CN100497373C - 新的黑皮质素受体模板、肽及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含拮抗剂和激动剂的内源性配体残基组合的新的嵌合肽和模板。具体而言，本发明涉及基于黑皮质素激动剂肽和野灰蛋白相关蛋白(AGRP)的新的嵌合肽及其模板。本发明提供了对黑皮质素受体具有特异生物活性的多功能嵌合肽以及它们作为治疗多种疾病和不良状况的药物的用途。

Description

新的黑皮质素受体模板、肽及其用途
联邦政府基金支持声明
本发明是在美国国立健康研究院(National Institutes of Health)授予的基金号DK57080和DK64250的联邦基金支持下完成的。美国政府享有本发明的一定权利。
发明领城
本发明涉及包含拮抗剂和激动剂内源性配体残基组合的新的嵌合肽和模板。具体而言，本发明涉及基于黑皮质素激动剂肽和野灰蛋白(agouti)相关蛋白(AGRP)拮抗剂肽的新的嵌合肽及其模板以及它们作为治疗多种疾病和不良状况的药物的用途。
发明背景
根据疾病控制与预防中心(Centers for Disease Control andPrevention)的统计，当今大约三分之二的美国成年人超重或肥胖。肥胖对身体健康是有害的并且是已经确立的大量潜在威胁生命的疾病如动脉粥样硬化、高血压、糖尿病、中风、肺栓塞和癌症的危险因素。此外，肥胖能够摧毁个体的心理健康并且影响人们在社会上与其它人交往的能力。
伴随该问题的破坏性医学后果是美国健康保障系统的巨大经济负担。据估计，每年因为肥胖症和其相关疾病导致的医疗费用和收入损失超过680亿美元。鉴于肥胖症对个体和社会的影响，已经致力于寻找治疗肥胖症的方法，但是在长期治疗和/或预防肥胖症方面成功的很少。
已知阿黑皮素原(POMC)衍生肽能够影响食物摄取。几方面的证据支持如下观点，即黑皮质素受体(MCR)家族的G-蛋白偶联受体(GPCR)是涉及控制食物摄取和代谢的POMC衍生肽的靶点，其中在所述的G-蛋白偶联受体中，有几种在脑中表达。
因此早已鉴定出5种不同的MCR，并且它们在不同的组织中表达。MC1R最初是通过扩展位点(Extension locus)的显性功能获得性突变而进行特征描述的，该扩展位点通过控制酪氨酸酶来控制褐色素向真黑色素的转变从而影响表皮颜色。MC1R主要表达于黑色素细胞。MC2R表达于肾上腺并且是促肾上腺皮质激素(ACTH)的受体。MC3R表达于脑、消化道和胎盘并且涉及食物摄取和产热的控制。MC4R专一表达于脑，并且实验室观察表明它也涉及食物摄取的控制。见Kask A，等，“Selectiveantagonist for the melanocortin-4 receptor(HS014)increases food intakein free-feeding rats，”Biochem.Biophys.Res.Commun.，245：90-93(1998)。MC5R在包括白脂肪、胎盘和外分泌腺在内的多种组织中表达。MC5R敲除小鼠表现出降低的皮脂腺脂类产生(Chen等，“Exocrine glanddysfunction in MC5-R-deficient mice：evidence for coordinated regulationof exocrine gland function by melanocortin peptides，”Cell，91：789-798(1997))。
在肥胖症中存在MCR参与的证据包括：a)异位表达MC1R、MC3R和MC4R拮抗剂的野灰(agouti)(Avy)小鼠是肥胖的，表明阻断这三种MCR的作用会导致饮食过量和代谢失调；b)MC4R敲除小鼠(Huszar，D.等，“Targeted disruption of the melanocortin-4 receptor results in obesity inmice，”Cell，88：131-141(1997))重现了野灰小鼠的表型—这些小鼠是肥胖的；c)向啮齿动物脑室内注射(ICV)环状七肽MT-II(非选择性的MC1R、MC3R、MC4R和MC5R激动剂)在几种动物喂养模型(NPY、ob/ob、野灰、禁食)中食物摄取降低了，而脑室内注射SHU-9119(MC3R和MC4R的拮抗剂；MC1R和MC5R的激动剂)逆转了该效应并且能够导致饮食过量；iv)据报道，用NDP-MSH衍生物(HP228)慢性腹膜内处理Zucker脂肪大鼠在12周内激活MC1R、MC3R、MC4R和MC5R并且减弱了食物摄取和体重增加(Corcos，I.等，“HP228 is a potent agonist of melanocortinreceptor-4 and significantly attenuates obesity and diabetes in Zucker fattyrats，”Society for Neuroscience abstracts，23：673(1997))。
虽然已有证据表明MC4R信号在介导摄食行为中是重要的(Giraudo，S.Q.等，“Feeding effects of hypothalamic injection of melanocortin-4receptor ligands，”Brain Research，80：302-306(1998))并且MC3R信号能够降低食物摄取并参与能量稳态(肥胖)的调节，但是还没有鉴定出能够作为控制肥胖症靶标的特异性单一MCR。
野灰蛋白相关蛋白(AGRP)是一个推测包含5个二硫键的132个氨基酸(对人而言)的肽并且拮抗中枢大脑的黑皮质素受体(MC3R和MC4R)(Ollmann，M.M.等，“Antagonism of central melanocortin receptors invitro and in vivo by agouti-related protein，”Science，278：135-138(1997)；和Yang，Y.K.等，“Characterization of Agouti-related protein binding tomelanocortin receptors，”Mol.Endo.，13：148-155(1999))。野灰蛋白(ASP)是AGRP的同系物并且作为内源性G蛋白偶联受体(GPCR)的拮抗剂被首先鉴定出来。该两个蛋白质是目前报道的仅知的GPCR的天然存在的拮抗剂，使得它们成为肽的独特家族。
对野灰肽的结构-活性的先前研究鉴定出三氨基酸基序Arg-Phe-Phe是重要的，该基序在野灰蛋白和AGRP中是保守的(见，例如Kiefer，L.等，“Mutations in the carboxyl terminus of the agouti protein decrease agoutiinhibition of ligand binding to the melanocortin receptors，”Biochemistry，36：2084-90(1997))。这些研究表明在野灰蛋白和AGRP中发现的保守Arg-Phe-Phe基序对于该两种分子对黑皮质素受体的拮抗特性和分子识别特性是重要的。
所有内源性黑皮质素激动剂均包含公认的氨基酸序列(His)/Phe-Arg-Trp，推测它们对于黑皮质素受体分子识别和激活是重要的。此外，如Tota，M.R.等，“Molecular interaction of Agouti protein andAgouti-related protein with human melanocortin receptors，”Biochemistry，38：897-904(1999)和Haskell-Luevano，C.等，“The agouti-related proteindecapeptide(Yc[CRFFNAFC]Y)possesses agonist activity at the murinemelanocortin-1 receptor，”Peptides，2l：683-689(2000)所支持，对拮抗剂Arg-Phe-Phe基序和内源性黑皮质素激动剂保守残基Phe-Arg-Trp之间同源性的进一步外推暗示拮抗剂残基模拟了激动剂Phe-Arg-Trp与黑皮质素受体的相互作用。
已经报道野灰蛋白片段是MC1R的激动剂(Yang，Y.K.等，“Functionalproperties of an agouti signaling protein variant and characteristics of itscognate radioligand，”Am.J.Physiol.Regul.Integr.Comp.Physiol.，281：R1877-1886(2001))。已经报道多种黑皮质素激动剂肽(即Ac-His-DPhe-Arg-Trp-NH2和Ac-His-Phe-Arg-Trp-NH2)对小鼠黑皮质素受体分别具有nM和μM级的效能，并且三肽Ac-Phe-Arg-Trp-NH2对mMC1R具有μM级激动剂活性(Haskell-Luevano，C.等，“Characterizationof melanocortin NDP-MSH agonist peptide fragments at the mouse centraland peripheral melanocortin receptors，”J.Med.Chem，44：2247-2252(2001))。进一步的研究表明，Ac-His-Phe-Arg-Trp-NH2是在经典的青蛙和蜥蜴皮肤生物测定中产生生理反应(μM)所需要的黑皮质素激动剂的最小片段(Hruby，V.J.等，“alpha-Melanotropin：the minimal active sequence inthe frog skin bioassay，”J.Med.Chem.，30：2126-2130(1987)；和Castrucci，A.M.L.等，“Alpha-melanotropin：the minimal active sequence in the lizardskin bioassay，”Gen.Comp.Endocrinol.，73：157-163(1989))。
