CN102000348A - 一种药物粘膜局部使用的安全性评价方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于传染病预防和粘膜用药安全性评价领域，涉及一种药物粘膜局部使用的安全性评价方法，尤其是一种基于细胞因子的粘膜使用的药物安全性评价方法。该评价方法通过测定给药部位粘膜的灌洗液中细胞因子的表达水平，以判断所用药物粘膜使用的安全性。本发明基于免疫活化和细胞因子调控网络的复杂性，使用了一系列细胞因子作为测定分析指标，能够准确地衡量粘膜用药物的粘膜毒性，可以快速灵敏地反映药物诱导粘膜产生炎症的情况，并能够反映粘膜局部的免疫异常活化。本发明的评价方法可以用于粘膜用候选药物的临床前安全性评价。
Description
技术领域
本发明属传染病预防和粘膜用药安全性评价领域，涉及一种药物粘膜局部使用的安全性评价方法，尤其是一种基于Th17样细胞因子的粘膜炎症反应的粘膜用药的安全性评价技术。
背景技术
性传播疾病一直以来都严重威胁着人类的健康，人们为此做出了不懈的努力，研制了包括杀微生物剂在内的各种预防治疗保健药物来对抗这些经生殖道粘膜感染的病毒或其他病原体。对于这些药物，除了考虑有效性外，其安全性也是必须关注的问题。
任何包括杀微生物剂在内的生殖道用药候选药物在正式进入临床试验前，必须在动物身上进行安全性试验的测试。虽然存在动物资源受限，费用昂贵，工作量大等缺点，但是动物模型可以对完整的药物剂型进行评价，可以从器官整体水平来观察对外界刺激的反应，可以动态系统地观察所诱导的炎症和免疫反应。因此动物模型评价往往被研究者们视做进入临床前必做的步骤。
目前评价包括杀微生物剂在内生殖道或直肠用药的动物模型主要有三类：兔子阴道激惹模型(Rabbit vaginal irritation，RVI)、小鼠模型和非人灵长类模型。检测指标主要集中在组织病理学观察以及菌群检测方面。非人灵长类虽然也做为安全性评价的模型之一，但由于资源稀少、价格昂贵，再加上由于能够被SIV或SHIV感染，因此非人灵长类模型更多地被用于杀微生物剂候选药物的效果评价而较少被用于安全性评价。
兔子模型是用于评价阴道用药物安全性的经典模型。兔子的阴道上皮由简单的柱状上皮细胞组成，因此对外界刺激具有较高的敏感性，更利于对药物进行安全性评价。标准的RVI模型是用候选药物对宫颈阴道粘膜进行刺激(每天一次，连续10天)之后，进行解剖学和组织病理学两方面的定性评估，用轻微(minimal)、温和(mild)、中等(moderate)、严重(severe)四个等级来表示刺激的严重程度，从而评估该药物是否可以用于人体。但是近些年来，人们却发现传统的RVI模型不能灵敏反映出药物安全性的准确情况。例如，第一代微生物杀菌剂N-9在用RVI模型中以4％的浓度给药时，测评结果显示安全，但是在人体临床试验中却证明它引起了明显的粘膜损伤，增加了HIV等病原体的感染机率。这是因为传统RVI模型不能灵敏地反映出粘膜给药后可能给粘膜组织造成的病理损伤程度，而这些不同程度的粘膜损伤对于增强HIV等病原微生物的粘膜感染至关重要。因此需要在传统的RVI模型的基础上进行改进，不仅要对药物投递的局部粘膜进行组织病理学的观察，同时还要发现可预测粘膜组织病理损伤的生物学标志物，提高粘膜用药安全性评价的灵敏度。
由于兔子较少地被用于免疫病理学研究，因此缺乏相关的抗体和免疫检测试剂，因此兔子模型在评价粘膜用药特的安全性方面存在很大的局限性。相比之下小鼠模型具有其本身的一些独特优势：价格便宜、来源和数量不受限制、可用于统计分析的样本量大、相关抗体和免疫学试剂丰富、实验数据检测方便等优势，因此做为RVI模型的补充也得到了一定的应用。有人曾尝试采用一些基于检测炎症因子的小鼠模型来评价抗HIV杀微生物剂的安全性，但是这些模型所检测的炎症细胞因子较为单一，未能考虑到免疫活化和细胞因子调控网络的复杂性，到目前为止还没有建立任何一种动物模型能够准确地衡量粘膜用药的安全性。
发明内容
本发明所要解决的技术问题包括(1)粘膜组织病理损伤定量分析技术；(2)通过筛选预测粘膜病理损伤的生物学标志物或其组合，建立非侵入性粘膜用药安全性评价技术。
