CN102625711A - 调节去泛素化酶和泛素化多肽的方法和材料 - Google Patents

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Abstract

本文涉及参与调控去泛素化酶(如USP10多肽)和/或泛素化多肽(如，肿瘤抑制多肽或肿瘤抑制多肽的突变型)的方法和材料。例如，提供增加去泛素化酶(如USP10多肽)表达或活性的方法和材料，降低去泛素化酶(如USP10多肽)表达或活性的方法和材料，稳定肿瘤抑制多肽(如野生型p53多肽)的方法和材料，去稳定肿瘤抑制多肽的突变型(如突变型p53多肽)的方法和材料以及减少癌细胞增殖、增加癌细胞凋亡和/或治疗癌症(如野生型p53多肽水平下降的癌症或突变型p53多肽水平上升的癌症)的方法和材料。本文还提供鉴定介导p53多肽稳定的USP10多肽的激动剂和拮抗剂的方法和材料。

Description

调节去泛素化酶和泛素化多肽的方法和材料
相关应用的交叉参考
本申请要求2009年11月12日提交的美国临时申请系列号61/260,637以及2009年9月10日提交的美国临时申请系列号61/241,152的权益。在先申请的公开被认为是本申请公开的部分(且通过引用纳入本文)。
背景技术
1.技术领域
本文涉及参与调节去泛素化酶和泛素化多肽(例如肿瘤抑制物如野生型p53多肽)的方法和材料。例如，本文涉及增加或降低去泛素化酶表达或活性的方法和材料，稳定或去稳定泛素化多肽的方法和材料，以及治疗癌症的方法和材料。
2.背景信息
p53是在超过50％的人癌症中突变的肿瘤抑制物，其主要作用是细胞应激后调控细胞命运和抑制受伤细胞的增殖(Lane，1992；Riley等，2008；Vogelstein等，2000)。p53作为转录因子行使功能，并通过其靶标基因调节各种细胞功能，从细胞衰老到能量代谢、DNA修复、细胞分化、细胞周期进展和凋亡。除了激活转录，p53还用作转录的抑制物，其在抑制涉及肿瘤发生的蛋白CD44中也作用(Godar等，2008)。最后，p53还具有不依赖转录的功能，如通过蛋白之间的相互作用调控凋亡(Moll等，2005)。
发明内容
本文涉及参与调控去泛素化酶(如USP10多肽)和/或泛素化多肽(如，肿瘤抑制多肽或肿瘤抑制多肽的突变型)的方法和材料。例如，本文提供增加去泛素化酶(如USP10多肽)表达或活性的方法和材料，降低去泛素化酶(如USP10多肽)表达或活性的方法和材料，稳定肿瘤抑制多肽(如野生型p53多肽)的方法和材料，去稳定肿瘤抑制多肽突变型(如突变型p53多肽)的方法和材料以及减少癌细胞增殖、增加癌细胞凋亡和/或治疗癌症(如野生型p53多肽水平下降的癌症或突变型p53多肽水平上升的癌症)的方法和材料。本文还提供鉴定介导p53多肽稳定化的USP10的激动剂或拮抗剂的方法和材料。
一些癌细胞能表达低水平的p53多肽，而其他癌细胞能表达平均或高水平的p53多肽突变型。如本文所述，USP10多肽能与野生型或突变p53多肽相互作用并使之去泛素化，因此增加其稳定性。具有低水平野生型p53多肽的癌细胞的情况中，本文提供的方法和材料可用于增加USP10多肽表达或活性，从而增加所述野生型p53多肽的稳定性。这可使癌细胞中的野生型p53多肽水平升高，从而使癌细胞增殖减少并增加癌细胞凋亡。表达突变型p53多肽的癌细胞的情况中，本文提供的方法和材料可用于降低USP10多肽的表达或活性，从而降低所述突变型p53多肽的稳定性。这可使癌细胞的突变型p53多肽水平下降，从而使癌细胞增殖减少并增加癌细胞凋亡。
一般，本文一方面涉及降低有癌细胞的哺乳动物中癌细胞增殖的方法。所述方法包括或主要包括，将组合物在其调控癌细胞内的USP10多肽表达或活性的条件下给予所述哺乳动物，从而减少癌细胞增殖。所述癌细胞可具有降低水平的野生型p53多肽表达，且所述组合物可增加USP10多肽的表达或活性。所述组合物可包括编码USP10多肽的核酸。所述组合物可包括编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽的核酸。所述癌细胞可表达突变型p53多肽，且所述组合物可降低USP10多肽的表达或活性。所述组合物可包括介导p53多肽稳定的USP10多肽的拮抗剂。所述拮抗剂可包含具有诱发针对所述USP10多肽表达的RNA干扰能力的核酸。所述USP10多肽可为人USP10多肽。
在另一方面，本文涉及在哺乳动物中治疗癌症的方法。所述方法包括或主要包括(a)鉴定哺乳动物具有表达降低水平的野生型p53多肽或表达突变型p53多肽的癌细胞，(b)若所述哺乳动物鉴定为具有表达降低水平的野生型p53多肽的癌细胞，则给予增加所述癌细胞内USP10多肽表达或活性的USP10多肽或组合物，和(c)若所述哺乳动物鉴定为具有表达突变型p53多肽的癌细胞，则给予降低所述癌细胞内USP10多肽表达或活性的组合物。
在其他方面，本文涉及鉴定介导p53多肽稳定的USP10多肽的拮抗剂的方法。所述方法包括或主要包括，确定存在检测剂时与USP10多肽接触的泛素化p53多肽的稳定水平是否低于无检测剂时与USP10多肽接触的泛素化p53多肽的稳定水平，其中存在检测剂时与USP10多肽接触的泛素化p53多肽的稳定水平低于无检测剂时与USP10多肽接触的泛素化p53多肽的稳定水平表明所述检测剂是拮抗剂。
在其他方面，本文涉及鉴定介导p53多肽稳定的USP10多肽的激动剂的方法。所述方法包括或主要包括，确定存在检测剂时与USP10多肽接触的泛素化p53多肽的稳定水平是否高于无检测剂时与USP10多肽接触的泛素化p53多肽的稳定水平，其中存在检测剂时与USP10多肽接触的泛素化p53多肽的稳定水平高于无检测剂时与USP10多肽接触的泛素化p53多肽的稳定水平表明所述检测剂是激动剂。
在另一方面，本文涉及评估癌细胞的p53基因型的方法。所述方法包括或主要包括，确定所述癌细胞中的USP10多肽的表达水平，若所述癌细胞含有降低的USP10多肽表达水平则诊断所述癌细胞具有野生型p53，若所述癌细胞含有增加的USP10多肽表达水平则诊断所述癌细胞具有突变型p53。
除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语的意义与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同。虽然在本发明的实施或测试中可以采用类似于或等同于本文所述的那些方法和材料，但是下面描述了合适的方法和材料。本文中述及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都通过引用全文纳入本文。在抵触的情况下，以本说明书(包括定义在内)为准。此外，材料、方法和实施例都仅是说明性，并不构成限制。
从下面的详述和所附权利要求很容易了解本发明的其他特征和优点。
附图简要说明
图1.USP10与p53相互作用。(A和D)用对照IgG或抗USP10抗体对U2OS细胞裂解物进行免疫沉淀。然后用抗p53、抗Mdm2或抗USP10抗体印迹所述免疫沉淀物。(B和C)用对照IgG或抗USP10抗体(B)或抗p53抗体(C)对HCT116p53+/+和p53-/-细胞裂解物进行免疫沉淀。然后用抗p53或抗USP10抗体印迹所述免疫沉淀物。(HC：重链).(E).纯化的带FLAG标记的USP10与偶联GSH琼脂糖凝胶的GST或GST-p53一起孵育。然后用所示抗体印迹保留在琼脂糖凝胶上的蛋白。(F)将编码带FLAG标记的全长(FL)或缺失突变的USP10的构建体转染入H1299细胞。转染后48小时裂解细胞，并将细胞裂解物与偶联GSH琼脂糖凝胶的GST或GST-p53一起孵育。用所示抗体分析保留在琼脂糖凝胶上的蛋白。
