CN101977931A - 多肽及包含该多肽的药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新型的能抑制血管生成的多肽。还公开了该多肽的用途。该多肽包含选自SEQ ID No：1-3中描述的氨基酸序列中的至少一个氨基酸序列，包含120个或少于120个氨基酸残基，具有抗血管生成活性。该多肽具有抗血管生成活性，与PEDF相比具有较低的分子量，且具有优秀的渗透或吸收入活体，尤其是活体的感染部分的性能。

Description

多肽及包含该多肽的药物组合物

技术领域

本发明涉及一种能有效治疗或预防包括血管生成的疾病的多肽、一种以该多肽作为活性成分的抗血管生成药剂、或者一种包含该多肽的药物组合物。

背景技术

在人体中，仅在适当时间或适当位置通过在血管生成促进因子和抗血管生成因子之间的功能平衡的严格控制下会诱导血管生成，例如，在伤口愈合和月经期的特定阶段。

然而，已知的是，在某些疾病中，由于某些原因上述调节失效，引起产生不期望的血管生成和症状恶化。例如，在糖尿病视网膜病变和与年龄相关的黄斑变性，已经观察到在虹膜、视网膜或者视神经中有新血管形成，而已知这将引起严重的视力降低。此外，已知在若干实体肿瘤中也诱导血管生成，而新形成的血管为肿瘤细胞供血以长成肿瘤，并损害周围正常组织，其经由血流促进了肿瘤细胞向其他位置或组织的转移。

已经识别出一些与血管生成相关的因素。促进血管生成的因素的代表性例子包括血管内皮生长因子(VEGF)、低氧诱导因子1(HIF-1)的α亚组、免疫球蛋白总科的110kDa成员、血管生成素-1(Ang1)、和血管生成素-2(Ang2)。此外，属于在内皮细胞的表面表达的跨膜蛋白酪氨酸激酶的Flt-1和FLK-1/KDR受体也通过与VEGF结合而引起细胞信号级联，导致在周围组织中的最终血管形成。因此，他们也被认为是血管形成促进因素。

同时，抗血管生成因子的代表性例子包括色素上皮衍生因子(PEDF)、内皮抑素、和TIMP-3。据报道当施加到已经被诱发血管生成的位置时，这些抗血管生成因子抑制血管生成并施加某些治疗效果。例如，在被施加表达PEDF的腺相关病毒载体的模型动物中，已经证实视网膜上皮细胞中的对毛细管血管生成的抑制。而且，已知的是，在被施加表达血管生成抑制因子的腺相关病毒载体的模型动物中，血管生成也被抑制，在早产儿视网膜病变的小鼠模型中通过视网膜下注射内皮抑素也抑制了视网膜血管生成(非专利文献2)。

这些抗血管生成因子中，PEDF(非专利文献1)作为抗血管生成试剂的应用由于其强抗血管生成作用已经被引起了注意(例如，专利文献1和专利文献3)。

同样，专利文献4也提出将PEDF或者具有包含PEDF的78-121位置的氨基酸序列的44氨基酸残基的多肽(PEDF44AA肽)应用在与过度血管生成或者血管通透性增高相关的疾病的治疗中。专利文献1已经推断所有的施加PEDF的已知生理功能存在于上述的44氨基酸区域，它们当中，特定氨基酸残基对于PEDF和PEDF44AA肽的功能性表达特别关键。

非专利文献1：Steele等，1993，Proc.Natl.Acad.USA，卷90，期4，页码：1526-1530

专利文献1：国际专利申请的国家公布2007-528903 

专利文献2：国际专利申请的国家公布2004-517117

专利文献3：国际专利申请的国家公布：2004-516001

专利文献4：国际专利申请的国家公布2007-509984

发明内容

本发明所要解决的问题

本发明的一个目的是要提供一种能够抑制血管生成的新颖的多肽及该多肽的用途。

解决该问题的方法

本申请的发明人寻找一种新型的能替代PEDF的具有抗血管生成活性的多肽。结果，他们惊奇的发现一种多肽，该多肽具有存在于PEDF的C端附近、但完全不同于PEDF的位置78-121的氨基酸区的特定氨基酸，展现出抗血管生成的效果，由此完成了下述的发明。即，本发明如下：

