CN101742995A - 检测琥珀酰丙酮 - Google Patents

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Abstract

本发明尤其涉及使用质谱法检测和/或测量琥珀酰丙酮和一种或多种额外的生物分析物。

Description

检测琥珀酰丙酮
对相关申请的交叉参考
本申请要求2007年5月4日提交的美国申请11/744,789的优先权，将其内容全部引入本申请作为参考。
背景技术
质谱法用于检测和测量宽范围的代谢物，所述代谢物的存在或量可以指示某些病症或疾病。由此，质谱法可用于例如诊断与代谢物水平改变相关的多种代谢性疾病(metabolic disorder)。一种所述代谢性疾病为I型遗传性高酪氨酸血症(hereditary tyrosinemia，Type I，HT1))，其是由延胡索酰乙酰乙酸水解酶(fumarylacetoacetate hydrolase，FAH))的缺乏引起的，并且与酪氨酸和琥珀酰丙酮水平增加相关。HT1是儿童期疾病，其引起肝衰竭、疼痛性神经性危象(painful neurological crises)、佝偻病(ricket)和肝癌(hepatocarcinoma)。若未经治疗，通常在不到2岁时发生死亡，一些慢性形式允许生存到12岁。如果在生命早期开始治疗，则目前可能用NTBC(或尼替西农)治疗HT1。由此，存在的主要动机是，通过新生儿筛查或甚至产前筛查来鉴别HT1感染的患者。
发明内容
琥珀酰丙酮(Succinylacetone)是早期检测HT1的主要标志物。然而，琥珀酰丙酮是非常具有反应性的酮，其与蛋白质形成缀合物。本申请所述的方法能够用于在以下条件下从试样中提取琥珀酰丙酮，所述条件允许同时提取其它代谢物，如氨基酸、游离肉毒碱或酰基肉毒碱。例如，可避免苛刻的提取条件(如极端酸性和高温)。
本申请所述的方法可用于使用质谱法(例如串联质谱法)检测和/或测量琥珀酰丙酮和一种或多种额外的生物分析物。所述方法用于诊断代谢性疾病如氨基酸病(amino acidopathy)(例如，I型酪氨酸血症)，以及用于产生所述疾病的检测/诊断的代谢分布。
在一个方面，本公开提供了提取的方法。所述方法包括以下步骤：使试样与提取溶液接触，所述提取溶液包含C1-3直链或支链一元醇和强碱，其中使试样与提取溶液接触从试样中产生了包含以下成分的提取物：(i)衍生化的琥珀酰丙酮，(ii)一种或多种氨基酸，(iii)游离肉毒碱，(iv)一种或多种酰基肉毒碱，或(v)(ii)、(iii)或(iv)的任何衍生化形式，其中衍生化的琥珀酰丙酮在提取物中的浓度反映了琥珀酰丙酮在试样中的浓度，其中一种或多种氨基酸、游离肉毒碱、一种或多种酰基肉毒碱或它们的衍生化形式在提取物中的浓度反映了它们在试样中的相应浓度。所述方法还可包括在使试样与提取溶液接触后，利用串联质谱法对试样进行分析的步骤。所述接触可将至少一种琥珀酰丙酮分子衍生为3-(5-甲基-1H-吡唑-3-基)丙酸(MPP)。所述C1-3直链或支链一元醇可以是甲醇、乙醇、丙醇或异丙醇。所述强碱可以是肼、修饰的肼(例如，酰肼、芳基肼、烷基肼、Girard-P和Girard-T试剂)或羟胺。
在一些实施方案中，所述试样可以是生物试样如干燥过的血斑(bloodspot)。所述试样可获自新生人类。所述试样可以是获自不疑患有代谢性疾病如I型酪氨酸血症或面临发展所述疾病危险的受试者的试样。
在一些实施方案中，所述提取溶液可含有水、有机酸和/或一种或多种内标物。例如，所述提取溶液可含有约5％至约30％水或约20％至约25％水。所述有机酸可以是例如，浓度为约5mM的草酸。所述内标物可包括至少一种重原子同位素如2H、15N或13C。一种或多种内标物可以是或含有琥珀酰丙酮、氨基酸、游离肉毒碱、酰基肉毒碱或上述任何物质的衍生化形式。
在一些实施方案中，所述方法可包括以下步骤：在使试样与提取溶液接触后，对试样进行蒸发，得到第一次蒸发的试样。所述方法还可包括以下步骤：对试样进行蒸发后，使第一次蒸发的试样与烷基醇溶液接触，所述烷基醇溶液包含烷基醇和酸。所述方法还可包括以下步骤：使试样与烷基醇溶液接触后，蒸发溶液，得到第二次蒸发的溶液，和/或重组(reconstitute)第二次蒸发的溶液。重组第二次蒸发的溶液可包括使第二次蒸发的溶液与溶剂接触。所述烷基醇可以是甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、正丁醇、叔丁醇或戊醇。所述酸可以是盐酸(HCl)。所述溶剂可包括乙腈、异丙醇，或水与异丙醇或与乙腈的混合物。
在另一个方面，本公开提供了提取(extraction)的方法，所述方法包括以下步骤：使试样与提取溶液接触，所述提取溶液包含C1-3直链或支链一元醇和强碱，其中使试样与提取溶液接触从试样中产生了包含以下成分的提取物：(i)衍生的生物学活性的酮，(ii)一种或多种氨基酸，(iii)游离肉毒碱，(iv)一种或多种酰基肉毒碱，或(v)(ii)、(iii)或(iv)的任何衍生化形式，其中衍生的生物学活性的酮在提取物中的浓度反映了生物学活性的酮在试样中的浓度，其中一种或多种氨基酸、游离肉毒碱、一种或多种酰基肉毒碱或它们的衍生化形式在提取物中的浓度反映了它们在试样中的相应浓度。所述C1-3直链或支链一元醇可以是甲醇、乙醇、丙醇或异丙醇。所述生物学活性的酮可以是例如琥珀酰丙酮或类固醇。类固醇包括但不限于睾酮、脱氢表雄酮(DHEA)、硫酸脱氢表雄酮、雄甾烯二酮(androstenedione)、17-羟孕酮(17-OHP)、17-羟基孕烯醇酮、皮质醇(cortisol)、11-脱氧皮质醇、皮质酮、醛固酮、雌二醇、18-OH皮质酮、孕烯醇酮、孕酮、可的松(cortisone)、四氢皮质醇、11-脱氧皮质酮、肌酸酐、17-酮类固醇、胆固醇、维生素B或维生素A。所述强碱可以是本申请描述的强碱中的任何一种。所述提取溶液也可包括水。
在另一个方面，本公开的特征为检测琥珀酰丙酮的方法。所述方法包括以下步骤：使试样与提取溶液接触，所述提取溶液包含C1-3直链或支链一元醇和强碱；对试样中的琥珀酰丙酮进行衍生化；然后利用串联质谱法评价衍生的试样中衍生化的琥珀酰丙酮。琥珀酰丙酮的衍生化形式可以是琥珀酰丙酮至3-(5-甲基-1H-吡唑-3-基)丙酸(MPP)。所述强碱可以是本申请所述的任何强碱。
在另一个方面，本公开提供了检测琥珀酰丙酮的方法，所述方法包括以下步骤：使试样与提取溶液接触，所述提取溶液包含C1-3直链或支链一元醇和肼；将试样中的琥珀酰丙酮衍生为3-(5-甲基-1H-吡唑-3-基)丙酸(MPP)；然后利用串联质谱法评价衍生的试样中的MPP。所述方法也可包括就相同注射试样中含有MPP的一种或多种额外的分析物(例如，本申请所述的任何额外的分析物)来评价试样。所述C1-3直链或支链一元醇可以是甲醇、乙醇、丙醇或异丙醇。
