CH721976A1 - Verfahren zur Gewinnung von Biopräparaten - Google Patents

Abstract

Bei dem Verfahren zur Gewinnung des biologischen Präparats, das ein künstliches materielles Objekt - eine Iteration - darstellt und eine biologische Aktivität besitzt, die der biologischen Aktivität eines biologischen Objekts ähnlich ist, wird eine sukzessive Vibrationsbehandlung eines neutralen Trägermittels im Beisein des biologischen Objekts, das die Rolle einer biologischen Substanz wahrnimmt, vorgenommen.

Description

[0001] Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der Pharmazeutik, und zwar zu einem Verfahren für die Gewinnung von biologischen Präparaten durch eine sukzessive, sich wiederholende Vibrationsbearbeitung eines neutralen Trägermittels im Beisein von biologischen Objekten, die die Rolle einer biologischen Ausgangssubstanz spielen, sowie auf die biologischen Präparaten selbst, die im Verlauf der Zubereitung biologische Eigenschaften erlangen, die den Eigenschaften der biologischen Ausgangssubstanz ähnlich sind und als Folge dessen als biologische (pharmazeutische) Präparate verwendet werden können, deren Wirkung im Organismus auf die gleichen Ziel-Moleküle, physiologischen oder biologischen Ziele ausgerichtet ist, auf welche die Wirkung des biologischen Objekts ausgerichtet ist.

[0002] Aus dem Bereich der Technik ist bekannt, dass nach jeglicher vibrationsartigen Einwirkung - sowohl einer mechanischen [Gudkov S.V. et al., 2019; Astashev M.E. et al., 2023; Demangeat JL., 2022; Duval E. et al., 2012] als auch einer elektromagnetischen - im Wasser bestimmte lange bestehende strukturelle Veränderungen auftreten können [D'Emilia E. et al., 2017; Sronsri C. et al., 2021; Wu T. et al., 2020].

[0003] Gleichfalls ist aus dem Bereich der Technik bekannt, dass bei der Zubereitung von Lösungen eines Ausgangsstoffes durch ein mehrfaches Verdünnen unter Nutzung einer äußeren mechanischen Einwirkung in Form eines vertikalen Schüttelns (einer Vibration) bei jedem Verdünnungszyklus - bis zu extrem starken Auflösungen, letztere eine Reihe neuer physikalischer Eigenschaften erlangen, die deren Aktivität selbst bei einer spekulativ geringen Menge in den Lösungen des Ausgangsstoffes bestimmen.

[0004] Zu solchen Eigenschaften gehört die Fähigkeit der Lösungen mit einem hohen Auflösungsgrad, die unter Vornahme einer sich mehrfach wiederholenden Vibrationseinwirkung gewonnen wurden, zu einer kontaktfreien (über eine gewisse Entfernung hinweg) Einwirkung auf andere Stoffe oder Lösungsmittel [Jerman, I.; Ružič, R.; Krašovec, R.; Skarja, M.; Mogilnicki, L. „Electrical Transfer of Molecule Information into Water, Its Storage, and Bioeffects on Plants and Bacteria“, Electromagnetic Biology and Medicine 2005, 24 (3), 341-353. https://doi.org/10.1080/15368370500381620; Ruzic, R., Jerman, I., Skarja, M., Leskovar, R., Mogilnicki, L. „Electromagnetic Transference of Molecular Information in Garden Cress Germination“, Int J High Dilution Res 2008; 7(24): 122-131 2008, 7, 122-131; Igor Jerman, Linda Ogrizek, Vesna Periček Krapež and Luka Jan, Physicochemical study of the molecular signal transfer of ultra-high diluted antibodies to interferon gamma. Int. J. Mol. Sci. 2023, 24; N.Penkov, N.Penkova. Analysis of Emission Infrared Spectra of Protein Solutions in Low Concentrations. Front. Phys., 18 December 2020 Sec. Interdisciplinary Physics, Volume 8 - 2020 | https://doi.org/10.3389/fphy.2020.624779; Penkov N., 2021; Novikov V.V. and Yablokova E.V., 2022)], aber auch die Fähigkeit der Verdünnungen einen modifizierenden Einfluss auf den Ausgangsstoff auszuüben [WO2012017324, US7,229,648, US4,311,897, RU2192888, 2577137, 2577136, 2536230, 2519695, 2778521, 2509572, 2531048, 2517085, 2505312, 2577299]. Modifizierende Effekte treten bei einer Strukturveränderung der Moleküle des Ausgangsstoffes, ihrer Hydrathülle auf, was zu einer Modulierung der biologischen Aktivität des Ausgangsstoffes führt [Tarasov SA, Gorbunov EA, Don ES, Emelyanova AG, Kovalchuk AL, Yanamala N, Schleker ASS, Klein-Seetharaman J, Groenestein R, Tafani JP, van der Meide P, Epstein OI. Insights into the Mechanism ofAction of Highly Diluted Biologics. J Immunol. 2020;205(5):1345-1354. doi: 10.4049/jimmunol.2000098; Woods KN. Modeling of protein hydration dynamics is supported by THz spectroscopy of highly diluted solutions. Front Chem. 2023;11:1131935. doi: 10.3389/fchem.2023.1131935] und das Bestehen einer biologischen (pharmakologischen) Aktivität der Lösungen mit einem hohen Auflösungsgrad bedingt.

[0005] Die modifizierende Wirkung, die der spezifischen pharmakologischen Aktivität der hoch aufgelösten Heilpräparate zugrunde liegt, ist recht ausgeprägt, was erlaubte, sie unter Verwendung der allgemein üblichen Analyseverfahren zu bewerten und zu standardisieren (siehe Staatliche Pharmakopöe der Russischen Föderation XV, allgemeiner Pharmakopöe-Artikel (APA) 1.7.0001).

[0006] Die Technologie für die Gewinnung von Lösungen mit einem hohen Auflösungsgrad in Form einer sukzessiven Verdünnung einer biologischen Substanz und Vibrationsbehandlung der Lösungen erhielt nach Erscheinen des APA erstmals die offizielle Bezeichnung „graduale Technologie“. Gegenwärtig werden Präparate auf der Grundlage der gradualen Technologie - graduierte Präparate - vorrangig aus Antikörpern hergestellt und gehören infolgedessen zu den biologischen Präparaten [Mkrtumyan A, Ametov A, Demidova T, Volkova A, Dudinskaya E, Vertkin A, Vorobiev S. A New Approach to Overcome Insulin Resistance in Patients with Impaired Glucose Tolerance: The Results of a Multicenter, Double-Blind, Placebo-Controlled, Randomized Clinical Trial of Efficacy and Safety of Subetta. J Clin Med. 2022; 11(5):1390. doi: 10.3390/jcm11051390; Geppe NA, Blokhin BM, Shamsheva OV, Abdrakhmanova ST, Alikhanova KA, Myrzabekova GT. Efficacy and Safety of Ergoferon in Children from 6 Months to 6 Years Old with Acute Respiratory Viral Infections in Contemporary Outpatient Practice: A Multicenter, Double-Blind, Placebo-Controlled Randomized Trial. Can Respir J. 2021; 2021:5570178. doi: 10.1155/2021/5570178; Lashch NU, Kamchatnov PR, Fedorova TN, Muzychuk OA, Khacheva KK, Pizova NV, Malygin AU, Shavlovskaya OA, Fateeva VV, Nikulina KV, Abrosimov AV, Gerasimova YA, Glushkov KS, Lebedeva AV. Efficacy and Safety of Divaza for the Correction of Oxidative Disturbances in Patients with Cerebral Atherosclerosis: A Randomized Controlled Trial. Cerebrovasc Dis. 2021; 50(4):472-482. doi: 10.1159/000515233; Avdeev SN, Vizel AA, Abrosimov VN, Zaicev AA, Ignatova GL, Khamitov RF, Mikhaylusova MP, Shapovalova JS, Pavlysh EF, Trofimov BI, Emelyanov AV, Martynenko TI, Martynenko VA, Kostina NE, Chizhov DA, Chizhova OY, Kuzubova NA, Makova EV, Makarova EV. 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[0007] Biologische Substanzen besitzen ein großes Potenzial für eine Implementierung, da sie im Unterschied zu synthetischen Präparaten über ein breites Aktivitätsspektrum und einen schonenden, maximal physiologischen Wirkungscharakter verfügen. Die Anwendung von Molekülen, die keiner gradualen Bearbeitung der biologischen Moleküle ausgesetzt wurden, hat jedoch eine Reihe von Einschränkungen in Form von unerwünschten Erscheinungen, solchen wie einen toxischen Charakter für monoklonale Antikörper.

[0008] Heutzutage haben individuelle Therapien für unterschiedliche Erkrankungen unter Verwendung verschiedener biologischer Objekte, vor allem von fetalen Geweben, die Stammzellen enthalten, in Form von Zelltransplantaten eine große Entwicklung erlebt. Diese Therapien besitzen sowohl Vorzüge, vor allem in Gestalt der Fähigkeit, eine regenerative Wirkung auszuüben, als auch Mängel. So ist es schwierig, Zell-Transplantate zu standardisieren und lange aufzubewahren, was ihren umfangreichen Einsatz in Form von Arzneimitteln erschwert. Der Einsatz von Zell-Transplantaten kann von immunologischen Abstoßungsreaktionen, einer virusbedingten oder Prionen-Dissemination begleitet werden. Im Zusammenhang damit ist der Einsatz graduierter biologischer Substanzen, die einer mehrfachen Verdünnung in Begleitung einer Vibrationsbehandlung ausgesetzt wurden, a priori eine perspektivreiche Richtung. Jedoch ist die Gewinnung hochgradiger Verdünnungen einer biologischen Substanz eine schwer zu realisierende Aufgabe, da im Verlauf der Verdünnung - mit einer vorherigen Homogenisierung - die biologische Substanz einen Teil der Ausgangsaktivität verliert.

[0009] Durch den Antragsteller wurde ermittelt, dass selbst ohne ein Auflösen der Ausgangssubstanz die sukzessive Vibrationsbehandlung des Reagenzglases mit einem Lösungsmittel in Anwesenheit eines nebenan angeordneten Reagenzglases, das unterschiedliche Moleküle, darunter biologische - Antikörper - enthält, dazu führt, dass das Lösungsmittel seine physikalischen Eigenschaften verändert und sich in ein künstliches materielles Objekt verwandelt, das als Iteration bezeichnet wird. Ermittelt wurde, dass die Iterationen hinsichtlich der physikalisch-chemischen Eigenschaften nach Fraktionen aufgeteilt werden, von denen jede die einen oder anderen pharmakologischen Eigenschaften des Ausgangsmolekül reproduzierte. In einer Reihe von Fällen übten die Iterationen eine unterschiedlich ausgerichtete Wirkung aus, was erlaubt, die Iterationen als Arzneimittel umfangreich zu verwenden. Sowohl in jenen Fällen, in denen der eine oder andere physiologische Prozess unterdrückt werden muss, als auch in jenen, in denen er verstärkt werden muss.

[0010] Die technische Aufgabe der vorliegenden Erfindung war die Entwicklung eines Verfahrens zur Gewinnung von biologischen Präparaten aus einer biologischen Ausgangssubstanz (aus einem biologischen Objekt), die über eine Wirkung verfügen, die der des biologischen Objekts ähnelt, und die im Organismus auf die gleichen endogenen Moleküle - Zielobjekte - oder funktional-metabolischen Prozesse, auf die das biologische Objekt einwirkt, ausgerichtet sind.

[0011] Durch den Antragsteller wurde ein Verfahren zur Gewinnung eines Mittels gefunden, das die Eigenschaften eines biologischen Objekts reproduziert, das im Organismus auf molekulare oder zelluläre Ziele, auf physiologische und metabolische Prozesse einwirkt, die durch das biologische Objekt geregelt werden, und ein biologisches (pharmakologisches) Präparat ist - Iterationen einer biologischen Sustanz, das unter Ausnutzung einer äußeren rhythmischen Einwirkung zubereitet wurden (Zeichnung 1).

[0012] Ein Wesenszug des anzumeldenden Verfahrens für die Gewinnung biologischer Präparate ist die Möglichkeit einer Verwendung eines ganzheitlichen biologischen Objekts als biologische Ausgangssubstanz, und zwar von Zellen und deren Strukturen (eine Kultur von Zellen, eines Gewebes, von Organen) - ohne eine Verdünnung der biologischen Substanz, um die Eigenschaften des nativen biologischen Objekts auf Iterationen zu übertragen.

[0013] Die im Verlauf der sukzessiven Vibrationsbehandlung der biologischen Objekte gewonnenen Iterationen üben eine biologische (pharmakologische) Wirkung aus, die teilweise oder vollkommen die biologischen Effekte des biologischen Objekts (der Substanz) reproduzieren. Das Spektrum, die Richtung und das Ausmass der pharmakologischen Wirkung unterscheiden sich bei den verschiedenen Fraktionen der Iterationen der biologischen Objekte und können auf dem Weg von Versuchen ermittelt werden.

[0014] Gleichfalls ist ein obligatorischer Bestandteil der Lösung die Aufteilung der gewonnenen Iterationen nach Fraktionen durch eine Beurteilung ihrer physikalisch-chemischen Eigenschaften mit Hilfe allgemein anerkannter analytischer Methodiken und die weitere Bestimmung ihrer biologischen (pharmakologischen) Eigenschaften mit Hilfe ebenfalls allgemein anerkannten Methoden der experimentellen Biologie und Pharmakologie.

[0015] Dabei schließt das Verfahren in der Anfangsphase den Erhalt einer Null-Iteration durch eine Vibrationsbehandlung der Reagenzgläser mit der biologischen Ausgangssubstanz und einem Lösungsmittel ein, die man sowohl gleichzeitig als auch sukzessiv vornehmen kann und die zu einer Transformation des Lösungsmittels in ein materielles Objekt mit neuen physikalisch-chemischen und biologischen (pharmakologische) Eigenschaften, die sich sowohl von den Eigenschaften des Ausgangsstoffes als auch des Lösungsmittels unterscheiden, führt. Und im Weiteren kann man auch eine weitere sukzessive Vibrationsbehandlung der vorangegangenen Iteration und des Lösungsmittels mit dem Erhalt der weiteren Iterationen 1, 2, 3 usw. aus dem Lösungsmittel vornehmen.

[0016] Unter einem biologischen Objekt werden im Rahmen dieser Erfindung eine ganzheitliche (intakte) und die ursprüngliche Aktivität bewahrte Zelle oder Zellverbindungen in Form einer Gruppe von Zellen, Geweben oder eines Organs oder Zellen von Mikroorganismen - vorrangig Bakterien - und Viren oder außerzelluläre Strukturen - Prionen - verstanden. Dabei können Mikro- oder Makroorganismuszellen oder eine relativ funktionell und morphologisch homogene Zellen eines Makroorganismus in Gestalt einer Zellstruktur (Gewebe, flüssige Milieus des Organismus, Organe, aber auch ein Zelltransplantat aus einem fetalen, embryonalen oder anderen Gewebe, bei dem es sich sowohl um ein eigenes vorab gewonnenes Biomaterial des Rezipienten (Autotransplantat) als auch ein Biomaterial, das von anderen Spendern erhalten wurde (allogenes Transplantat) handelt, aber auch um ein Biomaterial, das von anderen biologischen Arten (Xenotransplantat), die als biologische Substanz sofort oder nach einer Lagerung verwendet, aber auch außerhalb des Organismus gezüchtet werden können, gewonnen wurde), genutzt werden.

[0017] Da ein Teil der Iterationen eine unterdrückende Wirkung ausübt, kann man durch Versuche die Iterationen auswählen, die die Aktivität von Mikroorganismen verringern. In der überwiegenden Mehrheit der Fälle wirken als biologisches Objekt Zellen oder zelluläre Ensembles des Makroorganismus. In Abhängigkeit von den Therapiezielen wählt man in diesem Fall die Iterationen aus, die hinsichtlich der Richtung die erforderliche Wirkung ausüben.

[0018] Ein biologisches Objekt wird in Abhängigkeit davon ausgewählt, auf welche veränderten oder pathologischen funktional-metabolischen Prozesse oder auf welche Moleküle - Ziele - eine Einwirkung vorgenommen werden soll. Solch eine Vorgehensweise erlaubt, einen grossen Bereich an experimentellen und klinischen Daten über die Aktivität von biologischen Objekten zu nutzen, was die Entwicklung neuer Arzneimittel erleichtert.

[0019] Als biologische Objekte können Zellen in Form einer isolierten Zelle oder Gruppe von Zellen verwendet werden. Dabei wird das beanspruchte Präparat die gleichen Funktionen beeinflussen, die diese Zellen im Organismen wahrnehmen.

Gewährleistung der Möglichkeit einer Reproduktion des Organismus bei einer geschlechtlichen Fortpflanzung

Gameten: Samenzellen und Eizellen

Fähigkeit zur Verschmelzung mit den Gameten eines Individuums/Einzelwe sens des anderen Geschlechts und Bildung einer Zygote. Haploid-Charakter

Fähigkeit zu aktiven und passiven Verlagerungen mit einer Bewahrung der funktionalen Eigenschaften

Gewährleistung einer physiologischen und reparativen Regenerierung unterschiedlicher Organe dank der Fähigkeit zu Teilungen und Differenzierung in vielen Richtungen

Stammzellen verschiedener Gewebe

Polypotenz. Fähigkeit zur Selbstunterhaltung. Fähigkeit zur Teilung

Fähigkeit zu Migrationen

Synthese von Stoffen, die die Hauptmasse des Organismus ausmachen („festes“ und „weiches“ Skelett)

Fibroblasten und Fibrozyten. Chondroblasten und Chondrozyten. Osteoblasten und Osteozyten. Dentin- (-Odonto-) Blasten. Zementoblasten und Zementozyten.

Entwickelter Apparat zur Synthese und zum Herausführen von Proteinen und Glykosaminoglykanen

Vornahme einer Bewegung des Organismus und seiner Teile

Myosimplaste. Kardiomyozyten. Glatte Myozyten. Myoepithelzellen

Vorhandensein von Myofilamenten, Myoglobin. Entwickeltes agranuläres endoplasmatisches Retikulum

Großer spezifischer Umfang der Mitochondrien

Gewährleistung des Transports von Stoffen zwischen den verschiedenen Bereichen des Organismus

Säulenförmige Epithelzyten des Darms. Zellen der Nieren-Kanälchen. Zellen der Ausführungsgänge der Drüsen. Endothelzellen. Alveolozyten. Erythrozyten

Große Verhältnis der Fläche der Oberfläche (der Austauschoberfläche) zum Volumen

Vorhandensein einer großen Anzahl von Mikrovilli und Plasmalemma-Falten

Vornahme eines antimikrobiellen Schutzes

Makrophagen. Granuläre Leukozyten. Lymphozyten. Plasmozyten

Produktion von Stoffen mit einer großen bakteriziden und/oder bakteriostatischen Aktivität

Große Anzahl von Lysosomen. Große phagozytäre Aktivität

Formierung einer Grenze mit dem umgebenden Milieu und zwischen den verschiedenen Bereichen des Organismus

Zellen von Deckepithelien. Ependymzellen. Endothelialzellen

Bildung von Schichten aus eng miteinander kontaktierenden Zellen

Ausgeprägte Polarität

Erzeugung von biologisch aktiven Stoffen und deren Ausscheidung in das äußere und innere Milieu des Organismus

Sekretorische Zellen der der exokrinen und endokrinen Drüsen. Diskret gelegene Endokrinozyten. Neurosekretorische Zellen. Mastzellen

Gut entwickelter synthetischer Apparat, der eine Spezifik besitzt, und ein plattenförmiger bzw. lamellenartiger Komplex

Bestimmung der Fähigkeit des Nervensystems, die Arbeit des Organismus und seiner einzelnen Organe zu regulieren

Neuronen

Plasmalemma, das das Wirkungspotenzial generiert und weitergibt sowie an der Bildung von Synapsen teilnimmt

Synthese von Mediatoren. Vorhandensein von Rezeptoren für Mediatoren

Wahrnehmung der Wirkung spezifischer Reizfaktoren

Photorezeptor-, sensible olfaktorische, Geschmacks- und andere Chemorezeptorzellen. Hör- und vestibuläre Rezeptorzellen

Vorhandensein von für diesen Analysator spezifischen Rezeptoren, wobei ein Einwirken auf diese den Zustand einer Zelle verändert; Fähigkeit, Informationen darüber an andere Zellen weiterzuleiten

Vorhandensein von Auswüchsen des Zytoplasmas (Zilien, Mikrovilli - „Antennen“)

Schaffung der notwendigen spezifischen Bedingungen für die Entwicklung und das Funktionieren der Zellen, die eine Hauptfunktion für das Organ erfüllen (Hilfsbedingungen)

Gliazellen des zentralen und peripheren Nervensystems. Unterstützende (Stütz-) Zellen der peripheren Teile des Hör-, des vestibulären, des olfaktorischen und des Geschmacksanalysators. Stromazellen der blutbildenden Organe. Sustentozyten der Samentubuli

Besitzen Strukturen, die die Schaffung einer mechanischen Stütze und/oder Produktion von Stoffen, die die Mikroumgebung für die Zellen des Organs bilden, die seine Hauptfunktion wahrnehmen, gewährleisten.

Vorhandensein eines entwickelten Stützapparats im Zytoplasma - von Mikroröhrchen, Mikrofibrillen -, im Zytolemma - von spezialiserten Zonen eines Kontakts mit den für die Funktion des Organs „hauptsächlichen“ Zell en

[0020] Als ein biologisches Objekt können sowohl strukturell ganzheitliche Zellen und Zellkulturen genutzt als auch in einigen Fällen bei Bedarf die Aktivität des biologischen Objekts - seine Homogenats oder Supernatants -, aber auch Zellen von Mikroorganismen, die durch physikalische oder chemische Einwirkungen abgeschwächt wurden, abgeschwächt werden. Dabei können sowohl normale physiologische Zellen als auch atypische Zellen genutzt werden.

[0021] Als biologisches Objekt kann eine Zell- , Gewebe- oder Organkultur, die außerhalb des Organismus gezüchtet worden ist, verwendet werden.

Gruppe von Geweben

Besonderheiten des Aufbaus

Funktionen

Beispiele von Geweben

epitheliale

Eine oder mehrere Zellschichten, die eng beieinander liegen

Abdeckungs- bzw. Überzugs-, Schutz-, Ausscheidungs- und sekretorische Funktion, Resorption nützlicher Stoffe

Plattenepithel, mehrschichtiges Epithel, Drüsenepithel, Flimmerepithel

Bindegewebe

Vorhandensein einer gut entwickelten Interzellularsubstanz

Abdeckungs- bzw. Überzugs-, Schutz-, Stütz- und Transportfunktion, Ausfüllen des Raums zwischen den Organen, Schutz-(Immunität), humorale, trophische (Ernährung, Stoffwechsel), reparative (Wiederherstellung von Schäden durch eine Bindegewebsnarbe)

Knorpelgewebe, Knochengewebe, festes Gewebe (Lederhaut, Sehnen, Bänder, Faszien) und lockeres (areoläres Gewebe), fasriges und Fettgewebe, Blut, Lymphe

Muskelgewebe

Verlängerte Zellen, die kontraktile Proteine enthalten

Besitzt Eigenschaften einer Erregbarkeit und Kontraktilität. Gewährleistung von willkürlichen und unwillkürlichen Bewegungen

Quergestreiftes, glattes, Herzmuskelgewebe

Nervengewebe

Zellen, die kurze und lange Fortsätze besitzen

Besitzt Eigenschaften einer Erregbarkeit und Leitfähigkeit eines Nervenimpuls. Vornahme einer Nervenregulierung, der Wechselbeziehungen der Organe, Verbindung mit der Außenwelt und Vornahme der höchsten Nerventätigkeit

Nervengewebe

[0022] Als biologische Objekte können Organe oder ein System von Organen verwendet werden, die aus dem Organismus isoliert oder außerhalb des Organismus gezüchtet wurden.

Stütz- und Bewegungsapparat

Skelettknochen und Skelettmuskeln

Stützung, Bewegung, Schutz

Verdauungssystem

Darmrohr (Mundhöhle, Speiseröhre, Magen, Dünn- und Dickdarm) und Verdauungsdrüsen

Zerkleinerung, Transport und chemische Verarbeitung von Nahrung, Resorption von Nährstoffen, Ausscheidung unverdauter Reste

Atmungssystem

Luftführende Wege (Nasen- und Mundhöhle, Luftröhren, Bronchien) und Alveolen

Sauerstoffversorgung des Organismus, Ableitung von Kohlendioxid und gasartigen Produkten des Metabolismus

Harnausscheidungssystem

Nieren, Harnleiter, Harnblase, Harnröhre

Ausscheidung von Stoffwechselprodukten, überschüssigem Wasser, Toxinen und Salzen, Regulierung des arteriellen Blutdrucks

Nervensystem

Gehirn und Rückenmark, Nerven, Nervenknoten, Rezeptoren

Verbindung mit der Außenwelt, Koordinierung der Arbeit der Organe

Fortpflanzungssystem

Geschlechtsdrüsen und Ausführungsgänge

Vermehrung

Endokrines System

Endokrine Drüsen

Regulierung der Arbeit der Organe, Stoffwechsel

Herz-Kreislauf-System

Herz und Gefäße

Ernährung/Versorgung, Transport, Schutz, Regulierung

Hautsystem

Hautdecke und Haut-(exokrine) Drüsen

Schutz vor mechanischen Verletzungen, UV-Strahlen und das Eindringen von Fremdkörpern; Ableitung bzw. Ausscheidung von Produkten des Metabolismus; Temperaturregulation

Immunsystem

Organe des Immunschutzes (Knochenmark, Thymus, Lymphknoten, Milz)

Schutz vor Fremdkörpern und Infektionsagenzien (Bakterien, Viren, Protozoen); Vernichtung von veränderten Zellen, Tumoren usw.

[0023] Als Ausgangsstoff für den Erhalt des erfindungsgemässen Produkts kann sowohl eine homogenes Set von Zellen als auch deren Kombination verwendet werden. Zum Beispiel können sowohl separat gewonnene Stammzellen (nicht differenzierte Zellen, die in der Lage sind, sich in jeden der Typen der Zellen im Organismus zu verwandeln, die aus Embryonen, Uterus-Föten, Nabelschnurblut, Knochenmark sowie aus induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnen wurden), als auch Stammzellen, die in den fetalen Geweben enthalten sind, die üblicherweise als Zelltransplantate für die individuelle biologische Regenerationsmedizin eingesetzt werden, verwendet werden.

[0024] Als ein biologisches Objekt können fetale oder embryonale Zellen und Gewebe auto-, allo- oder heterogener Herkunft, die außer Stammzellen regionale Blastzellen genauso wie differenzierte Zellen, spezialisierte Zellen sowie biologisch-aktive Stoffe enthalten, genutzt werden. Dadurch kann die Iterationen solcher Zellen (oder Gewebe) für die Behandlung eines breiten Spektrums von Erkrankungen verschiedener Systeme verwenden: des Nervensystems, des endokrinen Systems, bei Stoffwechselstörungen, Blutkrankheiten und Krankheiten der blutbildenden Organe, bei Zuständen im Zusammenhang mit Störungen der Immunmechanismen, der Behandlung von Neubildungen, Krankheiten der Augen und deren Umfeld, der Ohren, des Blutkreislaufes, der Atmungs- und Verdauungsorgane, bei Erkrankungen der Haut und des Unterhaut-Zellgewebes, des Knochen- und Muskelsystems, der Bindegewebe, bei der Behandlung von Zuständen, die sich in der perinatalen Periode ergeben, von Unfallverletzungen und Vergiftungen, da aus dem Stand der Technikentwicklung bekannt ist, dass fetale Gewebe und Zellen einen Einfluss auf diese Organe (Zielobjekte) und die Funktionen des Organismus ausüben [RU2160112].

