CN100346830C - 一种治疗b细胞淋巴瘤的药物组合物 - Google Patents

一种治疗b细胞淋巴瘤的药物组合物 Download PDF

Info

Publication number
CN100346830C
CN100346830C CNB2005101121470A CN200510112147A CN100346830C CN 100346830 C CN100346830 C CN 100346830C CN B2005101121470 A CNB2005101121470 A CN B2005101121470A CN 200510112147 A CN200510112147 A CN 200510112147A CN 100346830 C CN100346830 C CN 100346830C
Authority
CN
China
Prior art keywords
rituximab
saha
lymphoma
cell
pharmaceutical composition
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CNB2005101121470A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1824307A (zh
Inventor
陈竺
陈赛娟
赵维莅
王兰
刘元华
阎金松
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ruinjin Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine Co Ltd
Original Assignee
Ruinjin Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ruinjin Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine Co Ltd filed Critical Ruinjin Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine Co Ltd
Priority to CNB2005101121470A priority Critical patent/CN100346830C/zh
Publication of CN1824307A publication Critical patent/CN1824307A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN100346830C publication Critical patent/CN100346830C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Images

Landscapes

  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明涉及一种治疗B细胞淋巴瘤的药物组合物，该药物由利妥昔(Rituximab，Rituxan，美罗华)和SAHA(suberoylanilide hydroxamic acid，辛二酰苯胺氧肟酸)组成，该药物有明显协同作用，较单用可显著抑制B淋巴瘤细胞生长增殖，协同诱导凋亡，协同抑制NF-κB活性和下调BCL-XL表达。两药组合在提高疗效的同时可大幅降低治疗费用。

