CH719425B1 - Zusammensetzung für POC-PCR. - Google Patents

Abstract

Flüssige Zusammensetzung zur Vorbereitung einer biologischen Probe für Verfahren zum Testen der Anwesenheit von SARS-CoV-2 oder von genetischen Variationen (Mutanten) des SARS-CoV-2-Wildtyps in der Probe durch eine POC-PCR, umfassend: a) ein chaotropes Salz, vorzugsweise Guanidiniumthiocyanat, in einer Konzentration im Bereich von 1 bis 960 mM, und b) gegebenenfalls einen oder mehrere RNAse-Inhibitoren.

Description

[0001] Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine flüssige Zusammensetzung zur Vorbereitung einer biologischen Probe für Verfahren zum Testen der Anwesenheit von SARS-CoV-2 oder genetischer Variationen (Mutanten) des SARS-CoV-2-Wildtyps in der Probe durch POC-PCR und auf die Verwendung der Zusammensetzung für die POC-PCR sowie auf ein POC-PCR-Verfahren zum Nachweis von SARS-CoV-2 oder Mutanten davon.

[0002] Das Schweres-Akutes-Atemwegssyndrom-Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) ist ein RNA-Virus, das die Coronavirus-Erkrankung 2019 (COVID-19) verursacht. SARS-CoV-2 mit einem Durchmesser im Bereich von etwa 60 bis 140 nm weist Spike-, Hüll-, Membran- und Nucleocapsid-Proteine auf. Das Spike-Protein ist dasjenige, das es dem Virus erlaubt, an den Rezeptor ACE2 einer Wirtszelle zu binden und in die Wirtszelle einzudringen. Ein mit SARS-CoV-2 infizierter Patient kann an einer schweren Lungenentzündung und akuter Atemnot leiden. Seit über den ersten Infektionsfall mit SARS-CoV-2 im Dezember 2019 beriochtet wurde, hat sich SARS-CoV-2 über die ganze Welt verbreitet, was große Probleme in medizinischen Einrichtungen, der Wirtschaft und andere soziale Probleme verursacht. Bis Anfang Oktober 2020 hat die Weltgesundheitsorganisation (WHO) mehr als 35 Millionen Infektionsfälle und 1 Million Tote weltweit berichtet. Zusätzlich zu anderen Eindämmungsmaßnahmen, zum Beispiel Abstandhalten und Händewaschen, hat die WHO eine große Menge an Tests, nicht nur an symptomatischen Personen und ihren Kontaktpersonen, sondern auch von asymptomatischen Kontaktpersonen dringend empfohlen. Daher gehören große Mengen von Tests zu den wichtigsten Maßnahmen, um den Ausbruch von SARS-CoV-2 einzudämmen. Bisher sind Tests auf der Basis einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) mit hoher Sensitivität und Spezifität der Goldstandard für die Diagnose einer SARS-CoV-2-Infektion. Zu den PCR-Tests gehören mehrere komplexe experimentelle Verfahren, bei denen es wenigstens einige Stunden dauert, bis man die Testergebnisse erhält, Bei einem PCR-Test erfordern die meisten experimentellen Verfahren hochentwickelte und sehr teure Instrumente und sollten von erfahrenen Experten durchgeführt werden. Ansonsten gibt es eine hohe Wahrscheinlichkeit für ein falsch positives/negatives Ergebnis. Dies führt zu gewaltigen Anstrengungen des mdizinischen Personals in den Kliniken, insbesondere während des exponentiellen Anstiegs der Infektionsfälle. In Entwicklungs- und unterentwickelten Ländern ist die Situation für die Diagnostik von SARS-CoV-2 mit PCR aufgrund des Mangels an ausgerüsteten Laboren, Instrumenten und erfahrenen Experten noch schlimmer. Daher ist es von äußerster Wichtigkeit und Dringlichkeit, neue Methoden und/oder Instrumente für die schnelle Diagnostik von SARS-CoV-2 mit vertretbaren Kosten zu entwickeln. Die WHO fördert in hohem Maße Forschungen zur Leistungsfähigkeit von Schnelldiagnoseansätzen und potentiellen diagnostischen Einrichtungen.

