CN101977925B - 优化的粘附素片段及相应的纳米颗粒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及优化的粘附素和在其上连接有所述粘附素的纳米颗粒。另外，本发明还涉及提供所述纳米颗粒作为体内造影剂，特别地用于肠癌的诊断。

Description

优化的粘附素片段及相应的纳米颗粒
本发明涉及优化的粘附素和在其上连接有所述粘附素的纳米颗粒。另外，本发明还涉及提供所述纳米颗粒作为体内造影剂，特别地用于肠癌的诊断。
对于许多疾病而言，尽可能早且有效力的诊断对于选择以及调整和施行必要的医疗措施具有决定性的意义。对于许多肿瘤种类来说尤其如此，关于所述肿瘤种类的鉴定和疗法(包括可能的切片)而言区别出健康的和癌变的组织是关键的。因此，患者的康复或者甚至存活决定性地取决于负责治疗和/或手术的医生是否以及在多大程度上能够区分不同的组织类型。
为了改善诊断和医疗措施，过去已开发出了造影剂，在其帮助下可以通过成像方法而使得体内的功能和结构可见。这些方法尤其用于有针对性地检测癌症相关的细胞变化。
例如，从WO 2007/057182A 3中获知包含至少三种结构(即无机核心，其包覆有钝化层，该钝化层又携带有特异性配体)的荧光纳米颗粒。这些配体允许所述纳米颗粒与靶分子(“靶标”)的特异性结合。所述靶分子尤其可以是靶细胞的特异的表面分子，例如肿瘤相关抗原。
从该出版物中获知的具有核心和围绕的钝化层的纳米颗粒具有小的流体动力学直径，所述流体动力学直径优选地在5和15nm之间。这种大小的纳米颗粒可以通过肾脏排出，并因此在体内不积累或者最多只以可认为正当的量积累。这是关于将纳米颗粒用于医疗目的的决定性要求之一。
另一个先决条件是连接在纳米颗粒上的配体在体内识别所选择的靶结构的高的特异性。只有高特异性的识别才允许检测，而检测正是造影剂的医疗应用的首要目的。这些高特异性的配体必须同时是如此小的，从而不妨碍纳米颗粒的良好分布和穿透深度。经常使用的特异性配体(例如，抗体或Fab片段)通常太大了从而不能满足这一要求。
在工业化国家中，肠癌新病例的数目在最近30年中明显增加了。以程度为30-35/100,000位居民的年新病例数目(发病率)，肠癌是中欧最常见的恶性疾病之一并且是造成所有癌症死亡病例中的大约15％的原因。据估计全球发病率为1百万新病例/年。与女性相比，男性略微更常见地受到影响，这尤其对于直肠癌是如此(性别比率60∶40)。
在德国，不仅在新病例方面而且在癌症死亡方面(在男性和女性中)，肠癌均是第二常见的癌症形式，2005年有超过20,000人死亡。流行病学癌症登记协会(Gesellschaft der epidemiologischenKrebsregister)甚至估计每年有差不多30,000例死亡比例。
肠癌是指肠的所有恶性肿瘤。在此，其可以是类癌(尤其是在阑尾中和在小肠中)，平滑肌肉瘤和胃肠道基质肿瘤(GIST)，其分别源自平滑肌系统和肠粘膜的结缔组织。但是，这些疾病是相当罕见的，并且仅代表所有肠癌病例中的一小部分。盲肠、结肠或直肠的腺癌代表了所有肠癌病例中最大的部分(超过95％)。对此，还概括性地使用术语“结肠直肠癌”。
肠癌，尤其是直肠结肠癌，很少首先引起症状，其几乎总是形成自起初良性的肠息肉。通过手术和随后的化学疗法的治愈机会(平均40％至60％的五年存活率)决定性地取决于发现肠癌时所处的疾病阶段。因此，预防措施以及早期诊断具有特别的意义。通过肠癌细胞特别是CRC细胞(结肠直肠癌细胞(Colorectal Cancer Cells))的及早检测，早期诊断将是可能的。
为了检测CRC细胞，需要靶标，所述靶标对于所述细胞而言是特异的并且尽可能在肿瘤中过表达。关于CEACAM家族(CEA-相关的细胞粘附分子；CEA＝癌胚抗原)的成员描述了，它们的表达在CRC细胞中被上调。因此，CEACAM家族成员特别适合作为用于检测CRC细胞的靶标。属于此类的尤其为CEA(CEACAM5)和NCA(CEACAM6)。
CEACAM家族是Ig超家族的成员。每个家族成员均被高度糖基化并且由N-末端Ig可变区-样结构域(在其后紧接有至多6个IgC2结构域)组成。CEACAM1、CEACAM3和CEACAM4通过羧基末端的跨膜结构域和胞质结构域而插入到细胞膜中，而CEA(CEACAM5)、CEACAM6(NCA)、CEACAM7和CEACAM8通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)而锚定在膜上。在该组内，所述N-末端结构域在氨基酸水平上具有超过90％的相似性。
在结肠组织中，CEA和NCA存在于柱状上皮和杯状细胞中。在那里，它们位于成熟肠细胞的顶部表面上，更确切地说位于糖萼/微绒毛区域中。CEACAM充当细胞间粘附分子。CEACAM在正常结肠上皮细胞中的这种严格的顶端定位在腺癌细胞中被取消——因此所述蛋白质在整个细胞表面上表达。在CRC细胞中，细胞组构和细胞极性被取消，因此发现例如CEA和/或NCA位于整个细胞表面上。CEA可以被释放出来，从而其进入血液中并因此作为血清肿瘤标志物而被检测出。
作为这些受体的配体，尤其已描述了大肠杆菌的Dr家族的粘附素(Afa/Dr粘附素，DrCEA亚家族)。在此，这些粘附素位于弥散粘附性大肠杆菌(diffusely adhering E.coli，DAEC)菌株的细菌表面上(部分地组构在菌毛中)，并且介导所述细菌与上皮细胞的粘附。该家族的成员例如为AfaE-I、AfaE-III、AfaE-V、DraE和DaaE。
编码Afa/Dr粘附素的结构装配基因具有同样的组构。它们由包含至少5个基因(A至E)的操纵子组成。在此，基因A至D编码附属基因(akzessorische Gene)，其中基因D编码侵袭素。基因E编码真正的粘附素。
该基因簇具有高度保守的区域，例如，基因afaA、afaB、afaC、afaD和afaF，它们例如具有调节或分子伴侣功能。所述结构性的、编码AfaE的基因是非常异质的，这导致产生在抗原性方面不同的粘附素。
表达粘附素的Afa/Dr家族的这些成员的大肠杆菌粘附到表达CEA的CHO细胞上(Berger等人，Molecular Microbiology，(2004)52(4)，pp.963-983，“Differential recognition of members of thecarcinoembryonic antigen family by Afa/Dr adhesins of diffuselyadhering Escherichia coli(Afa/Dr DAEC)”)。此外，Alain L.Servin(Clinical Microbiology Reviews(April 2005)18(2)，pp.264-292，“Pathogenesis of Afa/Dr Diffusely Adhering Escherichia coli”)也描述了粘附素。
但是，这些已知的粘附素在其对于CEA的亲和力方面仍不令人满意。因此，本发明的任务在于提供对于CRC细胞具有高亲和力的粘附素或粘附素片段(“粘附素构建体”)。为此，相比于已知的野生型粘附素而言，应当尽可能地改善对于CEA的亲和力。
此外，本发明的目标还是提供这样的粘附素和/或粘附素片段，所述粘附素和/或粘附素片段适合于作为配体而连接在可用于提供造影剂的纳米颗粒上。这些粘附素和/或粘附素片段应当优选地在医疗上是可用的，特别优选地可用作体内造影剂。
为了完成这一任务，提供了这样的粘附素或粘附素片段，所述粘附素或粘附素片段相比于各自的野生型粘附素氨基酸序列(优选地，DraE野生型序列)而言通过突变而进行了修饰。有利地，所述修饰导致经改善的根据本发明的粘附素对于CEACAM家族成员(特别是对于CEA和/或NCA)的亲和力。根据本发明的粘附素或粘附素片段在下文中也统称为“经修饰的”或“优化的”粘附素。
所述优化的粘附素包含一个或多个下列突变(在此，氨基酸位置的编号基于DraE野生型氨基酸序列；也可参见DraE的SEQ ID No.1，图1)。
T7(N，F，C，S，V，R，A，I，L，Y)；E 17(S，P，K，G，D，R，N，H，Q)；R22(T，A，S，N，K)；D25(S，G，N，A，T，K，R，H，Q，M)；T27(K，R，L，V，Y，P，N，Q)；V28(W，F)；A29(K，R，S，E，Q，F，G，L，H，P，N，T，W)；T 31(G，D，S，N)；Q 34(D，G，S，N，L，V，T，A)；D37N；A 38(S，T，L)；A39(Q，S，D，M，G，F)；I41(V)；Q47(T，N，C，S，G，A，P)；D52(G，N，S，C，P，Q，Y，H，K，R，T)；N84(D，S，H)；R86V；T88(M，L)；T95(L，M，Y，F，C，W，Q，N，E，S，I，H)；F100(Y，V)；V105(S，A，T，R，M，V，P，N，E，Q，G，K，H)；I111(C，V，H，Y，T，M，F)；I114(V，L，A，C)；Y115(T，W，E，V)；V116(A，S，L)；G118(P，S)。
然而，如果存在T88M和/或N77K，那么根据本发明的粘附素必须至少具有上述突变中的另一个。当这些突变存在于DraE组的粘附素中时，特别是如此。
优选的突变为V28W；V28F；A39Q；A39S；I41L；Q47S；Q47T；I85L；T95L；G118S和T123I。
在本发明的范围内，“粘附素”原则上是指能够与来自CEACAM家族的受体的N-末端结构域结合(特别是与CEA和/或NCA结合)的任何蛋白质(在下文也称结合蛋白)。属于此类的包括所谓的“粘附素组”、所谓的“DraE组”的粘附素，以及特别是蛋白DraE和AfaE-III。属于此类的还包括具有源自这些粘附素的共有序列的蛋白质。
