CN100347311C

CN100347311C - 类胡萝卜素尤其虾青素的重组生产及其可利用的生物物质

Info

Publication number: CN100347311C
Application number: CNB001371126A
Authority: CN
Inventors: 星野立夫; 小岛一之; 濑户口丰
Original assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 1999-12-01
Filing date: 2000-12-01
Publication date: 2007-11-07
Anticipated expiration: 2020-12-01
Also published as: NO20006050L; NO20006050D0; US20020168703A1; CA2324625C; CA2324625A1; US6869773B2; TWI279441B; AU7186700A; AU783717B2; BR0005690A; ID28574A; CN1316520A; MXPA00011816A; KR20010062070A; JP2001190294A

Abstract

本发明涉及类胡萝卜素的生产方法，其包括培养重组生物并从培养物中回收类胡萝卜素，其中该重组生物中编码一或多种活性氧类物质淬灭因子的一个基因被特异于该基因的裂解盒基本上裂解，本发明还涉及可用于该方法的遗传物质，如可产生类胡萝卜素的重组生物、裂解盒、重组DNA序列、重组DNA片段；和多核苷酸。

Description

类胡萝卜素尤其虾青素的重组生产及其可利用的生物物质

发明领域

本发明涉及类胡萝卜素，特别是虾青素的重组生产，及可用于该生产的生物物质。

背景技术

已知虾青素分布于多种生物体如动物(例如鸟类如火烈鸟和scarlet ibis，和鱼如虹鳟(rainbow trout)和大麻哈鱼(salmon))、藻和微生物中。并且还认识到同大多数类胡萝卜素一样，虾青素也具有很强的针对活性氧的抗氧化特性，因此虾青素有望作为医药用途来保护活体细胞免受某些疾病如癌症的侵袭。尤其是，因为虾青素能赋予动物以鲜艳的桔红色并能在市场里吸引顾客，所以从工业应用的角度来看，特别是在鱼如大麻哈鱼的养殖业中对作为显色试剂的虾青素的需要与日俱增。

已知Phaffia rhodozyma为专门生产虾青素的产胡萝卜素酵母菌。与另一种产胡罗卜素酵母，红酵母属的种不同，Phaffia rhodozyma能够发酵某些糖如D-葡萄糖。从工业应用的角度来看，这是一个重要的性质。最近的分类学研究发现Phaffia rhodozyma具有有性繁殖并且其有性形态(telemorphicstate)被命名为Xanthophyllomyces dendrorhous(W.I.Golubev；酵母11，101-110，1995)。为了从Phaffia rhodozyma中获得虾青素的高产菌株，进行了一些菌株改造的研究，但近十年中，研究只是局限于采用传统的诱变和原生质体融合的方法。近来，Wery等采用Phaffia rhodozyma研制了一种宿主载体系统，该载体系统中非复制质粒以多拷贝被组合到Phaffiarhodozyma基因组的核糖体DNA上(Wery等，基因，184，89-97，1997)。并且Verdoes等报道了更多的用来获得Phaffia rhodozyma转化子及其三个产胡萝卜素基因的改造载体，所述三个基因编码能催化3，7-二甲基-2，6-辛二烯焦磷酸生成β-胡萝卜素的酶(国际专利WO97/23633)。基因工程方法对于Phaffia rhodozyma的菌株改造研究的重要作用日益增加，在不久的将来将突破通过传统方法达到的产率。

如上所述，虾青素具有抗氧化剂特性，并且这一特性似乎在体内具有防活性氧类物质如O₂·，H₂O₂和OH·的重要作用，该活性氧类物质在活细胞中不断的产生。经过传统的化学诱变后，通过筛选抗霉素-敏感菌株，An等从Phaffia rhodozyma中获得了虾青素高产菌株(An，G-H.等，应用环境微生物学(Appl.Env.Microbiol.)，55(1)，116-124，1989)。已知抗霉素是细胞色素b和c₁之间呼吸链的抑制剂(Lucchini，G.等，Mol.Gen.Genet.，177，139-，1979)并能增强这种抗霉素-敏感突变株中的色素形成作用。由于初级呼吸链中bc₁复合物阻断而产生的活性氧类物质促进了类胡萝卜素的生成(An，G-H.等，应用环境微生物学，55，116-124，1989)。实际上，培养基中加入生成O₂的物质杜醌能够增加Phaffia rhodozyma中类胡萝卜素的总含量(主要的类胡萝卜素是虾青素)以及叶黄素的相对含量，而活性氧类物质淬灭因子甘露糖醇则起相反的作用(Schroeder，W.A.等，普通微生物学杂志(J.Gen.Mocrobiol.)，139，907-912，1993)。这些结果促使这些作者得出Phaffia rhodozyma中的虾青素具有抗氧化剂特点的结论。事实上，如果充分诱导生物氧化作用，就会增加指数生长后期产生虾青素的量。此外，培养基中加入氧化底物如乙醇能增强Phaffia rhodozyma中虾青素的产生量(Gu，W-L.等，J.Ind.Mocrobiol.Biotechnol.，19，114-117，1997)。尽管Schroeder等试图通过比较亲本菌株与抗霉素-敏感的虾青素高产菌株之间的差异，找到作为Phaffia rhodozyma中天然活性氧类物质淬灭因子的超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶活性与虾青素的产率之间的关系，但没有观察到体外活性的直接关系。

发明内容

本发明提供了活性氧类物质淬灭因子的基因和酶，如SOD和过氧化氢酶，它们是可用于改进类胡萝卜素，特别是虾青素的生产工艺的有效生物物质。本发明涉及线粒体和细胞质的SOD和过氧化氢酶编码基因的克隆和测定。本发明还涉及Phaffia rhodozyma中基因裂解后产生的酶的特性。通过在适当的培养条件下于合适的培养基中培养这种转化体能够证实其裂解对胡萝卜素形成的作用。

本发明特别提供了生产类胡萝卜素的方法，该方法包括培养重组生物体和回收培养物中的类胡萝卜素，所述重组生物体中编码一种或多种活性氧类物质淬灭因子的基因通过借助对该基因具有特异性的裂解盒基本上裂解。所述重组生物体的宿主生物体可以属于原核生物界、原生生物界或真菌界。更优选所述重组生物体的宿主生物体可属于欧文氏菌属、红细菌属、粘球菌属、黄杆菌属、副球菌属、聚球蓝细菌属、集胞蓝细菌属、土壤杆菌属、链霉菌属、Haematococcus、Dunaliella、Phaffia、Xanthophyllomyces、链孢霉属、红酵母属、布拉霉属或须霉属。最优选地是，所述的重组生物体是P.rhodozyma的菌株。

活性氧类物质淬灭因子是线粒体超氧化物歧化酶(SOD)，细胞质超氧化物歧化酶(SOD)和/或过氧化氢酶。

本发明还提供了一种可生产类胡萝卜素的重组生物体，其特征在于编码至少一种活性氧类物质淬灭因子的基因被借助对该基因特异性的裂解盒基本上裂解。被裂解的活性氧类物质淬灭因子是线粒体超氧化物歧化酶(SOD)，细胞质超氧化物歧化酶(SOD)和/或过氧化氢酶。

本发明进一步提供了用来制备本发明的重组生物体的裂解盒，该裂解盒用于裂解产类胡萝卜素生物体中有效的活性氧类物质淬灭因子的编码基因，该基因含有与编码活性氧类物质淬灭因子的部分DNA序列基本相同的部分核苷酸序列和可选择性标记基因。用于构建裂解盒的靶生物体可属于原核生物界、原生生物界或真菌界，更优选属于欧文氏菌属、红细菌属、粘球菌属、黄杆菌属、副球菌属、聚球蓝细菌属、集胞蓝细菌属、土壤杆菌属、链霉菌属、Haematococcus、Dunaliella、Phaffia、Xanthophyllomyces、链孢霉属、红酵母属、布拉霉属或须霉属。被裂解的活性氧类物质淬灭因子是线粒体超氧化物歧化酶(SOD)，细胞质超氧化物歧化酶(SOD)和/或过氧化氢酶。

如本文所用，多核苷酸或多肽序列(A)如果相对于另一序列(B)至少75％相同，优选至少85％相同，如至少95％相同则为基本相同。

本发明进一步提供了编码活性氧类物质淬灭因子(其在产生类胡萝卜素的生物体中发挥作用)的重组DNA序列。DNA序列可来源于属于原核生物界、原生生物界或真菌界的生物体，更优选属于欧文氏菌属、红细菌属、粘球菌属、黄杆菌属、副球菌属、聚球蓝细菌属、集胞蓝细菌属、土壤杆菌属、链霉菌属、Haematococcus、Dunaliella、Phaffia、Xanthophyllomyces、链孢霉属、红酵母属、布拉霉属或须霉属的生物体。特别优选P.rhodozyma。由重组DNA序列编码的活性氧类物质淬灭因子可以是线粒体超氧化物歧化酶(SOD)，细胞质超氧化物歧化酶(SOD)和/或过氧化氢酶。

编码线粒体超氧化物歧化酶的重组DNA序列可以是SEQ ID NO：1或4所示的序列，或它可以与SEQ ID NO：1或4具有高度的同源性，足以和SEQID NO：1或4中的任意一个序列发生重组。编码细胞质超氧化物歧化酶的重组DNA序列可以是SEQ ID NO：2或6所示的序列，或它可以与SEQ ID NO：2或6具有高度的同源性，足以和SEQ ID NO：2或6中的任意一个序列发生重组。编码过氧化氢酶的重组DNA序列可以是SEQ ID NO：3或8所示的序列，或它可以与SEQ ID NO：3或8具有高度的同源性，足以和SEQ ID NO：3或8中的任意一个序列发生重组。

在本发明中，只要认为适当就可利用以下杂交和洗涤条件的任意组合来鉴定同源多核苷酸序列：

高度严谨条件：6X SSC

0.5％SDS

100μg/ml变性的鲑精DNA

50％甲酰胺

于42℃轻轻旋转过夜。

高度严谨洗涤：2X SSC洗1次，0.5％SDS室温15分钟，然后

0.1X SSC洗1次，0.5％SDS室温15分钟。

低度严谨杂交：6X SSC

0.5％SDS

100μg/ml变性的鲑精DNA

50％甲酰胺

于37℃轻轻旋转过夜。

低度严谨洗涤：0.1X SSC洗1次，0.5％SDS室温15分钟。

可通过改变上述杂交反应温度和、或洗涤条件以获得中度严谨条件。

因此，如本文所用，如果一序列(A)与另一序列(B)在高度严谨条件(即上述高度严谨杂交和洗涤条件)下杂交，而且如果序列A所编码的多肽或多肽片段具有与B所编码的多肽相同的活性，则称序列(A)相对于另一序列(B)“高度同源”。

本发明进一步提供了含有位于目的蛋白编码区域上游的转运肽的编码区域的重组DNA片段，该目的蛋白可以是线粒体超氧化物歧化酶。该重组DNA片段的表达使得目的蛋白定位于线粒体上。因此，本发明还提供了将目的蛋白定位于线粒体上的方法，该方法包括含有位于目的蛋白编码区域上游的转运肽的编码区域的重组DNA片段在合适的重组宿主生物体中的表达。