[0025] Unter biologischer (pharmakologischer) Wirkung eines biologischen Präparats, das mit dem beanspruchten Verfahren einer sukzessiven Vibrationsbehandlung gewonnen wurde, wird eine aktivierende oder unterdrückende Wirkung auf die funktional-metabolischen Prozesse, an denen ein biologisches Ausgangsobjekt teilnimmt oder auf die das biologische Ausgangsobjekt eine regulierende Wirkung oder auf das biologische Objekt an sich ausübt, was eine spezifische (ausgerichtete) pharmakologische (biologische) Wirkung der biologischen Präparate dieses Typs, die der biologischen Wirkung des biologischen Ausgangsobjekts ähnlich ist, bedingt, verstanden.

[0026] Die Wirkungsziele der Iteration - des biologischen Präparats, das mit dem diskutierten Verfahren einer sukzessiven Vibrationsbehandlung gewonnen wurde -, können nicht nur endogene Ziele oder Prozesse sein, sondern auch die biologischen Ausgangsobjekte an sich, zum Beispiel Viren, Bakterien, Prionen oder atypische Zellen des Organismus. Ziele sind aber auch pathologische morpho-funktionale oder metabolische Prozesse im biologischen Ausgangsobjektselbst, zum Beispiel Zysten der Schilddrüse oder von der Schilddrüse kontrollierte Prozesse, zum Beispiel der Gehalt von Hormonen, Kalzium, Phosphor, Vitamin D3, im Organismus während der Behandlung, z.B. mit Iteration der nativen Schilddrüse aus dem Körper isoliert.

[0027] Bei der beanspruchten Erfindung handelt es sich um ein Verfahren zur Gewinnung eines biologischen Präparats, das die folgenden Stadien umfasst:

1)

Zubereitung einer Nulliteration - eines künstlichen materiellen Objekts -, die bzw. das durch eine äußere Vibrationsbehandlung des Lösungsmittels im Beisein der biologischen Ausgangssubstanz gewonnen wurde (mit ihrer weiteren Exposition - Inkubation);

2)

Gewinnung der ersten Iteration durch eine Vibrationseinwirkung auf das intakte Lösungsmittel im Beisein der Null-Iteration;

3)

Gewinnung einer Serie von Iterationen, wobei jede weitere Iteration dadurch gewonnen wird, dass das Lösungsmittel in Gegenwart der vorherigen Iteration einer Vibrationsbehandlung unterzogen wird.

[0028] In der ersten Stufe erhält man eine Null-Iteration, in die das Lösungsmittel bei einer gemeinsamen Vibrationsbehandlung des Lösungsmittels und der biologischen Ausgangssubstanz (mit ihrer weiteren Inkubation) transformiert wird. Danach werden durch eine Vibrationsbehandlung der vorangegangenen Iteration und des Lösungsmittels aus dem Lösungsmittel die weiteren Iterationen - die erste, die zweite, die dritte usw. - gewonnen.

[0029] Der Prozess zur Gewinnung der Iterationen kann sich hinsichtlich der Zeit, während eine äußere Vibrationseinwirkung ausgeübt wird, oder hinsichtlich der Inkubation (der Exposition) - des Post-Vibrationskontakts des Stoffs (oder der Iterationen) mit dem Lösungsmittel -, durch die Art des äußeren rhythmischen physikalischen Einflusses - durch eine horizontale oder vertikale mechanische Einwirkung (ein Schütteln, einer Rotation auf einem Vortex) -, durch Ultraschall, ein elektromagnetische Feld usw., aber gleichfalls durch die Varianten der äußeren rhythmischen Einwirkung hinsichtlich der Frequenz und der Amplitude unterscheiden. Gleichfalls können unterschiedliche Lösungsmittel verwendet werden, zum Beispiel Wasser oder ein Wasser- Alkohol-Gemisch. Die Serie der Iterationen kann aus einer einzigen biologischen Substanz oder einer Kombination davon gewonnen werden, zum Beispiel aus einem auto-, allo- oder heterogenen zellulären Transplantat, das unterschiedliche Arten von Zellen enthält.

[0030] Die Zeit der äußeren Vibrationseinwirkung und Inkubation (das gemeinsame Aufbewahren der Reagenzgläser mit einem intakten Lösungsmittel und einer Iteration oder einer biologischen Ausgangssubstanz bei Zimmertemperatur) hängt von der Menge des biologischen Ausgangsobjekts und vom Lösungsmittel ab und wird durch Versuche für jeden konkreten Fall gewählt. Die Reagenzgläser und Vials (Phiolen) werden nebeneinander angeordnet - dicht zueinander oder mit einem Abstand von vorrangig 1 bis 3 cm. Möglich ist gleichfalls eine separate Vibrationsbearbeitung des Stoffs (oder der Iterationen im Falle einer Gewinnung nachfolgender Iterationen) und des Lösungsmittels mit deren weiteren Inkubation, bei der die Reagenzgläser mit dem Stoff (oder der Iterationen im Falle einer Gewinnung nachfolgender Iterationen) und mit dem Lösungsmittel für eine Dauer von einer Sekunde und mehr nebeneinander angeordnet werden.

[0031] Iterationen, die durch sukzessive äußere Vibrationseinwirkung auf die Reagenzgläser mit dem Lösungsmittel und den vorangegangenen Iterationen oder der Ausgangssubstanz (für die Gewinnung der Null-Iteration) gewonnen wurden, stellen ein biologisches Präparat dar, da sie aus einem biologischen Rohstoff gewonnen wurden und ihre Wirkungsmechanismen biologische sind, da sie auf biologische Ziele im Organismus ausgerichtet sind.

[0032] Im Unterschied zu den individuell angewandten biologischen Präparaten, wie Zell-Transplantaten, verfügen die biologischen Präparate, die durch das beanspruchte Verfahren gewonnen wurden, über eine Reihe von Vorzügen. Sie können mit relativ einfachen physikalisch-chemischen Kriterien charakterisiert und unter Verwendung der allgemein zugänglichen analytischen Methoden validiert werden; sie können lange aufbewahrt werden, werden peroral angewandt und lösen keine Abstoßungsreaktionen und andere Nebenwirkungen aus. Es besteht beispielsweise kein Risiko für eine Virus- oder Prionen-Ansteckung. In einer Reihe von Fällen aktivieren die einen Iterationsfraktionen Prozesse, auf die sie ausgerichtet sind, und in anderen unterdrücken sie diese, was das Spektrum ihres Einsatzes erweitert.

[0033] Experimentell ist ermittelt worden, dass Fraktionen von Iterationen mit gemeinsamen physikalischen, vor allem mit spektralen Eigenschaften, gemeinsame biologische Eigenschaften besitzen. Daher ist die Trennung der Iterationen nach Fraktionen eine notwendige technologische Stufe für die Entwicklung von biologischen Präparaten dieses Typs - mit einer weiteren Bestimmung ihrer biologischen (pharmakologischen) Aktivität mittels Versuchen.

[0034] Das Verfahren zur Aufteilung nach Fraktionen umfasst gemäss der vorliegenden Erfindung die folgendenSchritte:

1.

Für jede gewonnene Iteration werden durch bekannte analytische Methoden ihre physikalisch-chemischen Eigenschaften, die sich von den Eigenschaften des intakten Lösungsmittels unterscheiden, unter Verwendung der folgenden Methoden bewertet: Bestimmung der spezifischen elektrischen Leitfähigkeit (SELF), Strahlungsmessung, Terahertz-Spektroskopie und Immunofermentanalyse (IFA), Bestimmung des pH-Wertes, Bestimmung der Menge des gelösten Sauerstoffs, dynamische Lichtstreuung, eine hochaufgelöste Thermografie etc.

2.

In Abhängigkeit der Auswertung werden die Iterationen in Fraktionen unterteilt, die eigene physikalisch-chemische Eigenschaften besitzen und die sich von den Eigenschaften des neutralen Ausgangslösungsmittels unterscheiden.

3.

Die spezifische pharmakologische (biologische) Aktivität, die der Aktivität des als Ausgangssubstanz verwendeten biologischen Objekts entspricht, wird für jede Fraktion experimentell bestimmt.

[0035] Somit kann man im Wissen um die Eigenschaften des biologischen Objekts, das als Ausgangsstoff für die Gewinnung von Iterationen ausgewählt wurde, voraussehen, welche Eigenschaften die gewonnenen Iterationen (das technologische Produkt) zeigen können, und sie zielgerichtet mit den allgemein üblichen Methoden untersuchen.

[0036] Unter einer äußeren Vibrationseinwirkung, die für den Erhalt von Iterationen einge-setzt wird, wird ein horizontales bzw. vertikales mechanisches Schütteln oder deren Kombination verstanden, aber auch die äußere Einwirkung, die mit Hilfe von Methoden der Akustik und Mikrofluidik [RU2724254], einer elektromagnetischen und Ultraschall-Beeinflussung oder einen anderen äußeren rhythmischen Einfluss ausgeübt wird. Die Reagenzgläser mit dem Lösungsmittel und dem Stoff (oder der vorangegangenen Iteration) können einer gemeinsamen (gleichzeitigen) Vibrationseinwirkung ausgesetzt werden, oder jedes der Reagenzgläser durchläuft unabhängig von dem anderen eine Vibrationsbearbeitung. In solch einem Fall kann man gleichfalls verschiedene Arten einer äußeren rhythmischen Einwirkung nutzen.

[0037] Unter intrinsischen physikalisch-chemischen Eigenschaften wird das Auftreten lang anhaltender physikalisch-chemischer Eigenschaften in Iterationen verstanden, die sich quantitativ oder qualitativ von den physikalisch-chemischen Eigenschaften des Ausgangsstoffs oder dem neutralen Lösungsmittel unterscheiden.

[0038] Als neutrales Trägermittel kann entweder ein Lösungsmittel genutzt werden, dessen Transformation zum Auftreten von Iterationen führt: Wasser, eine wässerige alkoholische Lösung , oder feste Stoffe wie Laktose oder jegliches pharmazeutisch akzeptable Lösungsmittel oder jegliches entsprechende Exzipient.

[0039] Unter einem intakten Trägermittel/Lösungsmittel wird ein neutrales Trägermittel/Lösungsmittel bis zum Moment der Vibrationsbeeinflussung verstanden.

[0040] Das biologische Ausgangsobjekt, eine biologische Substanz, kann in einer angenommen festen, unveränderten Form oder aber in Form eines Homogenats, Lyophilisats, Supernatants, einer Lösung oder eines in einem speziell ausgewählten Lösungsmittel hochaufgelösten Homogenats, in einer frischen oder eingefrorenen Art verwendet werden. Die Konzentration der biologischen Ausgangssubstanz im Vial kann 0,1 µg/ml bis 10 mg/ml ausmachen. Für jeden konkreten Fall wird die Konzentration auf dem Wege von Versuchen ausgewählt.

[0041] Das Präparat, das nach dem beanspruchten Verfahren gewonnen wurde, kann in einer flüssigen oder festen Arzneimittelform verwendet werden. So kann beispielsweise das Präparat, das mit dem beanspruchten Verfahren gewonnen wird, in einer festen Arzneimittelform verwendet werden und die technologisch notwendige (wirksame) Menge eines neutralen Trägermittels, das durch Iterationen gesättigt wurde, und pharmazeutisch akzeptable Zusätze, die beispielsweise Laktose, monokristalline Zellulose, Magnesiumstearat und andere umfassen, enthalten. Für den Erhalt einer festen oralen Form des anzumeldenden Arzneimittels nimmt man in einer Wirbelschichtsystemanlage (zum Beispiel des Typs Hüttlin Pilotlab von der Hüttlin GmbH) ein Befeuchten bis zu einer Sättigung der in eine pseudoverflüssigten siedenden Schicht einzuführenden Granula des jeweiligen neutralen Stoffs - Laktose (Milchzucker) - durch eine vorab gewonnene Wasser- oder Wasser- Alkohol-Lösung der Iterationen mit einer gleichzeitigen Trocknung in einem Strom aus unter ein Gitter zugeführten erhitzten Luft mit einer Temperatur von maximal 40 °C vor. Die gewonnene Tablettenmasse vermischt man gleichmäßig und verleiht ihr durch ein direktes Trockenpressen eine Tablettenform (zum Beispiel in der Tablettenpresse Korsch - XL 400) [WO2007105981(A1), 20.09.2007]. Nach der Tablettierung erhält man Tabletten mit einer Masse von 300 mg, die durch eine Wasser- oder Wasser-Spiritus-Lösung von Iterationen durchtränkt sind.

[0042] Die vorliegende Erfindung wird anhand der Zeichnungen näher im Detail illustriert:

Figur 1. Schema der Technologie zur Gewinnung von Iterationen.

Figur 2. Ergebnisse der Beurteilung des Ödems der betroffenen Ohrmuschel bei Tieren am 2. und am 4. Tag (5 Tiere pro Gruppe). Anmerkung - * - statistisch signifikante Unterschiede gegenüber der „Kontrollgruppe“ (p <0,05), @ - statistisch signifikante Unterschiede gegenüber der Placebogruppe (p <0,05), ^ - statistisch signifikante Unterschiede gegenüber der Gruppe „Induktion der Pathologie“ (p <0,05).

Figur 3. Einfluss der Iterationen der CHO-S-Zellen auf den Glukose-Verbrauch durch die CHO-S-Zellen, normalisiert hinsichtlich der Anzahl der Zellen, in Abhängigkeit von der Konzentration des Insulins.

[0043] Die Erfindung wird nun näher im Detail unter Bezugnahme auf die Figur 1 beschrieben worden.

[0044] Die Gewinnung eines künstlichen Produkts -von Iterationen - besteht aus mehreren-Stufen.

1.

Ein Reagenzglas mit der Ausgangssubstanz und ein Reagenzglas mit einem neutralen Trägermittel - Wasser - werden dicht beieinander angeordnet und werden einer gemeinsamen Vibrationsbearbeitung mit Hilfe eines Vortex ausgesetzt.

2.

Danach werden die Reagenzgläser bei Zimmertemperatur inkubiert. Auf empirischer Weise ist als minimale Zeit für die Inkubation eine Minute bestimmt worden, die sich für den Erhalt von Iterationen als ausreichende erwiesen hat. In einigen Fällen ist eine Verringerung der Inkubationszeit oder ein Verzicht auf eine Inkubation bei einem experimentell bestätigten Erreichen einer Transformation des neutralen Lösungsmittels in ein materielles Objekt - in eine Iteration - möglich.

[0045] Nach Durchführung der Stufen 1 und 2 erfolgt im ersten Reagenzglas eine Veränderung der physikalischen Eigenschaften des Lösungsmittels im Vergleich zum intakten Lösungsmittel.

[0046] Das Reagenzglas mit dem neutralen Trägermittel, das durch die erste Vibrationseinwirkung verändert wurde, wird als Null-Iteration der Substanz bezeichnet (I<0>).

3.

Danach wird I<0>dicht zum Reagenzglas mit Wasser (eine neue Portion) angeordnet, wonach beide Reagenzgläser einer Vibrationsbearbeitung und einer Inkubation bei Zimmertemperatur ausgesetzt werden. Im Ergebnis dessen verändert das Wasser im zweiten Reagenzglas ebenfalls seine Eigenschaften und verwandelt sich in die erste Iteration der Substanz (I<1>).

4.

Das beschriebene Verfahren der Vibrationsbehandlung wird wiederholt, um weitere Iterationen der Substanz aus der vorangegangenen Iteration - I<2>, I<3>, ..., I<n>- zu erhalten.

5.

Danach erfolgt die Phase der Selektion der gewonnenen Iterationen, die nach der Vibrationsbehandlung nach Fraktionen unterteilt wurden.

[0047] Fraktionen, die potenzielle Kandidaten für biologische Präparate sind, müssen sich nach der Vibrationsbehandlung hinsichtlich der physikalischen Eigenschaften vom Lösungsmittel unterscheiden. Für praktische Zwecke ist es ausreichend, Kandidaten nach dem Erhalt einer Serie aus sechs Iterationen und aus ihnen zwei Hauptgruppen auszuwählen, die sich auf maximale Weise voneinander hinsichtlich der physikalischen Eigenschaften unterscheiden, und vor allem hinsichtlich des Einflusses auf die spektralen Charakteristika des Ausgangsstoffs. Durch Versuche ist ermittelt worden, dass sich diese Fraktionen ebenfalls auf maximale Weise in Bezug auf die biologischen und chemischen Eigenschaften unterscheiden, was erlaubt, die für die jeweilige konkrete Aufgabe geeignetste Iteration auszuwählen. Dafür ist es ausreichend, nur eine Iteration aus der gesamten Reihe der gewonnenen Iterationen zu verwenden oder aber mehrere Iterationen einer Fraktion zu vermischen.

[0048] Unter Berücksichtigung der von uns genutzten Methoden können die ersten sechs Iterationen (I<1>- I<6>) hinsichtlich ihrer physikalischen Charakteristika in nur vier Fraktionen unterteilt werden, deren Verhältnis für jede Ausgangssubstanz variieren kann. Oder eine der Fraktionen kann herausfallen. Für die Kennzeichnung der Fraktionen sind durch uns die technischen Termini nativ, halbnativ, halbaktiv und aktiv vorgeschlagen worden.

1.

Nativ sind Iterationen, die entsprechend den Ergebnissen der Konduktometrie (K) und Radiometrie (GHz) keine wesentlichen Veränderungen der physikalisch-chemischen Eigenschaften im Vergleich zum intakten neutralen Trägermittel (Wasser) aufweisen und gemäß den Ergebnissen der Terahertz-(THz)-Spektroskopie (Einfluss auf die Ausgangssubstanz) und der Immunofermentanalyse (IFA) keine modifizierende Wirkung hinsichtlich der Ausgangssubstanz besitzen, d. h. K-, GHz-, THz, IFA-.

2.

Halbnativ sind die Iterationen, bei denen statistisch relevante Veränderungen der physikalisch-chemischen Eigenschaften im Vergleich zum intakten neutralen Trägermittel (Wasser) festgestellt wurden, die aber genauso wie auch die nativen keine modifizierende Wirkung in Bezug auf die Ausgangssubstanz besitzen, d. h. K+ und/oder GHz+, THz-, IFA-.

3.

Halbaktiv sind die Iterationen, die keine wesentlichen Veränderungen in den physikalisch-chemischen Eigenschaften im Vergleich zum intakten neutralen Trägermittel (Wasser) aufweisen, die dabei aber im Unterschied zu den nativen eine modifizierende Wirkung hinsichtlich der Ausgangssubstanz besitzen, d. h. K-, GHz-, THz+ und/oder IFA+.

4.

Aktive Iterationen sind die, in denen statistisch relevante Unterschiede der physikalisch-chemischen Eigenschaften im Vergleich zum intakten neutralen Trägermittel (Wasser) ermittelt worden sind und die eine modifizierende Wirkung hinsichtlich der Ausgangssubstanz besitzen, d. h. K+ und/oder GHz+, THz+ und/oder IFA+.

[0049] Üblicherweise erfolgt eine Auswahl zwischen den Fraktionen halbnativ und aktiv, die mit ein und denselben biologischen oder pharmakologischen experimentellen Modellen untersucht werden, um deren Aktivität zu bestimmen, die in unterschiedlichem Maße bei den verschiedenen Fraktionen der Iterationen die Wirkungen der Ausgangssubstanz reproduzieren.

[0050] Beispiel 1. Iterationen, die unter Verwendung menschlicher Adipozypten und Wasser als neutrales Trägermittel gewonnen wurden.

[0051] Die Temperatur und Feuchtigkeit im Labor während der Vorbereitung der Muster und der nachfolgenden Messungen wurden mit Hilfe des Thermohygrographen IVA-6N kontrolliert; die Temperatur betrug 22±3 °C, der Feuchtigkeitsgrad - 20-70 %. Für die Zubereitung der Iterationen verwendete man durchsichtige Fläschchen aus Borosilikatglas (mit einem Volumen von 40 und 60 ml, Glastechnik Grafenroda, Infochroma AG, Schweiz) oder Reagenzgläser (mit einem Volumen von 100, 250 und 500 ml, Simax, Tschechien).

[0052] Als neutrales Trägermittel für die Zubereitung der Iterationen, aber auch für alle anderen Reagenzien, die in dieser Arbeit verwendet werden, wurde Wasser des Typs 1 (ultrareines) mit einem spezifischen Widerstand von 18,2 mΩ×cm (Milli-Q Integral 5, Millipore) genutzt. Die Qualität des gereinigten Wassers wurde täglich durch eine Messung des spezifischen Widerstands mit Hilfe des Konduktometers SevenCompact S230 (Mettler Toledo) kontrolliert, und die Kontrolle des pH-Wertes mit Hilfe des pH-Messgerätes SevenCompact S220 (Mettler Toledo). Für die Flüssigkeiten verwendete man automatische Pipetten unterschiedlichen Volumens (Eppendorf, Deutschland; Socorex, Schweiz), aber auch gläserne Messgefäße der Genauigkeitsklasse A (Borosil, Indien; Steklopribor, Ukraine). Die trockenen Reagenzien wog man auf analytischen Waagen der Genauigkeitsklasse I (Pioneer PA214C, Ohaus, USA). Für die Messung der Zeit der Inkubation verwendete man einen geeichten Labortimer (Traceable, VWR). Die Vibrationseinwirkung erfolgte mit Hilfe des Basis-Shakers (Wirbel-Shaker) MS 3 (IKA-Werke, Deutschland) mit einem Standardeinsatz.

[0053] Der Prozess der Gewinnung von Iterationen umfasste mehrereStufen. Ein 60-Milliliter-Fläschchen mit einer frisch zubereiteten Suspension differenzierter Adipozyten des Menschen als Ausgangsstoff in einer Konzentration von 35*10<3>in einem Umfang von 50 ml und ein 250-Milliliter-Fläschchen mit gereinigtem Wasser (neutrales Trägermittel) in einem Umfang von 180 ml wurden auf einem Vortex während zehn Sekunden einer Rotation mit 3000 U/min in einem engen Kontakt ausgesetzt. Danach inkubierte man beide Fläschchen während einer Minute bei Zimmertemperatur in engem Kontakt. Mit Hilfe der oben beschriebenen Prozedur wurden 35 ml der I<0>(Iteration 0) gewonnen.

[0054] Danach wurde ein 40-Milliliter-Fläschchen mit der I<0>(35 ml) neben einem neuen 40-Milliliter-Fläschchen mit 35 ml des neutralen Trägermittels angeordnet und im Verlauf von zehn Sekunden mit 3000 U/min in einem engen Kontakt bewegt. Danach inkubierte man die beiden Fläschchen während einer Minute bei Zimmertemperatur in einem engen Kontakt. Das erhaltene Fläschchen mit dem neutralen Trägermittel wurde als I<1>bezeichnet. Danach wiederholte man die Prozedur zur Gewinnung einer nächsten Iteration (Nr. 2, Nr. 3 usw.) mehrfach, wobei das Fläschchen mit einer neuen Portion des neutralen Trägermittels und ein Fläschchen der vorangegangenen Iteration zusammen per Wirbelverfahren bewegt wurden.

[0055] Jede der gewonnenen Iterationen besitzt gleichfalls ihre physikalisch-chemischen Eigenschaften, die mit den nachfolgenden Verfahren bestimmt werden:

1.

Konduktometrie. Für die Bewertung der physikalisch-chemischen Eigenschaften der Serie von Iterationen verwendete man das Verfahren der Konduktometrie. Für die Messung der spezifischen elektrischen Leitfähigkeit (SELF) wurden 10 ml des Musters in 15-Milliliter-Reagenzgläser gegeben. Die Elektrode (Mettler Toledo, USA) ordnete man so an, dass die Membran der Elektrode vollkommen in die Lösung eingetaucht war, wonach man die SELF bestimmte. Insgesamt waren 21 Iterationen gewonnen worden. Durch das Verfahren der Konduktometrie wurde ermittelt, dass die Iterationen Nr. 1, 4, 11, 14 und 17 signifikante Unterschiede zum neutralen Trägermittel besitzen.

2.

Radiometrie (Strahlungsmessung). Die Bewertung der eigenen elektromagnetischen Strahlung der Iterationen erfolgte mit der Methode der Strahlungsmessung auf einer speziellen Anlage, bei der es sich um einen Faradayschen Käfig handelte, um ein Aluminiumskelett, das mit einem Kupfernetz bespannt worden war. Innerhalb des Käfigs wurden ein Stativ mit einer Greifereinrichtung für das Verankern des Detektors, ein Thermoshaker (BIOSAN PST-60HL-4) für das Erhitzen der Muster und ein Detektor für die elektromagnetische Strahlung (EMS) TES-92 (TES Electrical Electronic Corp., Taiwan), der die Stromdichte der EMS in einem Spektrum von 1 µW/m<2>bis 30,93 W/m<2>und in einem Frequenzbereich von 50 MHz bis 3,5 GHz zu bestimmen erlaubt, installiert. Als Messregime wurde der maximale Mittelwert (MAX AVG) verwendet. Das zu testende Muster (10 ml) wurde in eine Petri-Schale gegeben, danach wurde die Petri-Schale im Thermoshaker platziert, und das Muster wurde bis zu einer Temperatur von 37±1 °C erhitzt. Danach wurde der Detektor mit einem Abstand von 0,5 cm über dem Muster angeordnet und der Deckel der Petri-Schale entfernt. Die Messungen wurden im geschlossenen Faradayschen Käfig vorgenommen. Die Dauer der Messung betrug zehn Minuten. Nach Ablauf der (Mess-) Zeit wurde vom Display des Messgerätes ein maximaler Mittelwert für die Stromdichte der SELF fixiert. Bei der Nutzung der Strahlungsmessungsmethode wurde ermittelt, dass die Iterationen Nr. 6, 13, 15, 16 und 20 signifikante Unterschiede zum neutralen Trägermittel besitzen.

3.

Terahertz-Spektrometrie. Die Analyse der Veränderung der spektralen Charakteristika des Zielmoleküls im Terahertz-Bereich nach Hinzufügen der Iteration erfolgte mit Hilfe des Terahertz-Spektrometers Tera View TeraPulse Lx (England). Dafür fügte man einen Teil (5 µl) der Iterationen oder des neutralen Trägermittels 99 Teilen (495 µl) der Lösung des Stoffes hinzu, der das spezifische Ziel für die zu untersuchenden Iterationen ist, und registrierte die Brechungs- und Durchlässigkeitsbereiche. Für die Analyse der (gewonnenen) Daten wurden die Gleichungskoeffizienten der bekannten Debye-Funktion gefunden, die die ermittelten Spektren beschreibt (Pen'kov, N., Fesenko; Ye.: Entwicklung der Terahertz-Spektroskopie in einem zeitweiligen Bereich für eine Analyse der Eigenschaften hochverdünnter Antikörper. Appl. Sci. 2020;10:7736. doi: 10.3390/app10217736.) und die dielektrische Konstante in den Relaxationsbereichen charakterisiert. Mit Hilfe der Terahertz-Spektroskopie wurde ermittelt, dass die Iterationen Nr. 1, 4, 9, 12, 13, 18 und 21 wesentliche Unterschiede zum neutralen Trägermitteln hinsichtlich der Größe der Koeffizienten Δε1 (Amplitude des Relaxationsprozesses R1) oder Δε2 (Amplitude des Relaxationsprozesses R2) aufweisen.

4.

fermentgebundene Immunosorbent-Analyse/Immunoferment-Analyse (IFA). Mit Hilfe der IFA wurden gleichfalls die modifizierenden Eigenschaften der Iterationen untersucht. Dafür fügte man die zu untersuchenden Iterationen einem Antigen - einem Ziel-Molekül - hinzu, und die modifizierende Aktivität bewertete man indirekt anhand der Veränderung des Grades ihres Eingehens einer Verbindung mit monoklonalen Antikörpern in Abhängigkeit von ihrer Konzentration. Mit Hilfe des IFA-Verfahrens ist ermittelt worden, dass die Iterationen Nr. 6, 7, 10, 11, 14, 15, 16 und 19 signifikante Unterschiede zum neutralen Trägermittel hinsichtlich der Abhängigkeitskurve der optischen Dichte von der Konzentration der monoklonalen Antikörper gegenüber Adiponektin nach ihrem Zusammenwirken mit Adiponektin (1 µg/ml) im Beisein der Muster besitzen.

