CN101977930A

CN101977930A - 含核糖体蛋白质提取物(RPE)和任选的促Th1佐剂的疫苗

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Publication number: CN101977930A
Application number: CN2009801095928A
Authority: CN
Inventors: M·S·阿尔瓦瑞兹; D·R·阿班纳得斯; C·A·伯戴特
Original assignee: Laboratorios Leti SA
Current assignee: Laboratorios Leti SA
Priority date: 2008-01-18
Filing date: 2009-01-14
Publication date: 2011-02-16
Anticipated expiration: 2029-01-14
Also published as: PT2231700E; HRP20140447T1; US20110020405A1; WO2009090175A1; AU2009204849A1; BRPI0906787A2; AP3007A; CN101977930B; CO6280495A2; AU2009204849B2; AP2010005333A0; MA32080B1; EP2231700A1; PL2231700T3; RU2010134427A; JP2011509968A; RU2521499C2; CA2712475A1; HK1150291A1; EP2570427A1

Abstract

本发明涉及用于制备治疗或预防寄生虫病的药剂的组合物及其用途，所述组合物包含RPE并任选地包含促Th₁佐剂。

Description

含核糖体蛋白质提取物(RPE)和任选的促Th1佐剂的疫苗

技术领域

本发明涉及一种用于制备治疗或预防寄生虫病的药剂的组合物及其用途，所述组合物包含核糖体蛋白质提取物(RPE)和任选的促Th₁佐剂。

背景技术

利什曼病包括数种由主要感染多种哺乳动物(包括人和狗)巨噬细胞的利什曼原虫属(Leishmania)的细胞内原生动物寄生物造成的疾病。主要根据寄生物的物种和人宿主的免疫活性状态，该疾病谱的范围包括从自愈性的皮肤利什曼病(CL)到致死性的内脏利什曼病(VL)或黑热病(18)。由婴儿利什曼原虫(Leishmania infantum)和恰加斯氏利什曼原虫(L.chagasi)造成的犬内脏皮肤利什曼病(VCL)是一种新出现于地中海盆地周围、中东和拉丁美洲国家中的重要的人兽互通病(16)，狗为这些寄生物的主要携带者，在通过白岭亚科昆虫(phebotomine sandfly)传递给人的过程中起到主要作用(47)。感染的结果由宿主免疫系统和不同寄生物物种之间的相互作用决定，利什曼病的发病机制仍不清楚，并且关于人和狗对利什曼原虫属的免疫应答所涉及机制的知识仍是有限的。通常而言，保护性免疫与通过T细胞来源细胞因子来诱导巨噬细胞激活的经典的细胞介导免疫应答有关，而难愈疾病与强体液应答的产生有关(15，26)。针对基于粗寄生物级分或者基于确定的寄生物抗原的第二代疫苗的开发研究论述了对如下这样的不同的表面或分泌的寄生物分子的鉴定情况，即这些分子已经作为候选疫苗在数个实验模型中使用不同佐剂进行了测试(1，17，22，46，48，49，52，54)。以来自感染动物或人的血清进行的表达文库筛选也已经使得可选择出几种抗原作为候选疫苗(综述见(9))。其中，在感染小鼠或人患者细胞中主要诱发Th₁型免疫应答的抗原(不考虑其细胞定位)与不同动物模型中保护性应答的产生有关(51，55，56)。另一方面，一些分离的抗原是保守的细胞内蛋白，它们主要刺激患VL的人或狗中的体液应答，或者实验性感染的小鼠中Th₂介导的体液应答(3，36，38，40，42)。人们认为，在患有利什曼病的狗中所诱导的针对这些抗原的体液应答不足导致了免疫疾病，主要是由于免疫复合物的不良效应，特别是葡萄膜炎(13)、中枢神经系统损害(14)或肾炎(23，24，33，34)。同时，最近已经证明，在患有VL的人中IgG免疫复合物的存在与无法消除感染有关，这证明了免疫复合物可能对感染的宿主有害(30)。

虽然在感染过程中诱导强体液应答的蛋白最初未被认为是良好的候选疫苗，但是已经证实这些蛋白与保护性应答的诱导有关。例如，寄生物微管蛋白和组蛋白H2B被源自免疫供体的T细胞克隆识别(39)，rK39可造成免疫小鼠T细胞的增殖和IFN-γ产生(25)。已经证明，以寄生物H2B、H3和H4基因进行的基因免疫可在鼠科动物内脏利什曼病模型中诱导保护作用(27)。同时，以激活的C激酶的受体(LACK)(32)、一些寄生物半胱氨酸蛋白酶(38，41)或形成寄生物核小体的组蛋白(11，20)进行免疫(同时给予促Th₁佐剂)可在鼠类模型中产生与抵御皮肤利什曼病的保护作用有关的免疫应答。

在利什曼原虫属的进化保守的抗原中，数个证据链表明核糖体蛋白质在利什曼原虫属感染中是免疫相关分子。在一些情况下，核糖体组分通过其在感染过程中调节细胞活性和细胞因子释放的能力，能促使宿主免疫系统功能障碍。因此，将硕大利什曼原虫(L.major)核糖体蛋白质S3a注射至BALB/c小鼠中诱导了B细胞克隆的多克隆扩增并且抑制了T细胞增殖(10)。同时，以编码推定60S核糖体蛋白质L31的DNA疫苗进行的基因免疫会通过诱导IL-10和Th₂细胞因子使小鼠模型的疾病恶化(44，53)。另外，已经将一些寄生物核糖体蛋白质如寄生物酸性P蛋白与患有利什曼病的狗和人中的强体液应答的产生相关联(综述见(42))。

虽然到目前为止有这些尝试，但仍没有很有用的疫苗来抵御寄生虫病例如利什曼病。因此，仍存在对这类疫苗的需求。

发明内容

在此项工作中，本发明人证明，RPE特别是利什曼原虫属RPE(LRPE)在天然感染婴儿利什曼原虫的狗中以及实验感染硕大利什曼原虫的小鼠中是免疫应答的靶标。本发明人进一步证明，当LRPE与促Th₁佐剂例如CpG寡聚脱氧核苷酸(ODN)共同给药时，可诱导强的Th₁保护性免疫应答。这类组合物(与促Th₁佐剂结合的LRPE)非常有希望被用作疫苗。下文将进一步描述本发明。

用途

在本发明的第一方面中，提供了RPE和任选的促Th₁佐剂用于制备在受试者中治疗或预防寄生虫病的药剂的用途。

在一个优选的实施方案中，RPE可通过使用当存在于受试者中时会造成寄生虫病的寄生物细胞进行如下步骤来得到：

a.将寄生物细胞与裂解缓冲液混合，

b.离心所得到的混合物，以得到胞质提取物，

c.从所得到的胞质提取物制备RPE。

在步骤a中，寄生物优选是指原生动物。优选的寄生物在后文中定义。更优选地，原生动物处于前鞭毛体阶段。本领域技术人员应知道为了制备所需量的RPE大约需要的寄生物细胞量。一般而言，为制备大约500微克RPE，将使用大约3x10⁹个寄生物细胞。裂解缓冲液为缓冲液，它能裂解至少部分寄生物细胞。优选的裂解缓冲液包括非离子型表面活性剂。以Nonidet P 40(NP40)作为非离子型表面活性剂得到了良好的结果。然而，可以使用其他的非离子型表面活性剂。优选使用的裂解缓冲液如下(缓冲液A)：10mM Tris HCl(pH 8.0)、150mM NaCl、1.5mMMgCl₂和0.5％NP40(Roche)，优选补加蛋白酶抑制剂如PMSF 1mM、亮肽酶素8μg/ml、抑肽酶4μg/ml和Pentatin 8μg/ml。一般使用eppendorf移液器将合适量的寄生物细胞(大约10⁹个细胞/ml缓冲液A)与该裂解缓冲液轻轻混合。