如上所述，本发明公开了活性氧类物质淬灭因子，如线粒体超氧化物歧化酶、细胞质超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的核苷酸序列。这些多聚核苷酸被用来作为克隆编码活性氧类物质淬灭因子基因的探针或引物，基于基因的同源性，该活性氧类物质淬灭因子在其它产生类胡萝卜素的生物体中发生作用。

图1表示通过使用从ATCC96594和它的SOD突变株中获得的不含细胞的提取物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后的超氧化物歧化酶的活性染色分析。泳道1，P.rhodozyma ATCC96594；泳道2，P.rhodozyma ATCC96594::pSOD/G717(SOD1裂解物)；泳道3，P.rhodozyma ATCC96594::pSOD/G828(SOD2裂解物)；泳道4，P.rhodozyma ATCC96594。

主要如上述解释，本发明的目的是提供一种通过生物方法生产类胡萝卜素的新方法。所述新方法包括培养一种重组微生物，和从培养物中回收类胡萝卜素，其中该微生物中编码一种或多种活性氧类物质淬灭因子的基因被借助对该基因具有特异性的裂解盒充分裂解。

本发明的目的还在于提供一个含有编码活性氧类物质淬灭因子的开放式阅读框的重组DNA序列，所述活性氧类物质淬灭因子可以是一种酶，如线粒体SOD或细胞质SOD。该重组DNA序列可以含有部分编码过氧化氢酶的基因片段。因为这些序列能与编码所述酶的天然基因重组从而特异性地裂解该基因，所以它们被用来构建所述的裂解盒。

所述重组DNA序列可以是一种源自属于原核生物界、原生生物界或真菌界的生物体，更优选地属于欧文氏菌属、红细菌属、粘球菌属、黄杆菌属、副球菌属、聚球蓝细菌属、集胞蓝细菌属、土壤杆菌属、链霉菌属、Haematococcus、Dunaliella、Phaffia、Xanthophyllomyces、链孢霉属、红酵母属、布拉霉属或须霉属的一种生物体的重组DNA序列。特别优选的生物体是P.rhodozyma。由该重组DNA序列编码的活性氧类物质淬灭因子可以是线粒体SOD，细胞质SOD和/或过氧化氢酶。该重组DNA序列的一个特定例子是源自于Phaffia rhodozyma的基因并选自(i)SEQ ID NO：1或2所示的DNA序列；(ii)SEQ ID NO：4或6所示的那些cDNA；(iii)SEQ ID NO：1，2，4或6所示的DNA序列的同类编码或等位(基因)变异体，和(iv)SEQ IDNO：1，2，4或6所示的DNA序列中添加、插入、删除、和/或置换了一个或多个核苷酸所得到的衍生物，该衍生物编码具有所述酶活性的多肽。所述重组DNA序列的特征还在于(a)它编码具有选自SEQ ID NO：5和7所示的氨基酸序列的酶，或(b)它编码选自下组的酶的变异体(i)一个等位(基因)变异体，和(ii)具有一个或多个氨基酸添加、插入、删除、和/或置换并具有所述酶活性的酶。

如本文所用，“等位基因变异体”指在二倍体生物如Phaffia rhodozyma、Xanthophyllomyces、dendrorhous等的两个等位基因的任一个上至少有一个突变的变异体。一种指定基因的两个等位基因有相同的形状或特性，但一具体等位基因与该基因的另一等位基因在编码产物或功能上有定性或定量的差别。等位基因变异体可天然产生或经化学诱变而人工产生。野生型等位基因编码一特定生物的野生株中特定的表型特征。

如本文所用，“同类编码变异体”指下述变异体，其一个特定基因的核苷酸序列与野生型基因的序列有区别，但其翻译产物(即氨基酸序列)与野生型蛋白质相同。这是由于遗传密码的简并性造成的，并且是各种生物在密码子的利用中的差异造成的。

如本文所用，“DNA序列的衍生物”指下述DNA序列，其编码的多肽具有相应SEQ ID NO的活性但与该DNA序列不同在于1-20个，优选1-10个，如1-5个核苷酸的添加、插入、删除，和/或置换。

特别涉及的上述重组DNA序列可以是源自Phaffia rhodozyma的基因，其选自(i)SEQ ID NO：3代表的DNA序列；(ii)SEQ ID NO：8所定义的cDNA；(iii)SEQ ID NO：3或8代表的DNA序列的同类编码或等位(基因)变异体，和(iv)SEQ ID NO：3或8代表的DNA序列中添加、插入、删除、和/或置换了一个或多个核苷酸所得到的衍生物，该衍生物编码具有所述酶活性的多肽。所述重组DNA序列的特征还在于(a)它编码具有选自SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列中的部分氨基酸序列的酶，或(b)它编码的所述酶的一种变异体，其选自(i)一个等位(基因)变异体，和(ii)具有一个或多个氨基酸被添加、插入、删除、和/或置换并具有所述酶活性的酶。这种重组DNA序列优选地可以是载体的形式。

本发明还提供了用所述重组DNA序列转化宿主生物体以便得到这样一种生物体，该生物体中编码至少一种活性氧类物质淬灭因子的基因因引入该基因特异性裂解盒而基本上被裂解。如本文所用，一种基因如果其编码的多肽的活性相对于未被裂解的基因降低，则称该基因被“裂解”或“被基本上裂解”。优选地，活性降低100％，优选至少50％如至少75％，更优选至少90％-100％。该重组DNA序列的合适形式可以是载体。通过使用该重组DNA序列所得到的重组生物体在其编码线粒体SOD，细胞质SOD，或过氧化氢酶的DNA序列中被裂解。被该重组DNA转化的宿主生物体可有效改进类胡萝卜素，特别是虾青素的生产方法。因此，本发明也提供了这样的重组生物体。

这种生产类胡萝卜素的生物方法能提高类胡萝卜素，特别是虾青素的产率。因此，以在能诱导产生类胡萝卜素的条件下培养上述重组生物体为特征的生产类胡萝卜素的方法是本发明的一个方面。这种方法可以用于虾青素的生物生产。

许多研究者指出活性氧类物质可以促进已知的产胡萝卜素生物体产生类胡萝卜素。环境的氧化压力可增强Haematococcus pluvialisde的孢囊细胞对类胡萝卜素的生物合成(Kobayashi等，应用环境微生物学，59，867-873，1993)。活性氧类物质可诱导类胡萝卜素的生物合成，并且所积累的类胡萝卜素可以保护Dunaliella bardawil免遭氧化压力的破坏(Shaish等，Planta.，190，363-368，1993)。尽管在使活性氧类物质的产生发生改变的各种培养条件下对P.rhodozyma体内产生虾青素进行了研究，但大概由于在这种研究中仍有天然活性氧类物质淬灭因子存在并且在某种程度上弥补了活性氧类物质对类胡萝卜素生产的影响，所以还没有弄清楚活性氧的产生与类胡萝卜素产率之间的相互关系(Schroeder，W.A.等，普通微生物学杂志，139，907-912，1993)。

本发明中，为了排除P.rhodozyma中存在的天然活性氧类物质淬灭因子抑制活性氧对虾青素生产的正面作用的可能性，从P.rhodozyma中克隆天然活性氧类物质淬灭因子如SOD和过氧化氢酶，通过构建和引进基因裂解质粒来破坏天然活性氧类物质淬灭因子的表达。假设虾青素在P.rhodozyma中起着抗氧化剂的作用，天然活性氧类物质淬灭因子的失活可能影响类胡萝卜素的产生，其方式是由天然活性氧类物质淬灭因子的缺乏导致体内活性氧类物质相对增加，使作为活性氧类物质的另一种抑制因素的虾青素产生。

活性氧类物质可通过对细胞内分子如蛋白质或核酸的氧化损伤而对活细胞具有毒性。近来研究通过果蝇和线虫中超氧化物歧化酶活性的增加，存活期的增加，与氧化损伤作用的减少之间的相互关系，表明衰老是由氧化损伤作用引起的(Agarwal，S.等，美国国家科学院院报，91，12332-12335，1994，Larsen，P.L.美国国家科学院院报，90，8905-8909，1993，Sohal，R.S.等，生物化学杂志，270，15671-15674，1995)。SOD和相关的抗氧化酶以及它们的基因在原核生物和真核生物中也进行了充分的研究。

啤酒糖酵母如同大多数的真核生物一样，在胞质溶胶中含有Cu/ZnSOD(SOD1基因的产物)，在线粒体中含有MnSOD(SOD2基因的产物)。这些酶催化O₂·的歧化，而生成O₂和H₂O₂。小分子抗氧化剂，如谷胱甘肽和抗坏血酸；其它抗氧化酶，如过氧化氢酶和过氧化物酶；以及金属螯合蛋白如金属硫蛋白，可能通过减少氧化损伤使需氧微生物在有O₂的条件下生存。细胞质SOD的重要性通过缺乏SOD的啤酒糖酵母和大肠杆菌对双氧的高度敏感性证实。在两种生物体中，SOD活性的丧失与有氧条件下的慢速生长，较高的突变率和特异的生物合成缺陷有关。(sodl-酵母的需氧生长需要赖氨酸和蛋氨酸，而sod-大肠杆菌需要枝链氨基酸)。某些情况下，这些效果已知是由超氧化物对铁硫簇蛋白的抑制作用而引起的(Gardner，P.R.等，生物化学杂志，266，19328-19333，1991，Kuo，C.F.等，生物化学杂志，262，4724-4727，1987)。如果，生长在有氧条件下并以葡萄糖作为碳源，啤酒糖酵母的sod2突变株不受影响。然而，它们在要求需氧代谢的碳源中对高氧含量非常敏感而在正常氧含量(nomoxia)中生长缓慢。

因为编码SOD和过氧化氢酶的基因被从其它的种中克隆下来，所以来源于P.rhodozyma的相应基因可采用简并PCR方法进行克隆。首先，通过上述方法，我们可以克隆含有部分SOD基因和CAT基因的一个部分基因片段。所述简并PCR方法是一种克隆目的基因的方法，该目的基因与来源于其它种的功能相同或相似的已知酶具有氨基酸序列的高度同源性。通过将氨基酸序列反译成相应的(“简并”)核苷酸序列来设计简并引物，该简并引物用来作为简并PCR方法中的引物。在这种简并引物中，通常使用含有A，C，G或T中的任何碱基的混合引物，或多义密码中含有肌苷的引物。本发明中，采用这种混合引物作为简并引物来克隆上述基因。所采用的PCR反应条件随下述引物和要克隆的基因而变化。本发明中，序列相互不同的两种SOD基因被从同一PCR带中经简并PCR克隆下来并被命名为SOD1和SOD2基因。

