CH698908A1 - Pflanzenextrakt und seine therapeutische verwendung. - Google Patents
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Abstract
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Zusammensetzung, enthaltend einen wässrigen oder organischen Extrakt aus wenigstens einer Chamomilla-Pflanze und/oder aus wenigstens einer Achillea-Pflanze, für die Behandlung eines abnormalen proliferativen und/oder viralen Zustandes.
Description
Gebiet der Erfindung
[0001] Diese Erfindung bezieht sich auf einen Pflanzenextrakt und auf seine therapeutische Verwendung.
Hintergrund der Erfindung
[0002] WO 03/101 479 A1 beschreibt die wertvollen therapeutischen Eigenschaften einer Zusammensetzung, welche verschiedene Komponenten umfasst, welche typischerweise zusammen durch intramuskuläre Injektion verabreicht werden. Die Zusammensetzung, welche in den Beispielen verwendet wurde, umfasst einen Kamillenextrakt, obwohl ihm keine direkte therapeutische Aktivität zugeschrieben wird; vielmehr wird ihm eine reizmindernde Wirkung zugeschrieben, dessen Anwesenheit die unangenehmen Auswirkungen der Injektion per se mildern kann.
[0003] WO 2007/057 651 A1 beschreibt ein Verfahren für die Entfernung von wasserlöslichen Verunreinigungen, welche Lipidgruppen haben, insbesondere Endotoxine aus wässrigen Zusammensetzungen der Kamille.
Ziele der Erfindung
[0004] Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, eine Zusammensetzung für die Behandlung eines abnormalen proliferativen und/oder viralen Zustandes zur Verfügung zu stellen.
[0005] Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, eine Zusammensetzung für die Synchronisierung und die S-Phasen-Arretierung von abnormalen proliferativen Säugerzellen, insbesondere Krebszellen, im menschlichen oder tierischen Körper zur Verfügung zu stellen.
[0006] Diese Synchronisierung soll die Induktion der Ornithindecarboxylase und/oder die Hemmung der Topoisomerase II umfassen.
[0007] Es ist auch ein Ziel der vorliegenden Erfindung, eine Zusammensetzung für die Behandlung eines abnormalen proliferativen Zustandes zur Verfügung zu stellen, wobei die Behandlung die simultane oder sequenzielle Verabreichung dieser Zusammensetzung und wenigstens eines Antitumormittels umfasst.
[0008] Diese Ziele werden mit der vorliegenden Erfindung erreicht.
Zusammenfassung der Erfindung
[0009] Die Erfindung ist durch die Merkmale gekennzeichnet, wie sie in den unabhängigen Ansprüchen definiert sind.
[0010] Bevorzugte Ausführungsformen sind in den abhängigen Ansprüchen definiert.
[0011] Überraschenderweise ist jetzt gefunden worden, dass ein Kamillenextrakt, erhalten aus den Blumenköpfen, wie in WO 2007/057 651 A1 beschrieben, wertvolle therapeutische Eigenschaften hat. Im Speziellen ist gefunden worden, dass er die DNA- und RNA-Synthese ohne wesentlichen Effekt auf die Proteinsynthese reduzieren kann, wovon die Brauchbarkeit bei der Behandlung von Krebs abgeleitet werden kann.
[0012] Noch überraschender ist gefunden worden, dass organische Extrakte der Röhrenblüten von Matricaria recutita L. (Flores tubiformis) geeignet sind für die Synchronisierung und die S-Phasen-Arretierung von abnormalen proliferativen Säugerzelle, insbesondere von Krebszellen.
[0013] Diese Synchronisierung findet aufgrund der Induktion der Ornithindecarboxylase (Transfer von Go-Phase in G-i-Phase) und der Hemmung der Topoisomerase II (Akkumulierung und Arretierung in der frühen S-Phase) statt.
[0014] Es ist auch gefunden worden, dass die Hemmung der Topoisomerase II mit einem organischen Extrakt mehr als hundertfach stärker ist als mit einem wässrigen Extrakt (mit Bezug auf die Konzentration für die vollständige Hemmung des Enzyms).
[0015] Bedingt durch die Tatsache, dass die Hemmung der Topoisomerase II entscheidend ist für die Effektivität der Zellsynchronisierung, sind die organischen Extrakte der Röhrenblüten von Matricaria recutita L. (Flores tubiformis) der vorliegenden Erfindung viel potenter als die entsprechenden wässrigen Extrakte.
Beschreibung der Erfindung
[0016] Die Erfindung basiert auf Daten, welche erhalten worden sind durch die Verwendung eines wässrigen Extraktes von Kamille, und auf Daten, welche erhalten worden sind durch die Verwendung von organischen Extrakten, insbesondere alkoholischen Extrakten, beispielsweise ethanolische Extrakte, von den Röhrenblüten von Matricaria recutita L. (Flores tubiformis).
[0017] Die erhältlichen wissenschaftlichen Beweise zeigen, dass der wässrige Kamillenextrakt, erhalten wie weiter unten beschrieben, die Proteinbiosynthese aufrecht erhält, währendem die DNA- und RNA-Biosynthese reduziert wird. Dies ist eine gute Messgrösse für die erwünschten Eigenschaften dieses Extraktes.
[0018] Die wässrigen und organischen Extrakte können durch jedes geeignete Verfahren erhalten werden, das dem Fachmann bekannt ist. Die Extrakte können erhalten werden durch die Verwendung eines wässrigen oder organischen Mediums, insbesondere eines alkoholischen Mediums, wie etwa ein ethanolisches Medium, und durch Abtrennung von weiteren Komponenten.
[0019] Ein bevorzugtes Verfahren für die Herstellung eines wässrigen Extraktes ist in WO 2007/057 651 A1 beschrieben.
[0020] Vorzugsweise enthält eine Zusammensetzung gemäss der vorliegenden Erfindung zusätzlich noch wenigstens eine Komponente, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus pharmazeutischen Hilfsmitteln, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus pharmazeutischen Agentien und pharmazeutischen Arzneiträgern.
