CN101624629A - 单管中多重靶核酸的pcr检测方法及其试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及在单个PCR反应容器中多重检测样品中一种或几种靶核酸的实时PCR方法，其包括，(1)在所述单个PCR反应容器中混合样品、DNA聚合酶、dNTP、内对照核酸、靶核酸引物对、内对照核酸引物对、一种或几种靶核酸探针和内对照核酸探针，其中前述各种探针标记有荧光基团和淬灭基团，而且各种探针标记的荧光基团的荧光检测波长互不相同；(2)进行PCR反应，并实时检测不同波长的荧光；和(3)根据荧光检测结果计算出的Ct值判断是否有一种或几种靶核酸存在于样品中。另外，本发明还涉及用于上述方法的检测试剂盒和相应检测试剂盒的制备应用等。该多重检测方法无需专门设备，因此可广泛用于实验室研究、食品安全、医药卫生等众多领域。
Description
技术领域
本发明属于核酸检测技术领域，具体而言，本发明涉及在单个PCR反应容器中多重检测样品中靶核酸的PCR方法。另外，本发明还涉及上述PCR方法中所涉及的试剂，如内对照、引物、探针等，以及用于上述方法的检测试剂盒和相应检测试剂盒的制备应用等。
背景技术
聚合酶链反应(PCR)是当今核酸检测中最常用的技术之一，其中实时(Real Time)PCR技术采用了诸如荧光标记等可实时检测的标记，在核酸检测、临床诊断及分子生物学研究等方面的功用显得越来重要。这类技术目前应用领域非常广泛，已经在实验室研究、食品安全、医药卫生等众多行业中得以使用了。除了常规的实时PCR检测，近年来人们对实时PCR检测也做了大量改进工作。例如，中国专利申请CN1768151A、CN101189505A、CN101273262A、CN101302473A等均记载了对传统的实时PCR的改进。但是，传统和改进的实时PCR(尤其是实时荧光PCR)在进行实际样品的检测时，即使仅检测单一靶核酸，也必须面对样品中可能存在的多种核苷酸对检测结果的干扰；当在单个PCR反应容器中进行多重靶核酸检测(即同时检测多种靶核酸)时，由于要同时引入检测不同种靶核酸的引物和探针，因此还进一步需要面对不同的引物和探针的相互干扰的问题。而面对这些难题，现有技术中往往采用操作复杂、成本高的处理手段，甚至某些无法引入内对照监测系统来排除假阴性，或者引入的内对照(分子)本身(通常是核酸)进一步加剧了与多种靶核酸、引物及其探针之间的相互干扰。
为了克服现有技术的不足，经过长期艰苦努力，本发明人令人惊讶地通过优选结果判别方法、优化样品处理方法、选择内对照基因并任选包装成病毒样颗粒、和/或筛选出了引物和不同波长区域的荧光标记的探针，开发出了在单个PCR反应容器(如，单个PCR反应管)中多重检测样品中靶核酸的PCR方法，克服了实时荧光PCR开发中普遍遇到的多重引物/探针容易交叉污染及灵敏度相对低的技术难点，而且对于单管检测，操作方便并节省成本，同时采用全程内对照监控系统，保证试验的准确性。经过大量样本的验证，结果可靠，而且使用目前常规的市售实时荧光PCR设备，无需改造，就能使其特异性、灵敏度、重复性等技术指标均达到国际先进水平。另外，本发明人还发明了用于上述方法的试剂，如内对照、引物、探针等，以及检测试剂盒和相应检测试剂盒的制备应用等。
发明内容
本发明的目的在于提供在单个PCR反应容器中多重检测样品中靶核酸的实时PCR方法，该方法通过优化结果判别方法、优化样品处理方法、优化内对照基因并优化其包装形式、和/或优化出互不干扰的引物、探针以及荧光标记，可以在单个PCR反应容器中同时分辨出样品中是否存在的不同种靶核酸，尤其可以同时分辨出RNA和DNA靶核酸，而无需专门设备或试剂，也无需引入复杂实验步骤，就能得到高特异性、灵敏度和重复性的结果。另外，本发明的目的还在于提供上述方法的检测试剂盒和相应检测试剂盒的制备应用等。
具体而言，在第一方面，本发明提供了在单个PCR反应容器中多重检测样品中一种或几种靶核酸的实时PCR方法，其包括，
(1)在所述单个PCR反应容器中混合样品、DNA聚合酶、dNTP(即dATP、dCTP、dGTP和dTTP)、内对照核酸、靶核酸引物对、内对照核酸引物对、一种或几种靶核酸探针和内对照核酸探针，其中前述各种探针标记有荧光基团和淬灭基团，而且各种探针标记的荧光基团的荧光检测波长互不相同；
(2)进行PCR反应，并实时检测不同波长的荧光；和
(3)根据荧光检测结果计算出的Ct值判断是否有一种或几种靶核酸存在于样品中。
在本发明的第一方面，所述实时PCR方法所检测的样品是潜在可能含有靶核酸的离体样品，如食品、血液、血液制品、唾液、医疗用品或药品等。所述实时PCR方法仅限于对离体样品的检测，检测的直接结果是靶核酸的存在性与否。即使对于利用本发明的检测方法检测人或动物的血液样品中病原体(如，病毒)上的靶核酸，也只能直接得出靶核酸的存在与否，还需要有经验的医生或取样人员判断检测出的靶核酸是来自于血液中的病原体还是取样时不慎污染的病原体，而不能直接得到疾病的诊断结果或健康状况；即使靶核酸来自于血液中的病原体，也只能说明相应人或动物是相应病原体的携带者，还需要有经验的医生根据相应人或动物的体质、病史、临床症状等综合情况才能判断出是否会造成疾病或对健康状况有影响。优选在本发明的第一方面的方法中，样品是经过预处理而富集了核酸(如靶核酸)的样品，如样品是经过磁珠提取法处理过的样品。非特异性的磁珠提取法采用表面涂有非特异性核酸吸附类物质的顺磁性颗粒，在低pH(如，pH值5～7)和高盐浓度的情况下核酸可以吸附到顺磁性颗粒表面，在进行磁分离和充分洗涤后，在高pH(如，pH值8～9)、低盐浓度的条件下可将核酸洗脱下来，由此富集了核酸(如靶核酸)的样品可用于PCR试验；另外还可以采用特异性吸附(如杂交吸附和免疫吸附)的磁珠提取法。这些处理过程对于本领域技术人员来说是熟知的，也可参见郑秀芬等，模板DNA磁珠提取法.中国法医学杂志，18(3)：107-108；中国专利申请200610030229.5等。
