CN102770432B - 还原型吡咯并喹啉醌的制造方法 - Google Patents

Abstract

本发明的目的在于提供一种不需要昂贵的设备、由氧化型吡咯并喹啉醌简便地制造还原型吡咯并喹啉醌的方法、以及稳定地保存还原型吡咯并喹啉醌的方法。根据本发明，通过在溶剂中混合吡咯并喹啉醌和抗坏血酸，能够以适于工业规模的生产的方法、简便且有效地得到高品质的还原型吡咯并喹啉醌。

Description

还原型吡咯并喹啉醌的制造方法

参照相关申请

本专利申请享受2010年2月16日提出的日本申请特愿2010－31637的优先权。该在先申请中的全部公开内容通过引用作为本说明书的一部分。

技术领域

本发明涉及还原型吡咯并喹啉醌的制造方法以及由该制造方法得到的还原型吡咯并喹啉醌。本发明还涉及还原型吡咯并喹啉醌的稳定化方法。

背景技术

吡咯并喹啉醌（以下，有时表述为“PQQ”）被提出可能成为新的维生素而备受瞩目（非专利文献1）。而且，PQQ不限于细菌，也存在于真核生物的霉菌、酵母，作为辅酶发挥着重要的作用。另外，关于PQQ，近年来已知其细胞的增殖促进作用、抗白内障作用、肝脏疾病预防治疗作用、创伤治愈作用、抗过敏作用、逆转录酶抑制作用和乙二醛酶I抑制作用－抗癌作用等多种生理活性。该PQQ类能够通过有机化学的合成法（非专利文献2）和发酵法（专利文献1）等制造。

有报告指出还原型PQQ与现有的PQQ相比其抗氧化活性非常高（非专利文献3），是能够有效用作营养功能食品、特定保健用食品、营养辅助剂、营养剂、饮料、饲料、动物药、化妆品、医药品、治疗药、预防药等的化合物。有报告指出还原型PQQ可以通过使用硼氢化钠、连二亚硫酸钠等一般的还原剂将氧化型PQQ还原而得到；通过铂催化剂进行氢还原而得到；通过谷胱甘肽进行还原而得到（非专利文献3、4、5）。但是，一般的还原剂对生物体显示毒性的可能性高，需要将其除去的工序。另外，在使用催化剂时，由于使用容易泄露且容易爆炸的氢，所以需要特别的设备。利用谷胱甘肽的还原虽然安全性高、易于使用，但问题在于谷胱甘肽的价格高。因此需求安全性高、简便、且低成本的方法。

此外，作为具有将物质还原的作用的物质，抗坏血酸广为人知。因此，作为具有抗氧化活性的组合物，提出了PQQ与抗坏血酸的组合的方案，但如非专利文献3中的记载，由于PQQ的还原体比抗坏血酸的抗氧化活性高，可以认为利用抗坏血酸的还原困难。另外还原型PQQ容易被分子氧氧化为氧化型PQQ。因此，保存方法也需要对策。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开平1－218597号公报

非专利文献

非专利文献1：nature,vol.422,24,April,3003,p832

非专利文献2：JACS，第103卷，第5599～5600页（1981）

非专利文献3：J.Agric.Food Chem.2009,57,450-456

非专利文献4：Bull.Chem.Soc.Jpn,59,1911-1914(1986)

非专利文献5：Eur.J.Biochem.118,395-399(1981)

发明内容

发明所要解决的课题

本发明的发明人发现从将pH4以下的吡咯并喹啉醌溶液和抗坏血酸溶液混合得到的pH3.5以下的溶液中，能够以高收率得到还原型吡咯并喹啉醌。本发明是基于该见解得到的。

本发明的目的在于提供安全性高、简便、低成本的还原型吡咯并喹啉醌的制造方法、以及通过该制造方法得到的还原型吡咯并喹啉醌。本发明的目的还在于提供还原型吡咯并喹啉醌的稳定化方法。

