CN101284792A - 双苄基异喹啉化合物及制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种乌药中双苄基异喹啉化合物及制备方法，通过将乌药干燥块根为原料，用醇溶剂提取后，提取液减压浓缩得到浸膏，将该浸膏经水溶解混悬、稀酸酸化后用有机溶剂萃取除去中性成分，水相再用弱碱调节pH至10，用有机溶剂萃取经溶剂回收后得到总生物碱的粗品，将此粗品以醇溶解、再加适量水沉淀处理后即得精制总生物碱，经氯仿－甲醇系统洗脱，及以水－甲醇梯度洗脱，收集洗脱部分，浓缩除去溶剂后即得。用本发明对L1210，K562肿瘤细胞株进行抑制活性实验，结果表明均有较强的细胞毒活性，且呈现量效关系，可在制备抗肿瘤药物中应用。本发明所述化合物具有以上结构式。

Description

双苄基异喹啉化合物及制备方法和应用

技术领域

本发明属医药技术领域，具体涉及一种以中药乌药为原料制备一种新双苄基异喹啉生物碱的方法及其在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

乌药为传统常用中药，是重要的温胃理气止痛药之一，具有温中散寒、理气止痛的功效。现代研究发现乌药的化学成分复杂，含丰富的呋喃倍半萜及其内酯、黄酮、挥发油、异喹啉生物碱等，具有抗病毒、抑菌、抗肿瘤、调节消化道、兴奋心肌、改善中枢神经系统功能、抗炎镇痛、防治糖尿病肾病、保护肝脏、调节凝血功能等药理作用。乌药中所含生物碱多为异喹啉生物碱，其中新木姜子碱(laureolistine)，波尔定碱(boldine)和牛心果碱(reticuline)为主要的三种异喹啉生物碱，在樟科植物中普遍存在(乌药的化学成分及药理作用.王峥涛，徐珞珊.中国野生植物资源，1999，18(3)，5-10.)。现代药理研究表明：乌药提取物对小鼠肉瘤S180抑制作用明显。乌药提取物可诱导小鼠产生细胞生长抑制因子，抑制肿瘤生长，延长患肺癌小鼠的生存期，而对正常细胞不显示任何毒性，疗效与剂量正相关(乌药的植化及药理研究概况.王军伟，阮冰.浙江中医杂志，2006，41(11)，675-677.)。但目前尚未发现乌药中含有双苄基异喹啉类生物碱，更未见乌药中该类生物碱的抗肿瘤细胞毒活性报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种乌药中提取的双苄基异喹啉化合物(Linderegatine，I)，具有以下结构式：

本发明的第二个目的是提供双苄基异喹啉化合物(I)的制备方法，通过以下步骤实现：乌药干燥块根切成薄片，粉碎后按药材/溶剂重量/体积比加入10倍量醇，室温浸提或回流提取2-3次，至提取物颜色较浅。合并提取液，减压浓缩得浸膏，用适量水将此浸膏混悬溶解，以无机酸酸化后用中极性有机溶剂萃取除去非生物碱成分，水相再用弱碱调节pH至10，用中极性有机溶剂萃取三次，有机溶剂层再用水反洗至中性，经溶剂回收后得到总生物碱的粗品；将此粗品以适量醇溶解，再加水保持醇含量≤60％使沉淀完全，离心或过滤后即得精制总生物碱，取精制乌药总生物碱，与硅胶拌样，加入装有硅胶的色谱柱顶端，以氯仿-甲醇溶剂系统从50∶1→25∶1洗脱，收集氯仿∶甲醇25∶1极性段洗脱部分，浓缩除去溶剂后经过反相C-18硅胶色谱，以水-甲醇溶剂系统从80∶20→40∶60梯度洗脱，收集水∶甲醇40∶60洗脱部分，浓缩除去溶剂后得目的化合物I。