在另一个方面，本公开提供了检测琥珀酰丙酮的方法。所述方法可包括以下步骤：使试样与含有有机溶剂的提取溶液在实质上不固定蛋白质的条件下接触；将试样中的琥珀酰丙酮衍生为3-(5-甲基-1H-吡唑-3-基)丙酸(MPP)；然后利用串联质谱法评价衍生的试样中的MPP和额外分析物(或其衍生物)。所述提取溶液可含有约5％水。所述提取溶液可含有约85％C1-3直链或支链一元醇如甲醇、乙醇、丙醇或异丙醇。琥珀酰丙酮可用肼或衍生化的肼来衍生。
在一些实施方案中，所述方法可包括以下步骤：基于对试样中琥珀酰丙酮的检测，确定试样所来源的受试者是否患有遗传性I型酪氨酸血症或面临发展所述疾病的危险。在确定受试者患有遗传性I型酪氨酸血症或面临发展所述疾病的危险后，所述方法可包括给予受试者4-羟基苯基丙酮酸双加氧酶(4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase)的抑制剂。
在另一个方面，本公开的特征为检测生物学活性的酮的方法。所述方法包括以下步骤：使试样与提取溶液接触，所述提取溶液包含C1-3直链或支链一元醇和强碱；对试样中的生物学活性的酮进行衍生化；然后利用串联质谱法评价衍生的试样中衍生的生物学活性的酮。生物学活性的酮可以是琥珀酰丙酮或类固醇(steroid)，如本申请所述的任何类固醇。所述C1-3直链或支链一元醇可以是甲醇、乙醇、丙醇或异丙醇。所述提取溶液也可包括水。
在本申请所述的任何方法的一些实施方案中，所述试样可以是生物试样如干燥过的血样(干燥过的血斑)。所述试样可来自新生人类。所述试样也可包括至少一种重原子同位素，所述同位素在质谱分析之前包括在同一试样中。
在本申请所述的任何方法的一些实施方案中，所述评价可包括对来自注射到串联质谱仪中的试样中衍生化的琥珀酰丙酮以及一种或多种额外的分析物(例如，生物学分析物如一种或多种氨基酸、游离肉毒碱或酰基肉毒碱)进行分析。例如，衍生化的琥珀酰丙酮可与来自相同注射试样(注射到串联质谱仪中)的一种或多种(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15、18、20、22、25、28或30种)额外的分析物一起分析。
在本申请所述的任何方法的一些实施方案中，所述试样为先前未经提取的试样。
在本申请所述的任何方法的一些实施方案中，使试样与提取溶液接触导致了从试样中提取出：(i)衍生化的琥珀酰丙酮(SA)和(ii)一种或多种氨基酸、游离肉毒碱、一种或多种酰基肉毒碱或上述成分的衍生化形式，而没有改变这些分析物在试样中的比例。例如，从含有比例为约5∶1∶2的SA、酪氨酸和游离肉毒碱的试样中获得的提取液可含有比例为约5∶1∶2的衍生化的琥珀酰丙酮、酪氨酸(或衍生化的酪氨酸)和游离肉毒碱(或衍生化的游离肉毒碱)。
在另一个方面，本公开的特征为用于检测琥珀酰丙酮的试剂盒(kit)。所述试剂盒可包括衍生化的琥珀酰丙酮，所述琥珀酰丙酮包含至少一种重原子同位素；以及如何检测衍生化的琥珀酰丙酮的说明书。所述试剂盒也可包括强碱如肼。所述强碱可按小于约0.1％的浓度提供。所述肼可以是二盐酸肼。所述试剂盒也可包括一种或多种内标物，每种内标物含有(i)氨基酸、游离肉毒碱或酰基肉毒碱，和(i)至少一种重原子同位素。所述试剂盒也可包括至少一种干燥过的血斑，其包含已知量的一种或多种或琥珀酰丙酮、氨基酸、游离肉毒碱或酰基肉毒碱。所述衍生化的琥珀酰丙酮可以是3-(5-甲基-1H-吡唑-3-基)丙酸(MPP)。
在另一个方面，本公开提供了用于检测生物学活性的酮的试剂盒。所述试剂盒可包括相关的衍生化生物学活性的酮，所述酮至少一种重同位素原子，以及如何检测衍生化生物学活性的酮的说明书。
许多质谱仪具有高分辨的质量精确度。例如，在带单个电荷的离子(singly charged ion)的情况中，该范围对应于0.6m/z。质谱仪中较小变化(例如，校准的变化)可产生与本申请所述的信号不相同的离子m/z信号，但可例如通过对校准中的偏移量进行补偿而容易地鉴别和使用对应于所披露的信号的m/z信号。
将本申请提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献全文引入作为参考。
附图说明
图1为描述酪氨酸分解代谢途径的示意图。
图2为描述从生物试样中提取和衍生化琥珀酰丙酮的必要反应的示意图。
图3为一种方法的示意图，所述方法在通过串联质谱法(tandem massspectrometry)进行注射和检测/测量前提取和衍生化琥珀酰丙酮。
图4为一种方法的示意图，所述方法在通过串联质谱法进行注射和检测/测量前提取和衍生化琥珀酰丙酮，以及提取和酯化额外的分析物。
图5为使用图3所述的方法获得的衍生化的琥珀酰丙酮和其它非衍生化的氨基酸的串联质谱图(46次扫描的中性丢失(neutral loss))。氨基酸由三字母编码命名，例如，丙氨酸为“ala”，单独氨基酸的子离子(daughter ion)的具体荷质比(m/z)信号由箭头指示。“IS”是指内标物。X-轴代表m/z，Y-轴代表试样中各种离子的相对丰度(百分数)。
图6为所提取的血斑的串联质谱图(102次扫描的中性丢失)，其描述当根据图4所述的方法处理试样时，可与琥珀酰丙酮一起检测和/或测量的示例性分析物。
图7为用图3所述的方法获得的一系列光谱(46次扫描的中性丢失)。所述光谱描述了测量来自健康新生儿以及来自证实患有I型酪氨酸血症的新生儿的干燥过的血斑中琥珀酰丙酮和酪氨酸水平。X-轴代表相应的m/z，峰高代表分析物的相对丰度。
图8是一对条形图和表，其描述与健康新生儿(“真阴性(true neg)”)相比，测量从25小时和15天的证实患有I型酪氨酸血症的新生儿中获得的干燥过的血斑中琥珀酰丙酮和酪氨酸水平。图8A的条形图的Y-轴代表琥珀酰丙酮的水平(单位为μM)(左)。图8B的条形图的Y-轴代表酪氨酸水平(单位为μM)(右)。
图9为描述水合肼和二盐酸肼相对稳定性的线性图。X-轴代表天数，Y-轴代表保持在每个时间点的水合肼(菱形)或二盐酸肼(方形)的量(百分数)。
具体实施方式
可通过将试样中的琥珀酰丙酮修饰成更稳定形式，由质谱法来检测琥珀酰丙酮。本申请披露的是用于进行所述修饰以及当前用于处理试样的方法和组合物，所述试样处理是以这样的方式进行：该方式允许在单次步骤中从试样中提取琥珀酰丙酮和其它分析物(例如，氨基酸、酰基肉毒碱和游离肉毒碱)，从而使琥珀酰丙酮和其它分析物在提取物中的浓度反映它们在试样中的相应浓度。还披露了使用质谱法检测和/或测量琥珀酰丙酮(衍生化的琥珀酰丙酮)和一种或多种额外的分析物的方法。本申请所述的方法尤其可用于诊断受试者中一种或多种代谢性疾病如氨基酸病(例如，遗传性I型酪氨酸血症)和有机酸和脂肪酸代谢障碍或用于产生所述诊断的代谢分布(见下文)。
