CN101215560B

CN101215560B - 一种具有抗白血病作用的miR-21反义寡核苷酸及其应用

Info

Publication number: CN101215560B
Application number: CN2007100328092A
Authority: CN
Inventors: 费嘉; 兰菲菲; 刘誉
Original assignee: Jinan University
Current assignee: Guangzhou Disheng Biological Medicine Technology Co Ltd
Priority date: 2007-12-26
Filing date: 2007-12-26
Publication date: 2010-09-29
Anticipated expiration: 2027-12-26
Also published as: CN101215560A

Abstract

本发明涉及一种具有抗白血病作用的miR-21反义寡核苷酸及其应用，本发明所述的具有抗白血病作用的miR-21反义寡核苷酸，包含如下所示碱基序列之一：5′-tcaacatcagtctgataagcta-3′。本发明所述的具有抗白血病作用的microRNA反义寡核苷酸能够有效地抑制白血病细胞K562中的miR-21和miR-181a这两种基因的表达，促进白血病细胞凋亡，从而能够有效地治疗白血病。并且对白血病细胞K562的抑制效果呈现明显的量效关系。

Description

一种具有抗白血病作用的miR-21反义寡核苷酸及其应用

技术领域

本发明涉及核苷酸，具体涉及一种具有抗白血病作用的miR-21反义寡核苷酸及其应用。

背景技术

MicroRNA(简称miRNA)是存在于真核生物中的一类长度约为22nt的非编码小分子RNA，参与基因转录后水平调控，呈现出组织特异性或发育阶段特异性表达特征。MicroRNA基因存在于基因组的基因间隔区或内含子中，通过与靶mRNA序列的3′非翻译区或编码区以碱基互补配对的方式来执行对靶mRNA的转录翻译抑制的功能，从而调控基因的表达。

随着生物信息学的迅猛发展和基因克隆技术的不断改进，已经在生物体内发现了大量的miRNA，并且建立了miRNA数据库(http://www.sanger.ac.uk)，其中包括了人类已经发现的533个miRNA。

miRNA能够通过两种不同的机制指导RISC下调目的基因的表达：mRNA剪切和翻译抑制。miRNA与其靶基因的互补程度决定了它以何种机制沉默靶基因。一旦miRNA组装进入效应复合物RISC，当其与靶mRNA几乎完全互补时就指导mRNA特异性切割，引发靶mRNA的降解；当互补程度较低时就指导mRNA翻译抑制。

反义技术(antisense technology)是一种根据碱基互补原理，用人工合成或生物体表达的特定互补的DNA或RNA片段(或其化学修饰产物)，阻断从基因到蛋白质的信息流，以达到抑制或阻断基因表达的目的。反义核酸主要指反义RNA、反义DNA(ASODN)以及核酶，反义技术是一种新的药物开发方式，利用这一技术研制的药物称反义药物，通常指反义寡核苷酸(antisenseoligonucleotide)。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有抗白血病作用的miR-21反义寡核苷酸，本发明所提供的具有抗白血病作用的miR-21反义寡核苷酸，包含如下所示的序列：5′-tcaacatcagtctgataagcta-3′(22bp)；

所述的具有抗白血病作用的miR-21反义寡核苷酸可以经过不同的化学修饰，如甲氧修饰、硫代修饰等。

本发明的另一目的是提供这种具有抗白血病作用的miR-21反义寡核苷酸在制备治疗白血病药物中的应用。所述的应用是将所述的核苷酸按本领域常用的方法制成各种制剂。

本发明所述的具有抗白血病作用的miR-21反义寡核苷酸的序列是根据白血病细胞K562中的miR-21序列设计的反义寡核苷酸序列(Antisense-microRNAs-oligonucleotides，AMO)。所以相对应地，5′-tcaacatcagtctgataagcta-3′在本发明中称为AMO-miR-21。