在步骤b中，对步骤a所得到的混合物进行至少1个4℃下的离心步骤。通常，第一离心步骤以大约3,000g进行大约2分钟。优选地将所得到的上清液在4℃下再次以大约13,000g离心15分钟，该离心进行一次或两次。

在步骤c中，如(45)中所述将所得到的上清液用于制备RPE。简而言之，将所得到的上清液在4℃下在Beckman TL100.3转子中以大约90,000rpm高速离心大约30分钟。所得到的沉淀为粗制核糖体沉淀，将其重新悬浮于缓冲液B(20mM Tris-HCl pH 7.4、500mM AcNH₄、100mM MgCL₂、5mM β-巯基乙醇)中，并在4℃下在TL100.3转子中以大约90,000rpm在缓冲液A中进行不连续蔗糖梯度(20/40％)离心。所得到的沉淀包含核糖体。优选将该沉淀溶解于PBS(磷酸盐缓冲盐水)中、经超声处理并在-70℃下保存。

核糖体蛋白质是非常保守的胞质蛋白。因此，本文定义的RPE可以制备自任何真核生物，可以是植物或动物，可以来自哺乳动物、爬行动物、鱼类、昆虫或任何其他携带染色体的生物如原生动物。优选地，RPE获自与疾病紧密相关的生物，优选进化树中造成寄生虫病的生物。因此，特别受到关注的用于治疗寄生虫病的RPE的来源是原生动物，如疟原虫(plasmodium)，特别是锥虫(trypanosomatid)科的成员，更特别是锥虫原生动物利什曼原虫属的不同种。已知的利什曼原虫属种超过20种，包括利什曼原虫亚属的种，包括复合硕大利什曼原虫(complex L.major)，其包括硕大利什曼原虫；复合杜氏利什曼原虫(complex L.Donovani)，其包括恰加斯氏利什曼原虫、杜氏利什曼原虫和婴儿利什曼原虫；复合墨西哥利什曼原虫(complex L.Mexicana)，其包括亚马逊利什曼原虫(L.amazonensis)和墨西哥利什曼原虫；以及Viannia亚种，包括复合巴西利什曼原虫(complex L.braziliensis)，其包括巴西利什曼原虫和秘鲁利什曼原虫(L.peruviana)，及复合圭亚那利什曼原虫(complex L.guyanensis)，其包括圭亚那利什曼原虫和巴拿马利什曼原虫(L.panamensis)。特别受关注的疟原虫属(Plasmodium)种有恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)和间日疟原虫(Plasmodium vivax)。在一个优选的实施方案中，RPE获自利什曼原虫属种，优选硕大利什曼原虫和/或婴儿利什曼原虫。在另一个优选的实施方案中，RPE可获自疟原虫属种。本领域技术人员应理解，RPE还可以通过将来自本文描述的多种不同生物的RPE混合而制备。在疫苗中使用RPE而非使用给定蛋白是很有吸引力的，这是因为RPE包含大量不同的抗原。这些抗原中的每种均有可能在处理的受试者中诱导保护性免疫应答。而且，有受试者对抗原A应答而不对抗原B应答，或抗原B应答而不对抗原A应答。因此，本文定义的疫苗意欲用于到广泛的受试群体中，这是因为它包含大量不同的抗原。在一个优选的实施方案中，RPE包含至少一种核糖体蛋白质、核糖体蛋白质的至少一种抗原和/或核糖体蛋白质的至少一个蛋白片段。在一个更优选的实施方案中，RPE包含至少2种核糖体蛋白质、核糖体蛋白质的至少2种抗原和/或核糖体蛋白质的至少2个蛋白片段。本文定义的蛋白片段优选地为包含相应核糖体蛋白质的至少2、3、5、7、10、15、20、25、30或更多个连续氨基酸的片段。在一个实施方案中，本文定义的RPE不包含婴儿利什曼原虫的酸性核糖体蛋白质P0和/或来自巴西利什曼原虫的核糖体抗原LbeF4A，或者不由婴儿利什曼原虫的酸性核糖体蛋白质P0和/或来自巴西利什曼原虫的核糖体抗原LbeF4A组成。

促Th₁佐剂(如包含CpG ODN基序的佐剂)在文献(Liu N.，et al.，(2003)，Nature Immunology，687-693)中被定义为：根据将给定抗原(本文中RPE)与所处理的受试者的脾细胞上清液一起培养时所检测的，在与该抗原一块使用时能够促进或触发针对该抗原产生的Th₁免疫应答的佐剂。作为对照的促进或触发Th₁免疫应答的评估是在未经所述抗原和佐剂处理的同一受试者的脾细胞群中进行，或者以仅用所述抗原处理的同一细胞群进行。触发或促进Th₁免疫应答优选地由IFNγ的诱导作用来定义，该作用通过将所处理的受试者的脾细胞与所述抗原一起孵育进行检测，以及/或者通过诱导抗原特异性IgG2a免疫球蛋白的产生进行检测。如实施例中所述，对该细胞因子的诱导的评估优选在脾细胞上通过ELISA进行。如实施例中所述，对IgG2a诱导的评估优选通过ELISA或蛋白质印迹进行。在以RPE和佐剂刺激脾细胞时诱导IFNγ和/或IgG2a优选地表示所述佐剂能够作为促Th₁佐剂。除了上文给出的触发或促进Th₁免疫应答的第一定义之外或者与所述第一定义相结合，触发或促进Th₁免疫应答还可以由不存在Th₂免疫应答(或者不存在对Th₂免疫应答的诱导)进行定义。Th₂免疫应答的特征在于，与未处理的脾细胞相比，IL-4、IL-10诱导可检测地提高和/或可检测的IgG1免疫球蛋白的产生。如实施例中所述，对IL-4和/或IL-10诱导的评估优选地在脾细胞上通过ELISA进行。如实施例中所述，对IgG1诱导的评估优选地通过ELISA或蛋白质印迹进行。

除了上文给出的触发或促进Th₁免疫应答的前2个定义之外或者与所述前2个定义相结合，触发或促进Th₁免疫应答还可以由抗特定抗原(在该情况下为RPE)时出现IFNγ/IL-10比值和/或IFNγ/IL-4比值增大，以及/或者出现IgG1/IgG2a比值减小进行定义。在一个优选的实施方案中，任何这些比值变化(如上文指出的增大或减小)超过2时表示佐剂具有Th1性质。如实施例中所述，对所言及每种细胞因子诱导的评估优选地在脾细胞上通过ELISA进行。如实施例中所述，对免疫球蛋白IgG1或IgG2a诱导的评估优选地通过ELISA或蛋白质印迹进行。

在一个优选的实施方案中，促Th1佐剂为寡聚脱氧核苷酸、包含寡聚脱氧核苷酸或者由寡聚脱氧核苷酸组成。更优选地，寡聚脱氧核苷酸(ODN)包含C未甲基化的CpG或者由C未甲基化的CpG组成(CpGODN)：3’嘌呤-CpG-5’嘧啶。优选的寡聚脱氧核苷酸为硫代磷酸修饰的ODN序列，包含硫代磷酸修饰的ODN序列或者由硫代磷酸修饰的ODN序列组成。使用具有这类修饰的寡聚脱氧核苷酸是有利的，这是因为，如此使用的寡聚脱氧核苷酸比非修饰寡核苷酸更加稳定，并且一旦它们在血液系统中就不容易被降解。优选的促Th1佐剂由至少一个、至少2个或至少3个CpG基序组成，或者包含至少一个、至少2个或至少3个CpG基序。优选的免疫刺激性ODN序列(5’至3’)为TCAACGTTGA和GCTAGCGTTAGCGT。本领域技术人员不应局限于本文明确描述的序列。本领域技术人员可以设计其他序列，然后如前文所定义地测试它们的促Th1特性。该优选的鉴定的佐剂CpG ODN是受到高度关注，原因是在实施例中证明了LRPE与该促Th1佐剂的共同接种时在BALB/c和C57BL/6小鼠品系中都可诱导保护作用，抵御硕大利什曼原虫寄生物侵袭。在两模型中，保护作用都与IFN-γ的特异产生相关。在BALB/c中，还检测到了对IL-4和IL-10产生的限制作用。

