CH704227B1

CH704227B1 - Procédé pour obtenir des cellules cibles reprogrammées.

Info

Publication number: CH704227B1
Application number: CH00524/12A
Authority: CH
Inventors: Ilham Mohammed Saleh Saeed Abuljadayel
Original assignee: Tristem Trading Cyprus Ltd
Priority date: 2009-10-19
Filing date: 2009-10-19
Publication date: 2015-05-15
Also published as: MA33740B1; CN102647989A; WO2011048350A1; TN2012000157A1; EP2490702A1; CA2781522A1; AU2009354350B2; CU20120063A7; KR101766203B1; PH12012500714A1; UA109265C2; MX2012004522A; KR20120099686A; JP2013508343A; IL218902A; IL218902A0; RU2635317C2; AU2009354350A1; CU24006B1; JP6073135B2

Abstract

La présente invention concerne un procédé de production qui comporte de cellules cibles reprogrammées, par un procédé qui comprend: portant de cellules déterminées, la trans-différenciation de ces cellules pour obtenir des cellules cibles trans-différenciées, pour l’administration des cellules cibles trans-différenciées à un patient. Les cellules cibles trans-différenciées réparent ou régénèrent du tissu ou des cellules chez le patient.

Description

References

[0001 ] Tous les documents cités ou référencés dans les documents cités ici, en même temps que les instructions, descriptions, spécifications de produits, et fiches de produits de fabricants, pour tout produit mentionné ici ou dans tout document incorporé ici à titre de référence, sont ainsi incorporés ici à titre de référence, et peuvent être utilisés dans la mise en pratique de la présente invention.

Domaine de la présente invention

[0002] La présente invention peut être utilisée pour traiter divers troubles, maladies ou états chez un patient en utilisant des cellules reprogrammées, comme des cellules rétro-différenciées, trans-différenciées ou redifférenciées. Le procédé comporte, portant de cellules déterminées, la rétro-différenciation des cellules déterminées pour obtenir des cellules cibles rétro-différenciées. Dans certains modes de réalisation, le procédé comprend, portant de cellules déterminées, la transdifférenciation des cellules déterminées pour obtenir des cellules cibles trans-différenciées. Les cellules cibles rétro-différenciées ou trans-différenciées réparent ou régénèrent du tissu ou des cellules chez le patient.

Arrière-plan technologique

[0003] Des cellules souches sont caractérisées par leur aptitude à se renouveler elles-mêmes par une division cellulaire mitotique, et à se différencier dans une gamme diverse de types de cellules spécialisées. Les deux grands types de cellules souches de mammifères sont des cellules souches embryonnaires, qui sont isolées de la masse de cellules internes de blastocystes, et des cellules souches adultes que l’on trouve dans des tissus adultes. Lors du développement d’un embryon, les cellules souches peuvent se différencier en tout tissu embryonnaire spécifique. Dans des organismes adultes, des cellules souches et des cellules progénitrices régénèrent des cellules spécifiques, et maintiennent la rotation normale d’organes régénérables, comme le sang, la peau ou des tissus intestinaux.

[0004] Les cellules souches sont abondantes lors du développement d’un embryon, bien que la quantité de cellules souches diminue lorsque le développement progresse. Au contraire, un organisme adulte contient un nombre limité de cellules souches qui sont confinées dans certains compartiments du corps.

[0005] Les applications thérapeutiques de cellules souches ont pour potentiel de modifier des traitements pour de multiples maladies ou troubles. Bien que certaines thérapies par cellules souches adultes, comme des greffes de moelle osseuse, existent déjà, les chercheurs en médecine anticipent l’utilisation de cellules souches pour traiter une plus large variété de maladies, y compris le cancer, la maladie de Parkinson, des blessures de la moelle épinière, la sclérose latérale amyotrophique, la sclérose en plaques, et des troubles musculaires, entre autres. De telles thérapies tirent avantage de la capacité des cellules souches à se différencier en types de cellules qui sont nécessaires pour traiter la maladie.

[0006] Cependant, il existe une incertitude concernant le succès d’un traitement de telles maladies en utilisant des cellules souches, de même que des problèmes concernant la facilité d’obtention des cellules souches. Par exemple, des cellules souches hématopoïétiques sont extraites habituellement par isolement depuis la moelle épinière, du sang périphérique mobilisé par facteur de croissance, ou du sang de cordon ombilical (placenta). Des cellules souches hématopoïétiques peuvent également être préparées à partir de cellules souches embryonnaires (ES), qui sont extraites à partir d’embryons obtenus en utilisant des techniques de fécondation in vitro. Cependant, une extraction depuis ces sources est lourde et parfois dangereuse, et peut devoir faire face à des problèmes éthiques. En outre, le nombre de cellules souches qui peuvent être obtenues par ces sources est limité. De plus, les cellules souches peuvent rencontrer une difficulté à se différencier en cellules nécessaires pour traiter la maladie.

Résumé de la présente invention

[0007] La présente invention concerne un procédé pour obtenir des cellules reprogrammées pour réparer du tissu, ou régénérer du tissu ou des cellules chez un patient. Par exemple, la présente invention peut permettre l'utilisation de cellules rétro-différenciées, obtenues par rétro-différenciation de cellules différenciées ou déterminées, pour réparer du tissu ou régénérer du tissu ou des cellules chez un patient. La présente invention peut permettre également l'utilisation de cellules trans-différenciées, obtenues par trans-différenciation de cellules différenciées ou déterminées, pour réparer du tissu ou régénérer du tissu ou des cellules chez un patient.

[0008] La demande est basée, en partie, sur la découverte par le demandeur que des cellules déterminées ou somatiques obtenues depuis un patient peuvent être reprogrammées pour avoir pour résultat des cellules de lignages différents, et ces cellules reprogrammées peuvent être administrées au patient pour réparer ou régénérer des tissus ou des cellules. Des exemples du processus de reprogrammation comportent une rétro-différenciation et une trans-différenciation.

[0009] Par conséquent, les demandeurs ont découvert que des cellules déterminées peuvent subir une reprogrammation pour avoir comme résultat des cellules d’un lignage différent. Par exemple, des cellules déterminées peuvent subir une rétro-différenciation pour avoir comme résultat des cellules rétro-différenciées, c’est-à-dire des cellules qui sont moins différenciées, comme des cellules souches pluripotentes, et que ces cellules souches rétro-différenciées peuvent être

2 administrées au patient pour réparer ou régénérer des tissus ou cellules. Comme autre exemple, des cellules déterminées obtenues chez un patient peuvent subir une trans-différenciation pour avoir comme résultat des cellules trans-différenciées, c’est-à-dire des cellules d’un lignage différent de celui des cellules déterminées, et que ces cellules trans-différenciées peuvent être administrées au patient, pour réparer ou régénérer des tissus ou des cellules.

[0010] La présente invention peut être utilisée également dans un procédé de réparation ou de régénération d’un tissu ou de cellules d’un lignage cellulaire chez un patient en administrant au patient des cellules reprogrammées, en particulier, dans un procédé pour réparer ou régénérer du tissu ou des cellules d’un lignage cellulaire chez un patient, comprenant les étapes consistant à (i) obtenir des cellules déterminées, (ii) rétro-différencier les cellules déterminées pour obtenir des cellules cibles rétro-différenciées, et (iii) administrer les cellules cibles rétro-différenciées au patient, dans lequel les cellules cibles rétro-différenciées se redifférencient en cellules du lignage cellulaire. Ces cellules redifférenciées peuvent avoir le même lignage cellulaire que les cellules déterminées, ou un lignage différent.

[0011 ] La présente invention peut être utilisée également dans un procédé pour réparer ou régénérer un tissu ou des cellules d’un lignage cellulaire chez un patient, comprenant les étapes consistant à (i) obtenir des cellules déterminées, (ii) trans-différencier les cellules déterminées pour obtenir des cellules cibles trans-différenciées, et (iii) administrer les cellules cibles trans-différenciées au patient.

[0012] Dans certains modes de réalisation, le patient peut souffrir d’une maladie, d’un trouble ou d’un état comprenant, mais sans s’y limiter, une défaillance de la moelle osseuse, des états hématologiques, une anémie aplasique, une thalassémie β, le diabète, la sclérose latérale amyotrophique, la maladie de Parkinson, une blessure de la moelle épinière, une dystrophie musculaire, une maladie des reins, la sclérose en plaques, une insuffisance cardiaque congestive, le virus de l’hépatite C, le virus du VIH, un traumatisme crânien, des blessures de la colonne vertébrale, une maladie des poumons, une dépression, une azoospermie non obstructive, l’andropause, la ménopause et la stérilité, la rejuvénilisation, des ulcers de sclérodermie, le psoriasis, les rides, la cirrhose du foie, une maladie auto-immune, l’alopécie, une rétinite pigmentaire, une dystrophie cristalline/cécité, le diabète, et la stérilité. Ainsi, dans certains modes de réalisation, les cellules reprogrammées peuvent être des cellules de moelle osseuse qui traitent une anémie aplasique, la leucémie, un lymphome, ou le virus d’immunodéficience humaine (VIH) chez le patient.

[0013] Dans certains modes de réalisation, les cellules cibles reprogrammées, telles que des cellules rétro-différenciées, des cellules cibles trans-différenciées, ou des cellules différenciées peuvent comprendre, mais sans s’y limiter, des cellules souches pluripotentes, des cellules germinales pluripotentes, des cellules souches hématopoïétiques, des cellules souches neuronales, des cellules souches épithéliales, des cellules souches mésenchymateuses, des cellules souches endodermiques et neuroectodermiques, des cellules germinales, des cellules souches extra-embryonnaires et embryonnaires, des cellules du rein, des cellules épithéliales alvéolaires, des cellules endodermiques, des neurones, des cellules ectodermiques, des îlots de Langerhans, des cellules acineuses, des ovocytes, des spermatozoïdes, des cellules hématopoïétiques, des hépatocytes, de la peau/ des cellules de kératine, des mélanocytes, des cellules osseuses/ostéocytes, des cellules auditives internes/du bulbe épineux, des cellules de cartilage/chondrocytes, des cellules grasses/adipocytes, des cellules squeletto-musculaires, des cellules endothéliales, des cellules du muscle cardiaque/cardiomyocytes, et des tropoblastes.

[0014] Dans certains modes de réalisation, les cellules déterminées sont obtenues depuis du sang ou des tissus concernés, y compris la moelle épinière. Les cellules déterminées peuvent être obtenues à partir du sang complet, et/ou peuvent être obtenues par aphérèse. Le sang peut être du sang mobile ou immobile. De telles cellules déterminées comportent, mais ne sont pas limitées à celles-ci, des cellules T, des cellules B, des éosinophiles, des basophiles, des neutrophiles, des mégacaryocytes, des monocytes, des érythrocytes, des granulocytes, des mastocytes, des lymphocytes, des leucocytes, des plaquettes, des globules rouges. En variante, les cellules déterminées peuvent être obtenues depuis du tissu neuronal provenant du système nerveux central ou du système nerveux périphérique, du tissu musculaire, ou du tissu épidermique et/ou dermique provenant de la peau.

[0015] Dans certains modes de réalisation, les cellules déterminées sont obtenues depuis le sang ou le tissu d’un patient. Dans certains modes de réalisation, le patient chez lequel les cellules déterminées sont obtenues, et auquel les cellules cibles reprogrammées, comme des cellules cibles rétro-différenciées ou des cellules cibles trans-différenciées, sont administrées, est le même patient.

[0016] Dans certains modes de réalisation, les cellules déterminées sont rétro-différenciées en mettant en contact les cellules déterminées avec un agent. Par exemple, les cellules déterminées peuvent être mises en incubation avec l’agent. Dans certains modes de réalisation, l’agent coopère avec un récepteur qui sert de milieu à la capture, la reconnaissance ou la présentation d’un antigène à la surface des cellules déterminées. Le récepteur peut être un antigène MHC de classe I ou un antigène MHC de classe II. Dans certains modes de réalisation, l’antigène de classe I est un récepteur HLA-A, un récepteur HLA-B, un récepteur HLA-C, un récepteur HLA-E, un récepteur HLA-F ou un récepteur HLA-G, et ledit antigène de classe II est un récepteur HLA-DM, un récepteur HLA-DP, un récepteur HLA-DQ ou un récepteur HLA-DR.

[0017] Dans certains modes de réalisation, l’agent peut être un anticorps lié au récepteur, comme un anticorps monoclonal lié au récepteur. Dans certains modes de réalisation, l’anticorps est un anticorps monoclonal CR3/43 ou un anticorps monoclonal TAL 1 B5. Dans des modes de réalisation supplémentaires, l’agent module l’expression de gène MHC, comme l’expression de gène MHC de classe Γ et/ou l’expression de gène MHC de classe ll<+>.

3 [0018] Dans certains modes de réalisation, les cellules rétro-différenciées peuvent subir une différenciation dans une étape séparée. Par exemple, les cellules rétro-différenciées peuvent être redifférenciées en mettant en contact les cellules rétro-différenciées avec des facteurs de croissance comprenant, mais sans s’y limiter, un facteur de croissance de fibroblastes basique, un facteur de croissance épidermique, un facteur de croissance hématopoïétique de macrophages-granulocytes, un facteur de cellules souches, des interleukines-1 , -3, -6, et -7, un facteur de croissance de fibroblastes basique, un facteur de croissance épidermique, un facteur de croissance hématopoïétique de granulocytes-macrophages, un facteur de croissance hématopoïétique de granulocytes, de l’érythropoïétine, un facteur de croissance de cellules souches et des protéines morphogénétiques osseuses. Les cellules cibles redifférenciées résultantes peuvent ensuite être administrées à un patient.

[0019] Dans des modes de réalisation de la présente invention, les cellules déterminées peuvent être trans-différenciées en mettant en culture les cellules déterminées dans des conditions de culture particulière. Par exemple, les cellules déterminées peuvent être mises en culture dans des types particuliers de milieux de culture en association avec les agents de rétro-différenciation. Des exemples de ces milieux de culture peuvent comprendre du milieu minimum essentiel de Eagle modifié selon Dulbecco (DMEM), du milieu de Dulbecco modifié selon Iscove (IMDM), etc. Ces milieux de culture peuvent également comprendre un agent promoteur de différenciation comme des vitamines et/ou des suppléments minéraux, de l’hydrocortisone, de la déxaméthasone, du β-mercaptoéthanol, etc. De plus, des conditions de culture supplémentaires comprennent l’utilisation de chélateurs ou d’antibiotiques, une culture à certaines températures ou certains niveaux de dioxyde de carbone ou d’oxygène, et une culture dans certains récipients. Les conditions de culture peuvent déterminer le type de cellules cibles trans-différenciées en résultant.

[0020] Un aspect de la présente invention est par conséquent un procédé d’obtention de cellules cibles. Le procédé comporte la reprogrammation des cellules déterminées. Ces processus sont décrits dans cette demande. Dans certains modes de réalisation, le procédé peut comporter la rétro-différenciation de cellules déterminées. Dans d’autres modes de réalisation, le procédé peut comporter la trans-différenciation de cellules déterminées. Dans encore d’autres modes de réalisation, le procédé peut comporter la rétro-différenciation de cellules déterminées, et ensuite la redifférenciation des cellules rétro-différenciées,

[0021 ] Un autre aspect est l’utilisation d’une ou plusieurs cellules cibles reprogrammées dans la préparation d’un médicament pour réparer ou régénérer un tissu ou des cellules d’un lignage de cellules chez un patient, ou pour traiter une maladie ou une blessure de tissu

[0022] Un procédé pour traiter une maladie ou une blessure tissulaire chez un patient en ayant besoin est également décrit. Dans certains modes de réalisation, le procédé comprend l’obtention de cellules déterminées, la reprogrammation des cellules déterminées pour obtenir des cellules cibles reprogrammées, et l’administration des cellules cibles reprogrammées au patient. Dans certains modes de réalisation, les cellules cibles peuvent être reprogrammées via une rétro-différenciation, trans-différenciation et/ou redifférenciation. Dans des modes de réalisation particuliers, les cellules cibles sont des cellules cibles rétro-différenciées, des cellules cibles transdifférenciées et/ou des cellules cibles redifférenciées. Les processus pour obtenir les cellules déterminées et reprogrammer les cellules déterminées sont tels que décrits dans la présente demande.

[0023] Dans certains modes de réalisation, les cellules cibles reprogrammées, comme des cellules cibles rétro-différenciées, des cellules cibles transdifférenciées ou des cellules cibles redifférenciées, peuvent être administrées via une injection, implantation ou perfusion. Ces cellules peuvent être administrées par injection parentérale, intramusculaire, intraveineuse, sous-cutanée, intraoculaires, orale, ou transdermique, ou par injection dans du liquide rachidien. Dans certains modes réalisation, les cellules cibles rétro-différenciées ou les cellules cibles trans-différenciées sont administrées dans une composition pharmaceutique. La composition pharmaceutique peut comprendre les cellules cibles rétro-différenciées ou les cellules cibles trans-différenciées, et au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable.

[0024] Un aspect de la présente invention est la composition pharmaceutique pour administrer les cellules cibles reprogrammées, comme des cibles rétro-différenciées ou des cellules cibles trans-différenciées. La composition pharmaceutique peut comporter un ou plusieurs types de cellules cibles, et au moins un porteur pharmaceutiquement acceptable. Facultativement, la composition pharmaceutique peut comprendre des adjuvants et/ou d’autres excipients adaptés pour une administration à un patient.

[0025] Un autre aspect de la présente invention est un procédé de préparation d’une composition pharmaceutique ou d’un médicament, comprenant les étapes consistant à (i) obtenir des cellules déterminées, (ii) reprogrammer les cellules déterminées pour obtenir des cellules cibles reprogrammées, et (iii) facultativement, combiner les cellules cibles reprogrammées avec un ou plusieurs excipients pharmaceutiques. Dans certains modes de réalisation, les cellules cibles reprogrammées sont combinées avec un ou plusieurs excipients pharmaceutiques. Dans d’autres modes de réalisation, les cellules cibles reprogrammées ne sont pas combinées avec un ou plusieurs excipients pharmaceutiques. Les processus pour obtenir des cellules déterminées et reprogrammer les cellules déterminées sont tels que décrits dans la présente demande.

[0026] On doit noter que dans cette description, et en particulier dans les revendications et/ou des paragraphes, des termes comme «comporte», «compris», «comportant» et analogues, peuvent avoir la signification qui leur est attribuée dans la loi américaine sur les brevets; ils peuvent ainsi signifier «inclut», «inclus», «incluant», et analogues; et que des

4 termes comme «consistant essentiellement en» et «constitué essentiellement de» ont la signification qui leur est attribuée dans la loi américaine sur les brevets, par exemple, ils autorisent des éléments qui ne sont pas indiqués explicitement, mais excluent des éléments que l’on trouve dans la technique antérieure, ou qui affectent une caractéristique basique ou nouvelle de la présente invention.

[0027] Ces modes de réalisation ainsi que d’autres sont décrits ou apparaissent dans la description détaillée qui suit, et sont soutenus par celle-ci.

Brève description des dessins

[0028] La description détaillée qui suit, donnée uniquement à titre d’exemple, mais non prévue pour limiter la présente invention, des modes spécifiques de réalisation décrits, peut être comprise en association avec les dessins annexés, sur lesquels:

5 des cellules reprogrammées autologues (vues inférieures), les ventricules présentent une diminution des paramètres d’atrophie du cerveau comme une réduction de ventricule et une dilatation du sillon, avec une amélioration de l’hématome.

La fig. 19b représente des vues d’IRM supplémentaires du cerveau du patient avant (vues supérieures) et après (vues inférieures) traitement.

La fig. 20 représente des radiographies pulmonaires d’un patient souffrant d’une maladie des poumons avant (radiographie de gauche) et après (radiographie de droite) un traitement avec des cellules reprogrammées autologues. Après traitement, le patient présente une amélioration du volume des poumons et une réduction de la dimension de la lésion, comme indiqué par une diminution des zones hypodenses.

La fig. 21 montre des niveaux d’hormones sexuelles, pour l’hormone de stimulation folliculaire (fsh), la lutéostimuline (1 h), la progestérone (pro), et la testostérone (test,) chez des patients souffrant d’une azoospermie non obstructive, et traités avec des cellules reprogrammées autologues. Les niveaux montrent une augmentation importante de testostérone libre avec une augmentation de la dimension des testicules (données non indiquées), déterminée par ultrasons.

La fig. 22 montre une sensibilité rétinienne et une déficience visuelle chez un patient souffrant d’une vision défectueuse avant (partie supérieure) et après (partie inférieure) traitement avec des cellules reprogrammées autologues. Dans les résultats de sensibilité rétinienne, la zone orange indique une sensibilité rétinienne diminuée. Dans les résultats de déficience visuelle, les zones blanches indiquent une vision normale, et les zones rose, orange et noire indiquent une déficience visuelle accrue. Après traitement, le patient ressent une amélioration de son champ visuel, les zones orange dans les résultats de sensibilité rétinienne avant traitement étant devenues vertes, et blanches après traitement, et les zones noires dans les résultats de déficience visuelle avant traitement étant devenues blanches après traitement.

