CN100455276C - 表面涂覆二氧化钛基纳米薄膜层的人工晶状体的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种表面涂覆二氧化钛基纳米薄膜层的人工晶状体的制备方法，它包括以下制备步骤：先在二氧化钛溶胶中加入贵金属组分中的一种获得二氧化钛光催化剂溶胶；接着采用提拉或浸渍或喷涂技术将二氧化钛光催化剂溶胶在人工晶状体表面制备出二氧化钛光催化剂纳米薄膜；最后通过等离子体射频工艺使涂覆在人工晶状体表面的二氧化钛光催化剂纳米薄膜成为透明的二氧化钛基纳米薄膜，获得表面涂覆二氧化钛基纳米薄膜层的人工晶状体。本发明可制备出表面涂覆二氧化钛基纳米薄膜的人工晶状体，该人工晶状体在植入摘除白内障后的晶状体囊袋内后，可利用二氧化钛光催化剂对细胞增殖的抑制和氧化作用来抑制晶状体上皮细胞增殖。
Description
技术领域
本发明涉及一种表面涂覆二氧化钛基纳米薄膜层的人工晶状体的制备方法，具体的说是一种通过手术方式摘除白内障后，同时在晶状体囊袋内植入表面涂覆一层具有光催化作用的二氧化钛薄膜的人工晶状体以降低后发性白内障发生的方法。
背景技术
白内障是眼睛内晶状体发生混浊由透明变成不透明，阻碍光线进入眼内，从而影响视力甚至导致失明，是致盲的主要病症。目前治疗白内障最有效的方法是通过手术摘除混浊的晶状体，并植入人工晶状体，以获得视力的康复。但是约有20～50％的成年人患者，100％的青少年、儿童患者在白内障术后的三个月至四年间，因晶状体囊袋内残留的或新生的上皮细胞增殖，并迁移至后囊膜上，形成不透明膜，即后囊膜混浊(PCO)，也称之为后发性白内障。它是白内障术后最影响视力恢复的远期并发症，也是白内障盲人术后再致盲的主要原因。
目前，防治后发性白内障、减少再致盲因素所采用的方法有(1)改善手术条件，提高手术质量；(2)应用各种阻碍细胞增殖的药物；(3)基因疗法、基因反义技术、自杀基因、基因转染等；(4)改进人工晶状体材料和形状以及对人工晶状体表面进行修饰。这些方法主要基于通过手术尽量减少残留的晶状体上皮细胞(LEC)和皮质，通过药物防止残留LEC的增生、迁移和细胞外基质的合成。但由于眼内毒副反应明显，特异性差，或疗效不高至今仍不能安全而有效的应用于临床。因而如何彻底清除LEC，去除细胞增生的物质基础，是从根本上预防PCO的途径和方法。
光动力疗法(PDT)是通过某一波长的光激发化学光敏剂(药物)而起治疗作用的方法。其主要是通过分子能量转移过程激发产生高活性单态氧系，最终产生足够的具有细胞毒作用的氧物质，而导致组织坏死。这一方法已应用于皮肤、食道、膀胱、支气管、肺脏等肿瘤的治疗。也有学者将其应用于PCO治疗的研究，Yasmine等用菌绿素A(BCA)光动力法对囊袋内LEC的去除研究，并通过体外实验证实，在一定条件下LEC的增殖可完全被抑制。而Hyoung等用孟加拉红(Rose Bengal)作为光敏剂治疗PCO，动物实验证明该光敏剂可有效杀伤兔子的LEC，可降低兔眼PCO的发生率。但这些方法均发生结膜充血、水肿，切口处角膜水肿及轻微的虹膜炎，甚至对角膜内皮质存在潜在毒性。因此，该项技术的可行性很大程度上就在于能否找到一种更安全有效的物质来替代光敏剂，以减少或消除对眼的毒性。
光催化是近二十年来最活跃的化学研究领域之一，在众多的光催化剂中，半导体二氧化钛(TiO2)因其具有化学性质稳定、耐酸、耐碱，良好的生物相容性，对人体无害等特点而成为最理想的光催化剂。近年来研究也表明，TiO2能够有效的杀灭肿瘤细胞，因而光催化剂TiO2有可能作为光敏剂的替代物用于防治PCO。