[0056] Somit wurden mit Hilfe der oben beschriebenen Methoden die gewonnenen Iterationen mit den Nummern von 1 bis 21 (I<1>-I<21>) in die folgenden Fraktionen unterteilt: in diejenigen, die veränderte physikalisch-chemische Eigenschaften besitzen und eine modifizierende Wirkung demonstrieren (I<1>, I<4>, I<6>, I<11>, I<13>, I<14>, I<15>und I<16>); in diejenigen, die veränderte physikalisch-chemische Eigenschaften besitzen und keine modifizierende Wirkung demonstrieren (I<17>, I<20>); in diejenigen, die keine veränderten physikalisch-chemischen Eigenschaften besitzen, aber einen modifizierende Wirkung demonstrieren (I<7>, I<9>, I<10>, I<12>, I<18>, I<19>und I<21>); in diejenigen, die keine veränderten physikalisch-chemischen Veränderungen besitzen und keine modifizierende Wirkung demonstrieren (I<2>, I<3>, I<5>und I<8>).

[0057] Es ist bekannt, dass eine der Funktionen der Adipozyten des weißen Fettgewebes die Sekretion einer Reihe von Hormonen, unter anderem von Adiponektin, Leptin und Resistin, ist. Die gewonnenen Iterationen können eine spezifische Aktivität hinsichtlich der sekretorischen Funktion der Adipozyten demonstrieren.

[0058] Die Beurteilung der spezifischen Aktivität erfolgte mit einem in-vitro-Verfahren auf einer Kultur differenzierter Adipozyten des Menschen. Die Präadipozyten gewann man aus dem Fettgewebe gesunder Spender mit einem BMI von 27,1±1,1, sie vereinte man und säte sie auf einer Platte für Gewebekulturen mit einer Anfangsdichte von 40.625 Zellen/cm<2>in einem Medium für das Wachstum von Präadipozyten PM-1 aus. Die Platte inkubierte man in einem CO<2>-Inkubator während einer Nacht. Danach differenzierte man die primären Präadipozyten in einem CO<2>-Inkubator während einer Woche in dem Medium DM-2 für das Differenzieren von Adipozyten und noch eine weitere Woche in einem Misch-Medium aus DM-2 + AM-1 (in einem Verhältnis von 1:2).

[0059] Das Muster 1 (ein Gemisch aus den Iterationen I<4>, I<6>, I<11>, I<13>, I<14>, I<15>und I<16>von Adipozyten des Menschen) fügte man reifen Adipozyten in dem Medium AM-1 (50 % v/v) oder von 0,1-%-igem Dimethylsulfoxid (negatives Kontrollmuster) oder das Muster 2 (Kontrollmuster, gereinigtes Wasser) im Medium AM-1 hinzu und inkubierte es in einem CO<2>-Inkubator während 72 Stunden. Danach bestimmte man den Grad der Sekretion von Adiponektin in einem Kulturmedium mit Hilfe des quantitativen Festphasen-Tests IFA (Katalognummer ADIP-1, Zen-Bio, Inc., USA) entsprechend der Anleitung des Herstellers. Dafür fügte man 20 µl des erfassten Mediums 80 µl des Lösungsmittels für eine Vorabbehandlung aus dem IFA-Set hinzu. Die gewonnenen Muster erhitzte man bis zu einer Temperatur von 100 °C im Verlauf von fünf Minuten. Nach der Abkühlung bis zur Zimmertemperatur fügte man 50 µl eines jeden Musters 200 µl des Puffers für eine Verdünnung aus dem IFA-Set hinzu, mischte alles durch. Und danach gab man 100 µl des Gemischs in die Wells (Vertiefungen) des mit primären Antikörpern überzogenen IFA-Tablets. Das Tablet wurde während einer Stunde bei Zimmertemperatur inkubiert. Nach einem Abspülen fügte man sekundäre Antikörper hinzu und inkubierte sie während einer Stunde bei Zimmertemperatur. Nach einer Stunde wurde das Tablet erneut abgespült. Man fügte detektierbare Antikörper hinzu und inkubierte alles noch eine Stunde lang bei Zimmertemperatur. Nach einer Stunde spülte man das Tablet ab, fügte Reagenzien für das Detektieren hinzu und bestimmte die Absorption bei 570 nm mit Hilfe eines Microplate-Readers (SpectraMax 250, Molecular Devices).

[0060] Für die statistische Verarbeitung der Ergebnisse verwendete man eine einseitige Dispersionsanalyse (einseitige ANOVA) mit dem Tukey-Post-hoc-Test. Die Unterschiede zwischen den Gruppen wurden bei p<0,05 als statistisch signifikante angesehen.

[0061] Die Ergebnisse der Untersuchung sind in Tabelle 1 ausgewiesen worden.

Tabelle 1. Einfluss der Muster auf die Erzeugung von Adiponektin durch reife Adipozyten des Menschen (M±m)

[0062] Muster 125.81±3.03*Muster 2 (Kontrollmuster, gereinigtes Wasser)9.03±1.640,1-%-iges Dimethylsulfoxid (negatives Kontrollmuster)7.64±1.53 Anmerkung: * - Die Unterschiede sind im Vergleich zu den Gruppen des Musters 2 und des 0,1-%-igen DMSO signifikant.

[0063] Es hat sich herausgestellt, dass das Hinzufügen des Musters 1 zur Kultur der reifen Adipozyten des Menschen die Generierung von Adiponektin im Vergleich zu beiden Kontrollmustern erheblich steigerte: mit gereinigtem Wasser - um das 2,9fache, mit 0,1-%- igem Dimethylsulfoxid - um das 3,4fache.

[0064] Somit wurde nachgewiesen, dass das Muster 1 (Gemisch von Fraktionen der Iterationen I<4>, I<6>, I<11>, I<13>, I<14>, I<15>und I<16>von Adipozyten des Menschen) eine spezifische Aktivität hinsichtlich der Sekretionsfunktion der Adipozyten demonstriert, und zwar erhöht es statistisch signifikant die Produktion von Adiponektin in einer Kultur differenzierter Adipozyten des Menschen.

[0065] Beispiel 2. Iterationen, die unter Verwendung von Adipozyten von Mäusen und Wasser als ein neutrales Trägermittel gewonnen wurden.

[0066] Der Prozess der Gewinnung von Iterationen umfasste mehrere Etappen. Ein 5-Milliliter-Fläschchen mit einer frisch zubereiteten Suspension von Adipozyten, die aus einer Linie von embryonalen Mäusezellen 3T3-L1 (1,0×10<6>Zellen/ml) gewonnen wurden, in einem Umfang von 5 ml und ein 40-Milliliter-Fläschchen mit gereinigtem Wasser (neutrales Trägermittel) in einem Umfang von 35 ml wurden auf einem Vortex während zehn Sekunden einer Rotation mit 3000 U/min in einem engen Kontakt ausgesetzt. Danach inkubierte man beide Fläschchen während einer Minute bei Zimmertemperatur in einem engen Kontakt. Mit Hilfe der oben beschriebenen Prozedur wurden 35 ml der I<0>(Iteration 0) gewonnen.

[0067] Danach wurde ein 40-Milliliter-Fläschchen mit der I<0>(35 ml) neben einem neuen 40-Milliliter-Fläschchen mit 35 ml des neutralen Trägermittels angeordnet und während zehn Sekunden mit 3000 U/min in einem engen Kontakt bewegt. Danach inkubierte man die beiden Fläschchen während einer Minute bei Zimmertemperatur in einem engen Kontakt. Das erhaltene Fläschchen mit dem neutralen Trägermittel wurde als I<1>bezeichnet. Danach wiederholte man die Prozedur zur Gewinnung einer nächsten Iteration (Nr. 2, Nr. 3 usw.) mehrfach, wobei das Fläschchen mit einer neuen Portion des neutralen Trägermittels und ein Fläschchen der vorangegangenen Iteration zusammen per Wirbelverfahren bewegt wurden.

[0068] Die Temperatur und Feuchtigkeit im Labor während der Vorbereitung der Muster und der nachfolgenden Messungen wurden mit Hilfe des Thermohygrographen IVA-6N kontrolliert; die Temperatur betrug 22±3 °C, der Feuchtigkeitsgrad - 20-70 %. Für die Zubereitung der Iterationen verwendete man durchsichtige Fläschchen aus Borosilikatglas (mit einem Volumen von 40 und 60 ml, Glastechnik Grafenroda, Infochroma AG, Schweiz) oder Reagenzgläser (mit einem Volumen von 100, 250 und 500 ml, Simax, Tschechien).

[0069] Als neutrales Trägermittel für die Zubereitung der Iterationen, aber auch für alle anderen Reagenzien, die in dieser Arbeit verwendet werden, wurde Wasser des Typs 1 (ultrareines) mit einem spezifischen Widerstand von 18,2 mΩ×cm (Milli-Q Integral 5, Millipore) genutzt. Die Qualität des gereinigten Wassers wurde täglich durch eine Messung des spezifischen Widerstands mit Hilfe des Konduktometers SevenCompact S230 (Mettler Toledo) kontrolliert, und die Kontrolle des pH-Wertes mit Hilfe des pH-Messgerätes SevenCompact S220 (Mettler Toledo). Für die Flüssigkeiten verwendete man automatische Pipetten unterschiedlichen Volumens (Eppendorf, Deutschland; Socorex, Schweiz), aber auch gläserne Messgefäße der Genauigkeitsklasse A (Borosil, Indien; Steklopribor, Ukraine). Die trockenen Reagenzien wog man auf analytischen Waagen der Genauigkeitsklasse I (Pioneer PA214C, Ohaus, USA). Für die Messung der Zeit der Inkubation verwendete man einen geeichten Labortimer (Traceable, VWR). Die Vibrationseinwirkung erfolgte mit Hilfe des Basis-Shakers (Wirbel-Shaker) MS 3 (IKA-Werke, Deutschland) mit einem Standardeinsatz.

[0070] In dieser Untersuchung wurde die I<3>(Iteration Nr. 3) verwendet (im Weiteren - Muster 1). Die Aufteilung der gewonnen Iterationen nach Fraktionen erfolgte, wie im Beispiel 1 beschrieben wurde.

[0071] Die Untersuchung erfolgte mit dem Modell eines diätinduzierten metabolischen Syndroms an geschlechtsreifen Mäusen C57B1/6 (5 Gruppen mit jeweils 13 Tieren in jeder). In der ersten Gruppe erhielten die Mäuse eine Standarddiät (STD), in der zweiten - eine STD und ein Placebo-Präparat (gereinigtes Wasser, Muster 2), in der dritten - eine fettreiche Diät (FRD), in der vierten - eine FRD und das Muster 2, in der fünften - eine FRD und das Muster 1 (Iteration Nr. 3 von Adipozyten). Die Tiere erhielten die FRD im Verlauf von zehn Wochen. Im Verlauf der gesamten Untersuchung erhielten die Tiere der Gruppe FRD ein standardmäßiges synthetisches vollwertiges Futtermittel, zubereitet im Forschungszentrum entsprechend der Rezeptur AIN-93G unter Hinzufügung von Schweineschmalz (Schmalz). Das Trinkwasser für die Tiere der Gruppe FRD wurde durch eine 8-%-ige Fruktose-Lösung ersetzt. Die Tiere der ersten und der zweiten Gruppe erhielten im Verlauf der gesamten Untersuchung ein standardmäßiges synthetisches vollwertiges Futtermittel und Wasser. Die experimentellen Muster sind den Tieren in Form einer Wasserlösung peroral, täglich und im Verlauf der zehn Wochen ab dem Zeitpunkt des Beginns des Modellierens des metabolischen Syndroms, ausgelöst durch die experimentelle Diät, verabreicht worden.

[0072] Im Verlauf des Experiments erfolgte ein Monitoring der Körpermasse und die Zunahme der Körpermasse der Labortiere aus der Kontroll- und einer Versuchsgruppe, aber auch der Parameter für den Verbrauch von Nahrung und Wasser. Nach Beendigung des Verabreichens der experimentellen Muster (zehn Wochen nach Beginn des Experiments) erfolgte eine humane Euthanasie der Mäuse aller Gruppen durch eine CO<2>-Erstickung mit einer unverzüglichen Entnahme von Blutserum für biochemische Analysen und von epididymalem Fettgewebe für eine histologische Untersuchung. Bei der Arbeit mit den Tieren wurden alle allgemein üblichen Standards der experimentellen Ethik (Richtlinie 2010/63/EU des Europäischen Parlaments und des Rates vom 22. September 2010 zum Schutz der für wissenschaftliche Zwecke verwendeten Tiere) eingehalten.

[0073] Die Effektivität der experimentellen Muster gegen Adipositas beurteilte man anhand der Körpermasse der Tiere am Ende des Experiments, aber auch anhand der Masse des epididymalen Fettgewebes.

[0074] Bei der statistischen Verarbeitung der Ergebnisse beurteilte man die Normalität der Verteilung mit Hilfe des Shapiro-Wilk-Tests und die Homogenität der Dispersion mit Hilfe des Bartlett- Tests. Der Vergleich der Gruppe erfolgte mit Hilfe einer Dispersionsanalyse und des Dunn-Tests. Genutzt wurde die Holm-Methode für die zahlreichen Vergleiche. Die Unterschiede zwischen den Gruppen wurden bei p<0,05 als statistisch signifikante angesehen.

[0075] Das Experiment zeigte, dass bei den Tieren, die eine fettreiche Diät erhalten hatten, eine statistisch signifikante Zunahme der Körpermasse und der Masse des epididymalen Fetts beobachtet wurde. Die Anwendung des Musters 1 führte zu einer erheblichen Verringerung der Körpermasse (um 32 % im Vergleich zum Placebo), aber auch des epididymalen Fetts (um 41 %). Die Ergebnisse der Untersuchung werden in der Tabelle 2 vorgestellt.

Tabelle 2. Ergebnisse der Bestimmung der Körpermasse am Ende des Experiments und der Masse des viszeralen Fetts

[0076] Standarddiät26±2.10.7±0.1Standarddiät + Muster 232±4.61.1±0.3Fettreiche Diät39±5.8*3,22±0.4*Fettreiche Diät + Muster 241±3.2*6.4±2.9*Fettreiche Diät + Muster 128±2.7#1.9±0.2# Anmerkung: * - Die Unterschiede sind im Vergleich zu den Gruppen signifikant, die mit einer Standarddiät gehalten wurden, # - die Unterschiede sind im Vergleich zu den Gruppen „fettreiche Diät“ und „fettreiche Diät + Muster 2“ signifikant.

[0077] Somit demonstrierte das Muster 1 (Iteration Nr. 3 von Adipozyten) die Fähigkeit, der Entwicklung eines metabolischen Syndroms und einer pathologischen Fettbildung bei Mäusen entgegenzuwirken.

[0078] Beispiel 3. Iterationen, die unter Verwendung von Zellen eines Maus-Melanoms oder von Keratinozyten und Wasser als neutrales Trägermittel gewonnen wurden.

[0079] Der Prozess der Gewinnung der Iterationen umfasste mehrere Etappen. Ein 5-Milliliter-Fläschchen mit einer frisch zubereiteten Suspension von Zellen eines Maus-Melanoms der Linie B16 (1,0×10<6>Zellen/ml) oder mit einer Suspension aus primären normalen Keratinozyten (1,0×10<6>Zellen/ml) in einem Umfang von 5 ml und ein 40-Milliliter-Fläschchen mit gereinigtem Wasser (neutrales Trägermittel) in einem Umfang von 35 ml wurden auf einem Vortex während zehn Sekunden einer Rotation mit 3000 U/min in einem engen Kontakt ausgesetzt. Danach inkubierte man beide Fläschchen während einer Minute bei Zimmertemperatur in einem engen Kontakt. Mit Hilfe der oben beschriebenen Prozedur wurden 35 ml der I<0>(Iteration 0) gewonnen.

[0080] Danach wurde ein 40-Milliliter-Fläschchen mit der I<0>(35 ml) neben einem neuen 40-Milliliter-Fläschchen mit 35 ml des neutralen Trägermittels angeordnet und während zehn Sekunden mit 3000 U/min in einem engen Kontakt bewegt. Danach inkubierte man die beiden Fläschchen während einer Minute bei Zimmertemperatur in einem engen Kontakt. Das erhaltene Fläschchen mit dem neutralen Trägermittel wurde als I<1>bezeichnet. Danach wiederholte man die Prozedur zur Gewinnung einer nächsten Iteration (Nr. 2, Nr. 3 usw.) mehrfach, wobei das Fläschchen mit einer neuen Portion des neutralen Trägermittels und ein Fläschchen der vorangegangenen Iteration zusammen per Wirbelverfahren bewegt wurden.

[0081] Die Temperatur und Feuchtigkeit im Labor während der Vorbereitung der Muster und der nachfolgenden Messungen wurden mit Hilfe des Thermohygrographen IVA-6N kontrolliert; die Temperatur betrug 22±3 °C, der Feuchtigkeitsgrad - 20-70 %. Für die Zubereitung der Iterationen verwendete man durchsichtige Fläschchen aus Borosilikatglas (mit einem Volumen von 40 und 60 ml, Glastechnik Grafenroda, Infochroma AG, Schweiz) oder Reagenzgläser (mit einem Volumen von 100, 250 und 500 ml, Simax, Tschechien).

[0082] Als neutrales Trägermittel für die Zubereitung der Iterationen, aber auch für alle anderen Reagenzien, die in dieser Arbeit verwendet werden, wurde Wasser des Typs 1 (ultrareines) mit einem spezifischen Widerstand von 18,2 mΩ×cm (Milli-Q Integral 5, Millipore) genutzt. Die Qualität des gereinigten Wassers wurde täglich durch eine Messung des spezifischen Widerstands mit Hilfe des Konduktometers SevenCompact S230 (Mettler Toledo) kontrolliert, und die Kontrolle des pH-Wertes mit Hilfe des pH-Messgerätes SevenCompact S220 (Mettler Toledo). Für die Flüssigkeiten verwendete man automatische Pipetten unterschiedlichen Volumens (Eppendorf, Deutschland; Socorex, Schweiz), aber auch gläserne Messgefäße der Genauigkeitsklasse A (Borosil, Indien; Steklopribor, Ukraine). Die trockenen Reagenzien wog man auf analytischen Waagen der Genauigkeitsklasse I (Pioneer PA214C, Ohaus, USA). Für die Messung der Zeit der Inkubation verwendete man einen geeichten Labortimer (Traceable, VWR). Die Vibrationseinwirkung erfolgte mit Hilfe des Basis-Shakers (Wirbel-Shaker) MS 3 (IKA-Werke, Deutschland) mit einem Standardeinsatz.

[0083] In dieser Untersuchung verwendete man die I<7>(Iteration Nr. 7), die unter Verwendung der zellulären Linie des Maus-Melanoms B16 als Ausgangsstoff gewonnen wurde (im Weiteren - Muster 1) und die I<23>(Iteration Nr. 23), die unter Verwendung einer Suspension primärer normaler Keratinozyten gewonnen wurde (im Weiteren - Muster 3). Die Aufteilung der gewonnenen Iterationen erfolgte nach Fraktionen, wie im Beispiel 1 beschrieben wurde.

[0084] Die Untersuchung erfolgte an einer zellulären Linie des Maus-Melanoms B16. Gebildet wurden die folgenden Gruppen: die erste - eine intakte (n=3), die zweite - mit einem Hinzufügen des Referenzpräparats Docetaxel in einer Dosis von 40 µg/ml (n=3), die dritte - mit einem Hinzufügen des Musters 1 (Iteration Nr. 7, n=3), die vierte - mit einem Hinzufügen des Musters 2 (Placebo, bei dem es sich um gereinigtes Wasser handelte, n=3 als Wiederholung), die fünfte - mit einem Hinzufügen des Musters 3 (Iteration Nr. 23, n=3). Die Zellen kultivierte man auf 96-Well-Platten bei einem Gesamtvolumen von 200 µl/Well und bei einer Konzentration von 15.000 Zellen je Well (Vertiefung). Die Testmuster brachte man in ein Medium in einem Umfang von 50 µl auf 150 ml des Mediums ein und inkubierte sie im Verlauf von 24 Stunden. Als Kontrollmuster verwendete man ein komplettes (kulturales) Nährmedium. Die Zellkultur wurde in einen Inkubator mit 5-%-igen CO<2>bei einer Temperatur von 37 °C und relativen Feuchtigkeit von 45 % gegeben. Als Nährmedium verwendete man DMEM/F12 unter Hinzufügung eines 10-%-igen fetalen Rinderserums, von 0,3 mg/ml L-Glutamin sowie 50 Units/ml Penicillin und 50 µg/ml Streptomycin.

[0085] Die direkte zytotoxische Wirkung beurteilte man mit Hilfe des MTT-Tests. Die Zellen inkubierte man mit den zu untersuchenden Präparaten bei einer Temperatur von 37 °C in einem 5-%-igen CO<2>-Milieu im Verlauf 24±4 Stunden. Danach entfernte man das Medium und fügte in jede Vertiefung (Well) ein MTT-Reagens, das in DMEM/F-12 aufgelöst worden war, bis zu einer Endkonzentration von 0,5 mg/ml hinzu und inkubierte alles unter den gleichen Bedingungen während vier Stunden. Danach fügte man 100 µl DMSO (Dimethylsulfoxid) hinzu. Formazan löste man im Verlauf von 15 Minuten bei Zimmertemperatur auf. Und danach bestimmte man die Absorption bei einer Wellenlänge von 540 nm mit dem Microplate-Reader Multiskan GO.

[0086] Die Apoptose der Tumorzellen analysierte man mit Hilfe der Durchflusszytometrie mit einer Einfärbung mittels Annexin V. Die Zellen entfernte man aus dem Tablet mit Hilfe einer 0,05-%-igen Trypsin-Lösung, zentrifugierte sie in einer phosphatgepufferten Salzlösung, und die Granula resuspendierte man in einem einmal bindenden Puffer in einer Konzentration von 1×10<6>/ml. 1×10<5>Zellen in einem Umfang von 100 µl in einem einmal bindenden Puffer gab man in Eppendorf-Röhrchen. Man fügte 5 µl des Farbstoffs Annexin V-AF 488 hinzu, vermischte und inkubierte alles im Dunkeln während 15 Minuten bei Zimmertemperatur. Den Mustern fügte man 1 µl einer Lösung von Propidiumiodid (PI) mit einer Konzentration von 100 µg/ml hinzu, vermischte und inkubierte alles im Dunkeln während fünf Minuten bei Zimmertemperatur. Den Zellen fügte man 0,4 ml eines einmal bindenden Puffers hinzu. Die gesamte Menge wurde in zytometrische Reagenzgläser gegeben und mit dem Durchlusszytometer NovoCyte Advanteon analysiert. Entsprechend den Ergebnissen der Untersuchung bestimmte man den Prozentsatz der apoptotischen Zellen.

[0087] Bei der statistischen Verarbeitung der Ergebnisse beurteilte man die Normalität der Verteilung mit Hilfe des Shapiro-Wilk-Tests, und die Homogenität der Dispersion - mit Hilfe des Bartlett-Tests. Den Vergleich der Gruppen nahm man mit Hilfe einer Dispersionsanalyse und des Dunn-Tests vor. Verwendet wurde die Holm-(Bonferroni-) Korrektur für die zahlreichen Gleichungen. Die Unterschiede zwischen den Gruppen wurden bei p<0,05 als statistisch signifikante angesehen.

[0088] Die Ergebnisse der Untersuchungen sind in den Tabellen 3 und 4 ausgewiesen worden. Dargestellt wird, dass sowohl die Iterationen der Zellen des Melanoms (Muster 1) als auch die Iterationen der gesunden Keratinozyten (Muster 3) die funktionale metabolische Aktivität der Kultur der Zellen des Melanoms B16 im Vergleich zum Placebo (Muster 2) und der intakten Gruppe verringerten. Diese Ergebnisse decken sich mit den Daten der Durchflusszytometrie, bei der eine statistisch signifikante Zunahme des Anteils der Zellen, die einer Apoptose ausgesetzt wurden, im Vergleich zum Placebo in den Gruppen mit Docetaxel (besonders spürbare), aber auch in den Gruppe 1 und 3 beobachtet wurde.

Tabelle 3. Ergebnisse des MTT-Tests (M±m)

[0089] Muster 10.71±0.40 * #Muster 21.57±0.33Muster 30.65±0.28 * #Kontrollgruppe1.45±0.21Docetaxel0.49±0.16 * # Anmerkung: * - die Unterschiede sind im Vergleich zum Muster 2 (Placebo) signifikant), # - die Unterschiede sind im Vergleich zur intakten Gruppe signifikant.

Tabelle 4. Ergebnisse der Durchflusszytometrie (M±m)

[0090] % der apoptotischenZellen34±12* #5±246±24* #3±196±7* # Anmerkung: * - die Unterschiede sind im Vergleich zum Muster 2 (Placebo) signifikant),<#>- die Unterschiede sind im Vergleich zur intakten Gruppe signifikant.

[0091] Somit war die Fähigkeit der Iterationen sowohl der Tumor- als auch der gesunden Zellen demonstriert worden, die metabolische Aktivität der Kultur von Tumorzellen zu unterdrücken, aber auch deren Apoptose zu induzieren.

[0092] Beispiel 4. Iterationen, die unter Verwendung der Schilddrüse und von Wasser als neutrales Trägermittel gewonnen wurden.

[0093] Der Prozess der Gewinnung der Iterationen umfasste mehrereStufen. Ein 5-Milliliter-Fläschchen mit einer Schilddrüse (14,6 mg) einer ausgewachsenen männlichen Wistar-Ratte im Umfang von 5 ml und ein 40-Milliliter-Fläschchen mit gereinigtem Wasser (neutrales Trägermittel) in einem Umfang von 35 ml wurden auf einem Vortex während zehn Sekunden einer Rotation mit 3000 U/min in einem engen Kontakt ausgesetzt. Danach inkubierte man beide Fläschchen während einer Minute bei Zimmertemperatur in einem engen Kontakt. Mit Hilfe der oben beschriebenen Prozedur wurden 35 ml der I<0>(Iteration 0) gewonnen.

[0094] Danach wurde ein 40-Milliliter-Fläschchen mit der I<0>(35 ml) neben einem neuen 40-Milliliter-Fläschchen mit 35 ml des neutralen Trägermittels angeordnet und während zehn Sekunden mit 3000 U/min in einem engen Kontakt bewegt. Danach inkubierte man die beiden Fläschchen während zwei Minuten bei Zimmertemperatur in einem engen Kontakt. Das erhaltene Fläschchen mit dem neutralen Trägermittel wurde als I<1>bezeichnet. Danach wiederholte man die Prozedur zur Gewinnung einer nächsten Iteration (Nr. 2, Nr. 3 usw.) mehrfach, wobei das Fläschchen mit einer neuen Portion des neutralen Trägermittels und ein Fläschchen der vorangegangenen Iteration zusammen per Wirbelverfahren bewegt wurden.

[0095] Die Temperatur und Feuchtigkeit im Labor während der Vorbereitung der Muster und der nachfolgenden Messungen wurden mit Hilfe des Thermohygrographen IVA-6N kontrolliert; die Temperatur betrug 22±3 °C, der Feuchtigkeitsgrad - 20-70 %. Für die Zubereitung der Iterationen verwendete man durchsichtige Fläschchen aus Borosilikatglas (mit einem Volumen von 40 und 60 ml, Glastechnik Grafenroda, Infochroma AG, Schweiz) oder Reagenzgläser (mit einem Volumen von 100, 250 und 500 ml, Simax, Tschechien).

