mM N-Methyl-D-glucamin, 5,4 mM KCl, 2,8 mM CaCl  2 , 1,2 mM MgCl 2 , 10 mM HEPES, pH eingestellt auf 7,4 mit HCl)  gewaschen. Die folgenden Komponenten werden dann zugegeben: (1) 50  mu l Reaktionspuffer (137 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 2,8 mM CaCl 2 , 1,2  mM MgCl 2 , 0,1 mM KH 2 PO 4 , 10 mM HEPES, pH eingestellt auf 7,4  mit KOH), (2) 40  mu l Testverbindungen verdünnt in Reaktionspuffer  und (3) 10 ml einer 10X Phosphatlösung (Endkonzentration Phosphat  ist 100  mu M), die entweder <32>P (0,25  mu Ci) oder <33>P (0,5  mu Ci) als Tracer enthält.

   Die Platten werden bei Raumtemperatur  20 bis 30 Minuten lang inkubiert und die Reaktion gestoppt, indem  die Aufnahmelösung entfernt wird und die Zellen dreimal mit eiskalter  Stopplösung (137 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7,2) gewaschen werden.  Die von den Zellen aufgenommene Radioaktivität wird bestimmt, indem  nach Zugabe von 150  mu l Szintillationscocktail gezählt wird. Kontrollen  bestehen aus    Zellen, die ohne Testverbindung (Träger allein) inkubiert  wurden und Zellen, die mit N-Methyl-D-glucamin in Reaktionspuffer  anstelle von Natrium inkubiert wurden. Die hemmende Wirkung wird  ausgedrückt als Prozentanteil Hemmung der natriumabhängigen Aufnahme  des Tracers. Unter Verwendung des obigen Protokolls werden in Betracht  gezogene therapeutische Mittel auf ihre Npt2B-modulierende Aktivität  gescreent. 



   Es ist aus den obigen Ergebnissen und der Diskussion offensichtlich,  dass ein neuer menschlicher intestinaler Natriumphosphat-Co-Transporter  ebenso wie Polypeptide, die damit verwandt sind und Nucleinsäurezusammensetzungen,  die ihn codieren, durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt  werden. Diese Polypeptid- und Nucleinsäurezusammensetzung finden  Verwendung in einer Vielzahl verschiedener Anwendungen, einschliesslich  Forschung, Diagnose, Screening und therapeutische Anwendungen. Es  werden auch neue Methoden zur Behandlung von Krankheiten bereitgestellt,  die mit Anormalitäten beim Plasmaphosphatpegel verbunden sind, da  die Identifikation des vorliegenden Natriumphosphat-Co-Transporters  ein weiteres Ziel für therapeutische Mittel für solche Krankheiten  liefert. Somit liefert die vorliegende Erfindung einen wesentlichen  Beitrag auf diesem Gebiet. 



   Alle Veröffentlichungen und Patentanmeldungen, die in dieser Beschreibung  zitiert werden, werden hier durch Bezugnahme mit eingeschlossen,  als wenn jede einzelne Veröffentlichung oder Patentanmeldung spezifisch  und einzeln hier angegeben würde. Die Nennung irgendeiner Veröffentlichung  erfolgt aufgrund ihrer Offenbarung vor dem Anmeldedatum und sollte  nicht als Zugeständnis ausgelegt werden, dass die vorliegende Erfindung  nicht berechtigt ist, vordatiert zu werden aufgrund einer früheren  Erfindung. 



     Obwohl die vorliegende Erfindung im Detail durch Erläuterung und  Beispiele beschrieben wurde, um das Verständnis zu erleichtern, ist  es für den Fachmann auf diesem Gebiet im Lichte der Lehren der Erfindung  offensichtlich, dass bestimmte Veränderungen und Modifikationen gemacht  werden können, ohne vom Schutzbereich der beigefügten Ansprüche abzuweichen.

Claims (16)

1. Npt2B-Polypeptid, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 01 umfasst.

2. Protein oder Polypeptid nach Anspruch 1, mit einer Aktivität als Natriumphosphat-Co-Transporter.

3. Nucleinsäure, die ein Protein oder Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 oder 2 codiert.

4. Nucleinsäure nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Nucleinsäure eine Nucleinsäuresequenz aufweist, die identisch ist mit der Nucleotidsequenz von SEQ ID Nr. 02.

5. Expressionskassette umfassend eine Transkriptionsstartregion, die in einem Expressionswirt funktionell ist, eine Nucleinsäure mit einer Nucleotidsequenz, die in der Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 3 oder 4 vorhanden ist unter der Transkriptionsregulation der Transkriptionsstartregion, und eine Transkriptionsendregion, die in dem Expressionswirt funktionell ist.

6.

Wirtszelle umfassend eine Expressionskassette nach Anspruch 5 als Teil eines extrachromosomalen Elements oder integriert in das Genom einer Wirtszelle als Ergebnis der Einführung der Expressionskassette in die Wirtszelle.

7. Zellnachkommen der Wirtszelle nach Anspruch 6.

8. Verfahren zur Herstellung von Npt2B, wobei das Verfahren umfasst, dass man eine Zelle nach Anspruch 6 oder 7 züchtet, wodurch Npt2B exprimiert wird, und Npt2B mit weniger als 90% anderen Proteinen isoliert.

9. Monoklonaler Antikörper, der spezifisch an Npt2B bindet.

10. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper die Npt2B-Aktivität hemmt.

11. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 9, oder Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper ein humanisierter Antikörper ist.

12.

Verfahren zum Screenen, um Npt2B-modulierende Mittel aufzufinden, wobei das Verfahren umfasst, dass man eine Zelle, die funktionelles Npt2B an ihrer Oberfläche exprimiert, mit einem in Betracht gezogenen Mittel in Gegenwart von Phosphoranionen in Kontakt bringt und die Menge an Phosphor-anionen, die von der Zelle aufgenommen wird, bestimmt.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Phosphoranion mit einer nachweisbaren Markierung markiert ist.

14. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, oder dadurch gekennzeichnet, dass die Markierung ein Isotop ist.

15. Nicht menschliches transgenes Tiermodell, das Npt2B exprimieren kann.

16. Verwendung eines Proteins oder Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 oder 2, um Npt2B-modulierende Mittel zu screenen.