[0003] Point-of-Care(POC)-SARS-CoV-2-Tests, die Ergebnisse in wenigen Minuten liefern können, werden vorgeschlagen, um von herkömmlichen klinisch-diagnostischen Labortests, die Tage dauern, weg und zu POC-Tests, die im Feld durchgeführt werden können, zu kommen.

[0004] Diese POC-Tests beruhen auf einer Vielzahl von sowohl alten als auch neuen Methoden und Formaten: herkömmlichen Antigentests zum Nachweis von viralen Proteinen; isotherme Nucleinsäureamplifikation und schleifenvermittelte isotherme Amplifikation (LAMP) zum Nachweis von viralem genetischen Material; und neuere diagnostische Tests auf CRISPR-Basis, die virales genetisches Material nachweisen, aber in weniger Schritten, und ohne PCR-Maschinen auskommen. POC-Tests sind leicht anzuwenden, da sie in Hochrisikoumgebungen, wie Heimen oder Lehreinrichtungen, eingesetzt werden können und nur wenig oder keine spezielle Ausbildung erfordern. Weiterhin sind einige POC-Tests für die Anwendung zu Hause geeignet, sobald die Zulassungsbehörden grünes Licht geben. Auf diese Weise sind POC-Tests allermindestens vielversprechend als nützliche Ergänzung zu diagnostischen PCR-Labortests.

[0005] SARS-CoV-2-Antigentests sind kosteneffektiv, da sie auf demselben Lateral-Flow-Immunassay(LFIA)-Format beruhen, das auch bei Schwangerschaftsselbsttests verwendet wird, und aufgrund der Leicjhten Anwendung in Kliniken und schließlich in Heimen dazu beitragen könnten, die Ausbreitung der Pandemie nachzuverfolgen und einzudämmen. Obwohl die Sensitivität von POC-Antigentests um etwa zwei Größenordnungen geringer ist als die eines PCR-Tests, könnte die wiederholte schnelle Testung der Allgemeinheit, auch als Monitoring bekannt, besser geeignet sein, infektiöse Personen zu identifizieren, als die zuverlässigen, aber aufwändigen PCR-Tests. Die großflächige Einführung von POC-Antigentests muss erst noch eingesetzt werden, aber wenn dies erfolgreich geschieht, wird es ein Präzedenzfall für die schnelle Entwicklung und den schnellen Einatz von Antigentests sein, falls ein weiterer Covid-19-Ausbruch oder eine weitere Pandemie stattfinden sollte. Einkommensschwache Länder können sich Tests der breiten Bevölkerung nicht leisten, sind aber aufgrund von deren Kosteneffizienz an POC-Antigentests als diagnostische Schlüsselstrategie interessiert.

[0006] Covid-19-Antikörpertests dienen als abschreckendes Beispiel, da es zu Beginn der Pandemie im März und April 2020 eine große Euphorie um Covid-19-Antikörpertests gab, um für „Immunitätstests“ für diejenigen zu sorgen, die Covid-19 bereits hatten und jetzt vielleicht immun gegen die Krankheit wären. Im Laufe der Zeit hat sich jedoch gezeigt, dass diese Euphorie fehl am Platz war, da die anfängliche Aufnahme von Covid-19-Antikörpertests immer noch keinen festen Platz und Funktion auf dem Markt der Covid-19-Tests gefunden hat. Entwickler von Covid-19-Antigentests könnten mit einem ähnlichen Dilemma konfrontiert sein. Da Antigentests eine geringere Spezifität haben als PCR-Tests, können Antigentests in Situationen mit niedriger Prävalenz, das heißt, wenn die Wahrscheinlichkeit einer Person, eine Infektion zu haben, und der Anteil von falsch positiven Ergebnissen bei dem Test ähnlich groß sind, zu mehr falsch positiven Ergebnissen führen. Deshalb ist nei einem LFIA-Antigentest immer noch ein PCR-Test zur Bestätigung erforderlich, wenn ein asymptomatischer Patient ein positives Testergebnis hat oder wenn ein symptomatischer Patient ein negatives Testergebnis hat.