图2.USP10使p53稳定化和去泛素化。(A)用编码带FLAG标记的USP10的载体或构建体转染HCT116细胞。48小时后裂解细胞，并用所示抗体印迹细胞裂解物。(B)用编码所示shRNA的慢病毒感染HCT116细胞。72小时后裂解细胞，并用所示抗体印迹细胞裂解物。(C)HCT116细胞稳定表达对照shRNA、USP10shRNA或USP10shRNA以及shRNA抗性USP10。用环己酰亚胺(0.1mg/mL)处理细胞并在所示时间收获。上图显示p53和USP10的免疫印迹。β-激动蛋白作为对照。下图：相对β-激动蛋白的p53蛋白水平的定量。(D)用所示质粒转染HCT116细胞。48小时后裂解细胞，并用所示抗体印迹细胞裂解物。(E-G)USP10对体内p53泛素化水平的调控。转染有所示构建体(E)或稳定表达对照或USP10shRNA(F)的H1299细胞用FLAG-p53转染。48小时后，用MG132处理细胞4小时然后收获。用抗FLAG抗体将p53免疫沉淀并用抗p53抗体免疫印迹。(G)用USP10体外去泛素化p53。去泛素化p53与纯化的USP10或USP10CA体外孵育然后用抗p53抗体印迹。
图3.USP10对p53亚细胞定位的调控。(A)USP10和泛素特异性蛋白酶HAUSP的亚细胞定位。用编码FLAG-USP10或FLAG-HAUSP的构建体转染U2OS细胞。48小时后，固定细胞并用所示抗体和DAPI染色。(B)用所示构建体共转染H1299细胞。48小时后，如本文所述用MG132处理细胞、收获并分离。然后细胞组分用所示抗体印迹。(C，胞质；N，核)。胞质标记蛋白(GAPDH)和核标记蛋白(组蛋白3)用作对照以确认分离质量。(C)用所示构建体转染H1299细胞。48小时后，用MG132处理细胞、固定并用所示抗体和DAPI染色。(D)用编码对照shRNA或USP10shRNA的慢病毒感染U2OS细胞。72小时后，用MG132处理细胞、固定并用所示抗体或DAPI染色。(C-D)右图：用不同p53亚细胞定位的细胞的定量。Nuc：仅核；Cyto+Nuc：胞质和核。数据表示3个实验的均值，各实验监控150个细胞。
图4.USP10对p53介导的转录活性、细胞生长抑制和细胞凋亡的影响。(A)p21启动子的p53报告构建体与所示构建体共转染到HCT116p53+/+和HCT116p53-/-细胞中。然后，如本文所述确定报告基因活性。(B)p53报告基因试验在稳定表达对照shRNA或USP10shRNA的HCT116p53+/+和HCT116p53-/-细胞中进行。(C)用所示构建体转染H1299细胞。48小时后，如本文所述测定凋亡细胞。(D)将稳定表达对照shRNA或USP10shRNA的HCT116p53+/+和HCT116p53-/-细胞接种，然后在所示时间定量细胞增殖。(E)软琼脂菌落形成试验在稳定表达对照shRNA、USP10shRNA或USP10shRNA以及shRNA-抗性USP10的HCT116p53+/+和HCT116p53-/-细胞中进行。右图：对软琼脂中形成的菌落定量。标尺，400μm。(A-E).误差线表示三重实验的平均值±SEM。**表示P＜0.01双尾学生t检验。
图5.DNA损伤后USP10移位到核中并调控p53活性。(A)稳定表达对照shRNA或USP10shRNA的HCT116细胞经照射(10Gy)并在所示时间收获细胞。然后细胞裂解物用所示抗体印迹。(B)HCT116细胞不处理或用10Gy照射处理。4小时后用抗USP10抗体染色细胞。(C)HCT116细胞经照射(10Gy)或不处理。4小时后，收获细胞并如本文所述分离。然后细胞组分用所示抗体印迹。(D)稳定表达对照shRNA或USP10shRNA的HCT116p53+/+或p53-/-细胞不处理或用10Gy照射处理。48小时后，如本文所述确定凋亡细胞。误差线表示三重实验的平均值±SEM。**表示P＜0.01双尾学生t检验。(E)用10Gy照射处理(D)中的相同细胞，然后在所示时间收获。用FACS检测细胞周期进展。
图6.ATM对USP10的磷酸化调控DNA损伤后USP10的稳定、移位和p53激活。(A)HCT116细胞经照射(10Gy)并在所示时间收获。然后提取细胞裂解物和mRNA并分别用Western印迹或RT-PCR分析。(B)HCT116细胞不处理或照射处理。然后用环己酰亚胺(0.1mg/mL)处理细胞并在所示时间收获。然后细胞裂解物用所示抗体印迹。(C)用带FLAG标记的USP10转染HCT116细胞。48小时后，所述细胞不处理或者用10Gy照射、40J/m2UV或20mM依托泊甙处理。再1小时后，收获细胞。用抗FLAG抗体对细胞裂解物进行免疫沉淀并用磷酸SQ/TQ(pSQ/TQ)抗体免疫印迹。(D)用带FLAG标记的USP10转染HCT116细胞并用DMSO、25mM Ku55933或3mM咖啡因预处理。孵育2小时后，细胞不处理或用10Gy照射处理。如(C)检测USP10的磷酸化。(E)ATM+/+或ATM-/-细胞经照射(10Gy)或者不处理。一小时后收获细胞，且用抗USP10抗体对细胞裂解物进行免疫沉淀并用pSQ/TQ抗体印迹。(F)ATM+/+或ATM-/-细胞不处理或经照射(10Gy)，并在所示时间收获。然后细胞裂解物用所示抗体印迹。(G)稳定表达USP10shRNA的HCT116细胞用带FLAG-标记的shRNA抗性USP10WT(野生型)、T42A、S337A或2SA(T42A和S337A双重突变)重建。细胞不处理或经照射(10Gy)，并在所示时间收获。然后细胞裂解物用所示抗体印迹。(H)稳定表达USP10shRNA的HCT116细胞用带FLAG标记的shRNA抗性USP10WT或2SA重建。细胞不处理或用10Gy照射处理。用pSQ/TQ抗体检测USP10磷酸化。(I)与(H)相同的细胞经照射(10Gy)或不处理。4小时后，收获细胞并如本文所述分离。(J)与(H)相同的细胞不处理或经照射(10Gy)。在所示时间收获细胞并用所示抗体印迹细胞裂解物。(K)与(H)相同的细胞不处理或经照射。48小时后确定凋亡细胞。
图7.USP10在肾细胞癌中下调。(A)USP10和p53在人肾细胞管状上皮细胞系(HK-2)和肾细胞癌(RCC)细胞系中的表达。(B)裂解11对新鲜冷冻RCC组织和相应的正常组织，并用所示抗体印迹细胞裂解物。(N：正常组织；T：肿瘤组织)。(C)USP10在正常肾细胞组织和肾细胞癌中的免疫组化染色。下表：USP10阳性或USP10阴性肾细胞癌情况中的定量。(ccRCC：透明细胞肾细胞癌)。(D-E)用稳定表达S/FLAG-USP10的CAKI-1和CAKI-2细胞(D)和稳定表达S/FLAG-USP10或USP10shRNA的786-O细胞(E)进行软琼脂菌落形成试验。下图：对软琼脂中形成的菌落定量。误差线表示三重实验的平均值±SEM。**表示P＜0.01双尾学生t检验。标尺表示400μm。(F)显示USP10如何调控p53的模式示意图。
图8.(A)用GFP-p53转染稳定转染有对照或USP10shRNA的H1299细胞。48小时后，用MG132处理细胞、固定并用所示抗体和DAPI染色。右图：用不同p53亚细胞定位的细胞的定量。Nuc：仅核；Cyto+nuc：胞质和核。数据表示3个实验的均值，各实验监控150个细胞。(B)与图6H相同的细胞不处理或用10Gy照射处理。4小时后，固定细胞并用抗FLAG抗体或DAPI染色。右图：用不同USP10亚细胞定位的细胞的定量。Cyto：仅胞质；Cyto+Nuc：胞质和核。数据表示3个实验的均值，各实验监控150个细胞。(C)裂解与图7D-E相同的细胞，并用所示抗体印迹细胞裂解物。
图9列出编码人USP10多肽的核酸序列(SEQ ID NO：1)。
图10列出编码人USP10多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。
图11列出可靶向编码人USP10多肽的核酸的shRNA。
图12列出编码人p53多肽的核酸序列(SEQ ID NO：3)。
图13列出人p53多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)。
图14列出编码人p53多肽突变型的核酸序列(SEQ ID NO：5)。
图15列出编码人p53多肽突变型的氨基酸序列(SEQ ID NO：6)。
图16包括胰腺癌细胞系(A)、乳腺癌细胞系(B)和胰腺组织(C)中的β-肌动蛋白和USP10多肽的Western印迹照片。N表示正常组织，而T表示肿瘤组织。