本发明的另一个目的是提供双苄基异喹啉化合物在制备抗肿瘤药物中的应用有较强的细胞毒活性。

在用H9C2心肌细胞系缺氧复氧模型筛选具有心肌保护作用的药物时发现，总生物碱在10、30μg/ml的较低浓度下可增加细胞的存活率及降低细胞LDH的活性，但在90μg/ml的较高浓度下对心肌细胞具有一定的毒性。因此推测总生物碱中的微量成分可能具有较强的细胞毒活性。随后将研究重点放在微量活性成分的获得。在活性实验指导下，经过多级色谱分离(包括硅胶、氧化铝、反相硅胶及凝胶色谱)得到了化合物I，通过多种波谱技术测试，包括紫外光谱(UV)、红外光谱(IR)、质谱(MS)、核磁共振(NMR)，在对波谱信息进行详细的解析后确证结构为含有高度不饱和共轭体系的双苄基异喹啉生物碱。将该化合物I配制成90μM/L，30μM/L和10μM/L三个浓度对L1210，K562肿瘤细胞株进行抑制活性实验，结果表明三个浓度均有较强的细胞毒活性，且呈现量效关系。

本发明的有益之处是：

(1)首次从乌药中发现具有高度不饱和共轭体系的双苄基异喹啉生物碱，提供了化合物I的制备方法及波谱数据，为今后继续从乌药中发现结构新颖的该类化合物奠定了基础；

(2)首次发现化合物I对肿瘤细胞有强抑制作用，对化合物I进行构效关系研究，通过计算机辅助合理设计后，将有可能通过化学合成得到活性更强的抗肿瘤先导化合物或药物；

(3)化合物I在对肿瘤细胞产生强抑杀作用的浓度下，对正常细胞几乎没有毒性，提示该化合物具有较好的开发成抗肿瘤新药前景。

附图说明

图1为乌药总生物碱的高效液相色谱图。

具体实施方式

本发明结合具体实施例和附图作进一步的说明。

实施例1化合物I的理化及UV、IR、MS波谱数据如下：

化合物I为浅黄色固体，[α]_D ²⁰-16°(c 1.0，MeOH)；电喷雾质谱(ESIMS)(正离子型positive)m/z 595[M+H]⁺(100)；(负离子型negative)m/z 593(100)；UV(MeOH)λ_max nm(logε)：207(5.30)，288(4.87)；IR(KBr)v_max cm^-1 3405，2937，2842，1664，1588，1510，1450，1371，1276，1228，1135，1028，756。

化合物I的¹H NMR，¹³C NMR数据及归属参见表1，每个氢、碳信号的归属通过测试二维核磁共振谱(碳-氢相关谱，碳-氢远程相关谱，核Overhauser效应二维相关谱)获得。

表1.化合物I的¹H(400MHz)和¹³C(100MHz)NMR数据及信号归属(CD₃OD溶剂)

No	δH(multi，J in Hz)	δC	No	δH(multi，J in Hz)	δC
						1		167.8	1′	4.45(dd，6.1，8.0)	57.3
3	3.79(2H，m)	47.8	3′	a 3.37(1H，m)b 3.15(1H，m)	40.6
						4	2.83(2H，m)	26.0	4′	2.89(2H，m)	26.9
4a		131.4	4′a		124.6
						5	6.90(1H，s)	111.9	5′	6.68(1H，s)	112.6
6		152.6	6′		148.8
						7		146.4	7′		146.2
8	6.67(1H，s)	114.4	8′	6.48(1H，s)	114.4
						8a		120.3	8a′		126.4
α		194.4	α′	a 3.25(1H，dd，14.0，6.1)b 3.03(1H，dd，14.0，8.0)	40.7
						9		130.3	9′		130.8
10，14	7.91(2H，d，8.8)	133.6	10′	6.93(1H，s)	124.8
						11，13	6.91(2H，d，overlap)	117.0	11′		144.0
12		165.0	12′		152.3
						6-OCH3	3.90(3H，s)	56.5	13′	7.13(1H，d，8.4)	114.6

			14′	7.20(1H，d，8.3)	128.7
									6′-OCH3	3.78(3H，s)	56.3
			12′-OCH3	3.74(3H，s)	56.3

