CN100347313C - 检测骨质疏松症的遗传素因 - Google Patents

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Abstract

本发明公开的是在患有骨质疏松症的个体中，用于确定与低骨矿物质密度有关的遗传多态性模式的方法和试剂盒。所述试剂盒包括DNA样品收集材料和用于确定遗传多态性模式的探针，随后对遗传多态性模式进行分析以确定受试者对骨质疏松症的敏感性。

Description

检测骨质疏松症的遗传素因
                       技术领域
本发明涉及检测骨质疏松症素因(predisposition)的方法。
                       技术背景
Bernadine Healy(医学博士，国立健康研究所负责人)在1993年确定骨质疏松症是“妇女的主要疾病之一”。骨质疏松症骨折后的并发症位于心脏病、癌症和中风之后，是65岁以上妇女的第四种主要致死原因。在美国，它是伤残的主要原因和髋部骨折的最常见的原因。就综述而言，通常见“骨质疏松症妇科医生指南”(Sherrer and Levinson，1995)；“关于骨质疏松症的150个最常见的问题”(Jacobowitz，1993)；和“骨质疏松症：病因、诊断和处理”(Raven Press，1988)，以及Peel andEastell(1995)和Eastell and Riggs(1988，1987a，b)。
有二千五百万美国人患有骨质疏松症，其中85％是妇女。I型骨质疏松症是因雌激素缺失而产生的绝经后骨质疏松症，它影响超过半数的65岁以上妇女，并已在90％的75岁以上妇女中检测到。II型或老年型骨质疏松症是严格地年龄相关的，它通常影响年龄超过70岁的男人和妇女。III型是最新分类的影响两性的骨质疏松症，它是药物引起的，例如由长期类固醇治疗引起的，已知类固醇治疗可加速骨损失(Eastell，1995)。接受长期类固醇治疗的患者组包括气喘病患者(七百万18岁以上的美国人)以及患有类风湿性关节炎和其他自身免疫疾病的患者。IV型骨质疏松症是由潜在的疾病例如类风湿性关节炎(在人口中的1-2％中流行)引起的。
骨质疏松症可用多种方法诊断、监测和治疗，这些方法如专利申请WO9420615、WO9501995和WO9414844给出的，并一般地见“骨质疏松症：病因、诊断和处理”(Raven Press，1988)。
每年骨质疏松症对一百五十万起骨折负有责任，这些骨折导致在医疗、社会和家庭护理方面花费达100亿美元的伤残。即使最乐观地估计，40％的65岁或更大年龄的患者在髋部骨折后不会活过两年。
在1991年，三名美国妇女中的一名是50岁或更老。出生高峰的一代将在1996年开始进入这个年龄组。因为妇女在绝经后一般存活30年，照目前的趋势，骨质疏松症的治疗是当代最主要的健康治疗之一。
生活方式可以是引发骨质疏松症的一个因素，特别是它是建立和维持健康的骨质以防止骨质疏松症的一个重要因素。目前，65岁以下的人比他们的父辈更多地久坐、有坏的饮食习惯、增加酒精和咖啡因的摄入和较多的与骨损失有关的药物治疗的经历。骨质疏松症发生的遗传素因也是明显的(见WO9403633，它讨论了骨质疏松症的遗传因素，特别引入第2-4页作为参考，以及Anderson and Pullitzer，1994；Dequeker et al.，1987；Garabedian，1995；Kelly et al.，1995；Pocock et al.，1987；Sambrook et al.，1994；Tokita et al.，1994)。
因此能够早期鉴定发生骨质疏松症的高危个体将是有用的，这样可劝告该个体适当地改变生活方式或进行其他治疗介入。例如，已表明在临界年龄早期阶段，补充钙和进行锻炼是有价值的预防性因素。激素替换治疗(HRT)也已被成功地用于对抗绝经后发生的骨质疏松症。如果在疾病过程的早期，在较多的骨损失已经发生之前应用，HRT将是极为有利的。因为HRT具有潜在的严重副作用，当决定用HRT而不是其他目的在于减少发生骨质疏松症危险的医疗介入时，知道妇女发生骨质疏松症的危险程度是有利的。