图17A的浓度曲线图绘制了与所示量的USP10多肽(μg)一起孵育后获得的Ub-AMC的去泛素化水平。图17B绘制了有(右)或没有(左)4μg/mL USP10多肽和所示化合物时的Ub-AMC的去泛素化水平。
图18是HCT116细胞裂解物与抗USP10多肽抗体(或对照抗体，IgG)免疫沉淀以及用抗G3BP1多肽抗体或抗USP10多肽抗体免疫印迹的照片。
图19A是USP10多肽(例如全长USP10多肽的全长和片段)的示意图和表明G3BP1多肽和p53多肽都与USP10多肽的N末端区域(例如1-100氨基酸)相互作用的表格。图19B是HCT116细胞裂解物与抗p53多肽抗体(或对照抗体，IgG)免疫沉淀以及用抗USP10多肽抗体、抗p53多肽抗体、或抗G3BP1多肽抗体免疫印迹的照片。所述HCT116细胞裂解物获自MG132和对照shRNA(对照)或设计用于降低G3BP1多肽表达的shRNA(G3BP1)处理的细胞。图19C是HCT116细胞裂解物与抗p53多肽抗体(或对照抗体，IgG)免疫沉淀以及用抗USP10多肽抗体、抗p53多肽抗体、或抗FLAG抗体免疫印迹的照片。所述HCT116细胞裂解物获自MG132和对照载体(载体)或设计用于过表达G3BP1多肽的载体(FLAG-G3BP1)处理的细胞。
图20是HCT116细胞裂解物用抗FLAG抗体、抗USP10多肽抗体、抗p53多肽抗体、或抗β肌动蛋白抗体免疫印迹的照片。HCT116细胞裂解物获自用对照构建体(对照)或设计用于减少USP10多肽表达(USP10)的shRNA构建体稳定转染的细胞，用空载体(载体)、设计用于过表达G3BP1多肽的载体(FLAG-G3BP1)、或设计用于过表达G3BP2多肽的载体(FLAG-G3BP2)转染。
图21绘制了稳定表达对照或设计用于降低USP10多肽表达的shRNA构建体(USP10shRNA)和用对照载体(载体)或FLAG-G3BP1构建体(G3BP1)转染的HCT116细胞的细胞生长(生长倍数，设第1天细胞数量为1)与时间(天)的图。
图22是HCT116细胞裂解物与抗USP10多肽抗体(或对照抗体，IgG)免疫沉淀以及用抗G3BP1多肽抗体和抗USP10多肽抗体免疫印迹的照片。所述HCT116细胞裂解物获自未处理细胞或用10Gy放射处理的细胞。
发明详述
本文涉及参与调控去泛素化酶(如USP10多肽)和/或泛素化多肽(如，肿瘤抑制多肽或肿瘤抑制多肽的突变形式)的方法和材料。例如，本文提供增加去泛素化酶(如USP10多肽)表达或活性的方法和材料，降低去泛素化酶(如USP10多肽)表达或活性的方法和材料，稳定肿瘤抑制多肽(如野生型p53多肽)的方法和材料，去稳定肿瘤抑制多肽的突变形式(如突变型p53多肽)的方法和材料以及减少癌细胞增殖、增加癌细胞凋亡和/或治疗癌症(如野生型p53多肽水平下降的癌症或突变型p53多肽水平上升的癌症)的方法和材料。本文还提供鉴定介导p53多肽稳定的USP 10的激动剂或拮抗剂的方法和材料。
在一个实施方式中，本文提供涉及治疗患癌症哺乳动物(如人)的方法和材料。可如本文所述治疗的哺乳动物示例包括但不限于：人、猴、狗、猫、牛、马、猪、大鼠和小鼠。可如本文所述治疗的癌症示例包括但不限于：肾癌(如肾细胞癌)、胰腺癌、乳腺癌和神经胶质瘤。哺乳动物可用合适的癌症诊断技术鉴定为患有癌症。在一些情况中，可评估癌症以确定所述癌症是否为p53多肽(如野生型p53多肽)水平下降的癌症。可用任何合适的方法评估癌细胞内的p53多肽水平。例如，核酸检测技术如RT-PCR或微阵列试验可用于评估癌细胞内的p53mRNA的水平或多肽检测技术如免疫组织化学或ELISA可用于评估癌细胞内的p53多肽的水平。
如本文所述，野生型p53多肽水平降低的癌症可通过提高USP10多肽表达或活性水平治疗。USP10多肽表达或活性水平的提高可稳定癌细胞中的野生型p53多肽，从而使癌细胞增殖减少并增加癌细胞凋亡。在一些情况中，癌细胞中的USP10多肽水平可通过给予含USP10多肽的组合物而升高。在一些情况中，癌细胞中的USP10多肽表达或活性水平可通过将USP10多肽激动剂或编码USP10多肽的核酸给予所述癌细胞而升高。所述核酸可编码全长USP10多肽如含SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的人USP10多肽，或含SEQ ID NO：2所示序列的520-793氨基酸残基的USP10多肽的生物活性片段。可用任何合适的方法将编码USP10多肽或其片段的核酸给予哺乳动物。例如，可用载体如病毒载体将核酸给予哺乳动物。
用于给予哺乳动物核酸(如编码USP10多肽或其片段的核酸)的载体在本领域已知且可用标准材料(如包装细胞系、辅助病毒和载体构建体)制备。参见例如，Jeffrey R.Morgan编的Gene Therapy Protocols(《基因治疗方案》)(Methods  in Molecular Medicine(《分子医学方法》))，新泽西州托托瓦的胡马纳出版社(Humana Press)(2002)和Curtis A.Machida编的Viral Vectors for Gene Therapy： Methods and Protocols(《用于基因治疗的病毒载体：方法和方案》)，新泽西州托托瓦的胡马纳出版社(2003)。基于病毒的核酸递送载体一般衍生自动物病毒如腺病毒、腺伴随病毒、逆转录病毒、慢病毒、痘苗病毒、疱疹病毒和乳头瘤病毒。慢病毒是可用于感染细胞(如癌细胞)的逆转录病毒属。腺病毒含线性双链DNA基因组，所述基因组可经遗传工程改造灭活该病毒活性以在正常裂解生命周期中复制。腺病毒和腺伴随病毒可用于感染癌细胞。
用于核酸递送的载体可遗传修饰从而所述病毒的致病性可改变或移除。病毒基因组可经修饰以增加感染性和/或适合包装核酸，如编码USP10多肽或其片段的核酸。病毒载体可为复制型或复制缺陷性，且可比相应的野生型病毒含更少的病毒基因或不含病毒基因。
除了编码USP10多肽或其片段的核酸，病毒载体可含与编码USP10多肽或其片段的核酸可操作性连接的调控元件。所述调控元件可包括启动子序列、增强子序列、响应元件、信号肽、内部核糖体进入序列、聚腺苷酸信号、终止子、或调控核酸表达(如转录或翻译)的诱导元件。包括在病毒载体内的元件选择取决于数种因素，包括但不限于，所需的可诱导性、靶向、和表达水平。例如，启动子可包括在病毒载体中以协助编码USP10多肽或其片段的核酸转录。启动子可为组成型或诱导型(如存在四环素时)，且可以通用或组织特异性方式影响编码USP10多肽或其片段的核酸表达。组织特异性启动子包括但不限于，烯醇酶启动子、朊病毒蛋白(PrP)启动子和酪氨酸羟化酶启动子。
本文所用的“操作性连接”指将调控元件以允许或协助编码多肽表达的方式置于涉及核酸的载体中。例如，病毒载体可包括神经元特异性烯醇酶启动子和编码USP10多肽或其片段的核酸。在此情况中，烯醇酶启动子可操作连接编码USP10多肽或其片段的核酸从而其驱动在神经元肿瘤细胞中的转录。
可用非病毒载体将编码USP10多肽或其片段的核酸给予癌细胞。用非病毒载体递送核酸的方法为本领域普通技术人员已知。参见例如Jeffrey R.Morgan编的Gene Therapy Protocols(《基因治疗方案》)(Methods in Molecular Medicine (《分子医学方法》))，新泽西州托托瓦的胡马纳出版社(2002)。例如，可通过直接注射(如肿瘤内注射)含编码USP10多肽或其片段的核酸的核酸分子(如质粒)，或通过给予与脂质、聚合物或纳米球复合的核酸分子，将编码USP10多肽或其片段的核酸给予哺乳动物。
编码USP10多肽或其片段的核酸可用标准技术生产，所述技术包括但不限于常见分子克隆、聚合酶链式反应(PCR)、化学核酸合成技术和这些技术的组合。例如PCR或RT-PCR可与设计用于扩增编码USP10多肽或其片段的核酸(如基因组DNA或RNA)的寡核苷酸引物一起使用。