本发明的一个优点是，它使得可制备用于治疗广谱寄生虫病的药剂，即具有跨物种特异性的药剂。在许多寄生虫病中，为抵御特定物种建立的疫苗仅对该特定物种起作用。这种情况的寄生虫病的一个实例是利什曼病。目前，该疾病可由药物控制，但药物治疗不能阻止该疾病传播，并且在许多病例中不是十分有效。在一个优选的实施方案中，寄生虫病为利什曼病或疟疾。更优选地，寄生虫病由利什曼原虫属或者由疟原虫属种造成。在又一优选的实施方案中，寄生虫病由与RPE所来源的物种不同的物种造成。具体而言，由一个利什曼原虫属种造成的利什曼病可以通过使用基于来自另一利什曼原虫属种的RPE的组合物进行治疗。在一个实施方案中，由硕大利什曼原虫造成的利什曼病由包含来自婴儿利什曼原虫的RPE的组合物成功地治疗。或者，其他寄生虫病如疟疾可以由基于另一物种的RPE(例如基于婴儿利什曼原虫的RPE)的组合物成功地治疗。

在本发明的上下文中，受试者是指人或动物。本发明范围涵盖的动物包括哺乳动物，优选狗。

在一个优选的实施方案中，本文定义的药剂可用于提高人或动物免疫系统抵御感染和/或疾病——更优选寄生虫感染和/或寄生虫病——的能力。具体而言，可以将所述药剂用于给予人或动物受试者。本文定义的药剂优选肠胃外给药，例如通过静脉内、皮下、腹膜内、肌内、动脉内或病灶内途径注射或输注。优选的给药方式为皮下给药。可通过本领域已知的常规技术将药剂与可药用介质或送递载体结合。例如，可将RPE和任选的促Th₁佐剂溶解于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。用于制备可肠胃外给药的组合物的方法是本领域中公知的，并且更详细记载于多种资料中，所述资料包括例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，Ed.ARGennaro，20th edition，2000，Williams&Wilkins，PA，USA。优选以治疗有效剂量给予药剂，即该剂量可提高人或动物免疫系统抵御本文定义的感染和/或疾病的能力。优选地，本发明药剂的治疗有效剂量可阻止和/或延迟真皮损伤的发展，并且/或者诱导耳中和/或引流淋巴结(DLN)中寄生物载量的显著降低。对真皮损伤存在情况的评估在图6的说明中有记载。对寄生物载量的评估在实施例中有记载。本发明药剂的治疗有效剂量将优选阻止真皮损伤的发展，并且/或者将优选在以下时间后导致耳中寄生物载量降低大约3个数量级和/或DLN中大约相近的数量级：包括使用本发明化合物的第一次疫苗接种并随后以寄生物相继感染一次的时间段和大约±6周的等待时间。在一个优选的实施方案中，本文定义的药剂是疫苗。在一个更优选的实施方案中，将至少12μg的RPE用于疫苗中。在一个甚至更优选的实施方案中，必须将至少12-20μg的RPE用于提供免疫应答，并任选地与至少50μg的促Th₁佐剂如CpG ODN相联合。本文定义的疫苗可以是预防性疫苗或治疗性疫苗。可溶解RPE和任选的促Th1佐剂的体积可以在100-500微升变化。

组合物

在又一方面中，提供了包含RPE和任选的促Th₁佐剂的组合物。RPE和促Th₁佐剂已在本文中定义。在一个优选的实施方案中，组合物由RPE和促Th₁佐剂组成。优选的促Th₁佐剂为CpG ODN。优选的组合物包含溶解于PBS中的RPE和任选的促Th₁佐剂，或者由溶解于PBS中的RPE和任选的促Th₁佐剂组成。在又一优选的实施方案中，本发明还包括相继给予RPE和促Th1佐剂。因此，它们不必在物理上存在于单一组合物中，而只要两组分均被给予至受试者即可。

该组合物还可包含可药用的辅料和/或载体。

优选将该组合物用作药剂。所述药剂优选为疫苗。药剂和疫苗已在本文中广泛定义。

方法

在另一方面中，本发明提供一种方法，所述方法可预防和/或治疗寄生虫病；并且/或者延迟寄生虫病的进展；并且/或者阻止和/或延迟真皮损伤发展；并且/或者诱导耳中和/或引流淋巴结(DLN)中寄生物载量的显著降低，所有这些都如本文中的定义。在该方法中，本发明疫苗作为治疗性疫苗发挥作用。一般而言，在感染和发病之间有一段时间。在该情况下，疫苗将作为如下这样的药理学免疫产物起作用，即其可通过在宿主中诱发抵消所述感染的病理效应的免疫应答来预防和/或治疗所述疾病，和/或延迟所述疾病的进展。治疗性疫苗和预防性疫苗的区别在于，治疗性疫苗会在已经有所述感染或所述疾病的患者中诱导保护作用。

在本文及权利要求书中，动词“包含”及其变化形式使用其非限制性含义，意为包括该词之后接着的要素，但是并不排除没有明确指出的要素。另外，动词“组成”可以由“基本由......组成”替换，是指本文定义的产品、组合物或保存混合物可包含明确指出组分之外的其他组分，所述其他组分不改变本发明的独特特征。

另外，用不定冠词“一个”或“一种”修饰要素时并不排除存在超过一种/个所述要素的可能性，除非上下文中清楚地要求有且仅有一种/个该要素。不定冠词“一个”或“一种”因此通常指“至少一种/个”。

本说明书引用的所有专利和文献特此通过引用的方式全文纳入本文。

通过如下的实施例进一步描述本发明，这些实施例不应被解释为对本发明的范围的限制。

附图说明

图1.(A)将婴儿利什曼原虫核糖体蛋白质在线性10-14％梯度SDS-PAGE凝胶上电泳，转移至硝酸纤维素印迹上，并与健康的狗的血清(第1-3道)和来自患有VCL的狗的血清(第4-13道)一起孵育。血清以1/200的稀释度应用。将辣根过氧化物酶缀合的抗狗IgG的抗体作为第二试剂使用(B-E)。将4只BALB/c小鼠在左足垫经皮下注射感染5×10⁴个硕大利什曼原虫稳定期前鞭毛体，并在激发后8周获取血清。将4只C57BL/6小鼠以硕大利什曼原虫的300个后循环前鞭毛体经皮内注射至耳真皮中进行感染，并在激发后14周获取血清。对于这两个品系，还在寄生物激发前获取感染前血清。

(B)将硕大利什曼原虫核糖体蛋白质在线性10-14％梯度SDS-PAGE凝胶上电泳，转移至硝酸纤维素印迹上，并与来自感染的BALB/c或C57BL/6小鼠的混合血清一起孵育。血清以1/200的稀释度使用。无感染前血清显示出抗LRP活性(未显示)。(C)通过ELISA在两小鼠品系中分别确定抗LRP的IgG1和IgG2a抗体的效价。(D)在感染后8周，使BALB/c小鼠安乐死并将它们的腘DLN细胞在存在12μg ml^-1的硕大利什曼原虫LRP情况下或者在仅培养基中体外培养48h。通过ELISA评估培养物上清液中IFN-γ、IL-4和IL-10的水平。(E)在感染后14周，使C57BL/6小鼠安乐死并将它们的上颌骨后DLN如D中一样处理。