Description détaillée Définitions

[0029] Telle qu’utilisée ici, l’expression «cellules déterminées» indique des cellules qui affichent un caractère différencié. Ces cellules sont souvent considérées comme matures et spécifiques. Des exemples comprennent des globules blancs, des globules rouges, des cellules épithéliales, des neurones, et des chondrocytes.

[0030] Telle qu’utilisée ici, l’expression «cellule indéterminée» indique des cellules qui n’affichent pas un caractère mature différencié. Ces cellules sont souvent considérées comme immatures et non spécifiques. Un exemple d’une cellule indéterminée est une cellule souche, qui est une cellule immature qui est capable d’un auto-renouvellement (division sans limite) et d’une différenciation (spécialisation).

[0031 ] Tel qu’utilisé ici, le terme «reprogrammation» indique un processus par lequel une cellule déterminée d’un premier lignage cellulaire est transformée en une cellule d’un type de cellule différent. Ce type de cellule différent peut être d’un lignage cellulaire différent. Une reprogrammation peut survenir par des processus comme une rétro-différenciation, une trans-différenciation ou une redifférenciation.

[0032] Telle qu’utilisée ici, l’expression «cellule reprogrammée» est une cellule qui a subi une reprogrammation d’une cellule déterminée. Une cellule reprogrammée peut comprendre une cellule rétro-différenciée, une cellule transdifférenciée et/ou une cellule redifférenciée.

[0033] Tel qu’utilisé ici, le terme «rétro-différenciation» est le processus par lequel une cellule déterminée, c’est-à-dire une cellule spécifique mature, revient à un stade cellulaire plus primitif. Une «cellule rétro-différenciée» est une cellule qui résulte d’une rétro-différenciation d’une cellule déterminée.

[0034] Tel qu’utilisé ici, le terme «trans-différenciation» indique le processus par lequel une cellule déterminée d’un premier lignage cellulaire est transformée en une autre cellule d’un type de cellule différent. Dans certains modes de réalisation, une trans-différenciation peut être une combinaison d’une rétro-différenciation et d’une redifférenciation. «Une cellule trans-différenciée» est une cellule qui résulte d’une transe-différenciation d’une cellule déterminée. Par exemple, une cellule déterminée, comme une cellule de sang complet peut être trans-différenciée en un neurone.

[0035] Tel qu’utilisé ici, le terme «redifférenciation» indique le processus par lequel une cellule déterminée ou une cellule rétro-différenciée se différencie en une cellule spécifique plus mature. «Une cellule redifférenciée» indique une cellule qui résulte d’une redifférenciation d’une cellule déterminée ou d’une cellule rétro-différenciée. Si une cellule redifférenciée est obtenue par redifférenciation d’une cellule rétro-différenciée, la cellule redifférenciée peut être du même lignage, ou d’un lignage différent, que la cellule déterminée qui a subi une rétro-différenciation. Par exemple, une cellule déterminée, comme un globule blanc, peut-être rétro-différenciée pour former une cellule rétro-différenciée comme une cellule souche pluripotente, et ensuite la cellule rétro-différenciée peut-être redifférenciée pour former un lymphocyte, qui est du même

7 lignage que le globule blanc (cellule déterminée), ou redifférenciée pour former un neurone, qui est d’un lignage différent du globule blanc (cellule déterminée).

[0036] Telle qu’utilisée ici, l’expression «cellules cible» est une cellule qui est obtenue pour administration à un patient afin de réparer ou de régénérer du tissu ou des cellules. Par exemple, une cellule cible peut être une cellule cible reprogrammée, comme une cellule cible rétro-différenciée ou une cellule cible trans-différenciée, de telle sorte que la cellule cible rétro-différenciée ou transdifférenciée est administrée au patient.

Cellules déterminées

[0037] Comme décrit ci-dessus, des cellules déterminées de la présente invention sont des cellules qui affichent un caractère différencié. La cellule déterminée peut comporter tous composants qui sont concernés par une présentation, une capture ou une reconnaissance d’antigène. Par exemple, la cellule déterminée peut être une cellule MHC de class Γ et/ou une cellule MEC de classe ΙΓ.

[0038] La cellule déterminée peut également être toute cellule dérivée ou pouvant être dérivée d’une cellule non différenciée. Ainsi, dans un mode de réalisation, la cellule déterminée est également une cellule non différenciée. Par conséquent, à titre d’exemple, la cellule déterminée peut être une cellule souche lymphoïde ou une cellule souche myéloïde, qui est différenciée par rapport à une cellule souche pluripotente.

[0039] Des cellules déterminées peuvent être dérivées d’une matière biologique, comme du sang ou des tissus concernés, y compris de la moelle épinière ou du sang de cordon ombilical, du tissu neuronal provenant du système nerveux central ou du système nerveux périphérique, du tissu musculaire, ou du tissu d’épiderme et/ou de derme provenant de la peau (par exemple au moyen d’un frottis buccal). La matière biologique peut avoir une origine post-natale.

[0040] La matière biologique peut être obtenue en utilisant des procédés connus dans la technique qui sont adaptés pour le type du tissu. Des exemples comprennent, mais sans s’y limiter, une excision, un prélèvement par aiguille, un essuyage, et une aphérèse.

[0041 ] Dans des modes de réalisation particuliers, les cellules déterminées proviennent de sang complet ou de produits traités de celui-ci, comme le plasma ou la couche leucocyto-plaquettaire, puisque leur prélèvement chez des sujets peut être effectué avec le minimum de surveillance médicale. Des échantillons de sang sont typiquement traités avec des anticoagulants comme de l’héparine ou du citrate. Des cellules dans l’échantillon biologique peuvent être traitées pour enrichir certains types de cellule, supprimer certains types de cellule ou dissocier des cellules d’une masse de tissu. Des procédés utiles pour purifier et séparer des cellules comprennent une centrifugation (comme une centrifugation en gradient de densité), une cytométrie en flux et une chromatographie d’affinités (comme l’utilisation de billes magnétiques comprenant des anticorps monoclonaux sur des marqueurs de surface de cellule ou une méthode d’adhérence sur plastique) (voir VetteseDadey, The Scientist 1999, pages 13 à 21 ). A titre d’exemple, une séparation Ficoll-Hypaque est utile pour enlever des érythrocytes et des granulocytes afin de laisser des cellules mononucléaires, comme des lymphocytes et des monocytes.

[0042] Des exemples de cellules déterminées qui peuvent être dérivées du sang comprennent, mais sans s’y limiter, des cellules CFC-T, des cellules CFC-B, des cellules CFC-Eosine, des cellules CFC-Bas, des cellules CFC-Bas, des cellules CFC-GM, des cellules CFC-M, CFC-MEG, des cellules BFC-E, des cellules CFC-E, des cellules T, des cellules B, des éosinophiles, des basophiles, des neutrophiles, des monocytes, des mégacaryocytes, et des érythrocytes.

[0043] Des cellules déterminées provenant du sang peuvent être identifiées par leur expression d’antigènes particuliers. Par exemple, les cellules B sont des cellules CD19<+>, CD21<+>, CD22<+>and DR<+>. Les cellules T sont des cellules CD2<+>, CD3<+>, et CD4<+>ou CD8<+>. Les lymphocytes immatures sont des cellules CD4<+>et CD8<+>cells. Les cellules T activées sont des cellules DR<+>. Les cellules tueuses naturelles (NKs) sont des cellules CD56<+>et CD16. Des lymphocytes T sont des cellules CD7<+>. Les leucocytes sont des cellules CD45<+>. Les granulocytes sont des cellules CD13<+>et CD33<+>. Les cellules monocytes macrophages sont des cellules CD14<+>et DR<+>.

[0044] Dans certains modes de réalisation, la cellule déterminée peut être un lymphocyte B (activé ou non activé), un lymphocyte T (activé ou non-activé), une cellule du lignage monocyte macrophage, une cellule nucléée capable d’exprimer des antigènes de classe I ou II, une cellule qui peut être induite pour exprimer des antigènes de classe I ou II, ou une cellule énucléé (c’est-à-dire une cellule qui ne contient pas de noyau, comme un globule rouge).

[0045] Dans des modes de réalisation en variante, la cellule déterminée peut être sélectionnée parmi l’un quelconque d’un groupe de cellules comprenant des lymphocytes granulaires larges, des lymphocytes nuis et des cellules tueuses naturelles, chacune exprimant les récepteurs de surface de cellule CD56 et/ou CD16.

[0046] Puisque les cellules déterminées sont essentiellement des cultures primaires, il peut être nécessaire d’ajouter aux populations de cellules des nutriments adaptés pour maintenir une viabilité. Des conditions de culture adaptées sont connues de l’homme du métier. Néanmoins, un traitement de population de cellules est initié de préférence dès que possible après prélèvement d’échantillons biologiques chez le patient, typiquement en moins de 12 heures, de préférence en moins de deux à quatre jours. La viabilité cellulaire peut être vérifiée en utilisant des techniques bien connues, comme une exclusion de bleu trypan ou de iodure de propidium.

8 Cellules rétro-différenciées

[0047] Une rétro-différenciation est un type de processus de reprogrammation par lequel des structures et fonctions de cellules sont modifiées progressivement pour donner naissance à des cellules moins spécifiques. Une rétro-différenciation peut survenir naturellement, les cellules pouvant subir une différenciation inverse limitée in vivo en réponse à une détérioration de tissu. En variante, une rétro-différenciation peut être induite en utilisant des procédés décrits dans la demande US numéro de série 08/594 164, maintenant brevet US 6 090 625; la demande US numéro de série. 09/742 520, maintenant brevet US 7 1 12 440; la demande US numéro de série 10/140 978, maintenant brevet US 7 220 412; la demande US numéro de série 10/150 789, maintenant brevet US 7 410 773; et la demande US numéro de série 09/853 188, qui sont incorporés ici en totalité à titre de référence.

[0048] Des cellules rétro-différenciées de la présente invention peuvent comprendre, mais sans s’y limiter, des cellules souches pluripotentes, des cellules souches lymphoïdes, des cellules souches myéloïdes, des cellules souches neuronales, des cellules satellites squeletto-musculaires, des cellules souches épithéliales, des cellules souches endothermiques, des cellules souches mésenchimateuses, et des cellules souches embryonnaires.

[0049] Dans des modes de réalisation particuliers, les cellules déterminées proviennent du sang, et sont rétro-différenciées pour former des cellules rétro-différenciées du lignage cellulaire hématopoïétique. Les exemples de ces cellules rétro-différenciées comprennent, mais sans s’y limiter, des cellules souches pluripotentes, des cellules souches lymphoïdes, et des cellules souches myéloïdes.

[0050] Les cellules indéterminées peuvent être rétro-différenciées en mettant en contact des cellules avec un agent qui coopère de manière opérationnelle avec les cellules. Les cellules sont ensuite incubées de manière à permettre à ces cellules qui sont entrées en collaboration opérationnelle avec l’agent de progresser à travers le processus de rétro-différenciation, et de devenir en définitif indifférenciées.

[0051 ] L’étape de mise en contact peut comprendre l’agent venant en contact avec des antigènes de surface sur la cellule déterminée. L’agent peut agir en contact direct ou en contact indirect avec la cellule déterminée. Un exemple de contact direct est lorsque la cellule déterminée a au moins un récepteur de surface de cellule sur sa surface de cellule, comme une chaîne β ayant des régions homologues (des régions que l’on trouve couramment avec la même fréquence ou une fréquence similaire) telles que celles que l’on peut trouver sur des cellules B, et où l’agent vient en contact direct avec le récepteur de surface de cellule. Un autre exemple est lorsque la cellule déterminée a un récepteur de surface de cellule sur sa surface de cellule, comme une chaîne a ayant des régions homologues à celles que l’on peut trouver sur des cellules T, et où l’agent vient en contact directement avec le récepteur de surface de cellule.

[0052] Un exemple de contact indirect est lorsque la cellule déterminée a au moins deux récepteurs de surface de cellule sur sa surface de cellule, et un contact de l’agent avec le premier récepteur affecte l’autre récepteur, ce qui induit alors une rétro-différenciation de la cellule déterminée.

[0053] L’agent pour la rétro-différenciation de la cellule déterminée peut être un composé ou une composition chimique. Par exemple, l’agent peut être capable de venir en contact avec un récepteur de surface de cellule situé sur la surface de la cellule déterminée. Dans certains modes de réalisation, l’agent vient en contact de manière opérationnelle avec un récepteur présent sur la surface de la cellule déterminée - lequel récepteur peut être exprimé par la cellule déterminée, comme un récepteur qui est capable d’être exprimé par la cellule déterminée.

[0054] Par exemple, les agents peuvent comprendre, mais sans s’y limiter, un quelconque ou plusieurs parmi de l’adénosine monophosphate cyclique (cAMP), une molécule CD4, une molécule CD8, une partie ou la totalité d’un récepteur de cellule T, un ligand (fixé ou libre), un peptide, un récepteur de cellule T (TCR), un anticorps, un anticorps à réaction croisée, un anticorps monoclonal, ou un anticorps polyclonal. Des facteurs de croissance peuvent également être utilisés, comme des facteurs de croissance hématopoïétique, par exemple de l’érythropoïétine et des facteurs stimulateurs de colonies de granulocytes-monocytes (GM-CSF).

[0055] Si l’agent est un anticorps, un anticorps à réaction croisée, un anticorps monoclonal ou un anticorps polyclonal, alors l’agent peut être un quelconque ou plusieurs parmi un anticorps, un anticorps à réaction croisée, un anticorps monoclonal ou un anticorps polyclonal lié à un quelconque ou plusieurs parmi: la chaîne β d’un antigène MHC de classe II, la chaîne β d’un antigène MHC HLA-DR, la chaîne a d’un antigène MHC de classe I or de classe II, la chaîne a d’un antigène HLA-DR, la chaîne a et β d’un antigène MHC de classe II ou d’un antigène MHC de classe I. Un exemple d’anticorps est CR3/43 (fourni par Dako).

[0056] Le terme «anticorps» peut comprendre les divers fragments (qu’ils proviennent d’une technologie de clivage protéolitique ou recombinante) et dérivés qui conservent une activité de liaison, comme les anticorps Fab, F(ab<'>)2et scFv de même que des imitations ou des bioisostères de ceux-ci. Sont également inclus comme anticorps des variants conçus génétiquement dans lesquels certaines des séquences d’acides aminés ont été modifiées, par exemple par un remplacement de résidus d’acides aminés pour améliorer la liaison, ou dans lesquels les anticorps ont été réalisés dans une espèce différente de l’organisme dont on souhaite que les cellules soient traitées selon les procédés de la présente invention, afin de diminuer la possibilité de réaction immune contraire (un exemple de ceci est des anticorps monoclonaux de souris «humanisées»).

9 [0057] Les agents utilisés pour réaliser la conversion d’une cellule déterminée en une cellule rétro-différenciée peuvent agir de préférence de manière extracellulaire par rapport à la cellule déterminée. Par exemple, la cellule déterminée peut comporter un récepteur qui peut être mis en contact opérationnel avec l’agent, et l’agent vient en contact opérationnel avec le récepteur.

[0058] Par exemple, le récepteur peut être un récepteur de surface de cellule. Des exemples spécifiques de récepteurs de surface de cellule comprennent, mais sans s’y limiter, des récepteurs MHC de classe I et de classe II. Le récepteur peut comporter un composant a et/ou un composant β, comme c’est le cas pour des récepteurs MHC de classe I et de classe II.

[0059] Le récepteur peut comporter une chaîne β ayant des régions homologues, par exemple au moins les régions homologues de la chaîne β de HLA-DR.

[0060] En variante, ou de plus, le récepteur peut comporter une chaîne a ayant des régions homologues, par exemple au moins les régions homologues de la chaîne a de HLA-DR. Le récepteur peut être un antigène de classe I ou de classe Il du complexe majeur d’histocompatibilité (MHC). Dans certains modes de réalisation, le récepteur de surface de cellule peut comporter, mais sans s’y limiter, un récepteur HLA-DR, un récepteur DM, un récepteur DR un récepteur DQ, un récepteur HLA-A, un récepteur HLA-B, un récepteur HLA-C, un récepteur HLA-E, un récepteur HLA-F, ou un récepteur HLA-G. Dans certains modes de réalisation, le récepteur de surface de cellule peut-être un récepteur HLA-DR.

[0061 ] L’agent peut être un anticorps lié au récepteur, comme un anticorps monoclonal lié au récepteur.

[0062] Un exemple d’agent peut être un qui module l’expression de gène MHC, comme l’expression de MHC de classe Γ et/ou l’expression de MHC de classe ll<+>.

[0063] Dans certains modes de réalisation, l’agent peut être utilisé en association avec un modificateur de réponse biologique. Des exemples de modificateurs de réponse biologique comprennent, mais sans s’y limiter, un agent alcoylant, un immunomodulateur, un facteur de croissance, une cytokine, un récepteur de surface de cellule, une hormone, un acide nucléique, une séquence nucléotidique, un antigène ou un peptide. Par exemple, un agent alcoylant peut être ou peut comporter un cyclophosphoamide.

[0064] D’autres modificateurs de réponse biologique peuvent comprendre des composés capables de réguler à la hausse l’expression d’antigène MHC de classe I et/ou de classe II qui, dans certains modes de réalisation, peuvent permettre à un agent qui se lie à un récepteur MHC d’agir plus efficacement.

[0065] Comme tout type de cellule peut être réalisé pour exprimer des antigènes MHC de classe I et/ou de classe II, ceci peut fournir un procédé pour rétro-différencier une large variété de types de cellule, qu’ils expriment ou non de manière constitutive des antigènes MHC de classe I et/ou de classe II.

[0066] Des cellules déterminées sont généralement incubées avec un agent pendant au moins 2 heures, typiquement entre 2 et 24 heures, de préférence entre 2 et 12 heures. Des incubations sont typiquement effectuées depuis une température ambiante ou par exemple d’environ 22 °C, jusqu’à environ 37 °C, y compris 33 °C. La progression de la procédure de rétro-différenciation peut être vérifiée périodiquement en enlevant une petite quantité aliquote de l’échantillon, et en examinant les cellules en utilisant une microscopie et/ou une cytométrie en flux. En variante, le dispositif peut comporter des moyens de suivi pour la surveillance en ligne de la progression du processus de rétro-différenciation.

[0067] En plus de l’utilisation d’agents de rétro-différenciation, les cellules déterminées peuvent être mises en culture dans du plasma ou sérum autologue, ou tant du sérum de sang foetal ou du sérum de cheval. Facultativement, les cellules déterminées peuvent être mises en culture avec des anticoagulants, des chélateurs ou des antibiotiques. La plage de température pour incuber les cellules peut être étendue de 18 à 40 °C, et peut également comprendre 4 à 10% de C02et/ou 10 à 35% d’02. En outre, une incubation peut survenir dans des poches de sang, des poches de culture de tissus ou des récipients en matière plastique, qui sont revêtus ou non revêtus.

[0068] Certains types de cellules rétro-différenciées peuvent être obtenus par rétro-différenciation en utilisant des conditions de culture particulières. Par exemple, des cellules déterminées peuvent être rétro-différenciées en cellules pluripotentes en mettant en culture les cellules déterminées dans du milieu minimum essentiel de Eagle modifié selon Dulbecco (DMEM), des acides aminés non essentiels (NEAA), de la L-glutamine (L-glu), et du β-mercaptoéthanol (2 βΜΕ), en association avec les agents de rétro-différenciation. Les cellules déterminées peuvent également être exposées initialement à des chélateurs.

[0069] Comme autre exemple, pour obtenir des cellules mésenchymateuses, des cellules déterminées peuvent être mises en culture en association avec un ou des agents de rétro-différenciation - en utilisant du DMEM (faible teneur en glucose) et de la L-glu, ou du DMEM (faible teneur en glucose), de la L-glu, du 2 βΜΕ, et du NEAA. De plus, la gentamicine antibiotique peut également être utilisée dans la culture cellulaire.

Cellules trans-différenciées

[0070] Des cellules trans-différenciées sont obtenues en mettant en culture des cellules déterminées avec un milieu de culture de tissu en association avec des agents de rétro-différenciation. Les cellules déterminées subissent ainsi une

10 transdifférenciation, dans laquelle les cellules déterminées sont transformées en cellules d’un autre type de cellule; dans certains modes de réalisation, les cellules déterminées sont transformées en cellules d’un lignage différent.

[0071 ] Le type de cellule cible obtenu par trans-différenciation dépend des conditions de culture. Ces conditions varient selon le type de milieu de culture de tissu, la présence/l’absence de divers agents promoteurs de différenciation, la présence/l’absence de différents sérums, la température d’incubation, la présence/l’absence d’oxygène ou de dioxyde de carbone, et le type de conteneur ou récipient utilisé pour l’incubation.