从试样中提取琥珀酰丙酮和额外的分析物的方法
本公开的特征为在单次步骤中从试样中提取琥珀酰丙酮以及一种或多种额外的分析物(例如，氨基酸、酰基肉毒碱和游离肉毒碱)的方法，从而使琥珀酰丙酮和一种或多种额外的分析物(例如，氨基酸、游离肉毒碱和酰基肉毒碱)在提取物中的浓度反映它们在试样中的相应浓度。提取后，可使用质谱法(例如串联质谱法)确定琥珀酰丙酮以及一种或多种额外的分析物(例如，游离肉毒碱，酰基肉毒碱和氨基酸)的存在或存在量。所述方法可包括使试样与提取溶液接触，所述提取溶液含有C1-3直链或支链一元醇(例如，甲醇、乙醇、丙醇或异丙醇)和强碱如肼、修饰的肼(例如，酰肼、芳基肼、烷基肼、Girard-P和Girard-T试剂)或羟胺。所述提取溶液也可含有水。使试样与提取溶液接触导致了对琥珀酰丙酮(若存在于试样中)的修饰(衍生化)以及对所修饰的琥珀酰丙酮和一种或多种额外的分析物(例如，游离肉毒碱、酰基肉毒碱和氨基酸)的提取。
图2描述了根据本申请所述的方法从干燥过的血斑试样中提取琥珀酰丙酮的示例性反应。琥珀酰丙酮是非常具有反应性的二酮，因此其快速地与生物学流体如全血中的某些氨基酸(例如，游离氨基酸或肽和蛋白质成分)的侧链反应。通过琥珀酰丙酮与氨基酸残基反应形成的席夫碱(Schiff base)缀合物比游离琥珀酰丙酮更稳定，因此血液中存在的多数(若不是全部)琥珀酰丙酮呈结合形式。
为了在单次步骤中从试样(例如，生物试样如血斑)中提取(释放)琥珀酰丙酮以及一种或多种额外的分析物，可使所述试样与提取溶液接触，所述提取溶液含有C1-3直链或支链一元醇(例如，甲醇、乙醇、丙醇或异丙醇)和强碱。所述强碱可以是肼或修饰的肼(例如，酰肼、芳基肼、烷基肼、Girard-P和Girard-T试剂)以及羟胺。所述C1-3直链或支链一元醇在溶液中的浓度按体积计例如可为约70％(例如，约70％、约71％、约72％、约73％、约74％、约75％、约76％、约77％、约78％、约79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％或约95％)。所述强碱(例如，肼、修饰的肼或羟胺)在溶液中的浓度可以为约600μM(例如，约200μM、约300μM、约400μM、约500μM、约550μM、约650μM、约700μM、约800μM、约900μM、约1,000μM、约1,200μM、约1,500μM或约2,000μM)。
所述提取溶液也可含有水。水在提取溶液中的浓度按体积计例如可为约6-30％(例如，7-28％、8-26％、10-26％、14-25％、18-24％)。水的浓度可以是这样的浓度，该浓度使提取溶液重组一些蛋白质和肽，同时溶解试样中存在的其它分析物(例如，酰基肉毒碱、游离肉毒碱和氨基酸)。所述提取溶液也可含有有机酸如草酸，浓度为约3mM(例如，约1mM、约2mM、约2.5mM、约3.5mM、约4mM、约4.5mM或约5mM)。
任选地，在用作催化剂的有机酸(例如，草酸)辅助下，肼将琥珀酰丙酮从氨基酸残基中释放，形成稳定的吡唑环(pyrazone ring)。琥珀酰丙酮与肼反应形成的吡唑环(pyrazone)称为3-(5-甲基-1H-吡唑-3-基)丙酸(MPP)。该化合物比琥珀酰丙酮与氨基酸残基形成的席夫碱更稳定。因此，一旦琥珀酰丙酮与肼反应，在单次步骤中可将该MPP衍生物与额外的分析物(例如，氨基酸、游离肉毒碱和酰基肉毒碱)一起全部提取出来。然后可利用串联质谱法测量所提取的MPP和额外的分析物。目前例如可利用串联质谱法评价琥珀酰丙酮可其它分析物。MPP的浓度直接反映试样中琥珀酰丙酮的浓度。
图3描述了制备用于质谱分析的试样的示例性方法。在这种情况中，可对获自新生儿(或任何年龄的人)的干燥过的血斑试样进行穿孔以产生置于例如微量滴定板的孔中的小盘(small disc)。可向该试样中加入提取溶液以提取试样中的分析物。所述提取溶液可包含C1-3直链或支链一元醇和强碱的混合物(这两种组分的比例可如上文所述的那样变化)。肼的来源可以是水合肼或二盐酸肼，或其它修饰的肼(例如，酰肼、芳基肼、烷基肼、Girard-P和Girard-T试剂)或羟胺。所述也可含有水(见上文)以及较小百分含量的有机酸(例如，草酸)。该溶液也可任选含有一种或多种内标物，例如，已知浓度的氨基酸、游离肉毒碱、酰基肉毒碱和琥珀酰丙酮。然后将试样混合物孵育预定的一段时间(例如，约25至约45分钟(例如，约30至约45分钟)；约30至约60分钟；约30至约70分钟；约30至约90分钟；约30至约120分钟；约35至约60分钟；或约40至约60分钟)，从而允许提取氨基酸、游离肉毒碱和酰基肉毒碱以及提取结合的琥珀酰丙酮并允许所述酮与肼发生伴随的反应。然后可将提取液转移到微量滴定板的未用过的孔中，然后通过串联质谱法，任选在用于注射试样的液体处理装置的辅助下对试样进行分析。然后将串联质谱仪上的仪器设置设置为以多路模式(multiplexfashion)检测所涉及的分别的代谢物(氨基酸、酰基肉毒碱、肉毒碱和琥珀酰丙酮)以及它们对应的内标物。
可能有益的是，不仅对所修饰的琥珀酰丙酮(例如MPP)进行衍生化，还对试样中额外的分析物(例如额外的分析物如氨基酸、酰基肉毒碱和肉毒碱)进行衍生化。本申请所述的多种分析物，包括琥珀酰丙酮相当于羧酸；因此，它们适合用于通过酯化进行试样衍生化。在通过质谱法分析前对试样中的多种分析物进行酯化的示例性方法描述于图4中。首先，进行如上文类似的操作，然而，可进行进一步的样品试样处理。例如，在用肼进行衍生化步骤后，可将试样蒸发至干。然后将干燥过的试样在烷基醇的酸性溶液中重组。所述醇可以是任何烷基醇，例如，但不限于甲醇、乙醇、丙醇、正丁醇、叔丁醇、戊醇或己醇。可使该醇与试样接触，并结合强的浓酸(例如，盐酸或硫酸)。所述烷基醇和酸的溶液可以是例如，丁醇/3N HCl或甲醇/1N HCl。在约39℃(例如，约30℃、约35℃、约36℃、约37℃、约40℃、约42℃、约50℃、约55℃、约60℃或约70℃)可将试样在所述烷基醇/酸溶液中孵育约30分钟(例如，约20分钟、约40分钟、约45分钟、约50分钟、约60分钟、约70分钟、约80分钟、约90分钟、约100分钟或约120分钟)。在该孵育后，可将试样蒸发至干，然后在溶剂(例如，乙腈；或乙腈和水(例如，80％乙腈和20％水)、异丙醇(例如80％异丙醇和20％水)或适于质谱法分析并能够溶解酯化的有机化合物的任何其它溶剂中重组。
可用衍生化的(修饰的)琥珀酰丙酮检测和/或测量的额外的分析物包括表1中列出的分析物。
表1.