在一些情况中，编码USP10多肽或其片段的核酸可从健康哺乳动物或患癌哺乳动物中分离。例如，编码含SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的野生型USP10多肽的核酸可从含所述核酸的人中分离。然后分离的核酸可用于生成病毒载体，例如，其可给予哺乳动物从而该哺乳动物内癌细胞的USP10多肽或其片段的水平升高。
在一些情况中，可评估癌症以确定所述癌症是否为表达突变型p53多肽的癌症。突变型p53多肽的例子包括但不限于含有另述氨基酸序列的那些((“TheUMD-p53database：New mutations and analysis tools，”(UMD-p53数据库：新突变和分析工具)Christophe Béroud和Thierry Soussi，Human Mutation，21卷：176-181页；和Berglind等，Cancer Biol.Ther.，7(5)：699-708(2008))。可用任何合适的方法评估癌细胞的突变型p53多肽。例如，核酸检测技术如RT-PCR或微阵列试验可用于评估癌细胞的突变型p53多肽或多肽检测技术如免疫组织化学或ELISA可用于评估癌细胞的突变型p53多肽。
如本文所述，表达突变型p53多肽的癌可通过降低USP10多肽的表达或活性水平来治疗。USP10多肽表达或活性水平的降低可去稳定癌细胞中的突变型p53多肽，从而使癌细胞增殖减少并增加癌细胞凋亡。在一些情况中，癌细胞中的USP10多肽表达或活性水平可通过将USP10多肽拮抗剂给予所述癌细胞而降低。有降低或抑制细胞内USP10多肽活性能力的USP10多肽拮抗剂的示例包括但不限于，N-乙基马来酰亚胺、Z-phe-ala氟甲基酮、抑凝乳蛋白酶素、E-64(反式环氧丁二酰基-L-亮氨酰(4-胍基)丁烷、E-64d((2S，3S)-反式-环氧丁二酰基-L-亮氨酰-3-甲基丁烷乙酯)、抗痛素二盐酸盐、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、和氰基茚并吡嗪衍生物。在一些情况中，USP10多肽拮抗剂可为设计用于诱导RNA干扰的核酸分子(如RNAi分子或shRNA分子)。这种shRNA分子示例包括但不限于图11所示的那些。设计用于诱导RNA干扰USP10多肽表达的核酸分子可用任何合适的方法给予哺乳动物，所述方法包括但不限于本文所述的方法。例如，可用载体如病毒载体将设计用于诱导RNA干扰USP10多肽表达的核酸给予哺乳动物。
在一些情况中，可用USP10多肽抑制剂如G3BP1多肽(又称为RasGap Sh3结构域结合蛋白1)降低或抑制细胞内USP10多肽的活性水平。G3BP1多肽的示例包括但不限于，人G3BP1多肽(例如，由
Figure BPA00001555329700111
登录号NM_005754.2(GI号38327550)或NM_198395.1(GI号38327551)所示核酸序列编码的人G3BP1多肽)、大鼠G3BP1多肽(例如，由登录号NM_133565.1(GI号281306780)所示核酸序列编码的大鼠G3BP1多肽)和小鼠G3BP1多肽(例如，由
Figure BPA00001555329700113
登录号NM_013716.2(GI号118130851)所示核酸序列编码的小鼠G3BP1多肽)。
在一些情况中，USP10多肽拮抗剂可为非多肽分子(例如基于核酸的分子如shRNA或RNAi分子)。在一些情况中，USP10多肽拮抗剂可为非G3BP1多肽分子(例如基于核酸的分子如shRNA或RNAi分子)。
本文还提供鉴定介导p53多肽稳定的USP10多肽的激动剂和拮抗剂的方法和材料。例如，本文提供使用USP10多肽和p53多肽(如泛素化p53多肽)鉴定试剂的方法和材料，所述试剂提高或降低所述USP10多肽稳定所述p53多肽的能力。在一些情况中，可评估有或没有测试剂时用USP10多肽处理的泛素化p53多肽的稳定性以确定所述测试剂是否提高或降低泛素化p53多肽的稳定性。以USP10多肽依赖性方式增加泛素化p53多肽稳定性的试剂可为介导p53多肽稳定的USP10多肽的激动剂，且以USP10多肽依赖性方式降低泛素化p53多肽稳定性的试剂可为介导p53多肽稳定的USP10多肽的拮抗剂。泛素化p53多肽的稳定性可用能检测完整全长多肽或降解多肽的多肽试验评估。USP10多肽激动剂和拮抗剂可通过筛选测试剂来鉴定(例如，从合成化合物库和/或天然产物库)。测试剂可获自任何市售来源且可用本领域技术人员已知的方法化学合成。测试剂可用体外基于细胞的试验、无细胞试验，和/或体内动物模型来筛选和表征。
USP10激动剂或拮抗剂可用体外筛选鉴定，所述体外筛选包括使用纯化的His标记USP10多肽与泛素-AMC(生物分子公司(BIOMOL))一起作为底物。泛素AMC是宽范围的去泛素化酶的荧光底物(Dang等，Biochemistry，37：1868(1998))。所述荧光可体外进行USP10激动剂和拮抗剂的高通量筛选。
在一些情况中，USP10多肽的表达水平可用于评估癌细胞的p53基因型。例如，鉴定出癌细胞的USP10多肽表达水平升高可指示所述癌细胞含突变型p53，鉴定出癌细胞的USP10多肽表达水平降低可指示所述癌细胞含野生型p53。
以下实施例进一步描述了本发明，这些实施例不限制权利要求书所述的本发明范围。
实施例
实施例1-USP10通过去泛素化p53调控p53定位和稳定性
细胞培养、质粒和抗体
H1299、HCT116p53+/+、HCT116p53-/-、U2OS、和HEK293细胞在补充有10％FBS的RPMI中培养。Caki-1和Caki-2细胞在补充有10％FBS的McCoy’s 5A中培养。A-498细胞在补充有10％FBS的MEM中培养。786-O和769-P细胞在补充有10％FBS的DMEM中培养。ATM+/+和ATM-/-MEFs在补充有15％FBS的DMEM中培养。
USP10克隆入p3xFLAG-CMV载体(西格玛公司(Sigma))和pET-28a载体(诺瓦基公司(Novagen))。Mdm2克隆入pCMV-HA载体(克隆泰克公司(Clontech))。p53克隆入pCMV-Myc载体(克隆泰克公司)。用英杰(Invitrogen)公司Gateway系统构建pBABE-S/FLAG/SBP(链霉亲和素结合肽)-标记的USP10。pcDNA3-FLAG-p53(T.Roberts博士提供的Addgene质粒10838)(Gjoerup等，J.Virol.，75：9142-9155(2001))、GFP-p53(T.Jacks博士提供的Addgene质粒12091)(Boyd等，Nat.Cell Biol.，2：563-568(2000))、GST-p53(PM Howley博士提供的Addgene质粒10852)(Huibregtse等，Embo J.，10：4129-4135(1991))、p21启动子A(B.Vogelstein博士提供的Addgene质粒16462)(el-Deiry等，Cancer Res.，55：2910-2919(1995))和pCI-neo Flag HAUSP(B.Vogelstein博士提供的Addgene质粒16655)(Cummins和Vogelstein，Cell Cycle，3：689-692(2004))获自Addgene。通过定点诱变(司查塔基公司(Stratagene))生成缺失突变。
用GST-USP10(氨基酸1-200)免疫兔子产生兔抗USP10抗体。用AminoLinkPlus免疫和纯化试剂盒(皮尔斯公司(Pierce))将抗血清亲和纯化。抗FLAG(m2)和抗HA抗体购自西格玛公司。抗p53(DO-1)抗体购自圣克鲁斯公司(SantaCruz)。抗MDM2单克隆抗体购自卡巴开公司(Calbiochem)。
RNA干扰
