CH700192B1 - Verfahren zur Herstellung einer Fermentationsbrühe. - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung einer Fermentationsbrühe. Diese Fermentationsbrühe enthält wenigstens ein Milchsäurebakterium, abgekürzt mit LAB, welches Folate herstellt, wenigstens ein Propionsäurebakterium, abgekürzt mit PAB, welches Vitamin B12 herstellt, freie Folate und Folate, welche in intrazellulärer Form im genannten Milchsäurebakterium vorhanden sind, Vitamin B12, vorhanden in intrazellulärer Form im genannten Propionsäurebakterium, Propionat und Acetat.

Description

  [0001]    Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung einer Fermentationsbrühe.

  

[0002]    Molke ist ein Nebenprodukt in der Käse-Industrie und enthält noch etwa 55 % der gesamten in der Milch enthaltenen Nährstoffe mit 44 bis 52 g/l Laktose, 6 bis 10 g/l Proteinen, 3 bis 7 g/l Mineralien und etwa 4 bis 5 g/l Fett. Es gibt zwei Arten von Molke: (1) süsse Molke von Lab-induzierter Koagulation und (2) saure Molke aus Fermentationen oder aus Säure-Koagulation. Molke-Permeat wird nach der Ultrafiltration von Molke erhalten und enthält weniger als 1.5 g/l Proteine.

   Die Abfallbeseitigung von Molke und von Molke-Permeat führt zu einer signifikanten Verschwendung von potentiellen Nahrungsmitteln und von Energie und zu schwerwiegenden Umweltproblemen; die physikalische und chemische Struktur des Erdbodens wird beeinträchtigt, und das Leben im Wasser wird durch eine Verringerung des gelösten Sauerstoffs reduziert (Panesar et al., 2007; Vasala et al., 2005; Gonzales Siso, 1996).

  

[0003]    Die Verwertung von Molke war Gegenstand von umfangreicher Forschung, und eine grosse Anzahl von Produkten kann aus Molke und aus Molkefermentationen erhalten werden, wie etwa Laktose, Ethanol, mikrobielle Biomasse, organische Säuren und fermentierte Getränke. Jedoch dominieren die Gewinnungskosten die Wirtschaftlichkeit der Verfahren (Mawson, 2003; Gonzales Siso, 1996). Ausserdem ist die Ergänzung mit leicht verdaulichen N-Verbindungen zwingend für die Verwendung von Molke als ein Substrat für Fermentationen (Lund et al., 1992).

  

[0004]    Milchsäurebakterien, abgekürzt mit LAB, Propionsäurebakterien, abgekürzt mit PAB, haben eine lange Tradition bei Fermentationen von Nahrungsmitteln. LAB verursachen eine rasche Ansäuerung durch die Herstellung von organischen Säuren und produzieren weitere Substanzen, wie etwa Aromaverbindungen, Bakteriozine und Exopolysaccharide. Von einigen LAB ist bekannt, dass sie Folate produzieren (Leroy und De Vuyst, 2004).

  

[0005]    Der Ausdruck "Folate" ist ein nichtspezifischer Ausdruck und bezieht sich auf irgendeine Folat-Verbindung mit Vitamin-Aktivität. Der Ausdruck "Folsäure" wird verwendet für das chemisch synthetisierte Vitamin (Hugenholtz und Smid, 2002).

  

[0006]    In der vorliegenden Erfindung wird der Ausdruck "Folate" dazu verwendet, um wenigstens eine Folat-Verbindung mit Vitamin-Aktivität zu beschreiben.

  

[0007]    PAB stellen Propionat und Acetat als die hauptsächlichen Endprodukte der Fermentation her, sind aber auch bekannt für Herstellung von Vitamin B12 in grösseren Mengen wie auch von Folaten (Hugenholtz et al., 2002; Hettinga und Reinbold, 1972).

  

[0008]    Der Ausdruck "Vitamin B12" wird verwendet, um irgendeine Verbindung der Cobalamin Gruppe zu beschreiben. Cyanocobalamin, per Definition Vitamin B12, wird industriell hergestellt, kommt aber in der Natur nicht vor (Piao et al., 2004).

  

[0009]    In der vorliegenden Erfindung wird der Ausdruck "Vitamin B12" dazu verwendet, um wenigstens eine Verbindung der Cobalamin Gruppe zu beschreiben zum Beispiel Hydroxocobalamin, Aquocobalamin, Nitritocobalamin, Adenosylcobalamin und Methylcobalamin.

  

[0010]    Die Folat-Biosynthese beginnt mit den 3 Vorläufern Guanosintriphosphat, abgekürzt mit GTP, p-Aminobenzoat, abgekürzt mit pABA, und Glutamat und kommt in vielen Pflanzen, einigen Pilzen und Bakterien vor (Quinlivan et al., 2006; Sybesma et al., 2003).

  

[0011]    Vitamin B12 wird nur durch Bakterien hergestellt. Dessen Biosynthese ist verschieden in aerobischen und anaerobischen Mikroorganismen und beginnt mit den 3 Vorläufern Uroporphyrinogen III, 5,6-dimethylbenzimidazol, abgekürzt mit DMBI, und einem Adenosyl-Teil im Falle von Adenosylcobalamin (Hugenholtz und Smid, 2002; Martens et al., 2002).

  

[0012]    Bei PAB ist die Herstellung in 2 Stufen aufgeteilt: eine anaerobische Stufe während der ersten 3 Tage der Fermentation, wo das Bakterium den Vitamin B12 Vorläufer Cobamid herstellt, gefolgt von einer aerobischen Stufe während 1 bis 3 Tagen für die Synthese von DMBI und dessen Verbindung mit dem Cobamid. Die genaue Erklärung für die aerobische Stimulation der Vitamin B12 Produktion ist jedoch noch nicht bekannt (Murooka et al., 2005; Hugenholtz et al., 2002).

  

[0013]    Nichtsdestotrotz führt für eine verbesserte Vitamin B12 Herstellung die Hinzugabe von Kobaltionen und DMBI in einem 2-Stufen Fermentationsverfahren in allen Fällen zu einer bedeutenden Verbesserung der Vitamin B12 Herstellung (Survase et al., 2006).

  

[0014]    Dabei scheint der Zeitpunk der Hinzugabe von DMBI wichtig zu sein und sollte während der letzten 24 Stunden der Fermentation erfolgen, da Marwaha et al. (1983) gefunden haben, dass zu einem früheren Zeitpunkt hinzugegebenes DMBI das Wachstum und die Vitamin B12 Herstellung von PAB hemmt. Ähnlich berichten Berry und Bullerman (1966) von negativen Effekten von DMBI auf die Vitamin B12 Herstellung, wenn DMBI zu Beginn der Fermentation hinzugegeben wird, verglichen mit keiner Zugabe von DMBI.