图2.(A)对在BALB/c小鼠中诱导的特异性体液应答的分析。以3个剂量的硕大利什曼原虫核糖体蛋白质单独地(LRP)或佐以CpG ODN(LRP+CpG)，以CpG ODN佐剂单独地(CpG)或以PBS(盐水)在右足垫经皮下注射免疫BALB/c小鼠(每组6只)。在第3次免疫后4周，将小鼠放血，并通过ELISA评估血清中IgG1同种型(黑柱)和IgG2a同种型(白柱)二者的特异性抗LRP抗体反应。免疫前血清未显示活性。(B-D)在疫苗接种后4周，使小鼠安乐死，获取它们的脾，并在存在LRP(灰柱)或仅存在培养基(黑柱)的情况下体外培养48小时。通过ELISA评估所述培养物上清液中IFN-γ(B)、IL-4(C)和IL-10(D)的水平。

图3.(A)疫苗接种的BALB/c小鼠中硕大利什曼原虫感染的过程。如图2所示，将小鼠(每组6只)经皮下注射免疫。最后一次免疫后1个月，以5×10⁴个硕大利什曼原虫稳定期前鞭毛体在左后足垫感染所述动物。以感染足垫和未感染的对侧足垫之间的厚度之差给出足垫肿胀度。结果表示为两次独立试验的平均值和标准差。^＊P＜0.001表示在激发后第8周时LRP+CpG ODN疫苗接种小鼠与CpG ODN小鼠组的炎症有显著差异。(B)在感染后第8周，通过有限稀释分别确定感染的腿腘DLN和脾中的活寄生物数目。结果表示为两次独立试验的平均值和标准差。^＊P＜0.01表示在激发后第8周时LRP+CpG ODN疫苗接种小鼠与CpGODN小鼠组的腘寄生物载量有显著差异。(C-D)在硕大利什曼原虫激发后8周确定疫苗接种小鼠和感染小鼠中的细胞因子产生。获取感染腿的腘DLN，并在存在SLA(白柱)、LRP(灰柱)或仅存在培养基(黑柱)的情况下体外培养48h。通过ELISA测试所述培养物上清液中IL-4(C)、IL-10(D)和IFN-γ(E)的水平。重复该实验得到了相似的结果。(F)对IL-12和T细胞参与IFNγ的产生的分析，所述IFNγ的产生与LRP+CpGODN疫苗接种赋予的保护作用相关。在以5×10⁴个硕大利什曼原虫稳定期前鞭毛体激发后8周，从以CpG ODN(黑柱)和LRP+CpG ODN(白柱)疫苗接种的小鼠获取腘淋巴结(LN)，并在存在抗IL-12抗体、抗CD4抗体或抗CD8抗体或者存在对照单克隆抗体的情况下以LRP刺激培养。在孵育78h后通过ELISA评估IFN-γ的水平。以抗CD8单克隆抗体处理和以对照抗体处理之间的IFN-γ生成差异是统计学上显著的(^＊P＜0.05)。数据对应于有相似结果的两个独立实验中的一项代表性实验。

图4.对所述IgG1/IgG2a极化的分析。(A)在激发后8周获取血清样品，通过ELISA分别确定针对LRP的IgG1和IgG2a抗体的效价。以LRP+CpG ODN疫苗接种的小鼠和另外3组之间IgG1效价的差异是统计学上显著的(^＊P＜0.01)。(B)将硕大利什曼原虫LRP在线性10-14％梯度SDS-PAGE凝胶上分开，转移至硝酸纤维素印迹上，并以稀释度1/200的获自所标明小鼠组的混合血清孵育。显示了IgG1和IgG2a同种型两者的抗体反应。(C)将相同的血清应用于确定IgG1和IgG2a抗SLA的效价。以LRP+CpG ODN疫苗接种的小鼠和另外3组之间IgG1效价的差异是统计学上显著的(^＊P＜0.02)。

图5.如图3中所示，将6只BALB/c小鼠以LRP+CpG ODN进行疫苗接种并感染左足垫。在第一次寄生物激发后8周，以硕大利什曼原虫的300个后循环前鞭毛体在耳中经皮内注射再次感染小鼠。将6只初次接受试验的小鼠作为对照也在耳中经皮内注射进行激发。(A)硕大利什曼原虫在受保护的BALB/c小鼠和再次感染的BALB/c小鼠中感染的过程。数值表示损伤的平均直径+标准差(SD)。^＊P＜0.0001表示在激发后第7周时再次感染的小鼠与对照的感染小鼠之间炎症有显著差异。(B)在再次感染后7周，使小鼠安乐死，分别定量测定耳真皮、脾和局部DLN中的寄生物载量。结果表示为12只耳和DLN的平均值±SD。^＊P＜0.001表示再次感染小鼠与感染对照小鼠相比显著降低。(C)安乐死后，从对照小鼠(黑柱)和再次感染小鼠(白柱)获取上颌骨后DLN，并且在存在SLA、LRP或仅存在培养基的情况下体外培养48h。通过ELISA评估培养物上清液中IFN-γ、IL-4和IL-10的水平。(D-E)在再次激发后7周获取血清样品，并通过ELISA分别确定针对LRP(D)和SLA(E)的IgG1和IgG2a抗体的效价。

图6.在C57BL/6小鼠中抵御硕大利什曼原虫感染的保护作用。以3个剂量的LRP+CpG ODN和仅以CpG ODN在右足垫经皮下注射对小鼠(每组6只)进行免疫。(A)疫苗接种的C57BL76小鼠的脾细胞产生的IFN-γ、IL-4和IL-10。在以CpG ODN(黑柱)或LRP+CpG ODN(白柱)疫苗接种后4周，使小鼠安乐死，获取它们的脾，并在存在LRP或仅存在培养基的情况下体外培养48h。通过ELISA评估培养物上清液中细胞因子的水平。(B)在疫苗接种的C57BL/6小鼠中硕大利什曼原虫感染的过程。将每组12只小鼠如上文所述进行免疫，在最后一次接种后4周，通过以硕大利什曼原虫的300个后循环前鞭毛体经皮内注射接种至耳中对它们进行感染。数值表示损伤的平均直径+标准差(SD)。^＊P＜0.001表示两组小鼠之间的炎症有显著降低。(C)在感染后第5周(每组6只小鼠)和第13周(每组6只小鼠)，定量测定来自以CpG ODN(黑柱)或LRP+CpG ODN(白柱)疫苗接种的小鼠的耳真皮和局部DLN中的寄生物载量。结果表示为12只耳和DLN的平均值±SD。^＊P＜0.01表示两组小鼠之间有显著降低。(D-E)以CpG(黑柱)或LRP+CpG ODN(白柱)疫苗接种的小鼠中的IFN-γ产生。在感染后5周获取上颌骨后细胞，并在存在SLA、LRP或仅存在培养基的情况下在培养基中刺激(D)，或者在存在抗IL-12抗体、抗CD4抗体或抗CD8抗体或者存在对照单克隆抗体的情况下以LRP进行刺激。在孵育78h后，通过ELISA评估IFN-γ的水平。以抗CD8单克隆抗体处理和以对照抗体处理之间的IFN-γ生成差异是统计学上显著的(^＊P＜0.01)。(F)在激发后第5周和第13周获取血清样品，并通过ELISA分别确定针对LRP的IgG1和IgG2a抗体的效价。(G)以CpG ODN(黑柱)或LRP+CpG ODN(白柱)疫苗接种的小鼠中IL-10的产生。在感染后5周获取上颌骨后细胞，并在存在SLA、LRP或仅存在培养基的情况下在培养物中进行刺激。在孵育78h后，通过ELISA评估IL-10的水平。