已发现一些检测与患骨质疏松症的危险相关，如专利申请EP93113604、WO8808457、WO9311149和WO9403633中所给出的。但是，这些申请都没有说明多基因座控制的细胞因子表达中的遗传变异以及它们在骨质疏松症中的可能作用。已显示细胞因子在骨的重建中起作用。在小鼠中，一种细胞因子，IL-6，据显示是失去雌激素后继发性骨损失的介体。(Poli et al.，1994)。此外，IL-1和肿瘤坏死因子(TNF)都诱导IL6，并在骨代谢中有一些重要作用。
因此，本发明的一个目的是确定编码细胞因子的基因是否在骨密度的调节中受到影响，以及骨密度的改变是否与骨质疏松症有关。如果是的话，那么鉴定与疾病敏感性有关的这些基因的等位变异体，并由此鉴定有骨质疏松症危险的个体将是有利的。
上面引用的申请都没有说明骨质疏松症中骨重建的细胞因子调节，因此无法鉴定所有的有骨质疏松症危险的个体。而且，对这样一些个体也是无法鉴定的，这些个体因具有一个或多个上述危险因素，并具有疾病的基于细胞因子方面以外的素因。
                本发明及其优点的概述
本发明公开了预测低骨矿物质密度(BMD)和骨密度损失速率，并由此预测骨质疏松症敏感性的方法。该方法包括从受试者中分离DNA，确定编码IL-1受体拮抗物(IL-1ra)的基因(IL-1RN)的DNA多态性模式。然后分析该模式，并确定在IL-1RN中表达遗传多态性模式(genetic polymorphism pattern)的个体，所述IL-1RN在骨质疏松症群体中是超显示的(overrepresented)。如此鉴定的个体可随后被更积极地治疗以预防或延缓疾病的发生。
本发明进一步公开了一种用于鉴定与受试者骨质疏松症有关的遗传多态性模式的试剂盒。该试剂盒包括DNA样品收集装置和确定遗传多态性模式的装置，随后对遗传多态性模式进行分析以确定受试者对骨质疏松症的敏感性。对照样品也包括在内。
              具体实施方案的详细说明
根据本发明，IL-1受体拮抗物(IL-1ra)的基因(IL-1RN)的等位基因被发现与骨质疏松症有关。通过检测IL-1ra的基因序列(IL-1RN)的DNA多态性的存在，本发明使得可以鉴定表现或没有表现出疾病的个体，所述个体具有患有骨质疏松症的遗传素因。如本文上文和后文给出的，骨质疏松症的定义与“骨质疏松症：病因、诊断和处理”(Raven Press，1988)，以及Peel and Eastell(1994，1995)和Eastelland Riggs(1988，1987a，b)中给出的相同。简单地说，骨质疏松症是一种骨病，其特征在于因骨密度减少而导致的骨脆性增加。
如下面实施例中所给出的，一种与骨密度减少有关的等位基因被鉴定为IL-1RN等位基因2。因此，本发明的方法鉴定与疾病危险有关的DNA遗传多态性模式至少一个拷贝的载体，即IL-1RN等位基因2。
本发明的方法也用于鉴定表达与患骨质疏松症有关的多遗传多态性模式的个体，这些个体具有较高的患骨质疏松症的危险。该方法从受试者中分离基因组DNA，在该DNA中鉴定IL-1受体拮抗物(IL-1RN)基因的遗传多态性模式。然后扫描该DNA针对其他与骨质疏松症有关基因的遗传多态性模式，所述基因如EP93113604、WO8808457、WO9311149和WO9403633中给出的。同时扫描对照DNA模式以正确地确定多态性模式。由此可确定受试者携带的与骨质疏松症危险有关的多态性的数量。这使得可以确定骨质疏松症的总的危险系数。