考虑到需要更好地理解肥胖症的生物学及其与MCR的关系，需要鉴定和研发用于治疗或预防肥胖症的新的试剂、方法和组合物。
发明简述
本发明提供了基于黑皮质素激动剂肽和野灰蛋白相关蛋白(AGRP)的新的嵌合肽和制备此类肽的方法。本发明的嵌合肽是多功能的并且证明对黑皮质素受体具有特异生物活性。
在本发明的一个实施方案中，黑皮质素激动剂肽中的氨基酸His/DPhe-Arg-Trp被AGRP的Arg-Phe-Phe残基取代以便提供对黑皮质素受体有效的多功能嵌合肽。在另一个实施方案中，用黑皮质素激动剂肽的His/DPhe-Arg-Trp氨基酸替代AGRP的Arg-Phe-Phe残基而得到嵌合肽。在一个相关的实施方案中，本文所描述的嵌合肽中的AGRPArg-Phe-Phe结构域可以包括在该结构域内发生替代的天然和/或非天然氨基酸。在一个优选的实施方案中，可以将形成内源性二硫键的半胱氨酸替换成天冬酰胺和二氨基丙酸，从而导致在AGRP侧链形成内酰胺键。所有这些实施方案均提供了多功能嵌合肽，其为黑皮质素受体的高效激动剂和/或拮抗剂。
附图简述
图1总结了一些黑皮质素激动剂和AGRP拮抗剂的氨基酸序列。
图2图解说明本文所述的氨基酸和其缩写。
序列的简要总结
按照本发明的合成肽或者基于包含基于黑皮质素氨基酸残基的AGRP(109-118)模板，或者基于包含hAGRP(111-113)Arg-Phe-Phe氨基酸的黑皮质素激动剂模板，或者基于上面所讨论的包含与二硫键相对的内酰胺键的任何模板或肽。为了实验和比较的目的，合成了肽SEQ ID NO：1(Tyr-c[Cys-Arg-Phe-DPhe-Asn-Ala-Phe-Cys]-Tyr)；SEQ ID NO：2(Tyr-c[Asp-Ala-Ala-Ala-Asn-Ala-Phe-Dpr]-Tyr)；SEQ ID NO：12(Ac-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-Ala-Ala-Ala-Gly-Lys-Pro-Val)和SEQ IDNO：19(Ac-Nle-c[Asp-His-Ala-Ala-Ala-Lys])。本发明的肽包括下列肽(从氨基末端至羧基末端)：
Tyr-c[Asp-Arg-Phe-Phe-Asn-Ala-Phe-Dpr]-Tyr(SEQ ID NO：3)；
Tyr-c[Asp-Trp-Arg-Phe-Asn-Ala-Phe-Dpr]-Tyr(SEQ ID NO：4)；
Tyr-c[Asp-Trp-Arg-DPhe-Asn-Ala-Phe-Dpr]-Tyr(SEQ ID NO：5)；
Tyr-c[Asp-Phe-Arg-Trp-Asn-Ala-Phe-Dpr]-Tyr(SEQ ID NO：6)；
Tyr-c[Asp-DPhe-Arg-Trp-Asn-Ala-Phe-Dpr]-Tyr(SEQ ID NO：7)；
Tyr-c[Asp-His-Arg-Phe-Phe-Asn-Ala-Phe-Dpr]-Tyr(SEQ ID NO：8)；
Tyr-c[Asp-His-Phe-Arg-Trp-Asn-Ala-Phe-Dpr]-Tyr(SEQ ID NO：9)；
Tyr-c[Asp-His-DPhe-Arg-Trp-Asn-Ala-Phe-Dpr]-Tyr(SEQ IDNO：10)；
Ac-Ser-Tyr-Ser-Nle-Tyr-c[Asp-Arg-Phe-Phe-Asn-Ala-Phe-Dpr]-Tyr-Lys-Pro-Val(SEQ ID NO：11)；
Ac-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-Phe-Phe-Arg-Gly-Lys-Pro-Val(SEQ IDNO：13)
Ac-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-Phe-Phe-Arg-Gly-Lys-Pro-Val(SEQ IDNO：14)；
Ac-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-Arg-Phe-Phe-Gly-Lys-Pro-Val(SEQ IDNO：15)；
Ac-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-DArg-Phe-Phe-Gly-Lys-Pro-Val(SEQID NO：16)；
Ac-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-Arg-DPhe-Phe-Gly-Lys-Pro-Val(SEQID NO：17)；
Ac-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-Arg-Phe-DPhe-Gly-Lys-Pro-Val(SEQID NO：18)；
Ac-Nle-c[Asp-His-Arg-Phe-Phe-Lys](SEQ ID NO：20)；
Ac-Nle-c[Asp-His-DArg-Phe-Phe-Lys](SEQ ID NO：21)；
Ac-Nle-c[Asp-His-Arg-DPhe-Phe-Lys](SEQ ID NO：22)；
Ac-Nle-c[Asp-His-Arg-Phe-DPhe-Lys](SEQ ID NO：23)；
Tyr-c[Asp-Ala-DPhe-Arg-Trp-Asn-Ala-Phe-Dpr]-Tyr(SEQ IDNO：24)；
Tyr-c[Asp-His-Ala-Arg-Trp-Asn-Ala-Phe-Dpr]-Tyr(SEQ ID NO：25)；
Tyr-c[Asp-His-DPhe-Ala-Trp-Asn-Ala-Phe-Dpr]-Tyr(SEQ IDNO：26)；
Tyr-c[Asp-His-DPhe-Arg-Ala-Asn-Ala-Phe-Dpr]-Tyr(SEQ IDNO：27)；
Tyr-c[Asp-Pro-DPhe-Arg-Trp-Asn-Ala-Phe-Dpr]-Tyr(SEQ IDNO：28)；
Tyr-c[Asp-Phe-DPhe-Arg-Trp-Asn-Ala-Phe-Dpr]-Tyr(SEQ IDNO：29)；
Tyr-c[Asp-(rac)Atc-DPhe-Arg-Trp-Asn-Ala-Phe-Dpr]-Tyr(SEQ IDNO：30)；
Tyr-c[Asp-His-Pro-Arg-Trp-Asn-Ala-Phe-Dpr]-Tyr(SEQ ID NO：31)；
Tyr-c[Asp-His-(pI)DPhe-Arg-Trp-Asn-Ala-Phe-Dpr]-Tyr(SEQ IDNO：32)；
Tyr-c[Asp-His-DNal(2’)-Arg-Trp-Asn-Ala-Phe-Dpr]-Tyr(SEQ IDNO：33)；
Tyr-c[Asp-His-DNal(1’)-Arg-Trp-Asn-Ala-Phe-Dpr]-Tyr(SEQ IDNO：34)；
Tyr-c[Asp-His-DBip-Arg-Trp-Asn-Ala-Phe-Dpr]-Tyr(SEQ IDNO：35)；
Tyr-c[Asp-His-DPhe-Pro-Trp-Asn-Ala-Phe-Dpr]-Tyr(SEQ IDNO：36)；
Tyr-c[Asp-His-DPhe-Lys-Trp-Asn-Ala-Phe-Dpr]-Tyr(SEQ IDNO：37)；
Tyr-c[Asp-His-DPhe-Arg-Pro-Asn-Ala-Phe-Dpr]-Tyr(SEQ IDNO：38)；
Tyr-c[Asp-His-DPhe-Arg-Nal(2’)-Asn-Ala-Phe-Dpr]-Tyr(SEQ IDNO：39)；
Tyr-c[Asp-His-DPhe-Arg-DNal(2’)-Asn-Ala-Phe-Dpr]-Tyr(SEQ IDNO：40)；
Tyr-c[Asp-His-DPhe-Arg-Bip-Asn-Ala-Phe-Dpr]-Tyr(SEQ IDNO：41)；
Tyr-c[Asp-His-DPhe-Arg-Tic-Asn-Ala-Phe-Dpr]-Tyr(SEQ ID NO：42)；和
Tyr-c[Asp-His-DPhe-Arg-Trp-Asn-Ala-DPhe-Dpr]-Tyr(SEQ IDNO：43).