优选地，根据本发明的粘附素具有139个氨基酸的序列和17kDa的大小。然而，它们也可以在N-末端和/或C-末端具有缺失，只要随之不失去与CEACAM，特别是与CEA和/或NCA的结合能力。C-末端缺失应当尽可能不超过5、8或最多10个氨基酸。在N-末端处可缺失至多18个氨基酸。但是，短的任何缺失，例如5、8或10个氨基酸的缺失，也是可能的。因而，在本发明的一个实施方案中，所述粘附素的长度为111个氨基酸。
所谓的“粘附素组”由AfaE-5，DrbE-122，DraE，SM254，DaaE；AfaE-2，AfaE-1以及NfaE-111组成(对此，还可参见图2；比对)。根据本发明，它们具有根据SEQ ID No.2的共有序列(图3)，以及一个或多个上述突变。
这同样适用于所谓的“DraE组”，其由下列蛋白质组成(对此，还可参见图4；比对)：G2152、SM297、JJB 30、SM437、SM249、SM246、SM245、SM54、G2171、G2166、G2106、G2102、G2097、G2096、DraE、G2099、G2100、SM252、JJB17、SM293、G2076、SM513、AFaE-III。它们具有根据SEQ ID No.3的共有序列(图5)。因此，在一个实施方案中，本发明涉及具有SEQ ID No.3的粘附素，其中具有一个或多个上述突变。
具有根据SEQ ID No.4的共有序列(图6)的粘附素是特别优选的。所述共有序列源自DraE和AfaE-III的比对。特别优选的是DraE。
根据本发明的粘附素与CEACAM组的蛋白质的N-末端序列结合，所述CEACAM组的蛋白质优选地具有根据SEQ ID No.5的共有序列(图7)。该组的成员为CEA(CEACAM 5)，NCA(CEACAM 6)，CEACAM 1、3、4、7和8(也可参见图8)。它们优选地与具有SEQ ID No.6的蛋白质的N-末端序列结合，所述SEQ ID No.6源自CEA和NCA的比对(图9，仅存在于CEA中的区域加有下划线)。在一个实施方案中，根据本发明的蛋白质与CEA(SEQ ID No.7，图10)和NCA(SEQ ID.No.8，图11)的N-末端结构域结合。
在一个优选的实施方案中，涉及根据DraE(SEQ ID No.1)的经修饰的粘附素，其与CEA和/或NCA结合并具有上述突变之一。因此，优选的是具有如下的根据SEQ ID No.9的共有序列(比对，图12)的粘附素：
X6 T7(N，F，C，S，V，R，A，I，L，Y)X9 E17(S，P，K，G，D，R，N，H，Q)X4 R22(T，A，S，N，K)X2 D25(S，G，N，A，T，K，R，H，Q，M)X T27(K，R，L，V，Y，P，N，Q)V28(W，F)A29(K，R，S，E，Q，F，G，L，H，P，N，T，W)X T31(G，D，S，N)X2 Q34(D，G，S，N，L，V，T，A)X2 D37N A38(S，T，L)X A39(Q，S，D，M，G，F)XI41(V) X5 Q47(T，N，C，S，G，A，P)X4 D52(G，N，S，C，P，Q，Y，H，K，R，T)X31 N84(D，S，H)X R86V X T88(M，L)X6 T95(L，M，Y，F，C，W，Q，N，E，S，I，H)X4 F100(Y，V)X4 V105(S，A，T，R，M，V，P，N，E，Q，G，K，H)X5 I111(C，V，H，Y，T，M，F)X2 I114(V，L，A，C)Y115(T，W，E，V)V116(A，S，L)X G118(P，S)X21。
在另一个实施方案中，所述粘附素，特别是来自DraE的粘附素，具有根据SEQ ID No.10的共有序列(比对，参见图13)：
X6 T7(N，F，C，S，V，R，A，I，L，Y)X9 E17(S，P，K，G，D，R，N，H，Q)X4 R22(T，A，S，N，K)X2 D25(S，G，N，A，T，K，R，H，Q，M)L26 T27(K，R，L，V，Y，P，N，Q)V28(W，F)A29(K，R，S，E，Q，F，G，L，H，P，N，T，W)X T31(G，D，S，N)X2 Q34(D，G，S，N，L，V，T，A)X2 D37N A38(S，T，L)X A39(Q，S，D，M，G，F)X I41(V)G42 P43 V44 X2 Q47(T，N，C，S，G，A，P)X L49 X2 D52(G，N，S，C，P，Q，Y，H，K，R，T)X31 N84(D，S，H)X R86V X T88(M，L)D89X S91 X3 T95(L，M，Y，F，C，W，Q，N，E，S，I，H)X4 F100(Y，V)X4 V105(S，A，T，R，M，V，P，N，E，Q，G，K，H)X S107 W108X G110 I111(C，V，H，Y，T，M，F)X2 I114(V，L，A，C)Y115(T，W，E，V)V116(A，S，L)X G118(P，S)X21。
在另一个实施方案中，所述粘附素，特别是来自DraE的粘附素，具有下述共有序列(SEQ ID No.11，图14)：
X6 T7(N，F，C，S，V，R，A，I，L，Y)X9 E17(S，P，K，G，D，R，N，H，Q)X C19 X2 R22(T，A，S，N，K)X2 D25(S，G，N，A，T，K，R，H，Q，M)L26 T27(K，R，L，V，Y，P，N，Q)V28(W，F)A29(K，R，S，E，Q，F，G，L，H，P，N，T，W)X T31(G，D，S，N)X2 Q34(D，G，S，N，L，V，T，A)X2 D37N A38(S，T，L)A39(Q，S，D，M，G，F)X I41(V)G42 P43 V44 X2 Q47(T，N，C，S，G，A，P)X L49X C51 D52(G，N，S，C，P，Q，Y，H，K，R，T)X31 N84(D，S，H)X R86V X T88(M，L)D89X S91 X3 T95(L，M，Y，F，C，W，Q，N，E，S，I，H)X4 F100(Y，V)X4 V105(S，A，T，R，M，V，P，N，E，Q，G，K，H)G106 S107 W108X G110 I111(C，V，H，Y，T，M，F)X2 I114(V，L，A，C)Y115(T，W，E，V)V116(A，S，L)X G118(P，S)X9 Y128 T129 X10。
所述共有序列SEQ ID No.9、10和11基于根据SEQ ID No.1的编号。在此，上面所提及的缺失同样也可以存在于N-末端和/或C-末端，只要所述粘附素与CEACAM成员(特别是CEA和/或NCA)的结合不是不可能的。
在一个特别的实施方案中，根据SEQ ID No.1的粘附素是优选的，其包含下列突变，即N77K、T88M、I111V、I114V和V116A(下文中也称为“五重突变体(Fünffach-Mutante)”，FM；SEQ ID No.12，图15)。
本领域技术人员基本上知晓如何制备粘附素单体。例如，在重组蛋白AfaE-III-dsc中，将N-末端的交联区段G克隆至C-末端，并且在F和G之间插入连接体。然后，区段G越过该连接体而折回，并结合至现在为N-末端的区段A1，由此稳定单体结构。可以通过凝胶过滤来检测AfaE-III-dsc的该单体结构(参见来自Anderson等人，2004的图1C)。
Piatek等人(Infection and Immunity(2005)73(1)pp.135-145，“Molecular Aspects of Biogenesis of Escherichiac oli DrFimbriae：Characterization of DraB-DraE-Complexes”)描述了用于产生单体粘附素的另外的可能性。他们从粘附素的N-末端去除不同数目的氨基酸，并因此获得了单体蛋白质(参见来自Piatek等人，2005的图2)。这些已知的原理基本上也可用于根据本发明经修饰的粘附素。
为了获得经修饰的粘附素，可以对野生型粘附素进行诱变，例如基于寡核苷酸的位点特异性诱变(例如，EP1777292A1)。
在一个优选的实施方案中，为了制备根据本发明的粘附素，可以将具有减少的对于DAF(衰变加速因子(Decay Accelerating Factor)，CD55)的亲和力的粘附素构建体用作模板以用于进一步的诱变。关于此的实例为突变N77K(van Loy等人，Molecular Microbiology(2002)45(2)，pp.439-452，“Identification of amino acids in Dradhesin required for binding to decay-accelerating factor”)。
可以将通过所述诱变而产生的文库与靶标一起转化到酵母中，并检测报道基因读数(对此也可参见下面的实施实例)。以这样的方式，可以鉴定出具有改善的对于CEA和/或NCA的亲和力的根据本发明的粘附素。
可以将根据本发明的粘附素连接在纳米颗粒上。它们优选地可以作为体内造影剂而用于检测CRC细胞。从WO 2007/057182A3中可知晓有利的纳米颗粒。为了公开所述纳米颗粒的制备以及用途的目的而整体援引该专利。所述纳米颗粒特别地为其流体动力学直径不超过15nm并且在生物系统中为非惰性的纳米颗粒。
根据本发明的纳米颗粒包含至少三种结构，即无机核心，其包覆有钝化层，该钝化层又携带有特异性配体，其中所述特异性配体也可以是所述钝化层的一部分。这导致所述纳米颗粒与生物系统的该靶分子(“靶标”)的特异性结合。