[0007] Die Verwendung von PCR-Techniken außerhalb des Labors leidet noch an zeitraubenden Schritten zur Vorbereitung von zu testenden Proben, wie Reinigung der Proben usw. Es besteht also immer noch ein Bedürfnis nach Zusammensetzungen, die die biologischen Proben, wie Speichel oder Nasen-Rachen-Sekrete, so vorbereiten, dass sie direkt in einem anschließenden PCR-Test verwendet werden können, und die für eine POC-Situation geeignet sind.

[0008] Überraschenderweise hat sich gezeigt, dass eine flüssige Zusammensetzung mit einer geringen Konzentration eines chaotropen Salzes die Anforderungen an eine Point-of-Care-PCR-Analyse erfüllen kann.

[0009] Die vorliegende Erfindung betrifft eine flüssige Zusammensetzung zur Vorbereitung einer biologischen Probe für Verfahren, die die Anwesenheit von SARS-CoV-2 oder von genetischen Variationen (Mutanten) des SARS-CoV-2-Wildtyps in der Probe durch POC-PCR testen, umfassend: a) ein chaotropes Salz, vorzugsweise Guanidiniumthiocyanat, in einer Konzentration im Bereich von 1 bis 960 mM, und b) gegebenenfalls einen oder mehrere RNAse-Inhibitoren.

[0010] Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine flüssige Zusammensetzung für Verfahren zum Testen der Anwesenheit von SARS-CoV-2 oder von genetischen Variationen (Mutanten) des SARS-CoV-2-Wildtyps in der Probe durch POC-PCR, umfassend ein chaotropes Salz, vorzugsweise Guanidiniumthiocyanat, in einer Konzentration im Bereich von 1 bis 960 mM.

[0011] Typische Varianten von SARS CoV-2 sind in der folgenden Tabelle 1 aufgeführt.

[0012] Eine wesentliche Komponente der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung ist ein chaotropes Salz. Chaotrope Salze sind Substanzen, die die Struktur von Makromolekülen, wie Proteinen und Nucleinsäuren (z.B. DNA und RNA), zerstören und diese denaturieren. Gelöste chaotrope Substanzen erhöhen die Entropie des Systems, indem sie intermolekulare Wechselwirkungen stören, die durch nichtkovalente Kräfte, wie Wasserstoffbrückenbindungen, van-der-Waals-Kräfte und hydrophobe Wirkungen, vermittelt werden. Die Struktur und Funktion eines Makromoleküls hängt von der Nettowirkung dieser Kräfte ab (siehe Proteinfaltung), und daher folgt, dass eine Erhöhung der Menge an gelösten chaotropen Substanzen in einem biologischen System Makromoleküle denaturiert, die enzymatische Aktivität reduziert und bei einer Zelle Stress induziert (d.h., die Zelle muss Stress-Schutzstoffe synthetisieren). Die Tertiärstruktur oder Faltung eines Proteins hängt von hydrophoben Kräften ab, die auf Aminosäuren aus der gesamten Sequenz des Proteins zurückgehen. Gelöste chaotrope Substanzen senken die hydrophobe Nettowirkung von hydrophoben Bereichen, da sie die Wassermoleküle in der Nähe des Proteins in Unordnung bringen. Dabei wird der hydrophobe Bereich in der Lösung solubilisiert und das Protein dadurch denaturiert. Dies lässt sich auch direkt auf den hydrophoben Bereich in Lipid-Doppelschichten anwenden; wenn eine kritische Konzentration einer gelösten chaotropen Substanz erreicht ist (in dem hydrophoben Bereich der Doppelschicht), wird die Membranintegrität beeinträchtigt, und die Zelle wird lysiert.