(1)一具有抗血管生成活性的多肽，包括SEQ ID NO：1-3中的任意一个或多个氨基酸序列，并具有120或少于120的氨基酸残基。

(2)根据(1)的多肽，包含SEQ ID NO：4所示氨基酸序列(F3)。

(3)根据(1)的多肽，具有20或小于20的氨基酸残基。

(4)根据(3)的多肽，包含SEQ ID NO：5所示氨基酸序列(P5)。

(5)根据(1)的多肽，包含SEQ ID NO：1-3中任一所示氨基酸序列(P5-1至P5-3)。

(6)一种用于牛皮癣的治疗试剂，包含一种多肽作为活性成分，该多肽包含SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列并具有抗血管生成功能(PEDF)。

(7)一种抗血管生成药剂，包含根据(1)-(5)中任一的多肽作为活性成分。

(8)一种用于牛皮癣的治疗药剂，包含根据(1)-(5)中任一的多肽作为活性成分。

(9)一种肿瘤细胞增生抑制药剂，包含根据(1)-(5)中任一的多肽作为活性成分。

(10)一种抗血管生成药物组合物，包含根据(1)-(5)中任一的多肽和一种药学上可接受的载体或赋形剂。

(11)一种用于治疗牛皮癣的药物组合物，包含根据(1)-(5)中任一的多肽和一种药学上可接受的载体或赋形剂。

(12)根据(10)或(11)的药物组合物，作为外用药剂而被提供。

技术效果

本发明的多肽与PEDF相比是一个较低分子量的多肽，并保持了抗血管生成作用。其能克服活体抵抗外来物质入侵的屏障机理，例如皮肤屏障，并具有优秀的渗透或吸收入活体，尤其是进入感染部分的性能。而且，该较低分子量的肽能通过化学合成制备，与PEDF相比可以更便宜的大量生产，其生产需要重组技术，这使得大量降低了药品的制造成本。而且，作为一个低分子量多肽，与大分子例如蛋白质相比，通常具有更优秀的稳定性，多肽有利于用作药物，其能被制成各种形式。

附图说明

图1所示是每个多肽关于PEDF的分布示意图；

图2是PEDF和多肽F1-F3对MG63、人体骨肉瘤细胞增生的抑制作用图。图中，Con指的是添加PBS的对照试验；

图3是多肽P1-P6对MG63、人体骨肉瘤细胞增生的抑制作用图。图中，Con指的是添加PBS的对照试验；

图4是多肽P5-1至P5-3对MG63、人体骨肉瘤细胞增生的抑制作用图。图中，Con指的是添加PBS的对照试验；

图5是多肽P5-1至P5-3对HUVECs增生的抑制作用图。图中，Con指的是添加PBS的对照试验；

图6是被移植到老鼠背部的源自牛皮癣患者的皮肤的厚度变化图。图中，对照肽指的是添加的具有随机序列的肽的对照试验；

图7是被移植到老鼠背部的源自牛皮癣患者的皮肤的毛细管内皮细胞数目变化图。图中，对照肽指的是添加的具有随机序列的肽的对照试验；

图8是被移植到老鼠背部的源自牛皮癣患者的皮肤的厚度照片，老鼠分别接受了PEDF蛋白或PBS的皮下注射；

图9是被移植到老鼠背部的源自牛皮癣患者的皮肤的厚度图，老鼠分别接受了PEDF蛋白或PBS的皮下注射；

图10是被移植到老鼠背部的源自正常个体的皮肤的厚度照片，老鼠分别接受了PEDF蛋白或PBS的皮下注射；

图11是被移植到老鼠背部的源自正常个体的皮肤的厚度图，老鼠分别接受了PEDF蛋白或PBS的皮下注射；

图12是被移植到老鼠背部的源自牛皮癣患者的皮肤中的CD31阳性毛细管内皮细胞的数目图，老鼠分别接受了PEDF蛋白或PBS的皮下注射；

图13是被移植到老鼠背部的源自正常个体的皮肤中的CD31阳性毛细管内皮细胞的数目图，老鼠分别接受了PEDF蛋白或PBS的皮下注射；

图14是被移植到老鼠背部的源自牛皮癣患者的皮肤的基底层中Ki67阳性细胞的频率；以及

图15是被移植到老鼠背部的源自正常个体的皮肤的基底层中Ki67阳性细胞的频率。

具体实施方式

本发明提供了一种具有抗血管生成作用的多肽，包括SEQ ID NO：1-3中的任意一个或多个氨基酸序列，并具有120或少于120的氨基酸残基。

在一个优选的方面，前述多肽是一包含如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的多肽。下文中，这样的多肽被称为F3。F3氨基酸序列与PEDF的301至418位置的氨基酸序列同一(其全部氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示)。