Figure G2008800232478D00091
Figure G2008800232478D00101
质谱法
串联质谱法可用于检测和/或测量试样(例如，生物试样)中的琥珀酰丙酮和一种或多种额外的分析物(例如，游离肉毒碱、酰基肉毒碱和氨基酸)。在串联质谱法中，将两台质谱仪通过碰撞池(collision cell)串联。第一台质谱仪(MS-1)用于选择相关离子(例如，具有特别荷质比(m/z)的离子)。然后将所选择的离子传输到碰撞池中，在那里它们通过与惰性气体碰撞变成碎片。这一过程被称为碰撞活化的解离(collisionally activated dissociation，CAD))。一旦母体(有时称为前体)离子变成碎片，则使用第二台质谱仪(MS-2)扫描和检测所有产生的子离子或选择和检测特别的碎片离子。
如附随的实施例所详细描述的那样，串联质谱法用于使衍生化的(修饰的)琥珀酰丙酮的前体分子和若干氨基酸的前体分子电离，使离子成为碎片并检测具体特征峰(specific peaks)，这些特征峰是试样中这些分子的存在的指示。所述串联质谱法检测可通过多种方式实现。在一种类型的串联质谱法(通常在三重四极串联质谱仪(triple quadrupole tandem mass spectrometer)上进行)中，变成碎片以产生普通子离子(碎片)的离子可通过进行“先驱离子扫描”(也称为母离子扫描)作为一类来扫描，其中通过选择用于MS-2中普通碎片离子的适当质量，对产生普通碎片离子的所有离子进行检测。这种类型的扫描可用于检测试样中的酰基肉毒碱(m/z 85的先驱离子扫描)。在一种不同形式的串联质谱法中，变成碎片以产生普通中性丢失(Neutral loss)的离子可通过进行所谓的中性丢失扫描作为一类来扫描，其中通过设置与MS-1和MS-2之间的普通中性丢失相等的适当质量偏移量，对变成碎片而产生特异性中性丢失的所有离子进行检测。进行这种类型的扫描以检测试样中的氨基酸和琥珀酰丙酮(若将所提取的试样中分析物修饰为丁酯，为m/z102的中性丢失，或若没有发生进一步分析物修饰，为m/z 46的中性丢失)。图5显示m/z 46的中性丢失扫描为若干氨基酸，而琥珀酰丙酮从相同试样中检测。在m/z 155时观测到对应于衍生化的琥珀酰丙酮的独特峰，以及对应于氨基酸的若干独特峰。由此，琥珀酰丙酮(如本申请所述的衍生化的琥珀酰丙酮)可在单一试样中在一次分析中与一种或多种额外的分析物一起被检测和/或测量。
在称为多重反应监测(MRM)的另一种类型的串联质谱法中，在MS-1中选择相关的母离子，在碰撞池中变成碎片，在MS-2中选择得自碰撞活化的特异性碎片离子，并最后进行检测。对MS-1和MS-2进行固定，从而历时预定量的时间(几毫秒)分别选择相关的相应母离子和碎片离子对。这种特异性母离子-产物离子跃迁可视为一种检测通道。若需要检测额外的分析物，可在实验中引入具有特异性质量跃迁的额外检测通道。可连续采集来自所有选择的质量跃迁(通道)的数据以获得期望的信息。混合物中琥珀酰丙酮(如本申请所述那样制备的试样中衍生化的琥珀酰丙酮)的检测和定量可通过采用每种这些化合物的特异性质量跃迁(specific mass transition)如下获得：对于衍生化的琥珀酰丙酮而言：在m/z155固定MS-1以选择和传输母离子，在m/z 109固定MS-2以选择和传输特异性产物离子(通道1或MRM跃迁1)；对于氨基酸如酪氨酸而言：在m/z182固定MS-1以选择和传输母离子，在m/z 136固定MS-2以选择和传输特异性产物离子(通道2或MRM跃迁2)。这两种MRM跃迁可从相同试样中连续测量预定量的时间，从而检测所述试样中这些化合物的混合物的存在和/或浓度。
可将对琥珀酰丙酮(衍生化的琥珀酰丙酮)的稳定的同位素标记的内标物加到试样中，可通过所述内标物对衍生化的琥珀酰丙酮以及琥珀酰丙酮本身进行定量。用稳定同位素标记的衍生化的琥珀酰丙酮的产生了质量漂移(mass shift)，而保留标记的和未标记的化合物之间非常类似的理化性质。
一般地，可将一种或多种内标物按已知浓度加到试样中，从而允许对相关的分析物(例如，琥珀酰丙酮)进行定量。例如，对于利用串联质谱法进行分析的试样而言，由衍生化的琥珀酰丙酮(例如，MPP)及其相应的内标物产生的信号比例可用于确定试样中这些化合物的量。也可加入内标物以分辨天然存在的(内源性)分子。如上所述，在将试样(例如，血样)和提取溶液混合前，可在提取溶液中制备所述内标物。可供选择地，可在试样制备的任何步骤中将内标物加到混合物中，而确保这些内标物不会在试样处理(例如在液液提取或固相提取后)过程中从混合物中除去。
通过本申请描述的方法检测的相关分析物的内标物(或其它分子，例如，本申请所述的生物分子)可以是可通过质谱法检测的分析物分子的任何修饰形式或类似物。内标物是基于独特的物理性质(如独特的质量或荷质比)从分子中单独检测的。用于质谱法的常用内标物为相关分析物的稳定的同位素标记形式或化学衍生物(例如，若分析物为MPP，则内标物可为同位素标记的MPP)。例如，稳定的同位素标记的类似物可用于使用称为同位素稀释质谱法的技术来定量相应的相关分析物，其中分析物和内标物在同一试样中处理。内标物可设计成这样：1)所述标记引起至少1个质量单位的的质量漂移以及2)没有稳定的同位素标记位于不稳定位点以预防交换。标记可以是2H(D)、15N、13C或18O或任何组合形式。标记在分子上的实际位置可发生变化，只要满足了条件2(上文中)。此外，碎片离子的质量中标记的位置和电势变化也可用于确认内标物和分析物的分离。用于本申请所述的方法中的可能内标物的实例包括但不限于同位素标记的：衍生化的琥珀酰丙酮(例如，3-(5-甲基-1H-吡唑-3-基)丙酸(MPP))、肉毒碱、酰基肉毒碱或氨基酸(例如，脯氨酸、蛋氨酸或酪氨酸)。
几种类型的质谱仪是可获得的或可用多种配置产生，所有这些都可用于本申请所述的方法中。一般而言，质谱仪具有以下主要组件：进样口、离子源、碰撞池、质量分析仪、检测器、真空系统和仪器控制系统以及数据系统。进样口、离子源和质量分析仪的差异通常限定了仪器的类型及其能力。例如，进口可以是毛细管柱液相色谱源，或可为例如用于基质辅助的激光解吸(matrix-assisted laser desorption)中的直接探针或镜台。常见离子源为例如，电喷雾，包括纳米喷雾(nanospray)和微量喷雾(microspray)或基质辅助的激光解吸。常见的质谱仪包括四极质量滤器、飞行时间质量分析仪(优选为正交加速飞行时间质量分析仪)、离子阱质量滤器(ion trap mass filter)、扇形磁场分析仪(magnetic sector analyser)，或傅里叶变换离子回旋加速器(Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance(″FTICR″))质量分析仪。所述碰撞池可以是例如，四级杆装置、六极杆装置或八极杆装置。所述碰撞池优选形成与离子进口和离子出口隔离的基本上气密的外壳。可将碰撞气体如氦、氩、氮气、空气或甲烷引入到碰撞池中。
本申请描述的具体实施例使用串联质谱仪进行(参见例如，附随的实施例)。
试样
用于本申请所述方法的合适试样包括任何生物学流体、细胞、组织或它们的级份，其包括作为代谢状态(例如，特征为琥珀酰丙酮水平改变的代谢性疾病，如遗传性I型酪氨酸血症)指示的生物分子。试样可以是例如，获自受试者(例如，哺乳动物如人)的标本，或可从所述受试者得到。例如，试样可以是由活组织检查(biopsy)获得的组织切片，或置于组织培养基中或适于组织培养的细胞。因此示例性试样包括培养的成纤维细胞、培养的羊水细胞和绒膜绒毛取样(chorionic villus sample)。试样也可以是生物学流体标本如尿、血液、血浆、血清、唾液、精液、痰(sputum)、脑脊髓液(cerebralspinal fluid)、眼泪、粘液等。期望时，可将试样进一步分级为含有具体细胞类型的级份。例如，可将血样分级成血清或分级成含有具体类型的血细胞(如红细胞或白血病(白血球))的级份。期望时，试样可以是来自受试者的试样的组合，如组织和流体试样的组合等。保持试样中分子的活性或完整性的获得试样的方法是本领域技术人员公知的。所述方法包括使用适当的缓冲液和/或抑制剂，包括核酸酶抑制剂、蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂，其使试样中的分子得到保持或使分子的变化最小。所述抑制剂包括例如，螯合剂如乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇二(P-氨基乙基醚)N，N，N1，N1-四乙酸(EGTA)，蛋白酶抑制剂如苯甲磺酰氟(PMSF)、抑肽酶、亮肽素、抗痛素等，以及磷酸酶抑制剂如磷酸盐、氟化钠、钒酸盐等。