[0021] Der wässrige Extrakt kann einem Reinigungsverfahren unterworfen werden. Ein solcher Extrakt umfasst ein Mehrkomponentengemisch von wasserlöslichen Komponenten. Er kann erhalten werden durch Hinzugabe von Wasser zum geeigneten Pflanzenteil, um eine Suspension zu erhalten, welche dann gewöhnlich auf eine Temperatur unterhalb des Siedepunktes von Wasser erwärmt wird, zum Beispiel 90–94°C, und anschliessend auf Raumtemperatur gekühlt wird.
[0022] Der wässrige Extrakt wird dann zwei Filtrierungsschritten unterworfen. Nur für die Zwecke der Illustration werden diese weiter unten als Mikrofiltration beziehungsweise als Ultrafiltration beschrieben. Andere Techniken, wie etwa die Verwendung einer lipophilen Barriere, können geeignet sein. Jeder Filtrationsschritt kann falls gewünscht in einem, zwei oder mehr als zwei Stufen ausgeführt werden.
[0023] Die Mikrofiltration wird angewendet, um Material zu entfernen, welches ansonsten die Wirksamkeit des Ultrafiltrationsschrittes gefährden würde.
[0024] Im folgenden Teil werden mögliche Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung beschrieben.
[0025] Die folgenden Beispiele illustrieren die vorliegende Erfindung.
[0026] Die Analyse von bakteriellen Endotoxinen der Proben, welche in den Beispielen erhalten wurden, wurden mit dem Cambrex PyroGene Assay durchgeführt, wobei ein Verdünnungsfaktor vom 1:10 000 verwendet wurde.
Beispiele 1 und 2
[0027] 45 g gelbe Kamillenröhrenblüten (Chamomilla recutita) wurden mit 900 g Wasser (Aqua purificata, Ph.Helv.) gemischt. Dieses Gemisch wurde auf eine Temperatur zwischen 90°C und 94°C innerhalb von 20 bis 30 Minuten erwärmt. Anschliessend wurde das Gemisch bei Raumtemperatur (15°C bis 25°C) gelagert bis eine Temperatur zwischen 30°C und 35°C erreicht wurde.
[0028] Der Drogenrückstand wurde durch eine Tiefenschichtenfiltration (deep layer filtration) entfernt. Das erhaltene rohe Filtrat wurde durch eine Filtration durch eine 0,22 µm Membran geklärt.
[0029] Zum geklärten Filtrat wurden 0,3% (Beispiel 1) beziehungsweise 0,1% (Beispiel 2), bezogen auf die Extraktmasse, an Rizinusöl (Ph.Eur.) hinzugegeben. Das erhaltene Gemisch wurde während 5 Minuten homogenisiert. Der so hergestellte Extrakt wurde filtriert (in tangentialem Flussmodus) mit einer Retentatrückgewinnung über eine 0,22 µm Membran.
[0030] Das erhaltene Permeat wurde filtriert (in tangentialem Flussmodus) mit einer Retentatrückgewinnung über eine 0,1 µm Membran. Schlussendlich wurde das erhaltene Permeat filtriert (in tangentialem Flussmodus) mit einer Retentatrückgewinnung über einer 1000 kDa Membran.
[0031] Der Rückstand an bakteriellen Endotoxinen in jedem schlussendlichen Filtrat:
< 100 EU/ml.
Beispiele 3 bis 5
[0032] Beispiel 1 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, dass anstelle von Rizinusöl 0,3% (Beispiel 3), 1,0% (Beispiel 4; VIP-E_Matr’06_1003) oder 3,0% (Beispiel 5), mit Bezug auf die Extraktmasse, von Mygliol (Ph.Eur.) zum geklärten Filtrat hinzugegeben wurde.
[0033] Der Rückstand an bakteriellen Endotoxinen in jedem schlussendlichen Filtrat:
< 100 EU/ml.
Beispiel 6
[0034] Dieses Beispiel verwendet ein revidiertes Protokoll, wobei das Erwärmen und Kühlen nicht in einem Autoklaven sondern in einem 10 L Doppelwandbehälter unter Rühren (maximale Temperatur der Heizvorrichtung 140°C) durchgeführt wurde.
[0035] Mygliol wurde an Stelle von Rizinusöl hinzugegeben. Das Mygliol war «Mygliol 812 für parenterale Verwendung» von Hänseler. Das Gemisch wurde an Stelle der Homogenisierung bei Raumtemperatur während 10 Minuten gerührt.
[0036] Die Mikrofiltrationen gemäss dem vorher beschriebenen Verfahren wurden alle mit Millipore Pellicon 2 Systemen durchgeführt. Für bessere Durchführbarkeit und um zeit-raubende Reinigungsverfahren zu vermeiden, wurden die Mikrofiltrationen in diesem Beispiel mit der folgenden Ausrüstung durchgeführt:
<tb>Filtration<sep>Filter System<sep>Kartusche
<tb>0,2 µm Filtration<sep>Millipore Pellicon 2<sep>Durapore 0,2 µ, C-screen
<tb>0,1 µm Filtration<sep>Einwegfilter<sep>Millipack 200, 0,1 µm
<tb>1000 kDa Filtration<sep>Millipore Pellicon 2<sep>Biomax 1000 kDa, V-Screen
<tb>0,2 µm Filtration<sep>Einwegfilter<sep>Millipack 200, 0,2 µm
[0037] Zusätzlich wurde Phenol für die Stabilisierung des Extraktes hinzugegeben. Die Menge an hinzugegebenem Phenol betrug 6,0–8,0 mg/ml. Es wurde nach der 1000 kDa Filtration hinzugegeben. Nach der Hinzugabe wurde die Suspension während ungefähr 10 Minuten gerührt bis sich alles Phenol gelöst hatte.
[0038] Das Endotoxin-Niveau war in jedem Fall tief.