Description

一种治疗B细胞淋巴瘤的药物组合物
技术领域
本发明涉及一种治疗癌症的药物组合物，尤其涉及一种治疗B细胞淋巴瘤的药物组合物。
背景技术
淋巴瘤是一种起源于淋巴组织的恶性肿瘤，近年来在世界范围内的发病率几乎增长了一倍，严重危害人类的健康。B细胞淋巴瘤是最常见的淋巴瘤种类，约占淋巴瘤的50-60％。除早期、局限性、低度恶性的B细胞淋巴瘤可单纯使用放射治疗外，目前主要的治疗方式仍为联合化疗。采用联合化疗可使约50-60％的患者获得疾病缓解，20-30％的患者获得长期生存，但大部分患者对治疗无效或治疗后迅速复发，疾病进展快，预后差。更重要的是，化疗的毒副反应大，患者尤其是老年或合并其它疾病患者不能耐受。
CD20广泛表达于B细胞淋巴瘤细胞表面，是开展免疫治疗的理想靶点。近年来，人-鼠嵌合性抗CD20单克隆抗体利妥昔(Rituximab，Rituxan，美罗华)已成功应用于临床，通过抗体介导的针对细胞特异表面标记的免疫治疗，具有低毒，低骨髓抑制和较高特异性的特点，为B细胞淋巴瘤的治疗开辟了新途径。然而患者的治疗费用昂贵，部分患者在治疗早期或疾病复发时发生耐药。因此，研究利妥昔和其他药物联合应用的可行性对于提高疗效、降低费用具有重要意义。
组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)抑制剂可通过抑制HDAC，阻断由于HDAC募集功能紊乱而导致的基因表达受抑，有显著的抗肿瘤效应。其中SAHA(suberoylanilide hydroxamic acid，辛二酰苯胺氧肟酸)已进入II期临床，治疗复发的B细胞淋巴瘤患者有一定的疗效，是一种极具潜力的靶向治疗药物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种治疗B细胞淋巴瘤的药物组合物。
本发明的目的是通过以下技术方法来实现的：本发明一种治疗B细胞淋巴瘤的药物组合物，该药物由利妥昔和SAHA组成。利妥昔用量为1-100μg/ml，SAHA用量为1-10μM。利妥昔用量可为1-50μg/ml，SAHA用量可为1-5μM。利妥昔用量优选为20μg/ml，SAHA用量优选为2.5μM。
本发明应用了以下两种人的细胞株：对利妥昔敏感的滤泡型淋巴瘤SU-DHL-4细胞株，和对利妥昔耐药的Burkitt’s淋巴瘤Daudi细胞株。该两种人的细胞株分别经不同浓度的利妥昔(0、1、20、50、100μg/ml)和SAHA(0、1、2.5、5、10μM)联合处理，进行了MTT实验、流式细胞仪检测annexin-V和线粒体跨膜电位实验、免疫印迹分析实验及核蛋白胶电泳转移检测实验。
本发明所公开的一种治疗B细胞淋巴瘤的药物组合物，其优点表现在：通过使用本发明的药物组合物，发挥两种药的协同作用，可以协同抑制B淋巴瘤细胞生长增殖，协同诱导B淋巴瘤细胞凋亡，协同抑制NF-κB活性和下调BCL-XL表达。两药组合在提高疗效的同时下可大幅降低费用。
附图说明
图1A显示单用利妥昔抑制B淋巴瘤细胞生长的效果图。
图1B显示单用SAHA抑制B淋巴瘤细胞生长的效果图。
图1C显示合用利妥昔、SAHA抑制B淋巴瘤细胞生长的效果图。
图2A显示流式细胞仪检测滤泡型淋巴瘤SU-DHL-4细胞株凋亡对照组的效果图。
图2B显示单用利妥昔诱导滤泡型淋巴瘤SU-DHL-4细胞株凋亡的效果图。
图2C显示单用SAHA诱导滤泡型淋巴瘤SU-DHL-4细胞株凋亡的效果图。
图2D显示合用利妥昔、SAHA诱导滤泡型淋巴瘤SU-DHL-4细胞株凋亡的效果图。
图2E显示合用利妥昔、SAHA诱导滤泡型淋巴瘤SU-DHL-4细胞株凋亡的协同指数效果图。
图2F显示用流式细胞仪检测Burkitt’s淋巴瘤Daudi细胞株凋亡对照组的效果图。
图2G显示单用利妥昔诱导Burkitt’s淋巴瘤Daudi细胞株凋亡的效果图。
图2H显示单用SAHA诱导Burkitt’s淋巴瘤Daudi细胞株凋亡的效果图。
图2I显示合用利妥昔、SAHA诱导Burkitt’s淋巴瘤Daudi细胞株凋亡的效果图。
图2J显示合用利妥昔、SAHA诱导Burkitt’s淋巴瘤Daudi细胞株凋亡的协同指数效果图。
图3显示单用及合用利妥昔或SAHA作用24小时线粒体跨膜电位的结果图。
图4A显示单用及合用利妥昔或SAHA对滤泡型淋巴瘤SU-DHL-4细胞株Caspase-3、PARP和BCL-XL影响的结果图。
图4B显示显示单用及合用利妥昔或SAHA对Burkitt’s淋巴瘤Daudi细胞株Caspase-3、PARP和BCL-XL影响的结果图。
图5显示单用及合用利妥昔或SAHA对B淋巴瘤细胞NF-κB活性影响的结果图
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述。
实施例1
一种治疗B细胞淋巴瘤的药物组合物制备
本发明一种治疗B细胞淋巴瘤的药物组合物，该药物由利妥昔和SAHA按照一定的浓度比例混合制得。其中利妥昔用量为20μg/ml，SAHA用量为2.5μM。
实施例2
一种治疗B细胞淋巴瘤的药物组合物制备
本发明一种治疗B细胞淋巴瘤的药物组合物，该药物由利妥昔和SAHA按照一定的浓度比例混合制得。其中利妥昔用量为1μg/ml，SAHA用量为10μM。
实施例3
一种治疗B细胞淋巴瘤的药物组合物制备
本发明一种治疗B细胞淋巴瘤的药物组合物，该药物由利妥昔和SAHA按照一定的浓度比例混合制得。其中利妥昔用量为100μg/ml，SAHA用量为1μM。
实施例4
一种治疗B细胞淋巴瘤的药物组合物药效评价
(一)试剂：
利妥昔购自上海罗氏公司，-4℃保存。SAHA由上海默沙东赠送，溶解于DMSO中，储存液浓度为100mM，-20℃保存。MTT、碘化丙啶(PI)、rhodamine 123(Rh123)、二硫苏糖醇购自Sigma公司。抗PARP、caspase-3、BCL-XL、NF-κB(P65)、过氧化物酶偶联的羊抗鼠二抗和羊抗兔二抗均购自Santa Cruz公司。抗β-actin购自Abcam公司。
(二)细胞培养，细胞存活和细胞形态学：