在另一个优选的方面，前述多肽是一个具有抗血管生成作用的多肽，其包含SEQ ID NO：1-3中任一个或多个所示氨基酸序列，并具有20个或少于20个氨基酸残基。更优选的，其为包含如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列的多肽。下文中，所述多肽被称为P5。P5的氨基酸序列与PEDF的381-400位置的氨基酸序列同一。

在最优选的一个方面，前述多肽为具有抗血管生成作用的多肽，其包含SEQ ID NO：1-3中任一个或多个所示氨基酸序列。如SEQ ID NO：1-3中所示的氨基酸序列分别与PEDF的381-387、388-394和395-400位置的氨基酸序列同一。包含如SEQ ID NO：1-3所示的氨基酸序列的多肽分别用P5-1、P5-2和P5-3表示。

如下文中所描述的实施例，本发明的多肽与PEDF类似，具有抑制人类骨肉瘤细胞MG63细胞或者正常人类脐静脉内皮细胞(HUVECs)生长的活性。这意味着本发明的多肽具有类似于PEDF的抗血管生成作用。因此，本发明的多肽能被用作抗血管生成药剂。值得注意的是，本发明中，“抑制血管生成”和“抗血管生成药剂”可以与“阻碍血管生成”和“血管生成阻碍药剂”互相替换。因此，“抗血管生成作用”也可以称为“阻碍血管生成作用”，“抗血管生成药剂”可以被称为“血管生成阻碍药剂”。

如上所述，专利文献4描述了支配PEDF功能的片段是PEDF的N端边的78-121位置的氨基酸序列片段。位置78-121的氨基酸序列完全不同于构成本发明的多肽的氨基酸序列，并且这些氨基酸序列在PEDF中完全不重叠。罕见的是功能蛋白例如为PEDF具有多个独立的所谓“活性中心”并且位于单一蛋白质分子内的不同位置。因此，本发明提供了一个先前未知的、完全新颖的与PEDF的结构-功能关系相关的新发现

值得注意的是，F3是“一种多肽，其具有抗血管生成作用包含SEQ IDNO：1-3中任一个或多个所示氨基酸序列，并包含120个或少于120个氨基酸残基”中的一个例子。关于氨基酸序列F3，一个氨基酸序列，其除了构成如SEQ ID NO：1-3中的任一个的氨基酸序列之外的一个或多个氨基酸序列被取代或删除，或者一个多肽，其包含，在氨基酸残基的数目不超过120的范围内，通过向F3氨基酸序列增加氨基酸而获得的氨基酸序列，只要其保留了抗血管生成效果，也被包含在本发明的范围内。

同样的，P5是“一种多肽，其具有抗血管生成作用，包含SEQ ID NO：1-3中任一个或多个所示氨基酸序列，并包含20个或少于20个氨基酸残基”中的一个例子。关于氨基酸序列P5，一个氨基酸序列，其中除了构成如SEQID NO：1-3中的任一个的氨基酸序列之外的一个或多个氨基酸被取代或删除，或者一个多肽，包含，在氨基酸残基的数目不超过120的范围内，向P5氨基酸序列通过增加氨基酸而获得的氨基酸序列，只要其保留了抗血管生成效果，也被包含在本发明的范围内。

与F3的氨基酸序列的取代和删除相关的“一个或多个”意思是一个到几十个，优选是1-30，更优选的是1-20，甚至更优选的是1-10，最优选的是1-5。同样的，基于F3氨基酸序列的氨基酸序列的同一性(％)，其可以表示成一个氨基酸序列具有与每个氨基酸序列的80％或更高、优选的85％或更高、更优选的90％或更高、特别优选的95％或更高的同一性。同样，与P5的氨基酸序列的取代和删除相关的“一个或多个”意思是1-10，优选是1-5，更优选的是1-3。同样的，基于P5氨基酸序列的氨基酸序列的同一性(％)，其可以表示成一个氨基酸序列具有与每个氨基酸序列的80％或更高、优选的85％或更高、更有选的90％或更高、特别优选的95％或更高的同一性。