具有SEQ ID NO：7和8所示序列的USP10shRNA购自开放生物系统公司(Openbiosystems)(RHS4533-NM_005153)。慢病毒USP10shRNA用另述的开放生物系统公司提供的市售可得方案制作(Moffat等，Cell，124：1283-1298(2006)；Stewart等，RNA，9：493-501(2003)；Zufferey等，Nat.Biotechnol.，15：871-85(1997)；Zufferey等，J.Virol.，72：9873-80(1998)；以及Yamamoto和Tsunetsugu-Yokota，Curr.Gene Ther.，8(1)：1-8(2008))。简而言之，用脂质体转染胺试剂(lipofectamine)2000将pLKO.1载体(3μg)以及包装质粒(1.5μg)和包被质粒(1.5μg)一起转染293T细胞(80％融合度)。20小时后更换培养基(含30％FBS的RPMI)。再过24小时和48小时后收集含病毒的上清并过滤(0.45μm低蛋白结合滤器)。存在8μg/mL聚凝胺时用病毒感染细胞。
共免疫沉淀试验
细胞用含50mM β-磷酸甘油、10mM NaF、以及抑胃酶肽A和抑肽酶各1mg/mL的NETN缓冲液(20mM Tris-HCl、pH 8.0、100mM NaCl、1mM EDTA、0.5％诺乃清洁剂(Nonidet)P-40)裂解。离心获得全细胞裂解物，与2μg抗体和蛋白A或蛋白G琼脂糖珠(阿莫山生物科学公司(Amersham Biosciences))一起4℃孵育2小时。然后用NETN缓冲液清洗免疫复合物3次并用SDS-PAGE分离。按照标准方法进行免疫印迹。
GST拉下
GST融合蛋白按照另述的标准方案制备(Einarson和Orlinick，Protein-ProteinInteractions：A Molecular Cloning Manual(《蛋白之间的相互作用：分子克隆手册》)中的Identification of Protein-Protein Interactions with Glutathione S-TransferaseFusion Proteins.(用谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白鉴定蛋白之间的相互作用)，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，37-57页(2002)；Einarson，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(《分子克隆：实验室手册》)第3版中的Detection of Protein-Protein Interactions Using the GST Fusion Protein PulldownTechnique.(用GST融合蛋白拉下技术检测蛋白相互作用)，冷泉港实验室出版社，18.55-18.59页(2001)；和Vikis和Guan，Protein-Protein Interactions，Methods andApplications(《蛋白相互作用，方法与应用》)中的Glutathione-S-Transferase-FusionBased Assays for Studying Protein-Protein Interactions(《用基于谷胱甘肽-S-转移酶融合蛋白的试验研究蛋白相互作用》)，Methods in Molecular Biology，261，Fu，H.编.新泽西州托托瓦的胡马纳出版社，175-186页(2004))。对于体外结合试验，结合GSH琼脂糖的p53GST融合蛋白与细胞裂解物孵育。清洗后，结合的蛋白用SDS-PAGE分离并用所示抗体免疫印迹。
蛋白稳定性试验
环己酰亚胺购自西格玛公司。对于蛋白周转分析，将环己酰亚胺以终浓度0.1mg/mL加入细胞培养基中，并在所示时间点收获细胞。然后裂解细胞，用SDS-PAGE解析细胞裂解物并用Western印迹分析。
p53的体内和体外泛素化
p53的泛素化水平基本如另述检测(Li等，Nature，416：648-653(2002))。对于体内去泛素化试验，H1299细胞用FLAG-p53或与所示不同表达载体联合转染。48小时后，用蛋白酶体抑制剂MG132(50μM)处理细胞4小时，然后收获。所述细胞提取物用抗FLAG抗体免疫沉淀并用抗p53抗体印迹。
为了制备大量泛素化p53用作体外去泛素化试验的底物，HEK293细胞用FLAG-p53、pCMV-Mdm2和HA-UB表达载体一起转染。如上所述处理后，用抗FLAG亲和柱在FLAG裂解缓冲液(50mM Tris-HCl pH 7.8、137mM NaCl、10mMNaF、1mM EDTA、1％曲通X-100、0.2％肌氨酰、1mM DTT、10％甘油和新鲜的蛋白酶抑制剂)中从细胞提取物纯化泛素化的p53。用FLAG裂解缓冲液充分清洗后，所述蛋白用FLAG肽(西格玛公司)洗脱。重组His-USP10和USP10CA在BL21细胞中表达并在His标记的纯化柱(诺瓦基公司)上纯化。对于体外去泛素化试验，泛素化的p53蛋白与重组USP10在去泛素化缓冲液(50mM Tris-HCl pH8.0、50mM NaCl、1mM EDTA、10mM DTT、5％甘油)中37℃孵育2小时。
细胞分离
用所示构建体转染H1299细胞。48小时后，用蛋白酶体抑制剂MG132(50μM)处理细胞4小时，然后收获。用Paris试剂盒(安碧公司(Ambion))分离胞质和不明部分。
免疫荧光
对于p53移位试验，H1299细胞接种在玻璃盖玻片上并用所示质粒转染。转染48小时后，加入50μM蛋白酶抑制剂(MG132)持续4小时然后固定。然后将细胞在4％多聚甲醛中室温固定10分钟并用标准方案染色。
荧光素酶试验
HCT116p53+/+和HCT116p53-/-细胞以8x104细胞/孔接种在24-孔板上。第二天，用200ng p21受体构建体和其他所示质粒转染细胞。包括pRL-TK(50ng)作为内部对照。按照生产商说明进行荧光素酶试验(双荧光素酶受体试验系统；普洛麦格公司(Promega))。结果根据海肾(Renilla)萤光素酶活性测量的pRL-TK表达归一化。
细胞生长试验
按照生产商指导用MTS试剂(普洛麦格)分析细胞生长。稳定转染有编码对照shRNA或USP10shRNA的慢病毒的HCT116p53+/+和HCT116p53-/-细胞接种于96孔板上(1,000细胞/孔)并在含10％血清的培养基中生长。1、2、3、4、8和10天后评价细胞增殖。
菌落和软琼脂菌落形成试验
软琼脂菌落形成试验如另述进行(Shim等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94：6658-6663(1997))。简而言之，用编码对照、USP10shRNA或USP10shRNA以及FLAG标记USP10的慢病毒感染细胞。然后细胞接种于35mm盘中的0.3％顶层琼脂糖并培养两周。用4xNA 0.10物镜(尼康(Nikon))在光学显微镜(ECLIPSE80i；尼康)下室温计数菌落。用相机(SPOT 2Megasample；诊断设备公司(DiagnosticInstruments))捕获图像并用SPOT 4.6软件(诊断设备公司)处理。用AdobePhotoshop和Illustrator生成图像。
凋亡分析
用PBS清洗细胞并在4％多聚甲醛中室温固定15分钟。对于DAPI染色，细胞用50μg/mL DAPI染色。用荧光显微镜记录各样品内至少400细胞中具有典型调亡核形态学的凋亡细胞数量。读数器对荧光显微分析中的实际组不可见。
组织微阵列
肾癌样品的组织阵列购自美国百麦克斯公司(Biomax)(KD 2083、KD991t、KD804、KD241、KD208t)。针对USP10(1∶500稀释)的免疫组化染色用IHC
Figure BPA00001555329700161
HRP/DAB试剂盒(目录号DAB50，密理博公司(Millipore))进行。由专科(board)授权的病理学家用4层分级系统(0＝阴性、1＝弱、2＝中等、和3＝强染色强度)以盲试方式确定免疫染色的程度。
结果
USP10与p53相互作用并稳定p53