含有带内含子的编码区和调节区如启动子或终止子的全基因可通过筛选构建在合适宿主中的噬菌体载体或质粒载体上的基因组文库而从染色体上克隆下来，方法是将上述简并PCR方法得到的一个部分DNA片段标记后作为探针。在文库的构建及随后的遗传操作如测序、限制性消化、连接等过程中，通常采用大肠杆菌作为宿主菌，并用大肠杆菌载体、噬菌体载体如λ噬菌体载体、或质粒载体如pUC载体。本发明中，根据插入大小在λ载体的衍生体，λZAPII和λDASHII中构建P.rhodozyma的EcoRI基因组文库。插入大小，必须克隆的插入长度，是通过在构建文库前对每一基因进行DNA印记杂交来确定的。本发明中，按照厂商提供的说明书(Boehringer-Mannheim，Germany)，以地高辛配基(DIG)，即一种类固醇半抗原取代传统³²p标记物来标记用作探针的DNA。通过采用DIG-标记的具有部分目的基因的DNA片段作为探针筛选由P.rhodozyma的染色体构建的基因组文库。挑选出杂交噬菌斑并进一步进行研究。如果使用λDASHII(插入大小为9至23kb)，制备的λDNA被EcoRI消化，然后将EcoRI插入片段克隆到质粒载体如pUC19或pBluescriptIISK+中。当采用λZAPII构建基因组文库时，利用单链M13噬菌体衍生物Ex辅助噬菌体(Ex assist phage)(Stratagene，La Jolla，USA)，体内切除方案方便地用于克隆到质粒的后续步骤。所获质粒DNA经测序检查。本发明中，从λZAPII文库中分别获得SOD1和SOD2基因，而过氧化氢酶(CAT)基因则克隆自λDASHII文库。

本发明中，我们使用了自动荧光DNA测序仪ALFered系统(Pharmacia，Uppsala，Sweden)，采用自动循环测序程序，其中大多数测序使用Taq DNA聚合酶。

本发明中，发明人确定了含有SOD1基因或SOD2基因的开放读框及其启动子和终止子序列的基因组序列。通过序列分析，根据其氨基末端存在转运肽来判断，发现SOD1编码线粒体SOD。相反，SOD2不具有这种转运肽序列并且这一事实暗示SOD2编码细胞质SOD。发明人还确定了CAT基因的开放读框的部分基因组序列。

转运肽是一个信号序列，用来将核基因产物转移到定位于线粒体的蛋白如参与TCA循环的酶上，其中所述核基因在染色体上编码而其翻译蛋白在线粒体中发挥功能。在氨基末端加转运肽有利于某些蛋白质在线粒体中的表达。

本发明中，通过连接上述基因的部分片段来构建SOD1，SOD2和CAT基因的裂解质粒，该质粒不含基因的任一末端，具有自杀载体的抗药基因，由于缺乏自主复制序列而不能在P.rhodozyma中自主复制。一个编码能使宿主在毒性抗生素存在下生存的酶的抗药基因通常被作为选择标记。定居在pPR2T(Verdoes等(国际专利出版物，WO97/23633))上的G418抗性基因是抗药基因的一个实例。这种自杀质粒不能自我复制，只能利用载体和染色体之间的同源序列进行单交重组，而以整合的形式存在于宿主染色体上。与目的基因重组时，由于缺少基因的两端其基因序列不能重组到宿主菌的染色体上，结果目的基因在如此获得的重组菌株中被裂解。裂解质粒的另一个实例是双交换型质粒。这种类型的裂解质粒含有待裂解之目的基因的两个不同片段并且筛选标记基因如抗药基因被插到这两个片段之间。受体细胞染色体和供体质粒DNA在该基因的两个同源区域重组后，染色体序列被供体DNA置换且筛选标记基因被插入到待裂解的目的基因上。总之，双交换型质粒比单交型载体的重组频率低。

在本发明中，发明人通过相应基因的裂解使得目的酶失活。评价目的基因产物效果的其它方法是利用基因工程方法降低它的表达。某些方法可用于此目的。其中一种是反义方法。反义法是通过引入一段人工基因片段(其序列与目的基因的序列互补)来降低目的基因的表达。这种反义基因片段与目的基因的成熟mRNA片段体内形成复合体，结果降低了mRNA的翻译效率。

另一方法是使启动子区突变。总之，基因由具有不同功能的几个部分组成。在真核生物中，编码相应蛋白质的基因被转录成前信使RNA(pre-mRNA)，它不同于核糖体RNA(rRNA)，小核RNA(snRNA)和转运RNA(tRNA)的基因。尽管RNA聚合酶II(PolII)在该转录过程中起着关键作用，但是如果没有能覆盖上游包含启动子之区域的顺式元件和上游活化序列(UAS)，以及反式作用蛋白因子，PolII不能单独启动转录。首先，由几个碱性蛋白组分组成的转录起始复合物识别表达基因的5’-邻近区域的启动子序列。对需在某些特殊调节(如热休克反应，或对营养缺乏的环境的适应等)下表达的基因来说，上述过程还涉及其它因素。在这种情况下，在5’-非翻译上游区的启动子序列附近需要有一个UAS存在，并且一些正调节或负调节蛋白识别UAS并与UAS结合。转录起始复合物与启动子序列的结合强度受启动子邻近区之反式作用因子结合的影响，并且这能够调节转录活性。

通过磷酸化作用激活转录起始复合物后，转录起始复合物启动从转录起始位点开始的转录。当延伸复合物从该基因的启动子区向3’方向移动时，转录起始复合物的某些部分脱离(这个步骤被称作启动子清除事件)，而延伸复合物继续转录直至位于该基因3’-侧下游区的终止序列。

为了降低目的基因的表达，通常在含有上述UAS序列的目的基因启动子区域进行常规化学诱变或基因定点诱变。用含有这样一个突变启动子区域的重组DNA转化宿主菌来获得其中目的酶表达降低的突变菌株。如上所述，这种降低基因表达的尝试也可如基因裂解一样，用于测定基因产物对活体生物体中环境的影响。

作为转化方法，LiCl法(Wery等，酵母，12(7)，641-651，1996)和电穿孔法(Wery等，基因，184，89-97，1997)均被用于转化P.rhodozyma，但是，这种条件下的转化效率似乎仍然很低。本发明中，Biolistic转化方法(Johnston等，分子生物学方法，53，147-153，1996)用于转化P.rhodozyma。Biolistic方法是一个简单可靠的方法，其中利用高压氦气将包裹在金或钨微粒表面的供体DNA直接射入活细胞中。用转化方法成功地转化了新型隐球菌，它和P.Rhodozyma同属担子菌纲(basisdiomycetous)，并且用传统的转化方法很难转化(Toifaletti等.，细菌学，175(5)，1405-1411，1993)。本发明中，这一Biolistic方法被成功地用来转化P.rhodozyma细胞。

基因裂解的发生可直接通过酶活性证实，也可用所得转化体的染色体经PCR或DNA印迹杂交证实。本发明中，通过进行活性染色来直接证实SOD的裂解和通过类似于常用于细菌分类学的过氧化氢酶试验中采用的目测法来定性过氧化氢酶的裂解。

在合适的培养基中培养这种基因工程获得的P.rhodozyma并评估其产生虾青素的产率。

本发明用以下实施例参照附图作进一步举例说明。

实施例

实施例中使用的材料和方法描述如下：

菌株

P.rhodozyma ATCC96594(根据布达佩斯条约于1998年4月8日再次进行了保藏，保藏号为ATCC74438)

大肠杆菌DH5α：F^-，φ80d，lacZΔM15，Δ(lacZYA-argF)U169，hsd(r_K ^-，m_K ⁺)，recA1，endA1，deoR，thi-1，supE44，gyrA96，relA1(Toyobo，Osaka，日本)

大肠杆菌XL1-Blue MRF：Δ(mcrA)183，Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)173，endA1，supE44，thi-1，recA1，gyrA96，relA1，lac[F’proAB，lacI^qZΔM15，Tn10(ter^r](Stratagene，La Jolla，USA)

大肠杆菌SOLR：e14^-Δ(mcrA)，Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)171，sbcC，recB，recJ，umuC::Tn5(kan^r)，uvrC，lac，gyrA96，relA1，thi-1，endA1，λ^R，[F’proAB，lacI^q ZΔM15]Su^-(非抑制的(nonsuppressing))(Stratagene)

大肠杆菌XL1-MRA(P2)：Δ(mcrA)183，Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)173，endA1，supE44，thi-1，gyrA96，relA1，lac(P2溶原菌)(Stratagene)

大肠杆菌TOP10：F^-，mcrA，Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)φ80，ΔlacZM15，ΔlacX74，recA1，deoR，araD139，(ara-leu)7697，galU，galK，rpsL(Str^r)，endA1，nupG(Invitrogen，Carlsbad，USA)

载体

λZAPII(Stratagene)

λDASHII(Stratagene)

pBluescriptII SK+(Stratagene)

pCR2.1TOPO(Invitrogen)

pUC 19(Takara Shuzo，Otsu，日本)

培养基

P.rhodozyma菌株常规维持于YPD琼脂平板上(DIFCo，Detroit，美国)。大肠杆菌菌株被保存在LB培养基中(每升培养基含有10g细菌用胰蛋白胨，5g酵母浸膏(DIFCO)和5g NaCl)。NZY培养基(每升培养基含有5gNaCl，2g MgSO₄-7H₂O，5g酵母浸膏(DIFCO)，10g A型NZ胺(NZ aminetype A)(WAKO，Osaka，日本))被用于在软琼脂(0.7％琼脂(WAKO))中繁殖λ噬菌体。制备琼脂培养基需要加入1.5％的琼脂(WAKO)。

方法

分子遗传技术的一般方法是根据“分子克隆”：实验室手册，第2版(冷泉港实验室出版社，1989)中的方法。从Takara Shuzo(日本)购买限制酶和T4DNA连接酶。

用QIAGEN基因组试剂盒(QIAGEN，Hilden，Germany)按照厂家提供的说明书从P.rhodozyma中分离染色体DNA。利用DNA自动分离系统(PI-50，Kurabo，Co.Ltd.，Osaka，日本)从大肠杆菌中小量制备质粒DNA。通过QIAGEN柱(QIAGEN)从大肠杆菌转化体中量制备质粒DNA。利用Wizard lambda制备DNA纯化系统(Promega，Madison，USA)按照厂家提供的说明书分离λDNA。采用QIAquick或QIAEX II(QIAGEN)在琼脂糖上分离和纯化DNA片段。λ噬菌体衍生体的操作按照厂家制定的说明书进行(Stratagene)。

通过使用Isogen(Nippon Gene，Toyama，日本)，利用酚法从P.rhodozyma中分离总RNA。使用mRNA分离试剂盒(Clontech，Palo Alto，USA)从如此获得的总RNA中纯化出mRNA。使用CapFinder cDNA构建试剂盒(Clontech)合成cDNA。

使用GigapackIII金包装提取物(Stratagene)进行体外包装。

聚合酶链反应(PCR)在Perkin Elmer 2400型的热循环仪中进行。实施例中描述了每一PCR反应条件。PCR引物从商家购买或采用DNA合成仪合成(392型，Perkin Elmer，日本，Urayasu，日本)。用于DNA测序的荧光DNA引物购自Pharmacia公司。利用荧光DNA自动测序仪(ALFred，Pharmacia)进行DNA测序。

大肠杆菌DH5α的感受态细胞购自Toyobo(日本)。

P.rhodozyma进行biolistic转化所使用的设备和试剂购自Nippon Bio-Red Laboratories(日本，东京)。

实施例1：从P.rhodozyma中分离mRNA并构建cDNA文库

为了构建P.rhodozyma的cDNA文库，细胞破碎后，紧接着采用酚提取法分离总RNA，利用mRNA分离试剂盒(Clontech)从P.rhodozyma的ATCC96594菌株中纯化出mRNA。