用于解决课题的方法

根据本发明，提供以下的发明。

（1）一种还原型吡咯并喹啉醌的制造方法，其包括：将调节为pH4以下的吡咯并喹啉醌或其盐的溶液与抗坏血酸类似物混合，得到含有还原型吡咯并喹啉醌的pH 3.5以下的溶液的工序。

（2）根据（1）所记载的制造方法，吡咯并喹啉醌或其盐的溶液为水溶液。

（3）根据（1）或（2）所记载的制造方法，吡咯并喹啉醌或其盐的溶液的pH为2～3.5。

（4）根据（1）所记载的制造方法，吡咯并喹啉醌或其盐与抗坏血酸类似物的摩尔比为1:0.5～1000。

（5）根据（1）所记载的制造方法，抗坏血酸类似物选自抗坏血酸、鼠李糖型抗坏血酸、阿拉伯糖型抗坏血酸、葡萄糖型抗坏血酸、岩藻糖型抗坏血酸、葡庚糖型抗坏血酸、木糖型抗坏血酸、半乳糖型抗坏血酸、古洛糖型抗坏血酸、异抗坏血酸、红抗坏血酸、6－脱氧抗坏血酸、以及它们的酯体和盐。

（6）根据（1）所记载的制造方法，还包括从溶液中分离还原型吡咯并喹啉醌的工序。

（7）通过（1）～（6）中记载的制造方法所制造的还原型吡咯并喹啉醌。

（8）根据（7）所记载的还原型吡咯并喹啉醌，作为含有抗坏血酸类似物的溶液提供。

（9）一种还原型吡咯并喹啉醌的稳定化方法，包括：使还原型吡咯并喹啉醌或其盐与抗坏血酸类似物一同存在于溶剂中的步骤。

发明的效果

根据本发明，能够安全性高、简便、且以低成本制造还原型吡咯并喹啉醌，并且，在制造还原型吡咯并喹啉醌时不需要昂贵的设备方面有利。根据本发明，在能够稳定保存还原型吡咯并喹啉醌的方面也有利。

具体实施方式

根据本发明，能够通过将pH4以下的吡咯并喹啉醌或其盐的溶液与抗坏血酸类似物混合，得到pH3.5以下的溶液，从而制造还原型吡咯并喹啉醌。

在本申请说明书中，“还原型吡咯并喹啉醌”是指下述式（1）所示的化合物。

在本发明中使用的吡咯并喹啉醌（游离体）是指式（2）所示的化合物。

根据本发明，能够用抗坏血酸类似物将吡咯并喹啉醌还原而制造还原型PQQ。

本发明中所使用的吡咯并喹啉醌既可以使用吡咯并喹啉醌（游离体），也可以使用吡咯并喹啉醌的盐。

作为本发明中所使用的“吡咯并喹啉醌的盐”，可以列举吡咯并喹啉醌的碱金属盐、碱土金属盐、铵盐，但优选碱金属盐。

本发明中所使用的吡咯并喹啉醌只要是游离体、碱金属盐就没有特别限定。特别优选使用易于获得的游离体、二钠体、二钾体。

作为本发明中所使用的吡咯并喹啉醌的碱金属盐，可以列举钠、钾、锂、铯、铷等的盐。优选从易于获得的方面考虑，优选钠盐和钾盐。吡咯并喹啉醌的碱金属盐中盐的取代数为1～3，单碱金属盐、二碱金属盐、三碱金属盐均可，优选为二碱金属盐。作为吡咯并喹啉醌的碱金属盐，特别优选二钠盐和二钾盐。

本发明中所使用的吡咯并喹啉醌或其盐既可以获得市售品，也可以通过公知的方法制造。

本发明中所使用的吡咯并喹啉醌或其盐，可以作为吡咯并喹啉醌或其盐的溶液使用。所使用的溶剂只要反应进行就没有特别限定，可以将吡咯并喹啉醌或其盐溶解于水、醇、二甲基亚砜等的溶剂中使用，但从即使在制品中残留也不会造成大的问题的方面考虑，优选水（水溶液）。