如图1A-B所示，USP10与U2OS和HCT116p53+/+细胞中的p53共免疫沉淀，但不是HCT116p53-/-细胞。与抗p53交互的免疫沉淀还拉下HCT116p53+/+中的USP10，但不是HCT116p53-/-细胞(图1C)。不同于HAUSP，USP10不与Mdm2相互作用(图1D)。这些结果说明体内USP10和p53之间有特异性相互作用。然而，不清楚USP10-p53相互作用是否是直接的。为对此进行测试，生成并纯化重组的USP10和p53。纯化的USP10能在无细胞条件下与p53相互作用，说明USP10和p53之间有直接相互作用(图1E)。USP10-p53相互作用的进一步做图说明N末端区域(AA1-AA101)为USP10和p53的相互作用所需，而不是USP10的酶结构域(图1F)。
USP10在细胞中过表达以确定USP10能否作用于稳定p53。如图2A所示，过表达USP10显著增加了内源p53和p53靶标p21的水平。为了证实这些结果，用USP10特异性shRNA敲减USP10表达。USP10的下调降低了p53和p21的水平(图2B)。第二USP10shRNA也显示相似的效应(图2B)。这些结果表明USP10能上调p53水平，最可能是通过去泛素化继而稳定p53。为了进一步证实USP10影响p53稳定性，用环己酰亚胺(CHX)处理对照细胞或稳定表达USP10shRNA的细胞并检测p53稳定性。稳定表达USP10shRNA的细胞中p53稳定性下降，而用shRNA抗性USP10的重建恢复了p53稳定性(图2C)。这些结果证明USP10稳定细胞中的p53。
USP10去泛素化p53
USP10可用于去泛素化p53以抵消E3泛素连接酶如Mdm2的作用。事实上，如图2D所示，尽管Mdm2的过表达显著诱导p53的降解，但USP10的共表达从Mdm2诱导的降解中有效拯救了p53。还检测了USP10是否调控细胞中p53泛素化的水平。如图2E所示，Mdm2诱导p53的泛素化，但通过共表达USP10显著消除了p53的泛素化。另一方面，在核心酶结构域上含突变的催化-灭活USP10突变体USP10-C488A(USP10CA)(Soncini等，Oncogene，20：3869-3879(2001))的共表达丧失了逆转Mdm2诱导的p53泛素化的能力(图2E)。相反地，USP10的下调增加p53泛素化(图2F)。这些结果表明细胞中USP10负调控Mdm2诱导的p53泛素化。然而，单从此数据尚不清楚USP10对p53的影响是否是直接的，因为有可能USP10影响另一蛋白，其继而影响p53泛素化。为了直接检测USP10对p53的去泛素化活性，确定USP10是否能在无细胞系统中去泛素化p53。从细菌中纯化USP10和USP10CA，并从表达FLAG-p53、pCMV-Mdm2、和HA-ub的细胞中纯化泛素化的p53。然后USP10和泛素化p53在无细胞系统中孵育。如图2G所示，纯化的野生型USP10而不是催化灭活的USP10CA，在体外有效去泛素化p53。这些结果证明USP10在体外和体内都能去泛素化p53。
USP10定位于胞质并抵消Mdm2作用
先前研究表明Mdm2对p53的泛素化可诱导p53从核移位到胞质中，(Boyd等，Nat.Cell.Biol.，2：563-568(2000)；Geyer等，Nat.Cell.Biol.，2：569-573(2000)；Li等，Science，302：1972-1975(2003)；和Stommel等，EmboJ.，18：1660-1672(1999))。此外，胞质泛素连接酶Parc能泛素化p53并将p53捕获在胞质中(Nikolaev等，Cell，112：29-40(2003)。然而，不清楚胞质p53能否被去泛素化并返回核中，因为HAUSP主要定位在核中且没有鉴定到针对p53的胞质泛素特异蛋白酶。不同于HAUSP，USP10主要定位在胞质(图3A)。此结果表明USP10是p53的胞质去泛素化酶。因此，可能USP10能逆转Mdm2诱导的p53核输出。为测试此想法，进行细胞分级分离实验。发现Mdm2的表达诱导p53的泛素化和核输出，这可被USP10共表达逆转(图3B)。为了证实此结果，进行免疫荧光试验以检测p53的亚细胞定位。当H1299细胞用带GFP标记的p53转染时，GFP-p53容易在核内检测。如先前所证明，当细胞用Mdm2共转染时，Mdm2诱导p53的胞质移位(Boyd等，Nat.Cell.Biol.，2：563-568(2000)；Geyer等，Nat.Cell.Bio1.，2：569-573(2000)；Li等，Science，302：1972-1975(2003)；和Stommel等，Embo J.，18：1660-1672(1999))。然而，野生型USP10的共表达(而不是催化灭活的USP10(USP10CA))逆转了Mdm2诱导的p53胞质移位(图3C)。这些结果证明USP10通过去泛素化p53抵消Mdm2并诱导p53从胞质移位回核。因此，USP10和Mdm2之间的平衡能确定p53的位置。如果是这样，USP10的下调与Mdm2的过表达会有相似的效果。与此发现相一致，USP10自身的下调诱导内源p53的核输出(图3D)。用GFP-p53也获得了相似结果(图8A)。这些结果支持USP10在细胞中调控p53内稳态的作用。
USP10调控p53功能
USP10对p53稳定和核输出的影响使USP10可能调控p53依赖型的转录活性、细胞转化和凋亡。如图4A所示，野生型USP10的过表达(而不是催化灭活的USP10(USP10CA))提高了HCT116p53+/+细胞中的p21启动子活性，而不是在HCT116p53-/-细胞中。相反地，shRNA对USP10的稳定敲减抑制HCT116p53+/+细胞中的p21启动子活性，但在HCT116p53-/-细胞中几乎没有效果(图4B)。这些结果证明USP10调控p53依赖型的转录活性。此外，进行实验测试USP10是否直接影响p53依赖性凋亡。如图4C所示，p53过表达诱导凋亡，而Mdm2显著减少p53依赖性凋亡。然而，USP10的共表达(而不是催化灭活的USP10)明显逆转Mdm2对p53介导的凋亡的抑制效应。还研究USP10如何影响细胞增殖。如图4D所示，USP10的下调增加p53+/+细胞中的癌细胞增殖，而不是p53-/-细胞中。癌细胞在软琼脂中培养时观察到相似效果(图4E)。另一方面，USP10在细胞中重建和USP10的下调抑制癌细胞增殖(图4E)，表明USP10敲减效应的特异性。总体上，这些结果证明USP10增强细胞中的p53功能。
DNA损伤后USP10上调并移位到该且调控p53-依赖型DNA损伤响应
本文提供的结果说明USP10能在非应激细胞中调节p53内稳态。由于DNA损伤后p53在DNA损伤响应中起作用并变得稳定化，所以DNA损伤后检测USP10是否参与p53稳定化。有趣的是，DNA损伤后USP10的下调显著降低p53的稳定和p53靶向基因p21和Bax的表达(图5A)，表明DNA损伤后USP10还调控p53稳定。此外，观察到USP10自身的表达在DNA损伤后增加。这些结果非常令人意外，因为大多数DNA损伤信号被认为发生在核内。DNA损伤响应中定位于胞质的USP10如何影响p53的稳定？可能DNA损伤响应期间p53仍积极输出核并在胞质中降解，尽管缺少证据支持这个观点。或者，USP10能移位到核内参与DNA损伤响应。事实上，如免疫荧光所测定，DNA损伤后USP10还定位于核内(图5B)。为了确认USP10的移位，进行细胞分离试验。如图5C所示，DNA损伤后在核内检测USP10的增加量，确认DNA损伤诱导USP10移位到核中。
因为DNA损伤后USP10调节p53稳定，检测DNA损伤响应期间p53依赖型功能是否需要USP10。如图5D所示，USP10的下调抑制HCT116p53+/+细胞中IR诱导的凋亡。HCT116p53-/-细胞中IR诱导的凋亡迟钝，但是USP10的下调没有进一步效果。此外，HCT116p53+/+细胞中USP10的敲减导致缺陷型DNA损伤诱导的G1期阻滞(图5E)。这些结果与USP10下调的细胞中Bax和p21表达减少相一致(图5A)，且表明DNA损伤后的p53激活需要USP10。