本发明的目的是建立一种药物粘膜局部使用的安全性评价技术。采用实验动物作为模型，通过粘膜给药，观察组织病理损伤，并加以量化；同时测定粘膜局部炎症因子的表达水平，分析其与病理损伤的相关性，从而筛选出可灵敏反应粘膜损伤的生物学标志物，最终建立非侵入性粘膜用药的安全性评价技术。本发明能够快速灵敏地反映粘膜用药物诱导粘膜产生炎症的情况，并能够反映粘膜局部的免疫异常活化，特别是可对潜在的组织病理损伤进行预测。
所述的实验动物为小鼠：粘膜给药时要将小鼠分为对照组、安慰组和用药组等，每组小鼠的品系和周龄应当一致。所述的粘膜局部使用药物包括但不限于化学合成药物、生物药物、微生物杀菌剂与粘膜疫苗等。
所述的粘膜组织病理损伤定量分析技术包括根据是否出现水肿、淋巴细胞浸润、上皮破损和充血情况(具体如表1所示)，粘膜用药所造成的各项病理损伤的评分值累计后，形成评分的总值，用以定量标定粘膜用药的组织病理损伤(表2)。
表1.粘膜组织病理损伤评分标准
*IC：炎症细胞(inflammatory cell)；
NC：正常细胞(normal cell)；
AEU：上皮破损面积(area ofepithelial ulceration)；§PRVJ：血管充血阳性率(positive rate of vascular injection).
表2粘膜组织病理损伤定量分析技术
| 总分 | ＜4 | 4≤总分＜6 | 6≤总分＜8 | 8≤总分＜10 | 10≤总分≤16 |
| 损伤判定 | 阴性 | 轻微 | 温和 | 中等 | 严重 |
所述的预测粘膜病理损伤的生物学标志物主要为炎症性细胞因子包括但不限于IL-10、IL-17A、TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-4、IL-2中的一种或者一种以上的组合。其测定方法包括细胞因子编码RNA(mRNA)与蛋白水平的测定方法。所述的粘膜局部包括但不限于粘膜局部的分泌物、粘膜局部灌洗液、粘膜局部组织等。
所述的生物学标志物的筛选方法，主要对粘膜用药局部的包括但不限于上述Th17样炎症因子的表达水平与粘膜组织病理损伤的评分之间的相关性进行线性回归分析。发现IL-17A和IL-6，以及IL-4和IL-10这两对因子的变化反映了炎症反应和抑炎反应之间的动态平衡，是预测潜在病理损伤的核心因子。IFN-γ、TNF-α和IL-2做为补充的因子指标来观察炎症和免疫激活状态。
以对小鼠阴道粘膜用药为例，所述的评价体系包括下述步骤：
(1)对小鼠生殖道粘膜每天两次给药，间隔12小时，连续一周；每天在第一次给药前收集生殖道粘膜灌洗液；一周后取给药部位组织，分为两份；
(2)取一份小鼠给药部位组织，做组织病理学切片HE染色检测分析；
(3)取另一份小鼠给药部位组织，抽提组织mRNA进行逆转录，并扩增细胞因子的DNA编码序列；
(4)取灌洗液，测量其中细胞因子表达量。
本发明的评价体系可以用于评价侯选药物，尤其是评价侯选药物的安全性。
本发明的评价方法具体包括建立小鼠模型、测定微量样本多指标流式蛋白定量技术检测灌洗液中细胞因子的表达情况、RT real-time PCR检测阴道粘膜组织中细胞因子的转录水平、组织病理学观察和数据分析。详述如下：
1、小鼠模型
②六到八周龄无菌环境饲养(SPF级)的BALB/c雌性小鼠按实验需要随机分组(每组至少五只小鼠，并设置正常小鼠阴性对照组和安慰剂(1.5％2-hydroxyethylcellulose(HEC)(Sigma-Aldrich，Saint-Louis，MO，USA))对照组，待评价药物实验组按不同浓度分组)并在正式实验前先静养一周；
③给每只小鼠通过皮下注射2mg的醋酸甲羟孕酮(medroxyprogesterone acetate(Sigma-Aldrich，Saint-Louis，MO，USA))，5天之后阴道给药；
④每只小鼠每次阴道给药40μl，每天两次给药，间隔12小时，连续5天；
⑤每天在第一次给药前收集阴道灌洗液200μl，加入10×蛋白酶抑制剂(proteaseinhibitor(Complete Protease Inhibitor Cocktail；Roche Applied Science，Indiana，USA))，200g 4℃离心10min，收集上清液-80℃保存，以便后续细胞因子定量检测；