发明内容
为了解决目前光动力学治疗后发性白内障所存在的问题，本发明提供了一种表面涂覆二氧化钛基纳米薄膜层的人工晶状体的制备方法，其目的是结合二氧化钛光催化剂的特点及其在光照下使生物分子失活甚至氧化分解的作用原理，通过本发明方法在人工晶状体表面涂覆上一层透明的二氧化钛基纳米薄膜，当将该人工晶状体植入摘除白内障后的晶状体囊袋内后，可利用二氧化钛光催化剂薄膜对细胞增殖的抑制作用和氧化作用达到抑制晶状体上皮细胞增殖的功效。
本发明的技术方案如下：
一种表面涂覆二氧化钛基纳米薄膜层的人工晶状体的制备方法，其特征在于，包括以下制备步骤：
(1)先在酸性pH＜5的条件下将钛的醇盐水解，得到均匀透明的溶胶，之后通过渗析法调节该溶胶的pH值至2～5，获得需要的二氧化钛溶胶；接着在制得的二氧化钛溶胶中以氯酸盐或金属溶胶的形式加入贵金属组分中的一种以制备出对自然光有一定吸收作用的二氧化钛光催化剂溶胶，加入时控制加入量以确保二氧化钛溶胶不凝胶；
(2)利用步骤(1)制备的二氧化钛光催化剂溶胶，采用提拉或浸渍或喷涂或其它技术在人工晶状体表面制备出二氧化钛光催化剂纳米薄膜；
(3)将表面涂覆有二氧化钛光催化剂纳米薄膜的人工晶状体放入射频等离子体发生器中，用纯度为99.999％的O2射频等离子体，射频功率为20～80W，真空度为20～60Pa，处理时间为5～120min，而后用去离子水浸泡24h～72h，最后在80℃或低于80℃的温度下烘干2～48小时，烘干时间与烘干温度成反比，使涂覆在人工晶状体表面的二氧化钛光催化剂纳米薄膜成为透明的二氧化钛基纳米薄膜，最终获得表面涂覆二氧化钛基纳米薄膜层的人工晶状体。
上述方案的进一步改进在于：步骤(2)在人工晶状体表面制备出透明的二氧化钛光催化剂纳米薄膜之前，先采用磺化法或等离子体技术对人工晶状体的表面进行预处理，以提高表面亲水性。
上述表面涂覆二氧化钛基纳米薄膜层的人工晶状体的用途在于：所述表面涂覆二氧化钛基纳米薄膜层的人工晶状体，可用于植入摘除了白内障后的晶状体囊袋内，当适当波长的光通过透明的角膜经瞳孔直接聚焦于人工晶状体表面和晶状体后囊膜面上时，可激发二氧化钛光催化剂纳米薄膜催化、氧化、分解残留在晶状体囊袋表面的上皮细胞，从而达到防止后发性白内障发生的目的。
本发明的效果和优越性在于：(1)与其他光敏剂相比，TiO2不会引起白细胞减少，毒理测试也表明TiO2对眼无刺激性；(2)TiO2薄膜具有良好的亲水耐久性而易与生物体相容；(3)由于晶状体在眼球解剖学及生物学的特殊性，经散大瞳孔后，晶状体可完全暴露在可见光照射的范围内，因而易接收到所需波长的自然光。
具体实施方式
本发明的具体技术方案如下：
一.表面涂覆二氧化钛基纳米薄膜层的人工晶状体的制备方法，其特征在于：包括人工晶状体和涂覆于人工晶状体表面的二氧化钛基纳米薄膜层。
二.表面涂覆二氧化钛基纳米薄膜层的人工晶状体的制备方法：
(一)二氧化钛溶胶的制备及其修饰
(1)二氧化钛溶胶的制备：在酸性pH＜5的条件下将钛的醇盐(例如钛酸四异丙酯、钛酸四丁酯)水解，得到均匀透明的溶胶，之后通过渗析法调节溶胶的pH值至2～5。
(2)二氧化钛溶胶的修饰：在上述溶胶中以氯酸盐或金属溶胶的形式加入一定量的Pt、或Au或其它贵金属组分中的一种以制备出对自然光有一定吸收作用的二氧化钛光催化剂溶胶，加入时控制加入量以保证溶胶不凝胶。溶胶中的二氧化钛的固体含量为0.1～5.0wt％，Pt、或Au与固体二氧化钛的重量含量比为10-4～10-1。
(二)PMMA材料表面的预处理有两种方法：