发明详述
本发明与对黑皮质素受体具有生物学活性的新的嵌合多功能肽有关。本发明的肽是基于对AGRP和涉及结合黑皮质素受体的黑皮质素激动剂结构域的鉴定。因此，本发明的肽具有重复或模拟AGRP或黑皮质素激动剂的结合结构域的分子结构。
因此，本发明的嵌合肽或者具有AGRP模板或者具有MCR激动剂模板。优选地，包含AGRP肽模板的肽具有基于黑皮质素激动剂的生物活性决定子序列，该序列替代了相应的类似的AGRP模板序列。备选地，包含MCR激动剂模板的肽具有基于AGRP的生物活性序列，该序列替代了相应的黑皮质素激动剂模板序列。在相关的实施方案中，基于AGRP的生物活性序列用天然和/或非天然氨基酸替代。在一个优选的实施方案中，本发明的肽具有替代二硫键的内酰胺键。
定义
术语“患者”是使用本发明的组合物对其进行治疗的动物，包括哺乳动物。从所公开的治疗方法受益的哺乳动物物种包括(但不限于)猿、黑猩猩、猩猩、人、猴；家养动物(例如宠物)如狗、猫、豚鼠、仓鼠、兔、大鼠、小鼠和雪貂；和家养农场动物如牛、马、猪、绵羊。
如本文所使用，术语“肽”定义为长度从3个氨基酸到大约700个氨基酸的氨基酸序列。
术语“AGRP/MCR激动剂肽”指具有SEQ ID NO：4-7和9-10中任意一个氨基酸序列的肽以及本文所述的所有相关肽。AGRP/MCR激动剂肽可以具有也可以不具有氨基末端的甲硫氨酸，是否具有氨基末端的甲硫氨酸取决于制备它们的方式。
术语“NDP-MSH/AGRP肽”指具有SEQ ID NO：12-18中任意一个氨基酸序列的肤以及本文所述的所有相关肽。NDP-MSH/AGRP肽可以具有也可以不具有氨基末端的甲硫氨酸，是否具有氨基末端的甲硫氨酸取决于制备它们的方式。
术语“MTII/AGRP肽”指具有SEQ ID NO：20-23中任意一个氨基酸序列的肽以及本文所述的所有相关肽。MTII/AGRP肽可以具有也可以不具有氨基末端的甲硫氨酸，是否具有氨基末端的甲硫氨酸取决于制备它们的方式。
相关肽包括等位基因变体；片段；衍生物；替代、缺失和插入变体；融合多肽和直向同源物；并且每个此类相关肽中的每个氨基酸可以是天然的或者非天然的“D”(天然的)或“L”(非天然的)构型，“D”和“L”构型分别对应于如Cahn等(Pure Applied Chemistry，45：11-30(1974)和本文所引用的参考文献)的RS系统中所定义的立体化学名称“S”和“R”。此类相关肽可以是成熟的肽，即缺乏信号肽。
如本文所使用，术语“AGRP/MCR激动剂肽变体”、“NDP-MSH/AGRP肽变体”或者“MTII/AGRP肽变体”分别指与SEQ ID NO：4-7、9-10、12-18以及-23所列出的AGRP/MCR激动剂肽、NDP-MSH/AGRP肽或MTII/AGRP肽的氨基酸序列相比其氨基酸序列包含一个或多个氨基酸序列替代、缺失和/或添加的AGRP/MCR激动剂肽、NDP-MSH/AGRP肽或者MTII/AGRP肽。包含天然L-构型氨基酸的此类肽变体可以从相应的核酸分子变体制备，其中所述核酸变体具有相应地从编码如SEQ ID NO：4-7、9-10、12-18和20-23所列出的肽序列改变而来的序列。备选地，可以使用本文描述的标准方法(还可见Biochem.J.，219：345-373(1984))合成制备包含D-构型氨基酸(非天然形式)的此类变体。
如本文所使用，术语“AGRP/MCR激动剂肽衍生物”、“NDP-MSH/AGRP肽衍生物”或“MTII/AGRP肽衍生物”指这样的肽、变体或其片段，即所述的肽、变体或其片段已经通过如添加一个或多个水溶性多聚体、N-连接或者O-连接糖类、糖、磷酸和/或其它此类分子而进行了化学修饰，并且其中SEQ ID NO：4-7、9-10、12-18和20-23所列出的肽天然情况下不带有这些分子。衍生物还包括天然连接于SEQ ID NO：4-7、9-10、12-18和20-23所列出的任意一个肽上的一个或多个化学基团的缺失。
如本文所使用，当用于描述核酸分子时，术语“AGRP/MCR激动剂核酸分子”、“NDP-MSH/AGRP核酸分子”或“MTII/AGRP核酸分子”指编码如SEQ ID NO：4-7、9-10、12-18和20-23所列出的任意一个肽和其任何片段、衍生物、替代、缺失和插入变体、融合肽、融合多肽和直向同源物的核酸分子或其片段。
如本文所使用，术语“生物学活性”指对黑皮质素受体产生功能性(激动剂和/或拮抗剂)药理学反应的肽。
对于每一个氨基酸，另外的保守替换包括该氨基酸的“同系物”，其中“同系物”是指在那个侧链的β位将亚甲基(CH2)插入到侧链的氨基酸。此类同系物的实例包括(但不限于)高苯丙氨酸、高精氨酸、高丝氨酸等。
术语“直向同源物”指从与SEQ ID NO：4-7、9-10、12-18和20-23所列出的任意一个肽的来源不同的物种得到的分别对应于AGRP/MCR激动剂肽、NDP-MSH/AGRP肽或MTII/AGRP肽的AGRP/MCR激动剂肽、NDP-MSH/AGRP肽或者MTII/AGRP肽。
通常，除非另外说明，用于定义所使用氨基酸和保护基的缩写基于IUPAC-IUB生物化学命名委员会(Commission of BiochemicalNomenclature)的推荐(Biochemistry，11：1726-1732(1972))。用于定义本发明化合物的名称是公布于European Journal of Biochemistry，138：9-37(1984)中的IUPAC指定名称。关于本文所公开的某些氨基酸，它们的结构和缩写见图2。
治疗组合物和施用
AGRP/MCR激动剂肽、NDP-MSH/AGRP肽或MTII/AGRP肽的治疗组合物处于本发明的范围之内。此类组合物可以包含与可药用载体混合的治疗有效量的肽或片段、变体或者衍生物。任选地，可以将肽配制成酸式盐的形式。载体材料可以是用于注射的水，优选添加在施用于哺乳动物溶液中常见的其他材料，例如氧化铝、卵磷脂、d-α-生育酚、聚乙二醇、表面活化剂、血清蛋白质如人血清白蛋白、磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾。
一般地，AGRP/MCR激动剂肽、NDP-MSH/AGRP肽或者MTII/AGRP肽治疗组合物可以以包含与一种或多种生理可接受载体、赋形剂或稀释剂结合的纯化的肽、片段、变体或衍生物(任选以其盐的形式)的组合物的形式施用。
用于本发明肽的可药用盐包括醋酸盐、己二酸盐、藻酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、环戊丙酸盐、二葡糖苷、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、延胡索酸盐、葡庚酸盐、乙醇酸盐、半硫酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、乳酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、草酸盐、pectinate、磷酸盐、水杨酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐和其它此类可药用盐。
中性缓冲液盐或者与血清白蛋白混合的盐是代表性的适当载体。优选地，使用适当赋形剂(例如蔗糖)将产物配制成冻干的形式。如果需要还可包括其它标准的载体、稀释剂和赋形剂。其它代表性的组合物包含pH大约7.0-8.5的Tris缓冲液或者pH大约4.0-5.5的醋酸盐缓冲液，其还包括山梨醇或其适当取代物。
任何AGRP/MCR激动剂肽组合物、NDP-MSH/AGRP肽组合物或MTII/AGRP肽组合物可以进行胃肠外施用。备选地，此类组合物还可以进行静脉内或皮下施用。当全身施用时，用于本发明的治疗性组合物可以是无热源的、胃肠外可接受水溶液的形式。此类可药用蛋白质溶液的制备处于本领域的技术范围内，但要适当注意pH、等渗性、稳定性等等。
通过将具有目的纯度的所选则组合物与任选的生理可接受载体、赋形剂或稳定剂(Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版，A.R.Gennaro编，Mack出版公司(1990))混合，可以将用于实施本发明的AGRP/MCR激动剂肽组合物、或NDP-MSH/AGRP肽组合物或MTII/AGRP肽组合物的治疗性制剂制备成冻干块或水溶液的形式以进行贮存。可接受载体、赋形剂或稳定剂对于接受者是无毒的并且优选地为在所应用的剂量和浓度时是惰性的，其包括缓冲液如磷酸盐、柠檬酸盐或其它有机酸；抗氧化剂如抗坏血酸；低分子量多肽；蛋白质如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性多聚体如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它糖类包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖醇如甘露醇或山梨醇；成盐抗衡离子(salt-forming counterion)如钠；和/或非离子表面活性剂如Tween、pluronics或聚乙二醇(PEG)。
当治疗性应用时，本发明肽组合物的有效量取决于如治疗目标(诸如使用AGRP/MCR激动剂肽时的指征)、施用途径和病人状况。因此，对于治疗学家而言，为了获得最佳治疗效果有必要滴定剂量和修改施用途径。典型的日剂量范围为大约0.01mg/kg至高达1000mg/kg或更多，这取决于上述因素。一般地，临床医生将施用组合物直至获得预期效果的剂量。因此组合物可以以单一剂量施用，或者在一定时间内以两次或多次剂量(其包含相同或不同量的肽)施用，或者通过植入设备或导管连续输注施用。
用于体内施用的本发明肽组合物必须是无菌的。这可以通过无菌滤膜过滤容易地实现。当组合物是冻干的情况下，在冻干和重溶之前或之后可以使用这些方法进行灭菌。用于胃肠外施用的组合物通常以冻干形式或溶液贮存。
治疗性组合物一般置于具有无菌液体入口(access port)的容积中，例如带有皮下注射针头可刺穿塞子的静脉输液袋或瓶。
组合物的施用途径与已知方法相一致，即口服、通过静脉内、腹膜内、大脑内(实质内)、脑室内、肌内、眼内、动脉内或病灶内途径、鼻内注射或灌注，或者通过缓释系统或植入装置，其中所述装置可以任选包含使用导管。当需要时，可以通过灌注、弹丸式注射或植入装置连续施用组合物。
作为备选或另外的方法，可以使用已经将本发明肽吸附于其上的膜、海绵或其它适当材料通过植入所选区域而局部施用组合物。
当使用植入装置时，可以将装置植入任意适当组织或器官，并且AGRP/MCR激动剂肽、NDP-MSH/AGRP肽或MTII/AGRP肤的递送可以经由装置进行大丸剂或连续施用，或者经由导管进行连续灌注而实现。
根据本发明，AGRP/MCR激动剂肽、NDP-MSH/AGRP肽或MTII/AGRP肽可以以缓释药剂或制剂形式施用。缓释制剂的适当例子包括定形物品形式的半渗透性聚合体基质，即薄膜或微胶囊。缓释基质包括聚酯、水凝胶、聚交酯(美国专利号3,773,919，EP 58,481)、L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酸酯共聚物(Sidman等，Biopolymers，22：547-556(1983))、多聚(2-羟乙基-甲丙烯酸酯)(Langer等，J.Biomed.Mater.Res.，15：167-277(1981)和Langer，Chem.Tech.，12：98-105(1982))、乙烯乙酸乙烯酯(Langer等，同上)或多聚-D(-)-3-羟基丁酸(EP 133,988)。缓释组合物还可以包括脂质体，可以通过本领域已知的几种方法(即Eppstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：3688-3692(1985)；EP 36,676；EP 88,046；EP 143,949)中的任意一种来制备脂质体。