首先，通过离心(1500xg离心10分钟)从用YPD培养基培养了两天的10ml培养物中收集ATCC96594菌株的细胞并用提取缓冲液(10mM柠檬酸钠/HCl(PH6.2)含有0.7M KCl)洗涤一次。将细胞悬浮在2.5ml的提取缓冲液中，用弗氏压碎匀浆器(Ohtake Works Corp.，日本，东京)按照生产厂家提供的方法以1500kgf/cm²的条件将细胞破碎并且马上与两倍体积的isogen(Nippon gene)混合。通过这一步骤，回收到400μg的总RNA。

然后，用mRNA分离试剂盒(Clontech)按照厂家提供的方法纯化该总RNA。最后，得到16μg P.rhodozymaATCC96594菌株的mRNA。

用CapFinder PCR cDNA构建试剂盒(Clontech)按照厂家提供的方法获得P.rhodozyma的cDNA。用1μg的纯mRNA经PCR扩增而合成第一条链。该PCR扩增反应后，得到了1mg的cDNA库。

实施例2：两种P.rhodozyma的部分SOD基因的克隆

采用简并PCR方法克隆P.rhodozyma的一个部分SOD基因。两种混合引物根据其它菌种的已知超氧化物歧化酶基因的共同序列进行设计和合成，该两种混合引物的核苷酸序列见表1。

表1

用于克隆SOD1和SOD2基因的引物序列

Sod1；AARCAYCAYCARACNTAYGTNAA(有义引物)(SEQ ID NO：10)

Sod4；GCCCANCCNGANCCYTGNACNCC(反义引物)(SEQ ID NO：11)

(R＝A或G；Y＝C或T；N＝A，C，G或T)

以ExTaq(Takara Shuzo)为DNA聚合酶和以实施例1得到的cDNA库为模板进行25轮PCR，每一轮为94℃ 15秒，46℃ 30秒，72℃为15秒，然后使反应混合物在琼脂糖凝胶上电泳。回收具有所需长度的PCR带并利用QIAquick(QIAGEN)按照生产厂家提供的方法进行纯化，然后连接到pCR2.1-TOPO(Invitrogen)上。对感受态大肠杆菌TOP10进行转化后，挑选出6个白色菌落，然后利用DNA自动分离系统(Kurabo PI-50)分离质粒。测序后，发现两种克隆具有互不相同的序列，其推导出的氨基酸序列分别与已知SOD基因相类似。这些分离出的cDNA克隆被命名为pSOD614#2和pSOD614#3并被用来作进一步的研究。

实施例3：从P.rhodozyma中分离基因组DNA

利用QIAGEN基因组试剂盒按照生产厂家提供的方法从P.rhodozyma中分离基因组DNA。

首先，通过离心(1500xg离心10分钟)从用YPD培养基过夜培养的100ml培养物中收集P.rhodozyma ATCC96594菌株的细胞并用TE缓冲液(含有1mM EDTA的10mM Tris/HCl(pH8.0))洗涤一次。将细胞悬浮在QIAGEN基因组试剂盒的Y1缓冲液8ml中，加入浓度为2mg/ml的溶细胞酶(SIGMA)经酶降解来破碎细胞并将反应混合物于30℃温育90分钟，然后进行下一步的提取步骤。最后得到20μg的基因组DNA。

实施例4：以pSOD614#2和pSOD614#3作为探针的DNA印迹杂交

进行DNA印迹杂交以便克隆含P.rhodozyma的SOD基因的基因组片段。用EcoRI消化2μg的基因组DNA并进行琼脂糖凝胶电泳，然后进行酸性和碱性处理。经transblot(Joto Rika，日本，东京)运行1小时使变性的DNA向尼龙膜(HybondN+，Amersham)转移。对转移到尼龙膜上的DNA进行热处理固定(80℃，90分钟)。按照DIG多引发方法(DIG multipriming)(BoehringerMannheim)标记模板DNA(EcoRI消化的pSOD614#2和pSOD614#3)来制备探针。按照厂家提供的方法进行杂交。结果，与由pSOD614#2制备的探针杂交的带显示7.5千碱基(kb)的长度，而与由pSOD614#3制备的探针杂交的带显示8.0千碱基(kb)的长度。

实施例5：含有序列互不相同的SOD基因的基因组片段的克隆

用EcoRI消化4μg的基因组DNA并进行琼脂糖凝胶电泳。然后，利用透析膜、通过传统的洗脱方法回收长度为7至9kb的DNA。纯化的DNA与1μg的经EcoRI-消化和CIAP(牛小肠碱性磷酸酶)-处理的λZAPII(Strangene)于16℃下过夜以连接，并用Gigapack III金包装提取物(Strangene)进行包装。用包装的提取物感染大肠杆菌XL1Blue MRF菌株，然后涂布于NZY培养基(其在LB琼脂培养基上)。以EcoRI消化的pSOD614#2和pSOD614#3为探针筛选出大约6000个噬菌斑。6个噬菌斑与标记的pSOD614#2探针进行了杂交，2个噬菌斑与标记的pSOD614#3探针进行了杂交。然后，按照生产厂家提供的方法(Strangene)对杂交噬菌斑进行体内切除。以sod1和sod4为引物进行PCR分析，结果发现从6个pSOD614#2-杂交噬菌斑分离的一个质粒与pSOD614#2具有相同的片段。这一质粒被命名为pSOD703。在以sod1和sod4为引物的PCR分析结果中，还发现从2个pSOD614#3-杂交噬菌斑分离的两个质粒与pSOD614#3具有相同的片段。其中一个质粒被命名为pSOD626并用于进一步的研究。

实施例6：从P.rhodozyma中得到的两种MnSOD基因的序列分析

采用引物-步行(primer-walking)法对pSOD703和pSOD626进行测序来确定完整核苷酸序列。位于pSOD703上的SOD1基因和位于pSOD626上的SOD2基因的核苷酸及其推导的氨基酸序列为序列表中的SEQ ID NO：1，NO：2，NO：5和NO：7。

BLAST分析(Altschul.S.F.等，分子生物学杂志215，403-410，1990)的结果表明，SOD1和SOD2基因的推导氨基酸序列与从其它菌种中得到的已知MnSOD同源，但不与Cu/Zn SOD或Fe SOD同源。

SOD1基因具有7个内含子和8个外显子，其推导的开放阅读框由223个氨基酸组成。另一方面，SOD2基因具有10个内含子和11个外显子，其推导的开放阅读框由199个氨基酸组成。两种分离的SOD基因之间的最大差别在于SOD1基因氨基酸末端的延伸区，该序列可能作为到线粒体的转运肽。

事实上，Schroeder等已报导了两种SOD，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)的活性染色，分析出该两种SOD是源自P.rhodozyma的抗KCN和H₂O₂的SOD。他们指出两种MnSOD是凝集体或同工酶，但没有提到它们的精确特征和亚细胞定位。如下所述，这两种抗KCN和H₂O₂的SOD(即MnSOD)是SOD1和SOD2基因的产物。如“发明详述”部分所述，大多数真核生物在其细胞内不同部位具有不同种类的SOD(MnSOD在线粒体中，Cu/ZnSOD在细胞质中)。这是两种Mn SOD在不同亚细胞位置上发挥作用的第一个实例。

实施例7：SOD1和SOD2基因的裂解质粒的构建

如“发明详述”部分所述，通过将G418抗性结构基因插入到甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAP)基因的启动子和终止子之间并连接到KpnI和HindIII消化的pUC19上来构建具有抗药标记盒的质粒。这一质粒被命名为pUC19-G418并用来作进一步的研究。通过以表2所示序列为引物的PCR方法体外合成SOD1和SOD2基因的部分片段用于同源重组。

表2

Sod14：GGTACCTCCGATGATAGGAATGTGAG(有义引物)(SEQ ID NO：12)

Sod15：GAATTCAGTTCAACGGAGGAGGACAC(反义引物)(SEQ ID NO：13)

Sod47：GAATTCGGAGGAGGACACATCAACCG(有义引物)(SEQ ID NO：14)

Sod48：GGTACCTGTACTGGAGGTAGAAAGCG(反义引物)(SEQ ID NO：15)

PCR的条件是：25个循环反应，每个循环反应为94℃维持15秒钟，50℃维持30秒钟和72℃维持15分钟。以0.1μg由实施例3得到的基因组DNA为模板，以ExTaq为DNA聚合酶。分别以sod14和sod15为引物经PCR扩增SOD1的一个部分片段，以sod47和sod48为引物经PCR扩增SOD2基因的一个部分片段。回收扩增的每一个0.65kb片段，并按照厂家提供的方案将其克隆到pCR2.1-TOPO(Invitrogen)上。从大肠杆菌TOP10转化体的白色菌落中挑选6个单菌落并从那些转化体中制备质粒。通过限制性分析和测序，一个具有部分SOD1基因的克隆被筛选出来作进一步研究并被命名为pSOD715。以类似的方式，一个具有部分SOD2基因的克隆被筛选出来并被命名为pSOD826。

然后，用EcoRI和KpnI消化pSOD715和pSOD826，所产生的0.65kb片段采用QIAquick方案纯化，并连接到EcoRI-和KpnI-消化的pUC19-G418上。从大肠杆菌DH5α转化体的抗氨苄青霉素菌落中挑选6个单菌落并从那些转化体中制备质粒。通过限制性分析和测序，获得了一个克隆，其中一个部分SOD1被融合到G418抗性盒的克隆并被命名为pSOD/G717。以类似的方式，获得了一个部分SOD2被融合到G418抗性盒的克隆并被命名为pSOD/G828。

实施例8：用biolistic方法转化P.rhodozyma ATCC96594

按照“分子生物学方法”(Johnston等，53；147-153，1996)中描述的方法制定转化方案。作为宿主菌的P.rhodozyma ATCC96594在YPD培养基中培养到稳定期。离心培养液后，用无菌水将细胞浓缩10倍，然后取200μl的细胞悬浮液铺在含有100μg的遗传霉素，0.75M的甘露醇和山梨糖醇的YPD培养基上。将5μg来自pSOD/G717和pSOD/G828的环形DNA包裹上1.5mg的0.9μm金微粒来作为biolistic转化的供体DNA。20℃下培养一星期后产生了几百个遗传霉素-抗性克隆。挑选4个这种转化体并制备其染色体。通过PCR和DNA印迹杂交分析，其中一个转化体被确定具有SOD1或SOD2基因的染色体裂解结构，并用来作进一步的研究。

实施例9：对从SOD1和SOD2裂解物的候选者中获得的粗提物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的活性染色分析

ATCC96594菌株和从ATCC96594的biolistic转化中获得的候选者用YPD培养基培养两天后，在4℃下以3000xg离心10分钟进行收集。用Tris-HCl缓冲液(10mM/PH8.0)洗涤后，用同样的缓冲液将细胞浓缩10倍。用弗氏压榨匀浆器(Ohtake Works)，在1500kg/cm²下破碎细胞，并在1500rpm下微量离心(TOMY，MRX150)匀浆级分来制备粗提物。

采用PIERCE(Rockford，美国)的BCA蛋白分析试剂测定如此获得的粗提物中的蛋白质浓度。按照Schroeder W.A.等描述的方法(普通微生物学杂志，139，907-912，1993)，对相当于300μg蛋白质的粗提物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。活性染色分析参考Flohe等描述的方法(酶学方法，105，93-104，1984)。