本文所用的术语“多态性”是指基因序列的变异体。多态性可以是这样的变异体(DNA序列差异)，它们一般存在于不同种族和不同地理分布的个体之间，虽然它们具有不同的序列，但产生功能等价的基因产物。多态性也包括可分为等位基因和/或突变体的变异体，它们可产生具有改变的功能的基因产物，即可产生非功能等价基因产物的序列变异体。多态性也包括这样一些可分为等位基因和/或突变体的变异体，它们或者不产生基因产物，或者产生失活的基因产物，或者产生增加的基因产物。而且，在适当的情况下，该术语可与等位基因互换使用。遗传检测可一般地按美国专利4,582,788、5,110,920和5,387,506中给出的进行，用于与一至二个基因(一旦基因被确定)有关或由其引起的疾病，以确定携带一个给定基因或基因组合的人的患病危险(见例如美国专利4,801,531、4,666,828和5,268,267)，如下面实施例所给出的。
本发明也公开了一种用于鉴定与受试者患骨质疏松症危险有关的遗传多态性模式的试剂盒。该试剂盒包括DNA样品收集装置和确定IL-1RN遗传多态性模式的装置。试剂盒中可包括显示已知IL-1RN模式的对照DNA样品。一旦个体的模式被鉴定，便可确定个体对骨质疏松症的敏感性。
在本发明方法的实践中，以及在所述试剂盒中，DNA样品得自血液或组织样品。在优选实施方案中，DNA将得自血细胞，该血细胞是通过针刺该个体的手指，将血液收集在吸收纸上而得到的。在进一步的优选实施方案中，血液被收集在AmpliCardTM(Sheffield大学，分子医学组，医学和病理学系，Royal Hallamshire医院，Sheffield，EnglandS10 2JF)上。用聚合酶链式反应(PCR)扩增干血斑的DNA中的靶序列。制备靶向感兴趣的基因中的特异性多态DNA区域的寡核苷酸DNA引物，使得在PCR反应中，靶序列的扩增可以完成。此实施方案的优点是只需要少量的血液，并且避免了静脉穿刺或组织活检的必要性。而且，一个干血斑可提供多项检测的足量模板DNA，使得结果可以重复并检测多个基因座。但是，也可使用本领域已知的其他收集DNA和确定多态性模式的装置。
然后分析从模板DNA扩增的DNA序列，以确定扩增序列中的遗传多态性，由此提供该个体的遗传多态性分布。靶DNA多态性的对照DNA样品同时进行分析。
许多疾病的临床表现是由细胞因子的产生调节的。细胞因子是由多种活化细胞产生的肽信号分子，所述活化细胞包括活化的免疫细胞例如来自胸腺的T淋巴细胞(T细胞)，B细胞和单核/巨噬细胞。细胞因子包括白介素(IL-1至IL-17)、粒细胞和/或巨噬细胞集落刺激因子(CSF)(CSF-G、CSF-M、CSF-GM)、肿瘤坏死因子(TNFα&β)，以及干扰素(IFNα，β&γ)。IL-1的基本活性包括IL-1α，IL-1β和IL-1受体拮抗物(IL-1ra)的组合活性。(综述见Duff，1993；Basic and Clinical Immunology，8th Ed.，1994，Stites，Terr & Parslow，editors，Chapter 9，pgs.105-123)。在例如下述疾病中发现单一细胞因子多态性与疾病状态有关：红斑狼疮(Blakemore et al.，1994)，溃疡性结肠炎(Mansfield et al.，1994)，脑少年类风湿性关节炎(McDowellet al.，1995)和脑疟疾(McGuire et al.，1994)。
据信细胞因子在骨重建中起作用。在小鼠中，IL-6是因失去雌激素而引起骨损失的介体(Poli，1994)。相应地，IL-1和肿瘤坏死因子(TNF)与骨重建的调节有关(Mundy，1993；Rickard et al.，Matfin，1993)。
发现编码IL-1ra的DNA序列中的一种特异多态性与骨质疏松症有关：IL-1RN等位基因2。编码IL-1ra的基因(IL-1RN)的该多态性位点的等位基因如下所示(Tarlow et al.，“人IL-1受体拮抗物基因内含子2中的多态性是由不同数量的86bp串联重复引发的”，Human Genetics 91：403-404(1993))：
等位基因1含有4段重复序列，长412bp；
等位基因2含有2段重复序列，长240bp；
等位基因3含有3段重复序列，长326bp；
等位基因4含有5段重复序列，长498bp；
等位基因5含有6段重复序列，长584bp。