  

[0015]    LAB und PAB wachsen oft in gemischten Kulturen, wie etwa in Molkereiprodukten (zum Beispiel Schweizer Käse) oder in Silage. Interaktionen von gemischten Kulturen können einen positiven, neutralen oder negativen Effekt auf die Fitness der Zellen haben, abhängig von den Spezies und den Stämmen (Sieuwerts et al., 2008; Liu und Moon, 1982).

  

[0016]    Ausserdem sind LAB-PAB Co-Kulturen mit erhöhten antimikrobiellen Eigenschaften beschrieben, wenn sie zusammen wachsen, verglichen mit individuellen Kulturen (Miescher Schwenninger und Meile, 2004).

  

[0017]    Organische Säuren, welche durch diese Bakterien produziert werden, d.h. Acetat und Propionat, sind starke antimikrobielle Mittel mit minimalen Hemmkonzentrationen (MIC) von 50 bis 500 mM für Acetat und 10 bis 670 mM für Propionat, in Abhängigkeit vom pH und vom Organismus (Miescher Schwenninger et al., 2008; Suomalainen und Mäyrä-Mäkinen, 1999).

  

[0018]    Es ist davon auszugehen, dass in industrialisierten Ländern die genügende Einnahme von Folaten kritisch ist, bedingt durch die geringen Folatkonzentrationen in der täglichen Nahrung. Die durchschnittlichen Einnahmen werden auf 200 bis 300 [micro]g pro Tag geschätzt, und die für Erwachsene empfohlene Tagesdosis ("Recommended Dietary Allowance"; RDA) für Folate ist auf 200 bis 400 [micro]g pro Tag festgelegt (Tönz, 2002; Forssén et al., 2000).

  

[0019]    Im Gegensatz dazu ist die Vitamin B12 Einnahme oberhalb der RDA von 1 bis 3 [micro]g pro Tag, und Mängel können nur bei strikten Veganern und bei Menschen mit gastrointestinalen oder anderen Funktionsstörungen auftreten. Jedoch, bedingt durch eine reduzierte Absorption, wird bei mehr als 20% der älteren Menschen ein Vitamin B12 Mangel festgestellt (Ryan-Harshmann und Aldoori, 2008; Frank, 2002).

  

[0020]    Folate sind biologisch aktiv, indem sie C-1 Einheiten für die Herstellung von DNA und RNA und für den Metabolismus von bestimmten Aminosäuren tragen. Ein niedriger Folatstatus führt zu megaloblastischer Anämie, einem erhöhten Auftreten von Geburtsfehlern, stellt einen Risikofaktor für Krebs und koronare vaskuläre Krankheiten dar und steht im Zusammenhang mit Demenz und Alzheimer (Bekaert et al., 2008; Witthöft und Jägerstad, 2002).

  

[0021]    Folate stehen in naher metabolischer Beziehung zu Vitamin B12 via Methionin Transferase, welche ein Vitamin B12 abhängiges Enzym ist, welches benötigt wird, um Folate wieder in die aktive Form zurückzubringen (Reynolds, 2006).

  

[0022]    Wie bei den Folaten führen auch Vitamin B12 Mängel zu megaloblastischer Anämie, aber auch zu neurologischen und psychiatrischen Störungen (Truswell, 2007).

  

[0023]    Ein Hauptproblem einer Folatergänzung bei Menschen besteht in der Maskierung eines Vitamin B12 Mangels und daher einer irreversiblen Schädigung des Nervensystems (Stover, 2004).

  

[0024]    Es ist von einigen weiteren potentiellen negativen Einflüssen auf die Folatergänzung bei einem gleichzeitig geringen Vitamin B12 Status (Aspekten bei einer Folatsupplementierung in Gegenwart eines geringen Vitamin B12 Status) berichtet worden. Neue Anzeichen deuten darauf hin, dass Personen mit einem tiefen Vitamin B12 Status und hohen Folatkonzentrationen einem hohen Risiko an Gedächtnisschädigung und Anämie ausgesetzt sind (Refsum und Smith, 2008; Johnson, 2007).

  

[0025]    Neueste Daten zeigen somit die Wichtigkeit, ein gutes Gleichgewicht zwischen Folaten und Vitamin B12 aufrechtzuerhalten. Die Co-Anreicherung mit Folaten und Vitamin B12 könnte simultan den Folat- und den Vitamin B12 Status verbessern (Winkels et al., 2008). Basierend auf diätetischen Empfehlungen wäre ein Folat zu Vitamin B12 Verhältnis von 130-200:1 optimal für die Nahrungsmittelergänzung.

  

[0026]    Neueste Daten weisen auch auf die Notwendigkeit hin, zwischen natürlich auftretenden Folaten und synthetischen Formen von Folaten, also Folsäure, zu unterscheiden, welche kommerziell mittels chemischer Synthese hergestellt und zu Nahrungsergänzungsmitteln und angereicherten Nahrungsmitteln hinzugegeben wird (Wright et al., 2007; Ulrich und Potter, 2006; Lucock, 2000). Es ist gezeigt worden, dass die Absorption und Biotransformation von synthetischer Folsäure ein Sättigungsniveau hat, welches, wenn überschritten, die Möglichkeit einer Belastung mit unmetabolisierter Folsäure erhöhen kann.

  

[0027]    Das Gesundheitsrisiko einer solchen Belastung ist noch nicht im Detail bekannt, aber das Risiko für einige Krebsarten kann erhöht werden.

  

[0028]    Synthetische Folsäure ist billig herzustellen und ist hochstabil im Vergleich zu den meisten natürlichen Formen dieses Vitamins. Verschiedene Verfahren für die Synthese von Folsäure sind beschrieben worden, aber bislang sind in Abhängigkeit des Verfahrens nur Ausbeuten von 12,6-84% erhalten worden (Wehrli, 1995). Im Jahr 1991 wurden weltweit ca. 300 t Folsäure mit einem Wert von etwa 30 Millionen USD hergestellt (Eurolex, 2003).

  

[0029]    Im Gegensatz zur chemisch-synthetischen Folsäure wird Vitamin B12 ausschliesslich mittels biosynthetischer Fermentationsverfahren hergestellt, weil eine chemische Synthese weitaus technisch zu schwierig und teuer ist. Mehr als 10 t an Vitamin B12 werden jährlich hergestellt. Dabei werden hohe Ausbeuten an Vitamin B12 erhalten und es werden ausgewählte und genetisch optimierte Mikroorganismen verwendet (Martens et al., 2002).