根据经验可知，在蛋白质的氨基酸序列中，氨基酸残基的物理化学性能的高度保守突变，例如电荷、尺寸和疏水性，是可以接受的。氨基酸残基取代的例子包括甘氨酸(Gly)和脯氨酸(Pro)、甘氨酸和丙氨酸(Ala)或者缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)和异亮氨酸(Ile)、谷氨酸(Glu)和谷氨酰氨(Gln)、天冬氨酸(Asp)和天冬酰胺(Asn)、半胱氨酸(Cys)和苏氨酸(Thr)、苏氨酸和丝氨酸(Ser)或者丙氨酸、赖氨酸(Lys)和精氨酸(Arg)。而且，即使当突变超出了可容忍保守，本领域技术人员经验上可认识到可以有不区别于蛋白质的关键功能的突变存在。相应的，同样在本发明的多肽中，有着包含通过取代、删除和/或增加一个或多个氨基酸而获得的氨基酸的多肽仍然保留着抗血管生成性能。这样的多肽仍然被理解为本发明的一个方面。

而且，本发明的多肽可以作为所谓的融合蛋白来生产或使用，其通过将具有不同于本发明多肽的功能的多肽添加到本发明的多肽的N端和/或C端。这样的融合多肽也是本发明的一个方面。考虑到额外增加了添加的多肽的功能，有可能与单独生产或使用本发明的多肽相比，融合蛋白具有增强了的效用。这样的功能化的多肽的例子包括谷胱甘肽-S-转移酶、荧光蛋白、FLAG标签、组氨酸标签、和角素结合序列。

此外，可能需要向本发明的多肽加上一个合适的例如为荧光物质和放射性物质的标记化合物、和连接不同化学改性物质和聚合物例如聚乙烯乙二醇。可选择的，还可能将本发明的多肽与一个不溶载体相连接。以一多肽为目标的化学改性方法对本领域技术人员而言是公知的，本发明中使用的多肽可以以任何方式被改性或利用，只要其功能不受损害。值得注意的是，由于本发明的多肽在非糖基化形式展现出抗血管生成活性，不一定需要对本发明的多肽进行糖基化。

本发明的多肽的抗血管生成的作用可以通过下列方法证实，例如，本领域公知的方法例如使用老鼠角膜实验来进行的血管生成阻碍活性测试(Ushiro等，FEBS Lett.，1997，卷418，页码341-345)，商业上可获得的血管生成试剂盒(血管生成试剂盒，Kurabo Industries Ltd.)，和小鸡绒毛膜尿囊的膜试验(Ausprunk等，Am.J.Pathol.，1975，卷97，页码597)，此外，下文中将描述在实施例中进行的对HUVECs的增殖抑制作用的证实。

本发明的多肽可以通过重组技术使用一个编码该多肽的核酸来生产。用于重组生产的核酸优选为DNA，其可通过检测基于本发明的多肽的氨基酸序列的碱基序列，和亚磷酰胺方法(phosphoamidite)等进行化学合成，或者使用市售DNA合成仪进行制备。此外，DNA可以通过PCR使用编码PEDF的DNA作为模板进行制备。这样，制备出的核酸，优选为DNA，被集成到合适的表达载体中，例如为E.coli的合适的宿主细胞与获得的载体一起被转换，由此可以通过重组技术制备本发明的多肽。

关于上述的使用基因重组技术制备多肽的方法，已经开发出并使用的有多个不同方法。关于上述方法，许多不同方法，用以制备核酸、选择启动子等、生产重组载体、检测宿主和载体的结合、宿主细胞的转换、以及宿主细胞转换的培养方法和培养条件已经被开发出和使用。而且，许多用于简单实现上述方法的试剂盒已经被投放到市场上。当本发明的多肽是通过重组技术制备的，可以使用任何重组技术，特定的操作可以根据粘附到试剂盒和试剂上的一系列实验操作手册和条款来进行。