然后如本发明给出的，分析个体的多态性分布，即等位基因类型。群体研究确定了健康人和如本发明确定的患骨质疏松症个体的预期分布。然后将个体的多态性分布与预期的分布进行匹配，由匹配结果确定患骨质疏松症的素因。
得到差异率值(接近相对危险值)来检测IL-1RN基因座的等位基因多态性模式(基因型)和疾病发生之间的相关性。这提供了预测性资料，可用于骨质疏松症的临床处理。可进一步得到除与骨质疏松症有关的IL-1RN之外的基因型的差异率。
此外，本发明提供了治疗对骨质疏松症敏感的个体的方法。这些个体是如上文讨论的，通过如下方法鉴定的：从受试者中分离基因组DNA，在DNA中鉴定IL-1受体拮抗物(IL-1ra)基因IL-1RN的遗传多态性模式，从而鉴定受试者中IL-1RN等位基因2的至少一份拷贝的存在，由此表明对骨质疏松症的敏感性。然后可以试图对这些患者施用IL-1(IL-1α和/或IL-1β)拮抗物。
对术语“拮抗物”用其最广泛的含义。拮抗物治疗可以是阻遏IL-1活性的任意药物或化合物。例如，拮抗物可结合IL-1，抑制或减少IL-1的产生或抑制IL-1对细胞的作用。此外，修饰IL-1的细胞受体使之不能接受IL-1的治疗也包括在此术语范围之内。
用于此目的的适当药剂可包括IL-1或IL-1受体的抗体，可溶性IL-1结合蛋白，IL-1受体拮抗物，抗炎性细胞因子(例如IL-6、IL-10、TGFβ)和一些小分子量药物，所述小分子量药物抑制与刺激骨重吸收有关的或抑制骨生成的IL-1、TNF和其他细胞因子的合成、释放或生物活性。拮抗物的施用和服用是根据有利的医学实践，考虑到个体的临床状况，施用的部位和方法，施用分案和医生所知的其他因素而进行的。用于本文中的“有效量”是出于本领域已知的考虑而确定的。该量必须对提高下述指标是有效的，所述指标包括但不限于骨密度的维持，以及其他本领域技术人员选作适当测量的指标。其他指标可包括维持或提高骨矿物质含量，增加成骨生化标记物，减少骨重吸收生化标记物。
在本发明方法中，可以以不同方式施用拮抗物。应注意拮抗物可以以化合物或药用盐的方式施用，可以单独施用或作为活性成分与药用载体、稀释剂、佐剂和赋形剂结合施用。依赖于本领域技术人员已知的所用拮抗物所需施用途径，这些化合物可以口服、皮下或胃肠外(包括静脉内)、动脉内、肌内、腹膜内和鼻内施用，以及鞘内和输注技术施用。化合物的植入也是有利的。口服、皮下或胃肠外(包括静脉内)、动脉内、肌内、腹膜内和鼻内施用，以及鞘内和输注技术输送拮抗剂，植入以及维持特定拮抗剂的生物活性的已知技术是优选的。
上面的讨论提供了本发明和用于鉴定受试者与骨质疏松症有关的遗传多态性模式的试剂盒的实际基础。对有患病危险的受试者的鉴定使得可以在疾病发生前开始进行预防性测量。而且，具有两个或更多危险因素、具有敏感基因型和生活方式素因或其他已知遗传素因的个体，可被特别地监测和积极地治疗，因为他们患病的危险非常高。本发明所用的方法以及本发明的应用由下面实施例表明。
                        实施例
一般方法
有关核酸技术的反应和操作，除非另外说明，按Sambrook et al.，1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress中一般性描述的进行；聚合酶链式反应(PCR)一般按PCRProtocols：A Guide To Methods And Applications，Academic Press，SanDiego，CA(1990)中描述的，以及美国专利4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659；5,272,057，和McDowell et al.，1995中一般性描述的方法进行，这些文献在此引入作为参考。
选择受试者
选择患过至少一次与骨质疏松有关的骨折的绝经后妇女，以评估很可能具有显著危险系数(环境和/或遗传)的妇女。骨矿物质密度的测量是在首次临床应诊或研究应诊时，通过双重发射X射线吸收测量技术(DEXA)进行的，该测量被用于进行分析(Peel和Eastell，1994)。骨矿物质密度(BMD)是指在一定量骨中的矿物质的含量。例如，如果在每平方厘米的骨中发现1克矿物质，则BMD值为1.0克/平方厘米。BMD是骨的强度和它们对骨质疏松症产生的骨折的抗性的量度。进行激素替换治疗(HRT)三个月以上或口服皮质类固醇的妇女被排除在外。