(1)磺化法：将浓硫酸和蒸馏水按体积比5∶1～1∶1合后冷却，将人工晶状体浸入到该溶液中1s～10s，然后迅速取出，用蒸馏水洗净表面的残留液，干燥后备用；
(2)等离子体处理：将人工晶状体放入射频等离子体发生器中，用纯度为99.999％的O2射频等离子体，射频功率为20～80W，真空度为20～60Pa，处理0.5～3min后备用。
(三)人工晶状体表面二氧化钛基纳米薄膜的制备方法有两种
方法一：将表面预处理后干净的人工晶状体浸入经过化学修饰后的二氧化钛溶胶中，接着以一定的速度提拉人工晶状体，在其表面形成一溶胶薄膜，薄膜晾干后放在射频等离子体发生器中，用O2(O2的纯度为99.999％)射频等离子体进行表面处理，射频功率为20～80W，真空度为20～60Pa，处理时间为5～120min(在这个过程中，通过等离子体氧化作用，并利用其产生的能量或局部高温可得到合适的二氧化钛晶相结构)。等离子体处理完毕后，将样品用去离子水浸泡24～72h，然后在80℃或低于80℃下烘干2～48小时，烘干时间与烘干温度成反比。也可采用浸渍、或喷涂、或其它技术在人工晶状体镀膜，镀膜后的人工晶状体按上述同样等离子体技术进行后处理。镀有二氧化钛基纳米薄膜的人工晶状体可按常规方式植入摘除了白内障后的晶状体囊袋内。
方法二：采用仿生成膜技术直接将二氧化钛前驱物溶液沉积在人工晶状体的表面，即以异丙醇钛溶液或其他有机钛醇盐溶液为沉积液，以聚乙烯醇、或聚乙二醇、或其它水溶性成膜物作为和无机离子相互作用的仿生有机界面，在低于90℃的温度下，用pH值为1～5，且含有2～8wt％的异丙醇钛溶液或其他有机钛醇盐、以及0.5～5w％的聚乙烯醇、或聚乙二醇、或其它水溶性成膜物的乙醇溶液，直接通过提拉、或浸渍、或喷涂或其它方法在人工晶状体表面制备出二氧化钛活性膜。
三、所述表面涂覆二氧化钛基纳米薄膜层的人工晶状体的用途在于：该表面涂覆二氧化钛基纳米薄膜层的人工晶状体，可用于植入摘除了白内障后的晶状体囊袋内，当适当波长的光通过透明的角膜经瞳孔直接聚焦于人工晶状体表面和晶状体后囊膜面上时，可激发二氧化钛光催化剂纳米薄膜催化、氧化、分解残留在晶状体囊袋表面的上皮细胞，从而达到防止后发性白内障发生的目的。
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1：二氧化钛溶胶的制备和化学修饰
将1.1毫升浓硝酸(68％)加入150毫升的去离子水中配成均匀溶液，在强烈搅拌下将12.5毫升钛酸四异丙酯缓慢滴入酸性水溶液中，水解得到的含有白色沉淀的悬浮液在40℃下继续搅拌直至白色沉淀溶解形成均匀透明的溶胶。把溶胶装入渗析膜袋中用2升去离子水进行渗析处理，每隔12小时换一次水至渗析水最终pH值为3.0。将溶胶从渗析袋中取出，制得浓度约为2.5％的二氧化钛溶胶。而后取此溶胶100毫升和1毫升制备好的1克/升的Au溶胶进行混合，制得Au/TiO2溶胶。
实施例2：人工晶状体表面TiO2基纳米光催化剂薄膜的制备
先将人工晶状体表面按磺化法进行预处理，即先将浓硫酸和蒸馏水按体积比2∶1混合后冷却，而后把人工晶状体浸入到该溶液中1s，然后取出，用蒸馏水洗净表面的残留液，干燥。
将上述预处理过的人工晶状体放入一丝网中，将丝网放入实施例1中制得的Au/TiO2溶胶中，以1cm/min的速度提拉出来，晾干后将其置放在射频等离子体发生器中，用O2(O2的纯度为99.999％)射频等离子体进行表面处理，射频功率为20W，真空度为25Pa，处理时间为20min。等离子体处理完毕后，将样品用去离子水浸泡36h，然后在80℃或低于80℃下烘干4h，制得镀有TiO2光催化剂薄膜的人工晶状体。