吡咯并喹啉醌或其盐的溶液，例如，能够调制为0.001～30g／l，优选为0.01～15g／l，更优选为0.1～5g／l。

为了有效地得到还原型PQQ，可以将吡咯并喹啉醌或其盐的溶液的pH调节为4以下。另外，为了提高吡咯并喹啉醌的溶解度，可以调节为1以上。吡咯并喹啉醌或其盐的溶液的pH优选为1～4，更优选为1～3.5，更加优选为2～3.5，进一步优选为2～2.5。为了调节pH，可以使用酸性物质（例如盐酸等）或碱性物质（例如氢氧化钠等）。

作为抗坏血酸类似物，没有特别限制，例如，可以列举抗坏血酸、鼠李糖型抗坏血酸、阿拉伯糖型抗坏血酸、葡萄糖型抗坏血酸、岩藻糖型抗坏血酸、葡庚糖型抗坏血酸、木糖型抗坏血酸、半乳糖型抗坏血酸、古洛糖型抗坏血酸、异抗坏血酸、红抗坏血酸、6－脱氧抗坏血酸等类似于抗坏血酸的物质。也可以是它们的酯体或盐（例如棕榈酸酯、硬脂酸酯、钠盐、钙盐等）。另外，它们也可以是L体（例如L－抗坏血酸、L－抗坏血酸钠等）、D体（例如D－阿拉伯糖型抗坏血酸、D－阿拉伯糖型抗坏血酸钠等）、或者外消旋体。

进一步具体而言，例如，能够列举L－抗坏血酸、L－抗坏血酸棕榈酸酯、L－抗坏血酸硬脂酸酯、D－阿拉伯糖型抗坏血酸等。

在还原型吡咯并喹啉醌的制造中，上述抗坏血酸类似物的任意一种均使用，但若考虑与生成的还原型吡咯并喹啉醌的分离的容易程度等，上述抗坏血酸类似物中，特别优选使用水溶性的物质。从获得容易性、价格等的观点出发，最优选L－抗坏血酸、D－阿拉伯糖型抗坏血酸等的游离体。

本发明中所使用的抗坏血酸类似物，既可以获得市售品，也可以通过公知的方法制造。

本发明中所使用的抗坏血酸类似物，可以以抗坏血酸类似物的状态使用，也可以以抗坏血酸类似物的溶液的状态使用。在以溶液的状态使用抗坏血酸类似物时，可以溶解在水、醇、二甲基亚砜等溶剂中使用，但优选以抗坏血酸类似物的水溶液的状态使用。

抗坏血酸类似物的溶液，例如，可以调制为0.1～500g／l，优选为0.5～100g／l。

在本发明的制造方法中，“将吡咯并喹啉醌或其盐的溶液与抗坏血酸类似物混合，得到含有还原型吡咯并喹啉醌的pH3.5以下的溶液”的工序，只要能够通过使吡咯并喹啉醌或其盐与抗坏血酸类似物在溶剂中反应、将吡咯并喹啉醌还原、从而得到还原型吡咯并喹啉醌即可，例如，既可以将吡咯并喹啉醌或其盐的溶液与抗坏血酸类似物的溶液混合而进行，也可以在吡咯并喹啉醌或其盐的溶液中添加抗坏血酸类似物而进行。

上述工序还包括如下方式：给哺乳类等口服给予含有吡咯并喹啉醌或其盐和抗坏血酸类似物的溶液，使其在生物体内（例如口腔、胃、肠）反应。

在本说明书中，关于“混合”，既可以在一个混合对象物中添加另一个混合对象物而进行，也可以将混合对象物添加到其他容器中进行。

在本申请说明书，关于“添加”，既可以将添加物一下子添加到添加对象中，也可以缓慢添加。

在反应中，抗坏血酸类似物与吡咯并喹啉醌或其盐的摩尔比，考虑到吡咯并喹啉醌或其盐与抗坏血酸类似物以等摩尔反应，可以根据所需要的还原体的含量决定。实际上优选使用相对于PQQ为0.5到1000倍摩尔的抗坏血酸类似物。在分离还原型PQQ时优选为0.9到10倍。当低于该范围时，由于还原体的含量低，所以得不到预期的效果。虽然即使过量添加也没有问题，但若过多则成本增高。