在本文中，“单个PCR反应容器”指所述实时PCR方法在技术上是在同一个容器中进行的，没有必要更换容器。最优选其中所述容器是PCR反应管，其它可以进行PCR反应并可进行实时荧光检测的容器也在本发明的保护范围内。在本发明第一方面的实时PCR方法中，在同一个容器中就可以完成PCR扩增和实时检测的步骤，整个过程不必更换容器，因而方便了操作者。操作者只需要向容器中加入样品与各种试剂即可，就可以通过市售的普通实时荧光PCR仪来自动完成，整个过程操作者只需添加样品和试剂即可，非常方便。尤其是，整个过程只需添加样品和试剂的步骤干预，便于实现全自动操作，如使用中国专利申请2007100030261公开的自动微量加液系统(即，吸取和分配实验液体的移液装置及带有该装置的PCR仪)，即可完成本发明检测方法的全过程自动化，从而节约了人力成本并最大程度降低了人为失误的可能性，因此本发明的检测方法便于自动化所带来的成本和可靠性优势是可以预期的。
在本文中，“多重检测”指的是同时检测的核酸有多种，即至少两种。在本发明的第一方面的方法中，由于至少检测了内对照核酸和一种靶核酸，因此检测的核酸至少有两种。当要检测的靶核酸种类不止一种时，和/或作为内对照的内对照核酸种类不止一种时，则同时检测的核酸相应增加。其中，每种核酸可以是RNA，也可以是DNA。在本发明的具体实施方式中，优选进行二重检测、三重检测、四重检测、或五重检测。多种靶核酸中优选既有RNA靶核酸，也有DNA靶核酸。同样，多种内对照核酸中优选既有RNA内对照核酸，也有DNA内对照核酸。
优选在本发明的第一方面的方法中，在步骤(1)中所述单个PCR反应容器中还进一步混合有PCR反应所需的其他试剂，如pH缓冲剂和盐。另外，还优选了甘油浓度，用以延长PCR条件下酶活耐久力。在本发明的具体实施方式中，pH缓冲剂优选是Tris.HCl；盐优选是KCl。本领域技术人员还可以容易地选择出其他pH缓冲剂(如磷酸缓冲液等)来调节到合适的pH，也可以容易地选择出其他可溶性盐(如氯化镁等)来调节离子强度。另外，还可以进一步混合有抗氧化剂(还原剂)、蛋白(酶)保护剂(如，牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)等)。这些成分的选择对于本领域技术人员来说都是熟知的。
优选在本发明的第一方面的方法中，在步骤(1)中所述单个PCR反应容器中还进一步混合有反转录酶，例如，常见的反转录酶有禽类成髓细胞病毒(AMV)反转录酶或Moloney鼠白血病病毒(MLV)反转录酶。这样，本发明的第一方面的方法除了可以进行常规PCR反应(扩增)，用以扩增DNA类靶核酸和内对照核酸，而且可以进行反转录PCR(RT-PCR)，用以扩增RNA类靶核酸和内对照核酸。此时，步骤(2)进行的PCR反应就是RT-PCR反应。更优选在步骤(1)中所述单个PCR反应容器中还混合有RNA酶抑制剂，如RNasin。这样，在RT-PCR反应中能防止RNA模板降解。
优选在本发明的第一方面的方法中，其中靶核酸优选有一种、两种或三种，其中每种靶核酸分别是RNA或DNA，优选是病原体RNA或DNA，更优选是病毒RNA或DNA，如优选是HCV(丙型肝炎病毒，其为RNA病毒)RNA、HIV(人免疫缺陷病毒，其为RNA病毒)RNA或HBV(乙型肝炎病毒，其为DNA病毒)DNA，最优选是HCV的5’非编码区RNA、HIV的gag基因RNA或HBV的编码S抗原的基因DNA。例如，检测的靶核酸可以是HCV RNA、HIV RNA和HBV DNA中的一种、两种或三种。在本发明的具体实施方式中，靶核酸的示例有HCV的5’非编码区RNA、HIV的gag基因RNA和HBV的编码S抗原的基因DNA。
在本发明的第一方面的方法中，内对照核酸是不结合靶核酸探针的核酸，优选是新霉素抗药性基因或其片段，也优选内对照核酸被包装在病毒样颗粒内。内对照核酸的种类优选与靶核酸的种类相同。如，靶核酸是DNA，则相应的内对照核酸是RNA；而靶核酸是RNA，则相应的内对照核酸是DNA；多种靶核酸中既有DNA也有RNA，则内对照核酸有两种，分别是DNA和RNA，分别用于作为DNA和RNA类靶核酸的内对照。本发明人经过核酸序列数据库的比对以及长期检测实践，发现新霉素抗药性基因与HCV的5’非编码区RNA、HIV的gag基因RNA和HBV的编码S抗原的基因DNA的序列差别很大，难以互相结合对方的探针，从而难以互相干扰，因而可以用于作为有效排除假阴性结果的对照。优选DNA内对照核酸的核苷酸序列包括Seq ID NO：16所示的序列或如Seq ID NO：16所示；优选RNA内对照核酸的核苷酸序列包括Seq ID NO：17所示的序列或如Seq ID NO：17所示。为了使内对照核酸更加类似于病原体，优选内对照核酸被包装在病毒样颗粒(包括假病毒)内，优选被包装在噬菌体病毒样颗粒内，如RNA内对照核酸可以被包装在MS2噬菌体或TMV等中，DNA内对照核酸可以被包装在M13噬菌体等中。本领域技术人员已知这些包装技术，如可参见张玉松等，假病毒的最新应用研究进展。医学研究杂志，37(6)：116-118；张括等，RNA噬菌体病毒样颗粒包装机制及其应用研究进展.微生物与感染，3(2)：111-114；陈信忠等，实时荧光定量RT-PCR检测石斑鱼病毒性神经坏死病.高技术通讯，16(4)：431-434；18(3)：107-108等。