本发明所述的具有抗白血病作用的miR-21反义寡核苷酸能够有效地抑制白血病细胞中的miR-21和miR-181a这两种基因的表达，促进白血病细胞凋亡，从而能够有效地治疗白血病。并且抑制效果呈现明显的量效关系，经实验证明，AMO浓度为0.6μmol/L时对白血病细胞生长的抑制效果为最佳。

附图说明

图1为不同浓度AMO对白血病细胞K562的生长抑制作用(72h)图。

图2至图5为AMO(0.6μmol/L)作用于白血病细胞K562 24h对细胞周期的影响图(其中p2：sub G₁；P3：G₀/G₁；P4：S；P5：G₂/M，图2为随机对照组，图3为空白对照组，图4为AMO-miR-181a组，图5为AMO-miR-21组)。

图6至图9为AMO(0.6μmol/L)作用于白血病细胞K562 48h对细胞周期的影响图(其中P2：sub G₁；P3：G₀/G₁；P4：S；P5：G₂/M，图6为AMO-miR-21组，图7为AMO-miR-181a组，图8为空白对照组，图9为随机对照组)。

图10为miR-21的标准曲线图(C_T值为8.30、13.00、17.07、20.98、25.36、28.57)。

图11是不同时间AMO对白血病细胞K562的生长抑制作用(0.6μmol/L)图。

具体实施方式

实施例1本发明的具有抗白血病作用的miR-21反义寡核苷酸(以下简称AMO)的制得

白血病细胞K562的miR-21序列为5′-uagcuuaucagacugauguugac-3′(23bp)；miR-181a序列为5′-aacauucaacgcugucggugagu-3′(23bp)。

针对白血病细胞K562的miR-21设计其反义寡核苷酸，并采用BLAST软件进行分析，比对后得序列如SEQ NO.1所示：5′-tcaacatcagtctgataagcta-3′(22bp)(以下称为AMO-miR-21)，针对白血病细胞K562的miR-181a设计其反义寡核苷酸，并采用BLAST软件进行分析，比对后得序列如SEQ NO.2所示：5′-actcaccgacagcgttgaatgtt-3′(23bp)(以下称为AMO-miR-181a)。以上两种反义寡核苷酸序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，全硫代修饰，PAGE纯化，于-20℃保存。用无血清的RPMI-1640培养基溶解配制成100μmol/L储存溶液，置-20℃备用，用时稀释成所需的使用浓度。

实施例2本发明的miR-21和miR-181a反义核苷酸对白血病细胞K562的抑制作用和诱导凋亡作用

1、主要试剂

Lipofectamine^TM 2000 invitrogen公司美国

antisense microRNAs 上海生工生物工程有限公司中国

琼脂糖 Promega公司美国

羟乙基哌嗪乙磺酸 Gibco公司美国

RPMI-1640培养基粉 Gibco公司美国

RPMI-1640液体培养基展晨生物公司中国

新生牛血清杭州四季青生物工程公可中国

青霉素、链霉素华北制药公司中国

胰酶(Trypsin) Sigma公司美国

CCK-8细胞计数试剂盒日本同仁化学研究所日本

台盼蓝(Typan Blue) Sigma公司美国

1000μL，200μL，10μL Tips Axygen公司美国

1.5mL，0.2mLEP Axygen公司美国

RNA Sigma公司美国

碘化丙啶(PI) Sigma公司美国

2.试剂配制

2.1Lipofectamine^TM 2000：4℃保存。

2.2Antisense-microRNAs-oligonucleotides(AMO)：设计实施例1中所述的针对白血病细胞K562中miR-21和miR-181a的反义寡核苷酸序列AMO-miR-21和AMO-miR-181a：序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，全硫代修饰，PAGE纯化，于-20℃保存。用无血清的RPMI-1640培养基溶解配制成100μmol/L储存溶液，置-20℃备用，用时稀释成所需的使用浓度。

2.3含酚红RPMI-1640培养基：

RPMI-1640干粉(10.4g/包)，用三蒸水溶解，加入碳酸氢钠2.0g，HEPES5.0g，磁力搅拌仪充分搅拌，定容至1000mL，过滤除菌，分装，4℃保存。