而且，通过使用一个组织特异性或器官特异性的基因表达的集成有编码本发明的多肽的核酸的基因的表达载体，有可能仅在活体的本发明的多肽能起作用的特定位置进行本发明的多肽的表达和生产。如上所述的组织特异性或器官特异性基因表达技术对于本领域技术人员也是公知的，可以使用适合用来制备本发明的多肽的方法中的任意一个。

本发明的多肽可以通过例如芴甲氧羰基(Fmoc)方法、叔丁氧羟基(tBoc)方法以及其他有机化学合成方法，或者通过使用市售合适的肽合成器来生产。特别的，相对低分子量的肽，例如P5-1至P5-3优选通过有机化学合成制备，因为考虑到例如可以大规模合成。

多肽的有机化学合成方法已经被描述：Stewart等(固相肽合成(Solid Phase Peptide Synthesis)，第二版，1984，Pierce Chemical Company，罗克福德(Rockford)，I11)、Bodanszky和Bodanszky(The Practice of Peptide Synthesis，1984，Springer-Verlag，New York)、以及一系列的实验操作手册，本发明的多肽可以根据上述方法而被合成。

此外，合成的多肽是否如设计的一样可以通过氨基酸分析仪、高分辨率质谱方法例如MALDI-TOF-MS、氨基酸测序仪等来确认。此外优选的合成的多肽在使用前需要先纯化，例如高效液相色谱(HPLC)。

本发明提供一种抗血管生成药物组合物，包含前述的多肽和一药学上可接受的载体或赋形剂。本发明还提供一种用于牛皮癣的治疗药剂，包含前述的多肽作为活性组分；还提供一种用于治疗牛皮癣的药物组合物，包含前述多肽和一种药学上可接受的载体或赋形剂。

药物组合物包含前述的本发明的多肽和一种或多种药学上可接受的载体或者一种或多种药学上可接受的赋形剂，并且可以进一步包含一种药物组合物中通常使用的添加组分，和更进一步的一种不同于本发明的多肽的药物组分。上述药物组合物可以制备成口服剂型、外用制剂、皮肤吸收制剂、经粘膜制剂、滴眼液、注射液和各种其他适合用于目标给药路径的剂型。此外，本发明的药物组合物还可以制备成下列形式，例如固体药剂、液体药剂、悬浮液、乳化制剂、药膏、脂质剂型和缓释剂型。如上所述的药物组合物的制备可以通过本领域技术人员公知的药物制备技术制备。

优选的，把本发明的药物组合物制备成外用剂型。外用剂型可以被制备成例如药膏、液体、洗液、脂状、粘贴膏、喷射和乳化剂型。本发明的多肽具有120个氨基酸残基或少于120个氨基酸残基的大小，因此与一般蛋白相比，更容易通过皮肤障碍而被吸收，因此，其适合于作为外用制剂使用。

本发明的药物组合物的剂量可以根据医师的判断进行适当的规定，医师的判断基于需要服用药物组合物的疾病的情况、年龄和其他医学因素。然而，要被添加到药物组合物的本发明的多肽的量可以粗略的在组合物的重量百分比的0.1-99％(w/w)的范围内调节，然后根据需要控制药物组合物的剂量。

如下文的实施例中所描述的，本发明的多肽具有等同于PEDF的生理活性，因此可以用于PEDF已经被证明应用的各种疾病。特别的，本发明的多肽具有抗血管生成活性，因此对于包括不期望的血管生成的疾病的治疗是有效的。可以使用本发明的多肽治疗的包括不期望的血管生成的疾病包括但不限于恶性肿瘤(肿瘤)、恶性黑色素瘤、动脉硬化、慢性风湿性关节炎、糖尿病视网膜病变、血管生成相关的与年龄有关的黄斑变性、和寻常型牛皮癣。

特别的，本发明的多肽对于寻常型牛皮癣的治疗有效。牛皮癣是一种皮肤病，包含皮肤中毛细血管的血管生成，其临床症状是主要在皮肤上的覆盖有浅灰白活银白鳞屑的红色干斑。特别的，在暴露部分的皮肤出疹极大的降低了患者的生活质量，而且其还发展成发烧伴有关节症状和脓疱。