Beispiel 7 (Herstellung eines Flüssigextraktes ViP-E_Matr’08_1102)
[0039] 100 g Röhrenblüten aus dem Blütenstand von Matricaria recutita L. wurden unter Rühren bei einer Temperatur zwischen 40°C und 60°C während zwei Stunden mit 500 g 80% (m/m) Ethanol extrahiert, entsprechend einem Drogen-Lösungsmittel-Verhältnis von 1/5. Anschliessend wurde die Zubereitung einer Tiefenschichtenfiltration (deep layer filtration) unterworfen, wobei ein Zellulosefilter (AF 6 Filtrox<®)> verwendet wurde. Es wurden 385 g eines klaren dunkelbraunen Flüssigextraktes mit einem Feststoffgehalt von 4,43% (m/m) erhalten.
Beispiel 8 (Herstellung eines Flüssigextraktes ViP-E_Matr’08_1106)
[0040] 100 g Röhrenblüten aus dem Blütenstand von Matricaria recutita L. wurden unter Rühren bei einer Temperatur zwischen 40°C und 60°C während zwei Stunden mit 500 g 90% (m/m) Ethanol extrahiert, entsprechend einem Drogen-Lösungsmittel-Verhältnis von 1/5. Anschliessend wurde die Zubereitung einer Tiefenschichtenfiltration (deep layer filtration) unterworfen, wobei ein Zellulosefilter (AF 6 Filtrox<®>) verwendet wurde. Es wurden 398 g eines klaren dunkelbraunen Flüssigextraktes mit einem Feststoffgehalt von 1,89% (m/m) erhalten.
Beispiel 9 (Herstellung eines Flüssigextraktes ViP-E_Matr’08_1105)
[0041] 100 g Röhrenblüten aus dem Blütenstand von Matricaria recutita L. wurden unter Rühren bei einer Temperatur zwischen 40°C und 60°C während zwei Stunden mit 500 g 99,9% (m/m) Ethanol extrahiert, entsprechend einem Drogen-Lösungsmittel-Verhältnis von 1/5. Anschliessend wurde die Zubereitung einer Tiefenschichtenfiltration (deep layer filtration) unterworfen, wobei ein Zellulosefilter (AF 6 Filtrox<®>) verwendet wurde. Es wurden 412 g eines klaren dunkelbraunen Flüssigextraktes mit einem Feststoffgehalt von 1,54% (m/m) erhalten.
[0042] Die folgenden Beispiele illustrieren das pharmakologische Aktivitätsprofil der Extrakte gemäss den Beispielen 4, 7, 8 und 9.
Beispiel 10 (Induktion der Ornithindecarboxylase Expression)
[0043] Mit dem Flüssigextrakt VIP-E_Matr’06_1003, hergestellt gemäss Beispiel 4, wurden die Ornithindecarboxylase Expressions-Experimente durchgeführt.
[0044] Für die Messung der Induktion der Ornithindecarboxylase Expression wurde dieser Extrakt zu HepG2 Zellen in Konzentrationen von 150, 100 oder 30 µg/ml hinzugegeben. Die so behandelten Zellen wurden während 6 Stunden, 24 Stunden oder 48 Stunden in 10% FBS Kulturmedium kultiviert.
[0045] Anschliessend wurde die Veränderung der Menge an Ornithindecarboxylase mittels der Westernblot-Analyse bestimmt.
[0046] Aus den in Fig. 9 gezeigten Daten ist ersichtlich, dass der Extrakt gemäss der vorliegenden Erfindung die Ornithindecarboxylase-Expression in konzentrationsabhängiger Art induziert.
Beispiel 11 (Vergleichsbeispiel; Hemmung der Topoisomerase I Aktivität)
[0047] Mit dem Flüssigextrakt ViP-E_Matr’08_1102, hergestellt gemäss Beispiel 7 wurden Topoisomerase I Aktivitäts-Experimente mit Extraktkonzentrationen von 0,3, 1, 3, 10 oder 30 µg/ml durchgeführt. Als Positivkontrolle wurde Camptothecin mitgeführt.
[0048] Für die Messung der Hemmung der Topoisomerase l Aktivität wurde dieser Extrakt zu gereinigter menschlicher DNA Topoisomerase I und zum «Topoisomerase I Drug Screening Kit» von TopoGEN zugegeben. Dabei wurde gemäss dem Protokoll des Herstellers vorgegangen. Die DNA wurde durch Elektrophorese in einem Agarosegel aufgetrennt und unter UV-Licht nach Anfärben mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht. Mit diesem Ansatz konnte die relaxierte DNA (Topoisomere), welche durch die Topoisomerase I generiert wurde, detektiert und klar vom supercoiled DNA-Substrat abgetrennt werden.
[0049] Aus den in Fig. 10 gezeigten Daten ist ersichtlich, dass der Extrakt gemäss der vorliegenden Erfindung die Topoisomerase I-Aktivität nur sehr schwach aber in konzentrations-abhängiger Art hemmt.
Beispiel 12 (Hemmung der Topoisomerase Il-Aktivität)
[0050] Mit dem Flüssigextrakt ViP-E_Matr’08_1102, hergestellt gemäss Beispiel 7, dem Flüssigextrakt ViP-E_Matr’08_1106, hergestellt gemäss Beispiel 8, oder dem Flüssigextrakt ViP-E_Matr’08_1105, hergestellt gemäss Beispiel 9, wurden Topoisomerase Il-Aktivitäts-Experimente mit Extraktkonzentrationen von 0,3, 1 oder 3 µg/ml durchgeführt. Als Positivkontrolle wurde Etoposid mitgeführt.
[0051] Die Hemmung der Topoisomerase II wurde bestimmt durch Verwendung von gereinigter menschlicher DNA Topoisomerase IIa und des «Topoisomerase II Drug Screening Kit» von TopoGEN. Dabei wurde gemäss dem Protokoll des Herstellers vorgegangen. Die DNA wurde durch Elektrophorese in einem Agarosegel aufgetrennt und unter UV-Licht nach Anfärben mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht. Mit diesem Ansatz konnte die relaxierte DNA (Topoisomere), welche durch die Topoisomerase II generiert wurde, detektiert und klar vom supercoiled DNA-Substrat abgetrennt werden.