[0096] Als neutrales Trägermittel für die Zubereitung der Iterationen, aber auch für alle anderen Reagenzien, die in dieser Arbeit verwendet werden, wurde Wasser des Typs 1 (ultrareines) mit einem spezifischen Widerstand von 18,2 mΩ×cm (Milli-Q Integral 5, Millipore) genutzt. Die Qualität des gereinigten Wassers wurde täglich durch eine Messung des spezifischen Widerstands mit Hilfe des Konduktometers SevenCompact S230 (Mettler Toledo) kontrolliert, und die Kontrolle des pH-Wertes mit Hilfe des pH-Messgerätes SevenCompact S220 (Mettler Toledo). Für die Flüssigkeiten verwendete man automatische Pipetten unterschiedlichen Volumens (Eppendorf, Deutschland; Socorex, Schweiz), aber auch gläserne Messgefäße der Genauigkeitsklasse A (Borosil, Indien; Steklopribor, Ukraine). Die trockenen Reagenzien wog man auf analytischen Waagen der Genauigkeitsklasse I (Pioneer PA214C, Ohaus, USA). Für die Messung der Zeit der Inkubation verwendete man einen geeichten Labortimer (Traceable, VWR). Die Vibrationseinwirkung erfolgte mit Hilfe des Basis-Shakers (Wirbel-Shaker) MS 3 (IKA-Werke, Deutschland) mit einem Standardeinsatz.

[0097] In dieser Untersuchung wurde die I<4>(Iteration Nr. 4) verwendet (im Weiteren Muster 2). Die Aufteilung der gewonnenen Iterationen nach Fraktionen erfolgte, wie im Beispiel 1 beschrieben wurde.

[0098] Bei der Arbeit wurde eines der stärksten physiologischen Modelle für eine Adipositas und ein metabolisches Syndrom verwendet, bei dem die Dysfunktion der Schilddrüse eine begleitende Pathologie ist. Die Untersuchung erfolgte an männlichen Wistar-Ratten mit einer Masse von 160-180 g und einem Alter von 1,5-2 Monaten (n=60). Die Tiere wurden nach dem Zufallsprinzip in fünf Gruppen mit jeweils zwölf Tieren in jeder Gruppe aufgeteilt. In der ersten Gruppe erhielten die Ratten eine Standarddiät, in der zweiten - eine Standarddiät und das Muster 1 (Placebo, gereinigtes Wasser) ab der 9. Woche, in der dritten - eine fettreiche Diät, in der vierten - eine fettreiche Diät und das Muster 1 (Placebo, gereinigtes Wasser) ab der 9. Woche, in der fünften - eine fettreiche Diät und das Muster 2 (die Iteration Nr. 4) ab der 9. Woche. Die Standarddiät umfasst granuliertes Futter entsprechend der bestätigten Ration für Labortiere in einem Vivarium. Eine kalorienreiche Ration umfasste granuliertes Futter und zusätzlich Speck (45 % vom Kaloriengehalt der Standardration). Das Trinkwasser wurde durch eine 10-%-ige Fruktose-Lösung ersetzt. Solch eine Ration löst die Entwicklung eines metabolischen Syndroms und eine Adipositas bei den experimentellen Tieren aus. Die zu testenden Muster und das Placebo wurden intraventrikulär einmal am Tag im Verlauf von acht Wochen in einem Umfang von 4 ml/kg verabreicht. Am Ende des Experiments wurde an den Tieren unter einer Narkose (Thiopental-Natrium) eine Dekapitation vorgenommen. Bei der Arbeit mit den Tieren wurden alle allgemein üblichen Standards der experimentellen Ethik (Richtlinie 2010/63/EU des Europäischen Parlaments und des Rates vom 22. September 2010 zum Schutz der für wissenschaftliche Zwecke verwendeten Tiere) eingehalten.

[0099] Die Körpermasse der Tiere registrierte man bis zum Beginn des Experiments, und danach allwöchentlich im Verlauf von 16 Wochen. Die Bestimmung der Masse des viszeralen Fetts erfolgte nach Herauslösung der Tiere aus dem Experiment durch eine Herauslösung der im Bereich der Nieren liegenden (perinephralen) epididymalen Fettablagerungen und ihrem Wiegen.

[0100] Am Ende der Untersuchung (12 bis 16 Stunden vorher) und vor der Entnahme von Blut entzog man den Tieren die Nahrung. Vor der Nekroskopie erfasste man vermischtes arterielles und venöses Blut mit dem Verfahren einer Dekapitation. Nach der Gerinnung zentrifugierte man die Blutproben bei 3000 U/min während 20 Minuten für den Erhalt von Serum. Die Bestimmung der Hormone im Blutserum (T3 und T4) erfolgte mit dem Verfahren der Immunfermentanalyse unter Verwendung der kommerziellen Fine-Sets und eines Microtab-Readers.

[0101] Das Schilddrüsen-Gewebe für eine Analyse des TPO-Wertes ist entsprechend dem anatomischen Atlas einer Ratte nach Herauslösung der Tiere aus dem Experiment eingesammelt bzw. erfasst worden. Die Homogenisierung der Gewebe erfolgte in einem Phosphatpuffer mit einer Konzentration von 0,05 mol/l (pH-Wert: 7,4) mit Hilfe des Homogenisators IKA T10 basic UltraTurrax. Die Homogenate bereitete man in einer Verdünnung im Verhältnis von 1:80 vor, zentrifugierte sie bei einer Temperatur von 4 °C und bei 10 667 g in der Zentrifuge Allegra 64R (Beckman Coulter). Das Supernatant erfasst man und bestimmte den Eiweißgehalt mit der Biuret-Methode im automatischen biochemischen Analysegerät Mindrey BS 200 unter Verwendung von Diassens-Reagenzien-Sets. Die spektrophotometrischen Untersuchungen wurden mit dem Spektralfluorimeter SOLAR CM 2203 durchgeführt. Die Pufferlösung und die anderen Komponenten wurden in eine für thermostatische Messungen bestimmte Küvette gegeben (mit einer Breite der optischen Schicht von 1 cm). Das Endvolumen des Inkubationsgemischs machte rund 3 ml aus. Der Inhalt der Küvette wurde während drei Minuten bei einer Temperatur von 25 °C aufbewahrt. Nach Hinzufügen von Wasserstoffperoxid mischte man das Muster durch und registrierte die optische Dichte bei einer Wellenlänge von 353 nm während ein bis drei Minuten.

[0102] Die statistische Verarbeitung der Ergebnisse erfolgte mit Hilfe des Programms Statistica 10 (Tibco, USA). Die Normalität der Verteilung wurde mit Hilfe des Shapiro-Wilk-Tests bewertet, die Homogenität der Dispersion - mit Hilfe des Bartlett-Tests. Der Vergleich der Gruppe erfolgte mit Hilfe des Student's_t-Tests und des Mann-Whitney-Tests. Die Unterschiede wurden bei p<0,05 als statistisch signifikante angesehen.

[0103] Die Haltung der Tiere mit einer fettreichen Diät führte zu einer erheblichen Zunahme der Körpermasse und der Masse des viszeralen Fetts. Es wurde aufgezeigt, dass das perorale Verabreichen des Placebos (Muster 1) keinen wesentlichen Einfluss auf die Tiere ausübte, die sowohl mit einer Standards- als auch fettreichen Diät gefüttert wurden. Zur gleichen Zeit führte das achtwöchige Verabreichen des Musters 2 (Iteration der Schilddrüse) an die Tiere zu einer unerheblichen Verringerung von Adiposität-Erscheinungen (siehe Tab. 5). Das Verabreichen des Schilddrüsen-Präparats an die Tiere führte zu einer Verringerung der Gesamtmasse des Körpers und zu einer statistisch signifikanten Verringerung der Masse des viszeralen Fetts.

Tabelle 5. Ergebnisse der Bestimmung der Masse des viszeralen Fetts (M±m)

[0104] Standarddiät190±12.14.85±2.1Standarddiät + Muster 1181±18.46.92±1.3Fettreiche Diät248±14.6*15.86±5.2*Fettreiche Diät + Muster 1253±20.0*14.32±3.7*Fettreiche Diät + Muster 2225±12.1*8.04±2.9# Anmerkung: * - Die Unterschiede sind im Vergleich zu den Gruppen signifikant, die mit einer Standarddiät gehalten wurden, # - die Unterschiede sind im Vergleich zu den Gruppen „fettreiche Diät“ und „fettreiche Diät + Muster 1“ signifikant.

[0105] Die Untersuchung des Einflusses der Ration und des Musters (Iterationen der Schilddrüse) auf die funktionale Aktivität der Schilddrüse hat gezeigt, dass eine fettreiche Diät Symptome einer Hypothyreose - eine Verringerung der Aktivität der Thyreoperoxidase (TPO) und eine Erhöhung des Thyroxin-Spiegels (siehe Tab. 6) - auslöst. Die Verabreichung des Musters 2 (Iterationen der Schilddrüse) an die Tiere erlaubte, diese Veränderungen zu kompensieren, indem die Werte dem Niveau der Gruppen, die eine Standarddiät erhalten hatten, angenähert wurden.

Tabelle 6. Biochemische Werte für die funktionale Aktivität der Schilddrüse (M±m)

[0106] Standarddiät

2.8±0.1

53.9±13.5

0.41±0.04

Standarddiät + Muster 1

2.1±0.5

47.6±10.4

0.38±0.02

Fettreiche Diät

2.5±0.3

71.3±16.9*

0.27±0.02*

Fettreiche Diät + Muster 1

2.2±0.3

68.4±18.2*

0.30±0.01*

Fettreiche Diät + Muster 2

2,1±0,4

59,2±11,6#

0,37±0,03#

Anmerkung: * - Die Unterschiede sind im Vergleich zu den Gruppen signifikant, die mit einer Standarddiät gehalten wurden, # - die Unterschiede sind im Vergleich zu den Gruppen „fettreiche Diät“ und „fettreiche Diät + Muster 1“ signifikant.

[0107] So hat das achtwöchige Verabreichen der Schilddrüsen-Iteration an die Ratten, die mit einer fettreichen Diät gehalten wurden, erlaubt, die gestörte Funktion der Schilddrüse wiederherzustellen, aber auch die Ablagerungen von viszeralem Fettgewebe zu verringern.

[0108] Beispiel 5. Iterationen, die unter Verwendung eines Grippe-Virus und von Wasser als neutrales Trägermittel gewonnen wurden.

[0109] Der Prozess der Gewinnung der Iterationen umfasste mehrere Etappen. Ein 5-Milliliter-Fläschchen mit einer frisch zubereiteten Ausgangslösung (A/California/04/2009 pndm (H1N1),104 TCID50 /0,1 ml) in einem Umfang von 5 ml und ein 40-Milliliter-Fläschchen mit gereinigtem Wasser (neutrales Trägermittel) in einem Umfang von 35 ml wurden auf einem Vortex während zehn Sekunden einer Rotation mit 3000 U/min in einem engen Kontakt ausgesetzt. Danach inkubierte man beide Fläschchen während einer Minute bei Zimmertemperatur in einem engen Kontakt. Mit Hilfe der oben beschriebenen Prozedur wurden 35 ml der I<0>(Iteration 0) gewonnen.

[0110] Danach wurde ein 40-Milliliter-Fläschchen mit der I<0>(35 ml) neben einem neuen 40-Milliliter-Fläschchen mit 35 ml des neutralen Trägermittels angeordnet und während fünfzehn Sekunden mit 3000 U/min in einem engen Kontakt bewegt. Danach inkubierte man die beiden Fläschchen während einer Minute bei Zimmertemperatur in einem engen Kontakt. Das erhaltene Fläschchen mit dem neutralen Trägermittel wurde als I<1>bezeichnet. Danach wiederholte man die Prozedur zur Gewinnung einer nächsten Iteration (Nr. 2, Nr. 3 usw.) mehrfach, wobei das Fläschchen mit einer neuen Portion des neutralen Trägermittels und ein Fläschchen der vorangegangenen Iteration zusammen per Wirbelverfahren bewegt wurden.

[0111] Die Temperatur und Feuchtigkeit im Labor während der Vorbereitung der Muster und der nachfolgenden Messungen wurden mit Hilfe des Thermohygrographen IVA-6N kontrolliert; die Temperatur betrug 22±3 °C, der Feuchtigkeitsgrad - 20-70 %. Für die Zubereitung der Iterationen verwendete man durchsichtige Fläschchen aus Borosilikatglas (mit einem Volumen von 40 und 60 ml, Glastechnik Grafenroda, Infochroma AG, Schweiz) oder Reagenzgläser (mit einem Volumen von 100, 250 und 500 ml, Simax, Tschechien).

[0112] Als neutrales Trägermittel für die Zubereitung der Iterationen, aber auch für alle anderen Reagenzien, die in dieser Arbeit verwendet werden, wurde Wasser des Typs 1 (ultrareines) mit einem spezifischen Widerstand von 18,2 mΩ×cm (Milli-Q Integral 5, Millipore) genutzt. Die Qualität des gereinigten Wassers wurde täglich durch eine Messung des spezifischen Widerstands mit Hilfe des Konduktometers SevenCompact S230 (Mettler Toledo) kontrolliert, und die Kontrolle des pH-Wertes mit Hilfe des pH-Messgerätes SevenCompact S220 (Mettler Toledo). Für die Flüssigkeiten verwendete man automatische Pipetten unterschiedlichen Volumens (Eppendorf, Deutschland; Socorex, Schweiz), aber auch gläserne Messgefäße der Genauigkeitsklasse A (Borosil, Indien; Steklopribor, Ukraine). Die trockenen Reagenzien wog man auf analytischen Waagen der Genauigkeitsklasse I (Pioneer PA214C, Ohaus, USA). Für die Messung der Zeit der Inkubation verwendete man einen geeichten Labortimer (Traceable, VWR). Die Vibrationseinwirkung erfolgte mit Hilfe des Basis-Shakers (Wirbel-Shaker) MS 3 (IKA-Werke, Deutschland) mit einem Standardeinsatz.

[0113] In dieser Untersuchung wurde die I<8>(Iteration Nr. 8) verwendet (im Weiteren - Muster 1). Die Aufteilung der gewonnenen Iterationen nach Fraktionen erfolgte, wie im Beispiel 1 beschrieben wurde.

[0114] In der Untersuchung wurde die zytotoxische und Antivirus-Aktivität der Iterationen eines Grippevirus in vitro beurteilt. Die Untersuchung erfolgte mit einer Kultur von MDCK-Zellen. Für die Experimente wurden die folgenden experimentellen Gruppen gebildet: erste Gruppe (Kontrollgruppe) - Zellen die mit dem Virus infiziert wurden und denen man weder zu testende Muster noch ein Referenzpräparat hinzufügte (n=5), zweite Gruppe - den mit dem Virus infizierten Zellen wurde das Referenzpräparat Oseltamivir-Carboxylat in einer Dosis von 10 µM hinzugefügt (n=5), dritte bis zehnte Gruppe - zu testendes Muster 1 (Iteration Nr. 8), das den Zellen, die mit dem Virus infiziert wurden, in vier unterschiedlichen Mengen hinzugefügt wurde (n=5 für jede Gruppe), elfte bis achtzehnte - den Zellen, die mit dem Virus infiziert wurden, fügte man die Test-Probe 2 (ein Placebo, gereinigtes Wasser), in vier verschiedenen Mengen hinzu (n=5 für jede Gruppe). Die Muster wurden in Form von Wasserlösungen verwendet. Die Zellkultur wurde in einem Inkubator mit einer 5-%-igen CO<2>-Konzentration bei einer Temperatur von 37 °C und relativen Feuchtigkeit von 45 % aufbewahrt. Als Nährmedium verwendete man DMEM/F12 unter Hinzufügung eines 10-%-igen Rinderserums, von 0,3 mg/ml L-Glutamin und eines Gemischs von Antibiotika, bestehend aus 50 Units/ml Penicillin und 50 µg/ml Streptomyzin.

[0115] Für die Beurteilung der zytotoxischen Wirkung der zu untersuchenden Muster wurde ein MTT-Test durchgeführt. Getestet wurden mehrere Endverdünnungen der zu untersuchenden Muster: 1/4, 1/8, 1/16, 1/32 (in Mengenanteilen vom Gesamtumfang des Inkubationsmediums). Nach der Entfernung des Mediums aus den Tablets gab man in jede Öffnung (Well) eine MTT-Lösung. Nach einer Inkubation während vier Stunden in einem CO<2>-Inkubator entfernte man die Lösung fügte DMSO hinzu. Nach dem Durchmischen und der Inkubation nahm man Messungen der Absorption bei 540 und 670 nm vor. Als eine zulässige Konzentration wurde die Konzentration des Präparats angenommen, die den Wert OD540 im Vergleich zu den Kontrollzellen nicht veränderte.

[0116] Das Testen der Antivirus-Aktivität der Präparate nahm man mit einer Kultur von MDCK-Zellen vor. Die Zellen wurden auf einer 96-Well-Platte ausgesät und während 24 Stunden bei einer Temperatur von 37 °C in einer 5-%-igen CO<2>-Atmosphäre bis zur Bildung einer Monoschicht inkubiert. Die zu testenden Präparate fügte man der Zellkultur 24 Stunden vor der Inokulation des Grippevirus A (A/California/04/09 (H1N1)) hinzu. Die zu untersuchenden Muster in einem Umfang von 100 µl im Medium fügte man der Zellkultur in zwei Mengen hinzu, die entsprechend den Ergebnissen der Beurteilung der zytotoxischen Wirkung ausgewählt wurden (maximale nichttoxische Dosen). Die Infizierung mit dem Virus nahm man 24 Stunden nach Hinzufügen der zu testierenden Muster vor. Der Virus wurde in die Zellkultur in einer Menge eingebracht, die für das Erreichen einer Dosis von 1 und 0,1 PFU/Zelle (Volumen: 100 µl) in der Kultur notwendig ist. Nach der Inkubation der infizierten Zellen mit den zu untersuchenden Mustern fixierten und bestimmten die Zellen etwa nach 24 Stunden nach der Infizierung der Kultur (bis zum Auftreten der ersten Anzeichen einer Zytotoxizität in den Kontrollzellen) eine Reproduktion des Virus durch eine Bestimmung des Grades der expression der Virus-Antigene (NP und M1) mit dem IFA-Verfahren.

[0117] Die statistische Analyse wurde mit Hilfe des Statistik-Pakets R 3.2.1 (R Foundation for Statistical Computing, Wien, Österreich) vorgenommen. Die Daten überprüfte man auf das Vorhandensein von Auswürfen unter Verwendung der Regel 1,5*IQR (Interquartil-Abstand). Die Relevanz der Unterschiede in den Werten für die optische Dichte bewertete man mit Hilfe des Kruskal-Wallis-Tests und mit dem Dunn-Post-hoc-Test. Die Unterschiede zwischen den Gruppen wurden bei p<0,05 als statistisch signifikante angesehen.

[0118] Laut den Angaben des MTT-Tests wurde der Tod einer erheblichen Anzahl von Zellen beim Verabreichen des Musters 1 (Iteration Nr. 8) und des Musters 2 (Placebo) beobachtet (aber auch von gereinigtem Wasser zur Kontrolle) in einer Konzentration von ¼ vom Volumen des Wells. Daher wurden für das weitere Studium der Antivirus-Aktivität der zu testenden Muster in der Kultur der MDCK-Zellen die Dosen 1/8 und 1/16 als maximale verträgliche Dosen (MTD) der Muster ausgewählt, die keine zytotoxische Wirkung auf die Zellen ausüben.

[0119] Im Muster wurde eine starke Inhibierung der Aktivität des Virus beobachtet (siehe Tab. 7). Dieser Wert war mit dem Wert für die Inhibierung durch das Referenzpräparat Oseltamivir Carboxylat, das wiederum ein goldener Standard für die Grippe-Therapie ist, vergleichbar. Signifikante Unterschiede wurden zwischen dem Muster 1 (Iteration Nr. 8) (1/8 der Dosis) und dem Muster 2 (Placebo) demonstriert.

Tabelle 7. Antivirus-Aktivität der Testmuster in vitro (ausgewiesen wurden die Mittelwerte für die optische Dichte und der Grad der Inhibierung der Virus-Aktivität in % von den entsprechenden Kontrollmustern).

[0120] 1/161/8OD%OD%Muster 11.22931.60.172 **100Muster 21.54817.21.08429.4Oseltamivir-Carboxylat10 µMOD%0.352100Kontrollmuster zum VirusOD1.878Grippevirus A (0.1 PFU/Zelle)1/161/8OD%OD%Muster 10.2341000.183*97Muster 20.845-0.68112,4Oseltamivir-Carboxylat10 µMOD%0.512100Kontrollmuster zum VirusOD0.899 Anmerkung: * - p<0, 05 für 0,1 PFU/Zelle; ** - p<0,001 für die Mannigfaltigkeit der Infektion 1 PFU/Zelle.

[0121] Somit haben die Iterationen des Grippevirus eine Antivirus-Aktivität demonstriert, die der Effektivität des Präparats im Vergleich zu Oseltamivir Carboxylat nicht nachstand.

[0122] Beispiel 6. Iterationen, die unter Verwendung einer Bakterie und von Wasser als neutrales Trägermittel gewonnen wurden.

[0123] Der Prozess der Gewinnung der Iterationen umfasste mehrere Etappen. Ein 5-Milliliter-Fläschchen mit einer frisch zubereiteten Ausgangslösung (Bakterien Salmonella enteritidis rif92, 1,35×10<6>KBE/ml) in einem Umfang von 5 ml und ein 40-Milliliter-Fläschchen mit gereinigtem Wasser (neutrales Trägermittel) in einem Umfang von 35 ml wurden auf einem Vortex während zehn Sekunden einer Rotation mit 3000 U/min in einem engen Kontakt ausgesetzt. Danach inkubierte man beide Fläschchen während einer Minute bei Zimmertemperatur in einem engen Kontakt. Mit Hilfe der oben beschriebenen Prozedur wurden 35 ml der I<0>(Iteration 0) gewonnen.

[0124] Danach wurde ein 40-Milliliter-Fläschchen mit der I<0>(35 ml) neben einem neuen 40-Milliliter-Fläschchen mit 35 ml des neutralen Trägermittels angeordnet und während fünfzehn Sekunden mit 3000 U/min in einem engen Kontakt bewegt. Danach inkubierte man die beiden Fläschchen während zwei Minuten bei Zimmertemperatur in einem engen Kontakt. Das erhaltene Fläschchen mit dem neutralen Trägermittel wurde als I<1>bezeichnet. Danach wiederholte man die Prozedur zur Gewinnung einer nächsten Iteration (Nr. 2, Nr. 3 usw.) mehrfach, wobei das Fläschchen mit einer neuen Portion des neutralen Trägermittels und ein Fläschchen der vorangegangenen Iteration zusammen per Wirbelverfahren bewegt wurden.

[0125] Die Temperatur und Feuchtigkeit im Labor während der Vorbereitung der Muster und der nachfolgenden Messungen wurden mit Hilfe des Thermohygrographen IVA-6N kontrolliert; die Temperatur betrug 22±3 °C, der Feuchtigkeitsgrad - 20-70 %. Für die Zubereitung der Iterationen verwendete man durchsichtige Fläschchen aus Borosilikatglas (mit einem Volumen von 40 und 60 ml, Glastechnik Grafenroda, Infochroma AG, Schweiz) oder Reagenzgläser (mit einem Volumen von 100, 250 und 500 ml, Simax, Tschechien).

[0126] Als neutrales Trägermittel für die Zubereitung der Iterationen, aber auch für alle anderen Reagenzien, die in dieser Arbeit verwendet werden, wurde Wasser des Typs 1 (ultrareines) mit einem spezifischen Widerstand von 18,2 mΩ×cm (Milli-Q Integral 5, Millipore) genutzt. Die Qualität des gereinigten Wassers wurde täglich durch eine Messung des spezifischen Widerstands mit Hilfe des Konduktometers SevenCompact S230 (Mettler Toledo) kontrolliert, und die Kontrolle des pH-Wertes mit Hilfe des pH-Messgerätes SevenCompact S220 (Mettler Toledo). Für die Flüssigkeiten verwendete man automatische Pipetten unterschiedlichen Volumens (Eppendorf, Deutschland; Socorex, Schweiz), aber auch gläserne Messgefäße der Genauigkeitsklasse A (Borosil, Indien; Steklopribor, Ukraine). Die trockenen Reagenzien wog man auf analytischen Waagen der Genauigkeitsklasse I (Pioneer PA214C, Ohaus, USA). Für die Messung der Zeit der Inkubation verwendete man einen geeichten Labortimer (Traceable, VWR). Die Vibrationseinwirkung erfolgte mit Hilfe des Basis-Shakers (Wirbel-Shaker) MS 3 (IKA-Werke, Deutschland) mit einem Standardeinsatz.

[0127] In dieser Untersuchung wurde die Iteration I<11>(Iteration Nr. 11) verwendet (im Weiteren - Muster 1). Die Aufteilung der gewonnenen Iterationen nach Fraktionen erfolgte, wie im Beispiel 1 beschrieben wurde.

[0128] Die Untersuchung erfolgte an weiblichen C57Bl-Mäusen mit einer Masse von 21-24 g und einem Alter von acht Wochen. Die Tiefe infizierte man intragastral mit Salmonella enteritidis rif92 (1,35×10<6>KBE/Maus). Am 3. bis 7. Tag nach der Infizierung applizierte man den Mäusen der ersten beiden Gruppen (n=10 in jeder) intraventrikulär das Muster 1 (Iterationen der Bakterien Salmonella enteritidis rif92; 0,2 ml/Tag) oder das Muster 2 (Kontrollmuster, gereinigtes Wasser; 0,2 ml/Tag). Die Tiere der dritten Gruppe (n=10) dienten als positives Kontrollmuster. An den gleichen Tagen des Experiments applizierte man ihnen Ciprofloxacin (zweimal am Tag, intraventrikulär, jeweils 1 mg/kg (ED100)).

[0129] Am Ende der Untersuchung beurteilte man das Vorhandensein oder Ausbleiben von Salmonella enteritidis rif92 in der Leber und den Fäkalien der Mäuse. Bei Vorhandensein bestimmte man den Mittelwert für KBE/g, die Häufigkeit des Antreffens pathologischer Merkmale der inneren Organe (vergrößerte Mesenteriallymphknoten, eine vergrößerte Leber, eine vergrößerte Milz, nekrotische Herde und Blutungen in der Leber, der Milz und im Darm).

[0130] Bei der Arbeit mit den Tieren wurden alle allgemein üblichen Standards der experimentellen Ethik (Richtlinie 2010/63/EU des Europäischen Parlaments und des Rates vom 22. September 2010 zum Schutz der für wissenschaftliche Zwecke verwendeten Tiere) eingehalten.

[0131] Die statistische Analyse der Ergebnisse wurde mit Hilfe des exakten Fisher-Tests vorgenommen, der paarweise Vergleich erfolgte mit Hilfe des Benjamini-Hochberg-Tests. Die Unterschiede zwischen den Gruppen wurden bei p<0,05 als statistisch signifikante angesehen.

[0132] Die Ergebnisse der Untersuchung sind in Tabelle 8 ausgewiesen worden.

Tabelle 8. Vorhandensein und Konzentration der Bakterien Salmonella enteritidis rif92 in der Leber und den Fäkalien der Mäuse, die mit dem Muster 1 oder mit Ciprofloxacin behandelt wurden.

[0133] Muster 1

37*

1.5×10<5>*

39*

1.1×10<5>*

Muster 2

84

8.9×10<7>

68

6.7×10<7>

Ciprofloxacin

40*

7.6×10<5>*

41*

1.9×10<6>*

Anmerkung: * - die Unterschiede sind im Vergleich zum Muster 2 signifikant 2 (p<0,05)

[0134] Es wurde aufgezeigt, dass das Muster 1 sowohl den Prozentsatz der erkrankten Tiere als auch die Konzentration des Pathogens in der Leber und den Fäkalien im Vergleich zum Muster 2 (Kontrollmuster) verringerte. Mehr noch, bei der Untersuchung des Pathogens in der Leber waren der Prozentsatz der erkrankten Tiere, aber auch der Durchschnittsgehalt an Salmonella enteritidis rif92 in dieser Gruppe minimale. Die Anzahl der Bakterien Salmonella enteritidis rif92 in den Fäkalien war um ein Mehrfaches verringert worden. Die therapeutische Aktivität des Musters 1 war mit der Wirkung des Referenzpräparats - des effektiven Antibiotikums Ciprofloxacin - vergleichbar.