在优选的纳米颗粒中，具有围绕其的钝化层的无机核心具有尽可能不大于15，优选地不大于10nm的流体动力学直径。特别优选地，流体动力学直径不大于8nm或不大于5nm。这对于球形纳米颗粒尤其如此。这种大小的纳米颗粒可以通过肾脏排出，并因此在体内不积累或者最多只以可认为正当的量积累。由此使得体内使用成为可能。这对于具有不大于5nm的流体动力学直径的纳米颗粒特别如此。
在备选的实施方案中，所述纳米颗粒也可以是小棒状的。在这种布置中，如果小棒的直径不超过上述的15nm的界限，那么则是有利的。在此，同样地，在5、8或10nm的范围内的直径是优选的，以便有助于从身体中清除。因此，根据本发明可使用的纳米颗粒，例如可以具有8×15nm的长度/宽度范围。
根据本发明可使用的纳米颗粒优选地发射在600和700nm之间，例如在620和660nm之间，特别优选地在大约625nm或655nm处具有最大发射的波长。所述发射对于人眼来说是良好可见的，并且这样的纳米颗粒因此可以在医疗干预中直接用作造影剂。因此，放弃支持性的光学设备也许是可能的。
在备选的实施方案中，根据本发明可以使用超过上述流体动力学直径的纳米颗粒，只要保证所述颗粒在体内是非惰性的。这即是下列状况的先决条件：所述颗粒为可生物降解的，并因此起初作为微粒结合在其中的金属(例如Cd)转化为离子形式。降解产物可通过肾脏排出。
如已经证明的，具有包含咪唑组分的钝化层的无机纳米颗粒在体内实际上是非惰性的，而是在这些条件下分解。因此，所述纳米颗粒满足与体内使用特别相关的关于生物可降解性和降解产物的肾通过性的标准。这一认识是令人惊讶的，因为钝化层特别地也用于提高纳米颗粒的化学和/或物理稳定性(对此也可参见下面的进一步的论述)。因此，下列两方面以适合于用作体内造影剂的比例相互共存：一方面是纳米颗粒的稳定性，其对于良好的诊断而言是必需的；和另一方面是生物可降解性，其对于“较大”颗粒的肾通过性而言是必需的。
钝化层的首要任务是提高无机核心的荧光强度以及化学和物理稳定性。用钝化层包覆的无机核心的表征为至少10％，有利地至少30、50或甚至70％的量子产率。在此，量子产率是指由样品所发射出的光的量与由该样品所吸收的光的量的比率。有利地，钝化层具有不大于1nm的厚度。在这种情况下，经钝化的核心的直径增加不多于2nm。
有利地，每次还给纳米颗粒配备改性剂，特别是为了改善与生物学环境的相容性。由于使用改性剂而导致的流体动力学半径的增加优选地不超过2nm。在特殊情况中，钝化层和改性剂的厚度还取决于这两种结构相互之间以及与无机核心之间的关系。
在根据本发明的纳米颗粒的上述尺寸限制的情况下，其特别适合于用作在活的患者中的诊断剂。因此，通过尺寸减少而增加了在组织中的扩散速率和穿透深度。这使得纳米颗粒能够在生物学环境中均匀且快速地散布，以及在局部施用后尽可能广泛地渗透入组织(例如肿瘤)中。同样地，根据本发明的纳米颗粒允许全身施用，这也可以通过注射进行。但是，局部施用(例如，表面施用，或者在治疗肿瘤时的肿瘤内或肿瘤周围施用)也是可能的。
在本发明的特别有利的实施方案中，与经修饰的粘附素相偶联的纳米颗粒具有不大于8nm，特别优选地不大于4nm的流体动力学直径。这个尺寸级别的纳米颗粒已经可以通过肾脏排出，从而其在体内不积累或者明显更少地积累。因此，根据本发明的纳米颗粒显著减少了可能与已知的量子点相关的长期毒性的问题。
所述纳米颗粒有利地发射在600和700nm之间的荧光光谱，特别优选地在600和660nm之间，尤其优选地在620和660nm之间具有最大发射。所述发射光谱具有尽可能高的组织传输的优点，这是由于血红蛋白和其他在活系统中的吸收光的物质(包括水)对其仅有很少的吸收。此类波长的光对于人眼来说仍是看得到的，从而负责进行治疗的医生能够鉴别出经标记的组织而无需另外的昂贵的用于进行检测的技术辅助手段(例如CCD相机)。当在外科手术干预期间将根据本发明的纳米颗粒用作造影剂以用于鉴定表达CEA和/或NCA的细胞，特别是用于区别出癌变的和健康的组织时，这是特别有利的。
在一个实施方案中，优选可使用的纳米颗粒为具有例如由CdSe、CdS或CdTe组成的核心的已知纳米颗粒，关于科学出版物，所述纳米颗粒例如描述在US 2004/0247861中。在该出版物中还指点参阅关于制备核心材料的文献，例如US 6,179,912。为了公开这些已知纳米颗粒的性质及其制备，整体援引这些文献。此外，用于制备纳米颗粒的方法还可从US 7,147,712B2中获知。为了公开的目的也援引此文献。
如果纳米颗粒的无机核心基本上由半导体组成，那么这是特别有利的。这些核心依照其个体的尺寸和/或组成而发射各种不同颜色的光，但它们均在相同的光谱范围(UV至VIS范围)内在宽谱带上进行吸收。由于高的斯托克斯频移(Stokes shift)，激发光谱和发射光谱相距较远，这使得能够简单且同时激发各种不同的纳米颗粒。他们具有狭窄且对称的发射光谱，所述发射光谱不重叠或者仅稍微重叠。特别是对于改善的穿透深度和在体内进行标记而言具有重大意义的其他有益性质是直至80％的高量子产率和高耐光性。
优选的纳米颗粒例如可从WO2005/001889中获知。照此，涉及由至少两种半导体的合金组成的无机核心，所述半导体要么均匀地分布，要么对于它们来说在合金内分别存在有浓度梯度。关于公开所述纳米颗粒的性质和制备，请参阅上面所引用的WO2005/001889。所述核心在其尺寸方面可以各偏差5％。
因此，所述纳米颗粒的无机核心可以包含至少两种半导体的合金，其中所述核心具有均匀的组成，并且以这样的“带隙能”为特征，所述“带隙能”对于所述两种半导体的摩尔比而言是非线性的。
备选地，所述核心可以是非均匀的，其中第一种半导体的浓度从核心的中心到核心的表面逐渐升高，而第二种半导体的浓度从核心的中心到其表面逐渐降低。
对于这两种核心同样也适合的是，所述半导体中的至少一种为II族-VI族半导体或者III族-V族半导体(所述族定义相应于元素周期表的族)。例如，所述合金可以选自下列合金的组中：CdSeTe、CdSSe、CdSTe、ZnSeTe、ZnCdTe、CdHgS、CdHgTe、InGaAs、InGaP、GaAlAs、InGaN。此外，这些核心还可以携带由无机材料例如半导体(例如ZnS)组成的涂层。本领域技术人员将该额外的层称为“盖(capping)”或“壳(shell)”。
II族-VI族和III族-V族半导体是熟知的，并且包括，例如，CdS1-xSex、CdS1-xTex、CdSe1-xTex、ZnSe1-xTex、Zn1-xCdxTe、Cd1-xHgxS、Cd1-xHgxTe、In1-xGaxAs、Ga1-xAlxAs和In1-xGaxP。优选地，使用半导体CdSe1-xTex、CdS1-xTex、ZnSe1-xTex、Zn1-xCdxTe、Cd1-xHgxS、Cd1-xHgxTe、In1-xGaxAs、In1-xGaxP，其中x为0至1的分数。
半导体的摩尔比可以采用任何摩尔比。然而，如果所述合金包含CdSSe，那么具有分子式CdS1-xSex的合金是优选的。如果所述合金包含CdSTe，那么具有分子式CdS1-xTex的合金是优选的。如果所述合金包含ZnSeTe，那么具有分子式ZnSe1-xTex的合金是优选的。如果所述合金包含ZnCdTe，那么具有仅由CdTe构成的分子式的合金是优选的。在这些阐述中，x各自为0和1之间的分数。
所述纳米颗粒的这些优选的无机核心可以使用下列步骤来制备：(i)在使得能够形成纳米晶体的条件下制备第一溶液；(ii)在使得不能形成纳米晶体的条件下制备第二溶液，所述第二溶液以一定的摩尔比包含所述半导体的前体；(iii)将所述第二溶液添加到所述第一溶液中，这使得能够形成纳米颗粒；和(iv)改变条件，这使纳米晶体的生长和其形成停止/停住。在WO 2005/001889中描述了用于制备核心的方法，为了公开根据本发明的纳米颗粒的无机核心的该优选实施方案的制备，援引了该文献。
在备选的实施方案中，所述无机核心可以基本上由贵金属簇组成，所述贵金属簇优选地包含2-27个贵金属原子。在优选的实施方案中，所述贵金属选自由下列组成的组：金、银、铜、铂、钯、锇、铱、钌和铑。所述簇可具有变化的电荷。
这些核心具有如下优点：由于它们的强吸收和发射，通过使用弱的水银灯激发，它们可容易地作为单个的所谓“纳米点(Nanodots)”而被检测出。具有这些核心的根据本发明的纳米颗粒有利地用作发荧光的单个分子标签和整体标签。
术语“贵金属”是指选自由下列组成的组中的元素集合：金、银和铜，以及铂系金属(PGM)铂、钯、锇、铱、钌和铑。在本发明的优选实施方案中，所述贵金属选自由金、银和铜组成的组中。在特别优选的实施方案中，所述贵金属为银或金。
术语“簇(Cluster)”涉及2-27个金属原子的联合体。簇尤其在化学催化、陶瓷、半导体技术和材料科学领域中是已知的。因此，本领域技术人员熟悉其制备。WO 2004/003558尤其描述了贵金属簇的制备，并且另外还包括关于这一方面而指定的广泛的进一步文献。特别地，公开了与有机分子相联合的贵金属纳米簇的制备。在此，术语“联合”是指任何形式的结合，而与所述结合的化学或物理性质无关(因此，例如，共价、非共价、静电或范德华结合)。关于作为根据本发明的纳米颗粒的核心的纳米簇的制备，援引WO 2004/003558。
根据本发明优选可使用的纳米颗粒具有钝化层，所述钝化层提高荧光强度并改善无机核心的化学和物理稳定性。因此，所述纳米颗粒优选地以大于10％，优选地大于50％的量子产率发射光。
所述纳米颗粒于4℃在水性环境中优选地具有至少12个月的储存稳定性，并且尽可能在pH 5至pH 10，优选地pH 7至pH 10的pH范围内是稳定的，即在它们的特定光谱特征(例如，量子效率、最大发射的位置、发射光谱的半值宽度)方面，它们表现出小于50％的偏差。优选的颗粒在这些特定光谱特征方面表现出小于10％的偏差。