2.4RPMI-1640液体培养基：过滤除菌，分装。

2.5新生牛血清：

56℃、30min灭活，分装于25mL小瓶中，-20℃保存。配制新鲜RPMI-1640液时，每180mL培养液加入血清20mL，使最终细胞培养液中血清的体积分数为10％。

2.60.2％台盼蓝工作液：

称取0.2g台盼蓝粉，用100mL PBS(pH7.2)溶解。

2.7RNA酶：

配制成10mg/mL的储存液，-20℃保存，使用时配制成工作液浓度。

2.8碘化丙啶(PI)染液：

称取20μg碘化丙啶，加入1000mL生理盐水，即20μg/L浓度，分装，4℃避光保存。

3主要仪器

3.1DL-2型台式低速离心机(北京医用离心机厂)

3.2CO₂培养箱(Thermo Forma，美国)

3.3超净工作台(苏州净化设备厂)

3.4微量加样器(0.5-10μL，1-20μL，10-100μL，50-200μL，200-1000μL，Eppendorf，德国)

3.5DS-1B倒置显微镜(重庆光学仪器厂)

3.6Neubauer Improved细胞计数板(Carl Roth GmbH&Co.KG，德国)

3.7流式细胞仪(Elite，Coulter公司，美国)

4实验方法

(1)细胞培养：

白血病细胞K562用含10％新生牛血清RPMI-1640培养基于37℃、体积分数为5％CO₂培养箱，饱和湿度条件下培养，0.25％的胰酶常规消化传代，2-3天传代一次。实验选用对数生长期、0.2％台盼蓝拒染率＞95％的细胞接种于培养板，加入Lipofectamine^TM2000-AMO反义核酸，每组药物均设3个复孔。

(2)Lipofectamine^TM2000与AMO复合物的配制：

单独的AMO-miR对细胞的转染效率不高，需要一种合适的转染载体介导才能提高AMO-miR的作用效果使之进入细胞发挥更好的作用效果。我们采用Lipofectamine^TM 2000来作为转染载体。

Lipofectamine^TM2000与AMO按质量比为2.5∶1配制，即取所需AMO量，计算所需Lipofectamine^TM2000的量，分别用无血清培养液配制，将Lipofectamine^TM2000缓慢加入AMO中，充分混匀，室温静置30min，即得Lipofectamine^TM2000-AMO复合物。

(3)台盼蓝拒染法检测AMO对白血病细胞K562生长的抑制作用：

取对数生长期白血病细胞K562，用无血清RPMI-1640培养基调整细胞浓度为5×10⁴cells/mL接种于96孔培养板，每孔100μL(每孔5000个细胞)，加入药物后终体积为150μL。

实验分为4组：AMO-miR-21组、AMO-miR-181a组、随机对照组组、空白对照组Lipofectamine^TM 2000与AMO的质量比为2.5∶1，

白血病细胞株K562每组AMO终浓度均分别为0.1μmol/L、0.21μmol/L、0.3μmol/L、0.61μmol/L，空白对照组加入与药物同体积的血清RPMI-1640培养基，脂质体对照组加入与药物同体积同浓度的Lipofectamine^TM2000，置37℃，体积分数为5％CO₂培养箱转染6h，加入含血清培养基分别培养24h、48h、72h。

选AMO终浓度均为0.6μmol/L，空白对照组加入与药物同体积的血清RPMI-1640培养基，脂质体对照组加入与药物同体积同浓度的Lipofectamine^TM2000，置37℃，体积分数为5％CO₂培养箱分别培养72h。