在本发明的制造方法中，吡咯并喹啉醌或其盐与抗坏血酸类似物的摩尔比，在溶剂中可以为1:0.5～1000，优选为1:1.5～1000，更优选为1:1.5～100，更加优选为1:1.5～10。

在本发明的制造方法中，反应温度没有特别限制，例如，可以为-10℃到180℃，优选为0℃到100℃。即使在室温下反应也充分进行。在希望进一步提高反应速度时，优选提高温度，在溶解度的方面，由于高的温度易于溶解，所以为了提高生产率，优选为50℃以上。

在本发明的制造方法中，反应时间没有特别限制，例如可以为0.2到48小时，优选为0.5～24小时。

只要反应进行则使用何种溶剂都没有关系，但优选即使在制品中残留也不会造成大的问题的水溶液。由于在碱性条件下反应难以进行，因此特别优选为pH5以下的水溶液，更优选为4以下。为了调节pH而加入酸或碱来调节没有特别问题，根据需要使用即可。

在本发明的制造方法中，反应没有特别限制，但优选在氧的存在少的环境中进行。为了防止还原型PQQ由于空气中的氧而变为氧化型，可以按照常规方法，在氮、氩等的不活泼气体中进行上述操作。可以通过利用不活泼气体的置换、减压、沸腾或组合这些操作来降低氧化反应。至少适合使用利用不活泼气体的置换、即、使用不活泼气体氛围。作为上述不活泼气体，例如可以列举氮气、氦气、氩气、氢气、二氧化碳等，优选为氮气。

在本发明的制造方法中，使吡咯并喹啉醌或其盐的溶液与抗坏血酸类似物反应得到的溶液（反应液）的pH，既可以通过调节吡咯并喹啉醌或其盐的溶液的pH或抗坏血酸类似物的量以达到pH3.5以下，也可以经过使用酸性物质（例如盐酸等）或碱性物质（例如氢氧化钠等）调节pH的工序以达到pH3.5以下。

得到的溶液的pH可以为3.5以下，优选为3以下，更优选为2.8以下，更加优选为2.6以下。

本发明的制造方法具体可以如下所述实施。

以0.01g/L到15g/L的水溶液浓度准备吡咯并喹啉醌。该浓度作为进行溶解的浓度记载，但高于此时容易变为悬浊状态的反应。通过将抗坏血酸类以粉末或溶液在其中混合的简单的操作反应结束。反应温度通常为0℃到100℃，反应时间依赖于温度，可以为0.2到48小时左右。

此时，要调节pH的话可以添加酸或碱。

在经过反应得到的溶液中，最终析出还原体。得到的析出物为还原型吡咯并喹啉醌。

本说明书中“析出物”是指从液相（溶液）中出现的固相（固体）。

析出物能够从溶液中分离。析出物（析出的还原体）可以通过过滤、离心分离、倾析得到。还可以利用水或醇对其进行清洗。然后可以通过减压干燥进行干燥得到固体。或者也可以不进行这样的分离操作而直接提供。

此外，在要求更纯的物质时可以通过进行重结晶以提高纯度。可以通过使其溶解于二甲基亚砜等良溶剂、降低溶解度的操作，具体而言通过降低温度、添加贫溶剂、进行浓缩的操作进行重结晶。还可以利用柱色谱进行精制。

本发明的还原型吡咯并喹啉醌的制造方法，由于反应在室温附近充分地进行，所以通过以相对于吡咯并喹啉醌或其盐含有0.5到1000倍摩尔的抗坏血酸类似物的组合物提供，可以在即将食用前，在杯子等容器内使其反应，也可以在生物体的口腔、胃、肠中使其反应。

为了即使在室温下反应也能够进行，制作相对于吡咯并喹啉醌或其盐含有0.5到1000倍摩尔的抗坏血酸类似物的组合物，用于上述的目的与本发明的目的一致。该组合物即使是固体、溶液任何形态，在口服给药后，也成为溶液状态进行反应。