活性染色的结果见图1。亲代菌株，ATCC96594的提取物中，观察到两条带在暗背景下为透明带，该透明带具有SOD活性。相反，其中SOD1基因被裂解的ATCC96594::pSOD/G717菌株在不变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中不具有高迁移率的活性带，而其中SOD2基因被裂解的ATCC96594::pSOD/G828菌株在不变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中不具有低迁移率的活性带。从这一结果发现，P.rhodozyma的粗提物中的两种MnSOD是SOD1和SOD2基因的产物，并且，在不变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中具有高迁移率和低迁移率的SOD分别对应于SOD1和SOD2基因的产物。

实施例10：克隆P.rhodozyma的部分过氧化氢酶(CAT)基因

采用简并PCR方法克隆P.rhodozyma的部分CAT基因。如表3所示的两种混合引物是根据源自其它菌种的已知过氧化氢酶基因的共有序列进行设计和合成的。

表3

用于克隆CAT基因的引物序列

Cat2；MGNTTYTCNACNGTNGGNGGNGA(有义引物)(SEQ ID NO：16)

Cat5；CKRTGNCKYTGNGTRTCNGGRTA(反义引物)(SEQ ID NO：17)

(M＝A或C；N＝A，C，G或T；Y＝C或T；K＝G或T；R＝A或G)

以ExTaq(Takara Shuzo)为DNA聚合酶和以实施例3得到的基因组DNA为模板进行25轮PCR，每轮为94℃维持15秒钟，45℃维持30秒钟，72℃维持15秒钟，反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳。回收具有1.0kb长度的一条PCR带并利用QIAquick(QIAGEN)按照生产厂家提供的方法进行纯化，然后连接到pCR2.1-TOPO(Invitrogen)上。对感受态大肠杆菌TOP10进行转化后，挑选出6个白色菌落，然后利用DNA自动分离系统分离质粒。测序后，发现两种克隆的序列推导出的氨基酸序列与已知的CAT基因相类似。这些分离的DNA克隆中的一个被命名为pCAT702并被用来作进一步的研究。

实施例11：含有CAT基因的基因组片段的克隆

以与实施例4相似的方式，采用pCAT702作为探针进行DNA印迹杂交的研究。结果，观察到了大小为9kb至23kb的杂交带。接着，用EcoRI消化4μg的基因组DNA并进行琼脂糖凝胶电泳。然后，利用透析膜、通过传统的洗脱方法回收长度为9kb至23kb的DNA。纯化的DNA与1μg的经EcoRI-消化和CIAP(牛小肠碱性磷酸酶)-处理的λDASHII(Strangene)于16℃过夜以进行连接，并用Gigapack III金包装提取物(Strangene)进行包装。用包装的提取物感染大肠杆菌XL1Blue MRA(P2)菌株，然后涂布于NZY培养基(其在LB琼脂培养基上)。以EcoRI消化的pCAT702为探针筛选出大约8000个噬菌斑。6个噬菌斑与标记的pCAT702探针进行了杂交。从每一λ克隆中制备λDNA，并且从以Cat2和Cat5为引物的PCR和序列分析结果中发现6个克隆中的4个具有与插入的pCAT702相同的片段。CAT基因的一个部分核苷酸及其推导出的氨基酸序列为序列表部分的SEQ ID NO：3和SEQ IDNO：9。

实施例12：CAT基因的裂解质粒的构建

以与实施例7相似的方式，构建CAT基因的裂解质粒。首先，SacI接头被插入到pUC19-G418的HindIII位点上，其中定位着G418-抗性盒的终止子区，并且限制性分析结果表明产生了pUC19-G418Sa，其在G418-抗性盒的末端具有SacI位点。然后，pUC19-G419Sa的KpnI-和SacI-片段被连接到KpnI-和SacI-消化的pCAT702上，并产生pCAT/706，其中一个部分基因组CAT基因与G418-抗性盒融合。

实施例13以pCAT/706作为供体质粒转化P.rhodozyma ATCC 96594

以类似于实施例8的方式，采用CAT-裂解质粒，pCAT/706转化P.rhodozyma ATCC 96594。20℃下培养一星期后产生了几百个遗传霉素-抗性克隆。挑选4个这种转化体并制备其染色体。通过PCR和DNA印迹杂交分析，其中一个转化体被确定具有染色体CAT基因的裂解结构，并用来作进一步的研究。

然后采用过氧化氢酶试验定性CAT裂解物的两个候选者，该方法通常用来进行细菌分类的研究。将一接种环的P.rhodozyma细胞浸入3％的H₂O₂溶液中，然后观察到氧气的生成。尽管当ATCC 96594细胞一进行过氧化氢酶试验，就立刻产生了O₂泡沫，而两株ATCC 96594::pCAT/706突变体被浸入到H₂O₂溶液中时，却很久才产生O₂泡沫。这一结果意味着CAT基因发生了裂解，但残余的微弱活性表明存在着另一种催化消除H₂O₂的物质如源自P.rhodozyma的过氧化物酶。

实施例14评价P.rhodozyma的SOD1，SOD2和CAT裂解体的虾青素产生

SOD1，SOD2和CAT的基因裂解对虾青素之产生的影响用YPD培养基中的振荡来评价。将生长在YPD琼脂培养基上的细胞悬浮到YPD培养基中，然后将一部分细胞悬浮液接种在500ml带挡板摇瓶中的50mlYPD培养基中。细胞在200r.p.m.和20℃的条件下培养84小时。间隔适当的时间，取3ml培养液并分析细胞的产量，葡萄糖的消耗及虾青素的含量。

细胞产量以66nm处的光密度计量，也可以细胞干重表示，干重是使细胞经0.45μm醋酸纤维膜加硝酸纤维膜(HAWP04700，Millipore，Bedford，美国)过滤并于80℃下加热过夜后测得。从以玻璃珠破碎的P.rhodozyma细胞中提取类胡萝卜素后，采用HPLC测定P.rhodozyma的虾青素含量。提取后，加入5ml含有适当浓度的胭脂树橙作为内标的丙酮/BHT/水。采用下述HPLC系统分析上清液中虾青素的含量。

HPLC柱：YMC-Pak ODS-A(6mm，150mm)

温度：室温

洗脱液：乙腈/甲醇/异丙醇(85/10/5)

进样体积：10μl

流速：2.0ml/分钟

检测：471nm处的UV

表4概述了从84小时-培养物中获得的结果。

表4SOD和CAT突变对P.rhodozyma的

总类胡萝卜素和虾青素产率的影响

菌株总类胡萝卜素虾青素

(mg/g细胞干重) (mg/g细胞干重)

ATCC96594 0.169 0.111

△SOD1 0.259 0.146

△SOD2 0.202 0.129

△CAT 0.229 0.144

SOD1和SOD2裂解体显示出高于其宿主菌，ATCC96594的总类胡萝卜素和虾青素的产率。尤其是SOD1裂解体的类胡萝卜素和虾青素产量分别明显地增加了53.3％和31.5％。

根据推导的其氨基酸末端的转运肽序列来判断，SOD1似乎是线粒体酶并且可能起着清除超氧化物自由基的作用，该超氧化物自由基是线粒体的呼吸链上出现的一种活性氧类物质。这些数据表明，由于胞内活性氧的产生而补偿了天然活性氧类物质淬灭因子SOD1的缺乏，从而促进了虾青素的产生。

序列表

<110>F.HOFFMANN-LA ROCHE AG

<120>类胡萝卜素尤其虾青素的重组生产及其可利用的生物物质

<130>SOD

<140>

<141>

<160>17

<170>PatentIn Ver.2.0

<210>1

<211>3632

<212>DNA

<213>Phaffia rhodozyma

<220>

<221>5′UTR

<222>(922)..(923)

<223>实验的

<220>

<221>外显子

<222>(986)..(1096)

<220>

<221>内含子

<222>(1097)..(1306)

<220>

<221>外显子

<222>(1307)..(1456)

<220>

<221>内含子

<222>(1457)..(1555)

<220>

<221>外显子

<222>(1556)..(1589)

<220>

<221>内含子

<222>(1590)..(1694)

<220>

<221>外显子

<222>(1695)..(1799)

<220>

<221>内含子

<222>(1800)..(1920)

<220>

<221>外显子

<222>(1921)..(1982)

<220>

<221>内含子

<222>(1983)..(2076)

<220>

<221>外显子

<222>(2077)..(2140)

<220>

<221>内含子

<222>(2141)..(2246)

<220>

<221>外显子

<222>(2247)..(2272)

<220>

<221>内含子

<222>(2273)..(2390)

<220>

<221>外显子

<222>(2391)..(2507)