(4)PI单染流式细胞仪检测经AMO作用后，K562细胞周期及亚二倍体峰百分率变化情况：

取对数生长期白血病细胞K562用无血清RPMI-1640培养基调整细胞浓度为1.2×10⁵cells/mL，接种于24孔培养板，各组均设四复孔。加入无血清含AMO的RPMI-1640培养液后，每孔终体积500μL，置孵箱转染6h后，每孔加入500μL含20％血清RPMI-1640培养液继续培养。共设4组：AMO-miR-181a、AMO-miR-21组、随机对照组和空白对照组。Lipofectamine^TM2000与AMO的质量比为2.5∶1，每组AMO终浓度为0.6μmol/L，空白对照组加入与药物同体积的血清RPMI-1640培养基，脂质体对照组加入与药物同体积同浓度的Lipofectamine^TM2000，分另培养24h、48h、72h，倒置显微镜下观察后，用0.25％胰蛋白酶-EDTA消化收集细胞，预冷PBS洗涤3次后，用70％(v/v)乙醇于4℃固定过夜。上机前用预冷PBS洗涤3次后，加入碘化丙锭染色液(含RNA酶)，终浓度50μg/mL，避光染色30min，流式细胞仪分析细胞DNA含量的变化，每个样本随机分析5000个细胞，得到各组细胞亚二倍体峰百分率和各组细胞生长周期比例。

(5)统计学分析：

所有数据采用均数±标准差

表示，使用统计软件SPSS 11.5，各组均数比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)。P＜0.05表示差异有统计学意义。

(6)实验结果

实验发现，对于白血病细胞K562，AMO-miR-21和AMO-miR-181a在浓度为0.2μM时即发挥了抑制作用；0.3μmol/L，0.6μmol/L时抑制效果更明显，最佳作用浓度为0.6μmol/L，呈现出明显的量效关系。终浓度0.6μmol/L的AMO-miR-21和AMO-miR-181a转染白血病细胞K562 72h时，与随机对照组相比较，对细胞生长产生明显的抑制作用，且随着作用时间的增加，其抑制效果逐渐增强(如图1所示)。

终浓度为0.6μmol/L的AMO作用于白血病细胞K562，AMO-miR-21和AMO-miR-181a在培养48h时开始对细胞的生长出现抑制作用，且随着作用时间的增加，其抑制效果逐渐增强。72h时作用效果十分明显，有明显的时效关系(如图11所示)。

流式细胞仪分析各组DNA含量的细胞周期分析图中，P2峰代表亚二倍体峰，代表DNA含量不足二倍体的细胞，用来估计凋亡细胞的比例；P3峰代表处于G₀/G₁期的细胞，P4峰代表处于S期的细胞，P5峰代表处于G₂/M期的细胞。AMO转染白血病细胞K562 24h、48h、72h后(AMO终浓度为0.6μmol/L)，与随机对照组相比，AMO-miR-21组和AMO-miR-181a组凋亡峰十分明显，有显著的统计学差异(P＜0.05)(见表1)，细胞周期中各时期所占细胞周期的比例如表2所示。

表1AMO(0.6μmol/L)作用于白血病细胞K562不同时间亚二倍体峰所占细胞周期的比例(％，n＝3)

^*与随机对照组相比较，P＜0.05

表2AMO(0.6μmol/L)作用于白血病细胞K562不同时间对细胞周期的影响(％，

n＝3)

	分组	subG<sub>1</sub>(p2)	G<sub>0</sub>/G<sub>1</sub>(P3)	S(P4)	G<sub>2</sub>/M(P5)
	分组	subG<sub>1</sub>(p2)	G<sub>0</sub>/G<sub>1</sub>(P3)	S(P4)	G<sub>2</sub>/M(P5)	24h	空白对照组随机对照组AMO-miR-21组AMO-miR-181a组	12.66±0.6515.39±0.8119.68±1.01<sup></sup>22.39±1.16<sup></sup>	52.24±2.7952.43±2.8149.39±2.6551.27±2.70	27.67±1.4725.94±1.3223.55±1.2520.96±1.11	7.63±0.416.72±0.368.12±0.465.11±0.27
48h	空白对照组随机对照组AMO-miR-21组AMO-miR-181a组	32.01±1.6733.27±1.7644.39±2.30<sup></sup>38.62±2.01<sup></sup>	49.12±2.6350.61±2.6847.64±2.5246.59±2.47	23.65±1.2619.87±1.0115.58±0.8115.01±0.78	7.99±0.455.68±0.314.33±0.263.39±0.19	24h	空白对照组随机对照组AMO-miR-21组AMO-miR-181a组		52.24±2.7952.43±2.8149.39±2.6551.27±2.70	27.67±1.4725.94±1.3223.55±1.2520.96±1.11	7.63±0.416.72±0.368.12±0.465.11±0.27