[0135] Somit demonstrierte das Muster 1 (Iterationen der Bakterien Salmonella enteritidis rif92) eine erhebliche antibakterielle Wirkung gegenüber den Bakterien Salmonella enteritidis rif92. Die ermittelte Effektivität zeigte sich in einer Verringerung der bakteriellen Kontamination der Organe und der Anzahl der kranken Tiere.

[0136] Beispiel 7. Iterationen, die unter Verwendung eines einfachen Herpes-Virus und von Wasser als neutrales Trägermittel gewonnen wurden.

[0137] Der Prozess der Gewinnung der Iterationen umfasste mehrere Etappen. Ein 5-Milliliter-Fläschchen mit einer frisch zubereiteten Ausgangslösung (einfacher Herpes-Virus des Typs 2, 5,3 lg PFU/ml) in einem Umfang von 5 ml und ein 40-Milliliter-Fläschchen mit gereinigtem Wasser (neutrales Trägermittel) in einem Umfang von 35 ml wurden auf einem Vortex während zehn Sekunden einer Rotation mit 3000 U/min in einem engen Kontakt ausgesetzt. Danach inkubierte man beide Fläschchen während einer Minute bei Zimmertemperatur in einem engen Kontakt. Mit Hilfe der oben beschriebenen Prozedur wurden 35 ml der I<0>(Iteration 0) gewonnen.

[0138] Danach wurde ein 40-Milliliter-Fläschchen mit der I<0>(35 ml) neben einem neuen 40-Milliliter-Fläschchen mit 35 ml des neutralen Trägermittels angeordnet und während zwanzig Sekunden mit 3000 U/min in einem engen Kontakt bewegt. Danach inkubierte man die beiden Fläschchen während einer Minute bei Zimmertemperatur in einem engen Kontakt. Das erhaltene Fläschchen mit dem neutralen Trägermittel wurde als I<1>bezeichnet. Danach wiederholte man die Prozedur zur Gewinnung einer nächsten Iteration (Nr. 2, Nr. 3 usw.) mehrfach, wobei das Fläschchen mit einer neuen Portion des neutralen Trägermittels und ein Fläschchen der vorangegangenen Iteration zusammen per Wirbelverfahren bewegt wurden.

[0139] Die Temperatur und Feuchtigkeit im Labor während der Vorbereitung der Muster und der nachfolgenden Messungen wurden mit Hilfe des Thermohygrographen IVA-6N kontrolliert; die Temperatur betrug 22±3 °C, der Feuchtigkeitsgrad - 20-70 %. Für die Zubereitung der Iterationen verwendete man durchsichtige Fläschchen aus Borosilikatglas (mit einem Volumen von 40 und 60 ml, Glastechnik Grafenroda, Infochroma AG, Schweiz) oder Reagenzgläser (mit einem Volumen von 100, 250 und 500 ml, Simax, Tschechien).

[0140] Als neutrales Trägermittel für die Zubereitung der Iterationen, aber auch für alle anderen Reagenzien, die in dieser Arbeit verwendet werden, wurde Wasser des Typs 1 (ultrareines) mit einem spezifischen Widerstand von 18,2 mΩ×cm (Milli-Q Integral 5, Millipore) genutzt. Die Qualität des gereinigten Wassers wurde täglich durch eine Messung des spezifischen Widerstands mit Hilfe des Konduktometers SevenCompact S230 (Mettler Toledo) kontrolliert, und die Kontrolle des pH-Wertes mit Hilfe des pH-Messgerätes SevenCompact S220 (Mettler Toledo). Für die Flüssigkeiten verwendete man automatische Pipetten unterschiedlichen Volumens (Eppendorf, Deutschland; Socorex, Schweiz), aber auch gläserne Messgefäße der Genauigkeitsklasse A (Borosil, Indien; Steklopribor, Ukraine). Die trockenen Reagenzien wog man auf analytischen Waagen der Genauigkeitsklasse I (Pioneer PA214C, Ohaus, USA). Für die Messung der Zeit der Inkubation verwendete man einen geeichten Labortimer (Traceable, VWR). Die Vibrationseinwirkung erfolgte mit Hilfe des Basis-Shakers (Wirbel-Shaker) MS 3 (IKA-Werke, Deutschland) mit einem Standardeinsatz.

[0141] In dieser Untersuchung wurde die Iteration I<11>(Iteration Nr. 11) verwendet (im Weiteren - Muster 1). Die Aufteilung der gewonnenen Iterationen nach Fraktionen erfolgte, wie im Beispiel 1 beschrieben wurde.

[0142] Die Untersuchung erfolgte an weiblichen glatthaarigen Agouti-Meerschweinchen (400-420 g). Die Tiere wurden mit Herpes-Simplex-Viren des Typs 2 (Genitalherpes - Stamm EC) durch das Auftragen einer virushaltigen Flüssigkeit auf die skarifizierte Oberfläche der Genitalien infiziert. Das Muster 1 (Iteration HSV-2, n=15) oder das Muster 2 (Kontrollmuster, gereinigtes Wasser; n=15) applizierte man intraventrikulär mit jeweils 5 ml/kg zweimal täglich (Tagesdosis - 10 ml/kg) während 15 Tagen nach der Infizierung. Das Referenzpräparat - Aciclovir (KRKA, n=15) - applizierte man in einer Dosis von 50 mg/kg zweimal täglich (Tagesdosis - 100 ml/kg) während 15 Tagen nach der Infizierung. Die andere Gruppe bestand aus 15 Tieren, die das Muster 1 während 20 Tagen erhielten (5 ll/kg, zweimal am Tag) beginnend fünf Tage vor der Infizierung und während 15 Tagen nach der Infizierung. Beurteilt wurden die folgenden Parameter:

•

Schwere des Infektionsprozesses während zwei Monaten nach der Infizierung mit einer Bewertung der hauptsächlichen Merkmale der Erkrankung entsprechend einer 4-Punkte-Skala: Hyperämie, Aufgedunsenheit, spezifische Elemente (Bläschen, Pusteln, Geschwürbildungen), Aktivität der Tiere;

•

Virentiter in den Vaginalabstrichen am 2., 5., 8., 11., 15. und 60. Tag nach der Infizierung. Den Virengehalt in den Vaginalabstrichen beurteilte man mit Hilfe der VERO-Zellen (4-5×10<5>Zellen/ml). Als Testvirus verwendete man Herpes-Simplex-Viren des Typs 2, Stamm VN, mit einer Aktivität von 5,0-5,5 Lg TCD50/0,1 ml. Den Virus bereitete man im Eagle-Medium unter Hinzufügung von 100 µg/ml Streptomycin und 100 Units/ml Peniciilin in gleichen Mengen (jeweils 0,4 ml von jeder Komponenten) und inkubierte ihn in einem Inkubator bei einer Temperatur von +37 °C während 60 Minuten. Danach brachte man das Gemisch in die Kultur von VERO-Zellen (dabei hatte man das Wachstumsmedium entfernt, und die Monoschicht der Zellen wurde dreimal mit einer Hank-Lösung (HBSS durchgespült) ein und inkubierte es in einem Thermostat bei +37 °C während 45 Minuten. Mit Hilfe eins invertierten Mikroskops untersuchte man die zytopathische Wirkung des Virus im Verlauf des gesamten Zeitraums der Beobachtung der zellulären Monoschicht (nach 24, 48, 72 und 96 Stunden) und berechnete den Virentiter. Den Virentiter bestimmte man entsprechend den Standardmethoden und gab ihn in lg an.

[0143] Bei der Arbeit mit den Tieren wurden alle allgemein üblichen Standards der experimentellen Ethik (Richtlinie 2010/63/EU des Europäischen Parlaments und des Rates vom 22. September 2010 zum Schutz der für wissenschaftliche Zwecke verwendeten Tiere) eingehalten.

[0144] Für die statistische Verarbeitung der Ergebnisse verwendete man den Wilcoxon-Test, die einseitige ANOVA und die einseitige ANOVA mit erneuten Messungen, wonach man alle Gruppen untereinander mit Hilfe des Tukey-Post-hoc-Tests verglich. Die Unterschiede zwischen den Gruppen wurden bei p<0,05 als statistisch signifikante angesehen.

[0145] Die Ergebnisse der Untersuchung sind in Tabelle 9 ausgewiesen worden.

[0146] Es wurde gezeigt, dass der therapeutische und in einem noch größeren Maße der heilende und prophylaktische Einsatz des Musters 1 die Expressivität und die Dauer der allgemeinen und lokalen Symptome der Herpes-Infektion erheblich verringert, aber auch die Absonderung von Viren signifikant reduziert hatte. Es muss betont werden, dass sich das Muster 1 bei der therapeutischen und prophylaktischen Anwendung effektiver als das Referenzpräparat Aciclovir erwiesen hat, indem es die Dauer der klinischen Symptome im Vergleich zum Kontrollmuster verringerte, aber auch eine Schädigung der Schleimhaut vollkommen unterdrückte. Der Index für die therapeutische Wirkung des Musters 1 war bei einer heilenden und prophylaktischen Anwendung um das 4,6fache höher (p<0,05) als bei Aciclovir.

[0147] Somit demonstrierte das Muster 1 (Iteration HSV-2) eine spezifische Aktivität gegenüber dem genitalen Herpes-Simplex-Virus des Typs 2 (DNA-Virus HSV-2). Eine maximale therapeutische Wirkung wurde bei der Verwendung des Musters 1 (Iteration HSV-2) bei einem kombinierten (einem prophylaktischen und einem heilenden) Anwendungsschema beobachtet. Dabei wurden minimale klinische Erscheinungen einer Herpes-Virusinfektion und minimale Virentiter in den Abstrichen beobachtet. Hinsichtlich aller untersuchten Parameter übertraf das Muster 1 (Iteration HSV-2) bei einem kombinierten (prophylaktischen und therapeutischen) Einnahme-Schema das Vergleichspräparat Aciclovir.

[0148] Beispiel 8. Iterationen, die unter Verwendung von Leberzellen und Wasser als neutrales Trägermittel gewonnen wurden.

[0149] Der Prozess der Gewinnung der Iterationen umfasste mehrere Etappen. Ein 5-Milliliter-Fläschchen mit einer frisch zubereiteten Suspension von Leberzellen eines Schweins (1,0×10<6>Zellen/ml) in einem Umfang von 5 ml und ein 40-Milliliter-Fläschchen mit gereinigtem Wasser (neutrales Trägermittel) in einem Umfang von 35 ml wurden auf einem Vortex während zehn Sekunden einer Rotation mit 3000 U/min in einem engen Kontakt ausgesetzt. Danach inkubierte man beide Fläschchen während einer Minute bei Zimmertemperatur in einem engen Kontakt. Mit Hilfe der oben beschriebenen Prozedur wurden 35 ml der I<0>(Iteration 0) gewonnen.

[0150] Danach wurde ein 40-Milliliter-Fläschchen mit der I<0>(35 ml) neben einem neuen 40-Milliliter-Fläschchen mit 35 ml des neutralen Trägermittels angeordnet und während zehn Sekunden mit 3000 U/min in einem engen Kontakt bewegt. Danach inkubierte man die beiden Fläschchen während einer Minute bei Zimmertemperatur in einem engen Kontakt. Das erhaltene Fläschchen mit dem neutralen Trägermittel wurde als I<1>bezeichnet. Danach wiederholte man die Prozedur zur Gewinnung einer nächsten Iteration (Nr. 2, Nr. 3 usw.) mehrfach, wobei das Fläschchen mit einer neuen Portion des neutralen Trägermittels und ein Fläschchen der vorangegangenen Iteration zusammen per Wirbelverfahren bewegt wurden.

[0151] Die Temperatur und Feuchtigkeit im Labor während der Vorbereitung der Muster und der nachfolgenden Messungen wurden mit Hilfe des Thermohygrographen IVA-6N kontrolliert; die Temperatur betrug 22±3 °C, der Feuchtigkeitsgrad - 20-70 %. Für die Zubereitung der Iterationen verwendete man durchsichtige Fläschchen aus Borosilikatglas (mit einem Volumen von 40 und 60 ml, Glastechnik Grafenroda, Infochroma AG, Schweiz) oder Reagenzgläser (mit einem Volumen von 100, 250 und 500 ml, Simax, Tschechien).

[0152] Als neutrales Trägermittel für die Zubereitung der Iterationen, aber auch für alle anderen Reagenzien, die in dieser Arbeit verwendet werden, wurde Wasser des Typs 1 (ultrareines) mit einem spezifischen Widerstand von 18,2 mΩ×cm (Milli-Q Integral 5, Millipore) genutzt. Die Qualität des gereinigten Wassers wurde täglich durch eine Messung des spezifischen Widerstands mit Hilfe des Konduktometers SevenCompact S230 (Mettler Toledo) kontrolliert, und die Kontrolle des pH-Wertes mit Hilfe des pH-Messgerätes SevenCompact S220 (Mettler Toledo). Für die Flüssigkeiten verwendete man automatische Pipetten unterschiedlichen Volumens (Eppendorf, Deutschland; Socorex, Schweiz), aber auch gläserne Messgefäße der Genauigkeitsklasse A (Borosil, Indien; Steklopribor, Ukraine). Die trockenen Reagenzien wog man auf analytischen Waagen der Genauigkeitsklasse I (Pioneer PA214C, Ohaus, USA). Für die Messung der Zeit der Inkubation verwendete man einen geeichten Labortimer (Traceable, VWR). Die Vibrationseinwirkung erfolgte mit Hilfe des Basis-Shakers (Wirbel-Shaker) MS 3 (IKA-Werke, Deutschland) mit einem Standardeinsatz.

[0153] In dieser Untersuchung wurde die I<5>(Iteration Nr. 5) verwendet (im Weiteren - Muster 1). Die Aufteilung der gewonnenen Iterationen nach Fraktionen erfolgte, wie im Beispiel 1 beschrieben wurde.

[0154] Bei dem Experiment verwendete man 35 weibliche BALB/c-Mäuse im Alter von 6-7 Wochen. Alle Tiere wurden unter Standardbedingungen mit einem Hell-Dunkel-Zyklus von 12:12 gehalten. Bei der Arbeit mit den Tieren wurden alle allgemein üblichen Standards der experimentellen Ethik (Richtlinie 2010/63/EU des Europäischen Parlaments und des Rates vom 22. September 2010 zum Schutz der für wissenschaftliche Zwecke verwendeten Tiere) eingehalten. Die Tiere erhielten granuliertes Futter und Trinkwasser ad libitum. Die Tiere teilte man entsprechend dem Zufallsprinzip in 4 Gruppen auf:

1.

Kontrollgruppe (Aufnahme gereinigten Wassers in einer Dosis, die der Dosis des Musters 1 entspricht; n=5);

2.

Gruppe von Tieren mit einer experimentellen Pathologie - Akne-Modell (n=10);

3.

experimentelle Gruppe (Modellierung einer Akne + Applikation des Musters 1; n=10);

4.

Placebo (Modellierung einer Akne + Aufnahme gereinigten Wassers in einer Dosis, die der Dosis der Probe 1 entspricht; n=10).

[0155] Jedes Tiere wurde individuell mit einem permanenten Marker gekennzeichnet. In den Gruppen, in denen eine Pathologie (Modellierung einer Akne) induziert wurde, applizierte man den Tieren subkutan im zentralen Bereich der geschädigten Seite der Ohrmuschel (an der Basis des Scapha-Conchal-Winkels) Staphylococcus aureus (die pathogenen Eigenschaften wurden durch eine Koagulation-Reaktion mit Karnickel-Plasma und durch den Bereich einer aktiven Hämolyse auf dem Blutagar bestätigt) in einer Konzentration von 1×10<9>KBE/ml in einem Umfang von 20 µl, kultiviert in einem Eigelb-Kochsalz-Agar.

[0156] Am 2. und 4. Tag nach Modellierung der Akne wurden jeweils fünf Tiere aus jeder Gruppe in einer Kammer mit CO<2>abgetötet. Danach schnitt man am Ohransatz die Ohrmuschel aus und bestimmte die Masse der „Kontroll-“ und der (befallenen) „experimentellen“ Ohrmuschel, um die relative Größe des Ödems zu beurteilen.

[0157] Für den Vergleich der Daten des Indexes der Entzündung des Ohrs zwischen Gruppen verwendete man den Student's-t-Test. Die statistische Analyse erfolgte mit Hilfe des Programms Statistica 10.0 (StatSoft, USA). Die Unterschiede zwischen den Gruppen wurden bei p<0,05 als statistisch signifikante angesehen.

[0158] Eine lokale Entzündung, die durch eine Rötung und ein Ödem charakterisiert wurde, war bei allen Tieren sechs Stunden nach Induktion der Pathologie (am 1. Tag) zu beobachten. Am 2. Tag bildete sich bei allen Tieren eitrige Pusteln. Am 3. Tag nach Applikation der bakteriellen Suspension wurde bei den Tieren eine Verringerung des Ödems und eine Verringerung der Abmessungen der Pusteln beobachtet. Am 4. Tag wurden bei den Mäusen praktisch keine Anzeichen für eine Entzündung beobachtet. Für die quantitative Bewertung des Ödems (%) wurde in der Dynamik die Masse der Versuchs- (der befallenen) und der Kontrollohren am 2. und am 4. Tag nach Induktion der Pathologie bestimmt. Die Ergebnisse sind in der Zeichnung 2 dargestellt worden.

[0159] Somit belegen die gewonnenen Daten eine entzündungshemmende Aktivität des Musters 1 (Iteration von Leberzellen eines Schweins) am Modell einer Akne. Die therapeutische Wirkung des Präparats zeigte sich in einer Verlangsamung der Dynamik der Entzündungsreaktion (Verringerung des Umfangs des Ödems im Prozess der Therapie).

[0160] Beispiel 9. Iterationen, die unter Verwendung von CHO-S-Zellen und von Wasser als neutrales Trägermittel gewonnen wurden.

[0161] Der Prozess der Gewinnung der Iterationen umfasste mehrere Etappen. Ein 60-Milliliter-Fläschchen mit einer frisch zubereiteten Suspension von CHO-S-Zellen (1,0×10<5>Zellen/ml) als Ausgangsstoff in einem Umfang von 50 ml und ein 60-Milliliter-Fläschchen mit gereinigtem Wasser (neutrales Trägermittel) in einem Umfang von 50 ml wurden auf einem Vortex während zehn Sekunden einer Rotation mit 3000 U/min in einem engen Kontakt ausgesetzt. Danach inkubierte man beide Fläschchen während einer Minute bei Zimmertemperatur in einem engen Kontakt. Mit Hilfe der oben beschriebenen Prozedur wurden 50 ml der Iteration 0 (I<0>) gewonnen.

[0162] Danach wurde ein 60-Milliliter-Fläschchen mit der I<0>(50 ml) neben einem neuen 500-Milliliter-Fläschchen mit 480 ml des neutralen Trägermittels angeordnet und während zehn Sekunden mit 3000 U/min in einem engen Kontakt bewegt. Danach inkubierte man die beiden Fläschchen während einer Minute bei Zimmertemperatur in einem engen Kontakt. Das erhaltene Fläschchen mit dem neutralen Trägermittel wurde als I<1>bezeichnet. Danach wiederholte man die Prozedur zur Gewinnung einer nächsten Iteration (Nr. 2, Nr. 3 usw.) mehrfach, wobei das Fläschchen mit einer neuen Portion des neutralen Trägermittels und ein Fläschchen der vorangegangenen Iteration zusammen per Wirbelverfahren bewegt wurden.

[0163] Die Temperatur und Feuchtigkeit im Labor während der Vorbereitung der Muster und der nachfolgenden Messungen wurden mit Hilfe des Thermohygrographen IVA-6N kontrolliert; die Temperatur betrug 22±3 °C, der Feuchtigkeitsgrad - 20-70 %. Für die Zubereitung der Iterationen verwendete man durchsichtige Fläschchen aus Borosilikatglas (mit einem Volumen von 40 und 60 ml, Glastechnik Grafenroda, Infochroma AG, Schweiz) oder Reagenzgläser (mit einem Volumen von 100, 250 und 500 ml, Simax, Tschechien).

[0164] Als neutrales Trägermittel für die Zubereitung der Iterationen, aber auch für alle anderen Reagenzien, die in dieser Arbeit verwendet werden, wurde Wasser des Typs 1 (ultrareines) mit einem spezifischen Widerstand von 18,2 mΩ×cm (Milli-Q Integral 5, Millipore) genutzt. Die Qualität des gereinigten Wassers wurde täglich durch eine Messung des spezifischen Widerstands mit Hilfe des Konduktometers SevenCompact S230 (Mettler Toledo) kontrolliert, und die Kontrolle des pH-Wertes mit Hilfe des pH-Messgerätes SevenCompact S220 (Mettler Toledo). Für die Flüssigkeiten verwendete man automatische Pipetten unterschiedlichen Volumens (Eppendorf, Deutschland; Socorex, Schweiz), aber auch gläserne Messgefäße der Genauigkeitsklasse A (Borosil, Indien; Steklopribor, Ukraine). Die trockenen Reagenzien wog man auf analytischen Waagen der Genauigkeitsklasse I (Pioneer PA214C, Ohaus, USA). Für die Messung der Zeit der Inkubation verwendete man einen geeichten Labortimer (Traceable, VWR). Die Vibrationseinwirkung erfolgte mit Hilfe des Basis-Shakers (Wirbel-Shaker) MS 3 (IKA-Werke, Deutschland) mit einem Standardeinsatz.

[0165] In dieser Untersuchung wurden die Iteration Nr. 5 und die Iteration Nr. 7 verwendet (im Weiteren - Muster 1). Die Aufteilung der gewonnenen Iterationen nach Fraktionen erfolgte, wie im Beispiel 1 beschrieben wurde.

[0166] Die Aktivität der Muster wurde an einer CHO-S-Zelllinie getestet (Thermo Fisher Scientific, USA). Für die Beurteilung der Wirkung der Muster bereitete eine 7 w%-Lösung in einem Umfang von 10 ml vor. Dafür löste man 0,07 g eines jeden Musters (Iteration Nr. 5 und Iteration Nr. 7) in dem Hybris-Medium ohne Insulin durch ein vorsichtiges Pipettieren auf. Danach ließ man die Lösung durch Spritzenfilter mit einer PVDF-Membran mit einer Porengröße von 0,2 µm (Macherey-Nagel, Deutschland) laufen. Jedes Mal verwendete man frisch zubereitete Lösungen der Muster. Für eine Beurteilung des Einflusses der Muster des Wassers fügte man sie unmittelbar der Zellkultur zu.

[0167] Die CHO-S-Zellen kultivierte man in 6-Well-Tablets (Nest, China) in einem Hybris-Medium ohne Insulin während sieben Tagen (37 °C, 5% CO<2>). Dabei machte der Anteilder Proben der Lösungen der Testmuster 1/6 vom Gesamtumfang des Wells (der Vertiefung) aus, der Anteil der Iterationsproben auf Wasser - 1/10 vom Volumen des Wells. Weiter verlegte man die Zellen auf 48-Well-Tablets (Nest, China) bei Hinzufügung der Testmuster und verschiedener Konzentration von Menschen-Insulin (0,5 µg/ml, 5 µg/ml und 50 µg/ml). Die Endkonzentration der Zellen betrug 0,15×10<6>Zellen/ml, der Anteil der zu untersuchenden Muster betrug 1/6 oder 1/10 vom Gesamtvolumen der Vertiefung (500 µl). Die Tablets inkubierte man während 72 Stunden bei 37 °C und 5% CO<2>. Danach nahm man für jede experimentelle Vertiefung eine Analyse des Glukose-Verbrauchs mit Hilfe des Hexokinase-Verfahrens vor, aber auch eine WST-Analyse für die Berechnung des normalisierten Glukose-Verbrauchs.

[0168] Für das Hexokinase-Verfahren verwendete man 2-Millimeter-Plastikreagenzgläser (JetBiofil, China). In jedes Reagenzglas gab man 780 µl Tris-Puffer (0,1 M, pH 7,8) und 20 µl der Zellsuspension aus der entsprechenden Vertiefung des Musters. Die gewonnenen Lösungen transportierte man mit Hilfe eines Vortex (Biosan, Lettland) und fügte jeweils 50 µl in die Vertiefungen des 96-Well-Tablets (Corning Costar, USA). Danach fügte man 50 µl eines Gemischs aus Fermenten und Co-Fermenten (Tris-Puffer, Hexokinase, NAD+ und ATP (Adenosintriphosphat)) hinzu und inkubierte alles im Verlauf einer Stunde bei 37 °C. Nach der Inkubation gab man in jede Vertiefung jeweils 200 µl des Tris-Puffers (0,1 M, pH-Wert: 7,8). Die Absorptionsspektren ermittelte man mit dem Micro-Plate-Photometer Multiskan FC (Thermo Fisher Scientific, USA) bei einer Wellenlänge von 300 nm bis 450 nm. Die Werte für die optische Dichte in jeder Vertiefung erhielt man entsprechend der Formel: OD<glu>=OD340-OD450-OD<tris>(Kalibrierung). Weiter berechnete man den Glukose-Verbrauch entsprechend der Formel: C<glu>=30-((OD<glu>-b)/a*40), wobei die Kalibriergleichung y=ax+b verwendet wurde. Für die Repliken mit einer gleichartigen Insulin-Konzentration berechnete man einen Mittelwert, die Standardabweichung und den Variationskoeffizient mit Hilfe des Excel-Programms Excel (Microsoft, USA).

[0169] Für die Beurteilung der metabolischen Aktivität der Zellen verwendete man das Reaktionsmittel WST-1 (Biosynth, China). Die Analyse erfolgte entsprechend der Anleitung des Herstellers. Die CHO-S-Zellen gab man in 96-Well-Tablets (Corning Costar, USA) in einem Umfang von 100 µl/Vertiefung in zwei Exemplaren. Danach fügte man das Reaktionsmittel WST-1 in einem Umfang von 8 µl/Vertiefung und inkubierte alles während drei Stunden bei 37 °C. Die optische Dichte bestimmte man mit dem Micro-Plate-Photometer Multiskan FC (Thermo Fisher Scientific, USA) bei den Wellenlängen 440 nm und 650 nm. Die optische Enddichte berechnete man gemäß der Formel: OD<wst>= OD<440>-OD<650>.

[0170] Die Berechnung des normalisierten Glukose-Verbrauchs durch die CHO-S-Zellen erfolgte gemäß der Formel: N= C<glu>/OD<wst>(wo OD<wst>- der Mittelwert für jedes Duplikat).

[0171] Die herausfallenden Werte in den Gruppen bestimmte man mit Hilfe des Interquartilabstands. Der Vergleich zwischen Gruppen an jedem Punkt der Konzentration erfolgte mit dem Student's-/Welch-t-Test und dem Kruskal-Wallis-Test mit einem anschließenden Dunn-Test. Die R-Werte korrigierte man mit der Holm-Methode. Die Unterschiede zwischen den Gruppen wurden bei p<0,05 als statistisch signifikante angesehen.

[0172] Die Ergebnisse der Untersuchung sind in der Zeichnung 3 dargestellt worden.

[0173] Ausgehend von den gewonnenen Daten kann man die Schlussfolgerung ziehen, dass die Verwendung von Iterationen von CHO-S-Zellen einen statistisch signifikanten Einfluss auf den Glukoseverbrauch durch die CHO-S-Zellen im Beisein unterschiedlicher Insulin-Konzentrationen ausübt. In Abhängigkeit von den physikalisch-chemischen Eigenschaften der zu untersuchenden Fraktionen kann sich der Glukoseverbrauch durch die Zellen entweder verringern oder zunehmen.

[0174] Beispiel 10. Iterationen, die unter Verwendung von Zellen einer Placenta und von Wasser als ein neutrales Trägermittel gewonnen wurden.