[0013] Chaotrope Salze, die in Lösung dissoziieren, üben über verschiedene Mechanismen chaotrope Wirkungen aus. Salze können chaotrope Eigenschaften aufweisen, indem sie Ladungen abschirmen und die Stabilisierung von Salzbrücken verhindern. Wasserstoffbrückenbindungen sind in unpolaren Medien stärker, so dass Salze, die die chemische Polarität des Lösungsmittels erhöhen, auch Wasserstoffbrückenbindungen destabilisieren können. Mechanistisch ist dies der Fall, weil es nicht genügend Wassermoleküle gibt, um die Ionen effektiv zu solvatisieren. Dies kann zu Ion-Dipol-Wechselwirkungen zwischen den Salzen und den Wasserstoffbrücken bildenden Spezies führen, welche günstiger sind als normale Wasserstoffbrückenbindungen.

[0014] Übliche chaotrope Salze werden aus der Gruppe ausgewählt, die aus Guanidiniumchlorid, Lithiumperchlorat, Lithiumacetat, Magnesiumchlorid, Natriumdodecylsulfat und Guanidiniumthiocyanat besteht.

[0015] Die wirkungsvollsten Ergebnisse konnten mit Guanidiniumsalzen, wie Guanidiniumthiocyanat, als chaotropes Salz erreicht werden.

[0016] Für den Zweck der vorliegenden Erfindung und deren Verwendung bei der POC-PCR-Analyse sollte die Konzentration des chaotropen Salzes auf einen Bereich von unter 1 M eingestellt sein. Hohe Konzentrationen von chaotropen Salzen führen zur Lyse von SARS-CoV-2 und zur Freisetzung der viralen RNA. Eine zu geringe Konzentration führt jedoch zu einer Inaktivierung des Virus ohne Lyse. Somit muss die Konzentration des chaotropen Salzes ausreichend sein, um eine Lyse des Virus durchzuführen. Andererseits inaktivieren hohe Konzentrationen von chaotropen Salzen Nucleasen, am wichtigsten das RNA-abbauende Enzym RNase von Wirt und Pathogen. Es hat sich gezeigt, dass niedrige Konzentrationen von chaotropen Salzen ausreichend sind, um virale RNA zu stabilisieren und RNasen zu inaktivieren.

[0017] Konzentrationen von 1 M oder mehr eines chaotropen Salzes, insbesondere Guanidiniumthiocyanat, sind problematisch, da diese Konzentrationen Polymerasen, wie Reverse Transcriptase und Taq-Polymerase, hemmen. Daher sind hohe Konzentrationen für direkte PCR ohne Beseitigung des chaotropen Salzes nutzlos. Eine Verdünnung mit Flüssigkeit würde auch helfen, reduziert aber die virale Konzentration (Verlust der Sensitivität). Überraschend ist, dass submolare Konzentrationen (mM) PCR-Enzyme nicht hemmen, aber ausreichend sind, um SARS-CoV-2 zu inaktivieren und RNasen zu inaktivieren.

[0018] Die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung umfasst vorzugsweise das chaotrope Salz, am meisten bevorzugt ein Guanidiniumsalz, insbesondere Guanidiniumthiocyanat, in einer Konzentration von 1 bis 500 mM, vorzugsweise 2 bis 250 mM, insbesondere 5 bis 100 mM oder 10 bis 90 mM, insbesondere 40 bis 60 mM.

[0019] In einem bevorzugten Aspekt der Erfindung ist die Zusammensetzung der Erfindung eine wässrige Zusammensetzung.