根据本发明的制造方法的优选方式，提供一种还原型吡咯并喹啉醌的制造方法，其包括：将pH为2～3.5的吡咯并喹啉醌或其盐的溶液与抗坏血酸类似物或其溶液混合，得到含有还原型吡咯并喹啉醌的pH3以下的溶液的工序。

根据本发明的制造方法的更优选的方式，提供一种还原型吡咯并喹啉醌的制造方法，其包括：将pH为2～2.5的吡咯并喹啉醌或其盐的溶液与抗坏血酸类似物或其溶液混合，得到含有还原型吡咯并喹啉醌的pH2.6以下的溶液的工序。

根据本发明，提供通过本发明的制造方法所制造的还原型吡咯并喹啉醌。

由于还原型吡咯并喹啉醌容易被氧化，所以在分离精制后的保存时，为了防止氧化，需要严格的管理。虽然为了抑制氧化只要放置在还原气氛中即可，但通常的还原剂大多有毒而不能使用。在本发明中，通过制成相对于还原型吡咯并喹啉醌含有抗坏血酸0.5到1000倍摩尔的组合物，能够抑制氧化，即使不进行精制也能够稳定地保存，能够直接提供。这是本发明的制造方法的优点之一。

根据本发明，为了稳定地保存还原型吡咯并喹啉醌，可以将还原型吡咯并喹啉醌以含有抗坏血酸类似物的溶液的形态提供。

在进行分离操作之后，通过添加抗坏血酸类似物也能够生成组合物。该组合物能够以固体、或悬浊液、溶液的状态提供，从反应条件出发能够容易提供的是在水中悬浊状态的组合物。

根据本发明，提供一种还原型吡咯并喹啉醌的稳定化方法。本发明的稳定化方法的特征在于，防止还原型吡咯并喹啉醌被分子氧所氧化。本发明的稳定化方法，通过使还原型吡咯并喹啉醌或其盐与抗坏血酸类似物一同存在于溶剂中，能够使还原型吡咯并喹啉醌稳定化。

在本发明的稳定化方法中，还原型吡咯并喹啉醌与抗坏血酸类似物的摩尔比，在溶剂中为1:0.5～1000，优选为1:1～500。

本发明中得到的还原型吡咯并喹啉醌的给药剂形没有特别限制，可以根据使用用途适当选择。本发明的口服摄取用组合物，作为人用或动物用，能够以食品、功能性食品、医药品或医药部外品（Quasi drug）使用。这里所说的功能性食品是指健康食品、营养辅助食品、营养功能食品、营养保健食品等以维持健康或者代替用餐以补给营养为目的进行摄取的食品。作为具体的形态，可以列举胶囊剂、药片、咀嚼片、锭剂、饮料剂等，但不限定于这些。

在制成功能性食品而制品化时，可以使用食品中所使用的添加剂，例如甜味剂、着色料、防腐剂、增粘稳定剂、抗氧化剂、发色剂、漂白剂、防菌防霉剂、胶基、苦味料、酶、光泽剂、酸味料、调味料、乳化剂、强化剂、制造用剂、香料、香辛料提取物等。一般而言也能够加入通常的食品中，例如味噌、酱油、即食酱汤、汤面、炒面、咖喱、玉米汤、麻婆豆腐、麻婆茄子、意大利面酱、布丁、蛋糕、面包等。