实施例

材料和方法

小鼠品系和寄生物

雌性BALB/c小鼠在实验开始时为6-8周龄，购自Harlan InterfaunaIbérica S.A.(Barcelona，Spain)。硕大利什曼原虫寄生物(克隆WHOM/IR/-173)和克隆V1(MHOM/IL/80)(Friedlin)通过在BALB/c小鼠中传代保持有毒力状态。硕大利什曼原虫无鞭毛体获自腘引流淋巴结(DLN)，并且通过以下方式将其转变成前鞭毛体：在26℃下在补加20％胎牛血清(FCS)的Schneider培养基(Gibco，BRL)中培养，直至它们到达稳定期后期。在26℃下将两克隆的前鞭毛体在补加20％FCS的Schneider培养基(Gibco，BRL)中培养。通过使用花生凝集素(VectorLaboratories，Burlingame，CA.)进行负选择从静态培养物中分离硕大利什曼原虫(克隆V1)的感染态前鞭毛体(后循环)。在26℃下，将婴儿利什曼原虫(MCAN/ES/96/BCN/150，MON-1)前鞭毛体在补加有10％FCS的RPMI培养基(Gibco，BRL)中培养。

CpG ODN和利什曼原虫抗原

为了制备利什曼原虫核糖体蛋白质提取物(LRP)，收获硕大利什曼原虫和婴儿利什曼原虫前鞭毛体，在预冷PBS中洗涤2次，并重新悬浮于1ml NP40(Roche Diagnostics，GmbH，Manheim Germany，cat.N.11332473001)裂解缓冲液(10mM Tris HCl pH 8.0，150mM NaCl，1.5mM MgCl₂和0.5％NP40，PMSF 1mM，亮肽酶素8μg/ml，抑肽酶4μg/ml和Pentatin 8μg/ml)中，并用吸量管吸打10次。在裂解后，将样品在4℃下以3,000×g微量离心2分钟，以沉淀细胞核。将上清液在4℃下以13,000×g微量离心15分钟，进行两次，如(45)中所述从胞质上清液制备核糖体。简而言之，将胞质在Beckman TL100.3转子中在4℃下以90,000rpm高速离心30分钟。将该粗核糖体沉淀再次悬浮于缓冲液A(20mM Tris-HCl pH 7.4、500mM AcNH₄、100mM MgCL₂、5mMβ-巯基乙醇)中，并在TL100.3转子中在4℃下在缓冲液A中以90,000rpm进行不连续蔗糖梯度(20/40％)离心。将洗涤后的核糖体沉淀溶解于PBS中、经超声处理并在-70℃下保存。

硕大利什曼原虫总蛋白(可溶性利什曼原虫抗原[SLA])通过以下方式制备：对悬浮于PBS中的硕大利什曼原虫的静态前鞭毛体进行3次冻融循环。在细胞裂解后，通过使用微量离心机以12,000g离心15分钟将可溶性抗原与不溶级分分开，并在-70℃下保存。用Isogen(TheNetherlands)合成包含CpG基序(CpG ODN)的硫代磷酸修饰的ODN序列。免疫刺激性ODN的序列(5’至3’)为TCAACGTTGA和GCTAGCGTTAGCGT。

免疫和寄生物激发

以12μg硕大利什曼原虫LRP单独地或与50μg的CpG ODN(每种免疫刺激性ODN 25μg)一块，以CpG ODN(50μg)佐剂单独地或者以磷酸盐盐水缓冲液(PBS)在右足垫经皮下注射(s.c.)接种BALB/c小鼠。2和4周后使用相同方案对每组进行加强免疫。通过以下方式进行第一次寄生物激发：在最后一次接种后4周，以5×10⁴个硕大利什曼原虫(克隆WHOM/IR/-173)的稳定期前鞭毛体经皮下注射接种至左(未处理的)足垫中。通过用公制卡尺测量厚度跟踪感染的进展。每只动物的对侧足垫代表对照值，肿胀按如下方式进行计算：左足垫的厚度减去右足垫的厚度。在损伤处开始坏死时将所述动物安乐死。为进行再次感染，将6只BALB/c小鼠如上文所述进行疫苗接种和感染。在18周后，将硕大利什曼原虫(克隆V1)的300个后循环前鞭毛体注入每只小鼠两耳的真皮中。所述感染的进展通过用公制卡尺测量耳损伤的硬结直径进行监测。将6只初次接受试验的BALB/c小鼠组也在耳真皮中进行感染，作为对照。

以12μg硕大利什曼原虫LRP+50μg CpG ODN(每种免疫刺激性ODN 25μg)和以50μg的CpG ODN(50μg)佐剂单独地在足垫经皮下注射注入C57BL/6小鼠。2和4周后以相同免疫方案对这些小鼠进行加强。在最后一次疫苗接种后4周，通过以下方式进行感染：将300个硕大利什曼原虫(克隆V1)的后循环前鞭毛体经真皮内注射(i.d.)接种至小鼠两耳的真皮中。所述感染的进展通过用公制卡尺测量耳损伤的硬结直径进行监测。

寄生物量化

通过有限稀释测定法(6)确定耳中的寄生物数目。简而言之，取感染小鼠的耳。将感染耳的腹片和背片分开。将耳片置于含Liberase CI酶混合物(50μg ml^-1)的DMEM培养基(Dulbecco′s modified Eagle medium)中。在37℃下孵育2小时后，将组织切成小片，匀浆并使用细胞过滤器(孔径70μm)过滤。将匀浆的组织连续稀释于含Schneider培养基和20％FCS的96孔平底微量滴定板中。从最大稀释度确定活寄生物的数目，在该稀释度下前鞭毛体在26℃下孵育可以生长最长达7天。还确定了感染的耳(上颌骨后)和足垫(腘)的局部引流淋巴结(DLN)和脾中寄生物的数目。如上文，取器官、机械分离，然后连续稀释。寄生物载量以整个器官中寄生物的数目表示。

上清液中细胞因子的测量

将脾和相应的局部DLN无菌地取下，机械分离并接种于完全RPMI培养基(补加10％FCS、2mM谷氨酰胺和10mM 2-巯基乙醇的RPMI1640)中。在存在LRP(12μg ml^-1)或SLA(12μg ml^-1)的情况下，在37℃下在48小时的过程中将5×10⁶个细胞ml^-1种于48孔板中。使用市售的ELISA试剂盒(Diaclone，Besancon，France)测量脾细胞和DLN细胞培养物的上清液中IFN-γ、IL-10和IL-4的释放。在一些情形下，将以12μg ml^-1LRP刺激的DLN细胞在存在10μg ml^-1抗小鼠CD4(GK1.5)、小鼠IL-12(C17.8)或小鼠CD8(53-6.7)的单克隆抗体(mAb)的条件下孵育。在该测试中还分析了与同种型匹配的合适对照物。抗体(无叠氮化合物/低内毒素^TM(endotoxin^TM))购自BD(PharMingen)。

体液应答的分析

通过ELISA或蛋白质印迹分析血清样品的抗LRP或SLA的特异性抗体。简而言之，在室温下以100μl的LRP(在PBS中5μg ml^-1)或SLA(在PBS中2μg ml^-1)将标准ELISA板包被过夜。效价通过血清的连续稀释确定，并定义为呈现＞0.2的吸光度的最大血清稀释因子的倒数。以下列辣根过氧化物酶缀合的抗小鼠免疫球蛋白(NordicImmunological Laboratories，Tilburg，The Netherlands)进行同种型特异性分析：抗IgG1(1/1000)和抗IgG2a(1/500)。将邻苯二胺二盐酸盐-OPD-(Dako，A/S，Glostrup，Denmark)用作ELISA测定的过氧化物酶底物。在15分钟后，通过加入100μl的1M H₂SO₄终止反应，并在450nm下读取吸光度。