<220>

<221>聚腺苷酸位点

<223>实验的

<400>1

tcctgttgat aatctttcta acgccttgta ctttgaccaa ggcgtttgtc cgaaattttg 60

caaacttagt gttggtcgca tggacggtct tcggatccag aactgacggc tcgccaataa 120

agtatgacga tggtagaggt gaaggaggga accacaggtt gaccagtctc aaagagtgct 180

gatgtgcgcg aggatttgtc attaaatggt gttgtatatg ctagagccaa gagaagacat 240

ttggttttgg ttttggtttt gcatttgatg agatgtgtca cgattgaaga cgggaggagg 300

ctcactaacc caagaagcca ggatcaggag gaatgcctcc cccttttcat caagatcttt 360

ctcacatcga acatttgaca ttctctttag tatccttcta tccttttctt ccaacttctc 420

ccattgtatc gactttgctc gacttgctct tcttatctct gagcagagat gggcattcca 480

atatcgaagg agcgacacaa gaccttggag tttgggtaac agatgaagag gggccgaggt 540

ggatggggct gtaggaagta gctgatcgat gagttcctgg atgatgatag gcgaaggaac 600

agacatagga tctctgtctc gtcctggaat tactgagtct tgtatccagc gtgttcttgt 660

ctcgaagaag ccttcaagat cgatgtaaga taagacaggc aatgaggacg gacgaacgaa 720

cgaacgaaaa gaacagaaga gctggtaagt cagtcagtca gtcagtcagt caatcaaaca 780

ctggtgtcta gggttatagc tcgacgcgac gcgacgcgtt tgagacgcga tatgcttacg 840

taatacctgg cgtcatcccc ccagccgagg caagagccga gccgctcgtg aacgacaaaa 900

ttcaaaaggc tttctccatc ttaagctcat tctcatctaa ccgactcatc tcgttcccat 960

cattcccatc attctaccgc catcc atg tct gtt cga gca tcc ctc tct tcc 1012

gtg tct aga cag act ttc gtc gct cct gct gct ttc cag atc agg gca 1060

aag cat acc ctg cct gag ctt cct tac gct tac gat gtaagacttt 1106

tccgtgttct cctattcgtc gctttcttgg tttttttcgt cttcgccctc tagctcttct 1166

tcgtcctttc tgtcctgctc tttgttgttg atattcagct cgatagacta acccatctca 1226

tctcctggac attcttttac tggaaacgta tcttgtcctt ggtttttctt ggctttggtt 1286

gaaaattcct ctccactcag gcc ctg gag ccc tcc atc tcc aag gag atc atg 1339

acc ctt cac cac acc aag cac cat cag act tat gtt aac ggc ctc aac 1387

gct gcc gag gag agc tac tcg gcc gct gtg ggc aag gag gat gtg ctt 1435

acc cag gtt aag ctt cag tct gtacgtctga ccgttttttt atcgaccgga 1486

acgcctggtg aggagggaga tgaagtttga tgagcgctca tcgtctagca cgttgacccg 1546

atcatacag gct ctc aag ttc aac gga gga gga cac atc aat c 1589

gtcagtgata ttcttcaaac tcttgctgag caagtcaggt caagctgact gtttcgcttt 1649

gtttctgcgg atctatctca tccttgattt ggcatgatga aacag ac tct ctg ttc 1705

tgg aag aac ttg gct ccc tat gga tcc gag gag gct acc ctc tct gaa 1753

gga cct ctc aag aag gct atc gag gaa tct ttt ggt tct ttc gag g 1799

gtccgtccat ctatcttcct attcagttgt gtttggttcc ggtatactca tctgttttgt 1859

ttccccacaa aataaaaata aaaatcttgt cctctccggg ggttcgactg cacgttcata 1919

g cc ttc aag aag aag ttc aac gct gac acc gct gct gtc caa gga tcc 1967

gga tgg ggc tgg ctt gtatgtatca tatcctttcc atctcaaact cttctcagag 2022

tctttttcct tgagacttca aactgactat acatgtttct acaacaaaca acag ggc 2079

ttg aac ccg ctt act aag aag ctg gaa gtc acc acg acc gcc aac cag 2127

gac cct ctg ctt a gtaagttgtt tctacatgat tttctatctc aacgcgatct 2180

gcatgattcg tcactgattc actggattct cttgtttcgt ttttctcggg atgatttcat 2240

aaacag ct cac att cct atc atc gga gtt gac gtgcgtatct ttcttgaata 2292

gtcgtagcgt ctgatctcgt tttattgact gacgtgttgc ttctgtccaa atcattaaaa 2352

aaaatgaaaa caaataatcg attgaccgac gaaaacag atc tgg gag cac gct ttc 2408

tac ctt cag tac aag aac gtc aag cct gac tat ctc gct gct gtt tgg 2456

tcc gtt atc aac tac aag gag gca gag gcc cga ttg cag gct gct ctc 2504

taa gcgggacgaa aagtaacgac atatgaaggg aggatcaaat atcgtttctt 2557

cataaacaac tttcgaggca gatgggagag tacgtacaag agaggtttgt atggagaatt 2617

gagtttgttg acggttagca ggttatgata tatgtagcta tagtctagtc taaatctgaa 2677

agaagagaac aagatggttt gtccgaagag attgagagat caagcccggt catctgatgt 2737

cgaacaaaca tgccctggtc tgccaacagt ttctagcaca ttatgaccat gttcatgtgt 2797

aaattgggaa atgagccaga aaggtttatt atctaattca ttgattcatg cgactatgga 2857

tacatatggg atttccagaa caaacagatg caacaaagca cggcattttc caaagatcga 2917

gtcctcccac aagtatgcgg caaggtttgt tgttaagaga tataaaagca gacgacaaaa 2977

caaatcgttt atcgaccctg tgcaccaaca ccgtgaccgt ttgacgagtt ggtagagttg 3037

tagttgttgc tgttcaaagg agctccagac tggacgcttc caagcttcaa caacttctcg 3097

gcagcgtcgc tgttcgggaa aagaaaaggc aaaaaggaac agagcgataa gcatatgtga 3157

ttctctactt cttataggct cttagctcaa gtcaactcac atgtctttgg cggtaccgaa 3217

gacgttctca agctgctgct tggaagcttt tccgagcttg ccagtaggtc cctggttgga 3277

gaagaagatg tcgaaggcta agggcgatga aaagcatgaa gatattagct atcggcgcga 3337

taaaagtgtg acgagatgaa aatggagaaa agatgattcg caccatcgac gacctcgacc 3397

aaaggaatgg aggtgtcacc ggccttccac ttcttgtact cctcaacgtt gacgaagatg 3457

acgaagcagt cggtggcctt agcctcgggc tcgtagatgc tgatgaaaca caataggtag 3517

taggagagga gaaagagaag atgatgagat gtcaggatgc ttgcttcact gtagatggag 3577

gaagaagata tgcgaagcaa gacatacact ttggaaagag cttgaaccat tgtag 3632

<210>2

<211>3375

<212>DNA

<213>Phaffia rhodozyma

<220>

<221>5′UTR

<222>(974)..(975)

<223>实验的

<220>

<221>外显子

<222>(1040)..(1063)

<220>

<221>内含子

<222>(1064)..(1237)

<220>

<221>外显子

<222>(1238)..(1280)

<220>

<221>内含子

<222>(1281)..(1358)

<220>

<221>外显子

<222>(1359)..(1402)

<220>

<221>内含子

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<220>

<221>外显子

<222>(1484)..(1589)

<220>

<221>内含子

<222>(1590)..(1674)

<220>

<221>外显子

<222>(1675)..(1826)

<220>

<221>内含子

<222>(1827)..(1907)

<220>

<221>外显子

<222>(1908)..(1922)

<220>

<221>内含子

<222>(1923)..(1992)

<220>

<221>外显子

<222>(1993)..(2056)

<220>

<221>内含子

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<220>

<221>外显子

<222>(2132)..(2157)

<220>

<221>内含子

<222>(2158)..(2238)

<220>

<221>外显子

<222>(2239)..(2293)

<220>

<221>内含子

<222>(2294)..(2376)

<220>

<221>外显子

<222>(2377)..(2426)

<220>

<221>内含子

<222>(2427)..(2524)

<220>

<221>外显子

<222>(2525)..(2542)

<220>

<221>聚腺苷酸位点

<222>(2667)..(2668)

<223>实验的

<400>2

cttatccttc tgccgctggt ctctgtctgt cgagtgtgtg ggatggtttt ggatatgttc 60

ctatacgaaa ggtagcgcag agcaaagctg acagtattaa gcaagacaag agcttctttc 120

tgttgacaga tgaaaggacg aactatgaag ctgtccatgc tccccaaacc gattgacaca 180

ccgccgtcag gcaacgcaga atttctcact gcttcgacgt cacaccaaca tcgatcctcc 240

atacctaaaa gcagatcgag acacattgtt ggtcgccatg ttggatggat gtacatcaaa 300

cccacagcat atatcactca catgtgagaa ctccgtagcc tctaccttct tgtctctcaa 360

tctgaatgtc tcgttgagag gtggaatgaa tgtttacagt ttgagaagac gaaagaaaga 420

aagagaagag aagagaggaa tacgtacgac gaagttatca tcgtatggga acttttctaa 480

aaaactgcct atagtagaga cgatctctgg aggaaagctc tgtagtatga tagtgaagag 540

cgagcaagtc tgggcaagtg catccttcgt ctacaagaaa gagaccagga aatgaaggag 600

agacgagtaa gcaggtacct accgatattg gatcgttctc tctacccagc gatgccttca 660

ccacgcgttc tatctcttct tgggatggca gatacatact taacgagagc aatctgatgt 720

ataccgaact tcgaacggaa tgatcccaga atcctcttga acccttgaac ccttgaaccc 780

tggaaccaag taccaaccga gcaacacgcc gatacggtcc acaccacaga accacacgcc 840

ctcgtcatta aaggtgggac gcgccgatgc tggttacgtt cggcccaatc cggaagttac 900

cggcttggac gtgcctgtaa ccatgccctg acggtatttc gccttcagct aactccatct 960

catctttttc ctttactacc acaacccacc cttgaacctt cttccccggc ttttttacta 1020

tatccatcta tcaatcatc atg gct cct tac act ctt ccc gac gtaagcttaa 1073

agtttgagct gtgtgtgctt atctcaatct tggagttgaa ctcaccgttt tttgtttttg 1133

cttcctggtt tttttatcgg catccctcc tttttttcccc tcgtggtcgc atatgatttg 1193

ctcatcaatc ggcgtttccc atgcatcttt gtcatccgtt tcag ctt cct tac gct 1249

tac gat gcc ttg gag cct tac atc tct aag g gtgagattct tagtcagact 1300

gttgttccgg ttcgacacga tagctaatcg tctctcgttc ctcaatatga acatgcag 1358

aa atc atg atc ctt cac cac tcc aag cac cat cag act tac gtc 1402

gtacgtaatc taaaggtcat ctccgtctac atggccggat caacttgctc atagatcttc 1462

cttctgttcg gcgctacgta g acc aac ctc aac gcc gct atc cag gct ttc 1513

tcc cag acc aat gac atc aag gcc cag atc gct ctt cag agc gct ctc 1561

aag ttc aac gga gga gga cac atc aac c gtacgatcat tctccctctt 1609

ctggcttatc atatgtgttg cttgtcacta acacgcatgc aaccccggga tatctcaccc 1669

tgtag ac tcc ctc ttc tgg aag aac atg gct cct gcc gac tct gct gat 1718

gcc aag ctc acc gag gga tcg ctc aag act gcc atc gac aag gac ttt 1766

gga tcc ttc gag gag ttc aag aag aag ttc aac act gct act ctc ggt 1814

gtc cag gga tct gtcagtatct cgtttgcttc gacatactct cagctttcct 1866

tccgtaaact gacgaatag tttttcggaca tgtacttgta g gga tgg gga tgg ctc 1922

gtgcgtttga cctttttcca ctttgaacat tagcgatagt gatacctaac aactgtgaat 1982

tggaatatag gga tac aac acc gct acc aag cac ctc gag atc gcc acc 2031

acc gcc aac cag gat ccc ctt atc a gtatgtgact tctctcgtgt 2076

ggtcaccata agccagttgc tgacacattt cgttcgctgt ctctcgactt cgtag ct 2133

ttg act ccc atc att ggt ctt gac gttagtaatt ctatctagtg attggagtcg 2187

agttctgaac ttgccttgat ctcaaacgaa tgaatcaatt tcttttggta g atc cgg 2244

gag cac gct ttc tac ctc cag tac aag aat gtc aag cct gat tac ctt g 2293

gtacgtaatt ctctattcg tttgccccggt ttgatctttg actcactctt caaaatgttt 2353

tcgtttgta actttgaaaa acag cc gct ttc tgg aac gtc tgc aac ttt gct 2405

gag gct cag cga agg ttt gat gtgagtacag gcgctacccc tacggaggaa 2456

gcgaaggtga gctgaccact ttttatcttt ctgatttgga atgaacgatc cgatgatcaa 2516

acaaacag gct gct gtc aag gct taa tggtcccatt tatctctttg attcgacggc 2572

gatgacggct ttctcgcatc cgaagaaggc aaggctatga ttactgttat tctgccatgt 2632

tgcttgcttt gctatgctct atgttctttt cttttgcctc tcttcaaagc caaggcgtta 2692

aggaaggccc ttcagtctg ttttacatatg cacatataca tgagaacata tcacggactc 2752

ggcggctggt ggtcctcttg agcgtcggc ttcaagattag tgtccacacg tgaagcgttc 2812

ggtgccatcc aacctggtag gaatccccat cgggcgggaa tccaattatc aattggcggt 2872

cggccagatt cgagctcggg tatctcagaa gcgtcaagcg ggcgcatttc caggccttta 2932

agaggagcaa atttaatccg cctgggtgtt cagcgagaca cgaacagttt gaaacagagt 2992

ctgcttgtga gttactcggc gagatcactg aggactaaac tttctcagct cgtggacgaa 3052

aagaacgaac caaacggtct tccctgtatc tcgaccatct ccttctccat ctcttacaac 3112

acctcggatg aactccaagg cttgctttcc aaagttcaaa caaactccgg gttgccatcc 3172

acctggtttg tctctaacga gccgagggat atccatcgtt cggaacgttt gaacagactg 3232

gatggtaggt ggccggtcgc ttcggaagcc aatcataatg gtgggaatcg agagaaggaa 3292

tgattgggcc cagtgtttaa gacttgtgtt tgttggcaga gtacggacgg aaagtaggac 3352

agacttaatc aaggcgagcc aag 3375

<210>3

<211>951

<212>DNA

<213>Phaffia rhodozyma

<220>

<221>外显子

<222>(1)..(34)