在本发明的第一方面的方法中，不同种探针(包括不同种靶核酸探针、不同种内对照核酸探针)之间所标记的荧光基团的荧光检测波长互不相同，这样能够同时或快速地顺序扫描不同的检测波长，分别记录下各种荧光基团的荧光变化，从而能够进行同时检测。在本文中，探针具有本领域技术人员所熟知的含义，其由为能与扩增出的靶核酸单链结合的单链DNA。通常，在每种探针的核苷酸序列的5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团。优选其中各种探针标记有不同的荧光基团。优选荧光基团及其淬灭基团是市售的，如可以采用FAMTM/
Green I、
/JOE/HEX、NEDTM/TAMRATM/
ROXTM/Texas
和
等常规产品，它们的检测波长互不相同，也可以委托公司合成标记有荧光标记的探针。在本发明的具体实施方式中，其中采用的标记有不同检测波长的荧光标记的探针都是委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成的，纯度达到HPLC纯，不含杂带。
对于在本发明的第一方面的方法中优选针对的靶核酸，也优选针对这些优选的靶核酸设计靶核酸探针的核苷酸序列，更优选靶核酸探针的核苷酸序列选自HBV的编码S抗原的基因中的连续序列或其互补序列、HCV的5’非编码区中的连续序列或其互补序列、和HIV的gag基因中的连续序列或其互补序列，最优选选自Seq ID No：11或其互补序列、Seq ID No：12或其互补序列、和Seq ID No：13或其互补序列。这些最优选的探针的核苷酸序列在同时检测时不会结合其他靶核酸和内对照核酸。相应地，对于在本发明的第一方面的方法中优选针对的靶核酸，也优选针对这些优选的靶核酸设计引物对。在本文中，引物对具有本领域技术人员所熟知的含义，其由分别为单链DNA的上游引物和下游引物组成，能用于扩增相应基因或其片段。优选靶核酸引物所扩增的基因或片段选自HBV的编码S抗原的基因或之中、HCV的5’非编码区或之中、和HIV的gag基因或之中，最优选的靶核酸引物对选自Seq IDNo：1和2、Seq ID No：3和4、以及Seq ID No：5和6。
另外，对于在本发明的第一方面的方法中优选使用的内对照核酸，也优选针对这些优选的内对照核酸设计内对照核酸探针的核苷酸序列，更优选内对照核酸探针的核苷酸序列选自新霉素抗药性基因中的连续序列或其互补序列，最优选内对照核酸探针的核苷酸序列是SeqID No：14或15，Seq ID No：14针对DNA内对照核酸，Seq ID No：15针对RNA内对照核酸。这些最优选的探针的核苷酸序列在同时检测时不会结合其他内对照核酸和靶核酸。相应地，对于在本发明的第一方面的方法中优选使用的内对照核酸，也优选针对这些优选的内对照核酸设计引物对。优选内对照核酸引物所扩增的基因或片段选自新霉素抗药性基因或之中，最优选的内对照核酸引物对选自SeqIDNo：7和8、以及SeqIDNo：9和10。
本领域技术人员能够根据引物及相应需要PCR扩增的核酸来设计PCR反应条件。对于多重检测，为了平衡不同种核酸的扩增条件，本发明人经过长期摸索，优化出的条件为：PCR反应的每个循环的条件为94℃ 10秒、50℃ 10秒以及65℃45秒。在本发明的具体实施方式中，PCR反应优选先50℃保温2分钟并94℃变性3分钟，然后进行上述条件的45个循环；对于需要进行RT-PCR的反应来说，在前述PCR反应前还进行42℃保温30分钟，以进行反转录。
在实时荧光PCR反应中，Ct值表示每个PCR反应管内荧光信号到达实时荧光PCR仪所默认设定的阈值时所经历的循环数，其具有良好的再现性，因此可以用于作为判读结果的优良指标。默认设定的阈值优选为3～15循环的荧光信号的标准偏差的10倍。优选在本发明的第一方面的方法中，对于步骤(3)，其中一种靶核酸的荧光检测结果计算出的Ct值≤45，则这种靶核酸存在于样品中；一种靶核酸的荧光检测结果计算出的Ct值＞45，而且相应内对照核酸的荧光检测结果计算出的Ct值＜30，则这种靶核酸不存在于样品中。这是我们经过长期大量试验摸索出来的经验。其他情况，即一种靶核酸的荧光检测结果计算出的Ct值＞45，而且相应内对照核酸的荧光检测结果计算出的Ct值≥30，则需要重新测量。这样简单的判读用人工即可完成，避免了很复杂的试剂或仪器的使用。
在第二方面，本发明提供了用于本发明第一方面所述方法的检测试剂盒，其包括DNA聚合酶、dNTP、内对照核酸、靶核酸引物对、内对照核酸引物对、一种或几种靶核酸探针和内对照核酸探针，其中前述各种探针标记有荧光基团和淬灭基团，而且各种探针标记的荧光基团的荧光检测波长互不相同。其中，不同的试剂可以分装在不同容器中，也可以选择几种长期保存而不发生化学反应的试剂合并保存在相同的容器中。容器可以是瓶、盒、注射器等能容纳上述试剂的容器，例如常规用于装PCR、酶或核酸试剂的容器。检测试剂盒中还可以有标签或说明书，用以指示按照本发明第一方面所述方法进行操作。标签可以贴在上述容器上，或者直接打印到上述容器上，也可以提供独立的说明书。根据需要，如方便运输、存放的需要，试剂盒还可以进一步包装进更大的包装中，这样的产品也在本发明的范围内。