用于分离分子的适当缓冲液和条件是本领域技术人员公知的，并且可根据例如试样中分子的类型来变化(参见例如，Ausubel et al.Current Protocols in Molecular Biology(Supplement 47)，John Wiley&Sons，New York(1999)；Harlow and Lane，Antibodies：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press(1988)；Harlow and Lane，Using Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborPress(1999)；Tietz Textbook of Clinical Chemistry，3rd ed.Burtis and Ashwood，eds.W.B.Saunders，Philadelphia，(1999))。也可对试样进行处理以消除干扰物或使干扰物的存在最小化。就用于本申请所述的方法而言，试样可呈各种物理状态。例如，试样可以为液体或固体，可溶于或悬浮于液体中，可呈乳液或凝胶形式，并可吸附在物质上。作为非限制性实例，试样可以是液态血样、液态血清试样、液态白细胞试样、干燥过的血液、干燥过的血清或干燥过的白细胞试样，或吸附在纸上或聚合物基质上的所述试样。
示例性应用
本申请所述的方法可用于对试样(例如来自受试者如人的试样)获得分子分布。所述分布可包括指示琥珀酰丙酮或琥珀酰丙酮和其它生物学分析物如氨基酸是否存在的信息，并且通常包括关于琥珀酰丙酮(和一种或多种额外的生物分析物)的存在(定性的或定量的)的信息。
在这些质谱法的一些应用中，可获得受试者(例如，人)的代谢分布。例如，所述分布可包括受试者(例如，人类患者)中琥珀酰丙酮的水平。也可利用串联质谱法对生物试样中的其它生物分子进行检测、定量和/或评价，这些生物分子包括例如，一种或多种氨基酸、游离肉毒碱、酰基肉毒碱。得到的信息(代谢分布)可用于评价受试者(例如，人类患者)的健康状态，如代谢性疾病(例如，氨基酸病、脂肪酸或有机酸病症，或与琥珀酰丙酮的水平改变相关的代谢性疾病(例如，遗传性I型酪氨酸血症))的存在或不存在，或用于评价所述病症的危险。氨基酸病的实例包括但不限于精氨酸血症，精氨基琥珀酸尿(精氨基琥珀酸裂解酶缺乏/精氨琥珀酸酶缺乏)、瓜氨酸血症(精氨琥珀酸合成酶缺乏(argininosuccinic acid synthetase deficiency)/精氨基琥珀酸合成酶缺乏(argininosuccinate synthetase deficiency))、同型胱氨酸血症、胱硫醚合成酶缺乏(cystathione synthase deficiency)、高蛋氨酸血症、高鸟氨酸血症、高氨血(hyperammonemia)、超均瓜氨酸尿综合征(hyperhomocitrullinuriasyndrome)、鸟氨酸易位酶缺乏、血脯氨酸过多(hyperprolinemia)、槭糖浆尿病(Maple Syrup Urine Disease)(支链酮酸尿)、非酮性高甘氨酸血症(nonketotichyperglycinemia)、苯丙酮酸尿(phenylketonuria)、焦谷氨酸血症/六氢吡啶羧酸血症(pyroglutamic/pipecolic acidacademia)、酪氨酸血症(I型)、酪氨酸血症(II型)、5-羟脯氨酸血尿或焦谷氨酸尿。脂肪酸和有机酸病症的实例包括例如，2-甲基丁酰辅酶A脱氢酶缺乏、2，4-二烯酰辅酶A还原酶缺乏、3-羟基-3-甲基戊二烯辅酶A裂解酶缺乏(羟甲基戊二酸血症)、3-甲基丁烯酰辅酶A羧化酶缺乏(3-甲基巴豆酰甘氨酸血症)、肉毒碱棕榈酰转移酶(I型)缺乏、肉毒碱棕榈酰转移酶(II型)缺乏、肉毒碱运载体缺乏、肉毒碱/酰基肉毒碱易位酶缺乏、乙基丙二酸血症、戊二酸血症(I型；戊二酰辅酶A脱氢酶缺乏)；异丁酰辅酶A脱氢酶缺乏、异戊酸血症、长链酰基辅酶A脱氢酶缺乏、长链羟基酰基辅酶A脱氢酶缺乏、丙二酸尿、中链酰基辅酶A脱氢酶缺乏、甲基丙二酸血症、线粒体乙酰酰基辅酶A硫解酶缺乏(B-酮硫解酶缺乏)、多种酰基辅酶A脱氢酶缺乏(戊二酸血症，II型)、多种辅酶A羧化酶缺乏(羧化全酶合成酶缺乏)、丙酸血症、短链酰基辅酶A脱氢酶缺乏、短链羟基乙烯辅酶A脱氢酶缺乏、三官能蛋白缺乏和极长链酰基辅酶A脱氢酶缺乏。额外的代谢性疾病描述于例如，Chace et al.(2001)Clinical Chemistry47：1166-82；Rashed et al.(1997)Clinical Chemistry 43(7)：1129-41；Schulze etal.(2003)Pediatrics 111(6)：1399-1406；and Zytkovicz et al.(2001)ClinicalChemistry 47(11)：1945-55中。
I型酪氨酸血症(例如，遗传性I型酪氨酸血症)，例如，是由延胡索酰乙酰乙酸酶(fumarylacetoacetase)活性的缺乏引起的，这种缺乏导致乙酰乙酸酶的蓄积(图1)。延胡索酰乙酰乙酸被其它酶快速转化为琥珀酰丙酮，由此患有I型酪氨酸血症的患者在其血液中蓄积琥珀酰丙酮。因此，单独检测琥珀酰丙酮或一起检测检测琥珀酰丙酮和其它生物分子(例如，代谢性生物分子)的能力可用于评价受试者的健康状态。因此，可能的是，同时检测试样中的其它氨基酸如酪氨酸和蛋氨酸，以及其它生物分子如游离肉毒碱和酰基肉毒碱，这种检测例如通过在质谱法分析中鉴定所述分子的独特峰来进行。表1包括可使用本申请所述的方法用琥珀酰丙酮(通过衍生化的琥珀酰丙酮)来检测/测量的分析物(例如，生物分子)的非穷举性列举。
由本申请所述的方法获得的代谢分布可用于诊断或预测各种代谢性疾病的易感性(susceptibility)，因为所检查的生化指示剂(例如，琥珀酰丙酮)可以是所述病症的指示，无论这些病症的生理学症状或行为症状是否变得明显(例如，怀疑患有代谢性疾病如氨基酸病(例如，I型酪氨酸血症)的人)。本申请所述的代谢分布可用于监测受试者(例如，哺乳动物如人)例如进行代谢性疾病治疗的受试者的代谢。作为非限制性实例，所述方法可用于确定具体治疗的治疗效果(例如，将琥珀酰丙酮的水平恢复至生理水平的治疗的能力)。基于这种测定，所述受试者可被提供额外的或供选的治疗选择。所述代谢分布也可用于评价患者对具体治疗方式如饮食限制(例如，将琥珀酰丙酮的水平恢复至生理水平的饮食方案的效力)的顺应性。因此，本申请所述的技术适用于筛查、诊断、预测、监测治疗和顺应性(compliance)，并且确定名单所列的两种或多种生物分子(如琥珀酰丙酮和一种或多种氨基酸、游离肉毒碱或酰基肉毒碱)的存在或量的任何其它应用都是有用的。
使用本申请所述的方法产生的代谢分布可使用多种生物试样获得。合适的试样包括上述的那些。
在一个方面，如本申请所述的代谢分布可用于评价代谢性疾病如氨基酸病(例如，I型酪氨酸血症)的存在或不存在。
所有年龄的受试者都有可能被使用本申请所述的代谢分布诊断的代谢性疾病感染。因此，在本申请所述的方法中使用的试样可从任何年龄的受试者(例如，人)获得，包括婴儿(neonate)、新生儿(newborn)、幼儿(baby)、儿童和成人，如患有或怀疑患有酪氨酸血症的怀孕的女性和个体。所述方法也可用于面临感染代谢性疾病危险的个体。所述个体包括具有以下情况的个体：(i)所述病症的家族史(遗传倾向)或(ii)发展所述病症的一种或多种危险因子。如果在母体试样如羊水、孕妇外周血或血浆中琥珀酰丙酮或至少一种额外分析物(例如，一种或多种氨基酸、游离肉毒碱或酰基肉毒碱)水平的变化是明显的，所述方法也可用于产前诊断。所述方法还可用于监测具有与琥珀酰丙酮水平改变相关的健康状况的个体中琥珀酰丙酮水平，所述个体如进行肝移植的个体。
本申请所述的方法涉及检测琥珀酰丙酮和一种或多种额外的生物分析物(例如，氨基酸、游离肉毒碱或酰基肉毒碱)的存在或量，其中每种生物分子的存在或量与代谢性疾病的存在或不存在相关。期望时，本申请所述的方法可定量使用，从而允许对试样结果与已知的或一种或多种预定标准量的具体分析物进行比较(例如，通过使用上文所述的内标物)。当将试样与参比试样(其可以是正常的参比或代谢性疾病参比)进行比较时，所述方法也可定量使用。在这种形式中，生物分子的相对量可为代谢性疾病的指示。参比试样，例如，可来自以下受试者，所述受试者患有、并不被怀疑患有病症(如代谢性疾病如氨基酸病(例如，I型酪氨酸血症))或并不面临发展所述病症的危险。