ATM对USP10的磷酸化为DNA损伤后其稳定和移位所必需
进行下述实验确定调控USP10上调和移位的分子机制。初始实验说明不同于p21，发生USP10上调而没有任何USP10mRNA变化(图6A)，说明其不是在转录水平调控，且可在翻译后水平调控。为了检测USP10多肽是否变得稳定，照射细胞，并用环己酰亚胺处理细胞。如图6B所示，USP10在照射细胞中变得更稳定，表明DNA损伤后的USP10积累是由于稳定性增加。
磷酸化是DNA损伤响应途径的主要翻译后修饰，且其显示其提高蛋白稳定性和活性。例如，IR后p53在Ser20由检测点激酶Chk2磷酸化，这导致p53从Mdm2上的分离和其随后的稳定化(Chehab等，Genes Dev.，14：278-288(2000)；Hirao等，Science，287：1824-1827(2000)；和Shieh等，Genes Dev.，14：289-300(2000))。ATM还可在Ser15直接磷酸化p53，从而调控p53转录活性并定位(Canman等，Science，281：1677-1679(1998)；Siliciano等，Genes Dev.，11：3471-3481(1997)；和Zhang和Xiong，Science，292：1910-1915(2001))。因此，检测DNA损伤后USP10是否磷酸化，这可能引起其稳定化和定位。如图6C所示，IR、UV或依托泊苷处理后，USP10在SQ/TQ基序磷酸化(USP10多肽水平与图6C-E的实验中具体检测的USP10磷酸化相等)。SQ/TQ基序是PI3激酶样激酶(PIKKS)如DNA损伤响应途径的主要上游激酶ATM、ATR和DNA-PK的共有磷酸化位置(Abraham，Genes Dev.，15：2177-2196(2001))。用泛PIKK抑制咖啡因进行实验确定PIKK是否为USP10磷酸化所必需(Sarkaria等，Cancer Res.，59：4375-4382(1999))。如图6D所示，咖啡因抑制DNA损伤后的USP10磷酸化。此外，特异性ATM抑制剂KU55933(Hickson等，Cancer Res.，64：9152-9159(2004))还在IR后抑制USP10磷酸化。这些结果表明PIKKS(类似ATM)调控DNA损伤后的USP10磷酸化。用ATM+/+或ATM-/-细胞进一步确认ATM在USP10磷酸化中的作用。如图6E所示，ATM-/-细胞中USP10未能在SQ/TQ基序磷酸化。此外，ATM-/-细胞中DNA损伤后USP10水平没有增加(图6F)。这些结果表明DNA损伤后USP10被ATM磷酸化，这可能有助于其稳定化。
进行实验确定USP10的ATM磷酸化位置。ATM特异性磷酸化SQ/TQ基序，其中USP10中有2个候选位置：T42Q和S337Q。T42或S337上的突变部分影响USP10稳定，且突变T42和S337(USP102SA)破坏了DNA损伤后的USP10稳定(图6G)。T42和S337的突变(USP102SA)还破坏了ATM对USP10的磷酸化(图6H)。此外，USP102SA突变体未能在DNA损伤后移位到核中(图6I和图8B)。这些结果表明ATM介导的USP10磷酸化为USP10移位和稳定所必需。
检查USP10被ATM磷酸化的功能性意义。稳定表达USP10shRNA的HCT116细胞用shRNA抗性的野生型USP10或USP102SA重建。如图6J所示，表达USP102SA突变体的细胞在DNA损伤后表现出缺陷型p53稳定以及弱诱导Bax和p21。此外，野生型USP10(而不是USP102SA突变体)的重建恢复了DNA损伤诱导的凋亡(图6K)。这些结果建立了DNA损伤后USP10磷酸化在p53激活中的作用。
USP10在肾细胞癌中下调。
因为p53是调控细胞增殖的肿瘤抑制剂，且USP10通过去泛素化p53增强p53的功能，所以USP10还可能用作肿瘤抑制剂。图4D和E中所示的结果证明USP10抑制癌细胞增殖的能力，并支持USP10在体内作为肿瘤抑制剂的假设。为了进一步测试该假设，检查一组肾细胞癌(RCC)细胞系中的USP10表达。选择RCC研究USP10表达，因为RCC情况中发现p53突变的百分比非常低(Soussi等，Hum.Mutat.，15：105-113(2000))。也参见癌症研究国际机构的p53数据库。考虑到肿瘤抑制中p53的功能，p53途径在RCC中可能通过其他机制如USP10的下调而受到影响。事实上，发现USP10的表达在包括A498、Caki-1和Caki-2细胞在内的数种RCC细胞系中显著降低，这些细胞都含野生型p53(图7A)。这些细胞中p53的表达也低于正常肾细胞。然而，含突变p53的RCC细胞系中，USP10水平增加。USP10水平还在大部分新鲜冷冻RCC组织中相较对应的正常组织降低(图7B)。USP10下调的RCC样品都含野生型p53基因(T1-T9)，尽管p53水平降低。这些结果表明USP10的下调可能是RCC中抑制p53活性的替代方法。有趣的是，与RCC细胞系相似，USP10在一些RCC组织中过表达，且这些组织含突变型p53(T10，T11)。这些结果表明突变p53背景中USP10水平上升可能有利于肿瘤生长。
还用RCC组织微阵列检查USP10的表达。USP10的染色得分为0-3，0-1的得分为阴性且2-3的得分为阳性。图7C显示代表性染色和得分。令人惊奇的是，接近90％的透明细胞癌表现出USP10染色阴性。约50％不染色细胞和20％的乳头状RCC表现出阴性USP10染色。这些结果说明RCC情况尤其是透明细胞癌中USP10下调。
为了确认USP10在肿瘤抑制中的作用，在USP10下调的RCC细胞中重建USP10，并用软琼脂试验检查肿瘤细胞生长。含野生型p53的CAKI-1和CAKI-2透明细胞癌细胞系中的USP10重建恢复了p53表达并提高p21表达(图8C)。此外，USP重建抑制了细胞增殖(图7D)。这些结果与USP10通过稳定p53而起肿瘤抑制剂作用的假设相一致。
USP10在含突变p53的RCC细胞系和组织中过表达，与p53水平增加相关联。这与突变p53通常在许多癌症中过表达的现象一致。由于突变p53通常为显性且表现为功能获得，增加的p53水平可有利于癌症。与含野生型p53的细胞不同，在突变p53背景中的USP10表达上升可有利于癌细胞增殖。事实上，含突变p53的786-O细胞中USP10表达增加使细胞增殖上升，而USP10的下调抑制细胞增殖(图7E和图8C)。这些结果表明USP10以环境依赖性方式调控p53和癌细胞增殖。
检查USP10在乳腺癌和胰腺癌细胞系中的表达。如图16A-B所示，USP10在乳腺癌和胰腺癌细胞系亚组中下调。此外，USP10的表达在许多胰腺癌组织中丧失(图16C)。这些结果还证实了USP10可能在多种癌症中作为肿瘤抑制剂。
总体而言，本文提供的结果表明在非应激细胞中，USP10定位于胞质并调控p53内稳态。DNA损伤后，USP10部分移位到核中并有助于p53激活(图7F)。USP10通过其对p53的调控在肿瘤抑制中起作用。
实施例2-抑制USP10多肽活性
广泛的去泛素化酶的荧光底物(Dang等，Biochemistry，37：1868(1998))泛素AMC(Ub-AMC；生物分子公司(BIOMOL))用作USP10多肽的底物，以证明USP10多肽对Ub-AMC的去泛素化是剂量依赖型。简而言之，体外Ub-AMC去泛素化的量随着USP10多肽浓度的增加而增加(图17A)。
用USP10多肽(4μg/mL)和Ub-AMC(300nmol/L)测试N-乙基马来酰亚胺(1mM)、Z-phe-ala氟甲基酮(80μM)、抗痛素二盐酸盐(10μg/mL)、E-64(10μM)、抑凝乳蛋白酶素(100μM)、氟化磺酰苯基甲烷(40μM)、E-64d(0.5μM)、和半胱氨酸蛋白酶抑制剂(36μg/mL)抑制USP10多肽活性的能力。简而言之，在USP10反应缓冲液(50mmol/L Tris-HCl(pH 7.6)、0.5mmol/L EDTA、5mmol/L DTT、0.01％曲通X-100、和0.05mg/mL血清白蛋白)中新鲜制备酶(USP10多肽)和底物(Ub-AMC)用于各运行。一般试验中各孔(除底物对照孔以外)含4μg/mL的USP10、所述化合物、或2％DMSO。所述孔孵育30分钟以达到平衡，然后通过添加所述底物(300nmol/L的Ub-AMC)开始酶反应。所述反应混合物室温孵育2小时，且通过添加250mmol/L乙酸终止反应。