AGRP/MCR激动剂肽、NDP-MSH/AGRP肽或MTII/AGRP肽，及其片段、变体和衍生物可以单独使用、一起使用或与其它药物组合物联合使用。本发明的肽、片段、变体和衍生物可以与细胞因子、激素、生长因子、抗生素、抗炎药物和/或适用于所治疗指征的化疗剂联合使用。
对细胞进行膜包封的方法是技术人员所熟悉的，并且无需过多实验就可以完成包封化细胞的制备及其向病人的植入。参见，即美国专利号4,892,538；5,011,472和5,106,627。用于包封活细胞的系统描述于PCT WO91/10425(Aebischer等)。制备多种其它持续或可控递送工具(例如脂质体载体、生物蚀解颗粒或球珠)的技术也是本领城那些技术人员熟知的，并且描述于例如美国专利号5,653,975(Baetge等，CytoTherapeutics公司)。可以将细胞(包封或未包封)植入病人的适当组织或器官。
如上所讨论，令人期望的是用本发明的一种或多种肽、变体、衍生物和/或片段处理所分离的细胞群体例如脑细胞和/或神经元。这可以通过将所分离的细胞直接暴露于以可渗透入细胞膜的形式存在的AGRP/ASP肽、变体、衍生物或片段来实现。
以下实施例仅用于举例说明的目的，并且将不以任何方式构成对本发明范围的限制。
缩写
文中使用的缩写“Boc”指叔丁氧羰基。
文中使用的缩写“DCM”指二氯甲烷。
文中使用的缩写“Dde”指(1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代环己-1-亚基)乙基)。
文中使用的缩写“DIPEA”指二异丙基乙胺。
文中使用的缩写“DMF”指二甲基甲酰胺。
文中使用的缩写“DMSO”指二甲基亚砜。
文中使用的缩写“EtOAc”指MeOH/乙酸乙酯。
文中使用的缩写“Fmoc”指芴甲氧羰基。
文中使用的缩写“HOBt”指N-羟基-苯并三唑。
文中使用的缩写“MBHA”指甲基二苯甲胺。
文中使用的缩写“PyBOP”指六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷。
文中使用的缩写“SPPS”指固相肽合成。
文中使用的缩写“tBu”指叔丁基基。
文中使用的缩写“TFA”指三氟乙酸。
文中使用的缩写“TRH”指促甲状腺激素释放激素。
以下实施例举例说明实施本发明的方法。这些实施例将不构成限制。除非特别指出，所有百分数为重量百分比并且所有溶剂混合物比例为体积百分比。
实施4例1—二硫化物交联或环化肽的合成
如技术人员所理解，使用描述于Carpino，L.A.和Han，G.Y.，“The9-Fluorenylmethyoxycarbonsy Amino-Protecting Group，”J.Org.Chem.，37：3404-3409(1972)；和Chang，C.和Meienhofer，J.，“Solid-phase peptidesynthesis using mild base cleavage of Nalpha-fluorenylmethyloxycarbonylamino acids，exemplified by a synthesisof dihydrosomatostatin”Int.J.Pept.Protein Res.，11：246-249(1978)的标准Fmoc方法能够合成二硫化物交联的或环化的肽。在自动或半自动合成仪(Advance ChemTech 440MOS或LabTech，Louisville，KY)上能够开展标准的Fmoc方法。氨基酸Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Tyr(tBu)、Fmoc-Nle、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-His(Trt)、Fmoc-Arg(Pbf)、Fmoc-DPhe、Fmoc-Trp(Boc)、Fmoc-Gly、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Pro、Fmoc-Val和Fmoc-Phe全部是商业可得的。全部试剂为ACS级或更高级别。
在商业可得的树脂rink-amide-MBHA(交换量0.40meq/g)上组装本发明的肽。使用具有一层Teflon玻璃料的40孔Teflon反应块(reaction block)进行合成。向每个反应块孔中加入大约200mg树脂(0.08毫摩尔)。树脂在二甲基甲酰胺(DMF)中溶胀2小时并且使用25％哌啶(溶于DMF)脱保护5分钟，随后用25％哌啶以500转/分孵育20分钟。如Kaiser，E.等，“ColorTest for Detection of Free Terminal Amino Groups in the Solid-PhaseSynthesis of Peptides，”Anal.Biochem.，34：595-598(1970)中所描述，将树脂进行“Kaiser测试”并得到阳性结果。阳性的Kaiser测试预示树脂上存在游离胺基。
使用以下常规氨基酸循环将加长的肽链加到酰胺树脂上：将500μLDMF加到每个反应孔中以“使玻璃料变湿”，加入比C-末端过量3倍的氨基酸(500μL 0.5M的氨基酸溶液，包含溶于DMF的0.5M HOBt)，随后加入500μL溶于DMF的0.5M DIC并且用DMF将反应孔体积增加至3mL。以500转/分混合1小时进行偶联反应，随后通过氮气正压将反应块排空。通过向每个反应器中加入500μL DMF进行第二次偶联反应，随后加入500μL各个氨基酸(3倍过量)、500μL 0.5M HBTU、400μL 1MDIEA，使用DMF将反应孔体积增加至3mL并以500转/分混合1小时。第二轮偶联循环之后，倒空反应块并用DMF洗涤树脂-Na-保护肽(4.5mL，洗涤5次)。通过加入4mL溶于DMF的25％哌啶并以500转/分混合5分钟进行Nα-Fmoc脱保护，随后以500转/分进行20分钟的脱保护。用4.5mL DMF洗涤反应孔并如上所述进行下一轮偶联循环。
通过用3mL裂解混合物(cleavage cocktail)(95％TFA、2.5％水、2.5％三异丙基硅烷)将肽-树脂以500转/分孵育3小时来进行氨基酸侧链的脱保护和酰胺-肽从树脂上的裂解。在氮气压力下将裂解产物从反应块排入含有7mL收集管的裂解块(cleavage block)中。用1.5mL裂解混合物以500转/分洗涤树脂5分钟并将树脂加入先前的裂解溶液中。将肽转移至预先称重的50mL圆锥形管中并用冷的(4℃)无水乙醚(多达50mL)沉淀。通过以2000转/分离心(使用吊桶式转头的Sorval Super T21高速离心机)3分钟沉淀絮状肽，倾倒乙醚，并且用冷的无水乙醚洗涤肽一次并沉淀。将粗肽真空干燥48小时。粗肽产量范围为理论产量的60％-90％。通过反相高效液相色谱(RPHPLC)将7-15mg的粗肽样品纯化并低压冻干，在所述反相高效液相色谱中使用带有光电二极管矩阵检测器和RP-HPLC C18键合硅半制备柱(Vydac 218TP1010，1.0 x 25cm)的Shimadzu色谱系统。纯化肽通过分析性RP-HPLC确定为>95％的纯度并且具有正确的分子量。
按照已知的方法，例如描述于Haskell-Luevano，C.等，“Theagouti-related protein decapeptide(Yc[CRFFNAFC]Y)possesses agonistactivity at the murine melanocortin-1 receptor，”Peptides，21：683-689(2000)和Haskell-Luevano，C.等，“Design，synthesis，biology，and conformationsof bicyclic alpha-melanotropin analogues，”J.Med.Chem.，38：1736-1750(1995)的那些方法，在溶液中进行上述合成肽的二硫键环化作用。
将粗制线性肽(在实施例1的上面部分合成)溶解于20mL水和3mL甲醇中。用几滴浓氨水将由200mL 0.01M铁氰化钾、10mL饱和醋酸铵、20mL乙腈、10mL水组成的氧化溶液调整至pH＝8.5。将肽溶液吸入50mL注射器并通过注射泵以1.5mL/h的速率转移至氧化溶液。当转移完成时，使用冰醋酸将pH调整至4.5。将Amberlite树脂(IRA-68HCl形式)加入混合物并混合45分钟。滤出Amberlite树脂，将包含肽的溶液进行浓缩、冻干并通过RP-HPLC纯化。
实施例2一包含环状内酰胺键的肽的合成
根据本发明，使用如Merrifield，R.B.，“Solid Phase Synthesis.II.The Syntheis of Bradykinin，”J.Am.Chem.Soc.，86：304-305(1964)以及Stewart，J.M.和Young，J.D.，Solid Phase Peptide Synthesis，第二版，Pierce Chemical Co.，Rockford，Illinois(1964)中所描述的标准Boc方法，在自动合成仪(Advanced ChemTech 440MOS，Louisville，KY)上制备包含环状内酰胺键的肽。氨基酸Boc-Tyr(2ClBzl)、Boc-二氨基丙酸[Dpr(Fmoc)]、Boc-Asp(OFm)、Boc-Arg(Tos)、Boc-Phe、Boc-His(Bom)、Boc-DPhe、Boc-Trp(CHO)、Boc-Asn和Boc-Ala是商业可得的。将肽装配于商业可得的pMBHA树脂上(交换量0.28meq/g)。全部试剂是ACS级或更高级。
使用商业可得的具有一层Teflon玻璃料的40孔Teflon反应块进行合成反应。向每个反应块孔中加入大约200mg树脂(0.08毫摩尔)。由于反应体积的限制，每一种肽可以在分开的两个反应孔中合成。树脂在5mL二甲基甲酰胺(DMF)中溶胀2小时并使用4mL溶于二氯甲烷(DCM)的50％三氟乙酸(TFA)、2％苯甲醚脱保护3分钟，随后以500转/分孵育20分钟并用DCM洗涤(每次4.5mL，2分钟，500转/分，洗涤3次)。通过加入4
mL溶于DCM的10％二异丙基乙胺(DIEA)中和肽-树脂盐(3分钟，500转/分，2次)，随后用DCM洗涤(每次4.5mL，2分钟，500转/分，洗涤4次)。使用Kaiser测试鉴定树脂上的游离氨基酸基团。
使用如下常规氨基酸循环将加长的肽链加到酰胺-树脂上：在每个反应孔中加入500μL DMF以“湿润玻璃料”，加入比C-末端过量3倍的氨基酸(400μL 0.5M溶液，溶于DMF的0.5M N-羟基苯并三唑(HOBt))，随后加入400μL溶于DMF的0.5M N，N′-二异丙基碳二亚胺(DIC)并且用DMF将反应孔体积增加至3mL。以500转/分混合1小时进行偶联反应，随后通过氮气正压将反应块排空。通过向每个反应器中加入500μL DMF进行第二次偶联反应，随后加入400μL各种氨基酸(3倍过量)、400μL 0.5M苯并三氮唑-N，N，N′，N′，-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)、300μL 1M DIEA，使用DMF将反应孔体积增加至3mL，并且以500转/分混合1小时。第二轮偶联循环之后，倒空反应块并用DCM洗涤树脂-Nα-保护肽(每次4.5mL，洗涤4次)。通过加入4mL溶于DCM的50％ TFA、2％苯甲醚进行Nα-Boc脱保护并以500转/分混合5分钟，随后以500转/分进行20分钟脱保护。用4.5mL DCM洗涤反应孔(4次)，用10％ DIEA中和(3分钟，500转/分，2次)，随后进行DCM洗涤(4.5mL，2分钟，500转/分，4次)，并且如上所述进行下一轮偶联循环。