  

[0030]    Die Verwendung von Mikroorganismen in Lebensmittelqualität hat jedoch den Vorteil, dass die Vitamine in situ im Lebensmittel hergestellt werden können, was eine komplexe Extraktion und Reinigung der Vitamine unnötig macht.

  

[0031]    Ausserdem können Produkte, welche adäquate Konzentrationen an natürlich hergestellten Folaten und Vitamin B12 enthalten, die problematische Einnahme von synthetischer Folsäure vermeiden, weil keine nachteiligen Gesundheitsrisiken von natürlich hergestellten Folaten bekannt sind. Gleichzeitig können sie zu einer genügenden und ausgewogenen Einnahme von beiden Vitaminen beitragen, was wichtig ist für deren vorteilhafte Effekte.

  

[0032]    Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, die von Jahr zu Jahr zunehmende Menge an Molke zu reduzieren, welche als Nebenprodukt bei der Käseherstellung erhalten wird.

  

[0033]    Molke soll in ein verwandelbares und gefragtes neues Produkt umgewandelt werden uns soll einen hohen Marktwert haben.

  

[0034]    Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung einer Fermentationsbrühe zur Verfügung zu stellen.

  

[0035]    In diesem Verfahren soll Molke als Wachstumsmedium verwendet werden, insbesondere angereicherte Molke und/oder angereichertes Molke-Permeat, wobei die genannte Molke vorzugsweise als Nebenprodukt bei der Käseherstellung erhalten wird.

  

[0036]    Die mit diesen Verfahren erhaltene Fermentationsbrühe soll natürlich hergestellte Folate und natürlich hergestelltes Vitamin B12 in adäquaten Konzentrationen enthalten.

  

[0037]    Die mit diesen Verfahren erhaltene Fermentationsbrühe soll einen Nährstoffgehalt und/oder antimikrobielle Eigenschaften haben.

  

[0038]    In diesen Verfahren sollen Bakterien verwendet werden, welche Folate und/oder Vitamin B12 herstellen.

  

[0039]    Dieses Verfahren soll einfach und kostengünstig sein.

  

[0040]    Mit der vorliegenden Erfindung werden diese Ziele erreicht.

  

[0041]    Völlig überraschend ist gefunden worden, dass bei der Anwendung von Co-Kulturen, bestehend aus Folate und Vitamin B12 produzierenden LAB und PAB Stämmen, und unter Verwendung ihrer komplementären Metabolismen für die simultane Herstellung von beiden Vitaminen, diese verwendet werden können, um eine solche Fermentationsbrühe herzustellen.

  

[0042]    Zudem führt die Verwendung von Co-Kulturen aus Folate und Vitamin B12 produzierenden LAB und PAB Stämmen zu einem erhöhten Folatgehalt, verglichen mit einer Einzelkultur mit nur LAB.

  

[0043]    Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung einer Fermentationsbrühe, enthaltend
wenigstens ein Milchsäurebakterium, abgekürzt mit LAB, welches Folate herstellt,
wenigstens ein Propionsäurebakterium, abgekürzt mit PAB, welches Vitamin B12 herstellt,
freie Folate und Folate, welche in intrazellulärer Form im genannten Milchsäurebakterium vorhanden sind,
Vitamin B12, vorhanden in intrazellulärer Form im genannten Propionsäurebakterium,
Propionat und
Acetat,dadurch gekennzeichnet, dass ein Gemisch aus
wenigstens einem Milchsäurebakterium, welches Folate herstellt,
wenigstens einem Propionsäurebakterium, welches Vitamin B12 herstellt, und
einem Wachstumsmedium für die Kultivierung von Bakterien, welches ein hinzugefügtes Kobaltsalz enthält,hergestellt wird,

   dann dieses Gemisch während wenigstens 96 Stunden unter Bedingungen kultiviert wird, welche die Bildung der genannten Folate und des genannten Vitamins B12 ermöglichen, und schlussendlich die resultierende Fermentationsbrühe gesammelt wird.

  

[0044]    Eine Fermentationsbrühe, enthaltend
wenigstens ein Milchsäurebakterium, abgekürzt mit LAB, welches Folate herstellt,
wenigstens ein Propionsäurebakterium, abgekürzt mit PAB, welches Vitamin B12 herstellt,
freie Folate und Folate, vorhanden in intrazellulärer Form im genannten Milchsäurebakterium,
Vitamin B12, vorhanden in intrazellulärer Form im genannten Propionsäurebakterium,
Propionat und
Acetat,kann verwendet werden
als Nahrungsmittel, oder
als Zusatzstoff in einem Nahrungsmittel, oder
als eine aktive Komponente in einem Medikament für die Vorbeugung und/oder Behandlung von Vitaminmängeln, oder
für die Herstellung eines Medikamentes für die Vorbeugung und/oder Behandlung von Vitaminmängeln.

  

[0045]    Bevorzugte Ausführungsformen dieser Erfindung sind in den abhängigen Ansprüchen definiert.

  

[0046]    Im folgenden Teil werden mögliche Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung beschrieben.

  

[0047]    Die folgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung illustrieren.

Beispiel 1 (Herstellung einer Fermentationsbrühe)

  

[0048]    Wenn nicht anders vermerkt, dann sind alle Chemikalien bei Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Buchs, Schweiz, bezogen worden.

A. Inokulum

  

[0049]    Lactobacillus plantarum SM39 / DSM 22118 - hinterlegt am 15.12. 2008 bei DSMZ (Braunschweig, Deutschland) - und Propionibacterium freudenreichii DF13 / DSM 22120 - hinterlegt am 15.12. 2008 bei DSMZ (Braunschweig, Deutschland) - wurden separat als gefrorene Vorräte ("stocks") bei einer Temperatur von -80[deg.]C in Glycerol (1:1) gelagert und wenigstens dreimal bei einer Temperatur von 30[deg.]C in angereichertem Molke-Permeat (abgekürzt mit SWP; siehe weiter unten) vor der Herstellung des Inokulums separat subkultiviert. Die OD600 (optische Dichte, gemessen bei 600 nm) von frisch gewachsenen Kulturen (4 d für PAB, 1 d für LAB) wurde gemessen und auf 2,0 für PAB und 0,2 für LAB eingestellt, entsprechend 10<9> und 10<7> KBE/ml (koloniebildende Einheit/ml).

   Ein 1-% Inokulum von jeder dieser standardisierten Kulturen wurde dann verwendet, um die Fermentoren zu inokulieren.