实施例2

乌药5kg干燥块根切成薄片，粉碎后加入50L乙醇，渗漉提取二次，第一次7天，滤液收集后补加50L乙醇继续渗漉5天。合并两次提取液后减压浓缩得浸膏，用10L水将此浸膏混悬溶解，以2N HNO₃酸化后用等体积乙酸乙酯萃取三次，乙酸乙酯层回收溶剂后弃去。水相再用5％Na₂CO₃调节pH至10，用等体积乙酸乙酯萃取二次，合并乙酸乙酯萃取液，用蒸馏水洗至中性，经减压回收乙酸乙酯后得到32.3g总生物碱的粗品。将此粗品以3L乙醇溶解，再加水使乙醇含量为60％，静置后使沉淀完全，过滤、干燥后即得12.8g精制总生物碱。

取上述精制乌药总生物碱，与15g硅胶拌样，加入装有600g硅胶的色谱柱顶端，以氯仿-甲醇溶剂系统从50∶1→25∶1洗脱，收集氯仿∶甲醇25∶1极性段洗脱部分，浓缩除去溶剂后经过反相C-18硅胶色谱，以水-甲醇溶剂系统从80∶20→40∶60梯度洗脱，收集水∶甲醇40∶60洗脱部分，浓缩除去溶剂后得316mg化合物I。

实施例3

乌药3kg干燥块根切成薄片，粉碎后加入30L甲醇，回流提取二次，第一次2小时，提取液过滤后补加24L甲醇继续回流提取1小时。合并两次提取液后减压浓缩得浸膏，用6L水将此浸膏混悬溶解，以3N HCl酸化后用等体积氯仿萃取三次，氯仿层回收溶剂后弃去。水相再用氨水调节pH至10，用等体积氯仿萃取二次，合并氯仿萃取液，用蒸馏水洗至中性，经减压回收氯仿后得到21.7g总生物碱的粗品。将此粗品以3L甲醇溶解，再加水使甲醇含量为50％，静置后使沉淀完全，过滤、干燥后即得8.6g精制总生物碱。

取上述精制乌药总生物碱，与10g氧化铝拌样，加入装有260g氧化铝的色谱柱顶端，以氯仿-甲醇溶剂系统从50∶1→30∶1洗脱，收集氯仿∶甲醇30∶1极性段洗脱部分，浓缩除去溶剂后经过凝胶Sephadex LH-20柱色谱，以甲醇为洗脱剂，TLC检测获得含化合物I的流份，浓缩除去溶剂后得到198mg化合物I。

经实施例1-3方法得到的乌药总生物碱纯度较高，主要含有三种成分，高效液相色谱HPLC归一化法测得三个化合物(化合物a，b，c)的含量之和超过85％，此外还含有一微量成分化合物I，参见附图1，其中1为化合物a(norboldine)；2：化合物b(boldine)；3：化合物c(reticuline)；4：化合物I(linderegatine)，结构式如下：

化合物a                   化合物b                  化合物c

实施例4化合物I的中试制备

乌药100kg干燥块根切成薄片，粉碎后加入1000L乙醇，回流提取二次，第一次2小时，提取液过滤后补加800L乙醇继续回流提取1小时。合并两次提取液后减压浓缩得浸膏，用200L水将此浸膏混悬溶解，以2N HCl酸化后用等体积乙酸乙酯萃取三次，乙酸乙酯层回收溶剂后弃去。水相再用氨水调节pH至10，用等体积乙酸乙酯萃取二次，合并乙酸乙酯萃取液，用蒸馏水洗至中性，经减压回收乙酸乙酯后得到766g总生物碱的粗品。将此粗品以80L醇溶解，再加水使乙醇含量为40％，静置后使沉淀完全，过滤、干燥后即得362g精制总生物碱。取上述精制乌药总生物碱，与400g氧化铝拌样，加入装有8kg氧化铝的色谱柱顶端，以氯仿-甲醇溶剂系统从50∶1→30∶1洗脱，收集氯仿∶甲醇30∶1极性段洗脱部分，浓缩除去溶剂后经过反相C-18硅胶色谱，以水-甲醇溶剂系统从80∶20→40∶60梯度洗脱，收集水∶甲醇40∶60洗脱部分，TLC检测获得含化合物I的流份，合并浓缩除去溶剂后得到7.9g化合物I。