[0052] Aus den in Fig. 11 gezeigten Daten ist ersichtlich, dass alle Extrakte gemäss der vorliegenden Erfindung die Topoisomerase Il-Aktivität in konzentrationsabhängiger Art stark hemmen. Das Ausmass der Hemmung nimmt klar mit zunehmenden Konzentrationen an Ethanol % m/m als Extraktionsmittel (99 %>90%>80%) zu. Der Extrakt, hergestellt mit 99 % m/m Ethanol, zeigte eine praktisch vollständige Hemmung der Enzymaktivität, sogar bei einer so niedrigen Konzentration wie 300 ng/ml.
[0053] Diese Hemmung war mehr als hundertfach stärker als die Hemmung, welche mit dem wässrigen Extrakt gemäss Beispiel 4 erhalten wurde. Nahezu 150 µg/ml waren notwendig für die vollständige Hemmung (Daten nicht gezeigt).
Beispiel 13 (Induktion der Zellzyklusarretierung in der S-Phase)
[0054] Mit dem Flüssigextrakt VI P-E_Matr’06_1003, hergestellt gemäss Beispiel 4, wurden Zellzyklus-Analyse-Experimente durchgeführt. Als Positivkontrolle für die Zellzyklusarretierung in der S-Phase wurde Camptothecin mitgeführt.
[0055] Für die Messung der Induktion der Zellzyklus-Arretierung wurde dieser Extrakt zu HepG2 Zellen in Konzentrationen von 10, 50, 100 oder 150 µg/ml hinzugegeben.
[0056] Die so behandelten Zellen wurden während 48 Stunden in 10% FBS Kulturmedium kultiviert.
[0057] Anschliessend wurde die Veränderung der Menge an Zellen in der G1-, S-oder G2-Phase des Zellzyklus mittels der Zellzytometrie-Analyse bestimmt.
[0058] Aus den in Fig. 12 gezeigten Daten ist ersichtlich, dass der Extrakt gemäss der vorliegenden Erfindung eine starke Zellzyklus-Arretierung in der S-Phase schon nach 48 Stunden Inkubation bei so niedrigen Konzentrationen wie 10 µg/ml induziert.
[0059] Die Zusammensetzungen gemäss der Erfindung können mittels dem Fachmann bekannter Verfahren formuliert werden. Pharmazeutisch annehmbare Komponenten sollten verwendet werden.
[0060] Die Verabreichung erfolgt vorzugsweise durch intravenöse, oder noch bevorzugter durch intramuskuläre Injektion.
[0061] Die pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend den aktiven Inhaltsstoff, kann auch in einer Form sein, welche für die orale Verwendung geeignet ist.
[0062] Die therapeutische Verwendung umfasst die Behandlung (und möglicherweise auch die Vorbeugung) von Krebs, zum Beispiel Lungenkrebs, Leberkrebs und Bauchspeicheldrüsenkrebs. Andere Verwendungen umfassen die topischen Zustände, wie etwa Psoriasis, Sklerodermie und Pemphigus, infektiöse Bronchitis, Krebserkrankungen, einschliesslich Sarkomas (wie etwa Kaposi’s Sarkoma), Leukämie, Hautkrebs und Karzinome, deren Behandlung weiter unten spezifisch illustriert wird, wie auch AIDS. Allgemeiner kann die Zusammensetzung für die Therapie von proliferativen und viralen Zuständen verwendet werden, insbesondere jene, welche mit DNA- oder RNA-Viren assoziiert sind. Die Wirkung auf RNA-Viren kann direkt sein, währendem die Wirkung auf DNA-Viren und Krebs wenigstens progressiv sein kann. Das Arzneimittel kann auch wertvoll sein bei der Therapie von anderen genetischen Funktionsstörungen, wie etwa motorische neuronale Erkrankungen und Multiple Sklerose.
[0063] Das Medikament kann auch verwendet werden, um andere virale Zustände zu behandeln. Zum Beispiel kann der Virus ein Koronavirus sein, wie im Fall von SARS (severe acute respiratory Syndrome). Ausserdem kann das Medikament eine Nützlichkeit in der Veterinärmedizin haben, beispielsweise bei Geflügelkrankheiten, wie Newcastle-Krankheit und Geflügelpocken.
[0064] Die folgende Studie illustriert weitere Aspekte der Erfindung, erhalten mit dem Extrakt gemäss Beispiel 4.
[0065] Im folgenden Teil wird eine kurze Beschreibung der Figuren gegeben:
<tb>Fig. 1<sep>bezieht sich auf System 4 und zeigt den Effekt des Extraktes gemäss Beispiel 4 auf die DNA-Synthese (A), auf die RNA-Synthese (B) und auf die Proteinbiosynthese (C) in HepG2 Zellen. Die verwendeten Extraktkonzentrationen sind 150, 500 und 1660 µg/ml.
<tb>Fig. 2<sep>ist in Analogie zu Fig. 1, aber die verwendeten Extraktkonzentrationen sind 10, 50, 100 und 150 µg/ml.
<tb>Fig. 3<sep>bezieht sich auf System 4 und zeigt den Effekt des Extraktes gemäss Beispiel 4 auf die RNA-Synthese (A) und auf die Proteinbiosynthese (B), berechnet unter Berücksichtigung der Resultate, welche in Fig. 2(A) gezeigt sind.
<tb>Fig. 4<sep>bezieht sich auf System 4 und zeigt den Effekt des Extraktes gemäss Beispiel 4 auf die DNA-Synthese (A), auf die RNA-Synthese (B) und auf die Proteinbiosynthese (C) in HT1376 Zellen. Die verwendeten Extraktkonzentrationen sind 150, 500 und 1660 µg/ml.