本研究应用了以下两种人的细胞株：滤泡型淋巴瘤SU-DHL-4细胞株，对利妥昔敏感，Burkitt’s淋巴瘤Daudi细胞株，对利妥昔耐药。淋巴瘤细胞在5％CO2-95％空气，饱和湿度以及37℃的条件下，培养于RPMI-1640培养液中(Gibco/BRL)，并加入10％胎牛血清。在每次实验中，细胞接种密度为2×105/ml。细胞的存活率采用台盼兰拒染实验检测。细胞形态学观察采用瑞氏染色法。
(三)MTT实验：
在96孔板中，用不同浓度利妥昔或SAHA处理细胞。72小时后，向每孔中加入0.1mg MTT，在37℃下孵育4小时后，在分光光度计570nm处测量标本吸光度值。
(四)流式细胞仪检测annexin-V和线粒体跨膜电位：
细胞凋亡用ApoAlert Annexin V-FITC Apoptosis kit(BD)进行分析。在检测线粒体跨膜电位中，细胞用PBS洗后，在37℃下与10μg/mlRh123孵育30分钟，然后再用50μg/ml PI染色。荧光强度用流式细胞仪进行测量。
(五)免疫印迹分析：
用200ml Laemmli裂解缓冲液(0.5M Tris-HCl，pH 6.8，2mM EDTA，10％glycerol，2％SDS and 5％β-mercaptoethanol)裂解5×106细胞。蛋白裂解物(20μg)用于10％聚丙烯酰胺凝胶电泳，再转移至硝酸纤维素膜上。硝酸纤维素膜在溶于TBS/0.05％Tween 20的5％脱脂牛奶中封闭，之后与一抗在室温孵育2小时，与辣根过氧化物酶标记的二抗孵育1小时。免疫复合物用辣根过氧化物酶化学发光检测试剂盒检测。
(六)核蛋白分离：
1×107细胞与不含NP-40的裂解缓冲液(10mM HEPES，10mM KCl，1.5mM MgCl2，0.5mM DTT，pH 7.9)洗后，重悬于提取缓冲液(20mM HEPES，pH 7.9，420mM NaCl，0.5mM DTT，0.2mM EDTA and 25％甘油)中，冰上孵育20分钟。12000×g离心10分钟后，上清即为核蛋白。
(七)胶电泳转移检测实验：
Daudi细胞核蛋白提取物用考马斯亮蓝试剂(Pierce)定量。核蛋白(10μg)与32P标记的双链NF-κB(5’-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3’)共有序列孵育，然后用4％非变性PAGE凝胶分离，用放射自显影检测被标记的条带。
(八)统计分析：
实验结果用三次独立实验的平均值和标准差表示，用t检验来比较差异。P值小于0.05则认为具有统计学差异。所有的统计采用SAS8.2软件。
(九)结果：
采用CD20阳性B淋巴瘤细胞系SU-DHL-4和Daudi细胞进行培养，通过分析生长曲线观察利妥昔、SAHA单独及联合应用对细胞生长增殖的影响。B淋巴瘤细胞分别经不同浓度的利妥昔(0、1、20、50、100μg/ml)和SAHA(0、1、2.5、5、10μM)联合处理。单用和合用不同剂量利妥昔或SAHA对B淋巴瘤细胞的抑制作用见图1A、图1B、图1C，利妥昔(20μg/ml)联合SAHA(2.5μM)应用48小时可显著抑制SU-DHL-4和Daudi细胞的增殖。
用流式细胞仪检测单用及合用药后B淋巴瘤细胞的凋亡(Annexin V和PI双染法)。SU-DHL-4经利妥昔20μg/mL、SAHA 2.5μM及利妥昔20μg/mL与SAHA 2.5μM联合处理的48小时后，Annexin V阳性细胞分别为：对照组3.4％(见图2A)；利妥昔组17.3％(见图2B)；SAHA组26.3％(见图2C)；利妥昔与SAHA合用组56.7％(见图2D)。在Daudi细胞中：对照组3.0％(见图2F)；利妥昔组4.2％(见图2G)；SAHA组24.4％(见图2H)；利妥昔与SAHA合用组61.7％(见图2I)。同时我们应用Berenbaum建立的等效应线图法分析利妥昔与SAHA的联合应用是协同、相加或拮抗。将利妥昔与SAHA单用与合用Annexin V阳性率取30％±5％，计算两者合用的协同指数(combined index，CI)：CI＝d1/D1+d2/D2。D1、D2代表单用药物1和2时产生30％±5％效应时所需的药物剂量，d1、d2代表联合应用药物1和2时产生同等效应时的药物剂量。CI＞1，图形为凸形，两者联合应用为拮抗作用，CI＝1，图形为一直线，两者联合应用为相加作用，CI＜1，图形为凹形，两者联合应用为协同作用。利妥昔与SAHA作用于SU-DHL-4和Daudi细胞，图形均为凹型(见图2E、图2J)，证明两者为协同作用。
用亲脂阴离子染料Rh123和PI双染色检测单个细胞可获得线粒体跨膜电位(Δψm)和细胞膜的完整性，前者由于线粒体摄取量与线粒体Δψm成正比，摄取量减少表示Δψm下降；PI不能通过完整的细胞膜，细胞发生凋亡早期细胞膜仍保持完整，PI不能进入细胞，反之，坏死细胞膜破坏早期即发生PI染色增加。请参阅见图3，经利妥昔(20μg/ml)联合SAHA(2.5μM)合用24小时后出现了Δψm的下降。
利妥昔与SAHA单用或合用SU-DHL-4细胞和Daudi细胞蛋白表达变化见图4A、图4B示。利妥昔单用Caspase-3活化不明显，SAHA单用可以诱导Caspase-3表达增加，相应的其底物PARP剪切成89KD的片段，不能发挥正常功能，导致细胞凋亡，利妥昔和SAHA合用时这种效应更明显。因此，利妥昔诱导B淋巴瘤细胞系凋亡无需激活的Caspases参与，而SAHA诱导B淋巴瘤细胞系凋亡通过激活的Caspases进行，这也可以部分解释两者协同作用的机制。BCL-XL是BCL-2家族的重要的凋亡抑制因子，可通过稳定线粒体膜通透性，减少凋亡因子的释放，抑制细胞凋亡。利妥昔和SAHA可以下调BCL-XL蛋白表达，合用组BCL-XL的下调更明显，从而促进淋巴瘤细胞凋亡(图4A和图4B)。
NF-κB是一个信号传导家族，多以异源性二聚体形式发挥作用，在细胞核内调节与细胞恶性转化、免疫以及炎症反应有关的许多基因的表达。BCL-XL是NF-κB的靶基因，NF-κB激活可上调BCL-XL的表达。在利妥昔(20μg/ml)联合SAHA(2.5μM)应用48小时可抑制NF-κB的表达(图5A)。在Daudi细胞中，核蛋白胶电泳转移检测进一步证实两者合用可导致NF-κB转录活性的减低(图5B)。
综上所述，抗CD20单克隆抗体利妥昔与组蛋白去乙酰化酶抑制剂合用能够抑制NF-κB活性，下调BCL-XL表达，协同抑制淋巴瘤细胞凋亡，可能成为B细胞淋巴瘤的又一种有效治疗方法。