按照实施例1和实施例2的制备过程，改变制备条件可得到其他几组涂覆有TiO2薄膜的人工晶状体样品见表1所示。
表1：采用不同条件制备的改性人工晶状体样品(采用磺化法对人工晶状体表面进行预处理)
改变预处理方法，即将人工晶状体放入射频等离子体发生器中，用纯度为99.999％的O2射频等离子体，射频功率为20～80W，真空度为20～60Pa，处理0.5～3min后备用，采用不同条件可得到其他几组涂覆有TiO2薄膜的人工晶状体样品见表2所示。
表2：采用不同条件制备的改性人工晶状体样品(采用等离子体技术对人工晶状体表面进行预处理)
实施例3：镀有薄膜的人工晶状体的细胞杀伤实验
无菌条件下，剔除牛眼肌肉组织，暴露干净巩膜，浸泡在含3.2万U/mL庆大霉素的生理盐水中1小时，接着用75％酒精浸泡10mins，再用无菌PBS液冲洗3次。沿角巩缘剪开角膜，撕去虹膜，暴露并截取晶状体前囊，将其剪成若干碎片，置于加有3mL含20％小牛血清的DMEM培养液的六孔板中，一眼晶状体囊膜放置一孔。于37℃，含5％CO2的细胞培养箱中静置培养，7-10天后换液一次，以后3天左右换液一次。原代培养的细胞在六孔板中长成亚汇合后，用0.02％EDTA和0.25％胰酶消化成单细胞悬液，按1∶2传代，用含20％小牛血清的DMEM培养液分种传代于75mL培养瓶中，2-3天换液一次。实验选取2-5代晶状体上皮细胞。消化牛晶状体上皮细胞在实施例2制得的镀有TiO2薄膜的第1组人工晶状体样片和未镀有TiO2薄膜的人工晶状体样片(高压灭菌)上，每片加入牛晶状体上皮细胞悬液180μL，使其尽量均匀布满玻片而又不长到玻片外，并尽量减少各组爬片细胞量的误差。4-8小时后，补加培养液820μL，使培养液终体积为1mL，待细胞生长至单层后分别进行下述三种实验。
1.MTT法检测UVA照射后的细胞存活率
在两组样片表面进行牛晶状体上皮细胞爬片(细胞生长至单层)后，经UVA照射不同时间，光镜下可见未镀有TiO2薄膜的人工晶状体表面细胞形态变化不很明显，镀有TiO2薄膜的人工晶状体，照射30分钟以上，就可见细胞大部分收缩变圆，细胞表面有大量泡状突起，表明细胞死亡。两组样片在照射相同时间后，两组样品表面的细胞存活率有差异，镀有TiO2薄膜组的细胞存活率低于未镀有TiO2薄膜组的细胞存活率；当光照40min后，镀有TiO2薄膜组的细胞存活率明显较未镀有TiO2薄膜组的空白样片显著降低(详见表3)。
表3MTT法测试结果
表3结果显示，在相同的照射时间下，镀有TiO2薄膜组样片的细胞存活率较未镀有TiO2薄膜组样片的低，特别是在在光照时间大于30min时，差异更未明显。
2.HE染色法光镜下观察细胞形态
在两组样片表面进行牛晶状体上皮细胞爬片(细胞生长至单层)后，经UVA进行照射，照射方法和时间均与MMT法一致。未镀有TiO2薄膜的人工晶状体表面细胞贴壁良好，分布均匀，细胞形态正常，细胞连接紧密，染色质分布均匀，核仁明显，直至照射30分钟细胞都无明显变化。但照射40分钟以上，可见部分细胞形态改变如：细胞收缩、间隙增大，胞质浓缩等。而在镀有TiO2薄膜的人工晶状体组中，未照射、照射10分钟、20分钟后，人工晶状体表面的细胞形态基本正常，但照射30分钟以上细胞改变明显：细胞收缩变圆，细胞间隙增大，细胞核固缩明显，未见到核仁，部分胞膜破裂，细胞崩解为碎片，表明镀有TiO2薄膜的人工晶状体表面上的细胞死亡。
3.AO-EB染色法荧光显微镜下观察细胞形态和细胞死亡率的测试。