<tb>Fig. 5<sep>bezieht sich auf System 4 und zeigt den Effekt des Extraktes gemäss Beispiel 4 auf die DNA-Synthese (A), auf die RNA-Synthese (B) und auf die Proteinbiosynthese (C) in C33-A Zellen. Die verwendeten Extraktkonzentrationen sind 150, 500 und 1660 µg/ml.
<tb>Fig. 6<sep>bezieht sich auf System 5 und zeigt den Effekt des Extraktes gemäss Beispiel 4 auf die Induktion der Apoptose in HepG2 Zellen nach 24 Stunden. Die verwendeten Extraktkonzentrationen sind 10, 50, 100, 150 und 300 µg/ml.
<tb>Fig. 7<sep>bezieht sich auf System 5 und zeigt den Effekt des Extraktes gemäss Beispiel 4 auf die Zytotoxizität (Membranintegrität) in HepG2 Zellen nach 24 Stunden. Die verwendeten Extraktkonzentrationen sind 10, 50, 100, 150 und 300 µg/ml.
<tb>Fig. 8<sep>bezieht sich auf System 5 und zeigt den Effekt des Extraktes gemäss Beispiel 4 auf die Induktion der Apoptose in HepG2 Zellen nach 48 Stunden. Die verwendeten Extraktkonzentrationen sind 10, 50, 100, 150 und 300 µg/ml.
<tb>Fig. 9<sep>bezieht sich auf Beispiel 10 und zeigt den Effekt des Extraktes gemäss Beispiel 4 auf die Induktion der Ornithindecarboxylase-Expression in HepG2 Zellen nach 6, 24 und 48 Stunden. Die verwendeten Extraktkonzentrationen sind 30, 100 und 150 µg/ml.
<tb>Fig. 10<sep>bezieht sich auf Beispiel 11 und zeigt den Effekt des Extraktes gemäss Beispiel 7 auf die Hemmung der Topoisomerase I in einem zellfreien Assay. Die verwendeten Extraktkonzentrationen sind 0,3, 1, 3, 10 und 30 µg/ml. Als Positivkontrolle wurde Camptothecin verwendet.
<tb>Fig. 11<sep>bezieht sich auf Beispiel 12 und zeigt den Effekt des Extraktes gemäss den Beispielen 7, 8 und 9 auf die Hemmung der Topoisomerase II in einem zellfreien Assay. Die verwendeten Extraktkonzentrationen sind 0,3, 1 und 3 µg/ml. Als Positivkontrolle wurde Etoposid verwendet.
<tb>Fig. 12<sep>bezieht sich auf Beispiel 13 und zeigt den Effekt des Extraktes gemäss Beispiel 4 auf die Induktion der Zellzyklus-Arretierung in der S-Phase in HepG2 Zellen. Die verwendeten Extraktkonzentrationen sind 10, 50, 100 und 150 µg/ml. Als Positivkontrolle wurde Camptothecin verwendet.
1) Ziel der Studie
System 4: RNA-, DNA- und Proteinbiosynthese
[0066] Der Einfluss des Extraktes gemäss Beispiel 4 auf die RNA-, DNA- und Proteinbiosynthese unter Verwendung von drei verschiedenen Zelllinien (HepG2: Leberkarzinomzellen; C33-A: Gebärmutterhalskarzinomzellen und HT1376: Blasenkarzinomzellen) wurde in vitro untersucht.
System 5: Apoptose und Membranintegrität
[0067] Zusätzlich wurde der Einfluss des Extraktes gemäss Beispiel 4 auf die Induktion der Apoptose in HepG2 Zellen geprüft. Gleichzeitig wurde die Zytotoxizität (Membranintegrität) des Extraktes gemäss Beispiel 4 in HepG2 Zellen untersucht.
2) Material und Methoden
2.1) Proben und Probenherstellung
[0068]
<tb>Extrakt<sep>Beschreibung<sep>Bezugsquelle<sep>Charge<sep>Extrakt Typ
<tb>VIP-E_Matr’06_1003<sep>Matricaria recutita Röhrenblüten<sep>Pentapharm<sep>578-01/End; 7.20.2006<sep>WässrigVIP-E_Matr’06_1003 wurde gemäss Beispiel 4 hergestellt.
2.2) Assay-Bedingungen
[0069]
<tb>Assay<sep>Zelllinien<sep>Inkubationszeit<sep>Probe<sep>Probenkonzentration
<tb>RNA-Synthese<sep>HepG2 C33-A
HT1376<sep>24h<sep>VIP-E_Matr’06_1003<sep>150/500/
1660µg/ml
10/50/100/150 µg/ml
<tb>DNA-Synthese<sep>HepG2 C33-A
HT1376<sep>24h<sep>VIP-E_Matr’06_1003<sep>150/500/1660 µg/ml
<tb>Proteinbiosynthese<sep>HepG2 C33-A
HT1376<sep>24h<sep>VIP-E_Matr’06_1003<sep>150/500/1660 µg/ml
<tb>Apoptose<sep>HepG2<sep>24h<sep>VIP-E Matr’06 1003<sep>10/50/100/150/300 µg/ml
<tb>Zytotoxizität
(Membranintegrität)<sep>HepG2<sep>24h<sep>VIP-E_Matr’06_1003<sep>10, 50, 100, 150, 300 µg/ml
2.3) Assays
2.3.3) RNA-/ DNA-Synthese
[0070] Für die RNA- und DNA-Synthese wurden Assay-Zellen (HepG2: humane Leberkarzinomzellen; C33-A: humane Gebärmutterhalskarzinomzellen und HT1376: humane Blasenkarzinomzellen) durch Trypsinisierung geerntet (harvested) und bei 10 000 Zellen/Loch (cells/well) in einer 96-Loch-Platte ausgesät. Nach der Behandlung der Zellen mit den Proben in den benötigten Konzentrationen wurde die Platte während zwei Stunden bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Die Zellen wurden für die RNA-Synthese mit 5-<3>H-Uridin (1µCi/ml) (Perkin Elmer) und für die DNA-Synthese mit 6-<3>H-Thymidin (1µCi/ml) (Perkin Elmer) während einer weiteren Inkubationsperiode von 24 Stunden gepulst. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen und zweimal mit Methanol während 5 Minuten fixiert. Das Protein wurde mit 0,3 N TCA gefällt. Nach einem Waschschritt wurden 150 µl 0,3 N NaOH während 15 Minuten hinzugegeben, um die Zellen zu lysieren. Negativkontrollen t(0) wurden mit den Proben ohne Zellen durchgeführt.