B. Herstellung von angereichertem Molke-Permeat (SWP)

  

[0050]    SWP besteht aus 6% Molke-Permeat (w/v), 0,98% K2HPO4(w/v), 0,48% KH2PO4 (w/v), 0,02 % Magnesiumsulfat (w/v), 0,005 % Mangansulfat (w/v) und 1% Hefeextrakt (w/v) und hatte einen schlussendlichen pH von 6,2. Dessen Herstellung wurde wie folgt gemacht:
8,6% Molke-Permeat (w/v; Emmi Schweiz AG, Dagmersellen, Schweiz, "Permeatpulver" Artikelnummer 1000074/FP1076) mit einem auf 5,0 (5 M HCl) eingestellten pH wurde autoklavisiert (121[deg.]C, 15 min) und filtriert (Celluloseacetat Membran, 0.2 [micro]m; VWR International AG, Dietikon, Schweiz). 700 ml dieses autoklavisierten und filtrierten Molke-Permeats wurden mit 150 ml einer Mg/Mn Lösung [2,73 g/l Magnesiumsulfat-heptahydrat und 0,37 g/l Mangansulfatmonohydrat] vermischt und wieder autoklavisiert (121[deg.]C, 15 min).

  

[0051]    Zusätzlich wurden 100 ml 1 M Kaliumphosphat Puffer (pH 6,4) und 50 ml 20% Hefeextrakt (w/v, VWR International AG, Dietikon, Schweiz) vermischt und autoklavisiert (121[deg.]C, 15 min).

  

[0052]    Der genannte 1 M Kaliumphosphat Puffer wurde hergestellt durch Vermischen von 27,8 ml 1 M K2HPO4 und 72,2 ml 1 M KH2PO4.

  

[0053]    Schlussendlich wurden beide Lösungen entweder in einem sterilen Behälter für die Herstellung des Inokulums aseptisch vermischt oder aseptisch in den Fermentor mit Hilfe eines sterilen Trichters zusammen mit dem standardisierten Inokulum gegeben.

  

[0054]    Für das effiziente Wachstum von PAB für die Herstellung des Inokulums wurde Laktat zu SWP hinzugegeben. Dazu wurden 1,3% Natrium D/L- Laktat Sirup 60% (w/v), 50 ml 20% Hefeextrakt (w/v) und 100 ml 1 M Kaliumphosphat Puffer (pH 6,6) vermischt und autoklavisiert (121[deg.]C, 15 min). Phosphat Puffer mit einem pH von 6,6 (an Stelle von 6,4) wurde gewählt, um den gleichen schlussendlichen pH von 6,2 nach dem Autoklavisieren zu erhalten, wie für SWP ohne die Hinzugabe von Laktat.

  

[0055]    Der genannte 1 M Kaliumphosphatpuffer wurde hergestellt durch Vermischen von 38,1 ml 1 M K2HPO4 und 61, 9 ml 1 M KH2PO4.

C. Fermentationsbedingungen

  

[0056]    7-Tage Batch Fermentationen wurden in 1-Liter Bioreaktoren (Multiforce, Inforce HT, Bottmingen, Schweiz) unter anaeroben Bedingungen während 3 Tagen ausgeführt, gefolgt von aeroben Bedingungen während 4 Tagen. Die Fermentoren waren mit einer aseptischen Probeentnahme-Vorrichtung, einer Temperaturkontrolle, einer pH Elektrode, einer Basenpumpe und Einlassöffnungen für Luft und für die Base ausgerüstet. Die Fermentations-Parameter sind in Tabelle 1 gezeigt.

Tabelle 1: Fermentations-Parameter.

  

[0057]    
<tb>Parameter<sep>Konditionen


  <tb>Medium<sep>SWP + 5 ppm Cobaltchlorid + 10 ppm pABA + 15 ppm DMBI (das Letztere hinzugegeben während der letzten 2 Tage der Fermentation)


  <tb>Inokulum<sep>1% 10<7> KBE/ml L. plantarum SM39 / 1% 10<9>KBE/ml P. freudenreichii DF13


  <tb>Volumen<sep>500 ml


  <tb>Temperatur<sep>33[deg.]C


  <tb>Rühren<sep>150 rpm


  <tb>pH<sep>kontrolliert bei 6,1 durch die Hinzugabe von 5M NaOH


  <tb>Atmosphäre<sep>3 Tage anaerob, gefolgt von 4 Tagen aerob

  

[0058]    Anaerobe Bedingungen wurden erhalten durch einen kontinuierlichen Fluss von reinem N2 (Kopfraum, 1,2 bar, 0,15 l/min), enthaltend nicht mehr als 3 ppm an O2, und aerobe Bedingungen wurden erhalten durch einen kontinuierlichen Fluss von Luft (Kopfraum, 1,2 bar, 0,1 l/min). 10 ml von steril filtriertem (0.2-[micro]m Filter; Sartorius Minisart-Plus; VWR International AG, Dietikon, Schweiz) DMBI (0,75 mg/ml) wurden während der letzten 2 Tage der Fermentation hinzugegeben. 5 ml von steril filtriertem pABA (1 mg/ml) und 0,5 ml von Kobaltchlorid (5 mg/ml) wurden zu Beginn der Fermentation hinzugegeben.

  

[0059]    Am Ende der Fermentation wurde das resultierende kultivierte Medium gesammelt.

  

[0060]    Während der Fermentation wurden die Zellzahlen, die organischen Säuren, die Zucker und die Vitamine (Folate und Vitamin B12) regelmässig kontrolliert. Dazu wurden 5 bis 25 ml Proben alle 3 h am ersten Tag (Tag 0) und einmal pro Tag von Tag 1 bis Tag 7 für die folgenden Analysen entnommen: Ausplattierungen zur Bestimmung der Zellzahlen, HPLC Analysen für Zucker und organische Säuren, mikrobiologische Bestimmung der Folate, HPLC Analysen für Vitamin B12 (Tag 3 bis 7) und mikroskopische Analyse. Zusätzlich wurde eine 40 ml Probe am Tag 7 entnommen und bei einer Temperatur von -20[deg.]C gelagert. Die Ausplattierung wie auch die Folat und die Vitamin B12 Analysen wurden unmittelbar nach der Entnahme der Proben ausgeführt.

   Für die HPLC Analysen der Zucker und der organischen Säuren wurden die Proben zentrifugiert (10 000 x g, 10 min; Zentrifuge 5417R, Eppendorf, Deutschland), steril filtriert (0,2-[micro]m Filter; Sartorius Minisart-Plus; VWR International AG, Dietikon, Schweiz) und die zellfreien Überstände wurden bei einer Temperatur von -20[deg.]C während maximal 2 Monaten bis zur Analyse gelagert.