对照妇女是从一个流行病学研究项目中召集来的绝经后妇女。这些对照妇女没有接受过HRT，并且没有已知的骨质疏松的危险因素。
数据分析
应用的是x2分析和“Z”值分析。分析是用SAS统计学软件包进行的。“Z”值描述的是在一个给定的解剖学部位，与年龄校正后的骨矿物质密度平均值的偏差的幅度。
DNA的制备
用改进的盐析法(Nucleon IITM，Scotlab，UK)从全血中抽提DNA。
确定基因型
按前面Tarlow等(1993)描述的鉴定与IL-1RN基因有关的遗传多态性。PCR之后，在用溴乙锭染色的2％琼脂糖凝胶上，在紫外光下观察，鉴定不同的等位基因。在各实验中对不含DNA的阴性对照进行同样处理。
对IL-1RN的等位基因进行PCR扩增并确定产物大小
按前面Tarlow等(1993)描述的进行PCR扩增。RCR中所用的酶购自GIBCO BRL，热循环仪是Perkin-Elmer或Biometra产品。
IL-1RN基因的内含子2含有数目可变的串联重复(VNTR)区域，该区域产生五(5)个等位基因，它们被如下鉴定：
筛选：将基因组模板进行PCR扩增，产物在琼脂糖凝胶上分离之后，估计该产物的大小。
引物：基于基因组序列，在ABI DNA合成仪上制备下列引物：
5′CTCAGCAACACTCCTAT 3′(SEQ ID No：1)
5′TCCTGGTCTGCAGGTAA 3′(SEQ ID No：2)
PCR条件：
用1.75mM(终浓度)MgCl2，循环分案为：
96℃，1分钟，1个循环；
[94℃(1分钟)，60℃(1分钟)，70℃(1分钟)]30个循环；
70℃，2分钟，1个循环。
确定大小
在2％琼脂糖凝胶上，在90V下电泳45分钟。
从大小预测的结果：
等位基因1含有4段重复序列，长412bp；
等位基因2含有2段重复序列，长240bp；
等位基因3含有3段重复序列，长326bp；
等位基因4含有5段重复序列，长498bp；
等位基因5含有6段重复序列，长584bp。
虽然在IL-1RN基因座有5个已知的等位基因，但等位基因3、4和5是少见的。
结果
申请人在54名健康的无骨折史的绝经后妇女(平均年龄62.3岁，范围是52.5-77.8岁)和41名患有脊柱和/或远端前臂骨折的未经治疗的绝经后妇女(平均年龄72.0岁，范围是52.7-85.4岁)中，研究了IL-1RN基因的等位基因的转运(carriage)，与骨矿物质密度(通过DEXA扫描)之间的关系。
用PCR扩增IL-1RN基因VNTR多态性区域，在2％琼脂糖凝胶电泳上分析PCR产物。对照组和骨折组在等位基因2的转运速率方面没有显著差异(x2＝1.33，ρ＝0.25)。
在腰椎(L2-L4)(LSBMD)和股颈(FNBMD)处用双重X射线吸收测量技术(DEXA)(Eastell and Riggs，1988)测量骨矿物质密度(BMD)。BMD的“Z”值由310名年龄在50-80岁的妇女群体的BMD数据得来。将LSBMD和FNBMD的“Z”值与带有等位基因2和不带有等位基因2的妇女的“Z”值进行比较，如下所示。IL-12+指的是等位基因2纯合(1；2)或等位基因2杂合(1；2)的妇女，而IL-1RN2-指的是等位基因1纯合(1；1)的妇女。按双等位基因系统来处理该系统用于分析，因为等位基因3、4和5是少见的。
健康的对照组(n＝54)
  IL-1RN2+   IL-1RN2-   ρ
  LSBMD“Z”值FNBMD“Z”值   +0.04+0.09   +0.25+0.13   0.20.9
受试者：脊柱/远端前臂骨折组(n＝41)
  IL-1RN2+   IL-1RN2-   ρ
  LSBMD“Z”值FNBMD“Z”值   -1.06-0.70   -0.29-0.09   0.030.03