对于本发明第二方面的检测试剂盒，其中优选的各成分如本发明第一方面所述的那样优选。优选诸如，其中还进一步包括反转录酶；其中还进一步包括磁珠提取法所需试剂，如磁珠、裂解液、洗涤液等；其中内对照核酸是新霉素抗药性基因或其片段，优选所述基因或其片段被包装在病毒样颗粒内；各种探针标记有不同的荧光基团；其中靶核酸探针的核苷酸序列选自HCV的5’非编码区中的连续序列或其互补序列、HIV的gag基因中的连续序列或其互补序列、HBV的编码S抗原的基因中的连续序列或其互补序列；和/或，其中内对照核酸探针的核苷酸序列选自新霉素抗药性基因中的连续序列或其互补序列。最优选其中内对照核酸、各种探针、各种引物的核苷酸序列选自本说明书所附的序列表中的序列。
在第三方面，本发明提供了本发明第二方面所述的检测试剂盒在制备用于本发明第一方面所述方法的检测试剂产品中的应用。检测试剂产品可以是检测试剂盒本身，也可以是合并装有多个检测试剂盒的更大包装产品。根据前文所述，本领域技术人员很容易理解其中检测试剂盒的成分以及其中方法的流程。
为了便于理解，以下将通过具体的附图、实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。另外，本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。
附图说明
图1显示了示例性的本发明实施例中的二重实时PCR的检测图谱。
图2显示了示例性的本发明实施例中的三重实时PCR的检测图谱。
图3显示了示例性的本发明实施例中的四重实时PCR的检测图谱。
图4显示了示例性的本发明实施例中的五重实时PCR的检测图谱。
具体实施方式
以下本文将通过具体的实施例来描述发明。如未特别指明之处，可根据本领域技术人员所熟悉的《分子可隆实验指南》(第三版)(Cold Spring Harbor laboratory Press)、《细胞实验指南》(科学出版社，北京，中国，2001年)、《RNA实验技术手册》(科学出版社，北京，中国，2004年)、《免疫检测技术》(科学出版社，北京，中国，1991)等实验手册以及本文所引用的参考文献中所列方法来实施。其中所用的探针、引物可以委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
实施例1双重实时PCR反应
1.DNA类靶核酸双重Real Time(实时)PCR反应
用于检测HBV DNA和DNA内对照核酸(Seq ID No：16)
引物
扩增HBV DNA的引物为HBV-FQ-L1(Seq ID No：1)和HBV-FQ-R1(Seq ID No：2)；扩增DNA内对照核酸的引物为IC309L1(Seq ID No：7)和IC309R1(Seq ID No：8)
荧光探针
HBV的荧光探针的核苷酸序列为HBV-FQ-P1(Seq ID No：11)，其5’端采用FAM标记，3’端标记相应的淬灭基团；DNA内对照核酸探针的核苷酸序列为IC-FQ-P1(Seq IDNo：14)，其5’端采用ROX标记，3’端标记相应的淬灭基团。
PCR反应条件
PCR反应体系总体积为60μl，其中各组分的浓度分别为：Tris.HCl pH8.3 10mM；KCl50mM；dNTP各0.2mM；Taq DNA聚合酶2U；各种引物各15pM/种；各种荧光探针各5pM/种；甘油5％(v/v)；内对照核酸各100个拷贝数；各种靶核酸样品均为国家卫生部临检中心标准样品。
反应热循环条件如下：
| 50℃ 2分钟 | 94℃ 3分钟 | |||
| (94℃ 10秒 | 50℃ 10秒 | 65℃ 45秒) | *45个循环 |
使用ABI 7500实时荧光PCR仪，荧光采集FAM和ROX检测波长。
结果判断
结果分析条件设定：ABI 7500荧光仪的基线自动设定，荧光阈值设定为3～15循环的荧光信号的标准偏差的10倍。如FAM层Ct值＞45且ROX层Ct值＜30，则判定为HBV DNA阴性；如FAM层Ct值＞45且ROX层Ct值≥30，则需要重检；
如FAM层Ct值≤45，则判定为HBV DNA阳性。具体检测图谱如图1A所示。
2.RNA类靶核酸双重实时PCR反应
用于检测HCV RNA和RNA内对照核酸(其转录的DNA序列同Seq ID No：17)
引物
扩增HCV RNA的引物为HCV-F-L1(Seq ID No：3)和HCV-F-R1(Seq ID No：4)；扩增RNA内对照核酸的引物为IC-F-L2(Seq ID No：9)和IC-F-R2(Seq ID No：10)。
荧光探针
HCV的荧光探针的核苷酸序列为HCV-FQ-P1(Seq ID No：12)，其5’端采用FAM标记，3’端标记相应的淬灭基团；RNA内对照核酸探针的核苷酸序列为IC-F-P2(Seq ID No：15)，其5’端采用HEX标记，3’端标记相应的淬灭基团。
PCR反应条件
PCR反应体系总体积为60μl，其中各组分的浓度分别为：Tris.HCl pH8.3 10mM；KCl50mM；dNTP各0.2mM；Taq DNA聚合酶2U；M-MLV反转录酶25U；RNasin 10U；各种引物各15pM/种；各种荧光探针各5pM/种；甘油5％(v/v)；内对照核酸各100个拷贝数；各种靶核酸样品均为国家卫生部临检中心标准样品。