D. Bakterielle Auszählung durch Ausplattierung:

  

[0061]    Die Proben wurden seriell in NaCl-Pepton Wasser (0,85% NaCl (w/v; Mallinckrodt Baker, Inc., USA) -0,1% Pepton (w/v)) verdünnt und Tropfen von 20 [micro]l der entsprechenden Verdünnungen wurden auf Agar Platten platziert. Für die Auszählung von LAB wurde "MRS Medium" (Labo-Life Sàrl, Pully, Schweiz; De Man et al., 1960) verwendet, und für PAB wurde NL Medium (Natriumlaktat Medium) verwendet, enthaltend 1% tryptische Soja Brühe ohne Dextrose (w/v; Beckton Dickinson, Allschwil, Schweiz), 1% Hefeextrakt (w/v; VWR International AG, Dietikon, Schweiz) und 1,3% Natrium D/L-Laktat Sirup 60% (w/v) gemäss Grinstead und Barefoot (1992). Nach dem Trocknen der Tropfen wurden die Platten anaerobisch bei einer Temperatur von 30[deg.]C während 6 Tagen für PAB und bei einer Temperatur von 37[deg.]C während 2 Tagen für LAB inkubiert.

   Auf dem NL Medium wurden nur die braunen Kolonien gezählt, welche PAB entsprachen. Die Zellzahlen wurden zweifach ausgeführt, und die Mittelwerte wurden als Log 10 KBE/ml fermentiertes Medium ausgedrückt.

E. Folat (mikrobiologischer Assay) Analyse:

  

[0062]    Extrazelluläre Folate wurden quantifiziert unter Verwendung eines mikrobiologischen Assays mit L. casei ATCC7469 als Indikator Stamm in Mikrotiter Platten gemäss Horne und Patterson (1988) mit den folgenden Modifikationen:

E1. Herstellung von standardisiertem Inokulum:

  

[0063]    Das Inokulum des Indikator Stamms L. casei ATCC7469 wurde hergestellt gemäss Becton Dickinson, modifiziert wie folgt: 10 ml "Micro Inoculum Broth" (Beckton Dickinson, Allschwil, Schweiz) wurden mit 1% L. casei ATCC74 69 inokuliert und wurden bei einer Temperatur von 37[deg.]C über Nacht inkubiert. Dieses Verfahren wurde einmal wiederholt. Die zweite Kultur wurde zentrifugiert (10 000 x g, 10 min, 4[deg.]C; Zentrifuge 5417R, Eppendorf) und das Pellet wurde 4-mal mit einer 0,85-% NaCl Lösung (Mallinckrodt Baker, Inc., USA) gewaschen. Nach dem Waschen wurde das Pellet in 10 ml 2-fach konzentriertem "Folic Acid Casei Medium" (Beckton Dickinson, Allschwil, Schweiz) resuspendiert und 100-fach verdünnt mit frischem 2-fach konzentriertem "Folic Acid Casei Medium".

   Volumen von 1 ml wurden in "cryo vials" (Huber + Co, Reinach BL, Schweiz) gefüllt, enthaltend 1 ml 80% steriles Glycerol, und wurden bei einer Temperatur von -80[deg.]C bis zum Gebrauch gelagert.

E2. Herstellung der Proben:

  

[0064]    2-ml Fermentationsproben - wie erhalten gemäss obigem Schritt C - wurden zentrifugiert (10 000 x g, 10 min; Zentrifuge 5417R, Eppendorf) und steril filtriert (0,2-[micro]m-Filter; Sartorius Minisart-Plus; VWR International AG, Dietikon, Schweiz). Sie wurden 1500- bis 15 000-fach in Folat Puffer [0,1 M Natriumphosphat Puffer, pH 6,8, 0,1% Ascorbinsäure (VWR International AG, Dietikon, Schweiz), 0,01 M 2-Mercaptoethanol] verdünnt, um Folatkonzentrationen im Bereich von 0,0312 bis 0,625 ng/ml zu erhalten, und wurden bei einer Temperatur von 4[deg.]C im Dunkeln während maximal 4 Tagen bis zur Ausführung des Assays gelagert.

E3. Test:

  

[0065]    Jede Mikrotiter Platte (Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode; Applied Biosystems, Rotkreuz, Schweiz) wurde entweder mit 150 [micro]l Proben - wie gemäss obigem Schritt E2 erhalten - oder mit Folsäurestandard (Schircks Laboratories, Rapperswil-Jona, Schweiz) gefüllt. Dieser Folsäurestandard wurde hergestellt in Folat Puffer [0,1 M Natriumphosphat Puffer pH 6,8, 0,1% Ascorbinsäure (VWR International AG, Dietikon, Schweiz), 0,01 M 2-Mercaptoethanol] im Bereich von 0,0078 bis 10 ng/ml.

   Zwei "cryo vials" mit standardisiertem Inokulum - wie gemäss obigem Schritt E1 erhalten - wurden aufgetaut und zu 10 ml 2-fach konzentriertem "Folic Acid Casei Medium" hinzugegeben. 150 [micro]l dieses verdünnten Inokulums wurden anschliessend zu den oben erwähnten 150 [micro]l Proben oder zu den Standards gegeben, resultierend in einem schlussendlichen Volumen von 300 [micro]l pro Loch. Das Wachstum des Indikator Organismus L. casei ATCC7469 wurde bestimmt durch Messung der optischen Dichte bei 600 nm vor und nach einer anaeroben Inkubationsperiode von 20 h bei einer Temperatur von 37[deg.]C. Die Folatkonzentrationen der Proben wurden berechnet durch Vergleichen der optischen Dichte der genannten Proben und der Standardlösungen und wurden in ng/ml ausgedrückt.

F. Vitamin B12 (HPLC) Analyse:

  

[0066]    Vitamin B12 wurde analysiert gemäss Piao et al. (2004) mit einigen Modifikationen, wie beschrieben in den folgenden Schritten F1 und F2. Die Bestimmung von Vitamin B12 wurde nach dessen Extraktion aus den Zellen und dessen Überführung in Cyanocobalamin mit HPLC gemacht.