Claims (3)

1、一种治疗B细胞淋巴瘤的药物组合物，其特征在于该药物由利妥昔和SAHA组成，其中，利妥昔用量为1-100μg/ml，SAHA用量为1-10μM。
2、如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于利妥昔用量为1-50μg/ml，SAHA用量为1-5μM。
3、如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于利妥昔用量为20μg/ml，SAHA用量为2.5μM。
CNB2005101121470A 2005-12-28 2005-12-28 一种治疗b细胞淋巴瘤的药物组合物 Expired - Fee Related CN100346830C (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CNB2005101121470A CN100346830C (zh) 2005-12-28 2005-12-28 一种治疗b细胞淋巴瘤的药物组合物

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CNB2005101121470A CN100346830C (zh) 2005-12-28 2005-12-28 一种治疗b细胞淋巴瘤的药物组合物

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1824307A CN1824307A (zh) 2006-08-30
CN100346830C true CN100346830C (zh) 2007-11-07

Family

ID=36935252

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB2005101121470A Expired - Fee Related CN100346830C (zh) 2005-12-28 2005-12-28 一种治疗b细胞淋巴瘤的药物组合物

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN100346830C (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5738196B2 (ja) 2008-12-22 2015-06-17 ミレニアム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッドＭｉｌｌｅｎｎｉｕｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． オーロラキナーゼ阻害剤および抗ｃｄ２０抗体の併用
CN103169807A (zh) * 2013-04-11 2013-06-26 太仓市胜舟生物技术有限公司 一种中西组合药物在制药中的应用
CN110496223B (zh) * 2018-05-17 2021-09-10 复旦大学附属肿瘤医院 一种治疗非霍奇金氏淋巴瘤的药物组合物