一般而言，针对通常测试的分析物和酶，给定生物分子的截止值(cut-offvalue)可发生变化，并且在本领域是已知的。本领域已知的常规的明显的适应(adaptation)可用于建立不常见测试分析物的截止值。截止值通常为生物分子的量，或与另一种生物分子的比例，在所述截止值之上或之下所述生物分子被视为代谢性疾病的指征或再检验的起因。由此，根据本申请所述的技术，具体试样类型中至少一种生物分子的参比水平鉴定为截止值，在大于截止值时在至少一种生物分子的存在和代谢性疾病的存在(或不存在)之间有着显著关联。应该理解生物分子名单可解释为整体、部分或基于分析物-分析物(analyte-by-analyte)解释。
本领域技术人员应该认识到一些截止值不是绝对的，因为在所述截止值的任一端的值域范围中临床关联仍然是显著的；然而，可能的是针对具体试样类型选择生物分子的最佳截止值(例如变化的H得分(H-score)等)。通常将所确定的用于本申请所述方法的截止值与公开的范围进行比较，但可将其个体化以适应所用的方法学和患者群体的需要。应该理解最佳截止值的改进可根据所用的统计方法的复杂化(sophistication)以及用于确定不同生物分子和试样类型参比水平值的试样的数目和来源来确定。因此，可根据周期再评价(periodic re-evaluation)或方法学的变化或总体分布对所建立的截止值进行上调或下调。此外，期望时可使用仪器特异性截止值，例如当仪器间性能相似性＞10％时。
参比水平可由各种方法确定，只要得到的参比水平精确地提供了每种生物分子的量，在大于所述量时存在第一组受试者(例如，人)，所述受试者患代谢性疾病的概率不同于具有低于参比水平的代谢分析物或酶活性量的第二组受试者的患病概率。参比水平可如下确定：对例如患有相同代谢性疾病的各种群受试者(例如，患者)中生物分子的量进行比较。这可通过例如直方图分析来实现，在直方图分析中，患者的全部同龄组以图解方式表现，其中第一轴代表生物分子的量，第二轴代表在给定量时其试样含有一种或多种生物分子的同龄组中受试者的数目。两个或多个分别的受试者组可如下确定：鉴别具有相同或类似生物分子水平的同龄组的种群的亚组。然后可基于最能分辨这些分别的组的量来进行参比水平的确定。参比水平可以是单一的数，其同样适用于每个受试者，或参比水平可根据受试者的具体亚群而变化。例如，就同一代谢性疾病而言，年长的受试者可能具有不同于年轻受试者的参比水平。此外，患有更多重病(例如，代谢性疾病的更严重形式)的受试者可具有不同于患有所述疾病的轻度形式的受试者的参比值。
所述方法也可用于确定其它生物学活性的酮例如类固醇的存在或量。例如，本申请所述的方法可用于检测获自受试者(例如，人类患者)的生物试样中类固醇的存在或量，所述方法可用于诊断或产生代谢分布，所述代谢分布用于诊断与类固醇水平改变相关的一种或多种病症，例如，21-OH缺乏、11b-OH缺乏、盐耗(salt wasting)21-OH缺乏、肾上腺癌、肾上腺增生、垂体功能减退、醛固酮合成酶缺乏、肾上腺皮质病症、绝经或怀孕。
鉴定调节琥珀酰丙酮水平的化合物的方法
本申请还提供了鉴定在细胞中调节(例如，降低)琥珀酰丙酮水平的化合物的方法。所述化合物可调节琥珀酰丙酮和多种额外的生物分子例如，但不限于游离肉毒碱、酰基肉毒碱和氨基酸(例如，脯氨酸、蛋氨酸或酪氨酸)。如上文所讨论的那样，因为失调的(例如，升高的)琥珀酰丙酮水平与某些病症(例如，氨基酸病)的增加的危险相关，如此鉴定的化合物可用于治疗氨基酸病如I型酪氨酸血症。可与候选化合物接触的细胞可以是任何物种的细胞，只要所述细胞产生琥珀酰丙酮(无论是合成的还是天然的)。所述细胞可以是原代细胞或细胞系并可以是任何组织学类型的细胞，例如而不限于上皮细胞、成纤维细胞、淋巴样细胞、巨噬细胞/单核细胞、粒细胞、角质形成细胞、神经元细胞(neuronal cell)或肌细胞。所述细胞可在组织培养皿中培养。通常优选的是在多孔测定板(例如，96孔或384孔测定板)中培养细胞，从而可一次性评价多种候选化合物。可将候选化合物(任选为不同的浓度范围例如，0.001nM至10mM)加到含有细胞的溶液(例如，培养基)中，或者当所述化合物为蛋白质时，所述细胞可重组表达该蛋白质。在孵育表达琥珀酰丙酮的细胞后，可使用本申请所述的试样制备(提取)方法和串联质谱法确定琥珀酰丙酮的存在或水平。在检测前，可将细胞在允许制备试样的条件下溶解，该条件与本申请所述的提取方法和串联质谱法相容。通常可将作为阳性对照或阴性对照的对照化合物加到一组细胞中。
本申请所述的任何方法中鉴定的化合物包括各种化学种类。化合物可以是生物分子，包括但不限于肽、多肽、肽模拟物(例如，类肽)、氨基酸、氨基酸类似物、糖、脂肪酸、类固醇、嘌呤类、嘧啶类、它们的衍生物或结构类似物、多核苷酸和多核苷酸类似物。化合物可以是小分子化合物或大分子化合物。
通过使用本申请所述的各种信息库鉴定测试化合物允许随后对测试化合物“目的化合物(hit)”或“先导化合物(lead)”进行修饰以优化“目的化合物”或“先导化合物”调节细胞中琥珀酰丙酮水平的能力。
可对本申请所述的方法进行改良以鉴定调节生物学活性的酮(如类固醇或本申请所述的任何生物学活性的酮)水平的化合物。
试剂盒
本申请还提供了试剂盒，其用于制备用来检测和/或测量(利用串联质谱法)试样(如干燥过的血样或本申请所述的任何试样)中琥珀酰丙酮以及多种其它分析物(例如，氨基酸、游离肉毒碱和酰基肉毒碱)的试样。所述试剂盒可用于在单次步骤中从试样(例如，血斑)中提取琥珀酰丙酮以及一种或多种额外的分析物(例如，氨基酸、酰基肉毒碱和肉毒碱)，从而使提取物中琥珀酰丙酮和额外的分析物(例如，氨基酸、肉毒碱和酰基肉毒碱)的浓度反映它们在试样中的相应浓度(或比例)。所述试剂盒可用于制备试样，从而同时筛选琥珀酰丙酮、丙氨酸、精氨酸、瓜氨酸、甘氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、鸟氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸和酰基肉毒碱，如CO、C2、C3、C3DC/C4OH、C4、C4DC/C5OH、C5、C5:1.C5DC/C6OH、C6、C6DC/C7OH、C8、C8:1、C10、C10:1、C10:2、C12、C12:1、C14、C14:1、C14:2、C14OH、C16、C16:1、C16OH、C16:10H、C18、C18:1、C18:2、C18OH、C18:1OH(参见表1)。
所述试剂盒可包括用于随后质谱分析的一种或多种内标物和/或对照。例如，所述试剂盒可包括作为对照的琥珀酰丙酮(SA)和作为内标物的标记的(例如，同位素标记的)SA的衍生化形式(例如，3，4，5，6，7-13C5-(3-(5-甲基-1H-吡唑-3-基)丙酸(MPP))。琥珀酰丙酮和/或衍生化的琥珀酰丙酮可分别在所述试剂盒中以液体或干燥过的(例如，冻干的)形式存在。琥珀酰丙酮和/或衍生化的琥珀酰丙酮可按以下的量提供：约1毫摩尔(例如，约1.5毫摩尔、约2毫摩尔、约2.5毫摩尔、约3.0毫摩尔、约3.5毫摩尔、约4.0毫摩尔、约4.5毫摩尔或约5毫摩尔)。所述试剂盒可包括琥珀酰丙酮或衍生化的琥珀酰丙酮(例如，MPP)，它们位于含有一种或多种额外对照或内标物的容器中。例如，所述试剂盒可包括含有琥珀酰丙酮对照、一种或多种氨基酸对照，和一种或多种肉毒碱(例如，游离肉毒碱和酰基肉毒碱)对照的容器。所述试剂盒也可包括作为对照的脯氨酸，和作为内标物的稳定标记的(例如，同位素标记的)脯氨酸。
所述试剂盒也可包括强碱如肼，例如，二盐酸肼或本申请所述的任何其它强碱。所述碱可在溶液中按以下浓度提供：小于约0.5％(例如，小于约0.05％、小于约0.06％、小于约0.07％、小于约0.08％、小于约0.09％、小于约0.1％、小于约0.15％、小于约0.2％、小于约0.25％、小于约0.3％、小于约0.35％、小于约0.4％、小于约0.45％或小于约0.475％)。
包括在所述试剂盒中的一种或多种溶液可贮存在例如硅烷化玻璃小瓶中。试剂盒的一种或多种组分可贮存在这样的容器中，其防止物质的损失或溶剂的蒸发或使物质的损失或溶剂的蒸发最小化。例如，所述容器可用隔膜密封。
所述试剂盒可包括例如，用作对照的干燥过的血液(例如，血浆、淋巴)斑点。例如，干燥过的血斑可富集一种或多种分析物(例如，一种或多种已知浓度的分析物)如琥珀酰丙酮、一种或多种氨基酸、游离肉毒碱或一种或多种酰基肉毒碱。
所述试剂盒也可任选包括提取溶液如本申请所述的任何提取溶液。所述提取溶液可含有C1-3直链或支链一元醇和强碱。所述试剂盒也可包括一种或多种含有例如乙腈或异丙醇的溶剂溶液。所述溶剂溶液也可含有水，例如，含有80％乙腈和20％水的溶剂溶液。
在一些实施方案中，所述试剂盒也可包括一种或多种组分，所述组分用于测试试样中生物素酰胺酶(biotinidase)活性以及用于测试受试者中溶酶体贮存病症(lysosomal storage disorder)或半乳糖血症的存在。