[0175] Der Prozess der Gewinnung der Iterationen umfasst mehrere Etappen. Ein 5-Milliliter-Fläschchen mit einer frisch zubereiteten Ausgangslösung (Suspension von Zellen einer Schweine-Plazenta, 5×10<4>Zellen/ml) in einem Umfang von 5 ml und ein 40-Milliliter-Fläschchen mit gereinigtem Wasser (dem neutralen Trägermittel) in einem Umfang von 35 ml wurden auf einem Vortex während zehn Sekunden einer Rotation von 3000 U/min in einem engen Kontakt ausgesetzt. Danach wurden die beiden Fläschchen eine Minute lang bei Zimmertemperatur und in einem engen Kontakt inkubiert. Mit Hilfe der oben beschriebenen Prozedur wurden 35 ml der Iteration 0 (I<0>) gewonnen.

[0176] Danach wurde ein 40-Milliliter-Fläschchen mit der I<0>(35 ml) neben einem neuen 40-Milliliter-Fläschchen mit 35 ml des neutralen Trägermittels angeordnet und während zehn Sekunden mit 3000 U/min in einem engen Kontakt bewegt. Danach inkubierte man die beiden Fläschchen während drei Minuten bei Zimmertemperatur in einem engen Kontakt. Das erhaltene Fläschchen mit dem neutralen Trägermittel wurde als I<1>bezeichnet. Danach wiederholte man die Prozedur zur Gewinnung einer nächsten Iteration (Nr. 2, Nr. 3 usw.) mehrfach, wobei das Fläschchen mit einer neuen Portion des neutralen Trägermittels und ein Fläschchen der vorangegangenen Iteration zusammen per Wirbelverfahren bewegt wurden.

[0177] Die Temperatur und Feuchtigkeit im Labor während der Vorbereitung der Muster und der nachfolgenden Messungen wurden mit Hilfe des Thermohygrographen IVA-6N kontrolliert; die Temperatur betrug 22±3 °C, der Feuchtigkeitsgrad - 20-70 %. Für die Zubereitung der Iterationen verwendete man durchsichtige Fläschchen aus Borosilikatglas (mit einem Volumen von 40 und 60 ml, Glastechnik Grafenroda, Infochroma AG, Schweiz) oder Reagenzgläser (mit einem Volumen von 100, 250 und 500 ml, Simax, Tschechien).

[0178] Als neutrales Trägermittel für die Zubereitung der Iterationen, aber auch für alle anderen Reagenzien, die in dieser Arbeit verwendet werden, wurde Wasser des Typs 1 (ultrareines) mit einem spezifischen Widerstand von 18,2 mΩ×cm (Milli-Q Integral 5, Millipore) genutzt. Die Qualität des gereinigten Wassers wurde täglich durch eine Messung des spezifischen Widerstands mit Hilfe des Konduktometers SevenCompact S230 (Mettler Toledo) kontrolliert, und die Kontrolle des pH-Wertes mit Hilfe des pH-Messgerätes SevenCompact S220 (Mettler Toledo). Für die Flüssigkeiten verwendete man automatische Pipetten unterschiedlichen Volumens (Eppendorf, Deutschland; Socorex, Schweiz), aber auch gläserne Messgefäße der Genauigkeitsklasse A (Borosil, Indien; Steklopribor, Ukraine). Die trockenen Reagenzien wog man auf analytischen Waagen der Genauigkeitsklasse I (Pioneer PA214C, Ohaus, USA). Für die Messung der Zeit der Inkubation verwendete man einen geeichten Labortimer (Traceable, VWR). Die Vibrationseinwirkung erfolgte mit Hilfe des Basis-Shakers (Wirbel-Shaker) MS 3 (IKA-Werke, Deutschland) mit einem Standardeinsatz.

[0179] In dieser Untersuchung wurde das Muster (Iteration) I<34>(Iteration Nr. 34) verwendet (im Weiteren - Muster 1). Die Aufteilung der gewonnenen Iterationen nach Fraktionen erfolgte, wie im Beispiel 1 beschrieben wurde.

[0180] Die Untersuchung der Chondroprotektoren-Aktivität des Präparats hat man an 70 weißen männlichen Out-Breeding-Ratten (Alter: 4-5 Monate, Körpermasse: 265-290 g) vorgenommen. Die Tiere wurden in vier Gruppen à 15 Tiere in jeder aufgeteilt. Die erste Gruppe waren intakte Ratten; die zweite Gruppe - Tiere mit einer experimentellen Osteoarthrose (OA), ohne eine Heilbehandlung; die dritte Gruppe - Ratten mit einer experimentellen OA, die das Muster 1 in einer Dosis von 50 mg Salbe erhielten; die vierte Gruppe - Ratten mit einer experimentellen OA, die ein Placebo (gereinigtes Wasser) in einer Menge, die dem Muster 1 äquivalent war, erhielten.

[0181] Für die Induktion der OA wurde den Ratten dreimal in einem Intervall von sieben Tagen Dexamethason (intramuskulär in den Oberschenkel, einmalige Dosis - 7 mg/kg) verabreicht. Dem Modellieren der OA folgte man anhand der biochemischen Untersuchungen des biologischen Materials, das in der 4. Woche des Experiments von zehn Tieren einer zusätzlichen Kontrollgruppe, die unter einer Äthernarkose per Dekapitation getötet worden waren, gewonnen wurde. Ab dem 28. Tag des Experiments und im Verlauf der weiteren vier Wochen erhielten alle Tiere der dritten und der vierten Gruppe täglich entsprechende Präparate, die auf die Kniegelenke beider Pfoten in äquivalenten Mengen - jeweils 50 mg - aufgetragen wurden. Die Präparate wurden sorgfältig in die Haut der Rotten für ein schnelleres Einziehen eingerieben, wobei ihr Ablecken oder das Abwischen durch die Tiere an sich nicht zugelassen wurde.

[0182] Im Verlauf der Untersuchung wurde eine klinische Untersuchung der Tiere durchgeführt: Verfolgt wurde der funktionale Zustand ihrer Gelenke inklusive des Grades der Mobilität, der Widerstandsfähigkeit gegenüber physischen Belastungen, einer Aufgedunsenheit und Hyperämie. Nach Abschluss des Einsatzes der zu untersuchenden Präparate (am 56. Tag des Experiments) wurden alle Tiere unter einer Äthernarkose einer Dekapitation unterzogen, und man bestimmte den Gesamtgehalt und die Fraktionen der Glykosaminglykane (GAG) im Blutserum.

[0183] Bei der Arbeit mit den Tieren wurden alle allgemein üblichen Standards der experimentellen Ethik (Richtlinie 2010/63/EU des Europäischen Parlaments und des Rates vom 22. September 2010 zum Schutz der für wissenschaftliche Zwecke verwendeten Tiere) eingehalten.

[0184] Für die statistische Analyse verwendete man eine zweiseitige ANOVA mit dem Tukey-Post-hoc-Test. Die Unterschiede zwischen den Gruppen wurden als statistisch signifikante bei p<0,05 angesehen.

[0185] Die Zusammensetzung nach Fraktionen und der Gesamtgehalt an GAG im Blutserum der Ratten mit einer OA, denen das Muster 1 (Gruppe 3) oder ein Placebo (Gruppe 4) verabreicht wurden, sind in Tab. 10 dargestellt worden. Es ist ermittelt worden, dass beim Auftragen des Musters 1 auf die Gelenke der Tiere eine Verringerung des Gesamtgehalts an GAG erfolgte. Bedingt wurde dies nicht nur eine Verringerung des Gehalts an Chondroitin-4-Sulfaten, sondern auch durch eine Verringerung des Anteils der Chondroitin-6-Sulfate bis zum Niveau der gesunden Tiere (Gruppe 1). Bei der Verwendung eines Placebos (Gruppe 4) hatten sich die Werte für den Gesamtgehalt und des Inhalts der GAG-Fraktionen im Vergleich zu den nicht behandelten Tieren mit einer OA (Gruppe 2) praktisch nicht verändert.

[0186] Somit kann man die Schlussfolgerung ziehen, dass das Muster 1 (Iteration von Zellen der Placenta eines Schweins) Chondroprotektoren-Eigenschaften besitzt, wobei es Effektivität bei der Behandlung einer experimentellen Arthrose bei Ratten demonstriert.

[0187] Beispiel 11. Iterationen, die unter Verwendung von Zellen aus der Nabelschnur und aus Wasser als neutrales Trägermittel gewonnen wurden.

[0188] Der Prozess der Gewinnung der Iterationen umfasst mehrere Etappen. Ein 5-Milliliter-Fläschchen mit einer frisch zubereiteten Ausgangslösung (Suspension von Zellen einer Schweinenabelschnur, 1×10<6>Zellen/ml) in einem Umfang von 5 ml und ein 40-Milliliter-Fläschchen mit gereinigtem Wasser (dem neutralen Trägermittel) in einem Umfang von 35 ml wurden auf einem Vortex während zehn Sekunden einer Rotation von 3000 U/min in einem engen Kontakt ausgesetzt. Danach wurden die beiden Fläschchen eine Minute lang bei Zimmertemperatur und in einem engen Kontakt inkubiert. Mit Hilfe der oben beschriebenen Prozedur wurden 35 ml der Iteration 0 (I<0>) gewonnen.

[0189] Danach wurde ein 40-Milliliter-Fläschchen mit der I<0>(35 ml) neben einem neuen 40-Milliliter-Fläschchen mit 35 ml des neutralen Trägermittels angeordnet und während 30 Sekunden mit 3000 U/min in einem engen Kontakt bewegt. Danach inkubierte man die beiden Fläschchen während zwei Minuten bei Zimmertemperatur in einem engen Kontakt. Das erhaltene Fläschchen mit dem neutralen Trägermittel wurde als I<1>bezeichnet. Danach wiederholte man die Prozedur zur Gewinnung einer nächsten Iteration (Nr. 2, Nr. 3 usw.) mehrfach, wobei das Fläschchen mit einer neuen Portion des neutralen Trägermittels und ein Fläschchen der vorangegangenen Iteration zusammen per Wirbelverfahren bewegt wurden.

[0190] Die Temperatur und Feuchtigkeit im Labor während der Vorbereitung der Muster und der nachfolgenden Messungen wurden mit Hilfe des Thermohygrographen IVA-6N kontrolliert; die Temperatur betrug 22±3 °C, der Feuchtigkeitsgrad - 20-70 %. Für die Zubereitung der Iterationen verwendete man durchsichtige Fläschchen aus Borosilikatglas (mit einem Volumen von 40 und 60 ml, Glastechnik Grafenroda, Infochroma AG, Schweiz) oder Reagenzgläser (mit einem Volumen von 100, 250 und 500 ml, Simax, Tschechien).

[0191] Als neutrales Trägermittel für die Zubereitung der Iterationen, aber auch für alle anderen Reagenzien, die in dieser Arbeit verwendet werden, wurde Wasser des Typs 1 (ultrareines) mit einem spezifischen Widerstand von 18,2 mΩ×cm (Milli-Q Integral 5, Millipore) genutzt. Die Qualität des gereinigten Wassers wurde täglich durch eine Messung des spezifischen Widerstands mit Hilfe des Konduktometers SevenCompact S230 (Mettler Toledo) kontrolliert, und die Kontrolle des pH-Wertes mit Hilfe des pH-Messgerätes SevenCompact S220 (Mettler Toledo). Für die Flüssigkeiten verwendete man automatische Pipetten unterschiedlichen Volumens (Eppendorf, Deutschland; Socorex, Schweiz), aber auch gläserne Messgefäße der Genauigkeitsklasse A (Borosil, Indien; Steklopribor, Ukraine). Die trockenen Reagenzien wog man auf analytischen Waagen der Genauigkeitsklasse I (Pioneer PA214C, Ohaus, USA). Für die Messung der Zeit der Inkubation verwendete man einen geeichten Labortimer (Traceable, VWR). Die Vibrationseinwirkung erfolgte mit Hilfe des Basis-Shakers (Wirbel-Shaker) MS 3 (IKA-Werke, Deutschland) mit einem Standardeinsatz.

[0192] In dieser Untersuchung wurde ein Gemisch der I<6>(Iteration Nr. 6) und der I<8>(Iteration Nr. 8) verwendet (im Weiteren - Muster 1). Die Aufteilung der gewonnenen Iterationen nach Fraktionen erfolgte, wie im Beispiel 1 beschrieben wurde.

[0193] Das Experiment wurde an männlichen Wistar-Ratten mit einer Masse von 200-250 g vorgenommen. Die Tiere wurden in vier Gruppen mit jeweils 15 Tieren in jeder aufgeteilt: Die Gruppen I, III und IV waren während 180 Tagen (sechs Monaten) auf einer cholesterinreichen Diät, die darin bestand, dass dem Futter der Tiere Cholesterinpulver, Mercazolil und Vitamin D zugefügt wurde. 15 Tage vor der Umstellung der Ratten auf eine atherogene Diät wurde eine Operation durchgeführt: Abbindung des linken Nierenfüßchens durch nicht resorbierbare Nähte und Vernähen des oberen Pols der rechten Niere, wobei 2/3 des Organs belassen wurden. Im Verlauf des Experiments dienten 15 gesunde Ratten, die mit einer üblichen Diät gefüttert wurden, als Kontrollgruppe (Gruppe II). Den Tieren aus der Gruppe III applizierte man das Muster 1. Den Tieren der Gruppe IV verabreichte man eine äquivalente Menge des Placebos (gereinigtes Wasser). Das Experiment erfolgte in strikter Übereinstimmung mit den Forderungen der Europäischen Konvention für die Haltung, Fütterung und Pflege von experimentellen Tieren, aber auch deren Herauslösung aus dem Experiment und der anschließenden Verwertung. Die Experimente erfolgten entsprechend den Forderungen der World Society for the Protection of Animals (WSPA), heute: World Animal Protection und der Europäischen Konvention zum Schutz von Labortieren. Nach sechs Monaten der Untersuchung wurden die Tiere jeder Gruppe durch Kapitation unter einer Äthernarkose aus dem Experiment genommen. Erfasst wurden Fragmente der Aorta, der Oberschenkelschlagadern und der Mikrogefäße der vorderen Bauchwand (VBW).

[0194] Die Bestimmung des Gehalts an Gesamtcholesterin (GC), Triglyzeriden (TG) sowie von LDL und HDL erfolgte unter Verwendung der Standardreaktionsmittel des Kolometrie-Verfahrens. Der Index der Atherogenität berechnete man gemäß der Formel: (Gesamtcholesterin - HDL)/LDL. Den arteriellen Druck bestimmte man in der Schwanzarterie mit Hilfe des Analysegeräts MLU/4C 501 (MedLab, China). Die Magnet-Resonanz-Tomografie hat man auf folgende Art und Weise vorgenommen: Vor dem Scannen der Tiere wurden sie einer Euthanasie durch eine Überdosierung von Rometar-Lösungen (Xylazin, SPORA, PRAHA) in einer Konzentration von 1 mg/ml und Relanium in einer Konzentration von 2 mg/ml unterzogen, sie wurden intraperitoneal appliziert. Die MRT-Diagnostik erfolgte mit dem Tomograph für experimentelle Untersuchungen PharmaScan US 70/16 (Bruker, Deutschland) mit einer Spannung des Magnetfelds von 7,0 Tesla, einer Frequenz von 300 MHz und einer BGA-09P-Spule. Für die Angiografie verwendete man das Protokoll Head_Angio mit den folgenden Parametern: TR/TE=50,0/5,6; Neigungswinkel - 25,0; Darstellungsfeld - 3,0/3,0/3,0; effektive Stärke des Schnittpräparats - 30 mm; Überlappung - 30,0 mm; Matrix 256/256/64 Elemente; Mittelwertbildung eines Signals, Dauer des Scannens - 14 Minuten. Die histologischen Präparate fixierte man in 10-%-igem neutralen Formalin und bettete sie in Paraffin. Die Schnittpräparate färbte man mit Hämatoxylin, Eosin und Sudan IV ein (Okamota-Methode). Die Beschreibung der Mikropräparate erfolgte mit dem Mikroskop Olympus BX 41. Darstellungen erhielt man mit Hilfe der Kamera Olympus DR 12 bei einer 100- oder 400-fachen Vergrößerung. Die Morphometrie erfolgte mit Hilfe eines Okularmikrometers.

[0195] Für die Beurteilung der Aktivität der NADPH-Diaphorase verwendete man ein histologisch-chemisches Verfahren. Die Aktivität des Ferments bestimmte man im Endothel und in den glatten Myozyten der Aorta, den Oberschenkelschlagadern und der vorderen Bauchwand. Die Werte für die Aktivität der Fermente bestimmte man mit Hilfe des Programms ImageJ v. 1.37 und drückte sie in den Maßeinheiten für die optische Dichte aus.

[0196] Für die statistische Analyse verwendete man das Programm SPSS v. 16. Der Vergleich der Mittelwerte zwischen den Gruppen erfolgte mit Hilfe der einseitigen ANOVA mit einem anschließenden Vergleich aller Gruppen untereinander mit Hilfe des Tukey-Post-hoc-Tests. Die Unterschiede zwischen den Gruppen wurden bei p<0,05 als statistisch signifikante angesehen.

[0197] Die Ergebnisse der Untersuchung sind in den Tabellen 12, 13 und 14 ausgewiesen worden.

Tabelle 12. Werte für den arteriellen Druck bei Ratten mit einer experimentellen Atherosklerose.

[0198] Gruppe I131.5 ±1.4•83.5 ±3.0•140.30 ±3.27•90.28 ±4.39•161.61 ±1.68•99.48 ±3.67•Gruppe II115.6 ±0.6373.8 ±0.59116.24 ±0.7970.24 ±2.25116.12 ±3.1771.45 ±1.75Gruppe III117.5 ±0.4*^73.6 ±0.53*^116.25 ±0.84*^70.20 ±2,18*^116.01 ±3.05*^71.44 ±1.70*^Gruppe IV136.5 ±1.3•84.7 ±2.8•146.13 ±3.16•95.27 ±4,14•162.65 ±1.64•97.41 ±3.29• Anmerkung: SBP - systolischer arterieller Druck, DBP - diastolischer arterieller Druck. Die Daten sind als Mittelwerte ausgewiesen worden ± durchschnittlicher Standardfehler. ^ - die Unterschiede sind im Vergleich zur Gruppe 1 signifikant (p<0,05); - - die Unterschiede sind im Vergleich zur Gruppe II (p<0,05); * - die Unterschiede sind im Vergleich zur Gruppe IV signifikant (p<0,05).

Tabelle 13. Lipid-Profil des Serums des Bluts von Ratten mit einer experimentellen Atherosklerose.

[0199] Gesamtcholesterin (mmol/l)2.93#2.56#3.64#1.34^1.44^1.69^1.33^*1.41^*1.65^*2.98#2.47#^3.66#^Triglyceride (mmol/l)0.200.47#0.89#0.14^0.23^0.,44^0.13^*0.30^*0.43^*0.260.51#0.98#HDL (mmol/l)1.15#0.950.85#0.93^0.91^0.93^1.00^*0.960.96^*1.15#0.990.85#LDL (mmol/l)1.40#0.97#0.79#0.89^0.75^0.61^0.95^*0.72^*0.66^*1.46#0.93#0.81#AI1.45#1.59#3.54#0.47^0.56^0.74^0.46^*0.506^*0.73^*1.48#1.53#3.52# Anmerkung: Die Daten sind als Mittelwerte ausgewiesen worden. ^ - Die Unterschiede sind im Vergleich zur Gruppe 1 signifikant (Unterschiede zu den Werten im entsprechenden Monat - p<0,05); # - die Unterschiede sind im Vergleich zur Gruppe II signifikant (Unterschiede zu den Werten im entsprechenden Monat - p<0,05); * - die Unterschiede sind im Vergleich zur Gruppe IV signifikant (Unterschiede zu den Werten im entsprechenden Monat - p<0,05).

Tabelle 14. Aktivität der NADPH-Diaphorase in den Gefäßen von Ratten.

[0200] 2. Mon.

11#

8#

30#

65^

34^

78^

65^*

30^*

76^*

11#

7#

34#

4. Mon.

8#

5#

43#

63^

24^

84^

58^*

22^*

79^*

8#

5#

40#

6. Mon.

8#

4#

45#

64^

31^

82"

56^*

26^*

81^*

6#

4#

41#

[0201] Anmerkung: Die Daten sind als Mittelwerte ausgewiesen worden. ^ - Die Unterschiede sind im Vergleich zur Gruppe 1 signifikant (p<0,05); # - die Unterschiede sind im Vergleich zur Gruppe II signifikant (p< 0,05); * - die Unterschiede sind im Vergleich zur Gruppe IV signifikant (p<0,05).

[0202] Somit belegen die gewonnenen Daten den Einfluss des Musters 1 (Gemisch der I<6>(Iteration Nr. 6) und der I<8>(Iteration Nr. 8) von Zellen aus der Nabelschnur eines Schweins) auf die Werte für die strukturelle und funktionale Schädigung von Gefäßen bei einer experimentellen Atherosklerose.

[0203] Beispiel 12. Iterationen, die unter Verwendung embryonaler Zellen und von Wasser als neutrales Trägermittel gewonnen wurden.

[0204] Der Prozess der Gewinnung der Iterationen umfasst mehrere Etappen. Ein 5-Milliliter-Fläschchen mit einer frisch zubereiteten Ausgangslösung (Suspension embryonaler Schweinezellen, 5×10<5>Zellen/ml) in einem Umfang von 5 ml und ein 40-Milliliter-Fläschchen mit gereinigtem Wasser (dem neutralen Trägermittel) in einem Umfang von 35 ml wurden auf einem Vortex während 25 Sekunden einer Rotation von 3000 U/min in einem engen Kontakt ausgesetzt. Danach wurden die beiden Fläschchen eine Minute lang bei Zimmertemperatur und in einem engen Kontakt inkubiert. Mit Hilfe der oben beschriebenen Prozedur wurden 35 ml der Iteration 0 (I<0>) gewonnen.

[0205] Danach wurde ein 40-Milliliter-Fläschchen mit der I<0>(35 ml) neben einem neuen 40-Milliliter-Fläschchen mit 35 ml des neutralen Trägermittels angeordnet und während zehn Sekunden mit 3000 U/min in einem engen Kontakt bewegt. Danach inkubierte man die beiden Fläschchen während zwei Minuten bei Zimmertemperatur in einem engen Kontakt. Das erhaltene Fläschchen mit dem neutralen Trägermittel wurde als I<1>bezeichnet. Danach wiederholte man die Prozedur zur Gewinnung einer nächsten Iteration (Nr. 2, Nr. 3 usw.) mehrfach, wobei das Fläschchen mit einer neuen Portion des neutralen Trägermittels und ein Fläschchen der vorangegangenen Iteration zusammen per Wirbelverfahren bewegt wurden.

[0206] Die Temperatur und Feuchtigkeit im Labor während der Vorbereitung der Muster und der nachfolgenden Messungen wurden mit Hilfe des Thermohygrographen IVA-6N kontrolliert; die Temperatur betrug 22±3 °C, der Feuchtigkeitsgrad - 20-70 %. Für die Zubereitung der Iterationen verwendete man durchsichtige Fläschchen aus Borosilikatglas (mit einem Volumen von 40 und 60 ml, Glastechnik Grafenroda, Infochroma AG, Schweiz) oder Reagenzgläser (mit einem Volumen von 100, 250 und 500 ml, Simax, Tschechien).

[0207] Als neutrales Trägermittel für die Zubereitung der Iterationen, aber auch für alle anderen Reagenzien, die in dieser Arbeit verwendet werden, wurde Wasser des Typs 1 (ultrareines) mit einem spezifischen Widerstand von 18,2 mΩ×cm (Milli-Q Integral 5, Millipore) genutzt. Die Qualität des gereinigten Wassers wurde täglich durch eine Messung des spezifischen Widerstands mit Hilfe des Konduktometers SevenCompact S230 (Mettler Toledo) kontrolliert, und die Kontrolle des pH-Wertes mit Hilfe des pH-Messgerätes SevenCompact S220 (Mettler Toledo). Für die Flüssigkeiten verwendete man automatische Pipetten unterschiedlichen Volumens (Eppendorf, Deutschland; Socorex, Schweiz), aber auch gläserne Messgefäße der Genauigkeitsklasse A (Borosil, Indien; Steklopribor, Ukraine). Die trockenen Reagenzien wog man auf analytischen Waagen der Genauigkeitsklasse I (Pioneer PA214C, Ohaus, USA). Für die Messung der Zeit der Inkubation verwendete man einen geeichten Labortimer (Traceable, VWR). Die Vibrationseinwirkung erfolgte mit Hilfe des Basis-Shakers (Wirbel-Shaker) MS 3 (IKA-Werke, Deutschland) mit einem Standardeinsatz.

[0208] In dieser Untersuchung wurde die Iteration I<4>(Iteration Nr. 4) verwendet (im Weiteren - Muster 1). Die Aufteilung der gewonnenen Iterationen nach Fraktionen erfolgte, wie im Beispiel 1 beschrieben wurde.

[0209] Eine hypertonische Enzephalopathie modellierte man an wachen (munteren) 12 Monate alten Wistar-Ratten mit einem moderat aktiven Verhalten. Die Tiere wurden in sechs Gruppen - jeweils zehn Tiere in jeder - aufgeteilt. Die Tiere wurden in Plexi-Glas-Container gegeben, die rund um die horizontale Achse einer Zentrifuge in einer strikt kaudal-kranialen Ausrichtung angeordnet und einer Kraft von 9 g während fünf Minuten zweimal täglich vier Wochen ausgesetzt. Den Tieren der 6. Gruppe verabreichte man das Muster 1 (eine Iteration embryonaler Schweinezellen) täglich während fünf Tagen bis zur Modellierung der hypertonischen Enzephalopathie. Den Tieren der 5. Gruppe verabreichte man das Muster 1 täglich während fünf Tagen, beginnend eine Stunde nach der Modellierung der hypertonischen Enzephalopathie (Iteration embryonaler Schweinezellen). Die 4. Gruppe bestand aus Ratten, die ein Placebo (gereinigtes Wasser) täglich während fünf Tagen bis zur Modellierung der hypertonischen Enzephalopathie erhielten. Die 3. Gruppe bestand aus Ratten, die ein Placebo (gereinigtes Wasser) nach Modellierung der hypertonischen Enzephalopathie analog der 5. Gruppe erhielten. Die 2. Gruppe bestand aus Kontrollratten, an denen man eine hypertonische Enzephalopathie modellierte, aber keinerlei Therapie aussetzte. Zur 1. Gruppe gehörten (intakte) Kontrollratten, die keinerlei Einwirkung ausgesetzt wurden. Am 40. Tag ab dem Tag der Modellierung der Pathologie löste man die Tiere aus dem Experiment heraus. Man nahm an ihnen eine Dekapitation vor und entnahm Muster des Gehirns. Die Muster des Gehirns fixierte man in einer 10-%-igen neutralen Formalin-Lösung und legte sie in Paraffin ein.

[0210] Die Schnittpräparate (mit einer Stärke von 5-7 µm) wurden entsprechend der Nissl-Methode mit Hämatoxylin und Eosin sowie Thionin eingefärbt. Das Mikrofotografieren der histologischen Präparate erfolgte mit einem Mikroskop der Marke Micros (Österreich) und mit einer digitalen Kamera der Marke Olympus (Japan). Untersucht wurden die hauptsächlichen morphometrischen Parameter der Pyramidenschicht des Hippocampus der rechten Gehirnhälfte: die durchschnittliche Fläche des Perikaryons der Neuronen, die durchschnittliche Fläche der Neuronenkerne, die spezifische Fläche des Perikaryons der Neuronen, aber auch der Anteil der hyperchromen Neuronen.

[0211] Die statistische Verarbeitung der Daten erfolgte unter Verwendung der Programme MS Office Excell 2007 (Microsoft Inc., USA) und Statistica 6.0 (StatSoft, USA). Die verallgemeinerten Daten sind in Gestalt eines Medians (IQR) dargestellt worden. Die Daten analysierte man mit einer einseitigen ANOVA. Danach verglich man alle Gruppen untereinander mit Hilfe des Tukey-Post-hoc-Tests und hielt sie bei p<0,05 für statistisch signifikante..