实施例5乌药总生物碱及化合物I的药理活性研究

5.1.实验材料

L1210，K562肿瘤细胞株，PAA血清，H-DMEM

5.2.实验方法

5.2.1.药物配制：将乌药总生物碱(LAA)配制成90μg/ml，30μg/ml和10μg/ml三个浓度，化合物I(Linderegatine)配制成90μM/L，30μM/L和10μM/L三个浓度。

5.2.2.将H9C2，L1210，K562细胞株按10000个细胞/孔接种到96孔板中，加入各种浓度的药物，培养48小时后，用MTT孵育4小时，检测细胞存活率。

5.2.3.统计方法：所有数据用t-text进行统计分析。

5.3.结果参见表2.

表2.乌药总碱及Linderegatine细胞毒活性测试数据

通过细胞毒实验，可知乌药总碱在90μg/ml的较高浓度下对心肌细胞产生一定的毒性，而化合物I在10、30μM的较低浓度下对两株肿瘤细胞L1210及K562均有很强的细胞毒活性，而在10μM的浓度下对正常心肌细胞几乎没有毒性，提示该化合物具有潜在的抗肿瘤价值，可望开发成抗肿瘤新药或作为先导化合物进行研究开发。

实施例6.化合物I(Linderegatine)制剂的制备

6.1.制成片剂

取化合物I(Linderegatine)3.0g与淀粉10g混匀，加10％淀粉浆3g制成软材，加入硬脂酸镁0.3g，干淀粉2g混匀后压制成100片，即得。每片含乌药总碱30mg。

6.2.制成注射剂

取化合物I(Linderegatine)1.0g，加入10g甘露醇，加注射用水至1000ml加热溶解，经0.22μm微孔滤膜过滤后每瓶2ml分装于5ml的西林瓶内，每瓶含Linderegatine 2.0mg，放入真空冷动干燥机内冻干，取出后轧盖包装即得。

Claims (5)

1.一种双苄基异喹啉化合物的制备方法，其特征是具有以下结构式：

2.一种双苄基异喹啉化合物的制备方法，其特征是通过以下步骤实现：乌药干燥块根切成薄片，粉碎后按药材/溶剂重量/体积比加入10倍量醇，室温浸提或回流提取2-3次，至提取物颜色较浅。合并提取液，减压浓缩得浸膏，用适量水将此浸膏混悬溶解，以无机酸酸化后用中极性有机溶剂萃取除去非生物碱成分，水相再用弱碱调节pH至10，用中极性有机溶剂萃取三次，有机溶剂层再用水反洗至中性，经溶剂回收后得到总生物碱的粗品；将此粗品以适量醇溶解，再加水保持醇含量≤60％使沉淀完全，离心或过滤后即得精制总生物碱，取精制乌药总生物碱，与硅胶拌样，加入装有硅胶的色谱柱顶端，以氯仿-甲醇溶剂系统从50∶1→25∶1洗脱，收集氯仿∶甲醇25∶1极性段洗脱部分，浓缩除去溶剂后经过反相C-18硅胶色谱，以水-甲醇溶剂系统从80∶20→40∶60梯度洗脱，收集水∶甲醇40∶60洗脱部分，浓缩除去溶剂后得目的化合物I。

3.权利要求1所述的双苄基异喹啉化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

4.根据权利要求2所述的双苄基异喹啉化合物的应用，其特征是：所述双苄基异喹啉化合物与制剂允许的药用辅料制备成药物。

5.根据权利要求3所述的双苄基异喹啉化合物的应用，其特征是：所述药物的制剂形式为注射剂或片剂。

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