通过用4.5mL溶于DMF的25％哌啶处理(以500转/分处理20分钟)分别从Dpr和Asp上去除Fmoc和OFm保护基，用Kaiser测试为阳性结果。使用5倍过量的并啶并三氮唑四甲基六氟磷酸盐(BOP)和6倍过量的DIEA作为偶联剂并以500转/分混合形成Asp和Dpr氨基酸之间的内酰胺键。在室温下大约3天后形成内酰胺键(Kaiser测试阴性)。通过用无水氟化氢(HF，5mL，0℃，1小时)和5％间甲酚、5％茴香硫醚作为消除剂与肽-树脂孵育将剩余氨基酸侧链脱保护并将酰胺-肽从树脂上断解下来。
反应完成并将HF已蒸馏出后，将肽用醚沉淀(50mL×1)并用50mL冷的(4℃)无水乙醚洗涤。使用具有一层玻璃料的玻璃滤器滤出肽并将其溶于冰醋酸，冰冻并冻干。粗肽产量范围为理论产量的60％-90％。通过RPHPLC纯化40mg粗肽样品并冻干，在所述反相高效液相色谱中使用带有光电二极管矩阵检测器和半制备反相高效液相色谱(RP-HPLC)C18键合硅柱(Vydac 218TP1010，1.0×25cm)的Shimadzu色谱系统。纯化的肽通过分析性RP-HPLC确定为>95％的纯度并且具有正确的分子量。
实施例3—测定法
对于细胞培养和转染，将HEK-293细胞维持生长于含10％胎牛血清的Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基(DMEM)，并于转染前1天以1-2×106细胞/100-mm培养皿的密度接种。使用磷酸钙方法将pCDNA3表达载体中的黑皮质素受体DNA(20μg)进行转染。使用G418筛选(1mg/mL)产生稳定表达受体的细胞群用于随后的生物测定分析。
功能生物测定
在功能生物测定研究中，如先前在Haskell-Luevano，C.等，“Characterization of melanocortin NDP-MSH agonist peptide fragments atthe mouse central and peripheral melanocortin receptors，”J.Med.Chem.，44：2247-2252(2001)；Haskell-Luevano，C.等，“Structure activity studies ofthe melanocortin-4 receptor by in vitro mutagenesis：identification ofagouti-related protein(AGRP)，melanocortin agonist and synthetic peptideantagonist interaction determinants，”Biochemistry，40：6164-6179(2001)；和Chen，W.等，“A colorimetric assay for measuring activation of Gs-andGq-coupled signaling pathways，”Anal.Biochem.，226：349-354(1995)中所描述，使用4μg CRE/β-半乳糖苷酶报告基因转染稳定表达小鼠MC1、MC3、MC4和MC5受体的HEK-293细胞。将5,000-15,000个转染后细胞铺于96孔Primera板(Falcon)中并培养过夜。在转染后48小时，使用溶于测定培养基(包含0.1mg/mL BSA和0.1mM异丁基甲基黄嘌呤的DMEM)中的100μL肽(10-4-10-12M)或毛喉素(10-4M)对照刺激细胞6小时。吸出测定培养基并加入50μL裂解缓冲液(250mM Tris-HCl pH＝8.0和0.1％ Triton X-100)。将板贮存于-80℃过夜。
第二天将包含细胞裂解液的板解冻。从每个孔中取出10μL的等份试样并转移至另一个96-孔板以进行相对蛋白质测定。向细胞裂解物板的每孔中加入含有0.5％ BSA的40μL磷酸缓冲盐溶液。随后，向每个孔中加入150μL底物缓冲液(60mM磷酸钠、1mM MgCl2、10mM KCl、5mM β-巯基乙醇、200mg/100mL ONPG)并将板于37℃孵育。
使用96孔板阅读器(Molecular Devices)测量样品吸光度—OD405。将200μL 1:5的Bio Rad G250蛋白质染料：水稀释液加入先前取出的细胞裂解物样品中，以测定相对蛋白质含量并且在96孔板阅读器(MolecularDevices)上测定OD595。针对相对蛋白质含量和非受体依赖白喉素刺激将数据点进行标准化。通过这些配体以剂量依赖方式在高达10μM的浓度竞争性替代MTII激动剂(Bachem)的能力评估了这些化合物的拮抗特性。使用描述于Schild，H.O.，“pA，A New Scale for the Measurement of DrugAntagonism，”Brit.J.Pharmacol.，2：189-206(1947)的Schild分析方法产生pA2值。
结合测定
在结合测定中，使用如Yang等，“Characterization of Agouti-relatedprotein binding to melanocortin receptors，”Mol.Endo.，13：148-155(1999)先前描述的改良氯胺-T方法制备了125I-NDP-MSH。利用50mM磷酸钠缓冲液pH7.4作为反应缓冲液，将125I-Na(0.5mCi，Amersham Life Sciences公司，Arlington Heights，IL)加入到含20mg NDP-MSH(Bachem，Torrance，CA)的5mL缓冲液中。为了启动反应，在15秒内边温和搅动边加入10mL 2.4mg/ml氯胺-T溶液(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)。通过在15秒内边温和搅动边加入50mL 4.8mg/ml焦亚硫酸钠溶液(SigmaChemical Co.)终止反应。
然后用200mL 10％牛血清白蛋白稀释反应混合物并且所得到的混合物置于Bio-Gel P2(Bio-Rad Labs，Hercules，CA)柱(1.0×30cmEconocolumn，Bio-Rad实验室)上成层，以便使用50mM磷酸钠缓冲液(pH 7.4)作为柱洗脱液通过大小排阻层析分离。将15个滴出的级分(大约500mL)收集于含有500mL 1％BSA的玻璃管中。然后在Apex自动γ粒子计数管(ICN Micromedic Systems Model 28023，Huntsville，AL，配备RIA AID软件，Robert Maciel Associates公司，Arlington，MA)上对每一级分计数以确定125I掺入峰的级分。
受体结合研究
实验前一天，将0.1-0.3×106细胞/孔的HEK-293细胞(如上所述制备和维持)铺于Primera 24孔板(Falcon)。肽(10-5M)和NDP-MSH(10-6-10-12M)用于竞争性替代125I-放射性标记的NDP-MSH(100,000cpm/孔)。产生NDP-MSH剂量反应曲线(1-6-10-12M)和IC50值并通过非线性最小二乘法分析法分析(参见Bowen，W.P.和Jerman，J.C.，“Nonlinear regressionusing spreadsheets，”TiPS，16：413-417(1995))和PRISM程序(v3.0，GraphPad公司)进行分析。对于在功能测定中不具有激动剂或拮抗剂药理学的肽，检测了其在10-5M浓度时竞争性替代125I-NDP-MSH(100,000cpm/孔)的能力。基于使用10-6M NDP-MSH和NDP-MSH剂量反应曲线所获得的非特异性值作为对照确定了总特异性结合百分比。标准偏差误差来源于三个独立实验中的特异性结合百分比平均值并使用PRISM程序(v3.0，GraphPad公司)获得。
数据分析
对于数据分析，EC50和pA2值代表在三次、四次或更多次独立实验中进行的两次重复实验的平均值。通过使用PRISM程序(v3.0，GraphPad公司)将数据用非线性最小二乘法分析进行拟合，以确定EC50和pA2值及其相关标准误差。
使用标准方法合成本发明的肽(即，SEQ ID NO：3-7、9-10、12-18和20-43)并使用如上面实施例1和2中所提供的半制备反相高压液相色谱法纯化至同质。表1总结了本发明肽对于小鼠黑皮质素受体(mMC1R、mMC3R、mMC4R和mMC5R)的激动剂EC50值和拮抗剂pA2值。表1中指出的误差代表从至少三个独立实验所确定的平均值的标准误差。使用Schild分析法和激动剂MTII确定拮抗剂pA2值。数植“>100,000”表示对化合物进行了测定但化合物在高达100μM浓度时缺乏激动剂或拮抗剂特性。轻微激动剂意味着在100μM浓度时可观察到一些刺激反应，但不足以确定EC50值。
表1—本发明嵌合肽对小鼠黑皮质素受体的药理学结果
Figure C200480021195D00271
Figure C200480021195D00281
Figure C200480021195D00291
实施例4—AGRP/MCR激动剂肽
根据本发明，hAGRP(109-118)十肽模板用于使用黑皮质素激动剂Phe-Arg-Trp残基对hAGRP(111-113)Arg-Phe-Phe拮抗剂氨基酸进行系统性替代(表1)。对于SEQ ID NO：1所代表的肽，将包含二硫键的hAGRP(109-118)十肽模板中的Phe113转变成D-氨基酸。在SEQ IDNO：2-11的肽中，二硫键被替换成侧链内酰胺键(Asp-Dpr)，以便确定在内酰胺键保持与二硫键相似的环大小时是否将导致产生药理学差异。
所合成的肽SEQ ID NO：2作为对照，其中用Ala-Ala-Ala替换hAGRP拮抗剂氨基酸Arg-Phe-Phe。在浓度高达100μM时，SEQ ID NO：2的肽对黑皮质素受体缺乏激动剂或拮抗剂活性，并且竞争性替换放射性标记的125I-NDP-MSH不超过在10μM的浓度时结合配体的25％。
SEQ ID NO：3的肽包含内酰胺键而不是二硫键。通过比较，发现hAGRP(109-118)与SEQ ID NO：3的肽的药理学几乎等效，对于mMC1R两个肽的药理学结果在试验误差范围内，但对于mMC4R除外，此时内酰胺键导致拮抗剂效能降低8倍，并且对于mMC3R可检测到μM级的拮抗药理学。
Phe-Arg-Trp和Trp-Arg-Phe序列均可替换进入hAGRP(109-118)十肤中。通过对SE QID NO：4和6肽(两者均含有L-Phe构型)的效能进行比较，发现它们对mMC1R具有μM级的激动剂活性，而SEQ ID NO：4的肽对mMC3R、mMC4R和mMC5R缺乏完全激动剂活性或拮抗剂活性，并且SEQ ID NO：6的肽对mMC4R和mMC5R具有μM级的完全激动剂活性而对mMC3R仅具有轻微激动剂活性。
对于激动剂黑皮质素肽的先前研究认为：在(α-MSH中从Phe7到DPhe7的手性转换导致效能增加10-1000倍。因此，为了评价激动剂活性的所有增加，在SEQ ID NO：5中的肽中将hAGRP 111-113位置替换成Trp-Arg-DPhe氨基酸，并且在SEQ ID NO：7的肽中将AGRPArg-Phe-Phe(111-113)位置替换成DPhe-Arg-Trp残基。与先前对于基于黑皮质素的激动剂的观察相一致，包含D-Phe构型的SEQ ID NO：5和7的肽与相应的L非对映异构的肽相比激动剂效能通常增加，但对于mMC3R例外，此时在高达100μM浓度时仅观察到轻微激动剂活性。