[0072] Des exemples de milieux de culture de tissus utilisés pour une transdifférenciation comprennent, mais sans s’y limiter, du milieu de Dulbecco modifié selon Iscove (IMDM), du milieu minimum essentiel de Eagle modifié selon Dulbecco (DMEM), du milieu minimum essentiel de Eagle (EME), de l’a-milieu minimum essentiel (a-MEM), Roswell Park Mémorial Institute (RPMI; site où le milieu a été développé) 1640, Ham-F-12, E199, MCDB, Leibovitz L-15, du milieu E de Williams, ou tout milieu de culture de tissu formulé commercialement.

[0073] Des agents promoteurs de différenciation comprennent des anticoagulants, des chélateurs et des antibiotiques. Des exemples de tels agents peuvent être un ou plusieurs parmi les suivants: des vitamines et minéraux, ou des dérivés de ceux-ci, comme de la vitamine A (rétinol), B3, C (ascorbate), ascorbate 2-phosphate, D2, D3, K, de l’acide rétinoïque, du nicotinamide, du zinc ou un composé de zinc, et du calcium ou des composés de calcium; des hormones naturelles ou synthétiques comme de l’hydrocortisone, et de la déxaméthasone; des acides aminés ou des dérivés de ceux-ci, comme de la L-glutamine (L-glu), de l’acide tétraacétique d’éthylèneglycol (EGTA), de la proline, et des acides aminés non essentiels (NEAA); des composés ou des dérivés de ceux-ci, comme 13-mercaptoéthal, de l’adénosine monophosphate cyclique de dibutyl (db-cAMP), du monothioglycérol (MTG), de la putrescine, du diméthylsulfoxide (DMSO), de l’hypoxanthine, de l’adénine, de la forskoline, du cilostamide, et de la 3-isobutyl-1 -méthylxanthine; des nucléosides et des analogues et ceux-ci, comme de la 5-azacytidine; des acides ou des sels de ceux-ci, comme de l’acide ascorbique, du pyruvate, de l’acide okadaïque, de l’acide linoléique, de l’acide éthylènediaminetétraacetique (EDTA), de la citrate-dextrose de formula A anticoagulante (ACDA), du disodium EDTA, du butyrate de sodium, et du glycérophosphate; des antibiotiques ou des médicaments, comme G418, gentamycine, Pentoxifylline (1 -(5-oxohéxyl)-3, 7-diméthylxanthine), et de l’indométhacine; et des protéines, comme activateur plasminogène tissulaire (TPA).

[0074] Ces agents promoteurs de différenciation peuvent être utilisés pour obtenir des types particuliers de cellules cibles. Par exemple, de la vitamine B3peut être utilisée pour produire des cellules acineuses, comme des îlots de Langerhans ou de l’hydrocortisone; de la déxaméthasone peut être utilisée pour produire des cellules d’une origine mésenchymateuse ou d’origine épithéliale (par exemple cellules épithéliales du rein, de la peau et de structures associées, comme des cellules de bulbe pileux); et du β-mercaptoéthal peut être utilisé pour produire des cellules ectodermiques comme des cellules neuronales, y compris des cellules accessoires du CNS.

[0075] Le milieu de culture peut contenir du plasma autologue; des plaquettes; du sérum, comme un échantillon de sang foetal; ou des sérums provenant de mammifères, comme du sérum de cheval. De plus, le processus de conversion peut avoir lieu dans des poches de sang, des ossatures, des poches de culture tissulaire, ou des récipients de culture tissulaire en matière plastique. Les récipients de culture tissulaire peuvent être des récipients de culture tissulaire adhérents ou non adhérents, ou peuvent être revêtus ou non revêtus avec des agents comme de la gélatine, du collagène, des matrigels, ou des matrices extracellulaires qui favorisent une adhérence ou une flottaison selon le type de tissus ou de cellules spécifiques nécessaires devant être préparé.

[0076] Des conditions de culture supplémentaires comprennent la température, qui peut être entre environ 10 et environ 60 °C, ou entre environ 18 et environ 40 °C; les niveaux de dioxyde de carbone (C02), qui peuvent être entre environ 0 et environ 20%, ou environ 4 et environ 10%; et d’oxygène (02), qui peuvent être entre environ 0 et environ 50%, ou environ 10 et environ 35%.

[0077] Des exemples de procédés pour obtenir les cellules cibles, et utilisés en association avec des agents de rétro-différenciation, sont décrits dans le tableau 1.

11 Tableau 1 : Procédés pour obtenir différents types de cellules cibles en association avec des agents de rétro-différenciation.

[0078]

Type de cellules Conditions de culture Conditions de culture cibles utilisées en association supplémentaires avec des agents de rétro-différenciation

Cellules souches • DMEM, NEAA, L- • Avant exposition de cellules pluripotentes ou glu, 2PME déterminées à chélateurs ou population agents anticoagulants. hétérogène de • Pour des progéniteurs cellules progenitors, ectraction progénitrices d’agent de pluripotentes rétrodifférenciation en diluant avec un milieu de culture seulement

Cellules souches • DMEM (faible teneur • Gentamycine mésenchymateuses en glucose), L-glu ; ou

* DMEM (faible teneur en glucose), L-glu, 2βΜΕ, NEAA

• Cellules ® RPMI 1640, GAIC germinales facultativement avec • L’incubation peut être à pluripotentes NEAA, L- glu, 2βΜΕ environ 30-32°C pour des

• Oocytes pour oocytes ; ou spermatozoïdes, et environ

• spermatozoïdes • milieu EME, retinol, 38 à 39°C pour des oocytes. L-glu, pyruvate de • Des cellules peuvent être sodium, lactate de exposées à des chélateurs sodium, NEAA pour comme EDTA et EGT avant oocytes ; ou rétro-différenciation et

• DMEM, Hams F12, redifférenciation. vitamine C, vitamine • Pour du sperm, on peut E, acide rétinoïque, inclure l'ajout d'acide rétinol, okadaïque, de DMSO et de pyruvate, facultative zinc ou d'un composé de ment avec zinc ; du Gamete 100 peut Pentoxifylline pour être utilisé à la place en tant spermatozoïdes ; ou que milieu de base.

• Pour des oocytes, on peut

• conditions de culture inclure l'ajout de dp-cAMP, pour cellules de EDTA de disodium, de souches forskolin, de cilostamide et pluripotentes listées de hypoxanthine. ci-dessus, et avec conditions de culture

12 supplémentaires • Pour des oocytes, on peut listées dans la utiliser à la place du milieu colonne suivante 199 en tant que milieu de pour du base. spermatozoïde ou des oocytes.

Kidney • DMEM, Hams F12, et hydrocortisone, facultativement avec de la vitamine K ; ou

• les conditions de culture pour des cellules souches pluripotentes listées ci-dessus, avec de l’hydrocortisone

• Épithélium • DMEM, NEAA, L- • Avec récipients de culture alvéolaire glu, facultativement tissulaire revêtus de matrigel « Endoderme avec 2βΡΜΕ, et d’antibiotique G418 nicotinamide ; ou

® Conditions de culture pour cellules souches pluripotentes listées ci-dessus, avec nicotinamide, facultativement avec dexamethasone, acide rétinoique, dbcAMP ; ou

• IMDM, L-glu, acide ascorbique, MTG

• Neurone • DMEM avec Hams

• Ectoderme F12, NEAA, 2βΜΕ, facultativement avec de la putrescine, de l'acide rétinoïque, de la L-glu, de l’hydrocortisone, de l’ascorbate ; ou

• Les conditions de culture pour les cellules souches pluripotentes listées ci-dessus, facultativement avec

13 de la putrescine, de l'acide rétinoïque, de la L-glu, de l’hydrocortisone, de l’ascorbate îlots de Langerhans • DMEM, Hams F12, cellules acineuses vitamine B3; ou

• RPMI 1640 avec vitamine B3; ou

• Les conditions de culture pour les cellules souches pluripotentes listées ci-dessus, avec de la vitamine B3 (nicotinamide), facultativement avec de la déxaméthasone

Cellules • IMDM, • L'incubation peut être à 33 hématopoïétiques facultativement avec °C de l’hydrocortisone ; • L'incubation peut être à ou température ambiante pour amplifier des

• IMDM, L glutamine mégacaryocytes dans la et MTG ; ou culture.

• Les conditions de • Des cellules différenciées culture pour les peuvent être exposées à des cellules souches chélateurs avant conversion pluripotentes listées pour amplifier des ci-dessus, avec progéniteurs d’érythroïdes MTG remplaçant durant la culture. 2βΜΕ, • Du RPMI 1640 peut être facultativement avec utilisé en tant que milieu de des vitamines base pour enrichissement de progéniteurs de lymphoïdes.

• Du butyrate de sodium et/ou de la 5- azacytidine peuvent être ajoutés à la culture pour favoriser une différenciation d’érythroïdes primitifs

Hépatocytes du foie • DMEM ou IMDM ou • α-milieu essentiel minimum, L-glu, facultativement avec de la

14 déxaméthasone, L'acide ascorbique2-phosphate et nicotinamide ; ou

• milieu E de Williams, sodium pyruvate de sodium, déxaméthasone ; ou

• Les conditions de culture pour les cellules souches pluripotentes listées ci-dessus, avec de la déxaméthasone

Peau/ kératinocytes • Hams F12, DMEM • Éventuellement avec (media ratio 3:1 ), gentamycine en tant hydrocortisone, L- qu'antibiotique. giu, facultativement • Peut incuber à 36,4°C avec adénine ; ou

• E199 or DMEM avec L-glu, facultativement avec hydrocortisone et adénine ; ou

• Les conditions de culture pour les cellules souches pluripotentes listées ci-dessus, avec de l’hydrocortisone, facultativement avec du calcium ou des composés de calcium ou de l'ascorbate

Mélanocytes • MCDB et Leibovitz L-15, TPA, facultativement avec 3-isobutyl-1 méthylxanthine ; ou

• milieu 199 and hydrocortisone

Ostéocytes/os • DMEM, βglycérophosphate, déxaméthasone, ascorbate et L-glu,

15 facultativement avec de la vitamine D3; ou

• Les conditions de culture pour les cellules souches pluripotentes listées ci-dessus, avec glycérophosphate, déxaméthasone et ascorbate, facultativement avec de la vitamine D3.

Cellule de bulbe • milieu E de William, pileux/cheveux L-glu, hydrocortisone, et/ou vitamine D2, adénine et acide linoléique ou

• DMEM, Hams F12 en tant que milieu de base, L-glu, hydrocortisone et/ou vitamine D2, adénine et acide linoléique ; ou

• Les conditions de culture pour les cellules souches pluripotentes listées ci-dessus, avec hydrocortisone, vitamine D2, adénine et acide linoléique.

Chondrocytes/ ® DMEM, pyruvate, cartilage ascorbate 2phosphate, déxaméthasone et proline ; ou • Les conditions de culture pour les cellules souches pluripotentes listées ci-dessus, avec ascorbate 2 phosphate,

16 déxaméthasone et proline.

Adipocytes/cellules • DMEM, grasses déxaméthasone, et indométhacine ; ou

• déxaméthasone et indométhacine

Muscles • DMEM, faible teneur • Éventuellement avec squelettiques en glucose, gentamycine en tant facultativement avec qu’antibiotique hydrocortisone, • Éventuellement avec une déxaméthasone, L- faible concentration en glutamine et sérum. pyruvate de sodium ; • Éventuellement avec des ou récipients de culture ayant de

• DMEM et Ham F12 la gélatine. ou F10 en tant que • Éventuellement à une milieu de base, ou température supérieure à DMEM et milieu 39°C. 199 ; ou • Éventuellement ajout de 5-

• Les conditions de azacytidine culture pour les cellules souches pluripotentes listées ci-dessus, avec glucose, gentamycine et sérum bas

Vaisseaux sanguins • DMEM, NE AA et (endothélium) 2βΜΕ ; ou

• IMDM et déxaméthasone

Muscles • DMEM 4:1 et milieu « Récipients de culture revêtus cardiaques/ M199 ou DMEM de gélatine pour une cardiomyocytes (faible teneur en différenciation complète et glucose), L-glu, sérum autologue ou plasma

NE AA ; ou DMEM appauvri en plaquettes. (faible teneur en • Une différenciation complète glucose) avec acide peut être observée sur une ascorbique et/ou lamelle couvre objet DMSO ; ou

• Les conditions de culture pour les cellules souches pluripotentes listées

17 ci-dessus, culture antigravitaire ou dans un environnement vibrant.

Tropoblastes • DMEM, L-glu, 2βΜΕ, Peut être utilisé pour produire NEAA avec une des facteurs de croissance dilution continue autologues et des hormones avec le même milieu nécessaires pour différencier de culture moins des cellules en mésoderme et l'agent de rétro- ectoderme, y compris des différenciation ; ou cellules souches germinales et

* RPMM 640, 2βΜΕ, des cellules souches pyruvate de sodium progénitrices. et L-glutamine

[0079] De manière notable, pour les conditions de culture décrites pour chaque type de cellule dans le tableau 1 , une suppression de l’agent de rétro-différenciation par une dilution consécutive de la condition de culture avec le milieu de culture correspondant a pour résultat une trans-différenciation plus renforcée.

[0080] Pendant la culture, le milieu de culture contenant facultativement les différents agents promoteurs de différenciation peut être dilué par l’ajout d’un ou plusieurs milieux, mais sans l’agent de rétro-différenciation. Sans être lié à une théorie, une dilution semble augmenter la différenciation du fait que les cellules deviennent moins denses, et les facteurs de stimulation de prolifération sont moins concentrés. Ainsi, l’ajout d’un milieu peut en outre améliorer une transdifférenciation, et va affecter le type de cellule qui est obtenu dans le lignage cellulaire. Par exemple, si la cellule cible est un neurone, l’ajout d’un milieu de culture peut avoir pour résultat un décalage du développement vers un neurone plus mature plutôt qu’un progéniteur de neurones (les deux ayant le même lignage). A titre d’autre exemple, une différenciation vers l’avant de progéniteurs de muscle squelettique va uniquement différencier par une dilution consécutive du milieu de culture qui est obtenue en diminuant graduellement la concentration en sérum.

Cellules redifférenciées

[0081 ] Les cellules rétro-différenciées peuvent être utilisées pour obtenir des cellules cibles en redéterminant ou redifférenciant les cellules rétro-différenciées en un type de cellule cible. Ceci peut être effectué en mettant en contact des cellules rétro-différenciées avec des facteurs de croissance. Par exemple, de l’acide rétinoïque a été utilisé pour différencier des cellules souches en cellules neuronales. De la méthylcellulose suivie par une co-culture avec une ligne stromale de moelle osseuse et IL-7 a été utilisée pour différencier des cellules souches en précurseurs de lymphocytes (Nisitani et al., Int Immuno 1994, 6: pages 909 à 916). Le Page (New Scientist, Dec. 16, 2000) enseigne que des cellules souches peuvent être différenciées en cellules épithéliales de poumons. Bischoff (Dev Biol 1986, 1 15: pages 129 à 139) enseigne comment différencier des cellules satellites de muscle en fibres musculaires matures. Des cellules précurseurs neuronales peuvent être agrandies avec un facteur de croissance de fibroblastes et un facteur de croissance épidermique basiques (Nakafuku et Nakamura, J Neurosci Res 1995, 41 : pages 153 à 168). Des cellules souches hématopoïétiques peuvent être dilatées en utilisant plusieurs facteurs de croissance, y compris GM-CSF, de l’érythropoïétine, un facteur de cellules souches et des interleukines (IL-1 , IL-3, IL-6) - voir Metcalf (Nature 1989, 339: pages 27-30) pour un résumé de ces différents facteurs.

[0082] Potocnik et al. (EMBO J 1994, 13: pages 5274 à 83) ont même démontré la différenciation de cellules souches en cellules hématopoïétiques en utilisant des conditions de faible teneur en oxygène (5%).

[0083] La cellule redifférenciée peut être du même lignage que la cellule déterminée d’où provient la cellule rétro-différenciée. En variante, la cellule redifférenciée peut être d’un lignage différent de la cellule déterminée d’où provient la cellule rétro-différenciée. Par exemple, un lymphocyte B peut être rétro-différencié en une cellule souche CD34<+>CD38<_>HLA-DR<“>. Cette cellule souche peut ensuite être redifférenciée ou redéterminée le long d’un lignage cellulaire B (le même lignage) ou d’un lignage lymphoïde (lignage différent).

Cellules cibles

[0084] Les cellules cibles de la présente invention sont des cellules reprogrammées qui peuvent être obtenues par rétrodifférenciation, transdifférenciation ou redifférenciation, comme décrit ci-dessus. Selon la présente invention, les cellules cibles peuvent comprendre, mais sans s’y limiter, des cellules souches pluripotentes, des cellules souches lymphoïdes, des cellules souches myéloïdes, des cellules souches neuronales, des cellules satellites de muscle squelettique, des cellules souches épithéliales, des cellules souches endodermiques neuroectodermiques, des cellules germinales, des cel-

18 Iules souches extra-embryonnaires et embryonnaires, des cellules souches mésenchymateuses, des cellules de rein, des cellules d’épithélium alvéolaires, des cellules d’endoderme, des neurones, des cellules d’ectoderme, des îlots de Langerhans, des cellules acineuses, des oocytes, du sperme, des cellules hématopoïétiques, des hépatocytes, de la peau/des kératinocytes, des mélanocytes, de l’os/des ostéocytes, des cheveux/des cellules de bulbe pileux, du cartilage/des chondrocytes, des cellules grasses/adipocytes, des cellules squeletto-musculaires, des cellules d’endothélium, des cellules de muscle cardiaque/cardiomyocytes, et des tropoblastes.

[0085] Comme décrit ci-dessus, des cellules déterminées et/ou des cellules rétro-différenciées sont mises en culture dans des conditions particulières pour induire une rétro-différenciation et/ou une trans-différenciation et/ou une redifférenciation, et obtenir les cellules cibles. La durée pendant laquelle les cellules déterminées et/ou les cellules rétro-différenciées sont mises en culture n’est pas commandée par un laps de temps particulier, mais plutôt par la détermination que les cellules cibles ont été produites.

[0086] La détermination de la production de, ou des changements du nombre de, cellules cibles rétro-différenciées, transdifférenciées ou redifférenciées peut être effectuée en surveillant les changements du nombre relatif de cellules déterminées qui régulent à la baisse l’expression de marqueurs associés au lignage ou de facteurs de transcription, et/ou les changements du nombre relatif de cellules ayant une caractéristique de marqueurs de surface de cellules des cellules cibles. En variante, ou de plus, des diminutions du nombre de cellules ayant des marqueurs de surface de cellule typiques de la cellule déterminée, et non pas des cellules cibles, peuvent être surveillées. Par exemple, la cellule cible peut-être une cellule souche embryonnaire, qui est caractérisée par des marqueurs spécifiques à de nombreux stades, comme POU5F1 (OCT-4), TERT, KLF4, UTF1 , SOX2, Nanog ou de marqueurs embryonnaires spécifiques à un stade 3 et 4 (SSEA-3 et SSEA-4), des glycoprotéines à poids moléculaire élevé TRA-1 -60 et TRA-1 -81 et du phosphatase alcalin (Andrews et al., Hybridoma 1984, 3: pages 347 à 361 ; Kannagi et al., EMBO J 1983, 2: pages 2355 à 2361 ; Fox et al., Dev Biol 1984, 103: pages 263 à 266; Ozawa et al., Cell Differ 1985, 16: pages 169 à 173). Ils n’expriment également pas SSEA-1 , dont la présence est un indicateur de différenciation. D’autres marqueurs sont connus pour d’autres types de cellules souches, comme Nestein pour des cellules souches neuro-épithéliales (J Neurosci 985, 5: 3310). Des cellules souches mésenchymateuses sont positives pour SH2, SH3, CD29, CD44, CD71 , CD90, CD106, CD120a et CD124, par exemple, et négatives pour CD34, CD45 et CD14. Des cellules souches pluripotentes sont des cellules CD34<+>DR<_>TdT<“>(d’autres marqueurs utiles étant CD38- et CD36<+>). Des cellules souches lymphoïdes sont des cellules DR<+>, CD34<+>et TdT<+>(également CD38<+>). Des cellules souches myéloïdes sont des cellules CD34<+>, DR<+>, CD13<+>, CD33<+>, CD7<+>et TdT<+>.

[0087] Des marqueurs de cellules supplémentaires pour des cellules cibles peuvent être découverts par analyse par puce à ADN. L’analyse peut impliquer d’isoler de TARN depuis des cellules cibles qui ont été rétro-différenciées et/ou trans-différenciées et/ou redifférenciées, d’étiqueter l’ARN isolé avec une teinture, et d’hybridiser l’ARN isolé sur une puce à ADN. La puce à ADN peut comporter des gènes ou des oligonucléotides représentant un génome entier, ou peut comporter des gènes ou des oligonucléotides concernant un système organique particulier, un système tissulaire particulier, une maladie et une pathologie particulières, etc. Des marqueurs de cellules peuvent être identifiés, par lesquels des gènes/oligonucléotides présentent une intensité de signal élevée, et sont ainsi régulés à la hausse ou à la baisse dans les cellules cibles. Cette information peut ensuite être appliquée pour déterminer des cellules cibles sur la base de la présence de marqueurs, ou même de groupes ou d’un motif de marqueurs, qui ont été identifiés par l’analyse par puce à ADN.