牛皮癣的药物治疗包括例如润肤剂、水杨酸、类固醇外用制剂、维生素D3外用制剂(卡泊三醇)、依曲替酯、或环孢霉素的局部给药。此外，光化学疗法包括补骨脂素的给药，偶尔使用长波紫外线照射。然而，上述治疗未必满足治疗效果的要求，许多带有副作用，例如皮肤刺激。特别的，根据副作用，类固醇外用制剂引起皮肤萎缩等，维生素D3外用制剂引起高钙血等，以及环孢霉素引起肾失调等。

本发明的多肽或者包含该多肽的药物组合物具有一个源自人类蛋白的多肽作为活性组分，并且表现出优秀的效果，而且其被认为是一种几乎没有副作用的优势的药物。基于前述，本发明的多肽或包含该多肽的药物组合物为寻常型牛皮癣提供了新型药物治疗方法。

下文中，本发明将进一步使用实施例具体描述。然而，下文描述的实施例仅为阐述目的提供，他们并不以任何方式限制本发明。而且，除非另外特别标记，实施例中的实验操作根据Maniatis T.等(Molecular Cloning，a Laboratory Manual，Cold Spring harbor Laboratory，New York，1982)以及其他实验操作手册或者市售试剂或试剂盒上附有的说明的描述进行。

实施例

实施例1

1)编码PEDF的cDNA的制备

根据Yamagishi等的描述(Biochem.Biophys.Res.Commun.，2002，卷296，页码877-882)，PCR通过使用一对如下所示的与人体胎盘素cDNA信息库(Clontech Laboratories，Inc.)相关的引物DNA进行。

引物1F：5′-CTCAGTGTGCAGGCTTAGAG-3′(SEQ ID NO：7)

引物1R：5′-CCTTCGTGTCCTGTGGAATC-3′(SEQ ID NO：8)

从琼脂糖胶收集大约1300bp的放大产物，并与pBluescriptIIKS的SmaI位点连接。由此获得的构造被限制性内切酶消化和测序所确认。上述载体被用XbaI和HindIII所切断并收集片段，它们接着在pBK-CMV(Stratagene Corporation)的NheI位点(平端)和XbaI位点之间被克隆，由此获得pBK-CMV-PEDF质粒，其为具有编码PEDF的cDNA的表达载体。

2)多肽F1至F3的制备

使用1)中制备的载体作为模板，使用下列三对引物进行PCR。

引物2F：5′-AAACATATGCAGGCCCTGGTGCTACTCCTCTGCAT-3′(SEQ IDNO：9)

引物2R：5′-CCCGTCGACTTATGACTTTTCCAGAGGTGCCACAAA-3′(SEQ ID NO：10)

引物3F：5′-AAACATATGTATGGGACCAGGCCCAGAGTCCTGA-3′(SEQ ID NO：11)

引物3R：5′-CCCGTCGACTTAGTCATGAATGAACTCGGAGGTGA-3′(SEQ ID NO：12)

引物4F：5′-GGGCATATGATAGACCGAGAACTGAAGACCGTGCA-3′(SEQ ID NO：13)

引物4R：5′-AAAGTCGACTTAGGGGCCCCTGGGGTCCAGAAT-3′(SEQ ID NO：14)

由引物2F和2R放大的DNA片段编码一包含PEDF的1-160位置的氨基酸序列的多肽(F1)，由引物3F和3R放大的DNA片段编码包含PEDF的161-300位置的氨基酸序列的多肽(F2)，而由引物4F和4R放大的DNA片段编码包含PEDF的301-418位置的氨基酸序列的多肽(F3)。

纯化通过前述PCR反应获得的每个放大产品，然后用NdeI和SalI进行切断。然后将获得的产物连接到类似的用NdeI和SalI开环的pGEX-6P-1(Amersham Biosciences Corp.)的多克隆位点，由此获得表达F1-F3中的每一个的载体pGEX-6P-F1至pGEX-6P-F3。此外，用每个载体(JM109)从E.coli转换，根据Walker等描述的方法制备多肽F1至F3(Biotechnology，1994，卷12，页码601 to 605)。