使用α-MSH和NDP-MSH模板的黑皮质素激动剂肽的截断研究产生如下观察结果，即包含His6氨基酸(α-MSH编号)导致对黑皮质素受体的激动剂效能显著增加。为了确定其对hAGRP(109-118)模板的增强激动剂配体效能的影响，将黑皮质素激动剂假定信使序列(His-Phe-Arg-Trp)的His6氨基酸插入内酰胺修饰的hAGRP(109-118)十肽模板以产生SEQ ID NO：8的肽。通过对SEQ ID NO：8和3的肽的药理学结果进行比较，发现将His残基插入AGRP(109-118)模板导致对mMC1R激动剂效能降低8倍，但是对mMC3R和mMC4R缺乏拮抗剂活性并且SEQ ID NO：8的肽以小于50％的特异性结合而结合至这些受体(mMC3R和mMC4R)。
将His残基(His-Phe-Arg-Trp)替换SEQ ID NO：8的His-Arg-Phe-Phe基序则产生SEQ ID NO：9的肽。SEQ ID NO：9的肽对于所有所检测黑皮质素受体具有nM级的完全激动剂效能。
SEQ ID NO：10的肽为在AGRP拮抗剂模板中包含激动剂His-DPhe-Arg-Trp序列的肽，其对mMC1R以及mMC3R、mMC4R和mMC5R具有nM以下级的激动剂效能，并且它们位于α-MSH对这些受体的实验误差范围内，但对于mMC4R除外，对于mMC4R而言SEQ IDNO：10的肽比α-MSH的效能高大约30倍。
将黑皮质素激动剂NDP-MSH的N末端Ac-Ser-Tyr-Ser-Nle和C-末端Lys-Pro-Val-NH2氨基酸替换具有内酰胺键的hAGRP(109-118)十肽的各个肽末端，从而产生SEQ ID NO：11的肽。SEQ ID NO：11的肽与缺乏N-和C-末端激动剂氨基酸延伸部分的SEQ ID NO：3的肽具有几乎等效的黑皮质素受体药理学，这支持这样一种假设，即hAGRP拮抗剂的中央“核心”残基109-118区域决定黑皮质素受体效能和药理学。
按照本发明，在用于替换hAGRP(111-113)Arg-Phe-Phe氨基酸的黑皮质素激动剂Phe-Arg-Trp残基内，用天然和/或非天然氨基酸进行替换，以产生SEQ ID NO：24-43的肽。SEQ ID NO：28-30的肽对mMC3R具有拮抗剂活性且对mMC4R和mMC5R具有激动剂活性。
实施例5—NDP-MSH/AGRP肽
按照本发明，以线性十三肽NDP-MSH激动剂模板用作基础序列，其中将DPhe-Arg-Trp氨基酸替换成hAGRP(111-113)Arg-Phe-Phe残基。合成SEQ ID NO：12的肽作为对照肽，其中激动剂DPhe-Arg-Trp残基由Ala-Ala-Ala替换。SEQ ID NO：12的肽在高达100μM浓度时完全丧失激动剂活性并且与MC3R或MC4R的结合不多于25％。因此，SEQ ID NO：12对照肽的生物活性证实DPhe-Arg-Trp残基对于黑皮质素受体活性的重要性。
SEQ ID NO：13的肽具有NDP-MSH线性三十肽模板，其中用hAGRP残基以Phe-Phe-Arg的方向进行替换并且缺失His6残基(α-MSH编号)。在高达100μM浓度时，SEQ ID NO：13的肽对MC3R、MC4R和MC5R缺乏激动剂或拮抗剂活性，但对MC1R具有部分激动剂活性。
相反，SEQ ID NO：14的肽包含HIS6氨基酸和以Phe-Phe-Arg方向的AGRP残基。SEQ ID NO：14的肽对MC1R、MC3R和MC5R具有部分激动剂活性且无拮抗剂活性，对MC4R具有轻微的可观察到的结合或活性。
将hAGRP(111-113)残基以Arg-Phe-Phe方向掺入到NDP-MSH模板以产生SEQ ID NO：15的肽。SEQ ID NO：15的肽具有nM级的黑皮质素受体激动剂效能。
这些结果和上面给出的对于hAGRP(109-118)模板的那些结果证明：hAGRP(111-113)Arg-Phe-Phe拮抗剂残基以与线性序列相似的地形方位(topographicalorientation)模拟激动剂Phe-Arg-Trp氨基酸。如先前所讨论，已经很好地证明了黑皮质素激动剂中Phe7(α-MSH编号)手性转换为D构型导致配体具有增强的黑皮质素受体效能。
为了阐明在关于推测的配体-受体相互作用中hAGRP(112-113)中哪一个Phe残基对应着黑皮质素激动剂的Phe7氨基酸，将SEQ ID NO：15的肽的hAGRP(111-113)Arg-Phe-Phe残基的进行系统立体化学转换，从而产生了SEQ ID NO：16-18的肽。通常，与SEQ ID NO：15的肽相比，SEQ IDNO：16-18的肽的NDP-MSH模板中Arg-Phe-Phe残基的立体化学转变导致黑皮质素受体活性急剧降低，但SEQ ID NO：17的肽例外。
与SEQ ID NO：15的肽相比，包含假定对应于hAGRP Phe112残基的DPhe的SEQ ID NO：17的肽(NDP-MSH线性模板)仅导致mMC1R激动剂效能增加8倍、mMC3R激动剂效能降低13倍、在100μM浓度时由完全mMC4R激动剂转变成仅仅为轻微激动剂以及mMC5R均等的激动剂效能。
实施例6—MTII/AGRP肽
按照本发明，环状七肽MTII激动剂模板用作基础模板，其中DPhe-Arg-Trp氨基酸替换为hAGRP(111-113)Arg-Phe-Phe残基，以合成SEQ ID NO：20-23的肽。用Ala-Ala-Ala替换MTII DPhe-Arg-Trp残基合成了SEQ ID NO：19的肽，其作为SEQ ID NO：20-23的肽的对照。
在SEQ ID NO：20的肽，环状MTII的DPhe-Arg-Trp氨基酸序列替换为hAGRP(111-113)Arg-Phe-Phe残基。SEQ ID NO：20的肽丧失了对MC3R、MC4R和MC5R完全激动剂活性并且对MC1R仅具有μM级的部分激动剂活性。
将SEQ ID NO：20中hAGRP(111-113)Arg-Phe-Phe残基进行立体化学转变产生了SEQ ID NO：21的肽，其中DArg-Phe-Phe掺入到MTII肽模板中。SEQ ID NO：21的肽在高达100μM浓度时丧失了对黑皮质素受体产生完全激动剂反应的能力。
然而，包含假定对应hAGRP Phe112残基的DPhe的SEQ ID NO：22的肽(MTII环状模板)导致将具有相应L-Phe异构体的肽(SEQ ID NO：20)从mMC1R部分激动剂转变成nM级的完全激动剂，并且配体对mMC3R、mMC4R和mMC5R具有完全的μM级的激动剂活性。
这些结果表明，在增强一般的黑皮质素受体激动剂的效能方面，环状hAGRP(109-118)和MTII肽模板中拮抗剂hAGRP Phe112可以模仿黑皮质素激动剂DPhe7与受体相互作用。尽管该新近推测还需要实验验证，但这是表明在假定的配体-mMC4R相互作用方面hAGRP Phe112拮抗剂残基与与黑皮质素激动剂Phe7氨基酸地形上(topographically)相关的第一个实验证据。
SEQ ID NO：23的肽包含替换MTII肽模板中DPhe-Arg-Trp氨基酸的Arg-Phe-Dphe基序。已证明，SEQ ID NO：23的肽在100μM浓度时对MC3R和MC5R具有轻微激动剂活性，但它是MC1R的μM级激动剂。
实例例7—黑皮质素受体选择性配体
通过使用敲除小鼠和体内给食研究，已经将表达于脑的中心MC3R和MC4R与体重和能量体内稳态的生理学作用相关联(参见Fan，W.等，“Roleof melanocortinergic neurons in feeding and the agouti obesity syndrome，”Nature，385：165-168(1997)；Huszar，D.等，“Targeted disruption of themelanocortin-4 receptor results in obesity in mice，”Cell，88：131-141(1997)；Butler，A.A.等，“A unique metabolic syndrome causes obesity in themelanocortin-3 receptor-deficient mouse，”Endocrinology，141：3518-21(2000)；和Chen，A.S.等，“Inactivation of the mouse melanocortin-3receptor results in increased fat mass and reduced lean body mass，”NatGenet，26：97-102(2000))。由于MC3和MC4受体mRNA在脑的某些区域发生神经解剖学上的重叠以及能量体内稳态途径的复杂性，因此对这些黑皮质素受体异型体中任意一个具有选择性的黑皮质素配体合乎体内研究需要。
在本发明中，SEQ ID NO：7的肽(Tyr-c[Asp-DPhe-Arg-Trp-Asn-Ala-Phe-Dpr]-Tyr-NH2)是一种配体，该配体仅仅为轻微的mMC3R激动剂(不是mMC3R拮抗剂，与mMC3R的结合不超过在10μM浓度时特异性结合的25％，但是拥有对mMC4R的450nM的激动剂EC50值，这导致其为对MC4R结合比对MC3R结合高>200倍的选择性化合物)。
SEQ ID NO：17的肽(Ac-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-Arg-DPhe-Phe-Gly-Lys-Pro-Val-NH2)为有效的nM级的mMC1R激动剂，并且其对mMC5R具有高的该激动剂当存在时具有高nM级的激动剂活性，对mMC3R具有μM级激动剂活性并且对mMC4R仅具有轻微激动剂活性(其不是拮抗剂并且与mMC4R的结合不超过在10μM浓度时特异性结合的25％)。因此，SEQ ID NO：17的肽是一个对MC1R的结合比对MC3R的结合高850倍、对MC5R的结合比对MC3R的结合高>16倍并且对MC1R的结合比对MC5R的结合高62倍的选择性肽。
文中提到或引用的全部专利、专利申请、临时申请和出版物全部整合作为参考，包括全部图或表，直到它们与本说明书的明确教导不一致的程度。
应该理解本文所描述的实施例和实施方案仅用于举例说明的目的并且其出现的多种修饰和变化对本领域技术人员而言是暗示的且包含于本申请的精神和范围之内。
序列表
<110>佛罗里达大学研究基金公司(UNIVERSITY OF FLORIDA RESEARCH FOUNDATION，
INC.)
<120>新的黑皮质素受体模板、肽及其用途
<130>UF-375
<160>43
<170>PatentIn 3.3版
<210>1
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
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<223>嵌合肽
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<221>MISC_FEATURE
<222>(6)..(6)
<223>Xaa＝DPhe
<400>22
Figure C200480021195D00461
<210>23
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>嵌合肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>Xaa＝乙酰(Ac)
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>Xaa＝正亮氨酸(Nle)