[0088] Une confirmation de cellules cibles peut également être effectuée en utilisant plusieurs dosages in vitro comme des dosages CFC (voir également les exemples). Des cellules souches hématopoïétiques très primitives sont souvent mesurées en utilisant un dosage de cellules initiatrices de culture à long terme (LTC-IC) (Eaves et al., J Tiss Cuit Meth 1991 , 13: pages 55 à 62). Les LTC-ICs soutiennent une hématopoïèse pendant 5 à 12 semaines.

[0089] Pour d’autres types de cellules comme des cellules du système nerveux central, du pancréas, du foie, du rein, de la peau, etc., une culture de cellules peut continuer jusqu’à ce que les cellules cibles émergent telles que caractérisées par immunohistochimie, cytométrie en flux, puce à ADN, ou réaction en chaîne de polymérase à transcription inverse (RTPCR), qui sont des techniques connues dans le domaine. Il peut s’agir également de dosages fonctionnels, par exemple, d’une greffe d’un hôte immunodéficient ou d’une correction ou d’une amélioration d’un état clinique sous-jacent, comme observé ici.

[0090] Les cellules cibles peuvent être identifiées par puce à ADN ou RT-PCR qui montre l’acquisition de nouveaux facteurs de transcription spécifiques à un lignage, de protéines, et de signaux dans les cellules cibles. Par exemple, des cellules souches rétro-différenciées converties en cellules cibles du lignage ectodermique peuvent exprimer des gènes comme Nestin, Criptol, isl1 , LHX1 , et/ou EN1 , et si elles sont en outre différenciées en neurones, elles vont exprimer des neurofilaments (NF). D’autre part, des cellules converties en cellules cibles du lignage endodermique peuvent exprimer des gènes comme sox7, sox 17, Nodal, PDX1 , et/ou FOXA2; mais des cellules cibles différenciées en outre vers des îlots de Langerhans pancréatiques peuvent exprimer des gènes comme insuline (INS) et neurog3 (NGN3). De manière notable, la conversion vers les cellules cibles souhaitées peut être accompagnée par une régulation à la baisse de facteurs de transcription matures associés à la population de départ d’origine qui a subi une conversion.

19 [0091 ] De plus, la détermination de la production de cellules cibles peut survenir en reconnaissant des caractéristiques structurelles et/ou morphologiques particulières des cellules cibles, par exemple la forme et la dimension de la cellule, etc. Ces caractéristiques sont connues dans la technique pour les cellules cibles de la présente invention.

[0092] Une fois que les nombres relatifs du type de cellule souhaité ont augmenté jusqu’à un niveau adapté, qui peut être par exemple aussi bas que 0,1 % ou aussi élevé que 5%, les populations de cellules modifiées résultantes peuvent être utilisées de plusieurs manières. Par rapport au nombre de cellules cibles, par exemple des cellules souches pluripotentes, formées, il est important d’apprécier l’aptitude à la prolifération de cellules souches. Bien que dans certaines circonstances, les nombres de cellules souches ou d’autres cellules rétro-différenciées formées puissent apparaître comme étant bas, des études ont montré que 50 cellules souches hématopoïétiques pluripotentes peuvent reconstituer à elles seules un système hématopoïétique entier chez une souris donneuse. Ainsi, l’utilité thérapeutique ne nécessite pas la formation d’un grand nombre de cellules.

[0093] Une conversion de cellules déterminées en cellules cibles rétro-différenciées, trans-différenciées ou redifférenciées peut également être effectuée in vivo par administration de l’agent, mélangé avec un porteur ou diluant pharmaceutique, à un patient. Cependant, on préfère dans de nombreux cas qu’une rétro-différenciation, une trans-différenciation ou une redifférenciation soit effectuée in vitro/ex vivo.

[0094] Des populations de cellules traitées obtenues in vitro peuvent ensuite être utilisées avec un traitement minimum. Par exemple, elles peuvent être simplement combinées à un porteur ou diluant pharmaceutiquement acceptable, et administrées à un patient ayant besoin de cellules souches.

[0095] Il peut cependant être souhaitable d’enrichir la population de cellules pour les cellules cibles rétro-différenciées, trans-différenciées ou redifférenciée, ou de purifier les cellules de la population de cellules. Ceci peut être effectué de manière pratique en utilisant plusieurs procédés (voir Vattese-Dadey-The Scientist 1999, 13). Par exemple, des cellules peuvent être purifiées sur la base de marqueurs de surface de cellule en utilisant une chromatographie et/ou une cytométrie en flux. Néanmoins, il sera souvent ni nécessaire ni souhaitable de purifier intensivement des cellules cibles rétro-différenciées, trans-différenciées ou redifférenciées à partir de la population de cellules, puisque d’autres cellules présentes dans la population (par exemple des cellules stromales) peuvent maintenir la viabilité et la fonction de cellules souches.

[0096] Une cytométrie en flux est une technique bien établie, fiable et puissante pour caractériser des cellules chez des populations mixtes, de même que pour trier des cellules. Ainsi, les moyens de purification ou d’isolement peuvent comprendre ainsi un cytomètre en flux. Une cytométrie en flux fonctionne sur la base de caractéristiques physiques de particules dans une suspension liquide, que l’on peut distinguer en interrogeant avec un faisceau de lumière. De telles particules peuvent bien sûr être des cellules. Des caractéristiques physiques comprennent la dimension et la structure cellulaire ou, comme cela est devenu très populaire ces dernières années, des marqueurs de surface de cellule liés par des anticorps monoclonaux conjugués à des molécules fluorescentes.

[0097] Kreisseg et al. (J Hematother 1994, 3: pages 263 à 89) établissent que, «du fait de la disponibilité d’anticorps monoclonaux anti-CD34, une cytométrie en flux à plusieurs paramètres est devenue l’outil de choix pour déterminer des cellules souches hématopoïétiques et des cellules progénitrices. » Kreisseg décrit en outre des techniques courantes pour quantifier et caractériser des cellules exprimant CD34 par cytométrie en flux. En outre, Korbling et al., (Bone Marrow Transplant 1994, 13: pages 649 à 654) enseigne la purification de cellules CD34<+>par immunoadsorption suivi par une cytométrie en flux, sur la base d’une expression de HLA-DR comme décrit ci-dessus, CD34<+>est un marqueur utile en association avec des cellules souches/cellules progénitrices. Des techniques de cytométrie en flux pour trier des cellules souches sur la base d’autres caractéristiques physiques sont également disponibles. Par exemple, Visser et al. (Blood Cells 1980, 6: pages 391 à 407) enseigne que des cellules souches peuvent être isolées sur la base de leur taille et de leur degré de structuration. Grogan et al. (Blood Cells 1980, 6: pages 625 à 644) enseigne également que des «cellules souches viables peuvent être triées à partir de tissus hématopoïétiques simples en pureté élevée et vérifiable».

[0098] De même qu’une sélection de cellules sur la base de la présence d’un marqueur de surface de cellules ou d’une autre propriété physique (sélection positive), des populations de cellules peuvent être enrichies et purifiées en utilisant des critères négatifs. Par exemple, des cellules qui possèdent des marqueurs spécifiques à un lignage, comme CD4, CD8, CD42 et CD3, peuvent être enlevés de la population de cellules par cytométrie en flux ou chromatographie d’affinité.

[0099] Une technique très utile pour purifier des cellules implique l’utilisation d’anticorps ou d’autres ligands d’affinité liés à des billes magnétiques. Les billes sont incubées avec la population de cellules, et les cellules qui ont un marqueur de surface de cellule, comme CD34, auquel se lie le ligand d’affinité, sont capturées. Le tube échantillon contenant les cellules est placé dans un concentrateur d’échantillon magnétique où les billes sont attirées vers les côtés du tube. Après une ou plusieurs étapes de lavage, les cellules intéressantes ont été partiellement ou sensiblement complètement purifiées des autres cellules. Lors d’une utilisation dans un format de sélection négative, au lieu de laver les cellules liées aux billes en mettant la phase liquide au rebut, la phase liquide est conservée et ensuite, les cellules liées aux billes sont enlevées efficacement de la population de cellules.

[0100] Ces procédés de vérification à base de ligand d’affinité peuvent être utilisés avec tout type de cellule pour lequel des marqueurs adaptés ont été caractérisés, ou peuvent être caractérisés. Urbankova et al. (J Chromatogr B Biomed Appl 1996, 687: pages 449 à 452) enseigne la micro-préparation de cellules souches hématopoïétiques depuis une suspension

20 de moelle osseuse de souris par fractionnement de champ-écoulement gravitationnels. Urbankova et al. font en outre comme commentaire que le procédé a été utilisé pour la caractérisation de cellules souches provenant d’une moelle épinière de souris du fait que ces cellules sont plus grosses que les autres cellules dans la moelle épinière, et qu’il est par conséquent possible de les séparer du mélange. Ainsi des paramètres physiques autres que des marqueurs de surface de cellule peuvent être utilisés pour purifier/enrichir des cellules souches.

[0101 ] Des populations de cellules comportant des cellules cibles reprogrammées, comme des cellules cibles rétro-différenciées, trans-différenciées ou redifférenciées, et/ou des cellules cibles reprogrammées purifiées, comme des cellules cibles rétro-différenciées, trans-différenciées ou redifférenciées produites par les procédés de la présente invention, peuvent être conservées in vitro en utilisant des techniques connues. Typiquement, des milieux de croissance minimum comme Hanks, RPMI 1640, milieu essentiel minimum de Dulbecco (DMEM) ou milieu essentiel minimum de Dulbecco modifié selon Iscove, sont utilisés, complétés avec du sérum de mammifère comme FBS, et facultativement du plasma autologue, afin de fournir un environnement de croissance adapté pour les cellules. Les cellules souches peuvent être mises en culture sur des couches d’alimentation comme des couches de cellules stromales (voir Deryugina et al., Crit Rev Immunology 1993, 13: pages 1 15 à 150). Les cellules stromales sont censées sécréter des facteurs qui maintiennent des cellules progénitrices dans un état indifférencié. Un système de culture à long terme de cellules souches est décrit par Dexter et al. (J Cell Physiol 1977, 91 : 335) et Dexter et al. (Acta Haematol 1979, 62: 299).

[0102] Par exemple, Lebkowski et al. (Transplantation 1992, 53: 101 1-9) enseigne que des cellules hématopoïétiques CD34<+>humaines peuvent être purifiées en utilisant une technologie basée sur l’utilisation d’anticorps monoclonaux qui sont immobilisés de manière covalente sur des surfaces en polystyrène, et que les cellules CD34<+>purifiées par ce procédé peuvent être conservées avec une viabilité supérieure à 85%. Lebkowski et al., (J Hematother 1993, 2: pages 339 à 342) enseigne également comment isoler et cultiver des cellules CD34<+>humaines. Voir également Haylock et al. (Immunomethods 1994, 5: pages 217-25) pour une revue des différents procédés.

[0103] Des populations de cellules comprenant des cellules souches et des préparations purifiées comprenant des cellules souches peuvent être congelées/cryo-préservées pour une utilisation future. Des techniques adaptées pour congeler des cellules et ensuite les faire revivre sont connues dans la technique.

[0104] Selon un premier aspect, la rétro-différenciation, trans-différenciation ou redifférenciation survient sur des cellules provenant d’échantillons de couche leucocyto-plaquettaire, ou dans ceux-ci. L’expression «couche leucocyto-plaquettaire» signifie la couche de globules blancs qui se forme entre la couche de globules rouges et le plasma lorsque du sans non coagulé est centrifugé ou laissé à reposer.

Procédés de traitement

[0105] Des cellules cibles reprogrammées de la présente invention, comme des cellules cibles rétro-différenciées, des cellules cibles trans-différenciées et des cellules cibles redifférenciées, peuvent être combinées avec différents composants pour produire des compositions de la présente invention. Les compositions peuvent être combinées avec un ou plusieurs porteurs ou diluants pharmaceutiquement acceptables pour produire une composition pharmaceutique (qui peut être destinée à une utilisation humaine ou animale). Des porteurs et diluants adaptés comprennent, mais sans s’y limiter, des solutions salines isotoniques, par exemple une solution tamponnée par phosphate. La composition de la présente invention peut être administrée par injection directe. La composition peut être formulée pour une administration parentérale, intramusculaire, intraveineuse, sous-cutanée, intraoculaire, buccale, transdermique, ou pour une injection dans le liquide céphalo-rachidien.

[0106] Des compositions comprenant des cellules cibles peuvent être administrées par injection ou implantation. Les cellules peuvent être délivrées dans une suspension, ou enrobées dans une matrice de support, comme des matrices naturelles et/ou synthétiques biodégradables. Des matrices naturelles comportent, mais sans s’y limiter, des matrices de collagène. Des matrices biodégradables synthétiques comportent, mais sans s’y limiter, des polyanhydrides et de l’acide polylactique. Ces matrices peuvent fournir un support pour des cellules fragiles in vivo.

[0107] Les compositions peuvent également comporter les cellules cibles rétro-différenciées ou trans-différenciées ou redifférenciées de la présente invention, et au moins un excipient, porteur ou véhicule pharmaceutiquement acceptable.

[0108] Une administration peut également être effectuée par une administration commandée, c’est-à-dire une administration sur un laps de temps qui peut être de plusieurs minutes à plusieurs heures ou plusieurs jours. L’administration peut être systémique (par exemple par injection intraveineuse), ou dirigée vers un site d’intérêt particulier. Des cellules peuvent être introduites in vivo en utilisant un transfert de liposomes.

[0109] Des cellules cibles peuvent être administrées en doses allant de 1 x 10<5>à 1 x 10<7>cellules par kilo. Par exemple, 14 x 10<6>cellules CD34<+>peuvent être administrées à un patient de 70 kg pour une reconstitution tissulaire. Les dosages peuvent être toute combinaison des cellules cibles listées dans cette demande.

[0110] Les procédés de la présente invention peuvent être utilisés pour traiter divers troubles, états ou maladies. De tels états comportent, mais sans s’y limiter, une défaillance de la moelle osseuse, des états hématologiques, une anémie aplasique, une thalassémie β, le diabète, la sclérose latérale amyotrophique, la maladie de Parkinson, une blessure de la moelle épinière, une dystrophie musculaire, une maladie des reins, une maladie du foie, la sclérose en plaques, une

21 insuffisance cardiaque congestive, le virus de l’hépatite C, le virus du VIH, un traumatisme crânien, une maladie des poumons, une dépression, une azoospermie non obstructive, l’andropause, la ménopause et la stérilité, la rejuvénilisation, des ulcers de sclérodermie, le psoriasis, les rides, la cirrhose du foie, une maladie auto-immune, l’alopécie, une rétinite pigmentaire, et une dystrophie cristalline/cécité, ou tout trouble associé à une dégénération tissulaire.

[0111 ] Une anémie aplasique est un trouble rare mais fatal de la moelle osseuse, marqué par une pancytopénie et une moelle épinière hypocellulaire (Young et al. Blood 2006, 108: 2509-2519). Le trouble peut être provoqué par une pathophysiologie auto-immune, avec des cellules cytotoxiques T de type 1 activées exprimant la cytokine Th1 , en particulier un γ-interféron ciblé vers le compartiment de cellules souches hématopoïétiques, menant à une défaillance de la moelle épinière, et ainsi à une déficience hématopoïétique (Bacigalupo et al., Hematology 2007, pages 23 à 28). La majorité de patients souffrant d’une anémie aplasique peuvent être traités avec une transplantation de cellules souches obtenues par fratrie appariée en HLA (Locasciulli et al. Haematologica., 2007; 92:1 1-18.), bien que l’extension de cette approche à des patients plus âgés ou à ceux qui manquent de donneurs familiaux reste un défi important. En dépit du taux de survie raisonnable après transplantation de cellules souches allogéniques appariées en HLA, la procédure implique certains risques potentiels du fait du régime immunosuppresseur utilisé pour empêcher une réaction de greffon contre hôte (GVDH). Par exemple, du cyclophosphoamide à haute dose avec ou sans globuline antithymocyte (ATG) conduit à une période d’immunosuppression prolongée, et prédispose le patient à une infection opportuniste. Un autre risque potentiel est un rejet de greffe qui peut survenir des semaines ou des mois après une transplantation de cellules souches (Gottdiener et al., Arch Intern Med 1981 , 141 : pages 758 à 763; Sanders et al., Semin Hematol 1991 , 28: 244-249). De plus, le risque de rejet de greffe augmente avec le nombre de transfusions sanguines reçues avant une transplantation de cellules souches.

[0112] La thalassémie est une maladie du sang récessive autosomique héréditaire marquée par un taux de synthèse réduit d’une des chaînes de globine constituant l’hémoglobine. Il y a ainsi une sous-production des protéines de globine normales, souvent du fait de mutations de gènes régulateurs, ayant pour résultat la formation de molécules d’hémoglobine anormales, provoquant une anémie. Différents types de thalassémie comprennent une alpha-thalassémie, bêta-thalassémie et delta-thalassémie, qui affectent la production de Palpha-globine, bêta-globine et delta-globine, respectivement. Des traitements comprennent une transfusion sanguine chronique, une chélation de fer, une splénectomie, et une transplantation hématopoïétique allogénique. Cependant, une transfusion sanguine chronique n’est pas disponible pour la plupart des patients du fait du manque de donneur de moelle osseuse appariée en HLA, tandis qu’une transplantation hématopoïétique allogénique est associée à de nombreuses complications possibles, comme des infections et une réaction de greffon contre hôte.

[0113] Le diabète est un syndrome résultant de niveaux de sucre anormalement élevés dans le sang (hyperglycémie). Le diabète fait référence à un groupe de maladies qui mènent à des niveaux de glucose sanguin élevés du fait de défauts de sécrétion d’insuline ou d’action d’insuline dans le corps. Les diabètes sont typiquement séparés en deux types: des diabètes de type 1 , marqués par une production diminuée d’insuline, ou des diabètes de type 2, marqués par une résistance aux effets de l’insuline. Les deux types mènent à une hyperglycémie, qui provoque largement les symptômes associés généralement aux diabètes, par exemple une production excessive d’urine, ayant pour résultat une soif de compensation, et une ingestion de liquide accrue, une vision troublée, une perte de poids inexpliquée, une léthargie, et un changement du métabolisme énergétique. Le diabète est considéré être une maladie chronique, c’est-à-dire sans guérison. Des options de traitement sont limitées à des injections d’insuline, de l’exercice, un régime adapté, ou pour des patients souffrant de diabète de type 2, à certains médicaments, par exemple ceux qui favorisent une sécrétion d’insuline par le pancréas, une diminution du glucose produit par le foie, une augmentation de la sensibilité des cellules à l’insuline, etc.

[0114] Une maladie de neurones moteurs fait référence à un groupe de troubles neurologiques qui affectent les neurones moteurs. De telles maladies comprennent une sclérose latérale amyotrophique (ALS), une sclérose latérale primaire (PLS), et une atrophie musculaire progressive (PMA). Une ALS est marquée par une dégénérescence des neurones moteurs supérieurs et inférieurs, qui cessent d’envoyer des messages aux muscles, en ayant pour résultat leur affaiblissement et une éventuelle atrophie. La PLS est une maladie de neurones moteurs rare affectant uniquement les neurones moteurs supérieurs, qui provoque des difficultés d’équilibre, de faiblesse et des rigidités dans les jambes, une spasticité, et des problèmes d’élocution. La PMA est un sous-type d’ALS qui affecte uniquement les neurones moteurs inférieurs, qui peut provoquer une atrophie musculaire, une fasciculation, et une faiblesse. Il n’y a pas de guérison connue pour des maladies de neurones moteurs. Le Riluzole, qui est considéré comme réduisant des dommages occasionnés aux neurones moteurs, a été approuvé en tant que médicament pour l’ALS, bien qu’il ralentisse la progression de l’ALS plutôt que d’en atténuer les effets. Pour la PLS, les traitements s’adressent uniquement aux symptômes, comme le Baclofen qui peut réduire la spasticité, ou la quinine qui peut diminuer les crampes.

