CN101201312A - 一种中性红染色法检测藻细胞活性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种中性红染色法检测藻细胞活性的方法，包括：将待测的含藻溶液离心，并用蒸馏水清洗，得到藻细胞沉淀物；然后加入0.15～0.20mg/ml中性红的Ringer溶液，进行染色10～15min，得到细胞悬液；在普通生物显微镜下检测该细胞悬液中的染色细胞数，每个样品记数20个视野，用上式计算细胞死亡率，式中：r-细胞死亡率；A-视野中未着色细胞数目；B-视野中着上红色的细胞数目。本方法克服了现有技术的缺陷，是一种简便、快捷和结果可靠的使用中性红染色法检测藻细胞活性的方法。

Description

一种中性红染色法检测藻细胞活性的方法

技术领域

本发明涉及一种中性红染色法检测藻细胞活性的方法。

背景技术

由于大量含氮磷的物质排放入水体，造成了地表水体的富营养化，导致水体中藻类大量生长繁殖，严重时出现藻华现象。藻类的大量生长不仅造成生态环境的恶化，而且也对人们的生活和生产带来许多影响，例如增加了饮用水处理的难度和成本，限制了水体的使用功能等。因此，为保证用水的安全和达到用水的目的，需要控制藻类的生长和灭活藻类。在藻类的处理过程中，经常需要检测藻细胞活性的变化状况。为了检测藻细胞活性，目前经常采用的是藻细胞培养方法或荧光染色法。

藻细胞培养方法是通过测定培养过程中生物量的变化来了解藻细胞活性的状况，如文献1：Cryopreservation of a marine microalga，Nannochloropsis oculata(Eustigmatophyceae).Cryobiology，2005，50：338-343，文献2：Some aspects on thecryopreservation of microalgae used as food for marine species.Aquaculture.1995，136：277-290和文献3：Biosorption of cadmium and copper contaminated water by Scenedesmusabundans.Chemosphere.2002，47：249-255中所述，可以通过测定细胞密度或叶绿素a等生物量的指标来检测藻细胞活性。但是，这种方法所消耗的时间较长，通常需要培养5-7天后，才能了解藻细胞活性情况，藻细胞是否被全部杀死，而且叶绿素a的测定方法也非常繁琐。

如在文献4：Algal esterase activity as a biomeasure of environmental degradation in afreshwater creek.Aquatic Toxicology.2002，59：209-223和文献5：FDA-PI双色荧光法检测蓝藻细胞活性的研究.环境化学，2005，9中公开的，荧光染色法是使用不同的荧光染色剂染色活细胞和死亡细胞，然后可在荧光显微镜下检测呈不同颜色的活细胞和死亡细胞。这种方法虽然比较简便，但需要荧光显微镜这样高档的仪器，而且荧光染色剂通常都有一定的毒性，对人体有害。在染色法检测细胞活性的方法中，最为常用的染色剂是台盼蓝，它可以将死亡细胞着上蓝色，而活细胞不被染色。但是这种染色剂在藻细胞活性检测中，其检测效果较差，检测结果也不稳定。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术在检测藻细胞活性时，使用藻细胞培养方法耗时长且繁琐，而使用荧光染色法需要成本高的仪器，且荧光染色剂具有毒性，其检测效果也较差，检测结果也不稳定的缺陷，从而提供一种简便、快捷和结果可靠的使用中性红染色法检测藻细胞活性的方法。

本发明的目的是通过如下的技术方案实现的。

本发明的中性红染色法检测藻细胞活性的方法，包括如下的步骤：

1)将待测的含藻溶液在3000r/min转速下离心，弃去上清液，用蒸馏水清洗，并离心，弃去上清液，用蒸馏水清洗2～3次，离心后得到藻细胞沉淀物；

2)在步骤1)的藻细胞沉淀物中加入0.15～0.20mg/ml中性红的Ringer溶液，加入的染液以完全浸泡藻细胞沉淀物为宜，摇匀，进行染色10～15min，得到细胞悬液；

3)在载玻片上滴上步骤2)得到的细胞悬液，用盖玻片盖好后，用普通生物显微镜进行检测，被中性红染成红色的为死亡细胞，没有被染上的为活细胞；

每个样品记数20个视野，每个视野里分别计算死细胞B和活细胞数A，然后用下式计算细胞死亡率r：

$r=\frac{B}{A+B}\×100\%$

式中：r-细胞死亡率；A-视野中未着色细胞数目；B-视野中着上红色的细胞数目。

与其他染色法相同，本发明提供的中性红检测藻细胞活性的方法适用于球形或椭圆形细胞。

本发明提供的以中性红染色法来检测藻细胞活性的方法，其中使用的中性红是吩嗪染料，属于碱性染料。该碱性染料具有溶解在拟脂质的特性，尤其对于卵磷脂和胆固醇，更易于溶解，而细胞表面的质膜就是浸润着卵磷脂和胆固醇。正常细胞具有摄取中性红的能力，并且中性红可以滞留溶酶体内而不被细胞洗涤液洗脱。在活性染色中，中性红可以将细胞内的液泡染成红色，但当细胞死亡后，中性红会充满整个细胞。