<220>

<221>内含子

<222>(35)..(115)

<220>

<221>外显子

<222>(117)..(159)

<220>

<221>内含子

<222>(160)..(242)

<220>

<221>外显子

<222>(243)..(363)

<220>

<221>内含子

<222>(364)..(436)

<220>

<221>外显子

<222>(437)..(951)

<400>3

tcc gga agc tca gat acc gct cga gat cct cga g gtttgtgtgc 44

tttcgctttg ttcgcatgga tgaagctgtt aacttaaaaa aatcctcgtg tttctctttg 104

tttcaacata g gt ttc tct ctt aag gtc aag acc tct gag gga aac tgg 153

gac ttt gtacgtattc ttatcgactg agtcatcaag ctcgttatcg ctctcttacc 209

ctcatccttt tgtgtctctg tctacacctc tag gtc gga aac aac act ccc atc 263

ttt ttc ttg aga gac cca gcc aag ttt ccg atc ttc att cac acc cag 311

aag agg aac ccg cag aca aac tct aaa gac aag gac gct ttc tgg gac 359

tac c gttcgtata accttgtcac tccctgcgtg ccgctctgat tcatgttgac 412

cttgtctttg atataatttt atag ta tcc caa aac ccc gag tcc gtg cat cag 465

gtg ctg cac ctg ttc agt gat cga gga acc cct gct tct tac cga cac 513

atg cat ggt tac tct gga cac acc ttc aag atg gtc aac agg aac ggt 561

gac tgg aat tat gtc cag att cac atg cgc acc gat cag ggt gtc aag 609

act cac acc aat gaa gag gct tcg aaa ctc gac gcc tcc aat ccc gat 657

tca aac gga gac gac ttg ttc gac gca atc aag aat gga gac ttc cct 705

agc tgg acg gtt cag gta cag gta atg tct cct gag cag gcc cag aag 753

ttc aga tac aac att ctg gat ctc acc aag gtc tgg tcc cac aag gag 801

ttc cca ctt aqg acg att gga aag ttc act ttg aac cga aac gtg gat 849

aac tat ttc gca gag gtt gaa cag ctc gcc ttt gct cct tcc cat ctg 897

cct cct gga atc gag ccc tcg aac gat ccc gtc ctt cag gct cga cta 945

ttc tcc 951

<210>4

<211>669

<212>DNA

<213>Phaffia rhodozyma

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(669)

<400>4

atg tct gtt cga gca tcc ctc tct tcc gtg tct aga cag act ttc gtc 48

Met Ser Val Arg Ala Ser Leu Ser Ser Val Ser Arg Gln Thr Phe Val

1 5 10 15

gct cct gct gct ttc cag atc agg gca aag cat acc ctg cct gag ctt 96

A1a Pro Ala Ala Phe Gln Ile Arg Ala Lys His Thr Leu Pro Glu Leu

20 25 30

cct tac gct tac gat gcc ctg gag ccc tcc atc tcc aag gag atc atg 144

Pro Tyr Ala Tyr Asp Ala Leu Glu Pro Ser Ile Ser Lys Glu Ile Met

35 40 45

acc ctt cac cac acc aag cac cat cag act tat gtt aac ggc ctc aac 192

Thr Leu His His Thr Lys His His Gln Thr Tyr Val Asn Gly Leu Asn

50 55 60

gct gcc gag gag agc tac tcg gcc gct gtg ggc aag gag gat gtg ctt 240

Ala Ala Glu Glu Ser Tyr Ser Ala Ala Val Gly Lys Glu Asp Val Leu

65 70 75 80

acc cag gtt aag ctt cag tct gct ctc aag ttc aac gga gga gga cac 288

Thr Gln Val Lys Leu Gln Ser Ala Leu Lys Phe Asn Gly Gly Gly His

85 90 95

atc aat cac tct ctg ttc tgg aag aac ttg gct ccc tat gga tcc gag 336

Ile Asn His Ser Leu Phe Trp Lys Asn Leu Ala Pro Tyr Gly Ser Glu

100 105 110

gag gct acc ctc tct gaa gga cct ctc aag aag gct atc gag gaa tct 384

Glu Ala Thr Leu Ser Glu Gly Pro Leu Lys Lys Ala Ile Glu Glu Ser

115 120 125

ttt ggt tct ttc gag gcc ttc aag aag aag ttc aac gct gac acc gct 432

Phe Gly Ser Phe Glu Ala Phe Lys Lys Lys Phe Asn Ala Asp Thr Ala

130 135 140

gct gtc caa gga tcc gga tgg ggc tgg ctt ggc ttg aac ccg ctt act 480

Ala Val Gln Gly Ser Gly Trp Gly Trp Leu Gly Leu Asn Pro Leu Thr

145 150 155 160

aag aag ctg gaa gtc acc acg acc gcc aac cag gac cct ctg ctt act 528

Lys Lys Leu Glu Val Thr Thr Thr Ala Asn Gln Asp Pro Leu Leu Thr

165 170 175

cac att cct atc atc gga gtt gac atc tgg gag cac gct ttc tac ctt 576

His Ile Pro Ile Ile Gly Val Asp Ile Trp Glu His Ala Phe Tyr Leu

180 185 190

cag tac aag aac gtc aag cct gac tat ctc gct gct gtt tgg tcc gtt 624

Gln Tyr Lys Asn Val Lys Pro Asp Tyr Leu Ala Ala Val Trp Ser Val

195 200 205

atc aac tac aag gag gca gag gcc cga ttg cag gct gct ctc taa 669

Ile Asn Tyr Lys Glu Ala Glu Ala Arg Leu Gln Ala Ala Leu

210 2l5 220

<210>5

<211>222

<212>PRT

<213>Phaffia rhodozyma

<400>5

Met Ser Val Arg Ala Ser Leu Ser Ser Val Ser Arg Gln Thr Phe Val

1 5 10 15

Ala Pro Ala Ala Phe Gln Ile Arg Ala Lys His Thr Leu Pro Glu Leu

20 25 30

Pro Tyr Ala Tyr Asp Ala Leu Glu Pro Ser Ile Ser Lys Glu Ile Met

35 40 45

Thr Leu His His Thr Lys His His Gln Thr Tyr Val Asn Gly Leu Asn

50 55 60

Ala Ala Glu Glu Ser Tyr Ser Ala Ala Val Gly Lys Glu Asp Val Leu

65 70 75 80

Thr Gln Val Lys Leu Gln Ser Ala Leu Lys Phe Asn Gly Gly Gly His

85 90 95

Ile Asn His Ser Leu Phe Trp Lys Asn Leu Ala Pro Tyr Gly Ser Glu

100 105 110

Glu Ala Thr Leu Ser Glu Gly Pro Leu Lys Lys Ala Ile Glu Glu Ser

115 120 125

Phe Gly Ser Phe Glu Ala Phe Lys Lys Lys Phe Asn Ala Asp Thr Ala

130 135 140

Ala Val Gln Gly Ser Gly Trp Gly Trp Leu Gly Leu Asn Pro Leu Thr

145 150 155 160

Lys Lys Leu Glu Val Thr Thr Thr Ala Asn Gln Asp Pro Leu Leu Thr

165 170 175

His Ile Pro Ile Ile Gly Val Asp Ile Trp Glu His Ala Phe Tyr Leu

180 185 190

Gln Tyr Lys Asn Val Lys Pro Asp Tyr Leu Ala Ala Val Trp Ser Val

195 200 205

Ile Asn Tyr Lys Glu Ala Glu Ala Arg Leu Gln Ala Ala Leu

210 215 220

<210>6

<211>597

<212>DNA

<213>Phaffia rhodozyma

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(597)

<400>6

atg gct cct tac act ctt ccc gac ctt cct tac gct tac gat gcc ttg 48

Met Ala Pro Tyr Thr Leu Pro Asp Leu Pro Tyr Ala Tyr Asp Ala Leu

1 5 10 15

gag cct tac atc tct aag gaa atc atg atc ctt cac cac tcc aag cac 96

Glu Pro Tyr Ile Ser Lys Glu Ile Met Ile Leu His His Ser Lys His

20 25 30

cat cag act tac gtc acc aac ctc aac gcc gct atc cag gct ttc tcc 144

His Gln Thr Tyr Val Thr Asn Leu Asn Ala Ala Ile Gln Ala Phe Ser

35 40 45

cag acc aat gac atc aag gcc cag atc gct ctt cag agc gct ctc aag 192

Gln Thr Asn Asp Ile Lys Ala Gln Ile Ala Leu Gln Ser Ala Leu Lys

50 55 60

ttc aac gga gga gga cac atc aac cac tcc ctc ttc tgg aag aac atg 240

Phe Asn Gly Gly Gly His Ile Asn His Ser Leu Phe Trp Lys Asn Met

65 70 75 80

gct cct gcc gac tct gct gat gcc aag ctc acc gag gga tcg ctc aag 288

Ala Pro Ala Asp Ser Ala Asp Ala Lys Leu Thr Glu Gly Ser Leu Lys

85 90 95

act gcc atc gac aag gac ttt gga tcc ttc gag gag ttc aag aag aag 336

Thr Ala Ile Asp Lys Asp Phe Gly Ser Phe Glu Glu Phe Lys Lys Lys

100 105 110

ttc aac act gct act ctc ggt gtc cag gga tct gga tgg gga tgg ctc 384

Phe Asn Thr Ala Thr Leu Gly Val Gln Gly Ser Gly Trp Gly Trp Leu

115 120 125

gga tac aac acc gct acc aag cac ctc gag atc gcc acc acc gcc aac 432

Gly Tyr Asn Thr Ala Thr Lys His Leu Glu Ile Ala Thr Thr Ala Asn

130 135 140

cag gat ccc ctt atc act ttg act ccc atc att ggt ctt gac atc tgg 480

Gln Asp Pro Leu Ile Thr Leu Thr Pro Ile Ile Gly Leu Asp Ile Trp

145 150 155 160

gag cac gct ttc tac ctc cag tac aag aat gtc aag cct gat tac ctt 528

Glu His Ala Phe Tyr Leu Gln Tyr Lys Asn Val Lys Pro Asp Tyr Leu

165 170 175

gcc gct ttc tgg aac gtc tgc aac ttt gct gag gct cag cga agg ttt 576

Ala Ala Phe Trp Asn Val Cys Asn Phe Ala Glu Ala Gln Arg Arg Phe

180 185 190

gat gct gct gtc aag gct taa 597

Asp Ala Ala Val Lys Ala

195

<210>7

<211>198

<212>PRT

<213>Phaffia rhodozyma

<400>7

Met Ala Pro Tyr Thr Leu Pro Asp Leu Pro Tyr Ala Tyr Asp Ala Leu

1 5 10 15

Glu Pro Tyr Ile Ser Lys Glu Ile Met Ile Leu His His Ser Lys His

20 25 30

His Gln Thr Tyr Val Thr Asn Leu Asn Ala Ala Ile Gln Ala Phe Ser

35 40 45

Gln Thr Asn Asp Ile Lys Ala Gln Ile Ala Leu Gln Ser Ala Leu Lys

50 55 60

Phe Asn Gly Gly Gly His Ile Asn His Ser Leu Phe Trp Lys Asn Met

65 70 75 80

Ala Pro Ala Asp Ser Ala Asp Ala Lys Leu Thr Glu Gly Ser Leu Lys

85 90 95

Thr Ala Ile Asp Lys Asp Phe Gly Ser Phe Glu Glu Phe Lys Lys Lys

100 105 110

Phe Asn Thr Ala Thr Leu Gly Val Gln Gly Ser Gly Trp Gly Trp Leu

115 120 125

Gly Tyr Asn Thr Ala Thr Lys His Leu Glu Ile Ala Thr Thr Ala Asn

130 135 140

Gln Asp Pro Leu Ile Thr Leu Thr Pro Ile Ile Gly Leu Asp Ile Trp

145 150 155 160

Glu His Ala Phe Tyr Leu Gln Tyr Lys Asn Val Lys Pro Asp Tyr Leu

165 170 175

Ala Ala Phe Trp Asn Val Cys Asn Phe Ala Glu Ala Gln Arg Arg Phe

180 185 190

Asp Ala Ala Val Lys Ala

195

<210>8

<211>714

<212>DNA

<213>Phaffia rhodozyma

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(714)