反应热循环条件如下：
| 42℃ 30分钟 | 50℃ 2分钟 | 94℃ 3分钟 | ||
| (94℃ 10秒 | 50℃ 10秒 | 65℃ 45秒) | *45个循环 |
使用ABI 7500实时荧光PCR仪，荧光采集FAM和HEX检测波长。
结果判断
结果分析条件设定：ABI 7500荧光仪的基线自动设定，荧光阈值设定为3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。。如FAM层Ct值＞45且HEX层Ct值＜30，则判定为HCV RNA阴性；如FAM层Ct值＞45且HEX层Ct值≥30，则需要重检；如FAM层Ct值≤45，则判定为HCV RNA阳性。具体检测图谱如图1B所示。
用于检测HIV-1 RNA和RNA内对照核酸(其转录的DNA序列同Seq ID No：17)
引物
扩增HCV RNA的引物为HIV-F-L1(Seq ID No：5)和HIV-F-R1(Seq ID No：6)；扩增RNA内对照核酸的引物为IC-F-L2(Seq ID No：9)和IC-F-R2(Seq ID No：10)。
荧光探针
HIV的荧光探针的核苷酸序列为HIV-F-P1(Seq ID No：13)，其5’端采用FAM标记，3’端标记相应的淬灭基团；RNA内对照核酸探针的核苷酸序列为IC-F-P2(Seq ID No：15)，其5’端采用HEX标记，3’端标记相应的淬灭基团。
PCR反应条件
PCR反应体系总体积为60μl，其中各组分的浓度分别为：Tris.HCl pH8.3 10mM；KCl50mM；dNTP各0.2mM；Taq DNA聚合酶2U；M-MLV反转录酶25U；RNasin 10U；各种引物各15pM/种；各种荧光探针各5pM/种；甘油5％(v/v)；内对照核酸各100个拷贝数；各种靶核酸样品均为国家卫生部临检中心标准样品。
反应热循环条件如下：
| 42℃ 30分钟 | 50℃ 2分钟 | 94℃ 3分钟 | ||
| (94℃ 10秒 | 50℃ 10秒 | 65℃ 45秒) | *45个循环 |
使用ABI 7500实时荧光PCR仪，荧光采集FAM和HEX检测波长。
结果判断
结果分析条件设定：ABI 7500荧光仪的基线自动设定，值荧光阈值设定为3～15循环的荧光信号的标准偏差的10倍。如FAM层Ct值＞45且HEX层Ct值＜30，则判定为HIV-1 RNA阴性；如FAM层Ct值＞45且HEX层Ct值≥30，则需要重检；如FAM层Ct值≤45，则判定为HIV-1 RNA阳性。具体检测图谱如图1C所示。
实施例2三重实时PCR反应
1.RNA类靶核酸三重实时PCR反应
用于检测HCV RNA、HIV-1 RNA和RNA内对照核酸(其转录的DNA序列同Seq IDNo：17)
引物
扩增HCV RNA的引物为HCV-F-L1(Seq ID No：3)和HCV-F-R1(Seq ID No：4)；扩增HCV RNA的引物为HIV-F-L1(Seq ID No：5)和HIV-F-R1(Seq ID No：6)；扩增RNA内对照核酸的引物为IC-F-L2(Seq ID No：9)和IC-F-R2(Seq ID No：10)。
荧光探针
HCV的荧光探针的核苷酸序列为HCV-FQ-P1(Seq ID No：12)，其5’端采用FAM标记，3’端标记相应的淬灭基团；HIV的荧光探针的核苷酸序列为HIV-F-P1(Seq ID No：13)，其5’端采用ROX标记，3’端标记相应的淬灭基团；RNA内对照核酸探针的核苷酸序列为IC-F-P2(Seq ID No：15)，其5’端采用HEX标记，3’端标记相应的淬灭基团。
PCR反应条件
PCR反应体系总体积为60μl，其中各组分的浓度分别为：Tris.HCl pH8.3 10mM；KCl50mM；dNTP各0.2mM；Taq DNA聚合酶2U；M-MLV反转录酶25U；RNasin 10U；各种引物各15pM/种；各种荧光探针各5pM/种；甘油5％(v/v)；内对照核酸各100个拷贝数；各种靶核酸样品均为国家卫生部临检中心标准样品。
反应热循环条件如下：
| 42℃ 30分钟 | 50℃ 2分钟 | 94℃ 3分钟 | ||
| (94℃ 10秒 | 50℃ 10秒 | 65℃ 45秒) | *45个循环 |
使用ABI 7500实时荧光PCR仪，荧光采集FAM、ROX和HEX检测波长。
结果判断
结果分析条件设定：ABI 7500荧光仪的基线自动设定，荧光阈值设定为3～15循环的荧光信号的标准偏差的10倍。如FAM层Ct值＞45且HEX层Ct值＜30，则判定为HCV RNA阴性；如FAM层Ct值＞45且HEX层Ct值≥30，则需要重检；如FAM层Ct值≤45，则判定为HCV RNA阳性。如ROX层Ct值＞45且HEX层Ct值＜30，则判定为HIV-1 RNA阴性；如ROX层Ct值＞45且HEX层Ct值≥30，则需要重检；如ROX层Ct值≤45，则判定为HIV-1 RNA阳性。具体检测图谱如图2所示。
实施例3四重实时PCR反应
1.DNA/RNA类靶核酸四重实时PCR反应
1.1用于检测HBV DNA、HCV RNA、DNA内对照核酸(Seq ID No：16)和RNA内对照核酸(其转录的DNA序列同Seq ID No：17)