与使用其他染色剂的方法相比，本发明的方法的优点在于：

1、使用的中性红的毒性较小，500ppm以下浓度的中性红对细胞活性影响不大，即活性检测中细胞不会因为染色剂的毒性而对活性检测带来较大的误差。

2、在活性染色中，中性红的染色操作非常简便，将需要染色的藻细胞离心后，直接加入中性红水溶液染色即可。

3、染色所需要的时间很短，只需要10-15分钟。

4、检测的仪器也很普遍，只需要使用普通生物显微镜就可以进行观察计数。

具体实施方式

本发明中使用的中性红染液按下述方法配制：称取0.5g中性红粉末溶于50mlRinger溶液中，配成10mg/ml中性红溶液，加热至30-40℃待中性红溶解后，用滤膜过滤，装入棕色瓶保存；使用时用Ringer溶液将该10mg/ml中性红溶液稀释至0.15-0.20mg/ml。

实施例1、

对细胞密度为2×10⁹个/l的铜绿微囊藻溶液进行灭活处理，然后取灭活后的藻细胞溶液10ml，在3000r/min转速下离心，弃去上清液，用蒸馏水清洗，并离心，弃去上清液；用蒸馏水再次清洗沉淀物，离心，弃去上清液，得到藻细胞沉淀物；加入4ml浓度为0.20mg/ml的中性红染液，使藻细胞沉淀物被浸泡在加入的染液中，进行染色15min，摇匀，得到细胞悬液；用滴管吸取一滴该细胞悬液，放在载玻片上，并用盖玻片盖好后，用普通生物显微镜进行检测。记录被中性红染成红色的死亡细胞数B和没有被染上的活细胞数A，每个样品记数20个视野，列于表1，然后用下式计算细胞死亡率r：

$r=\frac{B}{A+B}\×100\%$

式中：r-细胞死亡率；A-视野中未着色细胞数目；B-视野中着上红色的细胞数目。

表1、铜绿微囊藻的中性红染色结果

视野序数	A	B	A+B	细胞死亡率，％
					1	0	28	28	100
2	2	28	30	93.3
					3	0	25	25	100
4	0	47	47	100
					5	1	32	33	97.0
6	0	55	55	100
					7	0	34	34	100
8	1	20	21	95.2
					9	0	25	25	100
10	0	43	43	100
					11	0	18	18	100
12	1	25	26	96.2
					13	1	32	33	97.0
14	0	31	31	100
					15	1	41	42	100
16	0	38	38	100
					17	1	44	45	97.7
18	1	31	32	96.9
					19	1	39	40	97.5
20	0	36	36	100
					平均值	10	672	682	98.5

实施例2、

对细胞密度为5×10⁸个/l的小球藻溶液进行灭活处理，然后取灭活后的藻细胞溶液20ml，在3000r/min转速下离心，弃去上清液，用蒸馏水清洗，并离心，弃去上清液；用蒸馏水再次清洗沉淀物，离心，弃去上清液，得到藻细胞沉淀物；加入4ml浓度为0.15mg/ml的中性红染液，使藻细胞沉淀物被浸泡在加入的染液中，进行染色15min，摇匀，得到细胞悬液；用滴管吸取一滴该细胞悬液，放在载玻片上，并用盖玻片盖好后，用普通生物显微镜进行检测。记录被中性红染成红色的死亡细胞数B和没有被染上的活细胞数A，每个样品记数20个视野，列于表2。

表2、小球藻的中性红染色结果

视野序数	A	B	A+B	细胞死亡率，％
					1	1	17	18	94.4
2	2	24	26	92.3
					3	0	9	9	100
4	2	28	30	93.3
					5	1	16	17	94.1
6	0	18	18	100
					7	0	27	27	100
8	1	27	28	96.4
					9	1	30	31	96.7
10	0	13	13	100
					11	1	13	14	92.8
12	0	18	18	100
					13	0	16	16	100
14	1	19	20	95.0
					15	0	26	26	100
16	1	24	25	96.0
					17	0	19	19	100
18	0	26	26	100
					19	1	27	28	96.4
20	1	30	31	96.8
					平均值	13	427	440	97.1

Claims (5)

1.一种中性红染色法检测藻细胞活性的方法，包括如下的步骤：

1)将待测的含藻溶液离心，弃去上清液，用蒸馏水清洗，并离心，弃去上清液，用蒸馏水清洗2～3次，离心后得到藻细胞沉淀物；

2)在步骤1)的藻细胞沉淀物中加入中性红的Ringer溶液，摇匀，进行染色，得到细胞悬液；

3)在载玻片上滴上步骤2)得到的细胞悬液，用盖玻片盖好后，用普通生物显微镜进行检测，被中性红染成红色的为死亡细胞，没有被染上的为活细胞；

每个样品记数20个视野，每个视野里分别计算死细胞B和活细胞数A，然后用下式计算细胞死亡率r：

$r=\frac{B}{A+B}\×100\%$

式中：r-细胞死亡率；A-视野中未着色细胞数目；B-视野中着上红色的细胞数目。

2.如权利要求1所述的中性红染色法检测藻细胞活性的方法，其特征在于：所述步骤1)中的离心速度为3000r/min。

3.如权利要求1所述的中性红染色法检测藻细胞活性的方法，其特征在于：所述步骤2)中的中性红的Ringer溶液的浓度为0.15～0.20mg/ml。

4.如权利要求1所述的中性红染色法检测藻细胞活性的方法，其特征在于：所述步骤2)中的染色时间为10～15min。

5.如权利要求1所述的中性红染色法检测藻细胞活性的方法，其特征在于：所述的待测的含藻溶液为含球形或椭圆形细胞藻类。