为进行蛋白质印迹分析，获取婴儿利什曼原虫和硕大利什曼原虫核糖体蛋白质，将其重新悬浮于Laemmli缓冲液中，以SDS-PAGE分离，并转移至硝酸纤维素膜(Amersham，Aylesbury，UK)上。以对照狗、患有VCL利什曼病的狗的血清，或者来自本实验中应用的不同小鼠组的血清以标明的稀释度探测所述印迹。购自Nordic ImmunologicalLaboratories(Tilburg，The Netherlands)的辣根过氧化物酶缀合的抗小鼠的抗IgG(1/1000)、抗IgG1(1/1000)、抗IgG2a(1/500)免疫球蛋白和抗狗IgG(1/2000)作为二抗使用。

统计学分析

统计学分析通过Student t检验进行。P＜0.05时认为差异是显著的。

结果

感染过程中LRP的抗原性

为了分析利什曼原虫核糖体蛋白质(LRP)的抗原性，通过蛋白质印迹分析了来自天然感染婴儿利什曼原虫的狗的血清抗该寄生物LRP的反应性。已经发现，来自患有活跃疾病的狗的血清识别了LRP提取物中的大量蛋白质条带(图1A)。来自实验感染硕大利什曼原虫的C57BL/6和BALB/c小鼠的血清也识别硕大利什曼原虫LRP中的许多蛋白质条带，通过存在于BALB/c敏感小鼠血清中的IgG抗体所识别的核糖体蛋白质数目大于C57BL/6抗性小鼠血清中的这些抗体所识别的蛋白质数目(图1B)。

由于IgG1和IgG2a抗体的诱导可被用作Th₂型和Th₁型免疫应答的标记物(8)，本发明人在硕大利什曼原虫感染的小鼠中分析了抗LRP的IgG1/IgG2a极化。在BALB/c小鼠中，抗LRP反应主要是IgG1同种型，而它在C57BL/6小鼠中是IgG2a同种型(图1C)。在两小鼠品系中，以LRP体外刺激DLN细胞后的IFN-γ、IL-4和IL-10的产生也都被确认。在患有CL的BALB/c小鼠中，不但检测到了LRP特异的IFN-γ的产生，而且IL-4和IL-10的产生也受到强刺激，IFN-γ/IL-4比值≈2.4，IFNγ/IL-10比值≈1.4(图1D)。相反，当以LRP刺激来自痊愈C57BL/6小鼠的DLN细胞时，获得的结果是无IL-4(＜7.5pg ml^-1)和高IFN-γ/IL-10比值(≈15)(图1E)。

LRP在BALB/c小鼠中的免疫原性

在不存在或存在CpG ODN的条件下，在给予核糖体蛋白质后，在BALB/c小鼠中评估对LRP的免疫应答。在以LRPE+CpG ODN疫苗接种后，抗LRPE的体液应答主要是IgG2a同种型，而在来自仅以LRPE免疫的小鼠的血清中检测到了较低效价的IgG1同种型抗体(图2A)。在以LRPE体外刺激后，来自以LRPE+GpG ODN免疫小鼠的脾细胞分泌的IFN-γ水平高于来自对照小鼠和来自仅以LRPE免疫的小鼠的脾细胞分泌的水平(图2B)。在以LRPE刺激后，在任何组中均未出现IL-4产生的增加(图2C)。值得注意的是，在以LRPE+CpG ODN疫苗接种小鼠的脾建立的培养物的上清液中检测到了特异的IL-10，IFNγ/IL-10比值≈40(图2D)。总之，这些结果证明了，在BALB/c小鼠中，给予LRPE而无佐剂时仅诱导弱IgG1体液应答，但与CpG ODN共给药时可加强抗这些抗原的Th₁样应答。

以LRPE+CpG ODN进行疫苗接种可保护BALB/c小鼠对抗硕大利什曼原虫激发。

由于将疾病相关抗原诱导的Th₂应答重定向至Th1应答已经被认为是一种有前景的开发抗利什曼原虫疫苗的方法(7)，本发明人分析了以LRPE+CpG ODN进行的免疫接种是否能够诱导针对硕大利什曼原虫感染的保护作用。图3A显示，LRPE+CpG OND可诱导有效的保护作用，理由是在与对照小鼠和以仅LRPE疫苗接种的小鼠(平均值≈5.5mm)相比，这些小鼠中的足垫肿胀减轻(在第8周时平均值为0.7mm)。本发明人接着分析了4组小鼠腘DLN中和脾中的寄生物载量。来自以LRPE-CpG免疫的小鼠的DLN与其他组相比显示了≈3-log的寄生物载量减少。另外，虽然类似的寄生物载量出现于对照小鼠和仅以LRPE免疫的小鼠的脾中，但在LRPE+CpG ODN疫苗接种的小鼠的脾中未检测到寄生物(图3B)。

为了确定与LRPE+CpG ODN诱导的保护作用有关的免疫参数，测定了SLA或LRPE驱动的IL-4、IL-10和IFN-γ产生。在来自对照(盐水和CpG)以及来自仅以LRPE免疫的小鼠的DLN细胞中检测到了SLA或LRPE特异性诱导的IL-4和IL-10产生(图3C-D)。相反，来自以LRPE+CpG ODN免疫的小鼠的DLN细胞产生的IFN-γ量比其他3组中检测到的量更高(图3E)。还分析了LRPE特异性IFN-γ产生中CD4⁺和CD8⁺T细胞的贡献以及对IL-12的依赖性。如图3F中所示，IFN-γ的产生被抗IL-12单克隆抗体或抗CD4单克隆抗体完全抑制。将CD8抗体加入DLN细胞培养物中仅部分地降低该细胞因子在上清液中的量。

考虑到在BALB/c小鼠中，IL-4依赖的高效价抗体产生与疾病进展有关，本发明人在感染后第8周通过ELISA分析了诱发的抗LRPE体液应答。在已被LRPE+CpG ODN免疫的小鼠中所述寄生物激发所诱发的抗LRPE的抗体主要是IgG2a同种型。同时，与仅以LRPE免疫的小鼠和两对照中的小鼠相比，被保护的小鼠的血清中存在更低效价的IgG1同种型抗LRPE抗体(图4A)。抗LRPE的IgG1效价的降低与核糖体蛋白条带数目减少有关，所述核糖体蛋白条带被来自LRPE+CpG ODN疫苗接种小鼠血清的IgG1抗体所识别。如图4B中所示，来自以盐水、CpG或LRPE单独免疫的小鼠血清的IgG1同种型抗体在LRPE蛋白质印迹中识别了更多数目的蛋白质条带。而被保护小鼠的IgG1抗体仅识别少数条带。蛋白质印迹分析还表明，与其他3组相比，来自LRPE+CpGODN疫苗接种小鼠的血清中的IgG2a抗体所识别的蛋白质条带数目未增加(图4B)。以LRPE+CpG ODN进行的疫苗接种还决定了硕大利什曼原虫感染诱导的全身利什曼原虫属体液应答。在已经以LRPE+CpGODN免疫的小鼠中，寄生物激发所诱发的抗SLA抗体主要是IgG2a同种型，IgG1同种型抗体的抗SLA效价显著低于其他3组中检测的(图4C)。