根据本发明的进一步实施方案可使用的纳米颗粒在至少三天的时间段期间，在生物学(即生理学)条件下或者在体内，也基本上表现出核心(包括围绕其的钝化层)的性质的恒定性/稳定性。优选的颗粒在7至14天的时间段期间表现出如此的恒定性/稳定性，其中作为稳定性，保留了所述性质的该种恒定性的至少50％。该阐述尤其涉及在实际靶器官中纳米颗粒的稳定性。值得注意的是，在主要用于施行分解的器官中纳米颗粒的稳定性可能明显地较不稳定(例如在肝脏中)。这甚至可能明确地是所希望的。
虽然在上面意义上所述纳米颗粒是稳定的，然而它们在体内基本上是可降解的并因此是非惰性的。在这个意义上，“非惰性的”意味着，施用后12周或更长的时间段之后，所述纳米颗粒已降解了至少50％。优选地在8、6或4周后已经可检测到至少50％的降解。体内剩余颗粒的检测包括为此在身体器官中以及在血浆中的检测。因而，“惰性的”意味着，在施用后4周的时间段之后，在患者体内仍可检测到大于50％，甚至直至几乎100％的颗粒。
纳米颗粒的可降解性可通过本领域技术人员已知的测定法来检测，即例如通过电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)，其在合适的样品性质的情况下还可补充以荧光光谱测量(对此也可参见下文)。
所述钝化层包含至少一种化合物，所述化合物能够与金属原子或金属离子(例如，锌离子、汞离子或镉离子)相配位。该化合物可以是路易斯碱或者具有共振电子的环状或线性不饱和的化合物。作为环状不饱和的化合物，其还可以是杂环或者杂芳族化合物。在一个优选的实施方案中，所述不饱和的或缀合的基团存在于相关于所述分子的结构而言的末端位置处。所述钝化层进一步地可以具有交联剂，或者所述环状或线性不饱和的化合物还可以作为交联剂起作用。所述交联剂可以是碱性的。
所述与金属原子或金属离子相配位的化合物可以通过螯合、配位或路易斯碱的电子供体特性而与荧光无机核心功能性地相结合，并且相应地具有缀合的部分/基团。在外，这些分子可以包含这样的部分，所述部分赋予用它们涂覆的核心以在水溶液中的可溶性或可湿性。
这些分子或化合物可以包括均质或异质(杂环)的环系统，所述环系统具有一个、两个或更多个结合的(或者还有稠合的)环。优选的杂芳族系统为例如噻唑、噻唑衍生物、唑、唑衍生物、吡咯、吡咯衍生物(包括经掺杂的或未掺杂的聚吡咯-寡聚物)、噻吩、噻吩衍生物(包括经掺杂的和未掺杂的聚噻吩)、呋喃、呋喃衍生物、吡啶和吡啶衍生物、嘧啶及其衍生物、吡嗪、吡嗪衍生物、三嗪和三嗪衍生物、三唑、三唑衍生物、酞菁和酞菁衍生物、卟啉和卟啉衍生物。这些化合物可以包括不饱和(烯属)烃或者其胺、其磷衍生物或其氧衍生物，这可以包括乙炔、丙炔和丙二烯，但并不局限于这些。优选的是，所述分子具有足够的p-或pi-电子密度，以便参与加合物形成或者在半导体核心表面上的共振。
所述杂芳族化合物优选地为咪唑组分。优选地，进一步还添加膦化合物(优选地，烷基膦化合物)作为交联剂。
在本说明书的范围内，术语“咪唑组分”是指含有至少一个咪唑基团(包括咪唑衍生物)的杂环的或杂芳族的分子，其可用于无机核心或钝化层与金属(例如，镉、锌、镓)或者金属阳离子或含有此类阳离子的底物的结合。在该情形下，优选地至少一个咪唑基团应当位于相关于所述分子的结构而言的末端位置处。所述咪唑组分以其功能形式通过包含离域分子轨道的环与荧光纳米晶体相结合。通常，咪唑环的氮用作配位配体，以便功能性地结合金属离子(例如，镉或锌)。
在一个实施方案中，所述咪唑组分包含具有反应性的官能团，例如一个或两个氨基酸，如组氨酸、肌肽、鹅肌肽、Balein、高肌肽、组氨酰基苯丙氨酸、环组氨酰基苯丙氨酸、5-氨基-4-咪唑甲酰胺、组氨酰基亮氨酸、2-巯基咪唑、boc-组氨酸、酰肼、Histinol、1-甲基组氨酸、3-甲基组氨酸、咪唑赖氨酸、含有咪唑的鸟氨酸(例如，5-甲基咪唑)、含有咪唑的丙氨酸(例如，(β)-(2-咪唑基)-L-(α)丙氨酸)、Carzinin、组胺。这些基于组氨酸的分子或者含有咪唑的氨基酸可以通过熟知的方法来合成。
在本发明的范围内，术语“膦”是指这样的分子，所述分子具有至少一个用于结合或螯合非金属(例如，Se、S或其他非金属)或者含有此类原子的底物的膦基团(包括其衍生物)，并且所述分子提供至少一个官能团(例如，羟基、氨基、巯基、羧基、甲酰胺基等)用于与邻近的分子反应。
优选地，至少一个膦基团应当位于相关于所述分子的结构而言的末端位置处。所述膦部分用作配位配体，以便以具有荧光核心或来自该屏蔽层的化合物的功能形式结合非金属或离子(例如，Se或S)。
在优选的实施方案中，所述含有膦的化合物包含一个、两个或更多个彼此(例如，以聚合物形式)偶联的膦基团，其可以包括羟甲基膦化合物等等，但并不局限于这些。含有膦的化合物可以根据熟知的方法来合成。如进一步已知的，含有烷基膦的化合物此外还可以具有一个或多个额外的官能团(例如，羟基、氨基、巯基、羧基、甲酰胺基等)。衍生物的实例为羟甲基膦衍生物、酰胺或酯，只要所述衍生化与本文中所描述的作为包衣的膦的功能相容。
特别优选的是三-(羟甲基)膦和β-[三-(羟甲基)膦基]丙酸，以用于涂覆根据本发明的纳米颗粒的荧光无机核心。众所周知，交联的含有膦的化合物另外还具有下述可能性：即功能性地与金属原子和/或金属离子(例如，Zn或Cd)结合。在这方面官能化的异氰酸酯(盐)或烷基氰基丙烯酸酯(盐)可以进一步地可用作关于配体的交联剂以及与荧光核心的加合物形成。所述交联剂也可以是碱性的。
根据本发明存在的钝化层的钝化效应基于通过与杂芳族化合物或杂环(优选地与咪唑组分)相络合而造成的表面镉或锌原子等等的屏蔽；以及基于通过与含有膦的化合物相络合而造成的反原子(Se或S等等)的屏蔽。
从US 2004/0247861A1中可获知根据本发明的纳米颗粒的钝化层。在该公开文献中描述了用钝化层包覆的无机核心(例如量子点)的制备。因此，为了公开根据本发明所使用的钝化层以及用其包覆的无机核心的制备的目的，援引US 2004/0247861。
进一步地，钝化层的分子还可以具有或携带化学基团，以便结合和交联(特异性配体)靶分子和细胞。在相应地合适的试剂(例如，ZnSO4和Na2S)存在下，这些分子或者化合物可以与在荧光核心上的分子形成钝化层(“盖”或“壳”)。这些试剂还可以功能性地与在荧光纳米晶体表面上的原子或离子结合，从而还可以直接在核心表面上形成该额外的钝化层。
在一个有利的实施方案中，根据本发明的纳米颗粒另外还可以具有改性剂，所述改性剂可以由有机和/或无机部分组成。它们用于在液体或悬浮介质中，特别是在生理学环境中纳米颗粒的改善的相容性、效率和/或可溶性。这种表面修饰对于实现在生物学系统中(特别是在人体中)尽可能低的非特异性吸附和提高的相容性来说是特别有利的。
一种可能性是用已被准许用于特定医疗应用的聚乙二醇(PEG)(特别是以低分子量的形式)进行表面修饰，以保持纳米颗粒的小的总体尺寸。这不仅可以提高纳米颗粒的生物相容性以及其血液循环时间，并且还可以提高摄取到细胞中的效率。通过将低分子量PEG层与其他物质(例如维生素，如叶酸)相组合，可以实现巨噬细胞中纳米颗粒的更低的摄取，这是因为由于由此减少的在纳米颗粒上的蛋白质吸附，从而妨碍了免疫系统对于纳米颗粒的识别。
通过使用改性剂进行的有利的表面修饰的另一种可能性是用单糖、二糖或三糖，直至由一种单糖或不同单糖组成的低分子量多糖进行涂覆。作为一种实施方式，用例如多聚葡萄糖进行修饰是可能的，其中可以使用在医学上被准许作为血液代用品的葡聚糖。其显示出良好的生物相容性/相容性。另一个实施方案是使用糖的离体异构体形式(D-/L-)，以便抵抗可能的降解。
另一个实施方案是使用生物学上相容的亲水性维生素作为改性剂，例如硫胺素、核黄素、烟酸、吡哆醇、钴胺素、泛酸、抗坏血酸和叶酸。因此，例如，叶酸可以导致纳米颗粒与癌细胞的优先的结合。这种维生素仅表现出低的免疫原性，并因此表现出高的生物相容性。通过与膜结合型叶酸受体的结合，促进了所述纳米颗粒的内在化。
用亲脂性维生素例如视黄醇、胆钙化醇、生育酚和叶醌进行表面修饰同样也是可能的。因此，例如，维生素E可以导致提高的纳米颗粒的细胞摄取。
脂肪酸，例如1-十八烯或18-甲基二十烷酸及其衍生物，可以提高胶体的可溶性和稳定性，并且具有末端功能性羧基，所述末端功能性羧基可以用于随后的特异性配体的结合。因此，接纳脂肪酸作为改性剂是合适的。
表面修饰的另一个实施方案是用多元醇(例如，二甘醇(DEG))进行涂覆，所述多元醇可以特别好地减少非特异性蛋白质吸附。这同样适用于聚四氟乙烯(PTFE，Teflon)，特别是以其低分子量形式，这是因为可以实现减少的蛋白质吸附。聚四氟乙烯经常在心脏外科应用中使用。
同样地，可以使用一种或多种天然存在的氨基酸以及合成的氨基酸来进行表面修饰，所述天然存在的氨基酸既包括成蛋白质性氨基酸也包括非成蛋白质性氨基酸。在此，可以使用所述两种立体异构体(D-和L-形式)。由上述氨基酸组成的二肽、三肽、四肽直至小的多肽几乎不刺激免疫系统，并因此同样也适于薄的相容性层。在此，可以涉及人工氨基酸序列以及来自生物学蛋白质的序列。天然蛋白质(例如，植物螯合肽)的肽衍生物同样也可以用于表面修饰。用Tat肽和含有Tat肽的肽进行表面修饰是使得纳米颗粒可用于在生物医学应用中使用的另一种可能性。对于例如将金纳米颗粒穿过细胞膜直至递送到细胞核中而言，所述Tat肽是有效的分子。
可能的改性剂的另一个实施方案是形成磷酸胆碱涂层。磷酸胆碱减少可能的非特异性蛋白质吸附，例如在接触镜片上。磷酸胆碱修饰由于其非血栓形成特性而可以在生物学系统中良好地使用，并且以高的长期稳定性为特点。
由于聚乳酸是生物相容的，因此该物质在各种医学应用中使用。特别是低分子量形式的聚乳酸是根据本发明的纳米颗粒的表面修饰的另一种可能性。在此，可以使用所述两种立体异构体(D-/L-形式)，以减少可能的生物降解。