在两组样片表面进行牛晶状体上皮细胞爬片(细胞生长至单层)后，经UVA进行照射，照射方法和时间均与MMT法一致。各组细胞分别只照射20分钟和30分钟。未镀有TiO2薄膜的人工晶状体表面细胞核染色质着绿色并呈正常结构。镀有TiO2薄膜的人工晶状体表面细胞大多数核染色质着桔红色，部分核结构正常，部分呈固缩状，表现出凋亡和死亡现象，照射20分钟后细胞主要表现为凋亡的细胞形态，照射30分钟后细胞绝大多数表现为死亡的细胞形态。
其两组样片表面细胞的具体变化结果见表4。
表4AO-EB法测试结果
表4结果显示，光照20min后，未镀有TiO2薄膜的人工晶状体表面细胞凋亡率4.3％；镀有TiO2薄膜的人工晶状体表面细胞凋亡率19.1％。而光照30min后，未镀有TiO2薄膜的人工晶状体表面细胞死亡率56.9％；镀有TiO2薄膜的人工晶状体表面细胞的细胞死亡率92.1％。
上述实验结果表明，在UVA照射下，纳米TiO2基光催化剂薄膜对人工晶状体表面的细胞有明显的杀伤和抑制作用。
实施例4：细胞移行实验
将按实施例2制得的表面上涂有细胞组织的镀有TiO2薄膜的第7组人工晶状体样片和未镀有TiO2薄膜的人工晶状体空白样片进行细胞移行实验对比。细胞爬片生长融合至单层，用PBS洗两遍，饥饿血清(含10g/LBSA和体积分数为1％胎牛血清的DMEM培养液)培养约24h，用无菌滴管在玻片中间划伤细胞，后用PBS洗两遍(去除细胞碎片)，加3ml左右的新鲜饥饿血清，培养24h和48h，分别照相并进行比较，用目镜上的标尺纪录移行距离。其结果见表5所示。
表5：细胞划伤后移行实验结果
表4结果显示，细胞划伤48小时后，未镀TiO2薄膜组(移行距离均数0.951)与镀有TiO2薄膜组(移行距离均数0.640)的细胞移行距离有显著性差别。这说明纳米TiO2基光催化剂薄膜对细胞的移行可以产生一定的抑制作用
实施例5：亲水性测试
人工晶状体与生物体的相容性可由其表面亲水性表示，亲水性可通过比较静态水解接触角的高低得出。为此，将实施例2制得的第4组样片和未涂覆TiO2薄膜的空白人工晶状体样片，经UVA(主波长365nm，光照强度0.5mW/cm2)活化5分钟后，在OCA20型接触角仪(德国Dataphysics Instruments Gmbh-数据物理仪器公司)上采用座滴法测定膜表面对水的接触角，水滴的体积为5μL。实验时连续测定几个接触角，然后取平均值，测量误差为±2°。结果为：
未镀有TiO2薄膜的人工晶状体组：15.8±2°；
镀有TiO2薄膜的人工晶状体组：接触角小至仪器无法测出。
结果显示，镀有TiO2薄膜的人工晶状体样片表面亲水性很好，说明其与生机体有良好的相容性。
实施例6：人工晶状体表面TiO2的仿生成膜制备及其性能测试
先将人工晶状体依次在NaOH和丙酮溶液中经超声波清洗器清洗2次～3次，除去表面的油脂和污物，用真空干燥箱烘干备用。在100ml乙醇溶液中加入3g异丙醇钛，10mL 3～7％PVA水溶液，加入滴加0.1mL浓HNO3，搅拌中在水浴中加热至80℃，维持4h。而后将上述洗净的人工晶状体在此溶液中以1cm/min的速度进行提拉，晾干后制得TiO2活性膜。
改变异丙醇钛浓度、pH值，或用聚乙二醇2000代替聚乙烯醇，制得其他成膜前驱溶液，从而在人工晶状体表面制得其他TiO2的防生成膜。样品共4组，编号为13～16。
将上述样品分别按实施例3、实施例4和实施例5的方法进行细胞杀伤、细胞移行和亲水性(水滴接触角)，并与空白样品对比。上述各组样品的制备条件及性能比较见表6所示。
表6利用防生成膜法在不同条件下制备的人工晶状体及其性能