LRPE+CpG ODN疫苗接种和感染的小鼠可抵抗耳真皮中硕大利什曼原虫的再感染

为了确定LRPE+CpG ODN疫苗接种和感染的小鼠是否能够控制第二次寄生物激发，如上文所述将6只BALB/c小鼠在足垫进行疫苗接种和感染。在18周中这些小鼠组的足垫肿胀＜0.7mm(数据未显示)。然后，将这些经保护的小鼠以300个硕大利什曼原虫后循环前鞭毛体在耳真皮中再次感染。6只首次用于试验的小鼠的对照组也被感染。观察到，LRPE+CpG ODN疫苗接种的再感染小鼠受到保护而不形成真皮损伤，原因是这些小鼠中未出现病状，而对照小鼠在第7周时出现明显的耳损伤(图5A)。耳真皮中和上颌骨后DLN中的寄生物载量在两组之间也显著不同(图5B)。疫苗接种的再感染小鼠耳中和DLN中的低寄生物载量与脾中不存在寄生物相关联。为了了解再次感染后出现的细胞反应，分析了以LRPE或SLA体外刺激后上颌骨后DLN细胞的IFN-γ、IL-4和IL-10分泌(图5C)。在对照小鼠中，当在足垫中感染小鼠时(图3C-E)检测到了特异的IFN-γ产生，而且也强烈刺激了IL-4和IL-10产生。相反，疫苗接种的再感染小鼠DLN细胞产生了大量的特异IFN-γ，但几乎未检测到IL-4和IL-10(图5C)。一致认为，它们的抗LRPE(图5D)和SLA(图5E)的IgG体液应答为IgG2a同种型。

以LRPE+CpG ODN进行的疫苗接种赋予C57BL/6小鼠抵御针对由硕大利什曼原虫激发引起的真皮病状的保护作用

考虑到在BALB/c小鼠中，以LRPE+CpG ODN进行的疫苗接种通过将抗LRPE的Th₂免疫应答重定向至Th₁应答而抵御硕大利什曼原虫感染，本发明人分析了在C57BL/6小鼠中给予该疫苗时的作用，C57BL/6小鼠是一种天然发生抗利什曼原虫抗原的Th₁应答的模型。将一组C57BL/6小鼠以3个剂量的LRPE+CpG ODN免疫，对照小鼠仅接受CpG ODN佐剂。以LRPE刺激的脾细胞培养物上清液中IFN-γ的体外生成证明了接种可诱导Th₁应答。在以LRPE+CpG ODN疫苗接种小鼠建立的脾细胞培养物的上清液中也检测到特异性IL-10的存在，而在刺激后未出现特异性IL-4的产生(图6A)。LRPE+CpG ODN疫苗接种小鼠被保护而可抵御真皮损伤的形成，原因是没有或几乎没有观察到病状(图6B)。CpG ODN免疫小鼠形成的损伤在第7周达到峰值，在第13周几乎完全痊愈。由于在该模型中感染部位的寄生物数目仅在形成损伤之前达到峰值(5)，本发明人在第5周确定了耳中和局部DLN(上颌骨后)中的寄生物载量。经疫苗接种的小鼠的耳真皮中寄生物数目降低≈300倍(LRPE+CpG ODN免疫小鼠为1.0×10⁴个寄生物，CpG-ODN免疫小鼠为3×10⁶个寄生物)，DLN中降低≈40倍(LRPE+CpG ODN小鼠为5.0×10⁴个寄生物，CpG ODN小鼠为2×10⁶个寄生物)。在痊愈后，在对照小鼠(激发后13周)中，在所有组中均观察到寄生物数目减少。

为了确定与保护作用相关的免疫参数，分析了抗原驱动的IL-4、IL-10和IFN-γ产生。在激发后第5周，建立了DLN细胞的培养物并以LRPE或SLA刺激。如图6D中所示，疫苗接种小鼠的细胞产生了比对照小鼠细胞更多的SLA和LRPE特异性IFN-γ。还分析了LRPE特异性的IFN-γ产生中CD4⁺和CD8⁺T细胞的贡献以及对IL-12的依赖性。IFN-γ的分泌被抗IL-12单克隆抗体或抗CD4单克隆抗体完全抑制。抗CD8抗体处理仅部分地降低该细胞因子的水平。这些数据证明了，在C57BL/6中以LRPE+CpG ODN进行的疫苗接种诱导了皮肤中的和局部DLN中的病状和寄生物载量的减少，这与抗LRPE的较早期特异性Th₁应答的诱导有关。一致认为，与对照小鼠相比，疫苗接种小鼠中更早检测到了更高效价的IgG2a特异性抗LRPE抗体(图6F)。本发明人还检测了SLA或LRPE抗原特性的IL-10产生，其在疫苗接种小鼠和对照小鼠之间是无统计差异的。

讨论

在本研究中，本发明人已证明与许多寄生物核糖体蛋白质反应的抗体出现于患VCL的狗的血清中和以硕大利什曼原虫感染的小鼠中，这表明所述蛋白质是利什曼原虫属天然感染和实验感染中的强抗原。感染的BALB/c小鼠抗LRPE的应答是Th2型，原因是抗LRPE抗体反应主要是IgG1同种型。该观察结果被如下这样的事实强化，即在以LRPE体外刺激来自感染小鼠的DLN细胞后，在培养物上清液中检测到了大量的IL-4。虽然LRPE还参与INF-γ的体外产生，但是检测到相当水平的IL-10，IL-10是使得感染的巨噬细胞对寄生物破坏的活化信号无反应的多效抗炎细胞因子(31)。再者，考虑到IL-4和IL-10在促进BALB/c小鼠的疾病发展中的作用似乎是加合性的(综述见(37))，可以将LRPE对这些细胞因子的刺激作用作为以下事件的指示：宿主抗核糖体抗原的应答有利于BALB/c小鼠中寄生物扩增和持续。可以认为，在利什曼原虫感染后早期，宿主的免疫系统被寄生物细胞溶解释放的高丰度LRPE初次免疫，随后由于寄生物增殖而加强免疫。因此，LRPE的强免疫原性及其病理抗原功能可能依赖于它们的高丰度和抗原特异性(尽管它们有进化保守特征)。相反，C57BL/6小鼠抗LRPE的应答是Th₁型，生成IgG2a特异性抗体并且体外产生高水平的特异性INF-γ，无法检测到IL-4水平。同时，本发明人发现，在感染后第14周有LRPE特异的IL-10产生。考虑到IFN-γ/IL-10比值类似于以SLA刺激细胞时(数据未显示)得到的比值，本发明人提出这些抗原诱导的IL-10产生可能与有利于已在该模型中出现的寄生物维持的调节应答是相关的(4)。本发明的数据表明，抗LRPE的应答与以下事实是一致，即在易感宿主中偏向于诱导病理相关的Th₂介导的体液应答，而在抗性宿主中偏向于诱导Th₁相关的保护性应答。

由于针对一些利什曼原虫表位诱导的Th₂应答重定向至Th₁应答可能是一种有前景的诱导抗硕大利什曼原虫感染的保护策略(7)，本发明人首先决定在BALB/c小鼠中分析与CpG ODN共给予的LRPE的免疫原性，佐剂CpG ODN在以不同的利什曼原虫抗原免疫时赋予Th₁相关的长期免疫性和保护作用(43)，并且在小鼠中还会抑制一些寄生物特异的Th₂应答(12，57)。如图2中所示，发现BALB/c中形成的免疫应答为Th₁型，原因是在以LRPE体外刺激后，免疫小鼠形成了IgG2a同种型的抗LRPE抗体并且来自疫苗接种小鼠的脾细胞产生了大量的IFN-γ，而不产生IL-4。在以LRPE+CpG ODN免疫时，C57BL/6小鼠中产生了类似的特异性免疫应答(图6A)。在两小鼠品系中，在免疫后还出现了LRPE驱动的IL-10产生。