1.1.1引物
扩增HBV DNA的引物为HBV-FQ-L1(Seq ID No：1)和HBV-FQ-R1(Seq ID No：2)；扩增HCV RNA的引物为HCV-F-L1(Seq ID No：3)和HCV-F-R1(Seq ID No：4)；扩增DNA内对照核酸的引物为IC309L1(Seq ID No：7)和IC309R1(Seq ID No：8)；扩增RNA内对照核酸的引物为IC-F-L2(Seq ID No：9)和IC-F-R2(Seq ID No：10)。
1.1.2荧光探针
HBV的荧光探针的核苷酸序列为HBV-FQ-P1(Seq ID No：11)，其5’端采用FAM标记，3’端标记相应的淬灭基团；HCV的荧光探针的核苷酸序列为HCV-FQ-P1(Seq ID No：12)，其5’端采用TAMRA标记，3’端标记相应的淬灭基团；DNA内对照核酸探针的核苷酸序列为IC-FQ-P1(Seq ID No：14)，其5’端采用ROX标记，3’端标记相应的淬灭基团；RNA内对照核酸探针的核苷酸序列为IC-F-P2(Seq ID No：15)，其5’端采用HEX标记，3’端标记相应的淬灭基团。
1.1.3 PCR反应条件
PCR反应体系总体积为60μl，其中各组分的浓度分别为：Tris.HCl pH8.3 10mM；KCl50mM；dNTP各0.2mM；Taq DNA聚合酶2U；M-MLV反转录酶25U；RNasin 10U；各种引物各15pM/种；各种荧光探针各5pM/种；甘油5％(v/v)；内对照核酸各100个拷贝数；各种靶核酸均为国家卫生部临检中心标准样品。
反应热循环条件如下：
| 42℃ 30分钟 | 50℃ 2分钟 | 94℃ 3分钟 | ||
| (94℃ 10秒 | 50℃ 10秒 | 65℃ 45秒) | *45个循环 |
使用ABI 7500实时荧光PCR仪，荧光采集FAM、ROX、TAMRA和HEX检测波长。
1.1.4结果判断
结果分析条件设定：ABI 7500荧光仪的基线自动设定，荧光阈值设定为3～15循环的荧光信号的标准偏差的10倍。如FAM层Ct值＞45且ROX层Ct值＜30，则判定为HBV DNA阴性；如FAM层Ct值＞45且ROX层Ct值≥30，则需要重检；如FAM层Ct值≤45，则判定为HBV DNA阳性。如TAMRA层Ct值＞45且HEX层Ct值＜30，则判定为HCV RNA阴性；如TAMRA层Ct值＞45且HEX层Ct值≥30，则需要重检；如TAMRA层Ct值≤45，则判定为HCV RNA阳性。具体检测图谱如图3A所示。
1.2用于检测HBV DNA、HIV-1 RNA、DNA内对照核酸(Seq ID No：16)和RNA内对照核酸(其转录的DNA序列同Seq ID No：17)
1.2.1引物
扩增HBV DNA的引物为HBV-FQ-L1(Seq ID No：1)和HBV-FQ-R1(Seq ID No：2)；扩增HIV RNA的引物为HIV-F-L1(Seq ID No：5)和HIV-F-R1(Seq ID No：6)；扩增DNA内对照核酸的引物为IC309L1(Seq ID No：7)和IC309R1(Seq ID No：8)；扩增RNA内对照核酸的引物为IC-F-L2(Seq ID No：9)和IC-F-R2(Seq ID No：10)。
1.2.2荧光探针
HBV的荧光探针的核苷酸序列为HBV-FQ-P1(Seq ID No：11)，其5’端采用FAM标记，3’端标记相应的淬灭基团；HIV的荧光探针的核苷酸序列为HIV-F-P1(Seq ID No：13)，其5’端采用Cy5标记，3’端标记相应的淬灭基团；DNA内对照核酸探针的核苷酸序列为IC-FQ-P1(Seq ID No：14)，其5’端采用ROX标记，3’端标记相应的淬灭基团；RNA内对照核酸探针的核苷酸序列为IC-F-P2(Seq ID No：15)，其5’端采用HEX标记，3’端标记相应的淬灭基团。
1.2.3 PCR反应条件
PCR反应体系总体积为60μl，其中各组分的浓度分别为：Tris.HCl pH8.3 10mM；KCl50mM；dNTP各0.2mM；Taq DNA聚合酶2U；M-MLV反转录酶25U；RNasin 10U；各种引物各15pM/种；各种荧光探针各5pM/种；甘油5％(v/v)；内对照核酸各100个拷贝数；各种靶核酸均为国家卫生部临检中心标准样品。
反应热循环条件如下：
| 42℃ 30分钟 | 50℃ 2分钟 | 94℃ 3分钟 | ||
| (94℃ 10秒 | 50℃ 10秒 | 65℃ 45秒) | *45个循环 |
使用ABI 7500实时荧光PCR仪，荧光采集FAM、ROX、Cy5和HEX检测波长。
1.2.4结果判断
结果分析条件设定：ABI 7500荧光仪的基线自动设定，荧光阈值设定为3～15循环的荧光信号的标准偏差的10倍。如FAM层Ct值＞45且ROX层Ct值＜30，则判定为HBV DNA阴性；如FAM层Ct值＞45且ROX层Ct值≥30，则需要重检；如FAM层Ct值≤45，则判定为HBV DNA阳性。如Cy5层Ct值＞45且HEX层Ct值＜30，则判定为HIV-1 RNA阴性；如Cy5层Ct值＞45且HEX层Ct值≥30，则需要重检；如Cy5层Ct值≤45，则判定为HIV-1 RNA阳性。具体检测图谱如图3B所示。