相较与DMSO一起孵育，USP10多肽的去泛素化活性被N-乙基马来酰亚胺(1mM)、Z-phe-ala氟甲基酮(80μM)、和抗痛素二盐酸盐(10μg/mL)显著抑制(p＜0.01)(图17B)。
实施例3-G3BP1多肽抑制USP10多肽活性
共免疫沉淀试验如下进行。细胞用含50mM β-磷酸甘油、10mM NaF、以及抑胃酶肽A和抑肽酶各1mg/mL的NETN缓冲液(20mM Tris-HCl、pH 8.0、100mM NaCl、1mM EDTA、0.5％诺乃清洁剂(Nonidet)P-40)裂解。离心获得全细胞裂解物，与2μg抗体和蛋白A或蛋白G琼脂糖珠(阿莫山生物科学公司(Amersham Biosciences))一起4℃孵育2小时。然后用NETN缓冲液清洗免疫复合物3次并用SDS-PAGE分离。按照标准方法进行免疫印迹。
细胞生长试验如下进行。按照生产商指导用MTS试剂(普洛麦格)分析细胞生长。稳定转染有编码对照shRNA或设计用于减少USP10多肽表达的shRNA的慢病毒的HCT116细胞(1,000细胞/孔)用所示构建体转染。24小时后，将所述细胞接种于96孔板上并在含10％血清的培养基中生长。1、2、3、4和5天后评价细胞增殖。
收获并裂解HCT116细胞。得到的细胞裂解物用抗USP10多肽抗体免疫沉淀并用抗G3BP1多肽抗体或抗USP10多肽抗体免疫印迹(图18)。这些结果证明G3BP1多肽与USP10多肽体内相互作用。此外，用全长USP10多肽的全长和片段的实验表明G3BP1多肽和p53多肽都与USP10多肽的N末端区域(例如1-100氨基酸)相互作用(图19A)。
在一个实验中，HCT116细胞用MG132处理4小时并用具有下述序列：5’-ATGTTTCATTCATTGGAAT-3’(SEQ ID NO：12)的shRNA消除G3BP1多肽表达。MG132是特异、有效、可逆且可透过细胞的蛋白酶体抑制剂。在另一实验中，转染有设计用于表达FLAG-G3BP1多肽的载体的HCT116细胞用MG132处理4小时。在两种情况中，裂解细胞并将细胞裂解物用抗p53多肽抗体免疫沉淀并用抗USP10多肽抗体、抗p53多肽抗体、抗G3BP1抗体和/或抗FLAG抗体免疫印迹。
G3BP1多肽与p53多肽竞争结合USP10多肽(图19B和19C)。shRNA消除G3BP1多肽表达显著增加USP10多肽和p53多肽之间的结合(图19B)。G3BP1多肽的过表达减少USP10多肽和p53多肽之间的结合(图19C)。这些结果表明G3BP1多肽与p53多肽竞争结合USP10多肽。
在另一实验中，稳定转染有对照构建体或设计用于减少USP10多肽表达的shRNA构建体的HCT116细胞用空载体、设计用于过表达带FLAG标记的G3BP1多肽的载体、或设计用于过表达带FLAG标记的G3BP2多肽的载体转染。设计用于减少USP10多肽表达的shRNA  具有下述序列：5’-GCCTCTCTTTAGTGGCTCTTT-3’(SEQ ID NO：13)。48小时后裂解细胞，并将细胞裂解物用抗FLAG抗体、抗USP10多肽抗体、抗p53多肽抗体、或抗β肌动蛋白抗体印迹。G3BP1多肽(而不是G3BP2多肽)的过表达降低p53多肽的水平(图20)。缺乏USP10多肽的细胞中，G3BP1多肽的过表达没有改变p53多肽的水平(图20)。这些结果表明G3BP1多肽通过USP10多肽调控p53多肽。
另一实验中，稳定表达对照构建体或设计用于降低USP10多肽表达的shRNA构建体(USP10shRNA)的HCT116细胞用对照载体或FLAG-G3BP1载体转染。24小时后将细胞接种并在第1、2、3、4和5天用MTS试验检测细胞生长。G3BP1多肽的过表达显著提高了HCT116细胞的细胞生长，但不是缺乏USP10多肽的HCT116细胞(图21)。这些结果表明G3BP1多肽通过USP10多肽调控癌细胞生长。
在另一实验中，HCT116细胞不处理或用10Gy辐射处理。2小时后裂解细胞。得到的细胞裂解物用抗USP10多肽抗体免疫沉淀并用抗G3BP1多肽抗体和抗USP10多肽抗体免疫印迹。X-射线辐射显著降低USP10多肽和G3BP1多肽的相互作用(图22)。这些结果证明DNA损伤减轻G3BP1多肽对USP10多肽的抑制。
其他实施方式
应理解，虽然本发明已结合其详述进行描绘，但以上描述是用于说明而不是限制本发明的范围，该范围由所附权利要求的范围限定。其他方面、优势和修改在以下权利要求的范围内。
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Claims (11)

1.一种用于降低具有癌细胞的哺乳动物中癌细胞增殖的方法，所述方法包括在组合物调控所述癌细胞内USP10多肽表达和活性的条件下将所述组合物给予所述哺乳动物，从而降低癌细胞增殖。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述癌细胞具有降低水平的野生型p53多肽表达，且所述组合物增加所述USP10多肽的表达或活性。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述组合物包括编码USP10多肽的核酸。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述组合物可包括编码具有SEQID NO：2所示氨基酸序列的多肽的核酸。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述癌细胞表达突变型p53多肽，且所述组合物降低所述USP10多肽的表达或活性。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述组合物包括介导p53多肽稳定的USP10多肽的拮抗剂。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述拮抗剂包含具有诱发针对所述USP10多肽表达的RNA干扰能力的核酸。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述USP10多肽是人USP10多肽。
9.一种治疗哺乳动物癌症的方法，所述方法包括：
(a)鉴定哺乳动物具有表达降低水平的野生型p53多肽或表达突变型p53多肽的癌细胞，
(b)若所述哺乳动物鉴定为具有表达所述降低水平的野生型p53多肽的癌细胞，则给予增加所述癌细胞内USP10多肽表达或活性的USP10多肽或组合物，和
(c)若所述哺乳动物鉴定为具有表达所述突变型p53多肽的癌细胞，则给予降低所述癌细胞内USP10多肽表达或活性的组合物。
10.一种鉴定介导p53多肽稳定的USP10多肽拮抗剂的方法，其中所述方法包括确定存在测试剂时与USP10多肽接触的泛素化p53多肽的稳定水平是否低于没有所述测试剂时与所述USP10多肽接触的所述泛素化p53多肽的稳定水平，其中存在所述测试剂时与所述USP10多肽接触的所述泛素化p53多肽的稳定水平比没有所述测试剂时与所述USP10多肽接触的所述泛素化p53多肽的稳定水平低表明所述测试剂是所述拮抗剂。
11.一种鉴定介导p53多肽稳定的USP10多肽激动剂的方法，其中所述方法包括确定存在测试剂时与USP10多肽接触的泛素化p53多肽的稳定水平是否高于没有所述测试剂时与所述USP10多肽接触的所述泛素化p53多肽的稳定水平，其中存在所述测试剂时与所述USP10多肽接触的所述泛素化p53多肽的稳定水平比没有所述测试剂时与所述USP10多肽接触的所述泛素化p53多肽的稳定水平高表明所述测试剂是所述激动剂。
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