| 试验组 | 溶液pH值 | 异丙醇钛含量(wt％) | 成膜物及其含量(wt％) | 处理温度(℃) | AO-EB法30min细胞死亡率(％) | 48h细胞移行距离(mm) | 水滴接触角(°) |
| 13 | 1 | 2.0 | 聚乙烯醇5.0 | 60 | 95.3±1.70％ | 0.8193±0.1305 | 1.0 |
| 14 | 3 | 8.0 | 聚乙烯醇2.0 | 20 | 93.6±1.80％ | 0.8324±0.1290 | 2.0 |
| 15 | 3 | 4.5 | 聚乙二醇0.5 | 80 | 92.8±1.30％ | 0.8211±0.1305 | 1.0 |
| 16 | 5 | 3.0 | 聚乙二醇2.0 | 60 | 95.1±1.90％ | 0.8308±0.1280 | 0.8 |
Claims (6)
1.一种表面涂覆二氧化钛基纳米薄膜层的人工晶状体的制备方法，其特征在于，包括以下制备步骤：
(1)先在酸性pH＜5的条件下将钛的醇盐水解，得到均匀透明的溶胶，之后通过渗析法调节该溶胶的pH值至2～5，获得需要的二氧化钛溶胶；接着在制得的二氧化钛溶胶中以氯酸盐或金属溶胶的形式加入贵金属组分中的一种以制备出对自然光有一定吸收作用的二氧化钛光催化剂溶胶，加入时控制加入量以确保二氧化钛溶胶不凝胶；
(2)利用步骤(1)制备的二氧化钛光催化剂溶胶，采用提拉或浸渍或喷涂或其它技术在人工晶状体表面制备出二氧化钛光催化剂纳米薄膜；
(3)将表面涂覆有二氧化钛光催化剂纳米薄膜的人工晶状体放入射频等离子体发生器中，用纯度为99.999％的O2射频等离子体，射频功率为20～80W，真空度为20～60Pa，处理时间为5～120min，而后用去离子水浸泡24h～72h，最后在80℃或低于80℃的温度下烘干2～48小时，烘干时间与烘干温度成反比，使涂覆在人工晶状体表面的二氧化钛光催化剂纳米薄膜成为透明的二氧化钛基纳米薄膜，最终获得表面涂覆二氧化钛基纳米薄膜层的人工晶状体。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)在人工晶状体表面制备出透明的二氧化钛光催化剂纳米薄膜之前，先采用磺化法或等离子体技术对人工晶状体的表面进行预处理，以提高表面亲水性。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述钛的醇盐为钛酸四异丙酯或钛酸四丁酯。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述贵金属组分为Pt或Au。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)获得的二氧化钛光催化剂溶胶中，二氧化钛的固体含量为0.1～5.0wt％，Pt或Au与固体二氧化钛的重量含量比为10-4～10-1。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述的磺化法预处理过程为：将浓硫酸和蒸馏水按体积比5∶1～1∶1混合后冷却，将人工晶状体浸入到该溶液中1s～10s，然后迅速取出，用蒸馏水洗净表面的残留液，干燥后备用；
所述的等离子体技术预处理过程为：将人工晶状体放入射频等离子体发生器中，用纯度为99.999％的O2射频等离子体，射频功率为20～80W，真空度为20～60Pa，处理0.5～3min后备用。
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