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(8)
<223>该肽环化
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>Xaa＝DPhe
<400>23
<210>24
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>嵌合肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(10)
<223>该肽环化
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(4)
<223>Xaa＝DPhe
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(10)..(10)
<223>Xaa＝二氨基丙酸(Dpr)
<400>24
Figure C200480021195D00471
<210>25
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>嵌合肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(10)
<223>该肽环化
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(10)..(10)
<223>Xaa＝二氨基丙酸(Dpr)
<400>25
Figure C200480021195D00472
<210>26
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>嵌合肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(10)
<223>该肽环化
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(4)
<223>Xaa＝DPhe
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(10)..(10)
<223>Xaa＝二氨基丙酸(Dpr)
<400>26
Figure C200480021195D00481
<210>27
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>嵌合肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(10)
<223>该肽环化
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(4)
<223>Xaa＝DPhe
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(10)..(10)
<223>Xaa＝二氨基丙酸(Dpr)
<400>27
Figure C200480021195D00491
<210>28
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>嵌合肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(10)
<223>该肽环化
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(4)
<223>Xaa＝DPhe
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(10)..(10)
<223>Xaa＝二氨基丙酸(Dpr)
<400>28
<210>29
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>嵌合肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(10)
<223>该肽环化
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(4)
<223>Xaa＝DPhe
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(10)..(10)
<223>Xaa＝二氨基丙酸(Dpr)
<400>29
Figure C200480021195D00501
<210>30
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>嵌合肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(10)
<223>该肽环化
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>Xaa＝(rac)Atc
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(4)
<223>Xaa＝DPhe
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(10)..(10)
<223>Xaa＝二氨基丙酸(Dpr)
<400>30
Figure C200480021195D00502
<210>31
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>嵌合肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(10)
<223>该肽环化
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(10)..(10)
<223>Xaa＝二氨基丙酸(Dpr)
<400>31
<210>32
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>嵌合肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(10)
<223>该肽环化
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(4)
<223>Xaa＝(pI)DPhe
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(10)..(10)
<223>Xaa＝二氨基丙酸(Dpr)
<400>32
Figure C200480021195D00512
<210>33
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>嵌合肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(10)
<223>该肽环化
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(4)
<223>Xaa＝DNal(2’)
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(10)..(10)
<223>Xaa＝二氨基丙酸(Dpr)
<400>33
Figure C200480021195D00521
<210>34
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>嵌合肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(10)
<223>该肽环化
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(4)
<223>Xaa＝DNal(1’)
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(10)..(10)
<223>Xaa＝二氨基丙酸(Dpr)
<400>34
Figure C200480021195D00522
<210>35
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>嵌合肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(10)
<223>该肽环化
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>Xaa＝DBip
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(10)..(10)
<223>Xaa＝二氨基丙酸(Dpr)
<400>35
Figure C200480021195D00531
<210>36
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>嵌合肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(10)
<223>该肽环化
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(4)
<223>Xaa＝DPhe
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(10)..(10)
<223>Xaa＝二氨基丙酸(Dpr)
<400>36
<210>37
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>嵌合肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(10)
<223>该肽环化
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(4)
<223>Xaa＝DPhe
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(10)..(10)
<223>Xaa＝二氨基丙酸(Dpr)
<400>37
Figure C200480021195D00541
<210>38
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>嵌合肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(10)
<223>该肽环化
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(4)
<223>Xaa＝DPhe
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(10)..(10)
<223>Xaa＝二氨基丙酸(Dpr)
<400>38
<210>39
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>嵌合肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(10)
<223>该肽环化
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(4)
<223>Xaa＝DPhe
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(6)..(6)