F1. Proben-Herstellung:

  

[0067]    20 ml Fermentationsproben - wie erhalten gemäss obigem Schritt C - wurden zentrifugiert (10 000 x g, 15 min; Biofuge Primo Heraeus) und das Pellet wurde mit einem 0,2 M Kaliumphosphat Puffer (pH 5,5) gewaschen, zentrifugiert und in 1 ml 0,2 M Kaliumphosphat Puffer (pH 5,5), enthaltend 0,1% Kaliumcyanid, resuspendiert. Die Proben wurden "vortexed" (geschüttelt) und autoklavisiert (121[deg.]C, 15 min). Nach dem Autoklavisieren wurden sie wieder "vortexed" und zentrifugiert (10 000 x g, 15 min; Biofuge Primo Heraeus). Der Überstand wurde in HPLC Vials (Infochroma, Zug, Schweiz) filtriert (0,45-[micro]m Nylon Membran Filter; Infochroma, Zug, Schweiz), mit Aluminium Klemm Kappen (Infochroma, Zug, Switzerland) versiegelt und bei einer Temperatur von 4[deg.]C im Dunkeln während maximal 4 Tagen bis zur HPLC Analyse gelagert.

F2. HPLC:

  

[0068]    HPLC wurde an einer reversed-phase C18 Säule (250 * 4.6 mm; 5 [micro]m Partikelgrösse; Atlantis; Waters, US) mit einer RP C18 Vorsäule (20 * 4.6 mm; 5 [micro]m Partikelgrösse; Atlantis; Waters, US) auf einem HPLC System ausgeführt, umfassend eine Merck Hitachi L-7100 Pumpe, einen Merck Hitachi L-7200 Autosampler mit einem Peltier Proben Kühler, einen VWR Scientific Instruments Säule Ofen II plus, einen Merck Hitachi L-7455 DAD Detektor und einen Merck Hitachi D-7000 HPLC System Manager. Ein Acetonitril / MilliQ Wasser Gradient wurde als mobile Phase (Tabelle 2) verwendet und die Detektion wurde bei 358 nm gemacht. Die Durchflussgeschwindigkeit wurde auf 1,4 ml/min festgelegt, die Ofentemperatur betrug 30[deg.]C und das Injektionsvolumen betrug 40 [micro]l. Cyanocobalamin Standards im Bereich von 1 bis 20 [micro]g/ml in MilliQ Wasser wurden verwendet.

   Jede Probe wurde zweimal eingespritzt und die Mittelwerte wurden berechnet. Mit dieser Methode betrug die Nachweisgrenze für Vitamin B1230 ng/ml fermentiertem Medium.

  

[0069]    Tabelle 2: Zeitabhängiger Gradient der Elutionsmittel MilliQ Wasser und Acetonitril für die Vitamin B12 Bestimmung unter Verwendung von HPLC.
<tb>Zeit [min]<sep>MilliQ Wasser [%]<sep>Acetonitril [%]


  <tb>0<sep>100<sep>0


  <tb>5<sep>95<sep>5


  <tb>7<sep>85<sep>15


  <tb>14<sep>80<sep>20


  <tb>17<sep>0<sep>100


  <tb>20<sep>100<sep>0


  <tb>25<sep>100<sep>0

G. HPLC Analyse der organischen Säuren und Zucker:

  

[0070]    Die zellfreien Überstände der Fermentationsproben - erhalten gemäss dem obigen Schritt C - wurden aufgetaut und 10-fach in MilliQ Wasser (Millipore AG, Zug, Schweiz) verdünnt. Die Proben wurden direkt in HPLC Vials (Infochroma, Zug, Schweiz) unter Verwendung von 0,45-[micro]m Nylon Membran Filtern (Infochroma, Zug, Schweiz) filtriert, mit Aluminium Klemm Kappen (Infochroma, Zug, Schweiz) versiegelt und mit HPLC analysiert.

  

[0071]    HPLC wurde an einer HPX-87H Säule (300 * 7.8 mm; Animex; BioRad, Schweiz) mit einer Cation-H Vorsäule (30 * 4.6 mm; BioRad, Switzerland) auf einem HPLC System ausgeführt, bestehend aus einer Merck Hitachi L-7100 Pumpe, einem Merck Hitachi L-7200 Autosampler mit einem Peltier Proben Kühler, einem Merck Hitachi L-7360 Säulen Ofen, einem Merck Hitachi L-7450 DAD Detektor und einem L-2490 RI Detektor und einem Merck Hitachi D-7000 HPLC System Manager. Als Eluierungsmittel wurde 10 mM H2SO4 in MilliQ Wasser verwendet. Die Durchflussgeschwindigkeit wurde auf 0.6 ml/min festgelegt, die Ofentemperatur betrug 40[deg.]C und das Injektionsvolumen betrug 40 [micro]l. Standards wurden in MilliQ Wasser im Bereich von 0,24 bis 6 g/l für Milchsäure, 0,04 bis 1,0 g/l für Propionsäure, Essigsäure, Glucose und Galactose und 0,2 bis 5 g/l für Lactose hergestellt.

   Jede Probe wurde zweimal eingespritzt und die Mittelwerte wurden berechnet. Mit dieser Methode betrugen die Nachweisgrenzen für die verschiedenen Substanzen in Wasser 0,18 g/l Milchsäure, 0,03 g/l für Propionsäure, Essigsäure, Glucose und Galactose und 0,13 g/l Lactose.

H. Resultate

  

[0072]    Folatausbeuten, Vitamin B12 Ausbeuten und Zellzahlen, welche während der Fermentation von L. plantarum SM39 und P. freudenreichii DF13 unter anaeroben Bedingungen während 3 Tagen, gefolgt von aeroben Bedingungen während 4 Tagen in SWP mit 5 ppm Cobaltchlorid, 15 ppm DMBI und 10 ppm pABA - wie in obigem Schritt C beschrieben - erhalten wurden, sind in Tabelle 3 gezeigt.

  

[0073]    Die Folat Konzentrationen nehmen kontinuierlich vom Beginn der Fermentation bis zum Tag 3 zu. Vom Tag 3 bis zum Tag 7 blieben die täglichen Folat Konzentrationen stabil bei einem durchschnittlichen Niveau von 6317 +- 1281 ng/ml (Tabelle 3). Bezüglich Vitamin B12 wurde eine Konzentration von 869 +- 524 ng/ml am Tag 5 erreicht. Nach der Hinzugabe von DMBI am Tag 5 nahm die Vitamin B12 Konzentration auf einen mittleren Wert von 1065 +- 378 ng/ml für die Tage 6 und 7 zu. Die Zellzahlen nahmen von anfänglich 5 und 7 Log KBE/ml für L. plantarum SM39 und P. freudenreichii DF13 auf etwa 9,5 Log KBE/ml nach 2 Tagen der Fermentation für beide Stämme zu und blieben danach in einem ausgewogenen Verhältnis stabil. Lactose (46 +- 3 g/l am Anfang) war nach 3 Tagen vollständig metabolisiert, unter gleichzeitiger Zunahme von Laktat.