⑥最后一次给药12小时后收集灌洗液，断颈处死小鼠，取小鼠的阴道组织做组织病理学切片HE染色检测或抽提组织mRNA，逆转录实时定量PCR检测细胞因子转录水平；
⑦检测的细胞因子种类包括：IL-10、IL-17A、TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-4、IL-2。
2、微量样本多指标流式蛋白定量技术检测灌洗液中细胞因子的表达情况
使用mouse cytokine cytometric bead array kit(BD Biosciences，Caiifornia，USA.)并在FACAria流式细胞仪上进行检测，每种细胞因子标准曲线浓度范围为0-5000pg/ml，检测的灵敏度为0.03-16.8pg/ml。
3、RT real-time PCR检测阴道组织中细胞因子的转录水平
①用液氮速冻小鼠阴道组织，用研钵碾成粉状，迅速用RNeasy Mini kit(Qiagen，Hilden，Germany)处理抽提组织总RNA；
②取1μg的总RNA，用M-MLV逆转录酶(TaKaRa biotechnology Co.，Ltd.，Dalian，China)进行逆转录反应得到cDNA；
③取25ng的cDNA为模板和0.4μmol/L的对应引物(见表2.)，在20μl 1×SYBR PremixEx Taq II(TaKaRa biotechnology Co.，Ltd.，Dalian，China)最终反应体系中进行real-timePCR反应；反应条件为1cycle，95℃ for 10s；40cycles，95℃ for 10s，58℃ for 5s，and 72℃ for 10s.使用2Ct(beta actin)-Ct(certain cytokine gene)进行相对定量计算(“Ct”循环阈值(cycle threshold))，使用beta-actin(Actb)cDNA作为内参。
表3用于real-time PCR反应的细胞因子引物序列(5’→3’)
4、组织病理学观察
①小鼠阴道组织用福尔马林液固定，石蜡包埋、切片；
②苏木紫-伊红染色法(Hematoxylin-Eosin染色，HE染色)对切片进行染色，观察病理损伤情况；
③用一种半定量的病理损伤打分系统以正常组织切片为参照对实验组病理切片从四个方面进行打分评价：上皮破损，淋巴细胞浸润，水肿，以及充血程度。每个方面从0到4分为4个等级(0＝正常，1＝轻微，2＝温和，3＝中等，4＝严重)，再把这四方面的分值加在一起得到总分用于评价整个组织病理损伤情况(详细打分依据见表1)，并据此与细胞因子的表达情况进行相关性分析。
5、数据分析
IL-17A和IL-6，以及IL-4和IL-10这两对因子的变化反映了炎症反应和抑炎反应之间的动态平衡，是预测潜在病理损伤的核心因子。IFN-γ、TNF-α和IL-2做为补充的因子指标来观察炎症和免疫激活状态。
本发明的粘膜用药安全性评价方法综合测量比较了给药部位粘膜组织的细胞因子的表达水平和粘膜病理损伤，能够快速灵敏地反映粘膜用药物诱导所产生的粘膜炎症情况，并能够反映粘膜局部的免疫异常活化，对潜在的组织病理损伤进行预测。本发明的评价技术可以用于评价粘膜侯选药物，尤其是评价侯选药物的安全性。
本发明的评价体系基于免疫活化和细胞因子调控网络的复杂性，使用了一系列细胞因子作为测定分析指标，对分子指标定量统计，对病理组织分级统计，能够准确地衡量粘膜用药物特别是杀微生物剂的粘膜安全性。
附图说明
图1是评价体系操作过程示意图。
图2是N-9诱导阴道粘膜产生炎症细胞因子(CBA)的剂量依赖特点结果图。
图3是N-9诱导阴道粘膜产生炎症细胞因子(CBA)的时间依赖特点结果图。
图4是RT real-time PCR平行检测了阴道组织中各炎症因子mRNA的表达情况。可见，检测结果和CBA的结果吻合。
图5是N-9作用下阴道粘膜组织病理学改变。
图6是N-9诱导细胞因子表达和病理损伤的相关性分析。
具体实施方式
壬苯醇醚-9(nonoxynol-9，N-9)是一种避孕用杀精剂，也曾作为抗HIV感染的第一代杀微生物剂进入临床实验；本实施例中用该小鼠模型粘膜炎症反应评价体系对N-9的阴道粘膜毒性进行评价，以验证该评价方法的可行性和科学性。