[0020] Für eine POC-Diagnose sind die biologischen Proben von den Patienten vorzugsweise leicht zugänglich und können auch von medizinisch nicht ausgebildeten Leuten erhalten werden. Insbesondere für die Diagnose von Infektionen mit SARS-CoV-2-Virus oder Mutanten davon werden biologische Proben vorzugsweise aus Speichel und/oder Nasen-Rachen-Sekret ausgewählt.

[0021] Die biologischen Proben können mit einem Wattestäbchen oder anderen Entnahmevorrichtungen, die dem Fachmann bekannt sind, von Patienten entnommen werden.

[0022] In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung umfasst die Zusammensetzung vorzugsweise zwei oder mehr RNase-Inhibitoren, die voneinander verschieden sind. Vorzugsweise sind die RNase-Inhibitoren auf Protein basierende RNase-Inhibitoren.

[0023] In einem weiteren Aspekt der Erfindung umfasst die Zusammensetzung einen rekombinanten RNase-Inhibitor, vorzugsweise zwei oder mehr rekombinante RNase-Inhibitoren.

[0024] Der rekombinante RNase-Inhibitor ist ein muriner RNase-Inhibitor, der RNase A hemmt, vorzugsweise RNase A, B und C hemmt.

[0025] Vorzugsweise ist der murine RNAse-Inhibitor ein rekombinantes 50-kDa-Protein muriner Herkunft. Der Inhibitor hemmt spezifisch RNase A, B und C. Er hemmt RNasen, indem er in einem 1:1-Verhältnis mit hoher Affinität nichtkovalent daran bindet. In einem Aspekt ist er gegen RNase 1, RNase T1, S1 Nuclease, RNase H oder RNase aus Aspergillus nicht wirksam. Außerdem wird keine Hemmung der Polymerase-Aktivität beobachtet, wenn RNase-Inhibitor mit Taq-DNA-Polymerase, AMV- oder M-MuLV-Reversen Transcriptasen oder Phagen-RNA-Polymerasen (SP6, T7 oder T3) verwendet wird.

[0026] Überraschend hat sich gezeigt, dass eine Zusammensetzung, die vorzugsweise einen murinen RNase-Inhibitor umfasst, der vorzugsweise RNase A, B und C hemmt, eine vorteilhafte Effektivität zeigt.

[0027] In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Zusammensetzung einen monoklonalen Antikörper für die Ribonuclease A.

[0028] Besonders bevorzugt sind Zusammensetzungen, die murinen RNase-Inhibitor und einen monoklonalen Antikörper gegen Ribonuclease A umfassen.

[0029] Proteinbasierte RNase-Inhibitoren, wie natürlicher muriner RNase-Inhibitor, sowie antikörperbasierte Hemmung sind bekannt dafür, RNasen zu hemmen, aber die verstärkte Wirkung der kombinierten Inaktivierung durch Antikörper und murinen RNase-Inhibitor ist überraschend - und deutet auf eine Synergie und größere Wirksamkeit in der RNA-Stabilität hin. Eine Synergie weist auf unterschiedliche Wirkungsweisen hin, was überraschend ist, da der Fachmann eine Hemmung des aktiven Zentrums erwarten würde.

[0030] In einem weiteren bevorzugten Aspekt umfasst die Zusammensetzung der Erfindung einen monoklonalen, Spike-Protein-bindenden und SARS-Cov-2-neutralisierenden Antikörper, der vorzugsweise auf einen Nanopartikel aufgetragen ist.

[0031] In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Nanopartikel ein Eisenpartikel, der vorzugsweise mit Siliciumoxid beschichtet ist. Es hat sich überraschend gezeigt, dass die Partikel eine Affinität zu Nucleinsäurematerial aufweisen und somit das SARS-CoV-2-Virusmaterial auf den Partikeln anreichern können.