然后可将所述试剂盒用于检测新生儿血液中升高的或降低的琥珀酰丙酮、氨基酸、游离肉毒碱或酰基肉毒碱水平，用于针对若干代谢性疾病中的一种或多种。例如，升高的琥珀酰丙酮水平可指示I型酪氨酸血症。游离肉毒碱和酰基肉毒碱是通常分类为脂肪酸氧化(FAO)病症有机酸尿病症(OAD)的标志物。类似地，氨基酸用作统称为氨基酸病的若干代谢性疾病的标志物。这些病症是先天性代谢缺陷(或遗传性代谢缺陷)。
应该理解，实质上并不影响本发明各种实施方案的作用的修改也包括在本申请提供的发明的定义中。因此，以下实施例旨在阐述而不是限制本发明。
实施例
实施例1
使用获自受试者的全血制备参比标准血液(全血)斑点。对血液如下处理：将血红蛋白浓度调节至17mg/dL，向血液中加入已知浓度的若干氨基酸、肉毒碱、酰基肉毒碱和琥珀酰丙酮。将经处理的血液分配到滤纸卡上，从而在滤纸基质上形成血斑。每个血斑是通过分配75μL经处理的血液而产生的。将血斑干燥过夜。
将干燥过的血斑的小圆片(1/8”)穿孔，然后置于微量滴定板的孔中。试样如下提取：调配100μL提取溶液，其由甲醇和水的混合物构成，相对体积-体积比例大约为78％甲醇和22％水。此外，提取溶液含有3mM草酸和浓度为600μM的二盐酸肼。用于若干氨基酸、肉毒碱、酰基肉毒碱和琥珀酰丙酮(MPP)的内标物(相关分析物的稳定重同位素类似物)也存在于提取溶液中。包括在溶液中的内标物在图5所示的串联质谱法扫描中指明。
在自动液体处理装置的辅助下，将提取的试样注射到电喷射三重四级串联质谱仪中。通过46次扫描的中性丢失获得氨基酸和琥珀酰丙酮(MPP)的质谱数据。
实施例2.
含有已知浓度的若干氨基酸、肉毒碱、酰基肉毒碱和琥珀酰丙酮的血斑如上制备(实施例1)。将干燥过的血斑的小圆片(1/8”)穿孔，然后置于微量滴定板的孔中。试样在内标物存在下如上所述提取。
提取后，将试样蒸发至干。然后将干燥过的试样在3N HCl/正丁醇中重组，然后在39℃孵育约30分钟。该次孵育后，将试样再次蒸发至干，然后在乙腈和水的溶液中重组。
在自动液体处理装置的辅助下，将提取的试样注射到电喷射三重四级串联质谱仪中。在102次扫描的中性丢失采集数据。丁酯形成的证据为，由这种酯化(图6)使离子的m/z增加了56道尔顿(Da)(交叉参考图5)。这些数据显示在对琥珀酰丙酮(如本申请所述)进行衍生化之后，需要时可进一步处理(例如，酯化)试样，以检测其它分析物组成。
实施例3.
干燥过的血斑如上制备。将血斑用表2和表3所示的不同水平的分析物(氨基酸、琥珀酰丙酮(SA)、游离肉毒碱和酰基肉毒碱)穿刺。血斑如上所述提取(实施例1；表中指明的每种分析物的定义参见表1)。在自动液体处理装置的辅助下，将提取的试样注射到电喷射三重四级串联质谱仪中。通过m/z 46次扫描的中性丢失获得氨基酸和琥珀酰丙酮(MPP)的质谱数据，通过m/z 85次扫描先驱离子获得肉毒碱和酰基肉毒碱的质谱数据。回收的各种分析物的百分数通过与每种分析物的内标物进行比较来确定。
各种百分比回收率显示于表2中，精确的各种水平显示于表3中。
不精确性的确定通过分析表3中所述的试样来确定。每种试样运行包括对每种试样进行三次穿孔，所述试样如实施例1所述来处理和测量。该研究每天包括两次这样的运行，共5天。有了这种信息，确定以下的不精确性组成：运行中、运行间-日中和日间的不精确性，由此确定总的不精确性。不精确性的结果示于表3中。
这些数据显示，本申请所述的方法可用于利用串联质谱法同时提取和定量MPP、氨基酸、肉毒碱和酰基肉毒碱。
实施例4.
酪氨酸目前用作筛查I型酪氨酸血症的诊断标志物。为了显示检测到，与酪氨酸相比，琥珀酰丙酮导致用于确定个体中I型酪氨酸血症状态的特异性增加，针对相关酪氨酸和琥珀酰丙酮(MPP)浓度，将来自被感染的患者(即，I型酪氨酸血症阳性患者)的血样与已知正常试样进行比较。来自健康新生儿的干燥过的血斑和来自证实患有I型酪氨酸血症的新生儿干燥过的血斑在25小时龄和14日龄获得。如上所述提取血斑并进行质谱分析(实施例1)。然而被感染的患者在25小时龄(新生儿筛查床)显示正常的酪氨酸水平，直到患者14日龄时酪氨酸水平才显著升高(图7光谱和图8；表和条形图)。相反，琥珀酰丙酮(MPP)在甚至出生后25小时就显示非常显著的升高(偏离正常中值的30-40标准误差)。由此，在25小时龄时，若酪氨酸不是唯一使用的标志物，则这种患者将为假阴性。因此针对I型酪氨酸血症的早期检测是关键的，检测琥珀酰丙酮对针对这种病症而言是非常有益的。
实施例6.
本申请所述的许多方法使用强碱与琥珀酰丙酮形成席夫碱，从而使其可被提取和测量。肼可呈若干形式获得，例如，水合肼或二盐酸肼。然而这两种形式在本申请所述的方法中都有类似的表现，为了测试这两种形式中哪种是最稳定的并由此具有最长的贮存期限，历时约60天的时间跨度来测试每种形式的相对稳定性。将每种形式的肼溶液(水合肼为0.5％，二盐酸肼为0.1％)在30℃孵育，并且在各个时间点(例如，1至约60天)，由标准化荧光测定法来确定每种肼形式的量。水合肼被确定为不稳定的，而二盐酸肼被确定为更稳定的，由此更适于坚固的产物(图9)。
表2.干燥过的血液中各种分析物的回收率百分数
     穿刺   回收率 穿刺   回收率 穿刺   回收率 穿刺   回收率
     (μM)         (μM)         (μM)         (μM)
ALA  81     67     644    77     1450   78     3261   90
ARG  79     70     635    71     1429   71     3216   80
CIT  31     90     251    86     564    83     1270   92
GLY  83     83     665    79     1495   78     3364   88
LEU  45     68     357    70     803    70     1807   79
MET  21     74     171    73     385    72     866    81
SA   4      72     29     69     65     66     147    76
ORN  68     100    544    94     1223   92     2752   101
PHE  42     101    337    99     759    99     1708   109
PRO  63     96     507    94     1141   92     2567   104
TYR  54     94     431    93     969    91     2181   102
VAL  41     78     324    83     730    83     1642   93
C0   45     101    362    94     814    92     1831   102
C2   14     79     110    77     248    75     557    83
C3   1.7    72     14     73     31     71     70     81
C4   1.3    71     10     68     24     66     53     75
C5   1.2    80     10     76     21     74     48     82
C5DC 0.5    102    4      97     9      95     21     104
C6   1.2    83     10     80     21     77     48     87
C8   0.8    80     7      76     15     73     33     80
C10  0.5    85     4      80     9      78     20     88
C12  0.9    82     7      78     15     75     35     85
C14  0.8    87     6      84     14     83     31     92
C16  1.5    84     12     82     28     81     62     90
C18  0.5    90     4      79     10     80     22     88
Figure G2008800232478D00241
表3.总不精确性.