而且，包含通过用20氨基酸残基(仅P6具有16个氨基酸残基)对PEDF的301至418位置的氨基酸序列分段而获得的氨基酸的多肽P1至P6是使用肽合成仪(Sigma-Aldrich公司)通过Fmoc固相合成方法化学合成的。此外，分别包含PEDF的381-387、388-394、395-400每个位置的氨基酸序列的多肽P5-1至P5-3是使用一肽合成仪化学合成的。图1所示是每个多肽关于PEDF的排列示意图。

3)活性的测量

根据Takenaka等描述的方法测量每个多肽对关于人体骨肉瘤、MG63(Health Science Research Resources)的肿瘤细胞增殖的抑制作用(生命科学(Life Science)，2005，卷77，页码3231-3241)。

向杜贝可改性伊格尔培养基(DMEM)中补充10％的胎牛血清(FBS)和100单位/mL的青霉素和链霉素(下文简称为培养基)，MG63被悬浮。然后，在每个培养基中分别添加100nM市售PEDF蛋白(Sigma)和10nM在实施例1(“2)多肽F1-F3的制备”)中制备的每个多肽F1-F3，接着在37℃下培养24小时。随后，添加[³H]胸苷(Amersham Biosciences Corp.)并培养4小时，之后，测量通过MG63掺入的[³H]胸苷的量，并检验对肿瘤细胞增殖的抑制效果。获得的结果如图2所示。

如图2所示，与添加了PEDF的对照组相比，多肽F3证实具有强烈的肿瘤细胞增殖抑制效果(图2，p＜0.01)。

此外，通过进行类似上述的操作，通过测量与添加的每个100nM多肽P1-P6掺入5-溴-2’脱氧尿苷(Roehe)的量来检验对MG63肿瘤细胞增殖的抑制效果。获得的结果如图3所示。

如图3所示，多肽P5证实了对肿瘤细胞增殖的抑制效果(图3，p＜0.01)。

此外，通过进行类似上述的操作，通过测量与添加的每个100nM多肽P5-1至P5-3掺入5-溴-2’脱氧尿苷的量来检验对MG63肿瘤细胞增殖的抑制效果。获得的结果如图4所示。

如图4所示，多肽P5-1至P5-3中的任一个被证实具有类似于多肽P5的对肿瘤细胞增殖的抑制作用(图4，p＜0.01)。

4)对正常人体脐静脉内皮细胞(HUVECs)增生的抑制作用

在96孔板中的每个孔，对HUVECs以细胞10³/100μL的速度接种，100nM的包含氨基酸序列SEQ ID NO：6的市售PEDF蛋白(Sigma)、100ng/mLVEGF(R&D systems，Inc.)、以及100nM多肽P5-1至P5-3中的每个被分别加入到孔中，接着在37℃和5％CO₂的条件下培养两到四天。随后，测量HUVECs掺入的5-溴-2’脱氧尿苷的量。获得的结果如图5所示。

如图5所示，与添加PEDF蛋白的对照组相比，多肽P5-1至P5-3中的任一个多肽显著抑制HUVECs的增殖。(图5，p＜0.01)

5)对皮肤的外用治疗效果

剃去7-8周大的SCID小鼠(Clea Japan，Inc.)背部大约1cm²面积的毛，移除全层皮肤，同时保持血管丛完整的保留在覆盖在背部肌肉上的绷带上。在符合伦理规章的条件下对牛皮癣患者的被感染区域的皮肤取样，并用包含1％盘尼西林、1％链霉素和1％两性霉素B的PBS清洗，这样处理过的每片皮肤分别移植到上述小鼠的皮肤移除区域。

移植后七天，70μL的将多肽P5-1、P5-2和P5-3溶解到磷酸盐缓冲盐水(PBS)中制备的每个溶液(各1mM)每天施加到三个小鼠的移植位置共14天。结果，在应用位置无副作用等。而且，对照样中，使用同样量的包含具有随机序列的多肽的PBS溶液和不含有多肽的PBS。14天后，收集部分移植皮肤并放入最佳切割温度试剂中(Sakura finetechnical Co.，Ltd.)，然后在液氮中冷冻，接着制备成5μm厚的截面。上述应用测试重复进行三次，获得的结果如图6所示。