[0032] Ohne uns auf eine bestimmte Theorie festlegen zu wollen, nehmen wir an, dass die Nanopartikel sich nicht absetzen, sondern in der Zusammensetzung schweben. Somit können die Nanopartikel verwendet werden, um das Virusnucleinsäurematerial selektiv zu reinigen.

[0033] Die Partikel haben vorzugsweise ein Volumenmittel des Teilchendurchmessers von 1 bis 150 nm, vorzugsweise 1 bis 100 nm, insbesondere 2 bis 50 oder 3 bis 20 nm, bestimmt nach dem Lichtstreuungsverfahren.

[0034] Die Verwendung von virusneutralisierenden Antikörpern, z.B. Inhibitoren der Bindung zwischen Covid-19 und dem humanen Rezeptor, in der Therapie ist bekannt, doch die Verwendung eines therapeutischen Antikörpers in biotechnologischen Diagnoseanwendungen zeigt überraschende Vorteile. Er führt nicht nur zu einer Inaktivierung und Reduktion des Infektionsrisikos, sondern führt auch zu einer Immobilisierung von Covid-19-Antikörper auf schwebenden Nanopartikeln, die die Virus-RNA binden und anreichern bzw. deren lokale Konzentration erhöhen.

[0035] In einem weiteren Aspekt der Erfindung umfasst die Zusammensetzung weiterhin vorzugsweise Nanopartikel die mit Anti-Spike-SARS-Cov-2-Antikörpern und/oder Biotin und/oder Protein A beschichtet sind.

[0036] Die vorliegende Erfindung betrifft zudem ein POC-PCR-Verfahren zum Nachweis von SARS-Cov-2 oder Mutanten davon, umfassend die Schritte: a) Mischen einer biologischen Probe mit einer Zusammensetzung der Erfindung, wobei man ein Gemisch A erhält, b) gegebenenfalls Inkubieren des Gemischs A, c) Mischen des Gemischs A mit einem PCR-Reaktionsgemisch, das vorzugsweise eines oder mehrere aus Reverser Transcriptase, Polymerase, PCR-Puffer, Primer und Sonden für einen PCR-Assay umfasst.

[0037] In einem bevorzugten Aspekt des vorliegenden Verfahrens wird Schritt a) in einem Behälter durchgeführt, der mit einem Verschluss abgedichtet werden kann, wobei der Verschluss vorzugsweise ein durchgehendes Loch mit einem Verschlusselement, das separat befestigt ist, aufweist.

[0038] Vorzugsweise wird Schritt b) in einem Behälter, vorzugsweise einem Probenröhrchen, durchgeführt, der Gemisch A umfasst und mit einem Verschluss abgedichtet ist, wobei der Verschluss vorzugsweise ein durchgehendes Loch mit einem Verschlusselement, das separat befestigt ist, aufweist.

[0039] Dies hat den Vorteil, dass Gemisch A durch das durchgehende Loch hindurch tropfenweise aus dem Behälter freigesetzt werden kann. Weiterhin wird die Gefahr einer Kontamination des Bedienpersonals minimiert.

[0040] Schritt c) wird vorzugsweise durchgeführt, indem man das Gemisch A durch das durchgehende Loch hindurch aus dem Behälter in das PCR-Reaktionsgemisch freisetzt.

[0041] Das PCR-Reaktionsgemisch umfasst Primer und Sonden, die für den Nachweis von SARS-Cov-2 oder Mutanten davon geeignet sind. Geeignete PCR-Reaktionsgemische und insbesondere Primer und Sonden sind dem Fachmann bekannt.

[0042] Die vorliegende Erfindung betrifft zudem die Verwendung der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung für einen POC-PCR-Assay.

[0043] Eine weitere Ausfuhrungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Kit, der einen Behälter, welcher die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung enthält, und einen separaten Behälter, der ein PCR-Reaktionsgemisch umfasst, umfasst, der vorzugsweise eines oder mehrere aus Reverser Transcriptase, Polymerase, PCR-Puffer, Primer und Sonden für einen PCR-Assay umfasst.