	分组	subG<sub>1</sub>(p2)	G<sub>0</sub>/G<sub>1</sub>(P3)	S(P4)	G<sub>2</sub>/M(P5)
	分组	subG<sub>1</sub>(p2)	G<sub>0</sub>/G<sub>1</sub>(P3)	S(P4)	G<sub>2</sub>/M(P5)	72h	空白对照组随机对照组AMO-miR-21组AMO-miR-181a组	18.52±0.9424.03±1.2332.33±1.68<sup></sup>35.17±1.83<sup></sup>	40.01±2.1240.24±2.1338.16±2.0234.61±1.89	21.31±1.0918.38±0.9814.65±0.7818.13±0.98	6.57±0.376.34±0.362.67±0.148.04±0.45

从上述结果可以看出AMO-miR-21与AMO-miR-181a可以有效促进白血病细胞K562的凋亡，从而抑制白血病细胞的生长。

实施例3实时定量PCR技术检测AMO作用肿瘤细胞后microRNA的水平

一实验材料

1主要试剂

Lipofectamine^TM2000 Invitrogen公司美国

antisense microRNAs 上海生工生物工程有限公司中国

羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES) Gibco公司美国

RPMI-1640培养基粉 Gibco公司美国

RPMI-1640液体培养基展晨生物公司中国

新生牛血清杭州四季青生物工程公司中国

青霉素、链霉素华北制药公司中国

胰酶(Trypsin) Sigma公司美国

台盼蓝(Typan Blue) Sigma公司美国

1000μL，200μL，10μL Tips Axygen公司美国

1.5mL，0.2mLEP管 Axygen公司美国

实时定量PCR管 Sigma公司美国

DEPC Sigma公司美国

Trizol Invitrogen公司美国

MMLV逆转录酶 Promega公司美国

Rnase Inhibitornb Promega公司美国

dNTP(10mM) Takara公司日本

RNase-free H₂O Takara公司日本

Hairpin-it^TMmiRNAsReal-Time 上海吉玛制药技术有限公司中国

PCR Quantitation Kit

2试剂配制

2.1Lipofectamine^TM2000：4℃保存。

2.2Antisense-microRNAs-oligonucleotides(AMO)：

AMO序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，全硫代修饰，PAGE纯化，于-20℃保存。用无血清的RPMI-1640培养基溶解配制成100μmol/L储存溶液，置-20℃备用，用时稀释成所需的使用浓度。

2.3含酚红RPMI-1640培养基：

2.4RPMI-1640液体培养基：过滤除菌，分装。

2.50.2％台盼蓝工作液：

称取0.2g台盼蓝粉末，用100mL PBS(pH7.2)溶解。

2.60.25％胰酶-0.02％EDTA混合消化液：

称取0.5g胰酶于烧杯中，用100mL D-Hanks液溶解，称取EDTA 0.04g于烧杯中，用100mL D-Hank’s液溶解，将溶解的胰酶-EDTA液体等体积混合。在超净台内用0.20μm滤器过滤除菌，分装至小瓶，-20℃冻存。

2.7Hairpin-it^TMmiRNAs Real-Time PCR Quantitation Kit-20℃保存。

3主要仪器

3.1DL-2型台式低速离心机(北京医用离心机厂)

3.2CO₂培养箱(Thermo Forma，美国)

3.3超净工作台(苏州净化设备厂)