除了所述的表面修饰之外，非特异性蛋白质与纳米颗粒的经蛋白水解可分开的结合也是可能的。这可以导致生物相容性/相容性的提高。在靶位置处，可以发生大的蛋白质的解离，从而在组织中释放出小的纳米颗粒。所述解离也可以在相应的停留时间之后进行。优选地，对此适合的是广泛流行的蛋白质，例如，除了其他降低非特异性吸附的蛋白质之外，转铁蛋白、乳铁蛋白、血浆铜蓝蛋白、弹性蛋白和白蛋白。因此，例如，由具有弹性蛋白的多肽组合组成的表面涂层可以防止不希望的血栓形成，并因而提高纳米颗粒的生物相容性。
白蛋白这种主要血清蛋白可以降低与质膜的非特异性相互作用。此外，经相应地修饰的纳米颗粒保留了通过特异性配体同时结合至颗粒表面而形成与靶细胞的特异性相互作用的能力。与采用未涂覆的纳米颗粒的情形相比，用血清白蛋白进行的涂覆可以通过阻止在静脉内给予后被巨噬细胞快速摄取而导致明显更长的血液循环时间。
除了上述非特异性涂层之外，根据本发明的纳米颗粒还携带有使用靶细胞特异性配体的选择性标记；例如，它们与蛋白质、抗体、肽，或者特别优选地与小的具有高亲和力的蛋白质结构域、抗体片段或其他有机分子(其例如与肿瘤细胞特异性结构或其他靶标结合)相缀合。优选的配体是粘附素(参见实施实例4)。在该情形下，“特异”意味着，所述配体要么仅仅要么以提高的程度在所述靶标上表达。
由减小的流体动力学直径(其导致所提及的更高的扩散速度和灌注速度)以及已描述的特性和改善及高荧光强度(尤其是在可见红光范围内)所组成的组合使根据本发明的纳米颗粒成为简单的可以各种方式进行使用的诊断剂以用于在体内选择性地和准确地区别组织形式。这些可能性与抗原特异性生物标志物相组合地尤其用于鉴定表达CEA和/或NCA的细胞，特别是用于区分异常的(前)癌变组织和正常组织，这在手术干预期间有助于为了更精确的肿瘤切除而进行的视觉评估。因此，在此可使用的根据本发明的纳米颗粒用作造影剂。这特别适用于在肠癌诊断和手术中使用。
具有根据本发明的经修饰的粘附素的纳米颗粒可以用作体外或体内诊断剂、治疗诊断剂和/或治疗剂。为此，它们可以局部施用(例如，肿瘤内、肌内或者在通过手术可达到的组织/器官内)或者全身施用(例如，静脉内)。局部/表面施用可以设计为液体、喷雾溶液、凝胶、泡沫、霜剂、活性贴剂。特别地，在治疗/诊断中空器官的情况下，例如在肠癌的情况下，这可以是优选的。口服也是可能的，例如作为糖浆或者以片剂或胶囊的形式。吸入(例如，喷雾)同样也是可能的。考虑了通过栓剂的肛门施用。在一种变化形式中，可以以贮库制剂形式植入所述纳米颗粒。
在本发明的范围内，术语“诊断剂”被用作“造影剂”的同义词，即其用于在生物学系统中(特别是在活的人中)形态或功能结构的区别性描绘，以支持医疗干预。
所述纳米颗粒可以用作诊断剂，尤其是在外科手术干预中。它们同样也可以在最小侵入性方法(例如，内窥镜检查、腹腔镜检查)中使用。与成像方法(例如，PET、MRT、CT等)相组合是合适的。
如已经在上面所阐明的，根据本发明以局部施用形式进行应用是特别有利的。在此，在局部施用时所使用的Cd的量有利地不超过总负荷的十分之一，所述总负荷在生命过程中通常在具有增长的年纪和平常的生活方式的人的肝脏和肾脏中无论以何种方式地累积。这些器官的总负荷为大约18mg(Saturag等人，2000；British Journal ofNutrition；2000，(84)，791-802)。因而，有利地在局部施用的情况下限制纳米颗粒的量，从而使所供给的Cd的量至少不显著超过2mg的值。在一个特别优选的实施方案中，已经用下述的造影剂量进行的肿瘤可视化是可能的：所述造影剂量不超过0.6mg，特别优选地0.2mg镉的总量。
在本发明的范围内，“局部施用”是指这样的任何施用，其中已经根据施用的类型和方式预期到在身体的特定区域中具有增加的量或剂量的造影剂。因此，如果通过给药人员的伴随措施(例如，对输入或输出血管实施结扎)而阻止了造影剂以基本上不受阻的方式通过血管系统在身体中分布，那么造影剂的血管施用也是局部施用。
该实施方案的特别的优点在于，在活的人上在医疗应用中使用纳米颗粒因而首次成为了可能，因为这否则(即采用全身给予)将会由于与之相关的毒性而被排除。这是因为，局部施用降低了对于充分描绘而言所需的纳米颗粒剂量。
已表明，所述含有Cd的造影剂根据本发明有利地以这样的剂量用于体内肿瘤可视化，所述剂量相应于0.002至0.02mg Cd/cm3肿瘤组织的量。0.002至0.015mg Cd/cm3肿瘤组织的造影剂剂量是特别有利的，特别是在0.002和0.010mg Cd/cm3之间的剂量。使用这一有利的剂量，使得能够在体内使体积为至多大约150cm3的肿瘤可视化，而不会因此超过人通常可接受的负荷上限。体积为至多50cm3的肿瘤的可视化是特别有益的。
检验对象可以为患者的所有可达到的组织/器官，尤其是皮肤、中空器官(例如胃肠道、泌尿生殖道、呼吸道)或者感觉器官的在外部可达到的区域以及心血管系统。
用作体外诊断剂也是可能的，例如免疫组织化学或FACS以及ELISA。体内和体外诊断的组合(例如，活组织检查材料)是特别有利的。
根据本发明的经修饰的粘附素可以保持与纳米颗粒相结合，或者是可分开或可解开的或可释放的。
实施例
I.提供经修饰的粘附素
对于粘附素的结合来说，CEACAM(例如CEA)的N-末端结构域是足够的。这是从使用纯化的菌毛(其中也存在有各自的粘附素)的结合研究中获知的(Korotkova等人，The Journal of BiologicalChemistry(2006)281(39)，pp.29120-29139，“A Subfamily of DrAdhesins of Escherichia coli Bind Independently toDecay-accelerating Factor and the N-doma in of CarcinoembryonicAntigen”)。因此，将CEA和NCA(CEACAM6)的N-末端结构域用作根据本实施方案的粘附素的靶标。
为此，首先为了在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中表达而优化了CEA和NCA的N-末端结构域以及作为配体(粘附素)的DraE的成熟蛋白的密码子使用。合成所述基因。
将DraE构建体(优选地具有突变N77K)以及CEA的末端结构域(下文中称为N-CEA)克隆到酵母的TH载体中，并转化到酵母中。
对粘附素实施诱变，在一个特别优选的实施方案中实施基于Oligo的位点特异性诱变(例如，EP1777292A1)。通过单菌落和文库DNA的测序来表征由此获得的文库。
将文库以及靶标(N-CEA)转化到通过将Met1基因(其编码尿卟啉原III甲基转移酶)整合到基因组中而改变的酵母菌株Y190中，并且将所述酵母在含有25mM 3-AT的培养基上进行涂板。为了读取报道基因Met1和β-半乳糖苷酶，这两种蛋白质必须相互作用。
如EP1721974A1中所描述的，进行定量筛选。通过由尿卟啉原III的酶促转化而产生的产物荧光来检测报道基因Met1。
为了确认所获得的命中，在测序前将第二个报道基因lacZ用于另一个测试。为此，β-半乳糖苷酶的活性通过底物FDG被该酶转化为荧光产物来进行测定，从而在测序前将命中数目减少至25％。
因此，可能的是，提供粘附素突变体，所述粘附素突变体相对于野生型而言，但特别地也相对于模板而言，具有改善的对于CEA和/或NCA的亲和力。相对于模版而言的亲和力的改善(其例如根据在EP1721974A1中所公开的筛选方法作为报道基因的读数而测得)为至少大约5％，优选地至少100％，特别优选地甚至至少300％或至少500％。在此，相对于野生型而言的亲和力甚至可以达到这样的值，所述值为对于模版而给出的值的直至2倍或者直至4倍。
特别高的亲和力改善通过至少两个突变，优选地还有直至3、5或7个突变的组合来实现。尤其是通过重复(可选地，还可以数次)根据EP1721974A1的筛选步骤，特别大的亲和力提高是可能的。
打算检测具有不同亲和力的经改善的突变体。在此，重要的是找到野生型，以便鉴定相对于其而言经改善的粘附素。由此用在亲和力方面经改善的突变体覆盖了整个序列空间。
从这些检验中得出根据本发明的经修饰的粘附素，即所述经修饰的粘附素在一个或多个氨基酸位置处被改变。
1.有利的修饰
实施实例1-位置88-苏氨酸
从文献(Korotkova等人，The Journal of Biological Chemistry(2006)281(39)，pp.29120-29139，“A Subfamily of Dr Adhesinsof Escherichia coli Bind Independently to Decay-acceleratingFactor and the N-domain of Carcinoembryonic Antigen”)中已知，突变T88M，在粘附素中，尤其是在DraE中，导致所述粘附素对于CEA的亲和力的提高。因此，对于第一次诱变，选择了位置T88。
该阐述以及所有随后的阐述涉及在根据SEQ ID No.1的DraE中的氨基酸位置。
如在EP1721974A1中所描述的，进行定量筛选。
(i)命中的测序和评价
在转化到细菌中后对于来自所述命中的DNA所进行的测序导致得到下列的在对于CEA的亲和力方面经改善的突变体的排列顺序，基于所鉴定出的命中的频数：
M＞L＞WT。
对于下列诱变，将在该位置处的经最强改善的突变体T88M用作模板。