[0044] In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Behälter, der die Zusammensetzung gemäß der Erfindung umfasst, ein Behälter, der mit einem Verschluss abgedichtet ist, wobei der Verschluss ein durchgehendes Loch mit einem Verschlusselement, das separat befestigt ist, aufweist.

[0045] Die vorliegende Erfindung gibt ein schnelles und wirksames Diagnoseverfahren für den Nachweis von SARS-Cov-2-Virus oder Mutanten davon vor Ort (point of care; POC) an.

[0046] Standard-RNA-Extraktionsverfahren und RT-qPCR-Reaktionen benötigen selbst mit Automation 60-90 Minuten. Die vorliegende Erfindung reduziert die RNA-Isolierung auf einen einzigen Schritt, der 5 Minuten Inkubation benötigen kann. Die Proben können direkt für die PCR-Analyse verwendet werden, bei der es sich vorzugsweise um eine RT-qPCR handelt. Die Zeit von der Probeentnahme bei dem Patienten bis zum Ergebnis kann innerhalb von 35 Minuten liegen.

Beispiel:

Zusammensetzung 1:

[0047] Eine exemplarische Zusammensetzung der Erfindung enthält eine wässrige Zubereitung, umfassend: 50 mM Guanidiniumthiocyanat Tensid Covid-19-neutralisierender Antikörper RNase-Inhibitor 1: muriner RNase-A-Inhibitor RNase-Inhibitor 2: Anti-RNase-A-Antikörper Eisen-Nanopartikel, die mit Siliciumoxid beschichtet sind, wobei die beschichteten Nanopartikel mit Protein A und Biotin und dem Covid-19-neutralisierenden Antikörper beschichtet sind.

Zusammensetzung 2:

[0048] Ein exemplarisches PCR-Reaktionsgemisch für eine einstufige RT-qPCR, enthaltend: MluV-Reverse-Transcriptase Taq-Polymerase PCR-Puffer Primer und Sonden, die für den Nachweis von SARS-Cov-2 oder Mutanten davon und für einen Taqman-Assay geeignet sind.

Exemplarische Vorgehensweise

[0049] Ein Nasen-Rachen-Probenmaterial wird mit einem Wattestäbchen entnommen, und die Spitze des Stäbchens wird vier- bis fünfmal in dem bereitgestellten Röhrchen mit Zusammensetzung 1 herumgewirbelt. Das Röhrchen ist mit einem Verschluss abgedichtet, wobei der Verschluss ein durchgehendes Loch mit einem Verschlusselement, das separat befestigt ist, aufweist.

[0050] Das erhaltene Gemisch wird 5 Minuten lang bei 25°C inkubiert.

[0051] Anschließend wird das Verschlusselement abgetrennt, um das durchgehende Loch im Verschluss zu öffnen.

[0052] Das inkubierte Gemisch wird direkt für die einstufige RT-qPCR-Reaktion verwendet - 1 Tropfen, der 25-30 µl Volumen entspricht, wird durch das durchgehende Loch hindurch in ein PCR-Röhrchen, das das RT-qPCR-Reaktionsgemisch (Zusammensetzung 2) enthält, übergeführt.

Ringversuchsproben

Ergebnisse des erfindungsgemäßen Verfahrens mit Zusammensetzung 1und 2

[0053] 1 32,38 negativ 2 32,98 positiv 3 40,43 positiv 4 39,30 37,27 positiv 5 negativ oder ungültig 6 34,80 positiv 7 negativ

Ergebnisse

[0054] Erfindungsgemäßes Verfahren vs. normale PCR vs. Abbot-POC getestet am DiagnosticLab Tauernklinikum Zell am See 1 negativ negativ negativ negativ 2 positiv positiv positiv negativ 3 positiv positiv negativ negativ 4 positiv positiv negativ negativ 5 negativ negativ negativ negativ 6 positiv positiv negativ negativ 7 positiv negativ negativ negativ Sensitivität 100% 80% 20% 0% Sensitivität 100% 100% 100% 100%