[0071] Um das eingebaute 5-<3>H-Uridin für die RNA-Synthese und das eingebaute 6-<3>H-Thymidin für die DNA-Synthese aufzufinden, wurden die Proben in Szintillationsröhrchen mit Szintillationscocktail transferiert. Die Quantifizierung wurde in einem Tri-Carb 1900 TR Flüssigszintillationszähler (Packard, USA) durchgeführt.
[0072] Der Effekt von verschiedenen Konzentrationen an Proben wurde durch Bestimmung der Menge an Radiomarker (dpm) unter den Assaybedingungen gemessen. Dosisbezogene Werte wurden in Prozenten der Positivkontroliwerte ausgedrückt. Probenpunkte wurden als Duplikate gemessen, Fehler wurden als Differenz vom Mittelwert ausgedrückt.
[0073] Das spezifische zelluläre 5-<3>H-Uridin-Einbauverhältnis (%) wurde unter Berücksichtigung der Resultate aus dem DNA-Synthese-Assay berechnet. Die jeweiligen Synthesewerte (%) wurden durch den DNA-Synthesekoeffizienten geteilt.
2.3.4) Proteinbiosynthese
[0074] Für die Proteinbiosynthese wurden Assay-Zellen (HepG2: humane Leberkarzinomzellen; C33-A: humane Gebärmutterhalskarzinomzellen und HT1376: humane Blasenkarzinomzellen) durch Trypsinisierung geerntet und bei 10’000 Zellen/Loch in einer 96-Loch-Platte ausgesät. Nach der Behandlung der Zellen mit den Proben in den benötigten Konzentrationen wurde die Platte während zwei Stunden bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Die Zellen wurden mit L-[3,4,5-<3>H(N)]-Leucin (1µCi/ml) (Perkin Elmer) während einer weiteren Inkubationsperiode von 24 Stunden gepulst. Die Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen, mit RIPA-Puffer lysiert und auf Eis während 15 Minuten inkubiert. Das Lysat wurde in ein Röhrchen transferiert. 250 µl eiskaltes TCA (20%) wurden hinzugegeben und die Proben wurden auf Eis während weiteren 15 Minuten inkubiert. Nach der Zentrifugation während 20 Minuten bei 10 000 µg und 4°C wurde der Überstand entfernt und das Pellet in 250 µl TCA (5%) resuspendiert und wieder zentrifugiert. Die erhaltenen Lysate jeder Probe wurden in 250 µl NaOH (0,2N) resuspendiert und während zwei Minuten bei 50°C erhitzt. Negativkontrollen t(0) wurden mit den Proben ohne Zellen durchgeführt.
[0075] Um das eingebaute L-[3,4,5-<3>H(N)]-Leucin aufzufinden, wurden die Proben in Szintillationsröhrchen mit Szintillationscocktail transferiert. Die Quantifizierung wurde in einem Tri-Carb 1900 TR Flüssigszintillationszähler (Packard, USA) durchgeführt.
[0076] Der Effekt von verschiedenen Konzentrationen der Proben wurde durch Bestimmung der Menge an Radiomarker (dpm) unter den Assaybedingungen gemessen. Dosisbezogene Werte wurden in Prozenten der Positivkontrollwerte ausgedrückt. Probenpunkte wurden als Quadruplikate gemessen, Fehler wurden als Standardabweichung ausgedrückt.
[0077] Das spezifische zelluläre L-[3,4,5-<3>H(N)]-Leucin Einbauverhältnis (%) wurde unter Berücksichtigung der Resultate aus dem DNA-Synthese-Assay berechnet. Die jeweiligen Synthesewerte (%) wurden durch den Proliferationskoeffizienten geteilt.
2.3.5) Apoptose Assay
[0078] HepG2 Zellen (humane Leberkarzinomzellen) wurden durch Trypsinisierung geerntet und bei 10 000 Zellen/Loch in 100 µl in einer 96-Loch-Platte ausgesät. Nach 24 Stunden wurden 20 µl Proben und 80 µl an frischem Medium (Gesamtvolumen 200 µl) zugegeben. Die Platte wurde während 24 Stunden und in einem weiteren Experiment während 48 Stunden weiter inkubiert. Nach der Zentrifugation der Platte während 10 Minuten bei 200 µg wurde der Überstand entfernt und das Pellet wurde während 30 Minuten bei Raumtemperatur in 200 µl Lyse-Puffer lysiert. Das Lysat wurde schlussendlich während 10 Minuten bei 200 µg zentrifugiert. Die Lösungsmittelkontrolle (= Negativkontrollen) wurden mit Lösungsmittel anstelle der Probe durchgeführt. Die Aussaat und die Inkubation wurden in einem Inkubator bei 37°C und 5% CO2 durchgeführt.
[0079] Die zytoplasmatischen Histon-assoziierten DNA-Fragmente (Mono- und Oligonukleosome) im Lysat-Überstand wurden in vitro mittels eines Zelltodbestimmungs-ELISA<plus> Kits (Roche, Katalog-Nr. 11 774 425 001) gemäss den Empfehlungen des Herstellers bestimmt.
[0080] Die Absorption wurde mit einem Mikroplatten-Lesegerät (TECAN Infinite M200) bei einer Wellenlänge von λ = 405 nm und einer Referenzwellenlänge von λ = 490 nm gemessen. Der spezifische Anreicherungsfaktor an ins Zytoplasma freigesetzten Mono- und Oligonukleosomen wurde wie folgt berechnet:
<tb>Anreicherungsfaktor<sep>=<sep>Absorption der Probe/Absorption der entsprechenden Negativkontrolle
[0081] Probenpunkte wurden als Duplikate gemessen, Fehler sind als Differenz aus dem Mittelwert ausgedrückt.