此外，引入突变N77K以阻止粘附素与DAF结合(van Loy等人，Molecular Microbiology(2002)45(2)，pp.439-452，“Identification of amino acids in Dr adhesin required forbinding to decay-accelerating factor”)。该突变对于粘附素与N-CEA的结合没有影响(Korotkova等人，The Journal of BiologicalChemistry(2006)281(39)，pp.29120-29139，“A Subfamily of DrAdhesins of Escherichia coli Bind Independently toDecay-accelerating Factor and the N-doma in of CarcinoembryonicAntigen”以及自身的数据)。由此，作为下列诱变的模板而得到DraET88M N77K。
实施实例2-位置7-苏氨酸
如在EP1721974A1中所描述的，进行定量筛选；此外，还进行了再筛选(见上)。
(i)命中的测序和评价
在转化到细菌中后对于来自所述命中的DNA所进行的测序导致得到下列的在对于CEA的亲和力方面经改善的突变体的排列顺序，基于所鉴定出的命中的频数：
N＞(F，C)＞S＞V＞R，A＞(I，L，Y)＞WT。
实施实例3-位置17-谷氨酸
如在EP1721974A1中所描述的，进行定量筛选；此外，还进行了再筛选(见上)。
(i)命中的测序和评价
在转化到细菌中后对于来自所述命中的DNA所进行的测序导致得到下列的在对于CEA的亲和力方面经改善的突变体的排列顺序，基于所鉴定出的命中的频数：
S＞P＞K＞G，D，R，N＞H，Q＞WT。
实施实例4-位置22-精氨酸
如在EP1721974A1中所描述的，进行定量筛选；此外，还进行了再筛选(见上)。
(i)命中的测序和评价
在转化到细菌中后对于来自所述命中的DNA所进行的测序导致得到下列的在对于CEA的亲和力方面经改善的突变体的排列顺序，基于所鉴定出的命中的频数：
T＞A＞S＞N＞K＞WT。
实施实例5-位置25-天冬氨酸
如在EP1721974A1中所描述的，进行定量筛选；此外，还进行了再筛选(见上)。
(i)命中的测序和评价
在转化到细菌中后对于来自所述命中的DNA所进行的测序导致得到下列的在对于CEA的亲和力方面经改善的突变体的排列顺序，基于所鉴定出的命中的频数：
S＞G＞N＞A，T＞K，R，H，Q，M＞WT。
实施实例6-位置27-苏氨酸
如在EP1721974A1中所描述的，进行定量筛选；此外，还进行了再筛选(见上)。
(i)命中的测序和评价
在转化到细菌中后对于来自所述命中的DNA所进行的测序导致得到下列的在对于CEA的亲和力方面经改善的突变体的排列顺序，基于所鉴定出的命中的频数：
K＞R＞L＞V，Y＞P，N，Q＞WT。
实施实例7-位置28-缬氨酸
如在EP1721974A1中所描述的，进行定量筛选；此外，还进行了再筛选(见上)。
(i)命中的测序和评价
在转化到细菌中后对于来自所述命中的DNA所进行的测序导致得到下列的在对于CEA的亲和力方面经改善的突变体的排列顺序，基于所鉴定出的命中的频数：
W＝F＞WT。
实施实例8-位置29-丙氨酸
如在EP1721974A1中所描述的，进行定量筛选；此外，还进行了再筛选(见上)。
(i)命中的测序和评价
在转化到细菌中后对于来自所述命中的DNA所进行的测序导致得到下列的在对于CEA的亲和力方面经改善的突变体的排列顺序，基于所鉴定出的命中的频数：
K＞R＞S＞E，Q＞F，G＞L，H＞P，N，T，W＞WT。
实施实例9-位置31-苏氨酸
如在EP1721974A1中所描述的，进行定量筛选；此外，还进行了再筛选(见上)。
(i)命中的测序和评价
在转化到细菌中后对于来自所述命中的DNA所进行的测序导致得到下列的在对于CEA的亲和力方面经改善的突变体的排列顺序，基于所鉴定出的命中的频数：
G＝D＞S＞N＞WT。
实施实例10-位置34-谷氨酰胺
如在EP1721974A1中所描述的，进行定量筛选；此外，还进行了再筛选(见上)。
(i)命中的测序和评价
在转化到细菌中后对于来自所述命中的DNA所进行的测序导致得到下列的在对于CEA的亲和力方面经改善的突变体的排列顺序，基于所鉴定出的命中的频数：
D＞＞G＞S＝N＞L＝V＝T＝A＞WT。
实施实例11-位置37-天冬氨酸
如在EP1721974A1中所描述的，进行定量筛选；此外，还进行了再筛选(见上)。
(i)命中的测序和评价
在转化到细菌中后对于来自所述命中的DNA所进行的测序导致得到下列的在对于CEA的亲和力方面经改善的突变体的排列顺序，基于所鉴定出的命中的频数：
N＞＞WT。
实施实例12-位置38-丙氨酸
如在EP1721974A1中所描述的，进行定量筛选；此外，还进行了再筛选(见上)。
(i)命中的测序和评价
在转化到细菌中后对于来自所述命中的DNA所进行的测序导致得到下列的在对于CEA的亲和力方面经改善的突变体的排列顺序，基于所鉴定出的命中的频数：
S＝T＞L＞WT。
实施实例13-位置39-丙氨酸
如在EP1721974A1中所描述的，进行定量筛选；此外，还进行了再筛选(见上)。
(i)命中的测序和评价
在转化到细菌中后对于来自所述命中的DNA所进行的测序导致得到下列的在对于CEA的亲和力方面经改善的突变体的排列顺序，基于所鉴定出的命中的频数：
Q＞S＞D，M＞G，F＞WT。
实施实例14-位置41-异亮氨酸
如在EP1721974A1中所描述的，进行定量筛选；此外，还进行了再筛选(见上)。
(i)命中的测序和评价
在转化到细菌中后对于来自所述命中的DNA所进行的测序导致得到下列的在对于CEA的亲和力方面经改善的突变体的排列顺序，基于所鉴定出的命中的频数：
V＞＞WT。
在借助于FDG-测试进行的再筛选中，I41L克隆具有比I41V克隆更高的读数。对序列的分析揭示出，所有这些克隆还具有额外的突变V116A。因此，I41L V116A也是改善的突变体。
实施实例15-位置47-谷氨酰胺
如在EP1721974A1中所描述的，进行定量筛选；此外，还进行了再筛选(见上)。
(i)命中的测序和评价
在转化到细菌中后对于来自所述命中的DNA所进行的测序导致得到下列的在对于CEA的亲和力方面经改善的突变体的排列顺序，基于所鉴定出的命中的频数：
T＞＞N＝C＞S＞G＝A＝P＞WT。
实施实例16-位置52-天冬氨酸
如在EP1721974A1中所描述的，进行定量筛选；此外，还进行了再筛选(见上)。
(i)命中的测序和评价
在转化到细菌中后对于来自所述命中的DNA所进行的测序导致得到下列的在对于CEA的亲和力方面经改善的突变体的排列顺序，基于所鉴定出的命中的频数：
G＞N，S＞C，P，Q，Y，H，K，R，T＞WT。
实施实例17-位置84-天冬酰胺
如在EP1721974A1中所描述的，进行定量筛选；此外，还进行了再筛选(见上)。
(i)命中的测序和评价
在转化到细菌中后对于来自所述命中的DNA所进行的测序导致得到下列的在对于CEA的亲和力方面经改善的突变体的排列顺序，基于所鉴定出的命中的频数：
D＞＞S＞H＞WT。
在该筛选中还发现了(组合)突变体Q34L N84S，其在FDG-再筛选中具有相比于N84S而言更高的读数。
这表明，相比于单一突变体而言，突变体的组合导致更高的对于CEA的亲和力。
实施实例18-位置86-精氨酸
如在EP1721974A1中所描述的，进行定量筛选；此外，还进行了再筛选(见上)。
(i)命中的测序和评价
在转化到细菌中后对于来自所述命中的DNA所进行的测序导致得到下列的在对于CEA的亲和力方面经改善的突变体的排列顺序，基于所鉴定出的命中的频数：
V＞＞WT。
实施实例19-位置95-苏氨酸
如在EP1721974A1中所描述的，进行定量筛选；此外，还进行了再筛选(见上)。
(i)命中的测序和评价
在转化到细菌中后对于来自所述命中的DNA所进行的测序导致得到下列的在对于CEA的亲和力方面经改善的突变体的排列顺序，基于所鉴定出的命中的频数：
L＞＞M，Y，F＞(C，W，Q)＞N，E，S，I，H＞WT。
还发现了组合型突变体T95E T123I；该组合具有比突变体T95E更高的FDG-读数。
这表明，相比于单一突变体而言，突变体的组合导致更高的对于CEA的亲和力。
实施实例20-位置100-苯丙氨酸
如在EP1721974A1中所描述的，进行定量筛选；此外，还进行了再筛选(见上)。
(i)命中的测序和评价
在转化到细菌中后对于来自所述命中的DNA所进行的测序导致得到下列的在对于CEA的亲和力方面经改善的突变体的排列顺序，基于所鉴定出的命中的频数：
Y＞V＞WT。
还发现了组合型突变体F100S T11I D37G；该组合具有比突变体F100S更高的FDG-读数。同样地，也发现了组合突变体F100I T123I，其显示出比突变体F100I更高的FDG-读数
这表明，相比于单一突变体而言，突变体的组合导致更高的对于CEA的亲和力。
实施实例21-位置105-缬氨酸
如在EP1721974A1中所描述的，进行定量筛选；此外，还进行了再筛选(见上)。
(i)命中的测序和评价
在转化到细菌中后对于来自所述命中的DNA所进行的测序导致得到下列的在对于CEA的亲和力方面经改善的突变体的排列顺序，基于所鉴定出的命中的频数：
S＞A，T＞R＞M，V，P，N，E＞Q，G，K，H＞WT。
实施实例22-位置111-异亮氨酸
如在EP1721974A1中所描述的，进行定量筛选；此外，还进行了再筛选(见上)。
(i)命中的测序和评价
在转化到细菌中后对于来自所述命中的DNA所进行的测序导致得到下列的在对于CEA的亲和力方面经改善的突变体的排列顺序，基于所鉴定出的命中的频数：
C＞V＞H＞Y＞T＞M＝F＞WT。
实施实例23-位置114-异亮氨酸
如在EP 1721974A1中所描述的，进行定量筛选；此外，还进行了再筛选(见上)。
(i)命中的测序和评价
在转化到细菌中后对于来自所述命中的DNA所进行的测序导致得到下列的在对于CEA的亲和力方面经改善的突变体的排列顺序，基于所鉴定出的命中的频数：