[0115] La maladie de Parkinson (PD) est un trouble neurodégénératif marqué par la perte de la voie striato-nigrale, résultant de la dégénérescence de neurones dopaminergiques dans le locus niger. La cause de la PD est inconnue, mais est associée à la mort progressive de neurones mésencéphaliques dopaminergiques (tyrosine hydroxylase (TH) positive), induisant une déficience motrice. Ainsi, la PD est caractérisée par une rigidité musculaire, des tremblements, une bradykinésie, et potentiellement une kinésie. Ainsi, il n’y a actuellement pas de cure satisfaisante pour la maladie de Parkinson, ni de traitement pour empêcher ou traiter la maladie de Parkinson, ou ses symptômes. Un traitement symptomatique des déficiences motrices associées à la maladie implique l’administration orale de dihydroxyphénylalanine (L-DOPA), qui peut mener à une amélioration substantielle de la fonction motrice, mais dont les effets sont réduits comme la dégénérescence

22 des neurones dopaminergiques progresse. Des stratégies en variante comprenne une greffe neuronale, qui est basée sur l’idée que la dopamine alimentée depuis les cellules implantées dans le striatum peuvent se substituer aux cellules striato-nigrale perdues, et une thérapie génique, qui peut être utilisée pour remplacer la dopamine dans le striatum affecté en agrandissant les enzymes sensibles à L-DOPA ou une synthèse de dopamine, comme en introduisant des molécules neuroprotectrices potentielles qui peuvent empêcher les neurones TH-positifs de mourir, ou stimuler la régénération et la récupération fonctionnelle dans le système striato-nigral détérioré.

[0116] Une blessure de la moelle épinière est caractérisée par une détérioration de la moelle épinière et, en particulier, des fibres nerveuses, en ayant pour résultat une déficience d’une partie ou de tous les muscles ou nerfs sous le site de blessure. Une telle détérioration peut survenir par un traumatisme occasionné à la colonne vertébrale qui se rompt, se disloque, s’écrase, ou par une compression d’une ou plusieurs vertèbres, ou par des blessures non-traumatiques provoquées par de l’arthrite, un cancer, une inflammation ou une dégénérescence de disques. Bien que des traitements suite à une blessure de la moelle épinière puissent impliquer des médicaments comme la méthylprédnisolone, qui est un corticostéroïde qui réduit la détérioration des cellules nerveuses et diminue l’inflammation dans la zone blessée, ou des médicaments pour contrôler la douleur et la spasticité musculaire, de même que l’immobilisation de la colonne vertébrale, ou une intervention chirurgicale pour enlever des disques à hernie ou tout objet susceptible de détériorer la colonne vertébrale, il n’existe pas de moyens connus pour inverser la détérioration de la moelle épinière.

[0117] Une dystrophie musculaire (MD) indique un ensemble de maladies musculaires héréditaires qui affaiblissent les muscles squelettiques. Une MD peut-être caractérisée par un affaiblissement progressif des muscles, des défauts dans les protéines de muscle, une apoptose de cellules de muscle, et une atrophie tissulaire. Il y a plus de 100 maladies qui présentent des caractéristiques de MD, bien que neuf maladies en particulier - de Duchenne, de Becker, des ceintures, congénitale, facioscapulohumérale, myotonique, oculopharyngée, distale, et de Emery-Dreifuss - soient classées en tant que MD. Il n’y a pas de guérison connue pour une MD, ni même de traitements spécifiques. Une thérapie physique peut maintenir une tonicité musculaire, et une intervention chirurgicale peut être utilisée pour améliorer la qualité de vie. En outre, des symptômes comme la myotonie peuvent être traités avec des médicaments, mais il n’y a pas de traitement à long terme.

[0118] Une maladie rénale indique des états qui détériorent les reins, et diminuent leur aptitude à fonctionner, comprenant l’enlèvement de déchets et de l’eau en excès depuis le sang, la régulation des électrolytes, de la pression sanguine, de l’équilibre acide-base, et la réabsorption de glucose et d’acides aminés. Les deux causes principales d’une maladie rénale sont le diabète et une pression sanguine élevée, bien que d’autres causes comprennent une glomérulonéphrite, un lupus, et des malformations et des obstructions dans le rein. Il n’y a pas de guérison d’une maladie rénale, et la thérapie se focalise ainsi sur un ralentissement de la progression de la maladie, et un traitement des causes de la maladie, comme en commandant le glucose sanguin et une pression sanguine élevée, et en surveillant l’alimentation; et un traitement des complications de la maladie, comme par exemple en s’occupant d’une rétention hydrique, d’une anémie, d’une maladie osseuse; et en remplaçant la fonction rénale perdue, comme par dialyse ou transplantation.

[0119] La sclérose en plaques est une maladie auto-immune dans laquelle le système immunitaire attaque le système nerveux central, en menant à une démyélinisation. La MS affecte l’aptitude des cellules nerveuses dans le cerveau et dans la moelle épinière à communiquer les unes avec les autres, comme le propre système immunitaire du corps attaque et détériore la myéline qui enveloppe les axons de neurones. Lorsque la myéline est perdue, les axons ne peuvent plus conduire efficacement des signaux. Ceci peut mener à divers symptômes neurologiques, qui progressent habituellement en incapacité physique et cognitive. Il n’y a pas de guérison connue pour la MS; des traitements tentent de restaurer la fonction après une attaque (démarrage soudain ou affaiblissement des symptômes de MS), d’empêcher de nouvelles attaques, et d’empêcher une incapacité. Par exemple, un traitement à base de corticostéroïdes peut aider à mettre fin à l’attaque, tandis qu’un traitement à base d’interféron pendant une attaque initiale s’est avéré diminuer la chance qu’une MS clinique se développe.

[0120] Le virus de l’immunodéficience humaine (HVIH) est un lentivirus qui peut mener au syndrome d’immunodéficience acquise (SIDA), un état dans lequel le système immunitaire commence à être défaillant. Le VIH infecte principalement des cellules vitales dans le système immunitaire humain, comme des cellules T auxiliaires, des macrophages, et des cellules dendritiques. Une infection par le VIH mène à des niveaux bas de cellules CD4<+>T par une suppression virale directe de cellules infectées, par des taux d’apoptose accrus dans les cellules infectées, ou en tuant des cellules CD4<+>T au moyen de lymphocytes CD8 cytotoxiques qui reconnaissent des cellules infectées. Actuellement, il n’y a pas de vaccin ni de guérison pour le VIH ou le SIDA. Un traitement pour une infection par le VIH consiste en une thérapie antirétrovirale très active, ou HAART. Des options de HAART courantes sont des combinaisons (ou «cocktails») constitués d’au moins trois médicaments d’au moins deux types d’agents antirétroviraux. Typiquement, ces classes sont deux inhibiteurs nucléosidiques de la transcriptase inverse analogue (NARTIs or NRTIs) plus un inhibiteur de protéase, ou un inhibiteur de transcriptase inverse non-nucléosidique (NNRTI).

[0121 ] Une insuffisance cardiaque congestive indique un état dans lequel le cœur ne peut plus pomper suffisamment de sang vers les autres organes du corps. Cet état peut résulter du maladie coronarienne, de tissu cicatriciel sur le cœur provoqué par un infarctus du myocarde, d’une pression sanguine élevée, d’une valvulopathie, de défauts du cœur, et d’une infection de la valvule cardiaque. Des programmes de traitement consistent typiquement de repos, une alimentation saine, des activités journalières modifiées, et des médicaments, comme des inhibiteurs d’enzyme convertissant l’angiotensin-

23 (ACE), des bêtabloquants, des digitales, des diurétiques et des vasodilatateurs. Cependant, le programme de traitement ne va pas inverser la détérioration ou l’état du cœur.

[0122] L’hépatite C est une maladie infectieuse dans le foie, provoquée par le virus de l’hépatite C. L’hépatite C peut progresser vers une cicatrisation (fibrose) et une cicatrisation avancée (cirrhose). La cirrhose peut mener a une défaillance du foie, et à d’autres complications, comme un cancer du foie. Les traitements actuels comprennent l’utilisation d’une combinaison d’alpha-interférons pegylés et de la ribavirine médicamenteuse antivirale. Les taux de succès peuvent varier entre 50 et 80% selon le génotype de virus.

[0123] Un traumatisme crânien indique une blessure de la tête qui peut ou non provoquer une blessure du cerveau. Des causes courantes de traumatisme crânien comprennent des accidents de circulation, des accidents domestiques et des accidents de loisirs, des chutes, et des assauts. Divers types de problèmes peuvent résulter d’un traumatisme crânien, comme une fracture du crâne, des lacérations du cuir chevelu, un hématome sous-dural (saignements entre la dure-mère et le crâne), une contusion cérébrale (ecchymose du cerveau), une commotion (perte temporaire de fonction du fait d’un traumatisme), un coma, ou même la mort. Le traitement d’un traumatisme crânien va varier selon le type de blessure. Si le cerveau est atteint, il n’y a pas de moyen rapide pour le rétablir, et souvent la détérioration ne peut pas être guérie par les moyens de traitement disponible.

[0124] Une maladie pulmonaire est une expression large pour des maladies du système respiratoire, ce dernier comprenant le poumon, la cavité pleurale, des tubes bronchiques, la trachée, la voix respiratoire supérieure, et les nerfs et muscles pour respirer. Des exemples de maladie pulmonaire comprennent une maladie pulmonaire obstructive, dans laquelle les tubes bronchiques deviennent rétrécis; une maladie pulmonaire restrictive ou fibrotique, dans laquelle le poumon perd de la souplesse, et provoque une dilatation de poumon incomplète et une rigidité de poumon accrue; des infections des voix respiratoires, qui peuvent être provoquées par le froid courant ou une pneumonie; des tumeurs respiratoires, comme celles provoquées par le cancer, des maladies de la cavité pleurale; et des maladies pulmonaires vasculaires, qui affectent la circulation pulmonaire. Un traitement pour une maladie pulmonaire varie selon le type de maladie, mais peut comprendre des médicaments comme des corticostéroïdes des antibiotiques, de l’oxygène, une ventilation mécanique, une radiothérapie, et une intervention chirurgicale.

[0125] Une dépression est un trouble mental caractérisé par une humeur morose accompagnée par une faible estime de soi et une perte d’intérêt ou de plaisir à des activités normalement agréables. Biologiquement, une dépression est accompagnée par une activité altérée dans de multiples parties du cerveau, y compris les noyaux du raphé, qui sont un groupe de petits noyaux dans le tronc cérébral supérieur qui est une source de sérotonine; le noyau suprachiasmatique, qui commande des rythmes biologiques comme le cycle de sommeil/éveil; l’axe hypothalamo-pituitaire-surrénalien, qui est une chaîne de structures qui sont activées pendant une réponse du corps à diverses contraintes; la zone ventrale de la calotte, qui est considérée comme étant responsable des circuits de «récompense» du cerveau; les noyaux accumbens, dont on nous enseigne qu’ils jouent un rôle dans la récompense, le rire, le plaisir, l’addiction, et la peur; et le cortex antérieur cingulaire, qui est activé par des expériences négatives. Des traitements contre la dépression comprennent des antidépresseurs qui augmentent la quantité de sérotonine extracellulaire dans le cerveau, l’exercice, et une psychothérapie. Cependant, on continue de s’interroger sur l’efficacité de ces traitements.

[0126] Une azoospermie non obstructive est un état médical d’un homme n’ayant pas un niveau quelconque de spermatozoïdes mesurable dans sa semence du fait d’un problème de spermatogenèse. Celui-ci est souvent provoqué par un déséquilibre hormonal, et peut être traité en utilisant des médicaments qui rétablissent le déséquilibre.

[0127] L’andropause est un état analogue à la ménopause que l’on rencontre chez des hommes d’âge moyen, impliquant une réduction de la production des hormones testostérone et déhydroépiandrostérone. Les traitements comprennent une thérapie de remplacement d’hormones et de l’exercice.

[0128] Une sclérodermie est une maladie auto-immune chronique qui affecte du tissu conjonctif. Un durcissement de la peau est la manifestation la plus visible de cette maladie, bien qu’elle puisse affecter du tissu conjonctif d’un bout à l’autre du corps. Il n’y a pas de guérison directe connue pour la sclérodermie.

[0129] Le psoriasis est une maladie auto-immune chronique qui provoque l’apparition de pastilles rouges à écailles sur la peau. La cause du psoriasis est liée à une croissance excessive de cellules de peau. Une hypothèse suggère qu’il est lié à des cellules-T qui migrent vers le derme, et déclenchent la libération de cytokines induisant la production rapide de cellules de peau. Des traitements pour le psoriasis comprennent des médicaments qui ciblent les cellules-T.

[0130] Une rétinite pigmentaire est un type de dystrophie rétinienne progressive dans laquelle les photorécepteurs ou l’épithélium de pigment rétinien sont anormaux, et mènent à une perte de vision. Les thérapies pour traiter une rétinite pigmentaire sont limitées.

[0131 ] Les états décrits ici peuvent être traités avec un type particulier, ou une combinaison de types, de cellules cibles. Dans des modes préférés de réalisation, les états décrits ici peuvent être traités par perfusion des types de cellules indiqués dans le tableau 2.

24 Tableau 2: Régimes de traitement pour divers états en utilisant des cellules cibles reprogrammées, c’est-à-dire rétro-différenciées ou trans-différenciées ou redifférenciées.

[0132]

Etat Type de cellules de traitement (un type, ou plusieurs en combinaison)

Anémie aplasique Cellules hématopoïétiques

Beta-thalassémie Cellules hématopoïétiques

Diabètes Cellules souches mésenchymateuses, cellules souches pluripotentes et/ou îlots de Langerhans

Maladie de Cellules souches pluripotentes, cellules d'épithélium neurones moteurs alvéolaires, cellules d'ectoderme et/ou neurones

Maladie de Cellules souches pluripotentes et/ou neurones Parkinson

Blessure de la Cellules souches pluripotentes et/ou neurones moelle épinière

Dystrophie Cellules souches pluripotentes, cellules souches musculaire mésenchymateuses et/ou cellules de muscle squelettique

Maladie rénale Cellules rénales, cellules souches mésenchymateuses et/ou cellules souches pluripotentes

Sclérose en Cellules souches pluripotentes, cellules souches plaques mésenchymateuses et/ou neurones

Défaillance cardiomyocytes, cellules souches mésenchymateuses, cardiaque cellules souches pluripotentes et/ou cellules congestive d'endothélium

Virus de cellules hématopoïétiques, cellules souches l'hépatite C pluripotentes, cellules souches mésenchymateuses et/ou hépatocytes du foie

Virus de Cellules hématopoïétiques l'immunodéficience humaine

Traumatisme Cellules souches pluripotentes et/ou neurones crânien

Maladie pulmonaire Cellules souches pluripotentes, cellules souches mésenchymateuses, cellules d'épithélium alvéolaires et/ou cellules d'endothélium

Dépression Cellules souches pluripotentes et/ou neurones

Azoospermie non Cellules souches pluripotentes, cellules germinales obstructive ou pluripotentes et/ou spermatozoïdes Andropause

Ménopause et Cellules souches pluripotentes, oocytes, cellules stérilité germinales pluripotentes Réjuvénilisation Cellules germinales pluripotentes, cellules souches

25 pluripotentes, kératinocytes, cellules du bulbe pileux, neurones, spermatozoïdes, ostéocytes, chondrocytes, cardiomyocytes, cellules de muscle squelettique, neurones, cellules d'endothélium, et/ou mélanocytes

Ulcères de Cellules souches pluripotentes, cellules d'endothélium, sclérodermie kératinocytes et/ou cellules souches mésenchymateuses

Psoriasis Cellules souches mésenchymateuses et/ou cellules souches pluripotentes

Rides Cellules souches mésenchymateuses, kératinocytes, et/ou cellules souches pluripotentes

Cirrhose du foie hépatocytes du foie, cellules souches mésenchymateuses, cellules endodermiques, cellules souches pluripotentes

Maladie autoCellules souches mésenchymateuses et/ou cellules immune souches pluripotentes

Alopécie Cellules du bulbe épineux et/ou mélanocytes

Rétinite neurones et/ou cellules souches pluripotentes pigmentaire ou dystrophie cristalline/cécité

[0133] A titre d’exemple, un patient peut être traité pour un état tel que décrit ci-dessus à travers les étapes suivantes:

1 ) une fistule-canule est insérée dans un bras du patient;

2) Des globules blancs sont recueillis par aphérèse en utilisant un système automatisé, comme le dispositif COBE® Spectra Device (Gambro PCT);

3) Des cellules souches rétro-différenciées autologues sont produites à partir des globules blancs du patient;

4) Les cellules souches rétro-différenciées autologues sont lavées puis perfusées de manière intraveineuse dans le patient;

5) Les progrès du patient sont surveillés, y compris par prélèvement d’échantillons de sang et évaluation des zones blessées.

[0134] La présente invention va maintenant être décrite au moyen d’exemples non limitatifs qui suivent, qui illustrent davantage la présente invention, et qui ne sont pas prévus, et ne doivent pas être interprétés comme limitant la portée de la présente invention.

EXEMPLES

Exemple 1

Matériaux et procédés

[0135] Cette étude clinique a évalué la sécurité d’une perfusion d’une dose unique de cellules reprogrammées pendant 3 heures autologues à la suite d’une exposition à une condition de culture inductive hématopoïétique, chez quatre patients souffrant d’une anémie aplasique.

[0136] Cette étude clinique a été approuvée par le comité d’éthique du King Edward Mémorial (KEM) Hospital, et a été effectuée en collaboration étroite avec l’institut d’immuno-hématologie (IIH). Les patients devaient satisfaire les critères indiqués dans le tableau 3. En résultat, quatre patients souffrant d’une anémie sévère (trois hommes) et hypoplasique (une femme) ont été choisis pour l’étude. Ces quatre patients ont été sélectionnés et surveillés par l’équipe IIH/KEM. Les historiques cliniques et de traitement des patients sont indiqués dans le tableau 4, tandis que leurs dosages de perfusion de cellules CD34<+>sont indiqués dans le tableau 5.

26 Tableau 3: Critères d’inclusion [0137]

Chaque 1 - Décomptes de Neutrophiles absolus < 0.5X10<y>/L critère est 2- Décompte de plaquettes <20X10<9>/L nécessaire 3- Anémie avec réticulocytes corrigés<1 %

Un seul 4- Cellularité de moelle osseuse <25 % des 5- Cellularité de moelle osseuse <50 % avec moins de 30 % critères est de cellules hématopoïétiques nécessaire 6- Sujet évalué durant les trois premiers mois de diagnostic

7- Sujet n'ayant pas reçu préalablement de thérapie immunosuppressive

[0138] Les patients ont été transfusés avec 2 unités de globules rouges conditionnés irradiés et 4 unités de plaquettes, afin de maintenir leur niveau d’hémoglobine au-dessus de 8 g/dl, et les numérations de plaquettes au-dessus de 50,000. Les patients ont subi une aphérèse en traitant 2 ou 3 fois leur volume de sang complet en utilisant la machine d’aphérèse Cobe Spectra, et le kit de séparation de globules blancs (les deux de chez Gambro BCT). L’aphérèse impliquait une cathétérisation veineuse jugulaire et anticubitale à l’aide d’un cathéter à une seule lumière pour un accès veineux.

[0139] Une quantité aliquote de cellules a été recueillie de manière aseptique pour une analyse de CD34, à la suite d’un recueil de 150 à 200 ml de couche leucocyto-plaquettaire. Par la suite, la couche leucocyto-plaquettaire a été soumise à une reprogrammation sous des conditions de culture inductive hématopoïétique. Brièvement, la procédure de reprogrammation a impliqué l’ajout de 1000 pg de CR3/43 purifié (spécialement préparé par DakoCytomation pour TriStem Corp.) dilué dans 30 ml de milieu modifié selon Iscove, de manière aseptique dans la poche de globules blancs. La poche ensuite été incubée dans un incubateur de culture de tissu stérile maintenu à 37 °C et 5% de C02pendant trois heures. A la suite de l’achèvement du processus de reprogrammation, les cellules converties ont été analysées quant à leur teneur en cellules CD34<+>. Ensuite, les cellules ont été lavées deux fois avec une solution saline en utilisant le dispositif de traitement de cellules 2991 de chez COBE. Après agitation et remise en suspension dans une solution saline, la suspension cellulaire a été perfusée dans le patient via la veine jugulaire sous l’action de la gravité en utilisant un ensemble de perfusion. Des signes vitaux, y compris les numérations CBC de patients, ont été surveillés en continu avant et après perfusion des cellules reprogrammées autologues.

Tableau 4: historiques cliniques et de traitement de patients souffrant d’une anémie aplasique jusqu’à une perfusion de cellules souches reprogrammées humaines autologues (HRSC).