2.3.6) LDH-Zytotoxizitäts-Assay (Induktion von Nekrose)
[0082] LDH-Zytotoxizitäts-Assay (Membranintegrität/Induktion von Nekrose):
Die Zytotoxizität wurde an HepG2 Zellen (humane Leberkarzinomzellen) untersucht. Die Zellen wurden in einer 96-Loch-Platte bei 10 000 Zellen pro Loch über Nacht ausgesät. 20 µl der jeweiligen Proben und Lösungsmittelkontrollen in den angegebenen Konzentrationen und 80 µl an frischem Medium (Gesamtvolumen 200 µl) wurden hinzugegeben. Die Aussaat und die Inkubation wurden in einem Inkubator bei 37°C und 5% CO2durchgeführt. Nach einer Inkubationszeit von 24 Stunden wurde die Membranintegrität mittels eines LDH-Zytotoxizität Assay-Kits (BioVision, #K311–400, CA USA) gemessen.
[0083] Die Membranintegrität der Zellen wurde mittels Messung der Aktivität von zytosolischer Laktat-Dehydrogenase (LDH), welche unter dem Einfluss der Proben ins Medium freigegeben wurde, bestimmt. Die Aktivität des Enzyms wurde durch Bestimmung von Formazan gemessen, welches aus dem Substrat Tetrazoliumsalz INT gebildet wird. Die Menge an Formazan wurde durch Bestimmung der optischen Dichte (OD) mittels eines Plattenlesers (TECAN Infinite M200) bei einer Wellenlänge von λ=490 nm direkt gemessen.
[0084] Für jede Testkonzentration wurden die OD-Werte des Hintergrunds (Assaygemisch mit Proben aber ohne Zellen) von den OD-Messungen mit Zellen subtrahiert. OD490-Werte wurden in Prozentwerte umgewandelt, wobei die Zytotoxizitätsmessungen von 100% den Messungen der lysierten Zellen (Triton X-100) mit Lösungsmittel entsprechen, und die Zytotoxizitätsmessungen von 0% den nur mit Lösungsmittel inkubierten Zellen entsprechen. Die optischen Messungen wurden als Duplikate durchgeführt. Fehler wurden als Differenz vom Mittelwert ausgedrückt.
4) Zusammenfassung
[0085] Mit Bezug auf die DNA-, RNA- und Proteinbiosynthese zeigt der Extrakt gemäss Beispiel 4 die folgenden Effekte: Die DNA-Synthese wird Dosis-abhängig unterdrückt, währendem die RNA-Synthese bis zu deutlich hohen Dosen immer noch intakt ist und die Proteinbiosynthese nur marginal beeinflusst wird, oder bei Anpassung an die Menge der proliferierenden Zellen sogar zunimmt (Fig. 3). Dieser Effekt ist ersichtlich für alle drei Zelllinien in nicht-zytotoxischen Dosis-Bereichen und kann als ein Zeichen für eine Zell-Arretierung und eine mögliche Differenzierung interpretiert werden. Alle untersuchten Karzinomzellen, HepG2 Leberkarzinomzellen, HT1376 Blasenkarzinomzellen und C33-A Gebärmutterhalskarzinomzellen, zeigten dieses Phänomen.
[0086] In den anschliessend initiierten Untersuchungen mit HepG2 Zellen für die Unterscheidung zwischen Apoptose und Nekrose (angezeigt durch LDH-Entweichung und Verlust an Zellmembranintegrität) wurde nach 24 Stunden keine Induktion von Apoptose gefunden, sogar bei der höchsten untersuchten Dosis-Menge. Der Extrakt gemäss Beispiel 4 zeigte keine Effekte, weder Apoptose noch Zytotoxizität.
[0087] Daher wurde entschieden, ein weiteres Experiment mit einer Inkubation der Zellen während 48 Stunden durchzuführen. Interessanterweise wurde nach 48 Stunden auch keine Induktion der Apoptose gefunden.
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Claims (27)
1. Zusammensetzung, enthaltend einen wässrigen oder organischen Extrakt aus wenigstens einer Chamomilla Pflanze und/oder aus wenigstens einer Achillea Pflanze, für die Behandlung eines abnormalen proliferativen und/oder viralen Zustandes.
2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Behandlung des abnormalen proliferativen Zustandes die Synchronisierung und die S-Phase-Arretierung von abnormalen proliferativen Säugerzellen, insbesondere Krebszellen, umfasst.
3. Zusammensetzung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die genannte Synchronisierung die Induktion von Ornithindecarboxylase und/oder die Hemmung von Topoisomerase II umfasst.
4. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die genannten organischen Extrakte erhältlich sind durch eine Extraktion mit einem Alkohol, insbesondere ein Alkohol mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen, wobei Ethanol speziell bevorzugt ist.
5. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Extrakte erhältlich sind aus
– Blumenköpfen der Chamomilla Pflanze, insbesondere Röhrenblüten, welche frei von Apigenin und Apigeninglykosiden sind, und/oder
– dem Kraut und/oder den Blumenköpfen der Achillea Pflanze.
6. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Chamomilla Pflanze ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus
– Matricaria Spezies, insbesondere
– Matricaria recutita L
– Matricaria discoidea DC.
– Anthemis Spezies, insbesondere -- Anthemis nobilis L.
Anthemis arvensis L.
– Anthemis cotula L.
– Anthemis tinctoria L.
– Ormenis muiticaulis Br.-Bl. & Maire
– Eriocephalus punctulatus DC,
wobei Matricaria recutita L. speziell bevorzugt ist.
7. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die zu extrahierenden Pflanzenteile vorgängig einer Wasserdampfdestillation unterworfen werden, um die ätherischen Öle zu entfernen.
8. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass der primäre flüssige wässrige oder organische Extrakt einer Molekulargewichtsfiltration unterworfen wird, um die Komponenten zu sammeln, welche ein Molekulargewicht von weniger als 10 000 Dalton haben, und um die Komponenten zu entfernen, welche ein Molekulargewicht von mehr als 10 000 Dalton haben, wobei die erhaltene flüssige Extrakt-Fraktion gegebenenfalls zu einem Trockenpulver verarbeitet wird.
9. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass der primäre flüssige wässrige oder organische Extrakt einer Molekulargewichtsfiltration unterworfen wird, um die Komponenten zu sammeln, welche ein Molekulargewicht von mehr als 10 000 Dalton haben, und um die Komponenten zu entfernen, welche ein Molekulargewicht von weniger als 10 000 Dalton haben, wobei die erhaltene flüssige Extrakt-Fraktion gegebenenfalls zu einem Trockenpulver verarbeitet wird.
10. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass sie wenigstens ein pharmazeutisch und/oder ein dermatologisch annehmbares Hilfsmittel enthält.
11. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die genannte Behandlung die simultane oder sequentielle Verabreichung dieser Zusammensetzung und wenigstens eines Anti-Tumor-Mittels umfasst.
12. Zusammensetzung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die genannte Behandlung
– die Verabreichung dieser Zusammensetzung während wenigstens zwei Tagen, vorzugsweise während wenigstens 5 Tagen, umfasst, um die genannten abnormalen proliferativen Säugerzellen, insbesondere die genannten Krebszellen, zu synchronisieren, und um sie in der S-Phase zu arretieren, und anschliessend
– diese Verabreichung vor dem Beginn der Verabreichung von wenigstens einem Anti-Tumor-Mittel während wenigstens 6 Stunden, vorzugsweise während wenigstens 24 Stunden, ausgesetzt wird, wobei
– während der Verabreichung des genannten Anti-Tumor-Mittels diese Zusammensetzung nicht verabreicht wird, und wobei
– während der folgenden Auswaschphase des genannten Anti-Tumor-Mittels diese Zusammensetzung auch nicht verabreicht wird.
13. Zusammensetzung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass der genannte Behandlungszyklus wenigstens zweimal, vorzugsweise wenigstens dreimal, wiederholt wird.
14. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass das genannte Anti-Tumor-Mittel ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus
– Anti-Metaboliten,
– DNA-Alkylierungsmitteln,
– Mitose-Hemmstoffen, und
– DNA-interkalierenden Stoffen.
15. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass der primäre Extrakt wenigstens eine wasserlösliche Verunreinigung enthält, welche Lipid-Gruppen aufweist, welche durch die folgenden Schritte entfernt wird:
(i) Kontaktieren der Zusammensetzung mit einer lipophilen Komponente, welche einen Komplex mit der Verunreinigung bildet,
(ii) einen ersten Entfernungsschritt zur Entfernung von Material, welches eine Teilchengrösse grösser als der in Schritt (i) gebildete Komplex hat, und
(iii) einen zweiten Entfernungsschritt zur Entfernung des in Schritt (i) gebildeten Komplexes.
16. Zusammensetzung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Verunreinigung ein Endotoxin ist, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Fragmenten der Zellwand oder Fragmenten von Molekülen, welche die Zellwand von Gram-negativen Bakterien ausmachen, beispielsweise ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Lipopolysacchariden und Carbohydraten, welche Proteingruppen haben, im Speziellen Glykoproteine, welche wenigstens eine Lipidkette haben.
17. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 15 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass das Endotoxin ein Molekulargewicht von mehr als 10 000 Dalton hat, vorzugsweise mehr als 5000 Dalton, noch bevorzugter von mehr als 1000 Dalton, und am meisten bevorzugt von mehr als 500 Dalton.
18. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass die lipophile Komponente ein Öl ist, vorzugsweise ein fettes Öl.
19. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 15 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass der Schritt (iii) eine Ultrafiltration umfasst, vorzugsweise unter Verwendung eines Filters, welcher eine Porengrösse im Bereich von 0,001 bis 0,02 µm, bevorzugterweise von 0,001 bis 0,01 µm, hat.
20. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass der Extrakt frei oder nahezu frei von Endotoxinen ist, wobei der Extrakt Endotoxine in einer Menge von nicht mehr als 100 EU/ml – Endotoxin-Einheiten pro ml gemäss European Pharmacopoeia –, vorzugsweise nicht mehr als 50 EU/ml, beispielsweise 25 EU/ml, enthält.
21. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Behandlung durch Injektion der Zusammensetzung oder durch orale Verabreichung erfolgt.
22. Verwendung einer Zusammensetzung, enthaltend einen wässrigen oder organischen Extrakt aus wenigstens einer Chamomilla Pflanze und/oder aus wenigstens einer Achillea Pflanze, für die Behandlung eines abnormalen proliferativen und/oder viralen Zustandes.
23. Verwendung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung eine solche Zusammensetzung ist, wie sie in einem der Ansprüche 2 bis 21 definiert ist.
24. Verwendung einer Zusammensetzung, enthaltend einen wässrigen oder organischen Extrakt aus wenigstens einer Chamomilla Pflanze und/oder aus wenigstens einer Achillea Pflanze, für die Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung eines abnormalen proliferativen und/oder viralen Zustandes.
25. Verwendung nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung eine solche Zusammensetzung ist, wie sie in einem der Ansprüche 2 bis 21 definiert ist.
26. Verfahren für die Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers, welcher unter einem abnormalen proliferativen und/oder viralen Zustand leidet, dadurch gekennzeichnet, dass am Patienten eine Zusammensetzung, enthaltend einen wässrigen oder organischen Extrakt aus wenigstens einer Chamomilla Pflanze und/oder aus wenigstens einer Achillea Pflanze, angewendet oder ihm verabreicht wird.
27. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung eine solche Zusammensetzung ist, wie sie in einem der Ansprüche 2 bis 21 definiert ist.
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