在一个给定解剖学部位，骨密度的年龄校正标准(平均)值的“Z”值偏差显示正常的对照个体具有平均为正的“Z”值(虽然IL-1RN2+即使在正常个体中也只有较低值)。骨折组具有负的“Z”值，表示与正常群体相比，在他们的年龄阶段具有较低的骨密度。重要的是，IL-1RN2+受试者与IL1RN2-的骨折妇女相比，在两个部位具有更低的平均骨密度(更负的“Z”值)。在两个骨部位测量到的IL-1RN(+)和IL-1RN(-)受试者之间的差异是统计学上显著的。
上面的数据显示在骨质疏松性骨折的妇女中，IL-1RN基因的等位基因2的转运是与较低的BMD相关的。这表明IL-1RN基因的等位基因2的转运是疾病严重程度的临床上有利的标记，在可能患骨质疏松症的受试者中，该基因标记可区分出骨密度明显偏低的受试者，这些受试者伴有骨质疏松性骨折-骨质疏松症的最重要的临床后果。
本发明因此提供鉴定有严重骨质疏松和低骨密度危险的受试者的方法，使得早期治疗可以进行。
在本申请全文中参考了不同的出版物和专利。本文未包括的参考出版物和专利的全部引用内容在下面列出。这些出版物的完整公开被引入本申请作为参考，以更全面地描述本发明相关领域的状况。
已对本发明以说明性方式进行了描述，应理解，本发明所用的术语是解释性词汇而不是限制性词汇。
显而易见的是，根据上文的讲授，本发明的许多改进和变化是可能的。因此，应理解，在所附权利要求的范围内，本发明可以以不同于具体描述的方式实施。
                         参考文献
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                          序列表
(1)一般资料
(i)申请人：MEDICAL SCIENCE SYSTEMS，INC.
(ii)发明名称：检测骨质疏松症的遗传素因
(iii)序列数量：2
(iv)相关地址：
(A)收信人：Baker & Botts，L.L.P.
(B)街道：910 Louisiana
(C)城市：Houston
(D)州：TX
(E)国家：USA
(F)邮政编码：77002-4995
(v)计算机可读形式：
(A)介质类型：软盘
(B)计算机：IBM兼容型
(C)操作系统：DOS
(D)软件：FastSEQ Version 1.5
(vi)当前申请资料：
(A)申请号：未知
(B)提交日：97年4月3日
(C)分类：
(vii)在先申请资料：
(A)申请号：
(B)提交日：
(viii)律师/代理人资料：
(A)姓名：Turley，Patrick
(B)注册号：35723
(C)参考/卷号：063268.0113
(ix)通讯资料：
(A)电话：713-229-1791
(B)传真：713-229-1522
(C)电传：
(2)SEQ ID No：1的资料：
(i)序列特征：
(A)长度：17个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：cDNA
(iii)假设：无
(iv)反义：无
(v)片段类型：
(vi)来源：
(x)序列描述：SEQ ID No：1
CTCAGCAACA CTCCTAT                 17
(2)SEQ ID No：2的资料：
(i)序列特征：
(ii)分子类型：cDNA
(iii)假设：无
(iv)反义：无
(v)片段类型：
(vi)来源：
(xi)序列描述：SEQ ID No：2
TCCTGGTCTG CAGGTAA                 17

Claims (2)

1.一种用于鉴定与骨质疏松症危险增加有关的受试者遗传多态性模式的试剂盒，其包含：
a)选自：5’CTCAGCAACACTCCTAT 3’和5’TCCTGGTCTGCAGGTAA 3’的寡核苷酸；
b)一种DNA对照样品，所述对照样品显示已知IL-1RN模式。
2.权利要求1的试剂盒，其还包括DNA样品收集装置。
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