   Die Laktat Konzentration erreichte ein Maximum nach 2 Tagen (5 +- 1 g/l) und nahm danach ab, bedingt durch den Verbrauch durch Propionibacterium unter gleichzeitiger Zunahme von Acetat und Propionat, wobei Werte von 9 +- 0.1 g/l und 21 +- 2 g/l am Tag 4 erreicht wurden.

  

[0074]    Tabelle 3: Zellzahlen, extrazelluläre Folate und intrazelluläre Vitamin B12 Produktion (Mittelwerte und Standardabweichungen bei doppelten Bestimmungen).
<tb>Zellzahlen
[Log KBE/ml]<sep><sep><sep><sep>Folat
[ng/ml]<sep>Vitamin
B12
[ng/ml]


  <tb>LAB<sep><sep>PAB<sep><sep><sep>


  <tb>0 h<sep>d2-d7<a,b><sep>0 h<sep>d2-d7<a,b><sep>d3-d7<a,c><sep>d6-d7<a,d>


  <tb>4. 97
+- 0.13<sep>9.55
+- 0.03<sep>7.06
+- 0.01<sep>9. 53
+- 0.02<sep>6317
+- 1281<sep>1065
+- 378a) Durchschnittswerte über mehrere Tage wurden berechnet für ein konstantes Zellwachstum / Vitamin Produktion, um die Stabilität zu zeigen.
b) Durchschnittliche tägliche Zellzahlen von Tag 2 bis Tag 7.
c) Durchschnittliche tägliche Zellzahlen von Tag 3 bis Tag 7.
d) Durchschnittliche tägliche Vitamin B12 Konzentrationen von Tag 6 und Tag 7.

Beispiel 2 (Herstellung einer Fermentationsbrühe)

  

[0075]    Die gleiche Fermentation wie in Beispiel 1 beschrieben wurde wiederholt, mit der Ausnahme, dass als Inokulum eine Einzelkultur von 10<7> KBE/ml L. plantarum SM39 an Stelle der Co-Kultur verwendet wurde.

Resultate von Beispiel 2

  

[0076]    Die Folat Konzentrationen nahmen kontinuierlich vom Beginn der Fermentation bis zum Tag 3 zu. Vom Tag 3 bis zum Tag 7 blieben die täglichen Folat Konzentrationen stabil bei einem durchschnittlichen Niveau von 4293 +- 193 ng/ml (Tabelle 4).  Die Zellzahlen nahmen von anfänglich 5 Log KBE/ml für L. plantarum SM39 auf etwa 9,6 Log KBE/ml nach 3 Tagen der Fermentation zu und blieben danach stabil. Lactose (43 +- 1 g/l am Anfang) war nach 4 Tagen vollständig metabolisiert, unter gleichzeitiger Zunahme von Laktat. Die Laktat Konzentration erreichte ein Maximum nach 3 Tagen  (36 +- 4 g/l), blieb während 3 Tagen stabil und nahm danach leicht ab. Acetat nahm kontinuierlich auf eine Konzentration von 2,4 +- 0,01 g/l an Tag 7 zu.

  

[0077]    Tabelle 4: Zellzahlen und extrazelluläre Folat Produktion (Mittelwerte und Standardabweichungen bei doppelten Bestimmungen).
<tb>LAB Zellzahlen [Log KBE/ml]<sep><sep>Folat [ng/ml]


  <tb>0 h<sep>d3-d7<a,b><sep>d3-d7<a,c>


  <tb>5.1
+- 0.35<sep>9. 62
+- 0.01<sep>4293
+- 193a) Durchschnittswerte über mehrere Tage wurden berechnet für ein konstantes Zellwachstum / Vitamin Produktion, um die Stabilität zu zeigen.
b) Durchschnittliche tägliche Zellzahlen von Tag 3 bis Tag 7.
c) Durchschnittliche tägliche Folat Konzentrationen von Tag 3 bis Tag 7.

Literaturstellen

  

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Claims (15)

1. Verfahren zur Herstellung einer Fermentationsbrühe, enthaltend

- wenigstens ein Milchsäurebakterium, abgekürzt mit LAB, welches Folate herstellt,

- wenigstens ein Propionsäurebakterium, abgekürzt mit PAB, welches Vitamin B12 herstellt,

- freie Folate und Folate, welche in intrazellulärer Form im genannten Milchsäurebakterium vorhanden sind,

- Vitamin B12, vorhanden in intrazellulärer Form im genannten Propionsäurebakterium,

- Propionat und

- Acetat,

dadurch gekennzeichnet, dass ein Gemisch aus

- wenigstens einem Milchsäurebakterium, welches Folate herstellt,

- wenigstens einem Propionsäurebakterium, welches Vitamin B12 herstellt, und

- einem Wachstumsmedium für die Kultivierung von Bakterien, welches ein hinzugefügtes Kobaltsalz enthält,

hergestellt wird, dann dieses Gemisch während wenigstens 96 Stunden unter Bedingungen kultiviert wird, welche die Bildung der genannten Folate und des genannten Vitamins B12 ermöglichen, und schlussendlich die resultierende Fermentationsbrühe gesammelt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Milchsäurebakterium ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus

- Lactobacillus plantarum, insbesondere Lactobacillus plantarum SM39,

- Lactobacillus brevis, insbesondere Lactobacillus brevis SM34,

- Lactobacillus fermentum, insbesondere Lactobacillus fermentum SM81, und

- Streptococcus thermophilus, insbesondere Streptococcus thermophilus SBl,

wobei Lactobacillus plantarum SM39 bevorzugt ist.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Propionsäurebakterium ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus

- Propionibacterium freudenreichii, insbesondere Propionibacterium freudenreichii DF13,

- Propionibacterium jensenii, insbesondere Propionibacterium jensenii DF20,

- Propionibacterium thoenii, insbesondere Propionibacterium thoenii DSM 20276,

- Propionibacterium acidipropionici, insbesondere Propionibacterium acidipropionici DSM 20273,

wobei Propionibacterium freudenreichii DF13 bevorzugt ist.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Wachstumsmedium ein komplexes Wachstumsmedium ist, vorzugsweise

- angereicherte Molke, wobei die genannte Molke vorzugsweise als ein Nebenprodukt während der Käseherstellung erhalten wird, oder

- angereichertes Molke-Permeat, wobei die genannte Molke vorzugsweise als ein Nebenprodukt während der Käseherstellung erhalten wird, oder

- beliebige Gemische aus genannter angereicherter Molke und angereichertem Molke-Permeat, oder