V＞＞L＞A＝C＞WT。
实施实例24-位置115-酪氨酸
如在EP1721974A1中所描述的，进行定量筛选；此外，还进行了再筛选(见上)。
(i)命中的测序和评价
在转化到细菌中后对于来自所述命中的DNA所进行的测序导致得到下列的在对于CEA的亲和力方面经改善的突变体的排列顺序，基于所鉴定出的命中的频数：
T＝W＞E＞V＞WT。
实施实例25-位置116-缬氨酸
如在EP1721974A1中所描述的，进行定量筛选；此外，还进行了再筛选(见上)。
(i)命中的测序和评价
在转化到细菌中后对于来自所述命中的DNA所进行的测序导致得到下列的在对于CEA的亲和力方面经改善的突变体的排列顺序，基于所鉴定出的命中的频数：
A＞S＞L＞WT。
实施实例26-位置118-甘氨酸
如在EP1721974A1中所描述的，进行定量筛选；此外，还进行了再筛选(见上)。
(i)命中的测序和评价
在转化到细菌中后对于来自所述命中的DNA所进行的测序导致得到下列的在对于CEA的亲和力方面经改善的突变体的排列顺序，基于所鉴定出的命中的频数：
P＞S＞WT。
还发现了组合型突变体G118S I85L；该组合具有相比于G118S而言更高的FDG-读数，并且是在最先的批命中中被发现的。
这表明，相比于单一突变体而言，突变体的组合导致更高的对于CEA的亲和力。
实施实例1至26的概括
基于下述的DraE N77K的序列来阐述所有下面的共有序列(也可参见图1，SEQ ID No.1)：
GFTPSGTTGTTKLTVTEECQVRVGDLTVAKTRGQLTDAAPIGPVTVQALGCDARQVALKADTDNFEQGKFFLISDNKRDKLYVNIRPTDNSAWTTDNGVFYKNDVGSWGGIIGIYVDGQQTNTPPGNYTLTLTGGYWAK。
从这些实施实例中得到下面的关于氨基酸的“正”共有序列，在粘附素基因中所述氨基酸的突变导致所述粘附素对于CEA的亲和力得到改善。
共有序列SEQ ID No.9
X6 T7(N，F，C，S，V，R，A，I，L，Y)X9 E17(S，P，K，G，D，R，N，H，Q)X4 R22(T，A，S，N，K)X2 D25(S，G，N，A，T，K，R，H，Q，M)X T27(K，R，L，V，Y，P，N，Q)V28(W，F)A29(K，R，S，E，Q，F，G，L，H，P，N，T，W)X T31(G，D，S，N)X2 Q34(D，G，S，N，L，V，T，A)X2 D37N A38(S，T，L)X A39(Q，S，D，M，G，F)XI41(V)X5 Q47(T，N，C，S，G，A，P)X4 D52(G，N，S，C，P，Q，Y，H，K，R，T)X31 N84(D，S，H)X R86V X T88(M，L)X6 T95(L，M，Y，F，C，W，Q，N，E，S，I，H)X4 F100(Y，V)X4 V105(S，A，T，R，M，V，P，N，E，Q，G，K，H)X5 I111(C，V，H，Y，T，M，F)X2 I114(V，L，A，C)Y115(T，W，E，V)V116(A，S，L)X G118(P，S)X21
该比对描述在图12中。
在一个有利的实施方案中，根据本发明的经修饰的粘附素具有一个或多个下列氨基酸：L26、G42、P43、V44、L49、D89、S91、S107、W108、G110。在一个特别优选的实施方案中，所有这些氨基酸都存在。
由此有利地得到如下的共有序列：
共有序列SEQ ID No.10
X6 T7(N，F，C，S，V，R，A，I，L，Y)X9 E17(S，P，K，G，D，R，N，H，Q)X4 R22(T，A，S，N，K)X2 D25(S，G，N，A，T，K，R，H，Q，M)L26 T27(K，R，L，V，Y，P，N，Q)V28(W，F)A29(K，R，S，E，Q，F，G，L，H，P，N，T，W)X T31(G，D，S，N)X2 Q34(D，G，S，N，L，V，T，A)X2 D37N A38(S，T，L)X A39(Q，S，D，M，G，F)X I41(V)G42 P43 V44 X2 Q47(T，N，C，S，G，A，P)X L49 X2 D52(G，N，S，C，P，Q，Y，H，K，R，T)X31 N84(D，S，H)X R86V X T88(M，L)D89 X S91 X3 T95(L，M，Y，F，C，W，Q，N，E，S，I，H)X4 F100(Y，V)X4 V105(S，A，T，R，M，V，P，N，E，Q，G，K，H)X S107 W108X G110 I111(C，V，H，Y，T，M，F)X2 I114(V，L，A，C)Y115(T，W，E，V)V116(A，S，L)X G118(P，S)X21
该比对描述在图13中。其中有利地存在的氨基酸加有下划线。
如果根据本发明的粘附素另外还具有一个或多个下列氨基酸(特别是所有下列氨基酸)，那么则是有利的：C19、C51、G106、Y128、T129。
因此，根据本发明的粘附素有利地具有如下的共有序列：共有序列11(参见图14，其中所有有利地存在的氨基酸加有下划线；共有结构9和10以及进一步的上面关于优选氨基酸的阐述的组合)：
共有序列SEQ ID No.11(图14)：
X6 T7(N，F，C，S，V，R，A，I，L，Y)X9 E17(S，P，K，G，D，R，N，H，Q)X C19 X2 R22(T，A，S，N，K)X2 D25(S，G，N，A，T，K，R，H，Q，M)L26 T27(K，R，L，V，Y，P，N，Q)V28(W，F)A29(K，R，S，E，Q，F，G，L，H，P，N，T，W)X T31(G，D，S，N)X2 Q34(D，G，S，N，L，V，T，A)X2 D37N A38(S，T，L)A 39(Q，S，D，M，G，F)X I41(V)G42 P43 V44 X2 Q47(T，N，C，S，G，A，P)X L49 X C51 D52(G，N，S，C，P，Q，Y，H，K，R，T)X31 N84(D，S，H)X R86V X T88(M，L)D89 X S91 X3 T95(L，M，Y，F，C，W，Q，N，E，S，I，H)X4 F100(Y，V)X4 V105(S，A，T，R，M，V，P，N，E，Q，G，K，H)G106 S107 W108X G110 I111(C，V，H，Y，T，M，F)X2 I114(V，L，A，C)Y115(T，W，E，V)V116(A，S，L)X G118(P，S)X9 Y128 T129 X10
2.特别优选的突变组合
已证明，下列的单一突变体的组合是特别有利的：
对于野生型粘附素DraE的诱变导致改善的突变体T88M(参见实施实例1)，并且在使用该突变体DraE T88M(N77K)作为模板来进行的进一步诱变轮次中检测到进一步的经改善的突变体(参见实施实例2至26)。因此，例如，产生了多重突变体DraE T88M(N77K)I111H，其显示出相比于野生型粘附素DraE和突变体DraE T88M而言明显更高的对于CEA的亲和力。
进一步的实例是构建体DraE T88M Q34L N84S，其具有比DraE T88MN84S更高的对于CEA的亲和力(参见实施实例17)。组合突变体DraET88M G118S I85L也具有相比于突变体DraE T88M G118S而言更高的对于CEA的亲和力(实施实例26)。
组合突变体F100S T11I D37G具有相比于F110S而言提高的对于CEA的亲和力(参见实施实例20)。在组合突变体F100I T123I的情况下也是如此，所述组合突变体F100I T123I具有相比于F100I而言提高的对于CEA的亲和力(参见实施实例20)。还发现了组合型突变体T95E T123I；此组合具有比突变体T95E更高的对于CEA的亲和力(参见实施实例19)。
因此，为了完成本发明的任务，确定了在对于CEA和/或NCA的亲和力方面经改善的粘附素-配体的优选实施方案，所述优选实施方案各具有在共有序列1中所列出的单一突变体的任何可能的组合。
所举出的实施实例表明，利用在此处所使用的n杂合体(nHybrid)/双合体(Two-Hybrid)筛选方法，通过进行重复循环，产生具有提高的对于CEA和/或NCA的亲和力的组合突变体是可能的。
3.多重诱变
这些实验在n杂合体系统中进行(EP1721974A1)。
一方面使用DraE T88M N77K I111V(TM＝三重突变体)作为诱变模板，另一方面使用具有更加高的对于CEA的亲和力的DraE T88MN77K I111V I114V V116A(FM＝五重突变体)。
实施实例27-位置39-丙氨酸
a)TM作为模板
如在EP1721974A1中所描述的，进行定量筛选；此外，还进行了再筛选(见上)。
(i)命中的测序和评价
在转化到细菌中后对于来自所述命中的DNA所进行的测序导致得到下列的在对于CEA的亲和力方面经改善的突变体的排列顺序，基于所鉴定出的命中的频数：
S＞G＞D＝H＞Q＞WT。
在DraE T88M N77K作为模板的情况下，改善的突变体的排列顺序为Q＞S＞D＞M＞G＞F，这表示TM可能具有经改变的结构，其导致在位置39处发现不同的突变体或者以改变的排列顺序的已知突变体。
b)FM作为模板
如在EP1721974A1中所描述的，进行定量筛选；此外，还进行了再筛选(见上)。
(i)命中的测序和评价
在转化到细菌中后对于来自所述命中的DNA所进行的测序导致得到下列的在对于CEA的亲和力方面经改善的突变体的排列顺序，基于所鉴定出的命中的频数：
S＞WT。
在DraE T88M N77K作为模板的情况下，改善的突变体的排列顺序为Q＞S＞D＞M＞G＞F，这表示FM可能具有经改变的结构，其导致在位置39处发现不同的突变体或者以改变的排列顺序的已知突变体。