实施例4五重实时PCR反应
1.DNA/RNA类靶核酸五重实时PCR反应
1.1用于检测HBV DNA、HCV RNA、HIV-1 RNA、DNA内对照核酸(Seq ID No：16)和RNA内对照核酸(其转录的DNA序列同Seq ID No：17)
1.1.1引物
扩增HBV DNA的引物为HBV-FQ-L1(Seq ID No：1)和HBV-FQ-R1(Seq ID No：2)；扩增HCV RNA的引物为HCV-F-L1(Seq ID No：3)和HCV-F-R1(Seq ID No：4)；扩增HIV RNA的引物为HIV-F-L1(Seq ID No：5)和HIV-F-R1(Seq ID No：6)；扩增DNA内对照核酸的引物为IC309L1(Seq ID No：7)和IC309R1(Seq ID No：8)；扩增RNA内对照核酸的引物为IC-F-L2(Seq ID No：9)和IC-F-R2(Seq ID No：10)。
1.1.2荧光探针
HBV的荧光探针的核苷酸序列为HBV-FQ-P1(Seq ID No：11)，其5’端采用FAM标记，3’端标记相应的淬灭基团；HCV的荧光探针的核苷酸序列为HCV-FQ-P1(Seq ID No：12)，其5’端采用TAMRA标记，3’端标记相应的淬灭基团；HIV的荧光探针的核苷酸序列为HIV-F-P1(Seq ID No：13)，其5’端采用Cy5标记，3’端标记相应的淬灭基团；DNA内对照核酸探针的核苷酸序列为IC-FQ-P1(Seq ID No：14)，其5’端采用ROX标记，3’端标记相应的淬灭基团；RNA内对照核酸探针的核苷酸序列为IC-F-P2(Seq ID No：15)，其5’端采用HEX标记，3’端标记相应的淬灭基团。
1.1.3 PCR反应条件
PCR反应体系总体积为60μl，其中各组分的浓度分别为：Tris.HCl pH8.3 10mM；KCl50mM；dNTP各0.2mM；Taq DNA聚合酶2U；M-MLV反转录酶25U；RNasin 10U；各种引物各15pM/种；各种荧光探针各5pM/种；甘油5％(v/v)；内对照核酸各100个拷贝数；各种靶核酸均为国家卫生部临检中心标准样品。
反应热循环条件如下：
| 42℃ 30分钟 | 50℃ 2分钟 | 94℃ 3分钟 | ||
| (94℃ 10秒 | 50℃ 10秒 | 65℃ 45秒) | 45个循环 |
使用ABI 7500实时荧光PCR仪，荧光采集FAM、ROX、TAMRA、Cy5和HEX检测波长。
1.1.4结果判断
结果分析条件设定：ABI 7500荧光仪的基线自动设定，荧光阈值设定为3～15循环的荧光信号的标准偏差的10倍。如FAM层Ct值＞45且ROX层Ct值＜30，则判定为HBV DNA阴性；如FAM层Ct值＞45且ROX层Ct值≥30，则需要重检；如FAM层Ct值≤45，则判定为HBV DNA阳性。如TAMRA层Ct值＞45且HEX层Ct值＜30，则判定为HCV RNA阴性；如TAMRA层Ct值＞45且HEX层Ct值≥30，则需要重检；如TAMRA层Ct值≤45，则判定为HCV RNA阳性。如Cy5层Ct值＞45且HEX层Ct值＜30，则判定为HIV-1 RNA阴性；如Cy5层Ct值＞45且HEX层Ct值≥30，则需要重检；如Cy5层Ct值≤45，则判定为HIV-1 RNA阳性。具体检测图谱如图4所示。
序列表
<110>上海浩源生物科技有限公司
<120>单管中多重靶核酸的PCR检测方法及其试剂盒
<160>17
<210>1
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
tgtcctggtt atcgctg 17
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
cagaagaacc aacaagaaga 20
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
ttcacgcaga aagcgtctag 20
<210>4
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
aattccggtg tactcaccgg tt 22
<210>5
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
agtgggggga catcaagcag ccatgcaaat 30
<210>6
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
tactagtagt tcctgctatg tcacttcc 28
<210>7
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
tcactgaagc gggagggac tggc 23
<210>8
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
gcaggtagcc ggatcaagcg tat 23
<210>9
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>9
cttcagcaat atcacgggt agc 23