3.5DS-1B倒置显微镜(重庆光学仪器厂)

3.6Neubauer Improved细胞计数板(Carl Roth GmbH&Co.KG，德国)

3.7实时定量PCR扩增仪(Bio-rad公司，美国)

3.8紫外分析仪(UVPupland，美国)

3.9超低温冰箱(Forma702，美国)

二实验方法

1实时定量PCR检测方法(Hairpin-it^TM miRNAs Real-Time PCRQuantitation Kit)：

实验选用针对miR-21设计的实时定量PCR检测试剂盒，该试剂盒能够高度特异地检测miR-21在肿瘤细胞中的表达水平。Hairpin-it^TM miRNAs qPCRQuatitation Assay包括两步：①Stem-loop RT②Real-time PCR。在Stem-loop RT这一步中，Stem-loop RT primer与miRNA分子的3′端结合，然后用逆转录酶将RNA逆转录成cDNA。Stem-loop RT primer是针对miR-21特殊设计的具有茎环结构的RT引物，由于设计的专一性，它只与miR-21结合而不与其他miRNA结合，保证了检测的高特异性。而且这种茎环状结构的RT引物只与成熟的miRNA结合，消除了miRNA前体的非特异性扩增。得到的RT产物与miR-21特异引物以及荧光标记的探针一起进行优化的Real-time PCR反应，根据标准曲线可以定量分析PCR反应中模板的拷贝数，从而反应miR-21的表达水平。

2细胞培养：

白血病细胞K562用含10％新生牛血清的RPMI-1640培养基于37℃、体积分数为5％CO₂培养箱，饱和湿度条件下培养，0.25％的胰酶常规消化传代，2-3天传代一次。实验选用对数生长期、0.2％台盼蓝拒染率＞95％的细胞接种于培养板，加入Lipofectamine^TM2000-AMO反义核酸，每组药物均设3个复孔。

3 Lipofectamine^TM2000与AMO复合物的配制：

4实时定量PCR技术检测经AMO作用不同时间，白血病细胞K562中microRNA的水平：

①细胞培养：取对数生长期白血病细胞K562，用无血清RPMI-1640培养基调整细胞浓度为1.2×10⁵cells/mL，接种于24孔培养板，各组均设六复孔。24h后细胞贴壁达50％-70％时，吸尽培养液上清，更换无血清含AMO的RPMI-1640培养液，所有AMO复合物都是按质量比2.5∶1比例制备。每孔终体积500μL，置孵箱转染6h后，每孔加入500μL含20％血清RPMI-1640培养液继续培养。共设4组：AMO-miR-21组、AMO-miR-181a组、随机对照组和空白对照组。Lipofectamine^TM2000与AMO的质量比为2.5∶1，每组AMO终浓度为0.6μmol/L，空白对照组加入与药物同体积的血清RPMI-1640培养基，脂质体对照组加入与药物同体积同浓度的Lipofectamine^TM2000。

②RNA提取：分别培养48h、72h收集细胞，预冷D-hank’s液洗涤2次后，用0.25％胰蛋白酶-EDTA消化收集细胞，将每组细胞悬液收集到同一离心管中。1000r/min，离心8min，PBS洗二次，同样条件离心，去上清，每管加入TRIzol 1mL，加入200μL氯仿，充分震荡，室温静止放置10min，12000/转离心10min，吸取80％上清于另一EP管中，加入500μL异丙醇，混合均匀，10000r/min离心6分钟，去上清，沉淀用1mL75％(v/v)乙醇洗涤后，10000r/min离心6分钟，去上清，沉淀于超净台内干燥3-5min，加入20-50μL RNase freeH₂O。提取后的各组总RNA经紫外分析仪测吸光度并计算浓度后，调整成相同的浓度用来进行下一步的RT反应。提取的RNA均放入超低温冰箱保存。