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1705635A (zh) * 2002-10-17 2005-12-07 梅特希尔基因公司 组蛋白脱乙酰酶抑制剂

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1705635A (zh) * 2002-10-17 2005-12-07 梅特希尔基因公司 组蛋白脱乙酰酶抑制剂

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
The combination of cytotoxic and molecularlytargeted therapies-can it be done JACKMAN A.L.drug discovery today:therapeutic strategies,Vol.1 No.4. 2004 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN1824307A (zh) 2006-08-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
El-Khoury et al. Disruption of autophagy by the histone deacetylase inhibitor MGCD0103 and its therapeutic implication in B-cell chronic lymphocytic leukemia
Kavazis et al. Effects of short-term endurance exercise training on acute doxorubicin-induced FoxO transcription in cardiac and skeletal muscle
Sikander et al. Cucurbitacin D exhibits potent anti-cancer activity in cervical cancer
Sp et al. Tannic acid inhibits non-small cell lung cancer (NSCLC) stemness by inducing G0/G1 cell cycle arrest and intrinsic apoptosis
Aravindan et al. Curcumin inhibits NFκB mediated radioprotection and modulate apoptosis related genes in human neuroblastoma cells.
Guan et al. Inhibition of HDAC2 sensitises antitumour therapy by promoting NLRP3/GSDMD‐mediated pyroptosis in colorectal cancer
Wang et al. Fangchinoline inhibits cell proliferation via Akt/GSK-3beta/cyclin D1 signaling and induces apoptosis in MDA-MB-231 breast cancer cells
Castellanos-Esparza et al. Synergistic promoting effects of pentoxifylline and simvastatin on the apoptosis of triple-negative MDA-MB-231 breast cancer cells
Wasim et al. Panobinostat induces apoptosis via production of reactive oxygen species and synergizes with topoisomerase inhibitors in cervical cancer cells
Nieto et al. Vorinostat combined with high-dose gemcitabine, busulfan, and melphalan with autologous stem cell transplantation in patients with refractory lymphomas
El‐Khattouti et al. Imiquimod‐induced apoptosis of melanoma cells is mediated by ER stress‐dependent Noxa induction and enhanced by NF‐κB inhibition
KR20210117347A (ko) 암 치료를 위한 병용 요법
Sp et al. The combination of methylsulfonylmethane and tamoxifen inhibits the Jak2/STAT5b pathway and synergistically inhibits tumor growth and metastasis in ER-positive breast cancer xenografts
CN106822128A (zh) 酪氨酸激酶抑制剂dcc‑2036的新应用
Thaklaewphan et al. Kaempferia parviflora extract inhibits TNF-α-induced release of MCP-1 in ovarian cancer cells through the suppression of NF-κB signaling
Rajasekar et al. Diosmin induce apoptosis through modulation of STAT-3 signaling in 7, 12 dimethylbenz (a) anthracene induced harmster buccal pouch carcinogenesis
Kadia et al. A phase I study of vorinostat in combination with idarubicin in relapsed or refractory leukaemia
Chang et al. Imiquimod-induced autophagy is regulated by ER stress-mediated PKR activation in cancer cells
Liu et al. The novel LSD1 inhibitor ZY0511 suppresses diffuse large B-cell lymphoma proliferation by inducing apoptosis and autophagy
AU2018332608A1 (en) TRPV2 antagonists
Kang et al. Combination therapy of niclosamide with gemcitabine inhibited cell proliferation and apoptosis via Wnt/β-catenin/c-Myc signaling pathway by inducing β-catenin ubiquitination in pancreatic cancer
Bunpo et al. Inhibitory effects of asiatic acid and CPT-11 on growth of HT-29 cells
Shin et al. The HDAC1 inhibitor CBUD-1001 enhances TRAIL-induced apoptosis in colorectal cancer cells
Torki et al. Synergistic antitumor effect of NVP-BEZ235 and CAPE on MDA-MB-231 breast cancer cells
Razmi et al. Lithium chloride attenuates mitomycin C induced necrotic cell death in MDA-MB-231 breast cancer cells via HMGB1 and Bax signaling

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
C17 Cessation of patent right
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20071107

Termination date: 20100128