<210>10
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>10
gatgcctgct tgccgaatat cat 23
<210>11
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>11
tgtgtctgcg gcgttttatc a 21
<210>12
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>12
atggcgttag tatgagtgtc gtg 23
<210>13
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<400>13
accatcaatg aggaagctgc agaatggg 28
<210>14
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>14
ccgccgcatt gcatcagcca tgatg 25
<210>15
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>15
cctgatagcg gtccgccaca ccc 23
<210>16
<211>142
<212>DNA
<213>人工序列
<400>16
gcaggtagcc ggatcaagcg tatgcagccg ccgcattgca tcagccatga tggatacttt 60
ctcggcagga gcaaggtgag atgacaggag atcctgcccc ggcacttcgc ccaatagcag 120
ccagtcccttc ccgcttcagt ga 142
<210>17
<211>124
<212>RNA
<213>人工序列
<400>17
cuucagcaau aucacgggu agccaacgcu auguccugau agcgguccgc cacacccagc 60
cggccacagu cgaugaaucc agaaaagcgg ccauuuucca ccaugauauu cggcaagcag 120
gcauc 124
Claims (15)
1，在单个PCR反应容器中多重检测样品中一种或几种靶核酸的实时PCR方法，其包括，
(1)在所述单个PCR反应容器中混合样品、DNA聚合酶、dNTP、内对照核酸、靶核酸引物对、内对照核酸引物对、一种或几种靶核酸探针和内对照核酸探针，其中前述各种探针标记有荧光基团和淬灭基团，而且各种探针标记的荧光基团的荧光检测波长互不相同；
(2)进行PCR反应，并实时检测不同波长的荧光；
(3)根据荧光检测结果计算出的Ct值判断是否有一种或几种靶核酸存在于样品中。
2，前述任一权利要求所述的方法，其中在步骤(1)中所述单个PCR反应容器中还进一步混合有反转录酶。
3，前述任一权利要求所述的方法，其中靶核酸优选有一种、两种或三种，其中每种靶核酸分别是RNA或DNA，优选是病原体RNA或DNA，更优选是病毒RNA或DNA，最优选是HCVRNA、HIVRNA或HBVDNA。
4，前述任一权利要求所述的方法，其中样品是经过磁珠提取法处理过的样品。
5，前述任一权利要求所述的方法，其中内对照核酸是新霉素抗药性基因或其片段，优选所述基因或其片段被包装在病毒样颗粒内。
6，前述任一权利要求所述的方法，其中各种探针标记有不同的荧光基团。
7，前述任一权利要求所述的方法，其中靶核酸探针的核苷酸序列选自HCV的5’非编码区中的连续序列或其互补序列、HIV的gag基因中的连续序列或其互补序列、和HBV的编码S抗原的基因中的连续序列或其互补序列。
8，前述任一权利要求所述的方法，其中PCR反应的每个循环的条件为94℃10秒、50℃10秒以及65℃45秒。
9，前述任一权利要求所述的方法，其中一种靶核酸的荧光检测结果计算出的Ct值≤45，则这种靶核酸存在于样品中；一种靶核酸的荧光检测结果计算出的Ct值＞45，而且相应内对照核酸的荧光检测结果计算出的Ct值＜30，则这种靶核酸不存在于样品中。
10，用于权利要求1所述方法的检测试剂盒，其包括DNA聚合酶、dNTP、内对照核酸、靶核酸引物对、内对照核酸引物对、一种或几种靶核酸探针和内对照核酸探针，其中前述各种探针标记有荧光基团和淬灭基团，而且各种探针标记的荧光基团的荧光检测波长互不相同。
11，前述任一权利要求所述的检测试剂盒，其中还进一步包括反转录酶。
12，前述任一权利要求所述的检测试剂盒，其中还进一步包括磁珠提取法所需试剂。
13，前述任一权利要求所述的检测试剂盒，其中内对照核酸是新霉素抗药性基因或其片段，优选所述基因或其片段被包装在病毒样颗粒内。
14，前述任一权利要求所述的检测试剂盒，其中各种探针标记有不同的荧光基团；其中靶核酸探针的核苷酸序列选自HCV的5’非编码区中的连续序列或其互补序列、HIV的gag基因中的连续序列或其互补序列、和HBV的编码S抗原的基因中的连续序列或其互补序列；和/或，其中内对照核酸探针的核苷酸序列选自新霉素抗药性基因中的连续序列或其互补序列。
15，前述任一权利要求所述的检测试剂盒在制备用于前述任一权利要求所述的方法的检测试剂产品中的应用。
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