如图6所示，基于对用苏木紫-曙红(HE)染色的截面的观察，施加了多肽P5-1、P5-2和P5-3中的任一个的移植皮肤的厚度显著降低了(图6，p＜0.05)。

同样，根据Abe等的方法(Am.J.Pathol.，2004，卷164，期4，页码1225-1232)，移植表面皮肤中的毛细内皮细胞通过免疫测定法使用鼠抗小鼠CD31抗体以CD31作为指标进行计数，CD31是毛细管内皮细胞的标记蛋白。获得的结果如图7所示。

如图7所示，毛细管内皮细胞的数目显著减少(图7)。

此外，与上述的方式类似，剃去7-8周大的SCID小鼠(Clea Japan，Inc.)背部大约1cm²面积的毛，移除全层皮肤，同时保持血管丛完整的保留在覆盖在背部肌肉上的绷带上。在符合伦理规章的条件下对牛皮癣患者的被感染区域的皮肤和正常个体的皮肤取样，并用包含1％盘尼西林和1％两性霉素B的PBS清洗，这样处理过的每片皮肤分别移植到上述小鼠的皮肤移除区域。

移植七天后，通过皮下注射对抑制位置施加市售PEDF蛋白(30μg)。注射每周三次，共进行3周。作为对照，对一小鼠仅皮下注射PBS。最后一次皮下注射后的那天，采集部分移植皮肤，并以上述类似的方式用HE染色，测量移植皮肤的厚度。从牛皮癣患者的感染区域皮肤获得的结果如图8(照片)和图9所示，从正常个体的皮肤获得的结果如图10(照片)和图11所示。

如图8、9、10和11所示，正常个体的皮肤以及牛皮癣患者的感染区域皮肤的厚度都显著减低(图9和11，都p＜0.05)。

此外，通过进行与上述类似的操作，使用CD31作为指数对毛细管内皮细胞进行计数。从牛皮癣患者的感染区域皮肤获得的结果如图12所示，从正常个体的皮肤获得的结果如图13所示。

如图12和13所示，在用PEDF蛋白给药组中，正常个体的皮肤和牛皮癣患者的感染区域皮肤中毛细管内皮细胞的数目都显著降低(图12和13，都P＜0.05)。

此外，根据Gilhar等的方法测量表达阳性细胞的Ki-67的频率，其中Ki-67是基底层的增殖标记物。(Am.J.Pathol.，2006，卷168，期1，页码170 to175)。从牛皮癣患者的感染区域皮肤获得的结果如图14所示，从正常个体的皮肤获得的结果如图15所示。

如图14和15所示，在用PEDF蛋白给药组中，正常个体的皮肤和牛皮癣患者的感染区域皮肤中毛细管内皮细胞的频率都显著降低，表明基底细胞的增殖被抑制(图14和15，都P＜0.05)。

Claims (12)

1.一具有抗血管生成作用的多肽，包括SEQ ID NO：1-3中的任意一个或多个所示的氨基酸序列，并具有120或少于120的氨基酸残基。

2.根据权利要求1所述的多肽，包含SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的多肽，具有20或小于20的氨基酸残基。

4.根据权利要求3所述的多肽，包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列。

5.根据权利要求1所述的多肽，包含SEQ ID NO：1-3中任一所示的氨基酸序列。

6.一种用于牛皮癣的治疗药剂，包含一多肽作为活性成分，该多肽包含SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列，并具有抗血管生成作用。

7.一种抗血管生成药剂，包含根据权利要求(1)-(5)中任一所述的多肽作为活性成分。

8.一种用于牛皮癣的治疗药剂，包含根据权利要求(1)-(5)中任一所述的多肽作为活性成分。

9.一种肿瘤细胞增生抑制药剂，包含根据权利要求(1)-(5)中任一所述的多肽作为活性成分。

10.一种抗血管生成药物组合物，包含根据权利要求(1)-(5)中任一所述的多肽和一种药学上可接受的载体或赋形剂。

11.一种用于治疗牛皮癣的药物组合物，包含根据权利要求(1)-(5)中任一所述的多肽和一种药学上可接受的载体或赋形剂。

12.根据权利要求10或11所述的药物组合物，作为外用药剂而被提供。

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