<223>Xaa＝Nal(2’)
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(10)..(10)
<223>Xaa＝二氨基丙酸(Dpr)
<400>39
Figure C200480021195D00551
<210>40
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>嵌合肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(10)
<223>该肽环化
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(4)
<223>Xaa＝DPhe
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(6)..(6)
<223>Xaa＝DNal(2’)
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(10)..(10)
<223>Xaa＝二氨基丙酸(Dpr)
<400>40
<210>41
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>嵌合肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(10)
<223>该肽环化
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(4)
<223>Xaa＝DPhe
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(6)..(6)
<223>Xaa＝Bip
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(10)..(10)
<223>Xaa＝二氨基丙酸(Dpr)
<400>41
Figure C200480021195D00562
<210>42
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>嵌合肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(10)
<223>该肽环化
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(4)
<223>Xaa＝DPhe
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(6)..(6)
<223>Xaa＝Tic
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(10)..(10)
<223>Xaa＝二氨基丙酸(Dpr)
<400>42
Figure C200480021195D00571
<210>43
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>嵌合肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(10)
<223>该肽环化
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(4)
<223>Xaa＝DPhe
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>Xaa＝DPhe
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(10)..(10)
<223>Xaa＝二氨基丙酸(Dpr)
<400>43
Figure C200480021195D00581

Claims (28)

1.对黑皮质素受体具有生物学活性的肽，其中所述的肽包含SEQ IDNO：3的AGRP(109-118)类似模板，其中AGRP(109-118)模板的AGRP(111-113)残基用基于黑皮质素激动剂的生物活性决定子序列替代，其中
a)基于黑皮质素激动剂的生物活性决定子序列选自：
i)Trp-Arg-Phe；
ii)Trp-Arg-DPhe；
iii)Phe-Arg-Trp；
iv)DPhe-Arg-Trp；
v)His-Phe-Arg-Trp；和
vi)His-DPhe-Arg-Trp。
2.根据权利要求1所述的肽，其中所述的肽具有SEQ ID NO：4-7、9和10中任意一个的序列。
3.根据权利要求1所述的肽，其中所述的基于黑皮质素激动剂的生物活性决定子序列中的至少一个氨基酸被选自Ala；Atc；Bip；Lys；Nal(1′)；Nal(2′)；(pI)Phe和Tic的氨基酸替代。
4.根据权利要求3所述的肽，其中所述的肽具有SEQ ID NO：24-43中任意一个的序列。
5.根据权利要求1所述的肽，其中所述的肽还包含替代AGRP(109-118)类似模板中二硫键的内酰胺键。
6.根据权利要求5所述的肽，其中所述的肽具有SEQ ID NO：2和11中任意一个的序列。
7.根据权利要求5所述的肽，其中所述的肽还分别在N末端和C末端包含第二个和第三个生物活性决定子序列，其中在N末端的第二个生物活性决定子序列是Ser-Tyr-Ser-Nle氨基酸残基并且在C末端的第三个生物活性决定子序列是Lys-Pro-Val氨基酸残基。
8.对黑皮质素受体具有生物学活性的肽，其中所述的肽包含NDP-MSH线性十三肽模板和已经替代了类似模板序列的hAGRP(111-113)生物活性决定子序列，其中
a)hAGRP(111-113)生物活性决定子序列选自：
i)Arg-Phe-Phe；
ii)Phe-Phe-Arg；
iii)DArg-Phe-Phe；
iv)Arg-DPhe-Phe；和
v)Arg-Phe-DPhe。
9.根据权利要求8所述的肽，其中所述的肽具有SEQ ID NO：13-18中任意一个的序列。
10.对黑皮质素受体具有生物学活性的肽，其中所述的肽包含环状MTII七肽模板和已经替代了类似模板序列的hAGRP(111-113)生物活性决定子序列，其中
a)hAGRP(111-113)生物活性决定子序列选自：
i)Arg-Phe-Phe；
ii)Phe-Phe-Arg；
iii)DArg-Phe-Phe；
iv)Arg-DPhe-Phe；和
v)Arg-Phe-DPhe。
11.根据权利要求10所述的肽，其中所述的肽具有SEQ ID NO：20-23中任意一个的序列。
12.包含对黑皮质素受体具有生物学活性的肽的药物组合物，其中所述的肽包含SEQ ID NO：3的AGRP(109-118)类似模板，其中AGRP(109-118)模板的AGRP(111-113)残基用基于黑皮质素激动剂的生物活性决定子序列替代，其中
a)基于黑皮质素激动剂的生物活性决定子序列选自：
i)Trp-Arg-Phe；
ii)Trp-Arg-DPhe；
iii)Phe-Arg-Trp；
iv)DPhe-Arg-Trp；
v)His-Phe-Arg-Trp；和
vi)His-DPhe-Arg-Trp。
13.根据权利要求12所述的药物组合物，其中所述的肽具有SEQ IDNO：4-7、9和10中任意一个的序列。
14.根据权利要求12所述的药物组合物，其中所述的基于黑皮质素激动剂的生物活性决定子序列中的至少一个氨基酸残基被选自Ala；Atc；Bip；Lys；Nal(1′)；Nal(2′)；(pI)Phe和Tic的氨基酸替代。
15.根据权利要求14所述的药物组合物，其中所述的肽具有SEQ IDNO：24-43中任意一个的序列。
16.根据权利要求12所述的药物组合物，其中所述的肽还包含替代AGRP(109-118)模板中二硫键的内酰胺键。
17.根据权利要求16所述的药物组合物，其中所述的肽具有SEQ IDNO：2和11中任意一个的序列。
18.根据权利要求16所述的药物组合物，其中所述的肽还分别在N末端和C末端包含第二个和第三个生物活性决定子序列，其中在N末端的第二个生物活性决定子序列是Ser-Tyr-Ser-Nle氨基酸残基并且在C末端的第三个生物活性决定子序列是Lys-Pro-Val氨基酸残基。
19.包含对黑皮质素受体具有生物学活性的肽以及可药用载体或稀释剂的药物组合物，其中所述的肽包含NDP-MSH线性十三肽模板和已经替代了类似模板序列的hAGRP(111-113)生物活性决定子序列，其中
a)hAGRP(111-113)生物活性决定子序列选自：
i)Arg-Phe-Phe；
ii)Phe-Phe-Arg；
iii)DArg-Phe-Phe；
iv)Arg-DPhe-Phe；和
v)Arg-Phe-DPhe。
20.根据权利要求19所述的药物组合物，其中所述的肽具有SEQ IIDNO：13-18中任意一个的序列。
21.包含对黑皮质素受体具有生物学活性的肽以及可药用载体或稀释剂的药物组合物，其中所述的肽包含环状MTII七肽模板和已经替代了类似模板序列的hAGRP(111-113)生物活性决定子序列，其中
a)hAGRP(111-113)生物活性决定子序列选自：
i)Arg-Phe-Phe；
ii)Phe-Phe-Arg；
iii)DArg-Phe-Phe；
iv)Arg-DPhe-Phe；和
v)Arg-Phe-DPhe。
22.根据权利要求21所述的药物组合物，其中所述的肽具有SEQ IDNO：20-23中任意一个的序列。
23.对黑皮质素受体具有生物学活性的肽在制备治疗病人中通过黑皮质素受体调节的不良状况的药物中的用途，其中所述的肽包含SEQ IDNO：3的AGRP(109-118)类似模板，其中AGRP(109-118)模板的AGRP(111-113)残基用基于黑皮质素激动剂的生物活性决定子序列替代，其中
a)基于黑皮质素激动剂的生物活性决定子序列选自：
i)Trp-Arg-Phe；
ii)Trp-Arg-DPhe；
iii)Phe-Arg-Trp；
iv)DPhe-Arg-Trp；
v)His-Phe-Arg-Trp；和
vi)His-DPhe-Arg-Trp。
24.对黑皮质素受体具有生物学活性的肽在制备治疗病人中通过黑皮质素受体调节的不良状况的药物中的用途，其中所述的肽包含NDP-MSH线性十三肽模板和已经替代了类似模板序列的hAGRP(111-113)生物活性决定子序列，其中
a)hAGRP(111-113)生物活性决定子序列选自：
i)Arg-Phe-Phe；
ii)Phe-Phe-Arg；
iii)DArg-Phe-Phe；
iv)Arg-DPhe-Phe；和
v)Arg-Phe-DPhe。
25.对黑皮质素受体具有生物学活性的肽在制备治疗病人中通过黑皮质素受体调节的不良状况的药物中的用途，其中所述的肽包含环状MTII七肽模板和已经替代了类似模板序列的hAGRP(111-113)生物活性决定子序列，其中
a)hAGRP(111-113)生物活性决定子序列选自：
i)Arg-Phe-Phe；
ii)Phe-Phe-Arg；
iii)DArg-Phe-Phe；
iv)Arg-DPhe-Phe；和
vi)Arg-Phe-DPhe。
26.使用权利要求1、8、12、19、21、23、24或25所述的肽制造用于治疗通过黑皮质素受体调节的不良状况的组合物的方法。
27.根据权利要求26所述的方法，其中选自色谱法、光谱法、折光测定法、旋光测定法、金属分析法、元素分析法、滴定法和氨基酸分析法的分析技术中的任意一个或组合被用于提供肽。
28.根据权利要求23-25中任意一项所述的用途，其中药物被配制成口服剂型。
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