[0140]

Patient Historique clinique jusqu'à Traitement jusqu'à perfusion de HRSC perfusion de RSC

Patient A • Diagnostic de SAA en A reçu un essai de homme de 2002 stéroïdes anabolisants 25 ans • Présentait des (TabMenabol) pendant anémie symptômes de faiblesse 8 mois, sans une aplasique et de dyspnée quelconque amélioration sévère ® Episodes fréquents de significative saignement rectal et des gencives, et de

27 vomissements

• A reçu respectivement 4 et 2 unités de sang et de plaquettes, tous les mois

• Apparition de jaunissement du blanc de l’oeil avec congestion oculaire sévère

Patient B • Diagnostic d'anémie A reçu des produits femme de 26 Hypoplasique en hématiques pendant 3 ans anémie janvier 2004 mois avant perfusion de Hypoplasique • Présentait des RSC, sans réponse symptômes de polyménorrhée de 6 mois

• Uniquement avant perfusion de RSC, les patients ont reçu 4 et 6 unités, respectivement, de globules rouges et de plaquettes

Patient C • Diagnostic d'anémie A reçu une thérapie de homme de aplasique très sévère en cyclosporine pendant 6 19 ans 2003 mois, qui s'est terminée anémie • Présentait des en mars 2003, sans aplasique symptômes d'anémie, de effet très sévère faiblesse et de dyspnée pendant l’effort

® Fièvre avec frissons durant 10 à 15 jours du fait d'une neutropénie sévère

• Multiples épisodes d'infections, de vomissements et de points purpuriques

• Abcès fessier

• Deux évanouissements du fait d'une hémorragie du cerveau

• · A reçu respectivement 5 et 2 unités de sang et de plaquettes toutes les deux semaines

28 Patient D homme de 35 ans anémie aplasique très sévère

Anémie, faiblesse, dyspnée

Fièvre avec frissons du fait d'une neutropénie sévère, et multiples épisodes d'infections et de saignement Diagnostic datant de 3 ans auparavant A reçu respectivement 4 et 2 unités de sang et de plaquettes, chaque mois

A reçu des thérapies de cyclosporine et antituberculose. Pas de réponse à 6 mois d'immunosuppression

[0141 ] Toute la surveillance clinique a été effectuée par l’équipe IIH/KEM. L’exigence de transfusion a été déterminée avant et après perfusion à partir des enregistrements de transfusion obtenus à la suite de la réception de toute unité de produit sanguin. Les unités de transfusion ont seulement été utilisées après avoir obtenu le consentement des patients et de leurs proches immédiats en tant que témoins. Avant transfusion au patient, tous les produits sanguins ont été irradiés au Tata Mémorial Hospital. Les patients ont également été questionnés concernant leur bien-être avant et après transfusion des cellules reprogrammées. Tous les patients ont emporté une copie ou les enregistrements originaux de leurs états, et la totalité du suivi laboratoire et clinique. La durée de surveillance de ces patients était établie à l’origine à 2 ans, mais a été étendue. Pour le premier mois suivant la perfusion, les patients ont été gardés à l’hôpital dans des pièces à pression positive stérilisées.

Tableau 5: Patient, date de perfusion, poids et taille, cellules mononucléaires recueillies et cellules CD34<+>perfusées.

[0142]

ID de Poids Taille Cellules CD34<÷>patient et mononucléaires reçues/kg date de recueillies perfusion

Patient A 48 152 1x10<9>1 1 .7x10<e>7/6/2004

Patient B 38 153 3,6X10<9>20x10<e> 7/14/2004

Patient C 52 166 3,9X10<9>25x10<e>7/27/2004

Patient D 52,5 160 4,3x10 23x10<e> 8/17/2004

[0143] Un million de cellules ont été teintées selon les instructions du fabricant avec les éventails suivants d’anticorps monoclonaux (tous de chez DakoCytomation):

[0144] Eventail 1 constitué de conjugués de IgG 1 -FITC, lgG1 -PE-Cy5 et IgGIRPE témoins négatifs en isotypes.

[0145] Eventail 2 constitué de CD45-FITC anti-humain et de CD34-RPE-Cy5 [0146] Eventail 3 constitué de CD38-FITC anti-humain et de CD34-RPE-Cy5 [0147] Eventail 4 constitué de CD61 -FITC et CD34-RPE-Cy5 [0148] Eventail 5 constitué de CD33/13 RPE and CD7-FITC [0149] Eventail 6 constitué de CD45 et Glycophorine-A-RPE [0150] Eventail 7 constitué de CD3-FITC et CD19-RPE

[0151 ] Une analyse de cellules a été réalisée avec le système FACSCalibur System (BD bioscience) en utilisant le logiciel BD cell Quest.

29 [0152] Pour un dosage clonal, des cellules mononucléaires de moelle osseuse (MNC) d’un patient avant et après perfusion des cellules reprogrammées ont été ensemencées avec du méthocult GFH4434 enrichi avec des facteurs de croissance recombinants selon les instructions du fabricant (technologies de cellules souches). Une différenciation en colonies de cellules hématopoïétiques a été évaluée et comptée au cours du temps en utilisant une microscopie inversé à contraste de phase.

[0153] Des CBC de patient, des enzymes du foie et des variants d’hémoglobine ont été surveillés en continu avant et après le processus. Une fois les patients sortis de l’hôpital, les CBC, enzymes du foie, les variants d’hémoglobine, et l’établissement d’un caryotype de sang périphérique et de G cerclage ont été surveillés par un laboratoire indépendant dans des buts de reconfirmation. Ces tests ont été effectués fréquemment à la suite d’une perfusion des cellules reprogrammées autologues.

[0154] Des échantillons de sang périphérique et des cellules de moelle osseuse ont été analysés avant et après perfusion des cellules reprogrammées autologues. Ce test a été répété à des intervalles de six mois la première année, et sur une base annuelle les deux années suivantes après déclenchement de la thérapie par cellules souches reprogrammées autologues. De plus, les cellules reprogrammées ont été analysées avant perfusion pour vérifier la stabilité des cellules, ce qui a également été effectué à la suite de l’étape de conversion de 3 heures, de même qu’après établissement d’une culture à long terme d’un mois au maximum des cellules transformées. L’établissement d’un caryotype et d’un G cerclage ont été surveillés par un troisième laboratoire indépendant.

[0155] Des frottis de moelle osseuse et une section au trépan ont été effectués avant et après perfusion des cellules reprogrammées autologues. Ce test a été effectué 14 à 20 jours après perfusion des cellules reprogrammées autologues, et ensuite sur une base annuelle.

[0156] Toutes les sections de frottis et au trépan ont été balayées en utilisant un microscope accroché à un caméscope avant et après perfusion des cellules souches reprogrammées pour évaluer et enregistrer une prise de greffe.

Résultats

[0157] Tous les patients ont toléré l’aphérèse, et le processus de perfusion de cellules souches reprogrammées uniques, sans effet contraire. Le patient A et le patient D sont devenus indépendants à la transfusion après une seule perfusion de cellules souches hématopoïétiques reprogrammées (RHSC) (voir Tableaux 6 and 7). Une greffe de plaquettes, de neutrophiles et de globules rouges a été délivrée 3 et 6 jours après perfusion chez le patient A et le patient D, respectivement. Une commutation d’hémoglobine foetale a été notée chez le patient A et le patient D (voir tableaux 4 et 5) mais pas chez les patient B et C (données non représentées). Avant perfusion, des enzymes du foie ont été élevées chez les patients A et D en dépit d’être négatifs à HCV (comme mesuré par le test ELISA). Les enzymes du foie ont commencé à se normaliser après perfusion de RHSC, et ont atteint des niveaux normaux 4 ans après perfusion de RHSC. Les patients B et C sont décédés 2 ans et six mois après perfusion, respectivement. Une commutation d’hémoglobine foetale a été notée chez des patients 001 et 004 (voir tableaux 6 et 7). Ces deux patients ont présenté une prise de greffe à long-terme après une seule perfusion de HRSC autologues.

30 Tableau 6: Numération de sang complet de patient A, variant d’hémoglobine et enzymes du foie d’un patient souffrant d’une anémie aplasique sévère avant et après perfusion de HRSC autologues.

[0158]

Tests du Nadir 19/07/2004 26/05/2005 07/03/2006 05/01/2008 sang avant après après après après perfusion perfusion perfusion perfusion perfusion

WBC [10<3>/μ I] 1,3 3,4 3,1 3,7 5,4

HB [g/dL] 2,6 7,1 9 12 14

RBC [10<Β>/μΙ_] 0,9 2 2,3 2,9 3,86

RETIC [%] 1 4 1,7

MCV [fL] 101,5 101,5 121,74 100 101,4

MCH [Pg] 33,6 35,5 39,13 30,8 36,3

MCHC [g/dL] 33,8 35 32,14 30,8 35,8

Plaquettes

18 26 37 58 189

[10<3>/μί]

Neutrophiles

0,32 1,000 1,054 1,184 1,994

[10<3>/pLl

ESO [10 /μ L] 0,62 0,74 0,65

BASO

0 0 0,054

[10<3>/pL]

LYMPH

1,500 1,922 2,220 2,214

[103⁄4JL1

MONO

0,500 0,062 0,222 0324

[10<3>/pL]

HB A [g/dL] 5,1 6,7 9,2 12

HBA2 [g/dL] 0,13 0,14 0,24 0,39

HBF [g/dL] ND 1,2 2,4 2,6 1,82

SGOT [U/L] 150 127 74 32 30

SGPT[U/L] 145 181 49 37 44

[0159] WBC = globules blancs; HB = hemoglobin; RBC = globule rouge; RETIC = réticulocyte; MCV = volume corpusculaire moyen; MCH = hémoglobine corpusculaire moyenne; MCHC = concentration en hémoglobine corpusculaire moyenne; ESO = éosinophiles; BASO = basophiles; LYMPH = lymphocytes; MONO = monocytes; HB A = hemoglobin A; HBA2 = hémoglobine A2; HBF = hemoglobin foetale; SGOT = transaminases SGO; SGPT = transaminases SGP

31 Tableau 7: Numération de sang complet de patient D, de variant d’hémoglobine et d’enzymes du foie d’un patient souffrant d’une anémie aplasique sévère avant et après perfusion de HRSC autologues.

[0160]

Tests du Nadir 28/09/2004 30/05/2005 07/03/2006 05/01/2008 sang avant après après après après perfusion perfusion perfusion perfusion perfusion

WBC

1,7 3 2,2 2,7 4

[10<3>/μΙ_]

HB 3 11,1 7,7 11,5 13

RBC 3,6 2,4 3,2 3,45

RET!C r%] 2,4 3,4 1,7

MCV 90,3 108,33 113 110,3

MCH 30,9 32 35,9 37,8

MCHC 34,2 29,62 31,9 34,2

Plaquettes 5 30 20 25 68

[10<3>/μΙ_]

Neutrophiles 0,1 0,72 0,50 1,0 1,24

Γ10<3>/μί]

ESO Π0<3>/μΙ_] 0,90 0,22 0,54 0,64

BASO 0 0 0 0

Γ10<3>/μΙ_1

LYMPH 2,01 1,67 1,59 1,88

[10<3>/pL]

MONO 0,18 0,44 0,54 0,12 ί10<3>/μί]

HB A 10,6 7,13 10,33 12,1

HBA2 0,33 0,19 0,28 0,36

HBF 0,11 0,2 0,38 0,9 0,42

SGOT 160 46 46 69 34 SCPT 150 57 32 60 46

[0161 ] WBC = globules blancs; HB = hemoglobin; RBC = globule rouge; RETIC = réticulocyte; MCV = volume corpusculaire moyen; MCH = hémoglobine corpusculaire moyenne; MCHC = concentration en hémoglobine corpusculaire moyenne; ESO = éosinophiles; BASO = basophiles; LYMPH = lymphocytes; MONO = monocytes; HB A = hémoglobine A; HBA2 = hémoglobine A2; HBF = hémoglobine foetale; SGOT = transaminases SGO; SGPT = transaminases SGPT.

[0162] La fig. 1 représente une cytométrie en flux de cellules mononucléaires ayant subi une aphérèse avant et 3 heures après induction d’une reprogrammation hématopoïétique. Le nombre de cellules positives CD34 généré après reprogrammation hématopoïétique est indiqué dans le tableau 4. Une cytométrie en flux représentative de cellules mononucléaires ayant subi une aphérèse avant et après reprogrammation hématopoïétique montre une augmentation importante du nombre de cellules positives CD34 avec et sans expression de CD45, CD38 et CD7 (fig. 1 ). Lors de la perfusion, les cellules CD34 sont mises en circulation dans du sang périphérique pendant trois à six jours, et sont ensuite différenciées à un niveau durable en myélocytes, comme indiqué par une augmentation importante de cellules exprimant CD33&13, avec et sans CD7, ayant une dispersion avant et latérale élevée (voir fig. 2). Ce motif de reprogrammation a été observé chez tous les patients.

[0163] Difficilement, des colonies ont été formées après aspiration de moelle osseuse de patients avant perfusion de HRSC autologue, opération suivie par un ensemencement dans une culture cellulaire de méthylcellulose (voir fig. 3). Un dosage clonal uniquement chez le patient B souffrant d’anémie hypoplasique a présenté une hématopoïèse diminuée. Cependant, 14 à 20 jours après perfusion, toutes les aspirations de moelle osseuse obtenues chez les patients ont donné naissance à une plage normale d’une variété de colonies hématopoïétiques avec une élévation moyenne du nombre d’unités de formation de Burst-erythroid (BFU-erythroid). Des frottis de moelle osseuse et des sections de trépan (voir fig. 3) 14 à 20 jours après perfusion de HRSC autologue ont montré une augmentation importante du nombre de myélocytes à différents stades de différenciation, avec des mégacaryocytes matures et immatures chez tous les patients par

32 comparaison à une ligne de base. Une hyperplasie érythroïde à différents stades de différenciation a également été notée dans tous les échantillons.

[0164] Aucun changement dans les motifs d’établissement de karyotype et de G cerclage dans des échantillons de sang périphérique et de moelle osseuse obtenus avant et après perfusion (chez le patient A et le patient D pendant plus de 4 ans) de HRSC autologue chez tous les patients (voir fig. 4).

[0165] Après perfusion de HRSC autologue chez des patients souffrant d’anémie aplasique, des cellules CD34 primitives (CD38-) et déterminées (CD38<+>) ont été mises en circulation dans la circulation périphérique pendant trois jours avant reprogrammation en myélocytes (fig. 2). Une prise de greffe de myéloïdes s’en est suivie trois jours après perfusion de HRSC chez les patients A, B, et D. D’autre part, une prise de greffe de myéloïdes s’en est suivie au 20<e>jour pour le patient 003, lors d’une analyse par cytométrie en flux. La perfusion unique de HRSC, sans l’utilisation d’un quelconque régime de pré-conditionnement, mène à une prise de greffe à long terme pour 2 des 4 patients souffrant d’une anémie aplasique. Les patients A et B ont présenté une prise de greffe à long terme sans une quelconque transfusion après perfusion de HRSC. Une prise de greffe de neutrophiles, de globules rouges et de plaquettes chez un tel patient a été accompagnée par un changement ou une augmentation du niveau d’hémoglobine Hb F (tableaux 6 et 7). Ceci n’a pas été noté chez les deux autres patients qui sont décédés. Un changement de Hb F chez ces deux patients confirme la capacité de HRSC perfusé vers un phénotype Hb juvénile, et ainsi une prise de greffe et une reconstitution, comme observé avec une transplantation de cellules souches de sang de cordon ombilical (Elhasid et al., Leukemia 2000, 14: pages 931 à 934; Locatelli et al., Bone Marrow Transplant 1996, 18: pages 1095 à 1 101).

[0166] La prise de greffe à long terme avec préservation du nombre de chromosomes et cerclage reflète clairement la sécurité de perfusion de HRSC dans un état hématologique où une évolution clonale n’est pas un événement rare avec des thérapies habituelles.

[0167] De manière importante, les HRSC autologues étaient capables d’une prise de greffe à long terme et d’un taux de survie dans un sous-ensemble de patients souffrant d’une anémie aplasique sévère sans l’utilisation d’un quelconque régime d’immunosuppression, comme celles constatées avec des cellules souches syngéniques.

[0168] En résumé, 14 jours après perfusion, l’analyse de la moelle osseuse des personnes perfusées a présenté une augmentation de cellularité de moelle osseuse, et des myéloïdes, des érythroïdes et des lignages mégacaryocytes à différents stades de différenciation, avec une chute de cellules grasses et de cellules stromales, qui sont l’occupant prédominant d’une moelle osseuse atteinte par une anémie aplasique sévère. Il y avait une augmentation importante de la masse de globules rouges dans la moelle osseuse, avec une augmentation correspondante du niveau d’hémoglobine, de même que de la numération de réticulocytes. Il y avait également une augmentation stable d’hémoglobine foetale - un composant important pour améliorer une anémie de cellules falciformes et de béta thalassémie - et de globules rouges exprimant l’hémoglobine foetale après perfusion. De plus, il y avait une amélioration importante des indices de globules rouges, comme déterminé par la taille des globules rouges, la teneur et la concentration en hémoglobine. Les cellules reprogrammées présentaient un caryotype normal et une stabilité génétique après perfusion. Enfin, une prise de greffe et un repeuplement à long terme ont été observés chez plus de trois patients souffrant d’une anémie aplasique.

Exemple 2

Matériaux et procédés

[0169] Des cellules hématopoïétiques reprogrammées autologues (cellules cibles) ont été testées chez 21 patients souffrant d’une bêta-thalassemie. 19 patients avaient une bêta-thalassémie majeure, et 2 avaient une bêta-thalassémie. L’un des patients souffrant d’une bêta-thalassémie intermédiaire avait un variant thalassémie/Hb E (courant chez un patient de l’extrême orient et d’origine indienne), et l’autre avait une thalassémie/anémie de drépanocytes.

[0170] Les patients ont été soumis à une aphérèse en traitant deux ou trois fois leur volume de sang complet. Les cellules reprogrammées autologues ont été générées par reprogrammation de globules blancs jusqu’à ce que les cellules cibles aient été obtenues, comme indiqué par leurs caractéristiques distinctives, comme décrit ci-dessus. Les patients ont reçu les cellules reprogrammées autologues via une perfusion intraveineuse dans la jugulaire ou les veines du bras ou de la cuisse.

Résultats

[0171 ] Aucun effet collatéral toxique ou contraire n’a été observé à la suite d’une perfusion des cellules reprogrammées chez des patients souffrant d’une bêta-thalassémie, comme mesuré par une surveillance des signes vitaux, un échocardiogramme, les densités osseuses, les enzymes du foie et du rein, y compris établissement de caryotype et G cerclage, par comparaison à une ligne de référence. Il y a une réduction moyenne statistiquement importante (50%) d’exigence de transfusion sanguine chez des patients souffrant d’une bêta-thalassémie majeure, maintenant presque 9 mois à la suite de la perfusion des cellules reprogrammées, par comparaison à une ligne de référence. Deux patients souffrant de thalassémie qui sont des bêta-thalassémies intermédiaires (une première était une thalassémie/HB E et l’autre une thalassémie/anémie de drépanocytes) sont devenus indépendants d’une transfusion maintenant presque 9 mois après une perfusion des cellules reprogrammées.

33 [0172] Le poids moyen et la taille à la suite de la perfusion des cellules reprogrammées ont été significativement supérieures par comparaison à une ligne de référence, et la taille d’organes chez des patients souffrant de thalassémie avec une rate et/ou un foie agrandi(e), a été normalisée. La concentration en hémoglobine foetale moyenne absolue a augmenté chez des patients souffrant de thalassémie majeure et d’une thalassémie intermédiaire à la suite d’une perfusion des cellules reprogrammées par comparaison à une ligne de référence (fig. 5). De même, les indices de globules rouges moyens tels que reflétés par une amélioration de la taille des globules rouges, la teneur en hémoglobine (fig. 6) et la concentration (fig. 7) ont également été améliorés significativement par comparaison à une ligne de référence.

[0173] Enfin, la ferritine de sérum moyenne (un biomarqueur pour une surcharge en fer) a diminué significativement chez des patients souffrant d’une thalassémie à la suite d’une perfusion des cellules reprogrammées (fig. 8).

[0174] Une surcharge en fer est la cause majeure de mortalité et de mobilité chez des patients souffrant de thalassémie, d’anémie de drépanocytes, et de tout trouble induit par une surcharge en fer de transfusion.

Exemple 3

Matériaux et procédés

[0175] Deux patients souffrant de diabète ont subi une aphérèse en traitant 2 à 3 fois leur volume de sang complet. Des cellules souches mésenchymateuses reprogrammées autologues, des cellules souches pluripotentes et des îlots de Langerhans (cellules cibles) ont été obtenues par reprogrammation de globules blancs ayant subi une aphérèse jusqu’à ce que les cellules cibles se soient développées, comme indiqué par leurs caractéristiques distinctives telles que décrites ci-dessus. Les cellules reprogrammées autologues ont été administrées aux patients via une perfusion intraveineuse dans la jugulaire ou des veines du bras ou de la cuisse.

Résultats

[0176] A la suite d’une perfusion des cellules reprogrammées autologues, les patients ont synthétisé un niveau normal d’insuline, comme mesuré par diète absolue and peptides c stimulés par ingestion d’aliments après 90 minutes. Ce niveau normal de peptides c a été maintenu jusqu’à trois mois après la perfusion des cellules reprogrammées (fig. 9). De plus, les niveaux de Hb A1 C, indiquant un témoin de glycémie, s’étaient normalisés à la suite de la perfusion des cellules reprogrammées (fig. 10). Par exemple, des patients ayant un niveau de Hb A1 C au-dessus de 10% avant perfusion ont maintenant un niveau de Hb A1 C de 5,8% à la suite de la réception des cellules reprogrammées. De plus, les niveaux de glucose sanguin de ces patients semblent atteindre des niveaux normaux après perfusion, par comparaison à une ligne de référence. De plus, une réduction drastique d’ingestion/injection d’insuline par le patient diabétique a été notée à la suite de la perfusion des cellules reprogrammées.