虽然已经报道，以编码L31的基因疫苗进行的疫苗接种可在基因疫苗接种后参与特异性IL-10产生(44)，但本发明人认为IL-10的产生可能与给予LRPE+CpG ODN后出现的Th₁应答的稳态控制更加有关。事实上，最近已报道，产生INF-γ的Th₁细胞还可以作为反馈控制机制参与IL-10的产生(2)。而且，获得的高IFNγ/IL-10比值可提供疫苗结果的良好预测(44)。

本文呈现的数据表明，LRPE+CpG ODN的共给药可在皮肤实验性利什曼病的两个不同模型中诱导保护作用：在BALB/c小鼠(在皮肤利什曼病疫苗测定中广泛使用)的足垫中高剂量接种，在C57BL/6小鼠(在途径和感染剂量方面更紧密模拟人疾病的模型)的耳中低剂量接种。疫苗接种的BALB/c小鼠的腘DLN中的寄生物载量减少，脾中无寄生物散布。而且在感染的足垫中检测到很轻的炎症。疫苗接种C57BL/6小鼠被保护而可防御耳真皮病状，显示出皮肤中和DLN中寄生物载量降低。该保护作用与热灭活利什曼原虫抗原+CpG ODN疫苗接种的C57BL/6小鼠所显示的保护作用相当，并且在该模型中还测试了含LACK、LmSTI1和TSA的多组分疫苗(28，29，43)。

重要的是，两个品系中的保护作用与抗LRPE的Th₁特异性免疫应答的生成是相关的。对该细胞应答的体外分析是在BALB/c小鼠感染后第8周测量的，以及在C57BL/6小鼠中第5周(与寄生物载量峰值一致(4))测量的。在以LRPE刺激时，来自以LRPE+CpG ODN疫苗接种的两个小鼠品系的DLN细胞分泌了比其相应对照组更高水平的IFN-γ。IFN-γ应答被发现是IL-12依赖的，并且由CD4+T细胞产生，同时有CD8+T细胞较少的贡献。如预计的，在两个品系中被保护的小鼠的SLA特异性的IFN-γ产生较高。在BALB/c小鼠中，被保护的小鼠中Th₁应答的产生与抗LRPE的主要IgG2a特异性抗体的生成相关(图4A)。观察到，品系之间在IL-10的体外产生上有一些差异。本发明人的数据表明，在以LRPE和SLA二者体外刺激后，被保护的BALB/c小鼠产生了比对照显著更低的IL-10水平，这与该细胞因子与该模型的敏感性有关是一致的(35)。在另一方面，在感染的急性期中，以LRPE或SLA体外刺激后，对照和疫苗接种的C57BL/6LNC都产生了IL-10(图6F)。如IFN-γ，与以SLA刺激细胞时相比，以LRPE刺激细胞时IL-10的水平更高。IFN-γ和IL-10产生具有相似情形的事实可以作为这样的指示，即疫苗接种后的IL-10的产生反映了对强Th₁在宿主中将引起的有害效应进行控制的稳态机制(4)。值得注意的是，本发明人已经发现，在以LRPE+CpG ODN疫苗接种后BALB/c小鼠中出现的保护作用还与以下事件相关，即以LRPE或SLA体外刺激后抗原驱动的IL-4的产生显著减少。这些细胞应答在体内与Th₂介导的针对核糖体蛋白质的抗体反应反转有关。因此，来自被保护的BALB/c小鼠的血清呈现显著降低的效价，并且特异性针对LRPE的IgG1抗体所识别的抗原数目显著减少。另外，以LRPE+CpG ODN对BALB/c小鼠进行的免疫还对硕大利什曼原虫感染诱发的小鼠全身体液应答具有明显影响(图5C)。因此，对疫苗接种小鼠的感染可诱导有限的IgG1抗利什曼原虫属的特异性抗体，而在所测定的其他对照小鼠组中诱导的体液应答更强，并且主要是Th₂型抗体(即IgG1同种型)。总之，在两个品系小鼠的疫苗接种小鼠中观察到的保护作用与抗LRPE的Th₁应答的产生有关，抗LRPE的Th₁应答还会导致BALB/c小鼠中IL-4驱动的抗SLA的Th₂和IL-10应答下调。

本发明人的数据表明，被保护的BALB/c小鼠已获得了赋予它们抵抗进一步感染的能力的免疫状态(可应用于疫区的疫苗的显著特征，在疫区中与寄生物的再接触会是十分频繁的)。在耳真皮进行再次激发后，这些小鼠显示了抵御硕大利什曼原虫感染的强保护作用。出现的真皮损伤发生很少(在一些情况下完全未检测到真皮损伤)，以及感染的耳中和DLN中寄生物数目的大量减少。虽然来自被保护的小鼠的DLN细胞未产生比对照更多的IFN-γ量(在感染后第7周测量)，但是抗LRPE和SLA的IgG2a抗体的效价可作为这些小鼠在第二次激发后发生特异的Th₁保护性应答的指示。值得注意的是，这些小鼠中疾病相关细胞因子IL-4和IL-10的特异性产生非常低。这些数据表明，初次寄生物激发后形成的免疫状态非常强，导致所述寄生物从所述再感染部位被快速且有效地清除。

本文呈现的数据证明了，在抗性小鼠和敏感性小鼠中，以LRPE+CpG ODN进行的疫苗接种在利什曼原虫感染时对免疫系统的决策都有直接影响。本发明人认为，抗诸如利什曼原虫属的复合寄生物的疫苗的产生可通过在疫苗制剂中整合不同靶抗原进行优化，这利用了这些可诱导所需免疫性(主要是CD4⁺和CD8⁺IFN-γ介导的应答)的抗原，并重定向至导致病状的偏向于Th₁的病理抗原驱动型免疫应答(IL-4Th₂驱动且IL-10失活的应答)。然而，应考虑的是，针对这些抗原中一些抗原的Th₂应答可能不能通过通常的Th₁诱导物重定向，如以硕大利什曼原虫的meta 1抗原的情况(50)。

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Claims

1.一种核糖体蛋白质提取物和任选的促Th₁佐剂用于制备治疗或预防受试者中寄生虫病的药剂的用途。

2.权利要求1的用途，其中所述药剂为疫苗。

3.权利要求1或2的用途，其中所述核糖体蛋白质提取物可通过使用当存在于受试者中时会造成寄生虫病的寄生物细胞进行如下步骤而得到：

a.将寄生物细胞与裂解缓冲液混合，

b.离心所得到的混合物，以得到胞质提取物，

c.从所得到的胞质提取物制备所述核糖体蛋白质提取物。

4.权利要求1-3任一项的用途，其中所述核糖体蛋白质提取物获自利什曼原虫属(Leishmania)种，优选硕大利什曼原虫(Leishmaniamajor)。

5.权利要求1-4任一项的用途，其中所述促Th₁佐剂为CpG ODN。

6.权利要求1-5任一项的用途，其中所述寄生虫病为利什曼病或疟疾。

7.权利要求1-6任一项的用途，其中所述寄生虫病由利什曼原虫属或者由疟原虫属(Plasmodium)种造成。

8.权利要求1-7任一项的用途，其中所述寄生虫病由与所述核糖体蛋白质提取物所来源的物种不同的物种造成。

9.一种包含核糖体蛋白质提取物和任选的促Th₁佐剂的组合物。

10.权利要求9的组合物，所述组合物由核糖体蛋白质提取物和促Th₁佐剂组成。

11.权利要求9或10的组合物，其中所述Th₁佐剂为CpG ODN。

12.权利要求9-11任一项的组合物，所述组合物还包含可药用的佐剂和/或载体。

13.权利要求9-12任一项的组合物，所述组合物用作药剂。

14.权利要求12的组合物，其中所述药剂为疫苗。