1.评价步骤
①购买6-8周龄的SPF级BalB/c小鼠，于SPF级饲养房中静养1周；
②给小鼠分组：空白对照组、安慰剂组(1.5％的HEC)、1％N-9组、3％N-9组、4％N-9组，其中各N-9组均用1.5％的HEC做为凝胶剂型；
③按2mg/只的剂量给所有的小鼠通过皮下注射醋酸甲羟孕酮；
④五天后按组分别阴道给药，每天早晚两次间隔8小时给药、连续5天，每天早上在给药前收集灌洗液并于200g 4℃离心后取上清冻于-80℃待测，CBA方法检测；
⑤第六天断颈处死小鼠，解剖取阴道组织做组织病理学切片HE染色分级打分或抽提组织mRNA，逆转录实时定量PCR检测细胞因子转录水平(具体方法见技术主案)；
⑥分析结果。
2.结果
①N-9诱导阴道粘膜产生炎症细胞因子的剂量依赖特点分析
从实验结果可知：与空白对照组和安慰剂组相比，N-9会不同程度地上调阴道粘膜各种炎症因子的表达。相对低浓度的N-9(1％和3％)比相对高浓度的N-9(4％)诱导的炎症因子表达量要高；但是组内个体差异较大，不如4％N-9的数据均一。(图2)这是因为4％N-9毒性太大，使上皮细胞和部分免疫细胞死亡，从而导致相关细胞因子分泌的减少。
②N-9诱导阴道粘膜产生炎症细胞因子的时间依赖特点分析
4％的N-9连续5天小鼠阴道给药，用微量样本多指标流式蛋白定量技术(CBA)检测各天阴道灌洗液中炎症因子的表达情况。N-9给药的第一天，各种炎症因子都有不同程度的上调，随着时间的推移，炎症因子的表达呈峰型分布，不同炎症因子到达顶峰的时间有所不同：IL-4、IL-6、IL-10(图3中B3、D3、F3)对N-9的刺激更为敏感，在给药第一天其表达量就增加了3-6倍，其中IL-6和IL-10表达量在后续的两天持续增加，第三天到达顶峰，之后逐渐下降，而IL-4在第一天就到达顶峰，之后下降；相比而言，其他炎症因子的表达量上升的较为缓慢，但依然在第三天到达顶峰(表达量为本底水平的2-3倍)之后逐渐下降。
为了确证CBA的结果，用RT real-time PCR平行检测了阴道组织中各炎症因子mRNA的表达情况，检测结果和CBA的结果吻合(图4)。
③N-9作用下阴道粘膜组织病理学改变
由于所检测的大多数炎症因子指标在第三天达到顶峰，因此本发明也在第三天最后一次给药24小时后观察小鼠阴道粘膜的病理损伤情况(见图5)，用半定量打分系统对上皮破损、淋巴细胞浸润、水肿和充血情况进行评价，总分小于4认为是阴性。空白对照组没有观察到病理损伤情况(分值：1-3)；N-9组观察到明确的病理损伤，特别是4％的N-9组观察到严重的上皮脱落破损、充血、水肿情况，相应的分值：10-13(其中一只小鼠病理损伤中等，分值为8)(表3.)。
表3.对4％N-9诱导的小鼠阴道粘膜病理损伤进行分级打分
④N-9诱导细胞因子表达和病理损伤的相关性分析
上述观察结果预示着在病理改变和炎症因子产生之间存在着相关性，使本发明有可能通过炎症因子来预测潜在的亚临床状态的病理损伤。因此把每只小鼠每种细胞因子的表达情况和小鼠对应的病理损伤分值的相关性进行线性回归分析(linear regression analysis)，发现炎症因子IL-17A、IL-6以及抗炎因子IL-4和IL-10与N-9导致的病理损伤高度相关。尽管N-9能诱导TNF-α，IFN-γ和IL-2高表达，但这几个因子与N-9导致的病理损伤的相关性并不是十分的显著，但是这几种因子都与免疫活化密切相关，因此反映了N-9活化粘膜局部免疫反应的能力(图6)。
⑤N-9诱导的各细胞因子之间表达情况的相关性分析
数据显示，除了IFN-γ，其他所有的细胞因子表达之间都有显著的相关性(P＜0.05)。其中IL-17A与同一Th17家族成员TNF-α(r＝0.739；P＜0.05)，以及与抗炎因子IL-10(r＝0.804；P＜0.05)和IL-4(r＝0.668；P＜0.05)之间具有显著的相关性。揭示了炎症和抗炎因子之间存在的平衡。同样炎症因子IL-6与抗炎因子IL-10(r＝0.804；P＜0.05)和IL-4(r＝0.733；P＜0.05)之间也表现了显著的相关性。而抗炎因子IL-10和IL-4之间也表现了很强的相关性(r＝0.894；P＜0.05)。此外IL-2做为激活免疫反应的调节因子与炎症因子IL-6(r＝0.687；P＜0.05)以及抗炎因子IL-4(r＝0.801；P＜0.05)之间具有显著的相关性，预示N-9导致的炎症反应会诱导机体进入一种免疫激活状态。