Exemple 4

Matériaux et procédés

[0177] Quatre patients souffrant d’une sclérose latérale amyotrophique (ALS) ont reçu les cellules reprogrammées autologues. Le diagnostic de cette maladie n’implique pas un biomarqueur spécifique. Cette maladie est diagnostiquée par une exclusion clinique d’autres troubles similaires.

[0178] Les patients ont subi une aphérèse en traitant 2 à 3 fois leur volume de sang complet. Des cellules souches pluripotentes reprogrammées autologues, des cellules d’épithélium alvéolaires, et des neurones (cellules cibles) ont été obtenues par reprogrammation de globules blancs ayant subi une aphérèse jusqu’à ce que les cellules cibles se soient développées, comme indiqué par leurs caractéristiques distinctives telles que décrites ci-dessus. Les cellules reprogrammées autologues ont été administrées au patient via une perfusion intraveineuse dans la jugulaire ou des veines du bras ou de la cuisse.

Résultats

[0179] Chez des patients souffrant d’ALS et traités avec les cellules reprogrammées autologues, il y a eu une amélioration importante du test de fonction pulmonaire (PFT). Une déficience dans ce test de fonction pulmonaire est l’une des causes qui mènent à une mortalité précoce. La plupart des patients ont ressenti une moindre rigidité dans les membres et le cou, et certains ont rapporté une amélioration de leur élocution. D’autres ont présenté une amélioration de l’aptitude à la marche, de même qu’à lever la tête.

Exemple 5

Matériaux et procédés

[0180] Quatre patients souffrant de la maladie de Parkinson ont subi une aphérèse en traitant deux à trois fois leur volume de sang total. Des cellules souches pluripotentes reprogrammées autologues et des neurones (cellules cibles) ont été

34 obtenus par reprogrammation de globules blancs ayant subi une aphérèse jusqu’à ce que les cellules cibles se soient développées, comme indiqué par leurs caractéristiques distinctives telles que décrites ci-dessus. Les cellules reprogrammées autologues ont été administrées aux patients via une perfusion intraveineuse dans la jugulaire ou des veines du bras ou de la cuisse.

Résultats

[0181 ] Des patients chez lesquels l’effet de tressaillement de la maladie est prononcé ont ressenti une réduction importante de l’agitation, et de l’ingestion de médicaments habituels utilisés pour gérer ce trouble. Le premier patient, qui prenait 4 comprimés de Sinemet (régulateur de dopamine) par jour, et quatre mois après transfusion, ne prend plus qu’un comprimé par jour.

Exemple 6

Matériaux et procédés

[0182] Deux patients souffrant d’une blessure de la moelle épinière ont subi une aphérèse en traitant deux à trois fois leur volume de sang complet. Des cellules souches pluripotentes rétro-différenciées autologues et des neurones (cellules cibles) ont été obtenus par reprogrammation de globules blancs ayant subi une aphérèse jusqu’à ce que les cellules cibles se soient développées, comme indiqué par leurs caractéristiques distinctives telles que décrites ci-dessus. Les cellules reprogrammées autologues ont été administrées aux patients via une perfusion intraveineuse dans la jugulaire ou des veines du bras ou de la cuisse.

Résultats

[0183] Un patient a perdu le suivi. L’autre patient était un quadriplégique avec une blessure de la moelle épinière en C5-C6. Ce patient était incapable de s’asseoir ou de tourner son torse dans un lit. A la suite du traitement, il était capable de s’asseoir droit pendant de très longues périodes de temps, et pouvait tourner son corps dans un lit. Il était également capable de tenir debout tout seul après avoir appuyé son corps contre un mur. De plus, il était capable de remuer ses orteils, et a rapporté une sensation dans sa vessie. Une analyse par IRM avant et après perfusion des cellules reprogrammées a montré une légère réduction de la taille de la lésion suite à la perfusion de cellules reprogrammées. Il a commencé à subir activement une physiothérapie, et s’est senti de manière générale beaucoup mieux que précédemment.

Exemple 7

Matériaux et procédés

[0184] Deux patients souffrant d’une dystrophie musculaire (MD) ont été traités avec des cellules souches pluripotentes reprogrammées autologues, des cellules souches mésenchymateuses, et des cellules de muscle squelettique (cellules cibles) ont été obtenues par reprogrammation de globules blancs ayant subi une aphérèse jusqu’à ce que les cellules cibles se soient développées, comme indiqué par leurs caractéristiques distinctives telles que décrites ci-dessus. Le premier patient souffrait d’une MD des membres-de la gaine abdominale, qui fait référence à une classe de MD dans laquelle les muscles qui sont affectés le plus sévèrement sont généralement ceux des hanches et des épaules, et le second patient souffrait d’une MD de type nemelin.

[0185] Les patients ont subi une aphérèse en traitant deux à trois fois leur volume de sang complet. Les cellules reprogrammées autologues ont été générées par reprogrammation selon la présente invention. Les cellules reprogrammées autologues ont été administrées aux patients via une perfusion intraveineuse dans la jugulaire ou des veines du bras ou de la cuisse.

Résultats

[0186] L’atrophie musculaire associée à une MD peut être mesurée en surveillant le niveau de créatine phosphokinase d’enzymes musculaires (CPK). Cette enzyme a diminué en réponse à la perfusion de cellules souches rétro-différenciées (fig. 1 1 ). La lactate déhydrogénase, une enzyme qui est sécrétée pendant une rupture de tissu, a également diminué (fig.1 1 ). Les patients ont également ressenti une diminution d’alanine aminotransférase d’enzymes du foie (ALT) et d’aspartate aminotransférase (AST), les deux étant associées à une inflammation et une blessure de cellules du foie, de même que du muscle squelettique.

[0187] De plus, les patients ont présenté une amélioration de mobilité, comme déterminé par enregistrement vidéo de patients avant et après perfusion des cellules reprogrammées, et de tests de fonction pulmonaire à la suite d’une perfusion des cellules reprogrammées, par comparaison à une ligne de référence.

35 Exemple 8

Matériaux et procédés

[0188] Des patients souffrant d’une maladie rénale ont été traités avec des cellules souches pluripotentes reprogrammées autologues, des cellules souches mésenchymateuses, et des cellules rénales (cellules cibles) ont été obtenues par reprogrammation de globules blancs ayant subi une aphérèse jusqu’à ce que les cellules cibles se soient développées, comme indiqué par leurs caractéristiques distinctives telles que décrites ci-dessus. Les patients ont subi une aphérèse en traitant deux à trois fois leur volume de sang complet. Les cellules reprogrammées autologues ont été générées par reprogrammation selon la présente invention. Les cellules reprogrammées autologues ont été administrées aux patients via une perfusion intraveineuse dans la jugulaire ou des veines du bras ou de la cuisse.

Résultats

[0189] Des patients recevant une perfusion de cellules reprogrammées autologues ont ressenti une amélioration de divers niveaux de marqueur de fluide qui sont indicateurs d’une fonction rénale plus saine, comme le débit d’urine, de créatinine de sérum et de BUN ou UREA. Par exemple, un patient homme diabétique de 75 ans a présenté une fonction rénale améliorée 24 mois après traitement avec les cellules reprogrammées autologues (voir tableau 8). Le patient a montré des niveaux accrus d’hémoglobine, qui est la molécule de protéines dans les globules rouges qui transporte l’oxygène, et un facteur de croissance-1 analogue à de l’insuline (IGF-1 ), un facteur de croissance. Le patient a également présenté des diminutions d’urée, qui est un composé organique, de créatinine, qui est un produit de rupture de phosphate de créatine dans du muscle, d’acid urique, qui est un composé organique excrété dans l’urine, et de phosphore, qui est un minerai que l’on trouve dans les os; des quantités élevées de ces marqueurs indiquent une pauvre fonction rénale. En outre, le patient présentait une diminution d’hémoglobine glycosylée (HbA1 C), qui est une forme d’hémoglobine, et qui est utilisée couramment comme un indicateur de concentration en glucose de plasma de gens souffrant du diabète.

[0190] De manière similaire, un homme diabétique de 51 ans a présenté une amélioration similaire 12 mois après traitement (voir tableau 8). Ce patient présentait des niveaux accrus d’hémoglobine, et des niveaux diminués de créatinine, de HbA1 C, et d’azote dans le sang sous la forme d’urée (BUN), qui est une mesure de la quantité d’azote dans le sang sous forme d’urée.

Tableau 8: niveaux de marqueur de fonction rénale chez deux patients hommes diabétiques.

[0191 ]

Homme diabétique de 75 ans Homme diabétique de 51 ans

Ligne de 24-mois Ligne de 12 mois après référence après référence traitement traitement

Hémoglobine 8 12.9 12 14.5

Ffl/dll

Urée [g/dl] 190 38 n/a n/a

Créatinine 12 1.9 15 4.5

[mg/dll

Acide urique 8.5 4 n/a n/a [mg/dl]

Phosphore 6.1 3.8 n/a. n/a rmg/dll

HbA1 C [%] 14.4 6.1 12 6

IGF-1 [ng/dl] 45 1 12 n/a n/a BUN [mg/dl] n/a n/a 79 19

[0192] HbA1 C = hémoglobine glycosylée; IGF-1 = facteur 1 analogue à de l’insuline; BUN = azote uréique du sang

[0193] Une analyse de 12 patients ayant un diabète de type II, et traités avec des cellules reprogrammées autologues, a révélé des niveaux diminués de microalbumine (fig. 13), qui est associée à une fuite d’albumine dans l’urine, et qui est un indicateur d’une maladie rénale, de même que d’un dysfonctionnement endothélial vasculaire et d’une maladie cardio-vasculaire. Les 12 patients ont également ressenti des niveaux moindres de HbA1 C (fig. 14).

[0194] De plus, une femme de 45 ans souffrant d’une glomérulonéphrite auto-immune a présenté une amélioration de fonction rénale en moins de 18 mois après traitement avec des cellules reprogrammées autologues (voir tableau 9).

36 Tableau 9: Niveaux de marqueurs de fonction rénale chez une femme de 45 ans souffrant de glomérulonéphrite auto-immune.

[0195]

Ligne de référence 18 mois après traitement

Hémoglobine

9 1 1 ,5

[q/dll

Créatinine

9,3 2,1

[mg/dl] BUN [mg/dl] 89 15

BUN = azote uréique du sang

[0196] De plus, une patiente femme de 59 ans souffrant d’une maladie rénale au stade terminal a présenté une amélioration du niveau de créatinine, du niveau d’urée, du niveau d’hémoglobine, et de parathormone (PTH) lors d’un traitement avec des cellules reprogrammées (voir tableau 10). Niveaux de marqueurs de fonction rénale chez une femme de 45 ans souffrant d’une maladie auto-immune. La patiente a également diminué le nombre de sessions d’hémodialyse qu’elle avait prévue par mois, de 12 sessions à environ 8 sessions.

Tableau 10: Niveaux de marqueurs de fonction rénale chez une femme de 59 ans souffrant d’une maladie rénale au stade terminal avant et après thérapie avec des cellules reprogrammées.

[0197]

Marqueur de Pré-thérapie Post-thérapie fonction rénale 02/03/2009 29/04/2009 23/05/2009 05/08/2009 11/08/2009

Hémoglobine [g/dl] 9,8 9,2 11,5

TLC/WBC (par μΙ) 3800 6800 5100

PLT (par pi) 361000 273000 348000

HbA1C [%] 5,6

AST [U/L] 25 16 14

ALT [U/L] 49 11 12

Urée [mg/dl] 90 70 22,13

Créatinine [mg/dl] 14,5 11,2 11,86 8,86 9,58

S. Albumine [g/dl] 3 3,4 3,3 3

PT [seconds] 31,2

INR 2,71

Calcium [mg/dl] 8,4 9,5 9,4 8,7 9,5 Phosphore[mg/dl] 8 9,2 5,9

Potassium [mmol/dl] 5.9 5.2 6.9 4.1

Sodium [mmol/dl] 133 136

Acide urique [mg/dl] 7,9 6,1 7,5 4,8 PTH [pg/ml] 195,6 108,2

[0198] TLC =numération de leukocytes totale; WBC = globules blancs; PLT = plaquettes; HbA1 C = hémoglobine glycosylée; AST = aspartate aminotransférase; ALT = alanine aminotransferase; PT = temps de prothrombine; INR = taux normalisé international (pour une coagulation sanguine); PTH = parathormone

[0199] Un patient de 46 ans souffrant d’une défaillance rénale chronique du fait d’un diabète a également présenté une amélioration du niveau de créatinine, du niveau d’urée et du niveau d’hémoglobine lors d’un traitement avec des cellules reprogrammées (voir tableau 1 1 ). Le patient a diminué le nombre de sessions d’hémodialyse qu’il avait prévu par mois, de 12 sessions à environ 5 sessions, et a diminué le traitement avec de l’époétine alfa (EPREX ) délivrée de manière sous-cutanée, de 4000 unités deux fois par semaine à 4000 unités une fois toutes les deux semaines.

37 Tableau 11 : Niveaux de marqueurs de fonction rénale chez un patient de 46 ans souffrant d’une défaillance rénale chronique avant et après thérapie avec des cellules reprogrammées.

[0200]

Marqueur de Pré-thérapie Post-thérapie fonction 21/09/2008 24/02/2009 20/04/2009 rénale

Hémoglobine

6,5 10,3 9,4 fa/d Π

TLC/WBC

5500 8200 10100 (par μΙ)

PLT (par μΙ) 159000 246000 300000

FBS [mg/dl] 133 120 121

2 hrs PP

170 172 169 img/di]

AST [U/L] 9 34 32

ALT [U/L] 5 22 15

Urée [mg/dl]

109 51 65

Créatinine

7,5 4,9 4

[mg/dll

S. Albumine

3,5 3,7 4 fa/d 11

PT

12,7 12 11

[secondes]

INR 1 1 1

Calcium

10 9,9 1 1

[mg/dl]

Phosphore

6 5,3 5

[mg/dll

Potassium

6,2 5,1 4,7

[mmol/l]

Magnésium

2,3 2,4 2,8 [mg/dl]

[0201 ] TLC =numération de leukocytes totale; WBC = globules blancs; PP = post prandial; PLT = plaquettes; FBS = glycémie à jeun; AST = aspartate aminotransférase; ALT = alanine aminotransferase; PT = temps de prothrombine; INR = taux normalisé international (pour une coagulation sanguine)

Exemple 9

Matériaux et procédés

[0202] Des patients souffrant d’une sclérose en plaques ont été traités avec des cellules souches pluripotentes reprogrammées autologues, des cellules souches mésenchymateuses et des neurones (cellules cibles). Les cellules cibles ont été formées par reprogrammation de globules blancs soumis à une aphérèse jusqu’à ce que les cellules cibles se soient développées, comme indiqué par leurs caractéristiques distinctives telles que décrites ci-dessus. Les patients ont subi une aphérèse en traitant 2 à 3 fois leur volume de sang complet. Les cellules reprogrammées autologues ont été administrées aux patients via une perfusion intraveineuse dans la jugulaire ou des veines du bras ou de la cuisse.

Résultats

[0203] Des patients traités avec des cellules reprogrammées autologues ont présenté une réduction des lésions dans le cerveau et la moelle épinière. Une réduction de lésions peut survenir dans les trois mois suivant la réception du traitement (fig. 15a-b). Une réduction de la détérioration de tissu cervical est survenue dans les six mois (fig. 16a-b).

38 [0204] Des patients traités avec des cellules reprogrammées autologues ont également présenté une suppression de lésions de moelle épinière (fig. 17a-b). En outre, ces patients ont présenté une amélioration du score d’échelle de statut d’impuissance étendue (EDSS), une rémission, et n’ont pas participé à une thérapie habituelle pendant quatre ans après la réception d’une perfusion unique.

Exemple 10

Matériaux et procédés

[0205] Une patiente souffrant du VIH a été traitée avec des cellules souches hématopoïétiques reprogrammées autologues. La patiente a été soumise à une aphérèse en traitant deux à trois fois son volume de sang complet. Les cellules cibles ont été obtenues par reprogrammation de globules blancs soumis à une aphérèse jusqu’à ce que les cellules cibles se soient développées, comme indiqué par leurs caractéristiques distinctives telles que décrites ci-dessus. Les cellules reprogrammées autologues ont été administrées à la patiente via une perfusion intraveineuse dans la jugulaire ou des veines du bras ou de la cuisse.

Résultats

[0206] Avant traitement, le test de criblage pour des anticorps VIH-1 et VIH-2 a présenté une valeur de test de 3,68. Une valeur de 1 ,0 ou supérieure est considérée comme positive.

[0207] Deux mois après traitement avec des cellules reprogrammées autologues, la valeur de test pour le criblage des anticorps VIH-1 et VIH-2 était de 0,46, indiquant que la patiente ne présentait pas un résultat positif pour VIH-1 et VIH-2. Six mois après traitement, la valeur de test pour le criblage des anticorps VIH-1 et VIH-2 était de 0,48, démontrant encore que la patiente ne présentait pas un résultat positif pour le VIH.

Exemple 11

[0208] Les effets d’un traitement avec des cellules reprogrammées autologues ont été démontrés chez des patients souffrant d’autres états et d’autres maladies. Les cellules cibles listées ici ont été obtenues par reprogrammation de globules blancs soumis à une aphérèse jusqu’à ce que les cellules cibles se soient développées, comme indiqué par leurs caractéristiques distinctives telles que décrites ci-dessus.

Défaillance cardiaque congestive

[0209] Un homme de 61 ans souffrant d’une défaillance cardiaque congestive a été perfusé avec des cardiomyocytes reprogrammés autologues, des cellules souches pluripotentes, des cellules souches mésenchymateuses, et des cellules d’endothélium. Le traitement a mené à une amélioration de la fraction d’éjection (EF); des niveaux de précurseur de peptide natriurétique du cerveau (Pro BNP), qui est un indicateur prévisionnel associé à une maladie coronarienne; des niveaux de glycémie à jeun; et des niveaux de HbA1 C (voir tableau 12). De plus, le cœur, qui était précédemment dilaté, est retourné à sa taille normale comme mis en évidence dans le tableau 12 par une diminution de la dimension interne ventriculaire gauche diastolique d’extrémité (LVID/D), la dimension interne ventriculaire gauche diastolique d’extrémité (LVID/S), et de l’épaisseur de septum diastolique d’extrémité (IVSD), comme mesuré par échocardiogramme.

39 Tableau 12. Marqueurs de maladie coronarienne chez un patient de 61 ans souffrant d’une défaillance cardiaque congestive avant et après thérapie avec des cellules reprogrammées.

[0210]

Marqueurs 1-mois 1-mois 2- mois 4- mois 6- mois 10- mois de maladie avant après après après après après coronarienne traitement traitement traitement traitement traitement traitement

LVID/D [cm] 6,5 6,3 5,9 6,9 6,5 5.7

LVID/S [cm] 6,1 5,6 5,4 5,9 5,7 4,9

EF 15 18 22 29 33 45

IVSD [cm] 1,3 1,3 1,2 1,2 0,6 1,0

LVPWD [cm] 0,7 0,6 0,6 0,8 0,6 1,0

LV indice de 283 251 209,5 167 151,5 masse 141,5 133,5 111,4 88,8 81

[gm/m]

Pro BNP 2969 800 600 600 600 497 [pg/ml]

Glycémie à 244 118 145 87 95 80 jeun [mg/dl] HbA1C [%] 9,2 nd nd 7,2 6,5 6

[0211 ] LVID/D = dimension interne ventriculaire gauche diastolique d’extrémité; LVID/S = dimension interne ventriculaire gauche diastolique d’extrémité; EF = fraction d’éjection; IVSD = épaisseur de septum intraventiculaire diastolique d’extrémité; LVPWD = épaisseur de paroi postérieure ventriculaire gauche diastolique d’extrémité; Pro-BNP= précurseur de peptide natriurétique; HbA1 C = hémoglobine glycosylée

Hépatite C

[0212] 13 patients infectés du virus de l’hépatite C (HCV) et ayant une bêta-thalassémie ont reçu la perfusion de cellules hématopoïétiques reprogrammées autologues, de cellules souches pluripotentes, de cellules souches mésenchymateuses, et d’hépatocytes. Les effets du traitement ont révélé une moindre charge ou une absence de celle-ci (voir tableau 13), de même que des marqueurs sanguins améliorés (voir tableau 14) comme des enzymes du foie, de la bilirubine, de l’albumine, le temps de pro-thrombine, et le taux normalisé international (pour une coagulation sanguine). En particulier, les patients ont ressenti une normalisation des enzymes du foie alanine aminotransférase (ALT) et aspartate aminotransférase (AST), qui sont toutes les deux associées à une inflammation et à une blessure des cellules du foie (fig. 18a-b).