c)两种模板的比较
TM：S＞G＞D＝H＞Q＞WT
FM：S＞WT
实施实例28-位置41-异亮氨酸
a)TM作为模板
如在EP1721974A1中所描述的，进行定量筛选；此外，还进行了再筛选(见上)。
(i)命中的测序和评价
在转化到细菌中后对于来自所述命中的DNA所进行的测序导致得到下列的在对于CEA的亲和力方面经改善的突变体的排列顺序，基于所鉴定出的命中的频数：
V＞L＞T＞WT。
这表示，在TM作为模板的情况下，在该位点处的突变也仍然导致对于CEA的亲和力的改善；在此，在该情况下，出现与在DraE T88M N77K作为模板的情况下相同的突变体谱。这一事实暗示，在TM中的结构改变对于氨基酸位置41没有大的影响。
b)FM作为模板
如在EP1721974A1中所描述的，进行定量筛选；此外，还进行了再筛选(见上)。
(i)命中的测序和评价
在转化到细菌中后对于来自所述命中的DNA所进行的测序导致得到下列的在对于CEA的亲和力方面经改善的突变体的排列顺序，基于所鉴定出的命中的频数：
L＞WT。
在DraE T88M N77K作为模板的情况下，L被检测为略微改善的突变体；V是最佳的突变体。这表示，FM可能具有经改变的结构，其导致在位置41处发现不同的突变体或者以改变的排列顺序的已知突变体。
c)两种模板的比较
TM：V＞L＞T＞WT
FM：L＞WT
实施实例29-位置47-谷氨酰胺
a)TM作为模板
如在EP1721974A1中所描述的，进行定量筛选；此外，还进行了再筛选(见上)。
(i)命中的测序和评价
在转化到细菌中后对于来自所述命中的DNA所进行的测序导致得到下列的在对于CEA的亲和力方面经改善的突变体的排列顺序，基于所鉴定出的命中的频数：
S＞A＞C＞T＞WT。
在DraE T88M N77K作为模板的情况下，改善的突变体的排列顺序为T＞N＝C＞S＞G＝A＝P＞WT，这表示TM可能具有经改变的结构，其导致在位置47处发现不同的突变体或者以改变的排列顺序的已知突变体。
b)FM作为模板
如在EP1721974A1中所描述的，进行定量筛选；此外，还进行了再筛选(见上)。
(i)命中的测序和评价
在转化到细菌中后对于来自所述命中的DNA所进行的测序导致得到下列的在对于CEA的亲和力方面经改善的突变体的排列顺序，基于所鉴定出的命中的频数：
S＞WT。
在DraE T88M N77K作为模板的情况下，改善的突变体的排列顺序为T＞N＝C＞S＞G＝A＝P＞WT，这表示FM可能具有经改变的结构，其导致在位置47处发现不同的突变体或者以改变的排列顺序的已知突变体。
c)两种模板的比较
TM：S＞A＞C＞T＞WT
FM：S＞WT
用这些实施实例再次表明，利用在此处所使用的n杂合体筛选方法，通过进行重复循环，产生具有提高的对于CEA的亲和力的组合突变体是可能的。
3.借助于高容量筛选来分析根据本发明可使用的纳米颗粒的体内降解
本检验的目的是检测用双肽包被的纳米颗粒(核心：CdSe，壳：ZnS，最大发射：655nm，没有蛋白质配体时的流体动力学直径为大约12.5nm)在所选择的小鼠器官中的生物降解，这通过比较在以1.7mg/kg体重的剂量静脉内注射荧光纳米颗粒缀合物后第2天和第42天时的荧光来进行。
方法
通过尾静脉给6只NMRI小鼠注射1.7mg/kg体重的荧光纳米颗粒缀合物(QD655#D416-36-KNH-蛋白质配体克隆5582(所谓的五重突变体FM，见上))。分别在注射后第2天和第42天将小鼠处死，取出器官并于-80℃急剧冷冻。
样品制备：
称量200mg各器官，并且使用匀浆器Fastprep24(MPBiomedicals)，用在冷冻小管中的1ml 500mM N-二(羟乙基)甘氨酸(Bicine)缓冲液(pH＝8.3)和1g匀浆珠(MP Biomedicals的MatrixD)进行匀浆1分钟。将匀浆物置于冰上。
样品包埋批料(所有的给出数值以μl表示)
BSA溶液30％ 106.4
匀浆物 213.6
戊二醛溶液25％ 17.0
在Eppendorf容器中引入BSA溶液，然后添加所述匀浆物，并且将样品在冰上冷却2分钟。然后，添加戊二醛溶液并快速混合。将200μl样品各自吸移到具有盖玻片底部的微量滴定板(Greiner)的孔中。通过戊二醛的固定持续数分钟，并导致形成固体凝胶。
原始数据的测量
使用带有60x/1.2W物镜的Olympus Scan^R系统进行显微镜检查。通过Scan^R Acquisition软件生成样品图像：记录16个堆垛(Stapel)/样品(＝/孔)，各40帧/堆垛，帧之间的间距为0.5μm。在2个通道中平行地进行记录：纳米颗粒通道(发射滤波器655/16)中的曝光时间为200ms，自发荧光通道(发射滤波器525/30)中的曝光时间为1000ms。
关于图像记录面积或体积的说明：
宽度 109μm
长度 109μm
高度 20μm
体积/堆垛 2.38E-101
总体积 3.80E-091
原始数据的评价
借助于Scan^R Analysis软件来进行纳米颗粒的定量。首先，沿着z轴在平面上生成堆垛的最大投影，然后借助于滚球(Rolling Ball)来进行平滑化最后将加权的自发荧光通道从纳米颗粒通道中减去。将用于分段(Segmentierung)的强度阈值设为43。
借助于门控(Gating)将所发现的纳米颗粒分为3类(小、中和大)，标准是所发现的纳米颗粒的面积，在由平均强度所确定的合适的走廊(在60-400范围内的灰色标度值等级)中。所述门(Gate)是矩形的并且如下定义：
小：4-35像素
中：36-400像素
大：401-100,000像素。
在小的门中发现了最多的目标，在大的门中发现的最少。
由于大的和中等大小的聚集体的出现，准确的定量陈述是不可能的，因为不能精确地确定每次有多少单个纳米颗粒形成聚集体。然而，可以通过作为无量纲的数值的荧光(其大致上与聚集体中纳米颗粒的数目成比例)，作出关于纳米颗粒分布和药物动力学的定性陈述。
无量纲的荧光的计算：
将目标数目乘以各纳米颗粒类别的平均总强度(平均总荧光强度/目标)：
目标×平均强度＝荧光。
计算了在第2天和第42天时来自肝、脾和肺的匀浆物的荧光，并确定了其平均值。各自将第2天时的荧光标准化为100％。
结果概括在图16中。根据所述结果，与第2天相比较，在第42天时在肝中仅可检测到0.54％的荧光、在脾中仅可检测到4.97％的荧光，和在肺中仅可检测到18.66％的荧光。这表明，根据本发明的与粘附素相偶联的纳米颗粒在体内被降解。

Claims (13)

1.粘附素，其包含选自由下列序列组成的组中的氨基酸序列：
a.SEQ ID No.3中所示的DraE组
b.SEQ ID No.4中所示的DraE/AfaE-III
c.SEQ ID No.1中所示的DraE
其中所述粘附素具有突变T88(M，L)和N77K以及一个或多个下列突变：
T7(N，F，C，S，V，R，A，I，L，Y)；E17(S，P，K，G，D，R，N，H，Q)；R22(T，A，S，N，K)；D25(S，G，N，A，T，K，R，H，Q，M)；T27(K，R，L，V，Y，P，N，Q)；V28(W，F)；A29(K，R，S，E，Q，F，G，L，H，P，N，T，W)；T31(G，D，S，N)；Q34(D，G，S，N，L，V，T，A)；D37N；A38(S，T，L)；A39(Q，S，D，M，G，F)；I41(V)；Q47(T，N，C，S，G，A，P)；D52(G，N，S，C，P，Q，Y，H，K，R，T)；N84(D，S，H)；R86V；T95(L，M，Y，F，C，W，Q，N，E，S，I，H)；F100(Y，V)；V105(S，A，T，R，M，V，P，N，E，Q，G，K，H)；I111(C，V，H，Y，T，M，F)；I114(V，L，A，C)；Y115(T，W，E，V)；V116(A，S，L)；G118(P，S)。
2.根据权利要求1的粘附素，其特征在于，所述粘附素在N-末端缺失了至多18个氨基酸和/或在C-末端缺失了至多10个氨基酸。
3.根据权利要求1的粘附素，其特征在于，所述粘附素能够与结合蛋白的N-末端序列结合，所述结合蛋白具有选自下列序列的组中的氨基酸序列：
a.SEQ ID No.6中所示的CEA/NCA
b.SEQ ID No.7中所示的CEA和/或SEQ ID No.8中所示的NCA。
4.根据权利要求1的粘附素，其特征在于，所述粘附素对于根据权利要求3的结合蛋白具有相比于野生型而言改善了至少5％的亲和力。
5.根据权利要求4的粘附素，其特征在于，所述粘附素对于CEA的N-末端序列具有相比于野生型而言改善了至少5％的亲和力。
6.根据权利要求1至5中任一项的粘附素，其特征在于，所述粘附素具有一个或多个下列突变：
V28W；V28F；A39Q；A39S；I41L；Q47S；Q47T；I85L；T95L；G118S和T123I。
7.根据权利要求1的粘附素，其具有根据SEQ ID No.12的氨基酸序列。
8.纳米颗粒，其与根据权利要求1至7中任一项的粘附素相缀合。
9.根据权利要求8的纳米颗粒，其特征在于，所述纳米颗粒具有无机核心和钝化层，并且带有该钝化层的所述无机核心的流体动力学直径不大于15nm。
10.根据权利要求8和9中任一项的纳米颗粒，其特征在于，所述纳米颗粒是非惰性的。
11.根据权利要求1至7中任一项的粘附素或者根据权利要求8至10中任一项的纳米颗粒在制备用于医疗应用的造影剂中的用途。
12.根据权利要求1至7中任一项的粘附素或者根据权利要求8至10中任一项的纳米颗粒在制备造影剂中的用途，所述造影剂用于鉴定肠癌细胞。
13.根据权利要求12的用途，其中所述肠癌细胞为CRC细胞。
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