表4.4％N-9诱导下各细胞因子之间表达的相关性分析
每只小鼠(n＝10，5只给盐水，5只给4％N-9)的炎症细胞因子数量由CBA方法测得，并由Pearson linear regression分析，所得数据结果见上表(*：P≤0.05)。
3.结论
从使用该小鼠模型粘膜炎症反应评价体系对N-9的阴道粘膜毒性进行评价的情况看，
①N-9诱导了各种炎症因子和抗炎因子不同程度的上调，特别是IL-17A和IL-6，以及IL-4和IL-10这两对预测潜在病理损伤的核心因子指标的上调，说明了N-9具有能强烈诱导炎症反应的能力；
②N-9诱导IFN-γ、TNF-α和IL-2的上调说明了N-9能够活化粘膜局部的免疫反应；
③从病理损伤和炎症因子的相关性分析情况看，上述因子的上调确实与N-9诱导的病理损伤情况相关联。
因此，N-9具有较强的诱导粘膜炎症反应和活化粘膜局部免疫系统的特性，并不是一种安全的阴道用药物，这一结论与N-9临床实验结果一致。
序列表
<110>复旦大学
<120>一种药物粘膜局部使用的安全性评价方法
<130>1030
<160>16
<170>Patentln version 3.1
<210>1
<211>21
<212>DNA
<213>Artificial
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Claims (6)
1.一种药物粘膜局部使用的安全性评价方法，其特征在于，该评价方法通过测定粘膜给药部位细胞因子表达水平，判断药物粘膜使用时的安全性。
2.如权利要求1所述的安全性评价方法，其特征在于，所述的细胞因子包括IL-10、IL-17A、TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-4、IL-2中的一种或者一种以上的组合。
3.如权利要求1所述的安全性评价方法，其特征在于，所述的药物包括化学合成药物、生物药物、微生物杀菌剂或者粘膜疫苗。
4.如权利要求1所述的安全性评价方法，其特征在于，所述的粘膜局部是粘膜局部的分泌物、粘膜局部灌洗液或者粘膜局部组织。
5.如权利要求1所述的安全性评价方法，其特征在于，所述的细胞因子测定方法包括细胞因子编码RNA或者蛋白水平的测定方法。
6.如权利要求1所述的安全性评价方法，其特征在于，所述的安全性包括药物对直接施用部位粘膜以及非直接施用部位的毒性、对粘膜免疫系统的激活与致病作用、以及粘膜被致病原感染的敏感性增加作用。
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| CN (1) | CN102000348A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105849768A (zh) * | 2013-11-28 | 2016-08-10 | 富士胶片株式会社 | 诊疗信息处理装置、方法及程序 |
-
2010
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Non-Patent Citations (1)
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| 刘月辉等: "《不同剂量辐射对豚鼠鼻黏膜结构的损伤及血清IL-1、IL-6、THF-α含量变化》", 《中国辐射卫生》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105849768A (zh) * | 2013-11-28 | 2016-08-10 | 富士胶片株式会社 | 诊疗信息处理装置、方法及程序 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20110406 |