- ein "De Man, Rogosa, Sharpe" (MRS) Medium,

wobei die genannte Anreicherung die Hinzugabe von wenigstens einer der folgenden Komponenten umfasst:

- ein Magnesiumsalz, zum Beispiel Magnesiumsulfat, vorzugsweise in einer Menge bis zu 0,2 g/l,

- ein Mangansalz, zum Beispiel Mangansulfat, vorzugsweise in einer Menge bis zu 0,05 g/l,

- ein Hefeextrakt, vorzugsweise in einer Menge von wenigstens 5 g/l,

- p-Aminobenzoesäure, abgekürzt mit pABA, vorzugsweise in einer Menge bis zu 15 mg/l,

- 5,6-Dimethylbenzimidazol, abgekürzt mit DMBI, vorzugsweise in einer Menge bis zu 20 mg/l

- ein Puffer, zum Beispiel K2HPO4 und KH2PO4, vorzugsweise 0,1 M.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Kultivierung zuerst unter anaeroben Bedingungen ausgeführt wird, zum Beispiel unter einer N2Atmosphäre, gefolgt von aeroben Bedingungen, wobei die genannten anaeroben Bedingungen vorzugsweise während wenigstens 72 Stunden aufrechterhalten bleiben, und wobei die genannten aeroben Bedingungen während wenigstens 24 Stunden aufrechterhalten bleiben.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Kultivierung unter Rühren ausgeführt wird, vorzugsweise bei einer Temperatur von 30[deg.]C bis 35[deg.]C, insbesondere bei einer Temperatur von 33[deg.]C.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Kultivierung bei einem pH-Wert von 5,5 bis 6,5 ausgeführt wird, vorzugsweise bei einem pH-Wert von 6,1, wobei der pH-Wert kontrolliert wird durch die Hinzugabe einer Base, zum Beispiel einer anorganischen Base, wie etwa NaOH oder KOH.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass am Beginn der Kultivierung wenigstens 10<4>KBE/ml an genanntem Milchsäurebakterium, vorzugsweise Lactobacillus plantarum SM39, und 10<7> KBE/ml an genanntem Propionsäurebakterium, vorzugsweise Propionibacterium freudenreichii DF13, vorhanden sind.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Kobaltsalz Kobaltchlorid ist und vorzugsweise in einer Menge von 5 [micro]g/l-5 mg/l hinzugegeben wird.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass ein Gemisch von

- Lactobacillus plantarum SM39,

- Propionibacterium freudenreichii DF13 und

- angereichertes Molke-Permeat, erhalten als ein Nebenprodukt während der Käseherstellung, welches hinzugefügtes Kobaltchlorid in einer Menge von 5 mg/l enthält,

wobei die genannte Anreicherung die Hinzugabe von

- 0,02% (w/v) Magnesiumsulfate

- 0,005% (w/v) Mangansulfat,

- 1% (w/v) Hefeextrakt,

- p-Aminobenzoesäure in einer Menge von 10 mg/l,

- 5,6-Dimethylbenzimidazol in einer Menge von 15 mg/l und

- einem Puffer, bestehend aus einer 0,1 M wässrigen Lösung von K2HPO4 und KH2PO4mit einem pH-Wert von 6,4,

umfasst, wobei 10<5>KBE/ml an genanntem Lactobacillus plantarum SM39 und 10<7> KBE/ml an genanntem Propionibacterium freudenreichii DF13 am Beginn der Kultivierung vorhanden sind, hergestellt wird, dann dieses Gemisch während 72 Stunden unter anaeroben Bedingungen unter einer N2 Atmosphäre kultiviert wird, gefolgt von einer Kultivierung unter aeroben Bedingungen während wenigstens 24 Stunden, vorzugsweise während 72 Stunden, wobei die genannte Kultivierung unter Rühren bei einer Temperatur von 33[deg.]C bei einem pH-Wert von 6,1 ausgeführt wird, und wobei der genannte pH-Wert durch die Hinzugabe von 5 M NaOH kontrolliert wird, und schlussendlich die resultierende Fermentationsbrühe gesammelt wird.

11. Fermentationsbrühe, enthaltend

- wenigstens ein Milchsäurebakterium, abgekürzt mit LAB, welches Folate herstellt,

- wenigstens ein Propionsäurebakterium, abgekürzt mit PAB, welches Vitamin B12 herstellt,

- freie Folate und Folate, welche in intrazellulärer Form im genannten Milchsäurebakterium vorhanden sind,

- Vitamin B12, vorhanden in intrazellulärer Form im genannten Propionsäurebakterium,

- Propionat und

- Acetat,

dadurch erhältlich, dass ein Gemisch aus

- wenigstens einem Milchsäurebakterium, welches Folate herstellt,

- wenigstens einem Propionsäurebakterium, welches Vitamin B12 herstellt, und

- einem Wachstumsmedium für die Kultivierung von Bakterien, welches ein hinzugefügtes Kobaltsalz enthält,

hergestellt wird, dann dieses Gemisch während wenigstens 96 Stunden unter Bedingungen kultiviert wird, welche die Bildung der genannten Folate und des genannten Vitamins B12 ermöglichen, und schlussendlich die resultierende Fermentationsbrühe gesammelt wird.

12. Fermentationsbrühe nach Anspruch 11, dadurch erhältlich, dass das Verfahren gemäss einem der Ansprüche 2 bis 10 ausgeführt wird.

13. Verwendung einer Fermentationsbrühe, enthaltend

- wenigstens ein Milchsäurebakterium, abgekürzt mit LAB, welches Folate herstellt,

- wenigstens ein Propionsäurebakterium, abgekürzt mit PAB, welches Vitamin B12 herstellt,

- freie Folate und Folate, welche in intrazellulärer Form im genannten Milchsäurebakterium vorhanden sind,

- Vitamin B12, vorhanden in intrazellulärer Form im genannten Propionsäurebakterium,

- Propionat und

- Acetat,

- als Nahrungsmittel, oder

- als Zusatzstoff in einem Nahrungsmittel, oder

- als eine aktive Komponente in einem Medikament für die Vorbeugung und/oder Behandlung von Vitaminmängeln, oder

- für die Herstellung eines Medikamentes für die Vorbeugung und/oder Behandlung von Vitaminmängeln.

14. Verwendung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Fermentationsbrühe eine Fermentationsbrühe nach einem der Ansprüche 11 bis 12 ist, vorzugsweise hergestellt gemäss dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10.

15. Verwendung nach einem der Ansprüche 13 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass das genannte Nahrungsmittel ein Brot oder ein Getränk ist, vorzugsweise ein Getränk, welches auch Aromakomponenten enthält.