     测量的 ％CV  测量的 ％CV 测量的 ％CV 测量的 ％CV
     μM          μM         μM         μM
ALA  567.1  8     604.1  9    709.9  8    1104.2 7
ARG  30.0   7     51.1   7    135.6  6    476.8  7
CIT  29.1   11    39.7   10   81.6   8    243.9  9
GLY  327.1  10    359.0  9    463.1  8    867.0  9
LEU  185.6  7     201.2  7    251.8  6    447.1  6
MET  27.2   7     33.5   8    57.0   7    152.3  7
SA   0.8    25    1.7    21   5.4    12   20.5   10
ORN  127.2  7     152.5  7    254.6  6    637.2  7
PHE  84.7   7     102.2  8    166.3  7    419.5  8
PRO  275.5  9     304.4  9    398.9  6    763.4  9
TYR  83.8   8     104.1  7    182.0  7    482.8  7
VAL  206.2  8     222.9  8    278.6  7    489.2  8
C0   51.0   7     67.9   7    134.9  8    390.0  6
C2   36.4   7     42.0   8    60.8   7    134.6  7
C3   3.3    9     4.0    11   6.3    8    15.3   9
C4   0.3    11    0.7    10   2.2    8    8.3    10
C5    0.3    11    0.6    10   2.0    7    7.4    7
C5DC  0.2    13    0.4    12   1.2    10   4.2    8
C6    0.1    12    0.5    10   2.0    8    7.7    8
C8    0.1    13    0.4    9    1.3    8    5.0    7
C10   0.1    12    0.3    10   0.9    9    3.3    7
C12   0.1    10    0.4    8    1.5    7    6.0    7
C14   0.2    10    0.4    8    1.4    7    5.3    7
C16   2.2    8     2.7    7    4.6    6    12.2   8
C18   2.1    7     2.3    6    2.9    6    5.5    10
总％CV包括：运行中、运行间-日中和日间的不精确性。
其它实施方案包括在所附的权利要求的范围中。

Claims (43)

1.检测琥珀酰丙酮的方法，所述方法包括：
使试样与包含甲醇和强碱的提取溶液接触；
对试样中的琥珀酰丙酮进行衍生化；以及
利用串联质谱法评价衍生的试样中的衍生化的琥珀酰丙酮。
2.检测琥珀酰丙酮的方法，所述方法包括：
使试样与包含甲醇和肼的提取溶液接触；
将试样中的琥珀酰丙酮衍生为3-(5-甲基-1H-吡唑-3-基)丙酸(MPP)；以及
利用串联质谱法评价衍生的试样中的MPP。
3.权利要求2的方法，还包括针对一种或多种额外分析物来评价试样。
4.权利要求3的方法，其中将同一试样注射中的一种或多种额外的分析物与MPP一起评价。
5.检测琥珀酰丙酮的方法，所述方法包括：
使试样与含有有机溶剂的提取溶液在实质上不固定蛋白质的条件下接触；
将试样中的琥珀酰丙酮衍生为3-(5-甲基-1H-吡唑-3-基)丙酸(MPP)；以及
利用串联质谱法评价衍生的试样中的MPP和额外分析物(或其衍生物)。
6.权利要求2或5的方法，其中所述提取溶液包含至少约5％水。
7.权利要求2或5的方法，其中所述提取溶液包含小于约85％甲醇。
8.权利要求2或5的方法，其中所述琥珀酰丙酮用肼或衍生的肼来进行衍生化。
9.权利要求2或5的方法，其中所述试样为干燥过的血样。
10.权利要求2或5的方法，其中所述试样来自新生人类。
11.权利要求2或5的方法，还包括：基于对试样中琥珀酰丙酮的检测，确定试样所来源的受试者是否患有遗传性I型酪氨酸血症或面临发展所述疾病的危险。
12.权利要求11的方法，还包括在确定受试者患有遗传性I型酪氨酸血症或面临发展所述疾病的危险后，给予受试者4-羟基苯基丙酮酸双加氧酶的抑制剂。
13.权利要求2或5的方法，其中在质谱分析之前，所述试样中包括衍生化的琥珀酰丙酮，所述衍生化的琥珀酰丙酮包含至少一种重原子同位素。
14.检测生物学活性的酮的方法，所述方法包括：
使试样与包含甲醇和强碱的提取溶液接触；
对试样中的生物学活性的酮进行衍生化；以及
利用串联质谱法评价衍生的试样中的衍生化的生物学活性的酮。
15.权利要求14的方法，其中生物学活性的酮为琥珀酰丙酮。
16.权利要求14的方法，其中生物学活性的酮为类固醇。
17.用于检测琥珀酰丙酮的试剂盒，所述试剂盒包含：
衍生化的琥珀酰丙酮，所述琥珀酰丙酮包含至少一种重原子同位素；以及
如何检测衍生化的琥珀酰丙酮的说明书。
18.权利要求17的试剂盒，其中所述衍生化的琥珀酰丙酮为3-(5-甲基-1H-吡唑-3-基)丙酸(MPP)。
19.权利要求17的试剂盒，还包括强碱。
20.权利要求19的试剂盒，其中所述强碱为肼。
21.权利要求20的试剂盒，其中所述肼为二盐酸肼。
22.权利要求20的试剂盒，其中所述肼呈浓度小于约0.1％的溶液形式。
23.权利要求17的试剂盒，还包括一种或多种内标物，每种内标物含有(i)氨基酸、游离肉毒碱或酰基肉毒碱，和(ii)至少一种重原子同位素。
24.权利要求17的试剂盒，还包括至少一种干燥过的血斑，所述血斑包含已知量的一种或多种或琥珀酰丙酮、氨基酸、游离肉毒碱或酰基肉毒碱。
25.提取的方法，所述方法包括：
使试样与提取溶液接触，所述提取溶液包含甲醇和强碱，其中使试样与提取溶液接触从试样中产生了包含以下成分的提取物：(i)衍生化的琥珀酰丙酮，(ii)一种或多种氨基酸，(iii)游离肉毒碱，(iv)一种或多种酰基肉毒碱，或(v)(ii)、(iii)或(iv)的任何衍生化形式，其中衍生化的琥珀酰丙酮在提取物中的浓度反映了琥珀酰丙酮在试样中的浓度，其中一种或多种氨基酸、游离肉毒碱、一种或多种酰基肉毒碱或它们的衍生化形式在提取物中的浓度反映了它们在试样中的相应浓度。
26.权利要求25的方法，还包括在使试样与提取溶液接触后，利用串联质谱法对试样进行分析。
27.权利要求25的方法，其中所述接触将至少一种琥珀酰丙酮分子衍生为3-(5-甲基-1H-吡唑-3-基)丙酸(MPP)。
28.权利要求25的方法，其中所述试样为生物试样。
29.权利要求28的方法，其中所述生物试样为干燥过的血样。
30.权利要求25的方法，其中所述提取溶液还包含水。
31.权利要求25的方法，其中所述提取溶液包含约5％至约30％水。
32.权利要求25的方法，其中所述强碱为肼。
33.权利要求25的方法，其中所述强碱为修饰的肼。
34.权利要求25的方法，其中所述提取溶液还包含有机酸。
35.权利要求34的方法，其中所述有机酸为草酸。
36.权利要求25的方法，其中所述提取溶液还包含一种或多种内标物。
37.权利要求25的方法，还包括在使试样与提取溶液接触后，对试样进行蒸发，得到第一次蒸发的试样。
38.权利要求37的方法，还包括对试样进行蒸发后，使第一次蒸发的试样与烷基醇溶液接触，所述烷基醇溶液包含烷基醇和酸。
39.权利要求38的方法，其中所述烷基醇为正丁醇。
40.权利要求38的方法，其中所述酸为HCl。
41.权利要求38的方法，还包括使试样与所述烷基醇溶液接触后，蒸发溶液，得到第二次蒸发的溶液。
42.权利要求41的方法，还包括重组第二次蒸发的溶液。
43.权利要求42的方法，其中所述重组包括使第二次蒸发的溶液与包括乙腈的溶剂接触。
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