[0212] Die Ergebnisse der Untersuchung sind in Tabelle 15 ausgewiesen worden.

Tabelle 15. Veränderungen der morphometrischen Parameter der Pyramidenschicht des Hippocampus der rechten Gehirnhälfte von Ratten mit einer simulierten hypertonischen Enzephalopathie.

[0213] CA1Hyperchrome Neuronen, %8.273.7*71.7*72.0*12.3^$25.4^&durchschnittliche Fläche des Perikaryons der Neuronen, µm<2>97.581.7*82.7*81.6*91.4^$89.7^&durchschnittliche Fläche eines Neuronenkerns, µm<2>76.359.960.758.673.0^$68.5^&Spezifische Fläche der Perikaryonen, %33.325.1*25.5*24.8*30.0^$29.1^CA2Hyperchrome Neuronen, %6.883.8*81.4*80.9*10.3*^$25.7*^&durchschnittliche Fläche des Perikaryons der Neuronen, µm<2>89.679.578.678.484.5*^$79.9*durchschnittliche Fläche eines Neuronenkerns, µm<2>72.36061.561.271.0^$67.4^&Spezifische Fläche der Perikaryonen, %34.528.2*26.3*25.9*33.6^29.7CA3Hyperchrome Neuronen, %6.386.7*87.6*87.1*9.7^$25.3^&durchschnittliche Fläche des Perikaryons der Neuronen, µm<2>120.299.7*99.5*99.8*110.3*^$105.6*durchschnittliche Fläche eines Neuronenkerns, µm<2>89.465.564.665.083.0^$78.5*^&Spezifische Fläche der Perikaryonen, %33.827.9*25.3*25.6*29.8*28.0*CA4Hyperchrome Neuronen, %4,676,5*75,6*76,1 *12,4*^$31,0*^&durchschnittliche Fläche des Perikaryons der Neuronen, µm<2>111.999.999.498.9101.399.8durchschnittliche Fläche eines Neuronenkerns, µm<2>88.964.1*62.8*63.4*73.9*^$70.1*^Spezifische Fläche der Perikaryonen, %28.625.324.925.326.025.8 Anmerkung: * - p <0,05 - die Unterschiede sind im Vergleich zur Gruppe 1 signifikant; ^ - p <0,05 - die Unterschiede sin dim Vergleich zur Gruppe 2 signifikant; $ - p <0,05 - die Unterschiede sind im Vergleich zur Gruppe 3 signifikant; & - p <0,05 - die Unterschiede sind im Vergleich zur Gruppe 4 signifikant.

[0214] So wurde beim Modellieren einer hypertonischen Enzephalopathie mit einer vierwöchigen Einwirkung großer Gravitationskräfte bei den Tieren aus der Gruppe 2 eine ausgeprägte Zunahme der Anzahl der geschädigten Zellen in allen Zonen beobachtet. Dies wurde von einer erheblichen Verringerung der spezifischen Fläche des Perikaryons der Neuronen in den Zonen CA1, CA2 II CA3 und von Merkmalen einer Störung der Blutzirkulation in den Mikrogefäßen begleitet, die die Entwicklung psychoneurologischer Störungen fördern. Diese pathologischen Veränderungen traten gleichfalls bei der Verwendung von Placebo-Mustern (Gruppe 3 und Gruppe 4) auf. Mehr noch, bei den Tieren aus den Gruppen 5 und 6 waren die zu beobachtenden Unterschiede im Vergleich zu den Parametern der intakten Ratten in erheblich geringerem Maße im Vergleich zum Placebo ausgeprägt. Die Unterschiede zwischen den Werten der Gruppen des Musters 1 (Gruppen 5 und 6) und der Placebo-Gruppen (Gruppen 3 bzw. 4) waren hinsichtlich der meisten zu untersuchenden Parameter statistisch signifikant.

[0215] Somit kann man die Schlussfolgerung ziehen, dass das Muster 1 (Iteration embryonaler Schweinezellen) Effektivität bei der Behandlung der experimentellen hypertonischen Enzephalopathie bei Ratten demonstrierte.

[0216] Beispiel 13. Iterationen, die unter Verwendung von Herzstammzellen und Wasser als neutrales Trägermittel gewonnen wurden.

[0217] Der Prozess der Gewinnung der Iterationen umfasste mehrere Etappen. Ein 5-Milliliter-Fläschchen mit einer frisch zubereiteten Ausgangslösung (Suspension von Herzstammzellen, 2×10<4>Zellen/ml) in einem Umfang von 5 ml und ein 40-Milliliter-Fläschchen mit gereinigtem Wasser (einem neutralen Trägermittel) in einem Umfang von 35 ml wurden auf einem Vortex zehn Sekunden lang einer Rotation von 3000 U/min in einem engen Kontakt ausgesetzt. Danach wurden die beiden Fläschchen eine Minute lang bei Zimmertemperatur in einem engen Kontakt inkubiert. Mit Hilfe der oben beschriebenen Prozedur wurden 35 ml der Iteration 0 (I<0>) gewonnen.

[0218] Danach wurde ein 40-Milliliter-Fläschchen mit der I<0>(35 ml) neben einem neuen 40-Milliliter-Fläschchen mit 35 ml des neutralen Trägermittels angeordnet und während fünfzehn Sekunden mit 3000 U/min in einem engen Kontakt bewegt. Danach inkubierte man die beiden Fläschchen während einer Minute bei Zimmertemperatur in einem engen Kontakt. Das erhaltene Fläschchen mit dem neutralen Trägermittel wurde als I<1>bezeichnet. Danach wiederholte man die Prozedur zur Gewinnung einer nächsten Iteration (Nr. 2, Nr. 3 usw.) mehrfach, wobei das Fläschchen mit einer neuen Portion des neutralen Trägermittels und ein Fläschchen der vorangegangenen Iteration zusammen per Wirbelverfahren bewegt wurden.

[0219] Die Temperatur und Feuchtigkeit im Labor während der Vorbereitung der Muster und der nachfolgenden Messungen wurden mit Hilfe des Thermohygrographen IVA-6N kontrolliert; die Temperatur betrug 22±3 °C, der Feuchtigkeitsgrad - 20-70 %. Für die Zubereitung der Iterationen verwendete man durchsichtige Fläschchen aus Borosilikatglas (mit einem Volumen von 40 und 60 ml, Glastechnik Grafenroda, Infochroma AG, Schweiz) oder Reagenzgläser (mit einem Volumen von 100, 250 und 500 ml, Simax, Tschechien).

[0220] Als neutrales Trägermittel für die Zubereitung der Iterationen, aber auch für alle anderen Reagenzien, die in dieser Arbeit verwendet werden, wurde Wasser des Typs 1 (ultrareines) mit einem spezifischen Widerstand von 18,2 mΩ×cm (Milli-Q Integral 5, Millipore) genutzt. Die Qualität des gereinigten Wassers wurde täglich durch eine Messung des spezifischen Widerstands mit Hilfe des Konduktometers SevenCompact S230 (Mettler Toledo) kontrolliert, und die Kontrolle des pH-Wertes mit Hilfe des pH-Messgerätes SevenCompact S220 (Mettler Toledo). Für die Flüssigkeiten verwendete man automatische Pipetten unterschiedlichen Volumens (Eppendorf, Deutschland; Socorex, Schweiz), aber auch gläserne Messgefäße der Genauigkeitsklasse A (Borosil, Indien; Steklopribor, Ukraine). Die trockenen Reagenzien wog man auf analytischen Waagen der Genauigkeitsklasse I (Pioneer PA214C, Ohaus, USA). Für die Messung der Zeit der Inkubation verwendete man einen geeichten Labortimer (Traceable, VWR). Die Vibrationseinwirkung erfolgte mit Hilfe des Basis-Shakers (Wirbel-Shaker) MS 3 (IKA-Werke, Deutschland) mit einem Standardeinsatz.

[0221] In dieser Untersuchung wurde die I<3>(Iteration Nr. 3) verwendet (im Weiteren - Muster 1). Die Aufteilung der gewonnenen Iterationen nach Fraktionen erfolgte, wie im Beispiel 1 beschrieben wurde.

[0222] Die Untersuchung wurde mit dem Modell eines Myokard-Infarkts an männlichen Wistar-Ratten mit einer Masse von 254-270 g im Alter von 2,5 Monaten mit einer anschließenden Therapie in Form einer Transplantation von Herzstammzellen (CPC) durchgeführt.

[0223] Den Infarkt des Myokards löste man durch eine Unterbindung der vorderen absteigenden Koronar-Arterie aus. Vor der Transplantation markierte man die CPC mit dem fluoreszierenden Farbstoff CM-Dil entsprechend den Empfehlungen des Herstellers. Die Tiere wurden in drei Gruppen aufgeteilt - jeweils 24 Tiere in jeder. Kontrollgruppe 1 (vier Injektionen des (Zellkultur-) Mediums M199 ohne Zusätze, jeweils 50 µl intramyokardial); Gruppe des Musters 1 (intramyokardiale Transplantation von CPC - vier intramyokardiale Injektionen von 25×10<4>Zellen in 50 µl des Mediums M199, danach intraventrikuläre Verabreichung des Musters 1 (Iterationen von Herzprogenitorzellen; 5 ml/kg/Tag während 14 Tagen, beginnend eine Stunde nach Modellierung der Pathologie); Gruppe des Musters 2 (intramyokardiale Transplantation von CPC - vier intramyokardiale Injektionen von 25×10<4>Zellen in 50 µl des Mediums M199, mit einer nachfolgenden intraventrikulären Verabreichung des Musters 2 (Kontrollmuster, gereinigtes Wasser; 5 ml/kg/Tag während 14 Tagen, beginnend eine Stunde nach Modellierung der Pathologie).

[0224] Für den Erhalt der Kultur c-kit + CPCs wurden die Herzen der Ratten mit Scheren zerschnitten, um Stückchen mit den Abmessungen 2-3 mm<3>zu erhalten, spülte diese mit einer phospatgepufferten Salzlösung (PBS) und behandelte sie mit einer Lösung aus Fermenten (0,1-%-ige Kollagenase A und 0,2-%-iges Trypsin) während 15 Minuten. Danach fügte man den dreifachen Umfang des Mediums DMEM/F12 mit einem 10-%-igen fetalen Kälberserum hinzu und zentrifugierte das Gemisch während drei Minuten bei 50 g. Die behandelten Stückchen des Myokards spülte man mit einer PBS und legte sie in mit Fibropektin überzogenen Schalen für ein Kultivieren von Zellen, um eine Explant-Kultur zu erhalten. Nach zwei Wochen verwendete man die Explant-Zellen für eine Immunmagnet-Selektion unter Verwendung primärer c+kit- und CD45-Antikörper und sekundärer Antikörper, die mit Magnetperlen konjugiert wurden. Das Kultivieren der c-kit+CD45-CPC wurde in dem Medium DMEM/F12 vorgenommen, das durch 10-%-iges embryonales Kälberserum, 100 Units/ml von Penicillin/Streptomycin, 2 mM L-Glutamin, 2-%-iges B27, einer Insulin-Transferrin-Selen-Lösung und Wachstumsfaktoren (20 ng/ml bFGF, 20 ng/ml EGF und 10 ng/ml LIF) ergänzt wurde.

[0225] Am 15. Tag des Experiments wurden die Tiere geopfert, und es wurde eine Bewertung der Migration der CPC aus dem Bereich der Transplantation vorgenommen. Vor der Entnahme des Herzens führte man in das linke Ventrikel 0,1 ml einer gesättigten KCl-Lösung ein, was zu einer Einstellung der Kontraktionen in der Diastole führte. Die Vorhöfe und großen Gefäße wurden ausgeschnitten, die Herzen wurden mit einer isotonischen Natriumchlorid-Lösung durchgespült, in das Kryomedium OCT eingebettet und in flüssigem Stickstoff eingefroren. Die Kryoschnittpräparate des Herzens (mit einer Stärke von 7 µm, zugeschnitten mit einem Intervall von 300 µm zwischen den Schnitten von der Spitze bis zur Basis des linken Ventrikels) wurden bei einer Temperatur von -70 °C aufbewahrt. Weiter beurteilten wir die Anzahl der CPC, die nach der Transplantation überlebten und die Fluoreszenz-Markierung Cell Tracker CM-Dil enthielten, und die Lebensfähigkeit der transplantierten CPC, die mit Antikörpern zum Proliferationsmarker Ki67 eingefärbt wurden. Bei der Arbeit wurde das Zeiss Axiovert 200M - ein inverses Mikroskop mit Fluoreszenz und Phasenkontrast - und die Software Axiovision 3.1 verwendet.

[0226] Bei der Arbeit mit den Tieren wurden alle allgemein üblichen Standards der experimentellen Ethik (Richtlinie 2010/63/EU des Europäischen Parlaments und des Rates vom 22. September 2010 zum Schutz der für wissenschaftliche Zwecke verwendeten Tiere) eingehalten.

[0227] Für die statistische Verarbeitung der Ergebnisse verwendete man eine einseitige Dispersionsanalyse mit dem Tukey-Post-hoc-Test. Die Unterschiede zwischen den Gruppen wurden bei p<0,05 als statistisch signifikante angesehen.

[0228] Die Ergebnisse der Untersuchung sind in Tabelle 16 ausgewiesen worden.

Tabelle 16. Einfluss der zu testenden Muster auf die Lebensfähigkeit der Herzstammzellen (CPC), die in die Herzen der Ratten im Rahmen des Modells eines Infarkts des Myokards transplantiert wurden (M±m).

[0229] Kontrollmuster33±139±3Muster 1131±38*25±4*Muster 238±177±3 Anmerkung: * - die Unterschiede sind im Vergleich zum Muster 2 (Kontrollmuster, gereinigtes Wasser) und der Kontrollgruppe (ohne Verabreichung des Musters) signifikant.

[0230] Die Analyse der Daten hat gezeigt, dass in der Gruppe ohne Verabreichung der Muster (Kontrollgruppe) und in der Gruppe des Musters 2 (gereinigtes Wasser) die transplantierten CPC ausschließlich in Form ausgedehnter Ansammlungen lokalisiert wurden und praktisch aus dem Bereich der primären Einführung nicht migrierten. Zur gleichen Zeit hat sich die Retention der transplantierten Zellen nicht unterschieden, statistisch signifikante Unterschiede hatte es zwischen diesen Gruppen nicht gegeben. Die Behandlung mit dem Muster 1 führte zu einer ausgeprägten Integration der CPC in das Myokard und zur Bewahrung einer erheblich größeren Anzahl transplantierter Zellen. Dieser Parameter überstieg in der Gruppe des Musters 1 den Wert der Kontrollgruppe um das 4fache (p<0,05) der Gruppe des Musters 2 um das 3,5fache (p<0,05).

[0231] Bei der Beurteilung der Lebensfähigkeit der transplantierten CPC in Bezug auf den Grad der Proliferation war die Anzahl der markierten Cardiolipin-Antikörper (CLAK), die den Proliferationsmarker Ki67 deutlich machen (dessen Expression bewirken), als Antwort auf das Verabreichen des Musters 1 glaubhaft größer als in den Gruppen zur Kontrolle und des Musters 2. Hinsichtlich dieses Parameters hatte der Mittelwert für die Gruppe des Musters 1 den Wert für die Kontrollgruppe um das 2,8fache (p<0,05) übertroffen, und für die Gruppe des Musters 2 - um das 3,6fache (p<0,05).

[0232] Somit war gezeigt worden, dass das Muster 1 (Iterationssuspension von Herzstammzellen) eine spezifische Aktivität hinsichtlich der Effektivität der Zelltransplantation demonstriert: Es vergrößert erheblich die Verteilung der transplantierten Zellen und sichert die Bewahrung einer erheblich größeren Anzahl proliferierender Zellen im geschädigten Myokard im Vergleich zur Gruppe des Musters 2 (gereinigtes Wasser).

[0233] Beispiel 14. Iterationen, die unter Verwendung von Gewebe aus den Hoden einer neugeborenen Ratte und von Wasser als neutrales Trägermittel gewonnen wurden.

[0234] Der Prozess der Gewinnung der Iterationen umfasste mehrere Etappen. Ein 5-Milliliter-Fläschchen mit einer frisch zubereiteten Ausgangslösung (testikuläres Gewebe einer neugeborenen männlichen Outbreeding-Ratte, 1 mg) in einem Umfang von 5 ml und ein 40-Milliliter-Fläschchen mit gereinigtem Wasser (einem neutralen Trägermittel) in einem Umfang von 35 ml wurden auf einem Vortex 30 Sekunden lang einer Rotation von 3000 U/min in einem engen Kontakt ausgesetzt. Danach wurden die beiden Fläschchen eine Minute lang bei Zimmertemperatur in einem engen Kontakt inkubiert. Mit Hilfe der oben beschriebenen Prozedur wurden 35 ml der Iteration 0 (I<0>) gewonnen.

[0235] Danach wurde ein 40-Milliliter-Fläschchen mit der I<0>(35 ml) neben einem neuen 40-Milliliter-Fläschchen mit 35 ml des neutralen Trägermittels angeordnet und während 30 Sekunden mit 3000 U/min in einem engen Kontakt bewegt. Danach inkubierte man die beiden Fläschchen während zwei Minuten bei Zimmertemperatur in einem engen Kontakt. Das erhaltene Fläschchen mit dem neutralen Trägermittel wurde als I<1>bezeichnet. Danach wiederholte man die Prozedur zur Gewinnung einer nächsten Iteration (Nr. 2, Nr. 3 usw.) mehrfach, wobei das Fläschchen mit einer neuen Portion des neutralen Trägermittels und ein Fläschchen der vorangegangenen Iteration zusammen per Wirbelverfahren bewegt wurden.

[0236] Die Temperatur und Feuchtigkeit im Labor während der Vorbereitung der Muster und der nachfolgenden Messungen wurden mit Hilfe des Thermohygrographen IVA-6N kontrolliert; die Temperatur betrug 22±3 °C, der Feuchtigkeitsgrad - 20-70 %. Für die Zubereitung der Iterationen verwendete man durchsichtige Fläschchen aus Borosilikatglas (mit einem Volumen von 40 und 60 ml, Glastechnik Grafenroda, Infochroma AG, Schweiz) oder Reagenzgläser (mit einem Volumen von 100, 250 und 500 ml, Simax, Tschechien).

[0237] Als neutrales Trägermittel für die Zubereitung der Iterationen, aber auch für alle anderen Reagenzien, die in dieser Arbeit verwendet werden, wurde Wasser des Typs 1 (ultrareines) mit einem spezifischen Widerstand von 18,2 mΩ×cm (Milli-Q Integral 5, Millipore) genutzt. Die Qualität des gereinigten Wassers wurde täglich durch eine Messung des spezifischen Widerstands mit Hilfe des Konduktometers SevenCompact S230 (Mettler Toledo) kontrolliert, und die Kontrolle des pH-Wertes mit Hilfe des pH-Messgerätes SevenCompact S220 (Mettler Toledo). Für die Flüssigkeiten verwendete man automatische Pipetten unterschiedlichen Volumens (Eppendorf, Deutschland; Socorex, Schweiz), aber auch gläserne Messgefäße der Genauigkeitsklasse A (Borosil, Indien; Steklopribor, Ukraine). Die trockenen Reagenzien wog man auf analytischen Waagen der Genauigkeitsklasse I (Pioneer PA214C, Ohaus, USA). Für die Messung der Zeit der Inkubation verwendete man einen geeichten Labortimer (Traceable, VWR). Die Vibrationseinwirkung erfolgte mit Hilfe des Basis-Shakers (Wirbel-Shaker) MS 3 (IKA-Werke, Deutschland) mit einem Standardeinsatz.

[0238] In dieser Untersuchung wurde die Iteration I<4>(Iteration Nr. 4) verwendet (im Weiteren - Muster 1). Die Aufteilung der gewonnenen Iterationen nach Fraktionen erfolgte, wie im Beispiel 1 beschrieben wurde.

[0239] Die Untersuchung erfolgte am Modell eines abdominalen Kryptorchismus unter Verwendung von männlichen Out-Breeding-Ratten mit einer Masse von 262 bis 274 g und einem Alter von drei Monaten. Bei 16 Tieren hatte man zwecks Störung der Spermatogenese vorab eine Pathologie durch eine Verlagerung beider Hoden aus dem Hodensack über den Leistenkanal in die Bauchhöhle und deren Fixierung mit einer Ligatur an der Seitenwand modelliert. Nach zwei Wochen brachte man die Hoden zurück in den Hodensack. In dieser Zeit hatte man auch unter der Tunica albuginea Gewebe der Hoden eingepflanzt, das von neugeborenen Jungtieren der Ratten (ein, zwei Tage nach der Geburt) gewonnen wurde. Danach teilte man die Tiere in zwei Gruppen mit jeweils acht Tiere in jeder auf und verabreichte ihnen während 14 Tagen intraventrikulär das Muster 1 (Iterationen des Gewebes von Hoden neugeborener (Ratten); 5 ml/kg/Tag) oder das Muster 2 (Kontrollmuster, gereinigtes Wasser; 5 ml/kg/Tag). Die Technik der Transplantation bestand in einer Durchtrennung der Tunica albuginea in der avaskulären Zone, der Bildung eines Tunnels unter der Tunica albuginea mit Hilfe einer mikrochirurgischen Sonde und dem Einbetten eines Fragments des neonatalen Testikulargewebes in diesen mit einem anschließenden Vernähen der Schnittstelle in der Tunica testis.

[0240] Die Tiere untersuchte man einen Monat nach der Retraktion der Hoden. Entnommen wurden Blutproben für eine Bestimmung des Testosteron-Spiegels im Blut. Man entfernte die Hoden, bestimmte ihre Masse durch ein Wiegen. Und aus dem Bereich der Transplantation entnahm man Gewebeproben für eine histologische Untersuchung. Die Konzentration des Testosterons im Blutserum bestimmte man mit dem Verfahren einer Chemilumineszenz-Immunanalyse mit Hilfe des immunchemischen Analysegerätes Access 2 (Beckman Coulter, USA). Die histologische Untersuchung erfolge entsprechend der Standardmethodik mit einem Einfärben der Paraffin-Schnittpräparate mit Hämatoxylin und Eosin.

[0241] Bei der Arbeit mit den Tieren wurden alle allgemein üblichen Standards der experimentellen Ethik (Richtlinie 2010/63/EU des Europäischen Parlaments und des Rates vom 22. September 2010 zum Schutz der für wissenschaftliche Zwecke verwendeten Tiere) eingehalten.

[0242] Für die statistische Verarbeitung der Ergebnisse verwendete man eine einseitige Dispersionsanalyse mit dem Tukey-Post-hoc-Test. Die Unterschiede zwischen den Gruppen wurden bei p<0,05 als statistisch signifikante angesehen.

[0243] Die Analyse der gewonnenen Daten hat gezeigt, dass sich alle Transplantate akklimatisiert hatten, und ihre Abmessungen haben mit Zunahme der Beobachtungszeit zugenommen. Dabei hatte sich die Masse des Organs in der Gruppe des Musters 1 in größerem Maße als in der Gruppe des Musters 2 vergrößert, wobei sie sich der physiologischen Norm von 1,61±0,03 g bis zum Ende des Experiments angenähert hatte.

[0244] Die quantitative Analyse der Parameter, die den Zustand der kryptorchiden Hoden charakterisiert, und zwar die Anzahl der leeren Kanälchen pro Flächeneinheit des histologischen Präparats, die Anzahl der Sertoli-Zellen im Kanälchen 1, die Anzahl der Leydig-Zellen je Flächeneinheit des Präparats, aber auch das Vorhandensein spermatogener Zellen mit einem unterschiedlichen Differenzierungsgrad, demonstrierte die therapeutische Wirkung des Musters 1. So machte in der Kontrollgruppe (Muster 2) der Anteil der vollkommen leeren Kanälchen einen Monat nach der Retraktion des Hodens 71,4±7,3 % aus, während sich wie in der Gruppe des Musters 1 ihr Anteil erheblich verringerte und ganze 8,0±0,7 % ausmachte. Die Anzahl der Sertoli-Zellen pro Kanälchen betrug in der Kontrollgruppe im Durchschnitt 3,3±0,7 Zellen. In der Gruppe des Musters 1 hatte sich aber dieser Parameter bis auf 36,6±2,7 Zellen erhöht. Die Anzahl der interstitiellen Leydig-Zellen je Flächeneinheit machte in der Kontrollgruppe 3,7±0,6 Zellen aus, und in der Gruppe des Musters 1 - 40,8±4,1 Zellen.

[0245] Ein wichtiger Parameter für den Zustand der Spermatogenese ist ihre Abgeschlossenheit, die histologisch durch eine Identifizierung der Zellen bestimmt wird. Die Analyse der Ergebnisse hat gezeigt, dass in der Kontrollgruppe (Muster 2) in der überwiegenden Mehrzahl der Kanälchen mit einer Bewahrung des spermatogenen Epitheliums ein Block der Spermatogenese auf dem Level der Spermatogonien oder der Spermatozyten der 1. Ordnung festgestellt wurde. Zur gleichen Zeit erreichte in der Gruppe des Musters 1 die Spermatogenese das Stadium der Spermatozyten der 2. Ordnung, und in der Mehrheit der Fälle war sie vollkommen abgeschlossen worden (Samenfäden waren im Lumen der Kanälchen entdeckt worden) (siehe Tab. 17).

Tabelle 17. Einfluss der zu testenden Muster auf die Transplantation neonatalen Testikulargewebes für eine Wiederherstellung der gestörten Spermatogenese in den kryptorchiden Hoden

[0246] Spermatogonien des Typs A (helle)100%100%Spermatogonien des Typs A (dunkle)100%100%Spermatogonien des Typs B100%64%Spermatozyten der 1. Ordnung100%*37%Spermatozyten der 2. Ordnung100%*12,5%Samenfäden74%*0% Anmerkung: * - Die Unterschiede sind im Vergleich zum Muster 2 (Kontrollmuster, gereinigtes Wasser) signifikant.

[0247] Die Bestimmung der Testosteron-Konzentration im Blut (Parameter für die funktionale Aktivität des Hodengewebes) hat gezeigt, dass in der Gruppe des Musters 2 einen Monat nach dem Hereinziehen der Hoden in den Hodensack dieser Wert 1,48±0,3 ng/ml ausmachte. Zur gleichen Zeit hatte sich als Antwort auf das Verabreichen des Musters 1 der Testosteron-Spiegel bis auf 3,17±0,7 ng/ml erhöht.

[0248] Somit wurde gezeigt, dass das Muster 1 (Iterationen von Gewebe der Hoden neugeborener (Ratten)) einen positiven Einfluss auf die Effektivität der Transplantation von Geweben neugeborener (Ratten) ausübt. Das transplantierte unreife Gewebe der Hoden durchlief eine normale Entwicklung mit Herausbildung der typischen Strukturen des reifen Organs, was beim Muster 2 (Kontrollmuster, gereinigtes Wasser) nicht beobachtet wurde.

[0249] Beispiel 15. Iterationen, die unter Verwendung von Mastzellen und von Wasser als neutrales Trägermittel gewonnen wurden.

[0250] Der Prozess der Gewinnung der Iterationen umfasste mehrere Etappen. Ein 5-Milliliter-Fläschchen mit einer frisch zubereiteten Ausgangslösung (Suspension von Mastzellen erwachsener männlicher Out-Breeding-Ratten, 2×10<4>Zellen/ml) in einem Umfang von 5 ml und ein 40-Milliliter-Fläschchen mit gereinigtem Wasser (einem neutralen Trägermittel) in einem Umfang von 35 ml wurden auf einem Vortex zehn Sekunden lang einer Rotation von 3000 U/min in einem engen Kontakt ausgesetzt. Danach wurden die beiden Fläschchen eine Minute lang bei Zimmertemperatur in einem engen Kontakt inkubiert. Mit Hilfe der oben beschriebenen Prozedur wurden 35 ml der Iteration 0 (I<0>) gewonnen.