Fazit

[0055] Das Verfahren der Erfindung mit Zusammensetzung 1 und 2 in einer POC-PCR zeigt eine klinische Sensitivität von >90% und eine Spezifität von 100%. Ein kommerziell erhältliches POC-PCR-System von Abbott zeigt eine Sensitivität von ca. 20% und eine Spezifität von 100%. Antigenetische Tests konnten keine einzige positive Probe nachweisen.

Claims (14)

1. Flüssige Zusammensetzung zur Vorbereitung einer biologischen Probe für Verfahren zum Testen der Anwesenheit von SARS-CoV-2 oder von genetischen Variationen „Mutanten“ des SARS-CoV-2-Wildtyps in der Probe durch eine POC-PCR, umfassend: a) ein chaotropes Salz, vorzugsweise Guanidiniumthiocyanat, in einer Konzentration im Bereich von 1 bis 960 mM, und b) gegebenenfalls einen oder mehrere RNAse-Inhibitoren.

2. Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei Guanidiniumthiocyanat in einer Konzentration von 1 bis 500 mM, vorzugsweise 2 bis 250 mM, besonders bevorzugt 5 bis 100 mM oder 10 bis 90 mM, insbesondere 40 bis 60 mM, vorhanden ist.

3. Zusammensetzung gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, umfassend zwei oder mehr RNase-Inhibitoren.

4. Zusammensetzung gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, umfassend zwei oder mehr rekombinante RNase-Inhibitoren.

5. Zusammensetzung gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, umfassend einen murinen RNase-Inhibitor, der vorzugsweise RNase A, B und C hemmt.

6. Zusammensetzung gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, umfassend einen monoklonalen Antikörper gegen Ribonuclease A.

7. Zusammensetzung gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, umfassend einen monoklonalen, Spike-Protein-bindenden und SARS-Cov-2-neutralisierenden Antikörper.

8. Zusammensetzung gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, umfassend Nanopartikel, die mit Anti-Spike-SARS-Cov-2-Antikörpern und/oder Biotin und/oder Protein A beschichtet sind.

9. POC-PCR-Verfahren zum Nachweis von SARS-Cov-2 oder Mutanten davon, umfassend die Schritte: a)Mischen einer biologischen Probe mit einer Zusammensetzung gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 8, wobei man ein Gemisch A erhält, b) gegebenenfalls Inkubieren des Gemischs A, c) Mischen des Gemischs A mit einem PCR-Reaktionsgemisch, das eines oder mehrere aus Reverser Transcriptase, Polymerase, PCR-Puffer, Primer und Sonden für einen PCR-Assay umfasst.

10. Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei Schritt a) in einem Behälter durchgeführt wird, der mit einem Verschluss abgedichtet werden kann, wobei der Verschluss vorzugsweise ein durchgehendes Loch mit einem Verschlusselement, das separat befestigt ist, aufweist.

11. Verfahren gemäß Anspruch 9 oder 10, wobei es sich bei der biologischen Probe um Nasen-Rachen-Sekret handelt.

12. Verwendung einer Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 für einen POC-PCR-Assay.

13. Kit, umfassend einen Behälter, der die Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 enthält, und einen separaten Behälter, der ein PCR-Reaktionsgemisch umfasst, der eines oder mehrere aus Reverser Transcriptase, Polymerase, PCR-Puffer, Primer und Sonden für einen PCR-Assay umfasst.

14. Kit gemäß Anspruch 13, wobei der Behälter, der die Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 umfasst, ein Behälter ist, der mit einem Verschluss abgedichtet ist, wobei der Verschluss ein durchgehendes Loch mit einem Verschlusselement, das separat befestigt ist, aufweist.