③RT反应合成cDNA：按照Hairpin-it^TM miRNAs Real-Time PCRQuantitation Kit提供的说明书进行操作，反应为25μL体系。5×buffer 5μL；dNTP Mixture(10mM)0.75μL；MIR-RT Primers(1μM) 1.25μL；RNasin(40U/μL)0.25μL；MMLV Reverse Transcriptase(200U/μL)0.5μL；RNA sample 2μL；RNase free H₂O 15.25μL。反应参数：16℃ 30min→42℃ 30min→85℃ 5min。反应产物于-20℃保存。

④Real-Time PCR检测各组cDNA样品中miR-21，miR-181a的表达情况：

按照Hairpin-it^TMmiRNAs Real-Time PCR Quantitation Kit提供的说明书进行操作，反应为20μL体系。2×Real-Time PCR Master Mix 10μL；mir specificPrimer set(5μM)0.8μL；microRNA RT product 2μL；Taq DNA polymerase(5U/μL)0.2μL；ddH₂O0.7μL。PCR反应参数：

1.Incubate at 94℃ for 00:03:00

2.Incubate at 94℃ for 00:00:20

3.Incubate at 50℃ for 00:00:25

4.Plate Read

5.Incubate at 72℃ for OO:00:20

6.Goto line 2 for 45 more times

7.Incubate at 37℃ forever

5统计学分析：

所有数据采用均数±标准差

表示，使用统计软件SPSS 11.5，各组均数比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，P＜0.05表示差异有统计学意义。

6实验结果

终浓度为0.6μmol/L的AMO作用于白血病细胞K562 48h和72h，将所得到的模板同一批反应进行实时定量PCR检测。miR-21的标准曲线如图10所示，标准品的C_T值分别为8.30、13.00、17.07、20.98、25.36、28.57，相关系数为0.998，相关性很好。均以miR-21的标准曲线为参照，K562细胞中不同AMO组miR-21 C_T值如表3所示。经统计学分析，与随机对照组相比较，AMO作用于白血病细胞K562 48h和72h时，miR-21在白血病细胞K562中的表达量有显著的统计学差异(P＜0.05)，K562细胞中不同AMO组miR-21分子相应的摩尔数参看表4。

表3AMO作用于白血病细胞K562不同时间miR-21的C_T值比较

Table 3 Comparison on miR-21 C_T value of Leukemia cells after treatment withAMO at different times points(

，n＝3)

^*与随机对照组组比，^*P＜0.05

表4AMO作用于白血病细胞K562不同时间miR-21分子摩尔数比较

Table 4 Comparison on miR-21 moles of Leukemia cells after treatment with AMOat different times points(

，n＝3)

^*与随机对照组组比，^*P＜0.05

从表3和表4的实验结果可以看出，AMO-miR-21和AMO-miR-181a能够显著抑制白血病细胞K562的生长。

SEQUENCE LISTING

<110>暨南大学

<120>一种具有抗白血病作用的miR-21反义寡核苷酸及其应用

<160>2

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>22

<212>DNA

<213>AMO-miR-21序列

<400>1

tcaacatca gtctgataag cta 22

<210>2

<211>23

<212>DNA

<213>AMO-miR-181a序列

<400>2

actcaccgacagcgttgaatgtt 23

Claims

1.miR-21反义寡核苷酸在制备抑制白血病细胞K562生长的药物中的应用，其特征在于：所述miR-21反义寡核苷酸的碱基序列如下所示：5’-tcaacatcagtctgataagcta-3’。

2.根据权利要求1所述的miR-21反义寡核苷酸在制备抑制白血病细胞K562生长的药物中的应用，其特征在于：所述反义寡核苷酸经过化学修饰。

3.根据权利要求2所述的miR-21反义寡核苷酸在制备抑制白血病细胞K562生长的药物中的应用，其特征在于：所述反义寡核苷酸经过硫代修饰。

4.根据权利要求2所述的miR-21反义寡核苷酸在制备抑制白血病细胞K562生长的药物中的应用，其特征在于：所述反义寡核苷酸经过甲氧修饰。