[0251] Danach wurde ein 40-Milliliter-Fläschchen mit der I<0>(35 ml) neben einem neuen 40-Milliliter-Fläschchen mit 35 ml des neutralen Trägermittels angeordnet und während zehn Sekunden mit 3000 U/min in einem engen Kontakt bewegt. Danach inkubierte man die beiden Fläschchen während einer Minute bei Zimmertemperatur in einem engen Kontakt. Das erhaltene Fläschchen mit dem neutralen Trägermittel wurde als I<1>bezeichnet. Danach wiederholte man die Prozedur zur Gewinnung einer nächsten Iteration (Nr. 2, Nr. 3 usw.) mehrfach, wobei das Fläschchen mit einer neuen Portion des neutralen Trägermittels und ein Fläschchen der vorangegangenen Iteration zusammen per Wirbelverfahren bewegt wurden.

[0252] Die Temperatur und Feuchtigkeit im Labor während der Vorbereitung der Muster und der nachfolgenden Messungen wurden mit Hilfe des Thermohygrographen IVA-6N kontrolliert; die Temperatur betrug 22±3 °C, der Feuchtigkeitsgrad - 20-70 %. Für die Zubereitung der Iterationen verwendete man durchsichtige Fläschchen aus Borosilikatglas (mit einem Volumen von 40 und 60 ml, Glastechnik Grafenroda, Infochroma AG, Schweiz) oder Reagenzgläser (mit einem Volumen von 100, 250 und 500 ml, Simax, Tschechien).

[0253] Als neutrales Trägermittel für die Zubereitung der Iterationen, aber auch für alle anderen Reagenzien, die in dieser Arbeit verwendet werden, wurde Wasser des Typs 1 (ultrareines) mit einem spezifischen Widerstand von 18,2 mΩ×cm (Milli-Q Integral 5, Millipore) genutzt. Die Qualität des gereinigten Wassers wurde täglich durch eine Messung des spezifischen Widerstands mit Hilfe des Konduktometers SevenCompact S230 (Mettler Toledo) kontrolliert, und die Kontrolle des pH-Wertes mit Hilfe des pH-Messgerätes SevenCompact S220 (Mettler Toledo). Für die Flüssigkeiten verwendete man automatische Pipetten unterschiedlichen Volumens (Eppendorf, Deutschland; Socorex, Schweiz), aber auch gläserne Messgefäße der Genauigkeitsklasse A (Borosil, Indien; Steklopribor, Ukraine). Die trockenen Reagenzien wog man auf analytischen Waagen der Genauigkeitsklasse I (Pioneer PA214C, Ohaus, USA). Für die Messung der Zeit der Inkubation verwendete man einen geeichten Labortimer (Traceable, VWR). Die Vibrationseinwirkung erfolgte mit Hilfe des Basis-Shakers (Wirbel-Shaker) MS 3 (IKA-Werke, Deutschland) mit einem Standardeinsatz.

[0254] In dieser Untersuchung wurde die I<6>(Iteration Nr. 6) verwendet (im Weiteren - Muster 1). Die Aufteilung der gewonnenen Iterationen nach Fraktionen erfolgte, wie im Beispiel 1 beschrieben wurde.

[0255] Die Untersuchung wurde an männlichen Out-Breeding-Mäusen mit einer Masse von 19-21 g und einem Alter von 2-2,5 Monaten durchgeführt. Die Tiere waren in drei Gruppen - jeweils zwölf in jeder - aufgeteilt worden. Die Mäuse der intakten Gruppe wurden während 14 Tagen keinerlei Manipulationen ausgesetzt. Die Tiere der beiden übrigen Gruppen wurden durch ein experimentelles Allergen aus Wolle sensibilisiert. Das Allergen in einer Dosis von 500 PNU/ml verabreichte man intraperitonal in einem Umfang von 0,1 ml, zweimal in einem Intervall von einem Tag. Einen Tag nach der letzten Injektion verabreichte man den Mäusen das Allergen in einer Dosis von 1000 PNU/ml in einem Umfang von 0,1 ml. Vorgenommen wurden zwei Injektionen mit einem Intervall von einem Tag. Ab dem Tag der letzten Injektion zählte man sieben Tage, wonach die Tiere einer zervikalen Dislokation ausgesetzt wurden. Danach gab man in die Bauchhöhle 5 ml einer phosphatgepufferten Salzlösung mit einem pH-Wert von pH=7,4, die bis auf eine Temperatur von 37 °C erhitzt worden war, und massierte die Bauchwand der jeweiligen Maus während ein, zwei Minuten. Die Peritoneal-Spülung wurde mit einer Spritze erfasst und in Reagenzglas mit Heparin (20 Units/ml) gegeben, danach zentrifugierte man sie bei einer Rotation von 1000 U/min während zehn Minuten. Die Zell-Körnchen löste man in einer phosphatgepufferten Salzlösung (PBS) mit einem pH-Wert von 7,4 auf. Die Suspension der Mastzellen, die von jedem Tier gewonnen wurde, teilte man in zwei Untergruppen auf, damit man die folgenden Stoffe hinzufügen konnte: PBS, PBS + Allergen, Muster 1 + Allergen oder Muster 2 + Allergen (siehe Tab. 18). Die PBS fügte man mit einem pH-Wert von 7,4 hinzu, und das Allergen fügte man in einer Dosis von 100 PNU/ml in einem Umfang von 0,1 ml hinzu. Das Muster 1 (Iteration von Mastzellen, 10 Mikroliter/ml) oder das Muster 2 (Kontrollmuster, gereinigtes Wasser, 10 Mikroliter/ml) fügte man in einem Umfang von 0,1 ml hinzu. Die Reagenzgläser inkubierte man bei 37 °C während 15 Minuten. Danach fügte man eine 0,1-%-ige Lösunmg von Toluidinblau hinzu und inkubierte zusätzlich die Muster bei einer Temperatur von 37 °C während zwanzig Minuten. In 20 Mikroliter der gewonnenen Lösung zählte man 100 Mastzellen, unter denen man die Anzahl der degranulierten Mastzellen bestimmte. Der Test wurde als ein negativer angesehen, wenn der Prozentsatz der Zellen mit solch einer Reaktion keine 15 % überstieg.

[0256] Bei der Arbeit mit den Tieren wurden alle allgemein üblichen Standards der experimentellen Ethik (Richtlinie 2010/63/EU des Europäischen Parlaments und des Rates vom 22. September 2010 zum Schutz der für wissenschaftliche Zwecke verwendeten Tiere) eingehalten.

[0257] Für die statistische Verarbeitung der Ergebnisse wurde eine einseitige Dispersionsanalyse mit dem Tukey-Post-hoc-Test verwendet. Die Unterschiede zwischen den Gruppen wurden bei p<0,05 als signifikante angesehen.

[0258] Die Ergebnisse der Untersuchung sind in Tabelle 18 ausgewiesen worden.

Tabelle 18. Einfluss der zu testenden Muster auf den Prozentsatz der Degranulierung der Mastzellen, die von intakten Mäusen und von Mäusen, die mit dem Allergen von epidermaler Wolle sensibilisiert wurden, gewonnen wurden (M±m)

[0259] PBS6.1±1.3%8.2±1.4%PBS + Allergen10.3±1.1%22.3±1.2%<#>Muster 1 + Allergen2.3±0.1%*7.7±1.2%*Muster 2 + Allergen9.3±1.7%19.6±1.3% Anmerkung: * - die Unterschiede sind im Vergleich zu dem Wert für die Kombination „PBS + Allergen“ in der entsprechenden Gruppe signifikant; # - die Unterschiede sind im Vergleich zur intakten Gruppe mit dem Parameter „PBS“ in der entsprechenden Gruppe signifikant.

[0260] Laut den gewonnenen Daten erfolgt in den Mastzellen, die von intakten Tieren gewonnen wurden, bei Einwirkung des Allergens eine Zunahme der Anzahl der degranulierten Mastzellen um das 1,7fache (im Vergleich zur PBS). Solch ein Prozentsatz für die Degranulierung der Mastzellen belegt jedoch nicht das Bestehen einer Sensibilisierung bei den Tieren der intakten Gruppe gegenüber diesem Allergen. Die Anzahl der degranulierten Mastzellen hat sich bei Hinzufügen des Musters 1 zu den Zellen der Tiere aus der intakten Gruppe um das 4,5fache im Vergleich zur Wirkung der Kombination „PBS + Allergen“ (p<0,05) und um das 4fache im Vergleich zur Kombination „Muster 2 + Allergen“ (p<0,05) verringert, was eine stabilisierende Wirkung des Musters 1 auf die Mastzellen belegt.

[0261] In den Mastzellen, die von sensibilisierten Tieren gewonnen wurden, war der Prozentsatz der Mastzellen, die bei Hinzufügen des Allergens degranulierten, um das 2,7fache höher als in der entsprechenden Kontrollgruppe (PBS). Die ausgewiesene Zunahme der Anzahl degranulierter Mastzellen belegt ein ausgeprägtes Auftreten einer allergischen Reaktion (p<0,05). Bei Hinzufügen des Musters 1 zu den Zellen der sensibilisierten Gruppe im Beisein des Allergens wurde eine erhebliche Verringerung der Anzahl der degranulierten Mastzellen beobachtet (um das 2,9fache im Vergleich zur Wirkung der Kombination „PBS + Allergen“ (p<0,05) und um das 2,5fache im Vergleich zur Kombination „Muster 2 + Allergen“ (p<0,05)). Dabei hatte sich die Wirkung der Probe hinsichtlich des absoluten Wertes statistisch nicht signifikant vom Wert der physiologischen Normen unterschieden (d. h. vom Prozentsatz der Degranulierung der Mastzellen, die von intakten Tieren unter Einwirkung der PBS gewonnen wurden, unterschieden.

[0262] Somit ist bewiesen worden, dass das Muster 1 (eine Iteration von Mastzellen) eine stabilisierende Wirkung auf Mastzellen (eine antiallergische Wirkung) ausübt, indem der Prozess der Degranulierung der Mastzellen unterdrückt wird.

[0263] Beispiel 16. Iterationen, die unter Verwendung eines Myokards und von Wasser als neutrales Trägermittel gewonnen wurden.

[0264] Der Prozess der Gewinnung der Iterationen umfasste mehrere Etappen. Ein 5-Milliliter-Fläschchen mit einer frisch zubereiteten Ausgangslösung (Myokard einer erwachsenen männlichen Wistar-Ratte, 15 mg) in einem Umfang von 5 ml und ein 40-Milliliter-Fläschchen mit gereinigtem Wasser (einem neutralen Trägermittel) in einem Umfang von 35 ml wurden auf einem Vortex zehn Sekunden lang einer Rotation von 3000 U/min in einem engen Kontakt ausgesetzt. Danach wurden die beiden Fläschchen eine Minute lang bei Zimmertemperatur in einem engen Kontakt inkubiert. Mit Hilfe der oben beschriebenen Prozedur wurden 35 ml der Iteration 0 (I<0>) gewonnen.

[0265] Danach wurde ein 40-Milliliter-Fläschchen mit der I<0>(35 ml) neben einem neuen 40-Milliliter-Fläschchen mit 35 ml des neutralen Trägermittels angeordnet und während fünfzehn Sekunden mit 3000 U/min in einem engen Kontakt bewegt. Danach inkubierte man die beiden Fläschchen während zwei Minuten bei Zimmertemperatur in einem engen Kontakt. Das erhaltene Fläschchen mit dem neutralen Trägermittel wurde als I<1>bezeichnet. Danach wiederholte man die Prozedur zur Gewinnung einer nächsten Iteration (Nr. 2, Nr. 3 usw.) mehrfach, wobei das Fläschchen mit einer neuen Portion des neutralen Trägermittels und ein Fläschchen der vorangegangenen Iteration zusammen per Wirbelverfahren bewegt wurden.

[0266] Die Temperatur und Feuchtigkeit im Labor während der Vorbereitung der Muster und der nachfolgenden Messungen wurden mit Hilfe des Thermohygrographen IVA-6N kontrolliert; die Temperatur betrug 22±3 °C, der Feuchtigkeitsgrad - 20-70 %. Für die Zubereitung der Iterationen verwendete man durchsichtige Fläschchen aus Borosilikatglas (mit einem Volumen von 40 und 60 ml, Glastechnik Grafenroda, Infochroma AG, Schweiz) oder Reagenzgläser (mit einem Volumen von 100, 250 und 500 ml, Simax, Tschechien).

[0267] Als neutrales Trägermittel für die Zubereitung der Iterationen, aber auch für alle anderen Reagenzien, die in dieser Arbeit verwendet werden, wurde Wasser des Typs 1 (ultrareines) mit einem spezifischen Widerstand von 18,2 mΩ×cm (Milli-Q Integral 5, Millipore) genutzt. Die Qualität des gereinigten Wassers wurde täglich durch eine Messung des spezifischen Widerstands mit Hilfe des Konduktometers SevenCompact S230 (Mettler Toledo) kontrolliert, und die Kontrolle des pH-Wertes mit Hilfe des pH-Messgerätes SevenCompact S220 (Mettler Toledo). Für die Flüssigkeiten verwendete man automatische Pipetten unterschiedlichen Volumens (Eppendorf, Deutschland; Socorex, Schweiz), aber auch gläserne Messgefäße der Genauigkeitsklasse A (Borosil, Indien; Steklopribor, Ukraine). Die trockenen Reagenzien wog man auf analytischen Waagen der Genauigkeitsklasse I (Pioneer PA214C, Ohaus, USA). Für die Messung der Zeit der Inkubation verwendete man einen geeichten Labortimer (Traceable, VWR). Die Vibrationseinwirkung erfolgte mit Hilfe des Basis-Shakers (Wirbel-Shaker) MS 3 (IKA-Werke, Deutschland) mit einem Standardeinsatz.

[0268] In dieser Untersuchung wurde die I<9>(Iteration Nr. 9) verwendet (im Weiteren - Muster 1). Die Aufteilung der gewonnenen Iterationen nach Fraktionen erfolgte, wie im Beispiel 1 beschrieben wurde.

[0269] Die Untersuchung wurde mit dem Modell einer kardio-pulmonalen Insuffizienz an männlichen Wistar-Ratten durchgeführt. Die Tiere im Alter von vier Wochen (Masse: 80-100 g) wurde entsprechend dem Zufallsprinzip in drei Gruppen aufgeteilt: eine intakte Kontrollgruppe (n=15), eine Gruppe mit einer experimentellen Pathologie und einer Therapie mit dem Muster 1 (Iterationen des Myokards, n=15) und eine Gruppe mit einer experimentellen Pathologie und einer Therapie mit dem Muster 2 (Kontrollmuster, gereinigtes Wasser, n=15).

[0270] Für das Modellieren der kardio-pulmonalen Insuffizienz sind den Tieren einmalig intraperitoneal 2 ml einer Kochsalzlösung unter Hinzufügung des Alkaloids Monocrotalin in einer Dosis von 50 mg/kg der Masse des Tieres verabreicht worden. Den intakten Tieren verabreichte man die Kochsalzlösung entsprechend dem analogen Schema ohne Hinzufügen von Monocrotalin. Eine Stunde nach Verabreichung dieser Stoffe und im Weiteren täglich im Verlauf des gesamten Experiments verabreichte man den Tieren der zweiten und der dritten Gruppe das Muster 1 bzw. Muster 2 (2 ml/kg/Tag, intraventrikulär).

[0271] In der siebten, achten Woche (Zeit des Auftretens klinischer Merkmale für eine Herzinsuffizienz: Masseverlust, Atembeschwerden im Ruhezustand) wurden die Tiere aller Gruppen geopfert. 15-20 Minuten vor der Euthanasie verabreichte man den Tieren intramuskulär ein Myorelaxant (Rometar, 1 ml/kg), ein Anästhetikum (Zoletil, 0,02 ml/kg) und Heparin (1000 Units/kg).

[0272] Nach der Euthanasie des Tieres entnahm man das Herz und legte es in eine vorbereitete Wanne mit einer Krebs-Henseleit-Lösung (in mM): (NaCl - 118, KCl - 4,7, MgSO<4>- 1,2, NaHCO<3>- 14,5, KH<2>PO<4>- 1,2, CaCl<2>- 2,5, Glukose - 11,1, pH-Wert - 7,35 unter Hinzufügung von 30 mM von 2,3-Butandion-2-monoxim. Aus dem rechten Ventrikel des Herzens schnitt man die dünne Trabecula heraus und legte sie in eine experimentelle Wanne mit einer fließenden Krebs-Henseleit-Lösung ohne 2,3-Butandion-2-monoxim bei einer ständigen Sättigung durch ein Gemisch aus 95 % O<2>und 5 % CO<2>. Ein Ende der Trabecula befestigte man am Stab des Kraftmessers, das andere - am Stab eines Servomotors für die Länge. Die biomechanischen Messungen im Muskelpräparat wurden mit Hilfe eines Systems für das Studium der Muskelaktivität (Muscle Research System, Scientific Instruments GmbH, Heidelberg, Deutschland) in einer pseudorealen Zeit (mit einem Intervall von 100 µs) sowie unter Verwendung des ADC (analog-digitaler Wandler)/DAC (digital-analoger Wandler) PCI-1716S (Ad-L ink Technology Inc., Taiwan) und der Software, die im Real-Zeit-Regime arbeitet, HyperKernel (Arc Systems Ltd., Japan) durchgeführt. Die Messungen wurden bei einer Frequenz der Elektrostimulierung von 1 Hz und einer Temperatur der physiologischen Lösung von 25 °C. Die isometrische Spannung des Muskels bestimmte man als das Verhältnis der Größe der Kraft des Muskels und seiner Querschnittsfläche, die entsprechend der Formel S = πd2/12 bestimmt wurde, wobei d - der Durchmesser des Muskels in einem nichtgedehnten Zustand.

[0273] Bei der Arbeit mit den Tieren wurden alle allgemein üblichen Standards der experimentellen Ethik (Richtlinie 2010/63/EU des Europäischen Parlaments und des Rates vom 22. September 2010 zum Schutz der für wissenschaftliche Zwecke verwendeten Tiere) eingehalten.

[0274] Für die statistische Verarbeitung der Ergebnisse wurde eine einseitige Dispersionsanalyse mit dem Tukey-Post-hoc-Test verwendet. Die Unterschiede zwischen den Gruppen wurden bei p<0,05 als statistisch signifikante angesehen.

[0275] Die Ergebnisse der Untersuchung sind in den Tabellen 19 und 20 ausgewiesen worden.

Tabelle 19. Einfluss der zu testenden Muster auf die morphometrischen Parameter des Herzmuskels des rechten Ventrikels von Ratten mit einer experimentellen kardio-pulmonalen Insuffizienz (M±m)

[0276] Masse des gesamten Herzes, g0.68±0.0370.70±0.041*0.79±0.022<#>Masse des linken Ventrikels, g0.34±0.0320.35±0.0280.33±0.014Masse des rechten Ventrikels, g0.17±0.0110.16±0,.024*0.33±0.010<#> Anmerkung: * - die Unterschiede sind im Vergleich zum Muster 2 (Kontrollmuster, gereinigtes Wasser) signifikant, # - die Unterschiede sind im Vergleich zu den intakten Tiere signifikant.

Tabelle 20. Einfluss der zu testenden Muster auf die Kontraktilität-Parameter des nicht gedehnten Herzmuskels des rechten Ventrikels von Ratten mit einer experimentellen kardio-pulmonalen Insuffizienz (M±m)

[0277] Amplitude der isometrischen Spannung, mg/mm<2>7.9±1.38.1±1.4*3.1±0.4<#>Zeit für das Erreichen der maximalen Spannung, ms119,0±2,1121,0±2,0*154.0±2.7<#>Zeit der Erschlaffung von der maximalen Spannung bis zu 50 % der Amplitude, ms64.7±2.366.2±3.1*86.5±3.4<#> Anmerkung: * - die Unterschiede sind im Vergleich zum Muster 2 (Kontrollmuster, gereinigtes Wasser) signifikant, # - die Unterschiede sind im Vergleich zu den intakten Tiere signifikant.

[0278] Gemäß den gewonnenen Ergebnissen bestätigen die morphometrischen Werte für das ganze Herz (siehe Tab. 19) und die Parameter für die Kontraktilität der isolierten Muskel-Präparate (siehe Tab. 20) die Entwicklung einer schweren Hypotrophie des Myokards des rechten Ventrikels und einer folgenden kardio-pulmonalen Insuffizienz bei den Ratten in der Gruppe des Musters 2 (Kontrollmuster, gereinigtes Wasser). So wurde in der Gruppe des Musters 2 drei, vier Wochen nach dem einmaligen Einsatz von Monocrotalin eine Zunahme der Masse des ganzen Herzens (um das 1,2fache im Vergleich zu den intakten Tieren), aber auch der Masse des rechten Ventrikels (um das 1,9fache im Vergleich zu den intakten Tieren beobachtet. Dabei hatte sich die Amplitude der isometrischen Spannung drastisch verringert (um das 2,6fache im Vergleich zu den intakten Tieren). Zugenommen hatte die Zeit für das Erreichen des Höhepunkts der Spannung (um das 1,3fache im Vergleich zu den intakten Tieren) und die Zeit für die Erschlaffung vom Höhepunkt der Spannung bis zu 50 % von der Amplitude (um das 1,4fache im Vergleich zu den intakten Tieren).

[0279] In der Gruppe des Musters 1 sind keine pathologischen Veränderungen sowohl der morphologischen Parameter des Herzens als auch der funktionalen Aktivität des Myokards ermittelt worden. Alle gemessenen Parameter entsprachen der physiologischen Norm, was das Nichtbestehen von statistisch signifikanten Unterschieden zwischen der Gruppe des Musters 1 und den intakten Tieren belegt.

[0280] Somit wurde bewiesen, dass das Muster 1 (Iterationen des Myokards) einen positiven Einfluss auf die morphologischen Parameter des Herzens und die funktionale Aktivität des Myokards im Modell einer kardio-pulmonalen Insuffizienz ausübt.

Claims (26)

1. Verfahren für die Gewinnung eines biologischenPräparats, bei dem es sich um ein künstliches materielles Objekt - eine Iteration - handelt, welches über eine biologische Aktivität, die der biologischen Aktivität eines biologischen Objekts ähnlich ist, verfügt - durch eine sukzessive Vibrationsbehandlung eines neutralen Trägermittels im Beisein eines biologischen Objekts, das die Rolle einer biologischen Substanz wahrnimmt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die biologische Aktivität in der Beeinflussung biologischer Objekte oder deren molekularen oder zellulären Ziel im Organismus, aber auch der funktional-metabolischen Prozesse, die durch die biologischen Objekte reguliert werden, die für die Gewinnung eines biologischen Präparats genutzt werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die biologische Substanz ein zelluläres Objekt, das aus einer Zelle, einer Gruppe von Zellen oder einer Vielzahl von Zellen besteht, oder ein extrazelluläres Objekt - ein Prion - darstellt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass eine Vielzahl von Zellen ein Gewebe, ein flüssiges Milieu eines Organismus - Blut oder Lymphe - oder ein Organ darstellen.

5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass Zellen, ihre Vereinigungen oder Zellstrukturen, die aus einem Organismus herausgelöst wurden, verwendet werden.

6. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass Zellen, ihre Vereinigungen und Zellstrukturen außerhalb eines Organismus gezüchtet worden sind.

7. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Zelle um die Zelle eines Makroorganismus handelt.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Zelle eines Mikroorganismus um Bakterien bzw. Viren handelt.

9. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Zellen um normal funktionierende Zellen handelt.

10. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Zellen um atypische Zellen handelt.

11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das biologische Objekt eine biologische Substanz ist, die eine extrazelluläre Struktur darstellt.

12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das als biologische Substanz verwendete biologische Objekt hinsichtlich des Organismus des jeweiligen Patienten ein autogenes, allogenes oder heterologisches ist.

13. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die sukzessive Vibrationsbehandlung des biologischen Objekts einen Prozess darstellt, der umfasst: a) eine äußere Vibrationseinwirkung auf die Reagenzgläser, die das biologische Objekt und ein neutrales Trägermittel enthalten, wobei aus dem neutralen Trägermittel das primäre künstliche Objekt - die Null-Iteration - gewonnen wird; b) eine äußere Vibrationseinwirkung auf eine vorangegangene Iteration und ein neutrales Trägermittel mit Erhalt einer nachfolgenden Iteration aus dem neutralen Trägermittel.

14. Verfahren nach Anspruch 1 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass das neutrale Trägermittel Wasser oder eine wässerige alkoholische Lösung, Laktose oder ein pharmazeutisch akzeptables Trägermittel ist.

15. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Vibrationsbearbeitung ein horizontales oder vertikales mechanisches Schütteln sein kann.

16. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Vibrationsbearbeitung durch eine elektromagnetische, Ultraschall- und akustische Einwirkung oder durch andere rhythmische physikalische Einwirkungen erfolgt.

17. Künstliches Objekt, erhältlich durch ein Verfahren gemäß Anspruch 1, mit einen neutralen Trägermittel, das einer Vibrationseinwirkung im Beisein eines des biologischen Objekts oder einer vorangegangenen Iteration des biologischen Objekts ausgesetzt wurde, und über biologische (pharmakologische) Eigenschaften verfügt, die den Eigenschaften des biologischen Objekts ähnlich sind.

18. Verfahren für die Gewinnung einer Fraktioneines biologischen Präparats - Iteration -, das durch das Verfahren gemäß Anspruch 1 gewonnen wurde und über eine spezifische Aktivität verfügt, umfassend: 1) eine vorherige Aufteilung der gewonnenen Iterationen nach Fraktionen in Abhängigkeit von den durch sie nach der Vibrationsbearbeitung erworbenen physikalisch-chemischen Eigenschaften, die sich von den Eigenschaften des neutralen Trägermittels unterscheiden;

2) die Bestimmung der spezifischen biologischen oder pharmakologischen Aktivität für jede Fraktion mittels Standardmethoden.

19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die physikalisch-chemischen Eigenschaften mit den allgemein üblichen analytischen Methoden gemessen werden.

20. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Aufteilung nach Fraktionen in Abhängigkeit vom Bestehen physikalisch-chemischer Eigenschaften, die sich im Vergleich zum neutralen Trägermittel veränderten, erfolgt.

21. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung der spezifischen Aktivität durch eine Bestimmung der biologischen und/oder chemischen Aktivität der jeweiligen Fraktion unter Nutzung der in der experimentellen Biologie allgemein üblichen Methoden erfolgt.

22. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die analytische Methode jegliche allgemein bekannte validierende analytische Methode für eine Bestimmung der physikalisch-chemischen Eigenschaften eines Stoffs darstellt.

23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass als eine analytische Methode die Messung der spezifischen elektrischen Leitfähigkeit (SELF), die Strahlungsmessung, die Terahertz-Spektroskopie, die Immunofermentanalyse (IFA), die Messung des pH-Wertes, die Bestimmung der Menge gelösten Sauerstoffs, die dynamische Lichtstreuung und die hochauflösende Thermografie ausgewähltwird.

24. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Iterationen für eine weitere experimentelle Bestimmung der biologischen (pharmakologischen) Wirkung aus zwei Fraktionen ausgewählt werden, die sich deutlich hinsichtlich ihrer physikalisch-chemischen Eigenschaften sowohl vom neutralen Trägermittel als auch voneinander - hinsichtlich des Bestehens oder Nichtbestehens eines modifizierenden Einflusses auf die physikalischen Charakteristika der biologischen Ausgangssubstanz - unterscheiden.

25. Arzneimittel, welches das biologische Präparat enthält, das durch das Verfahren nach Anspruch 1 gewonnen wurde, und über eine biologische Aktivität verfügt, die der biologischen Aktivität des biologischen Objekts ähnlich ist.

26. Arzneimittel nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass das biologische Objekt aus einer extrazellulären Struktur, einem Mikroorganismus, einer Zelle, einer Zell-Linie, einem Gewebe, einem Organ oder System von Organen ausgewählt wurde.