<400>8

tcc gga agc tca gat acc gct cga gat cct cga ggt ttc tct ctt aag 48

Ser Gly Ser Ser Asp Thr Ala Arg Asp Pro Arg Gly Phe Ser Leu Lys

1 5 10 15

gtc aag acc tct gag gga aac tgg gac ttt gtc gga aac aac act ccc 96

Val Lys Thr Ser Glu Gly Asn Trp Asp Phe Val Gly Asn Asn Thr Pro

20 25 30

atc ttt ttc ttg aga gac cca gcc aag ttt ccg atc ttc att cac acc 144

Ile Phe Phe Leu Arg Asp Pro Ala Lys Phe Pro Ile Phe Ile His Thr

35 40 45

cag aag agg aac ccg cag aca aac tct aaa gac aag gac gct ttc tgg 192

Gln Lys Arg Asn Pro Gln Thr Asn Ser Lys Asp Lys Asp Ala Phe Trp

50 55 60

gac tac cta tcc caa aac ccc gag tcc gtg cat cag gtg ctg cac ctg 240

Asp Tyr Leu Ser Gln Asn Pro Glu Ser Val His Gln Val Leu His Leu

65 70 75 80

ttc agt gat cga gga acc cct gct tct tac cga cac atg cat ggt tac 288

Phe Ser Asp Arg Gly Thr Pro Ala Ser Tyr Arg His Met His Gly Tyr

85 90 95

tct gga cac acc ttc aag atg gtc aac agg aac ggt gac tgg aat tat 336

Ser Gly His Thr Phe Lys Met Val A6n Arg Asn Gly Asp Trp Asn Tyr

100 105 110

gtc cag att cac atg cgc acc gat cag ggt gtc aag act cac acc aat 384

Val Gln Ile His Met Arg Thr Asp Gln Gly Val Lys Thr His Thr Asn

115 120 125

gaa gag gct tcg aaa ctc gac gcc tcc aat ccc gat tca aac gga gac 432

Glu Glu Ala Ser Lys Leu Asp Ala Ser Asn Pro Asp Ser Asn Gly Asp

130 135 140

gac ttg ttc gac gca atc aag aat gga gac ttc cct agc tgg acg gtt 480

Asp Leu Phe Asp Ala Ile Lys Asn Gly Asp Phe Pro Ser Trp Thr Val

145 150 155 160

cag gta cag gta atg tct cct gag cag gcc cag aag ttc aga tac aac 528

Gln Val Gln Val Met Ser Pro Glu Gln Ala Gln Lys Phe Arg Tyr Asn

165 170 175

att ctg gat ctc acc aag gtc tgg tcc cac aag gag ttc cca ctt agg 576

Ile Leu Asp Leu Thr Lys Val Trp Ser His Lys Glu Phe Pro Leu Arg

180 185 190

acg att gga aag ttc act ttg aac cga aac gtg gat aac tat ttc gca 624

Thr Ile Gly Lys Phe Thr Leu Asn Arg Asn Val Asp Asn Tyr Phe Ala

195 200 205

gag gtt gaa cag ctc gcc ttt gct cct tcc cat ctg cct cct gga atc 672

Glu Val Glu Gln Leu Ala Phe Ala Pro Ser His Leu Pro Pro Gly Ile

210 215 220

gag ccc tcg aac gat ccc gtc ctt cag gct cga cta ttc tcc 714

Glu Pro Ser Asn Asp Pro Val Leu Gln Ala Arg Leu Phe Ser

225 230 235

<210>9

<211>238

<212>PRT

<213>Phaffia rhodozyma

<400>9

Ser Gly Ser Ser Asp Thr Ala Arg Asp Pro Arg Gly Phe Ser Leu Lys

1 5 10 15

Val Lys Thr Ser Glu Gly Asn Trp Asp Phe Val Gly Asn Asn Thr Pro

20 25 30

Ile Phe Phe Leu Arg Asp Pro Ala Lys Phe Pro Ile Phe Ile His Thr

35 40 45

Gln Lys Arg Asn Pro Gln Thr Asn Ser Lys Asp Lys Asp Ala Phe Trp

50 55 60

Asp Tyr Leu Ser Gln Asn Pro Glu Ser Val His Gln Val Leu His Leu

65 70 75 80

Phe Ser Asp Arg Gly Thr Pro Ala Ser Tyr Arg His Met His Gly Tyr

85 90 95

Ser Gly His Thr Phe Lys Met Val Asn Arg Asn Gly Asp Trp Asn Tyr

100 105 110

Val Gln Ile His Met Arg Thr Asp Gln Gly Val Lys Thr His Thr Asn

115 120 125

Glu Glu Ala Ser Lys Leu Asp Ala Ser Asn Pro Asp Ser ASn Gly Asp

130 135 140

Asp Leu Phe Asp Ala Ile Lys Asn Gly Asp Phe Pro Ser Trp Thr Val

145 150 155 160

Gln Val Gln Val Met Ser Pro Glu Gln Ala Gln Lys Phe Arg Tyr Asn

165 170 175

Ile Leu Asp Leu Thr Lys Val Trp Ser His Lys Glu Phe Pro Leu Arg

180 185 190

Thr Ile Gly Lys Phe Thr Leu Asn Arg Asn Val Asp Asn Tyr Phe Ala

195 200 205

Glu Val Glu Gln Leu Ala Phe Ala Pro Ser His Leu Pro Pro Gly Ile

210 215 220

Glu Pro Ser Asn Asp Pro Val Leu Gln Ala Arg Leu Phe Ser

225 230 235

<210>10

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列：sod1(克隆SOD基因的有义引物)的描述

<400>10

aarcaycayc aracntaygt naa 23

<210>11

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列：sod4(克隆SOD基因的反义引物)的描述

<400>11

gcccanccng anccytgnac ncc 23

<210>12

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列：sod14(构建SOD1-裂解质粒的有义引物)的描述

<400>12

ggtacctccg atgataggaa tgtgag 26

<210>13

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列：sod15(构建SOD1-裂解质粒的反义引物)的描述

<400>13

gaattcagtt caacggagga ggacac 26

<210>14

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列：sod47(构建SOD2-裂解质粒的有义引物)的描述

<400>14

gaattcggag gaggacacat caaccg 26

<210>15

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列：sod48(构建SOD2-裂解质粒的反义引物)的描述

<400>15

ggtacetgta ctggaggtag aaagcg 26

<210>16

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列：sod2(克隆CAT基因的有义引物)的描述

<400>16

mgnttytcna cngtnggngg nga 23

<210>17

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列：cat5(克隆CAT基因的反义引物)的描述

<400>17

ckrtgnckyt gngtrtcngg rta 23

Claims

1.一种生产类胡萝卜素的方法，该方法包括培养重组生物体，并从培养物中回收类胡萝卜素，所述生物体中编码活性氧类物质淬灭因子的基因借助特异于该基因的裂解盒而裂解，其中所述活性氧类物质淬灭因子由选自如下的多核苷酸编码：

SEQ ID NO：1或4，或与SEQ ID NO：1或4的互补体在高严谨杂交和洗涤条件下杂交的多核苷酸，并且该杂交的多核苷酸编码的多肽具有线粒体超氧化物歧化酶(SOD)活性，

并且，

所述重组生物体的宿主生物体属于欧文氏菌属、红细菌属、粘球菌属、黄杆菌属、副球菌属、聚球蓝细菌属、集胞蓝细菌属、土壤杆菌属、链霉菌属、Haematococcus、Dunaliella、Phaffia、Xanthophyllomyces、链孢霉属、红酵母属、布拉霉属或须霉属。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述重组生物体的宿主生物体是P.rhodozyma的一个菌株。

3.如权利要求2所述的方法，其中所述重组生物体的宿主生物体是P.rhodozyma ATCC96594。

4.一种能够产生类胡萝卜素的重组生物体，其特征在于其中编码至少一种活性氧类物质淬灭因子的基因借助特异于该基因的裂解盒而裂解，其中所述活性氧类物质淬灭因子由选自如下的多核苷酸编码：

并且，

5.如权利要求4所述的重组生物体，其中所述宿主生物体是P.rhodozyma的一个菌株。

6.如权利要求5所述的重组生物体，其中所述宿主生物体是P.rhodozyma ATCC96594。

7.一种用于裂解活性氧类物质淬灭因子的编码基因的裂解盒，该活性氧类物质淬灭因子对在产生类胡萝卜素的生物体中的胡萝卜素形成有效，所述裂解盒包括与编码被裂解的所述活性氧类物质淬灭因子的部分DNA序列相同的部分核苷酸序列和选择性标记基因，其中被裂解的所述活性氧类物质淬灭因子由选自如下的多核苷酸编码：

并且，

所述重组生物体的宿主生物体属于欧文氏菌属、红细菌属、粘球菌属、黄杆菌属、副球菌属、聚球蓝细菌属、集胞蓝细菌属、土壤杆菌属、链霉菌属、Haematococcus、Dunaliella、Phaffia、Xanthophyllomyces.链孢霉属、红酵母属、布拉霉属或须霉属。

8.如权利要求7所述的裂解盒，其中所述宿主生物体是P.rhodozyma的一个菌株。

9.如权利要求8所述的裂解盒，其中所述宿主生物体是P.rhodozymaATCC96594。

10.如权利要求7-9任一项所述的裂解盒，其中编码缺陷性氧类物质淬灭因子的部分核苷酸序列与引入了裂解盒的生物体中活性氧类物质淬灭因子的至少部分编码DNA序列相同。

11.如权利要求10所述的裂解盒，其中与活性氧类物质淬灭因子的部分编码DNA序列相同的部分核苷酸序列相对于相应功能基因含有至少一个缺失和/或突变。