40 Tableau 13: Charge virale chez 12 patients infectés du virus de l’hépatite C et traités avec des cellules souches reprogrammées autologues.

[0213]

ID de patient Ligne de référence 3 mois après perfusion Charge virale x 1000 Charge virale x 1000

1 0 0

2 164 82

3 3 0

4 123 16

5 16 0

6 2 0

6 0 0

8 7,7 millions 7,7 millions

9 152 106

10 63 27

1 1 387 97

12 0 0 13 17 0

Tableau 14: Marqueurs sanguins chez des patients infectés par le virus de l’hépatite C, et souffrant d’une cirrhose du foie, au niveau de la ligne de référence, et après thérapie avec des cellules reprogrammées,

[0214]

Marqueurs sanguins Ligne de référence Trois mois après perfusion

Hémoglobine [g/dl] 9,8 12,9

Plaquette (par μΙ) 65000 120000

WBC (par pi) 4300 7200

Glycémie (à jeun) [mg/dl] 210 110

Sang 2 hrs (PP) [mg/dl] 190 134

ALT [U/L] 50 24

AST [U/L] 32 31

Bilirubine (Total) [mg/dl] 6,9 3,2

Bilirubine (Direct) [Mg/dm] 3,1 1 ,8

Albumine de sérum [g/l] 1 ,9 3,1

Urée [mg/dl] 60 36

Créatinine [mg/dl] 1 ,6 1 ,1

INR 1 ,8 1 ,0 PT [seconds] 18 12,8

[0215] WBC = globules blancs; PP = post prandial; ALT = alanine aminotransferase; AST = aspartate aminotransferase; INR = taux normalisé international (pour coagulation sanguine); PT = temps de prothrombine

[0216] Par exemple, un homme de 44 ans souffrant d’une cirrhose du foie du fait d’une infection par le virus de l’hépatite C a également présenté une amélioration des enzymes du foie alanine aminotransferase et aspartate aminotransferase, du taux international normalisé (pour coagulation sanguine), de la bilirubine, et de l’albumine, de même que de la glycémie aléatoire (voir tableau 15). En fait, ce patient était sous traitement d’albumine avant la thérapie avec les cellules reprogrammées, mais n’a pas reçu d’albumine après la thérapie.

41 Tableau 15: marqueurs sanguins chez un homme de 44 ans souffrant d’une cirrhose du foie du fait d’une infection par le virus de l’hépatite C, au niveau de la ligne de référence, et après thérapie avec des cellules reprogrammées.

[0217]

Marqueurs Ligne de Après thérapie sanguins référence

30/03/2009 04/04/2009 23/04/2009 i 06/05/2009 22/06/2009

Hémoglobine

10,9 10,4 1 1 ,6 13,4 10,2 fa/dil

TLC (par pi) 2500 2700 6100 4700 2800

PLT (par pl) 20000 17000 43000 50000 27000

AST [U/L] 212 170 131 141 120

ALT [U/L] 62 59 48 51 53

Alkaline

Phosphatase 196 147 58 ru/Li

GGT [U/L] 49 70 63 35

Bilirubine T [mg/L] 12,7 10,9 1 1 ,2 8,1 8,8

Bilirubine D

6,8 5,4 4,71 4,9 4 [mg/D1]

Urée [mg/dl] 13 18 20 16 25

Créatinine

0,7 0,7 0,8 0,7 0,7

[mg/dl]

S. Albumine

2,8 2,5 2,9 2,4 1 ,9 [0/Ll

RBS [mg/d1 ] 212 154 158 188 174

INR 1 ,9 1 ,8 1 ,72 1 ,69 1 ,72

Potassium

3,2 3,8 4,4

[mmol/L]

Sodium

134 141 137

[mmol/L]

Acide urique

3,5 2,4 3 [Mg/dl]

Alpha protéine

Normal foetale Cryoglobulines Négatives

[0218] TLC = numération de leucocytes totale; PLT = plaquettes; AST = aspartate aminotransférase; ALT = alanine aminotransférase; GGT = gamma-glutamyle transférase; RBS = glycémie aléatoire; INR = taux international normalisé (pour coagulation sanguine)

Traumatisme crânien

[0219] Un patient souffrant d’un traumatisme crânien suite à un accident de véhicule à moteur a été traité avec une perfusion de cellules souches pluripotentes reprogrammées autologues et de neurones. Le traitement a mené à une réparation du tissu du cerveau détérioré (fig. 19a-b), à une amélioration de la fraction d’éjection (EF); des niveaux de précurseur de peptide natriurétique du cerveau (Pro BNP), qui est un indicateur prévisionnel associé à une maladie coronarienne; de niveau de glycémie à jeun; et des niveaux de HbA1 C (voir tableau 10).

42 Maladie pulmonaire

[0220] Un patient souffrant d’une maladie pulmonaire restrictive associée à une maladie de neurones moteurs a été traité par perfusion de cellules souches pluripotentes reprogrammées autologues, de cellules souches mésenchymateuses, de cellules épithéliales alvéolaires, et de cellules d’endothélium. Six mois après le traitement, la capacité vitale forcée (FVC), qui est le volume d’air qui peut être soufflé de manière forcée après inspiration complète, a augmenté de 50% à 71 %, tandis que le volume d’expiration forcé en une seconde (FEV1 ), qui est le volume d’air qui peut être soufflé de manière forcée en une seconde, a augmenté de 64% à 68%. En outre, le rapport FEV1 sur FVC, qui est d’approximativement 75-80% chez des adultes sains, a diminué de 100% à 82%. Un balayage aux rayons X des poumons a présenté une moindre opacité de la cavité pulmonaire après traitement (fig. 20).

Ménopause

[0221 ] Une patiente de 51 ans ayant la ménopause s’est vue administrer une perfusion de cellules souches pluripotentes reprogrammées autologues, de cellules germinales pluripotentes, et d’oocytes. A la suite du traitement, la patiente a ressenti une augmentation de divers niveaux d’hormones et de protéines, y compris le facteur de croissance analogue de l’insuline (IGF-1 ), l’estradiole, et la lipoprotéine basse densité (LDL) (voir tableau 16).

43 Tableau 16: Effet de l’administration de cellules souches reprogrammées autologues à une patiente ayant la ménopause.

[0222]

Marqueurs Avant thérapie Après thérapie sanguins 23/11/2006 09/12/2006 01/01/2007 17/02/2009

IGF-1 [ng/ml] 91 53 100 143

IGF-1-bind

5,3 4 4,5 5,9

[mg/Ll

GH fug/Ll 2,4 3,5 3,5 1 ,5

Progestérone

1 ,2 1 ,5 17,5 2,25

[ng/ml]

Estradiole

26 82 162 168.82

[pg/ml]

Cortisol

17,8 24 4,3 24,5

[ug/di]

DHEA-S

2,2 3,6 0,4 5,3

[Nmo1/1]

Adrenocort

21 ,1 10 10

[pmol/l]

Tyroglobuline

47 18 31 1 .4

[ng/ml]

Calcitonine

28 40 50

[ng/ml]

FSH [IU/1] 41 ,2 5,4 3,88

LH [IU/1] 15,1 1 ,8 6,76

Prolactine

16,2 1 1 ,1 10,5 0,6

[ug/11

Test libre

8 6,4 7,5 [pmo1/1]

Cholest

242 258 280 268

[mg/dl]

HDL [mg/dl] 70 76 83 63,22

LDL [mg/dl] 22 162 173 179,9

Triglycer

1 1 1 102 122 125

[mg/dl]

Hbal c [%l 6,5 5,3 5,5 5,4

Fbs [Mg/dl] 94 90 102 103

Inhibine [U] 40 30

Ostéocalcine

6.9

[ng/mL]

TSH [uU/m1] 0,84 0,7 0,5

FT3 [pg/ml] 3,1 2,7 2,7 1 ,54

Calcitonin

28 40 50

[ng/ll FT4 [pg/ml] 1 ,4 0,94 0,71 0,82

[0223] IGF-1 = facteur de croissance analogue de l’insuline 1 ; IGF-1 -bind = liaison de facteur de croissance analogue de l’insuline; GFI = hormone de croissance; DFIEA-S = déhydroépiandrostérone sulfate ester; adrenocort = hormone adrénocorticale; FSFI = hormone stimulant les follicules; LFI = hormone de lutéinisation; FIDL = lipoprotéine haute densité;

44

Claims

LDL = lipoprotéine basse densité; triglycer = triglycérides; HBA1 C = hémoglobine glycosylée; FBS = échantillon de sang foetal; TSH = hormone stimulant la thyroïde; FT3 = triiodothryronine libre; FT4 = thyroxine libre Dépression [0224] Un patient souffrant de dépression a été traité avec perfusion de cellules souches pluripotentes reprogrammées autologues, et de neurones. À la suite du traitement, le patient a ressenti une augmentation de divers niveaux d’hormones et de protéines, y compris le facteur de croissance analogue de l’insuline -1 (IGF-1 ), le cortisol, et la testostérone (voir tableau 17). Tableau 17: Effets de l’administration à une patiente ayant la ménopause de cellules reprogrammées autologues. [0225] Marqueurs sanguins Avant thérapie Après thérapie 1 1/06/2007 23/07/2007 GH fgga] <0,05 0.06 IGF-1 fng/mll 93,4 140 IGF-bp [mg/l] 4,4 5,6 Cortisol [1 .1 g/d1] 4 20,9 Adrénocort [pg/ml] <10 17,1 Shbg [nmo1/1] 37,9 39,8 FSH riu/Li 4,94 4,98 LH [IU/L] 10,1 3,72 e2 [pg/ml] 29 <28 Testostérone [pmol/l] 28,4 57,8 Prolactine [pg/l] 15,7 1 ,6 DHEA-S [pmol/l] 2,3 2,9 TSH [pll/ml] 1 ,707 3,318 FT3 [pg/ml] 1 ,69 1 ,87 FT4 [ng/d 1 ] 0,81 0,89 [0226] GH = hormone de croissance; IGF-1 = facteur de croissance analogue à de l’insuline 1 ; IGF-bp = protéine de liaison de facteur de croissance analogue à de l’insuline; Adrenocort = hormone adrénocorticale; Sh-bg = globuline de liaison d’hormones sexuelles; FSH = hormone de stimulation de follicules; LH = hormone de lutéinisation; e2 = estradiole; DHEA-S = déhydroépiandrostérone sulfate ester; TSH = hormone stimulant la thyroïde; FT3 = triiodothryronine libre; FT4 = thyroxine libre Azoospermie non-obstructive [0227] Un patient souffrant d’une azoospermie non obstructive été traité avec une perfusion de cellules souches pluripotentes reprogrammées autologues, de cellules germinales pluripotentes, et de spermatozoïdes. A la suite du traitement, le patient a ressenti une augmentation de testostérone sur une période de huit mois (fig. 21 ). Déficience de vision [0228] Un patient souffrant d’une perte de vision du fait d’une tumeur bénigne qui a été enlevée a été traité par perfusion de cellules souches pluripotentes reprogrammées autologues et de neurones. A la suite du traitement, le client a ressenti une sensibilité rétinienne accrue, et une amélioration de la vision (fig. 22). [0229] En ayant ainsi décrit en détail des modes préférés de réalisation de la présente invention, on doit comprendre que la présente invention définie par le paragraphe ci-dessus n’est pas limitée aux détails particuliers établis ci-dessus dans la description qui précède, et que de nombreuses variantes apparentes de ceux-ci sont possibles sans sortir de l’esprit ni de la portée de la présente invention. Revendications 1. Procédé pour obtenir des cellules cibles reprogrammées destinées à être administrées à un patient en ayant besoin, consistant à: partant de cellules déterminées d’un premier lignage cellulaire, reprogrammer les cellules déterminées pour obtenir des cellules reprogrammées, dans lequel la reprogrammation comporte une trans-différenciation des 45 cellules déterminées pour obtenir des cellules trans-différenciées en mettant en culture les cellules déterminées dans un milieu de culture tissulaire comprenant un ou plusieurs agents de rétro-différenciation et un ou plusieurs agents promoteurs de différenciation.
2. Procédé selon la revendication 1 , dans lequel le patient souffre d’une maladie ou d’un trouble comprenant une défaillance de la moelle osseuse, des états hématologiques, une anémie aplasique, une thalassémie (3, le diabète, la sclérose latérale amyotrophique, la maladie de Parkinson, une blessure de la moelle épinière, une dystrophie musculaire, une maladie des reins, la sclérose en plaques, une insuffisance cardiaque congestive, le virus de l’hépatite C, le virus du VIH, un traumatisme crânien, des blessures de la colonne vertébrale, une maladie des poumons, une dépression, une azoospermie non obstructive, l’andropause, la ménopause et la stérilité, la rejuvénilisation, des ulcers de sclérodermie, le psoriasis, les rides, la cirrhose du foie, une maladie auto-immune, l’alopécie, une rétinite pigmentaire, une dystrophie cristalline/cécité, le diabète, et la stérilité.
3. Procédé selon la revendication 1 , dans lequel les cellules reprogrammées sont sélectionnées dans le groupe comprenant des cellules souches pluripotentes, des cellules souches hématopoïétiques, des cellules souches neuronales, des cellules souches épithéliales, des cellules souches mésenchymateuses, des cellules souches endodermiques et neuroectodermiques, des cellules germinales, des cellules souches extraembryonnaires et embryonnaires, des cellules du rein, des cellules épithéliales alvéolaires, des cellules endodermiques alvéolaires, des neurones, des cellules ectodermiques, des îlots de Langerhans, des cellules acineuses, des oocytes, des spermatozoïdes, des kéranocytes, des mélanocytes, des ostéocytes, des cellules de bulbe épineux, des chondrocytes, des adipocytes, des cellules endothéliales, des cardiomyocytes, et des tropoblastes.
4. Procédé selon la revendication 1 , dans lequel les cellules déterminées ont été obtenues à partir de sang complet, de moelle épinière, de tissu neuronal, de tissu musculaire, d’épiderme ou de derme.
5. Procédé selon la revendication 4, dans lequel les cellules déterminées sont obtenues à partir de sang complet.
6. Procédé selon la revendication 5, dans lequel les cellules déterminées sont obtenues à partir de sang mobile ou immobile.
7. Procédé selon la revendication 5, dans lequel les cellules déterminées sont sélectionnées dans le groupe comprenant des cellules T, des cellules B, des éosinophiles, des basophiles, des neutrophiles, des mégacaryocytes, des monocytes, des érythrocytes, des granulocytes, des mastocytes, des lymphocytes, des leucocytes, des plaquettes et des globules rouges.
8. Procédé selon la revendication 1 , dans lequel l’agent de rétro-différentiation vient en contact avec un récepteur qui sert de milieu à une capture, une reconnaissance ou une présentation d’un antigène au niveau de la surface des cellules déterminées.
9. Procédé selon la revendication 8, dans lequel l’agent de rétro-différentiation est un anticorps monoclonal lié au récepteur.
10. Procédé selon la revendication 9, dans lequel l’anticorps est sélectionné dans le groupe comprenant l’anticorps monoclonal CR3/43 et l’anticorps monoclonal TAL 1 B5.
1 1. Procédé selon la revendication 1 , dans lequel le milieu de culture tissulaire est sélectionné dans le groupe comprenant du milieu Dulbecco modifié selon Iscove, du milieu minimum de Eagle modifié selon Dulbecco, du milieu minimum essentiel de Eagle, de Γα-milieu minimum essentiel, du RPMI 1640, du Ham-F-12, milieu E199, MCDB, Leibovitz L-15, et du milieu de Williams E.
12. Procédé selon la revendication 1 , dans lequel l’agent promoteur de différenciation est un anticoagulant, un chélateur ou un antibiotique.
13. Procédé selon la revendication 1 , dans lequel l’agent promoteur de différenciation est une vitamine ou un élément minéral.
14. Procédé selon la revendication 13, dans lequel la vitamine ou l’élément minéral est sélectionné dans le groupe comprenant de la vitamine A, de la vitamine B3, de la vitamine C, de la vitamine D3, de la vitamine K, de l’acide rétinoïque, du nicotinamide, du zinc ou un composé du zinc, et du calcium ou un composé du calcium.
15. Procédé selon la revendication 1 , dans lequel l’agent promoteur de différenciation est une hormone naturelle ou synthétique.
16. Procédé selon la revendication 15, dans lequel l’hormone naturelle ou synthétique est de l’hydrocortisone ou de la déxaméthasone.
17. Procédé selon la revendication 1 , dans lequel l’agent promoteur de différenciation est un acide aminé.
18. Procédé selon la revendication 17, dans lequel l’acide aminé est sélectionné dans le groupe comprenant L-glutamine, ergothionéine, proline, et des acides aminés non essentiels. 46
19. Procédé selon la revendication 1 , dans lequel l’agent promoteur de différenciation est un composé chimique sélectionné dans le groupe comprenant β-mercaptoéthal, monophosphate d’adénosine cyclique de dibutyle, monothioglycérol, putrescine, sulfoxide de diméthyle, hypoxanthine, adénine, forskoline, cilostamide, et 3-isobutyl-1 -méthylxanthine.
20. Procédé selon la revendication 1 , dans lequel l’agent promoteur de différenciation est un nucléoside.
21. Procédé selon la revendication 20, dans lequel le nucléoside est de la 5-azacytidine.
22. Procédé selon la revendication 1 , dans lequel l’agent promoteur de différenciation est un acide ou un sel de celui-ci.
23. Procédé selon la revendication 22, dans lequel l’acide, ou un sel de celui-ci, est sélectionné dans le groupe comprenant de l’acide ascorbique, du pyruvate, de l’acide okadaïque, de l’acide linoléique, de l’acide éthylènediaminetétraacétique, de l’EDTA de disodium, de l’acide tétraacétique d’éthylène glycol, de la dextrose de citrate anticoagulante de formule A, du butyrate du sodium, et du glycérophosphate.
24. Procédé selon la revendication 1 , dans lequel l’agent promoteur de différenciation est un antibiotique.
25. Procédé selon la revendication 24, dans lequel l’antibiotique est sélectionné dans le groupe comprenant G418, gentamycine, Pentoxifylline (1 -(5-oxohéxyle)-3, 7-diméthylxanthine), et indométhacine.
26. Procédé selon la revendication 1 , dans lequel l’agent promoteur de différenciation est une protéine.
27. Procédé selon la revendication 26, dans lequel la protéine est un activateur plasminogène tissulaire.
28. Procédé selon la revendication 1 , dans lequel le milieu de culture tissulaire contient du plasma autologue, des plaquettes, du sérum, ou des sérums provenant de mammifères.
29. Procédé selon la revendication 1 , dans lequel les cellules sont mises en culture dans des poches de sang, des ossatures, des poches de culture tissulaire, ou des récipients de culture tissulaire en matière plastique.
30. Procédé selon la revendication 29, dans lequel les récipients de culture tissulaire sont des récipients de culture tissulaire adhérents ou non adhérents.
31. Procédé selon la revendication 30, dans lequel les récipients de culture tissulaire sont revêtus ou non revêtus.
32. Procédé selon la revendication 31 , dans lequel les récipients de culture tissulaire sont revêtus d’un agent sélectionné dans le groupe comprenant de la gélatine, du collagène, un mélange gélatineux de protéines sécrétées par les cellules d’un sarcome de Engelbreth-Holm-Swarm d’une souris, ou une matrice extracellulaire.
33. Procédé selon la revendication 1 , dans lequel les cellules sont mises en culture à une température entre 18 et 40 °C.
34. Procédé selon la revendication 1 , dans lequel les cellules sont mises en culture à des niveaux de dioxyde de carbone entre 4 et 10%.
35. Procédé selon la revendication 1 , dans lequel les cellules sont mises en culture à un niveau d’oxygène entre 10 et 35%.
36. Composition pharmaceutique comprenant des cellules reprogrammées obtenues par le procédé selon l’une des revendications 1 à 35.
37. Composition pharmaceutique selon la revendication 36 comportant en outre au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable.
38. Utilisation d’une ou de plusieurs cellules cibles reprogrammées obtenues par le procédé selon l’une des revendications 1 à 35 dans une préparation d’un médicament ou d’une composition pharmaceutique pour réparer ou régénérer du tissu ou des cellules d’un lignage cellulaire chez un patient, ou pour traiter une maladie ou une blessure de tissu.
39. Procédé de préparation d’un médicament ou d’une composition pharmaceutique destinée à être administrée à un patient en ayant besoin, le procédé comportant les étapes consistant à: (i) mettre en oeuvre le procédé selon l’une des revendications 1 à 35 pour obtenir des cellules cibles reprogrammées; et, (ii) combiner les cellules cibles reprogrammées avec un ou plusieurs excipients pharmaceutiques.
40. Composition pharmaceutique préparée par l’intermédiaire du procédé selon la revendication 39. 47