根据本发明，提供用于制造还原型PQQ的组合物。

根据本发明，提供用于制造对于氧化的耐受性强、能够稳定保存的还原型PQQ的组合物。

根据本发明，还提供以下的发明。

（1）一种还原型吡咯并喹啉醌的制造方法，在溶剂中混合吡咯并喹啉醌和抗坏血酸。

（2）根据（1）所记载的制造方法，溶剂为水。

（3）根据（1）或（2）所记载的制造方法，混合液的pH为5以下。

（4）根据（1）～（3）中任一项所记载的制造方法，相对于吡咯并喹啉醌，使用0.5到1000倍摩尔的抗坏血酸。

（5）相对于吡咯并喹啉醌，含有0.5到1000倍摩尔的抗坏血酸的组合物。

（6）根据（5）所记载的组合物，吡咯并喹啉醌为还原型。

实施例

通过实施例和比较例进一步具体地说明本发明，但本发明不仅仅限定于这些例子。另外，只要没有特别说明，本文中的％表示重量％。

在本实施例和比较例中，NMR测定使用JEOL制500MHz NMR、JNM-ECA500谱仪，在室温测定¹³C－NMR。

在本实施例和比较例中，UV测定使用HITACHI U－2000Spectrophotometer进行测定。

还原反应确认实验

实施例1

原料吡咯并喹啉醌二钠使用三菱瓦斯化学株式会社生产的试剂（商品名：Bio PQQ）。L-抗坏血酸使用和光纯药生产的试剂。

将1.53g吡咯并喹啉醌二钠溶解在500g水中，得到0.01mol／l的浓度。将3.51g L－抗坏血酸溶解在100g水中，得到0.2mol／l的浓度。

将0.01mol／l浓度的吡咯并喹啉醌二钠溶液（pH3.5）20g与0.2mol／l浓度的L－抗坏血酸溶液20g混合（pH2.5）。相对于吡咯并喹啉醌1，L－抗坏血酸为20倍的摩尔量。在室温混合这两种溶液，使其在70℃反应2小时（pH2.5）。反应后，固体析出。在该溶液中加入盐酸，使pH为1以下。将其以1000rpm离心分离10分钟，弃去上清，得到固体。将所得到的固体用脱气的盐酸水溶液清洗，利用氮气流进行干燥。在其中加入重二甲基亚砜，在氮气流下装入NMR管中，在室温测定¹³C－NMR。

其结果，为105.7,111.0,119.4,122.9,123.6,128.1,131.3,134.2,137.8,140.9,142.6,162.2,165.5,170.1ppm(DMSO-d6:39.5ppm基准)。

该值与非专利文献5（Eur.J.Biochem.118,395-399(1981)）中记载的还原体一致，确认了还原体的生成。另外，该测定数据中不存在来自醌结构的173.3、178.0ppm的峰。

比较例1

在吡咯并喹啉醌二钠的饱和水溶液中加入盐酸，使pH为1以下。利用过滤器过滤析出的红色固体，得到吡咯并喹啉醌的游离体。在其中加入重二甲基亚砜，装入NMR管中，在室温测定¹³C－NMR。

其结果，为113.5,124.5,126.4,127.6,129.2,134.3.136.3,146.8,148.7,160.9,164.9,168.7,173.3,178.0ppm(DMSO-d6:39.5ppm基准)。与实施例1的峰不同，被还原的PQQ应该存在的峰没有测到。

实施例2

将0.01mol／l浓度的吡咯并喹啉醌二钠溶液（pH3.5）20g和0.2mol／l浓度的L－抗坏血酸溶液10g混合（pH3）。相对于吡咯并喹啉醌1，L－抗坏血酸为10倍的摩尔量。将这两种溶液在室温混合搅拌。颜色立刻改变，固体析出。在室温放置过夜后，用pH试纸测定pH为3。通过离心分离（1000rpm、10分钟）取出固体，进行减压干燥，得到0.073g的不存在氧化体的还原体含水固体。UV谱的分析显示为还原状态。

实施例3

将0.01mol／l浓度的吡咯并喹啉醌二钠溶液（pH3.5）20g和0.2mol／l浓度的L－抗坏血酸溶液5g混合（pH3）。相对于吡咯并喹啉醌1，L－抗坏血酸为5倍的摩尔量。将这两种溶液在室温混合搅拌。颜色立刻改变，固体析出。在室温放置过夜后，用pH试纸测定pH为3。通过离心分离（1000rpm、10分钟）取出固体，进行减压干燥，得到0.044g的还原体固体。分离粗收率为66％。

实施例4

将0.001mol／l浓度的吡咯并喹啉醌二钠溶液（pH3.5）20g和0.2mol／l浓度的L-抗坏血酸溶液10g混合（pH2）。相对于吡咯并喹啉醌1，L－抗坏血酸为100倍的摩尔量。将这两种溶液在室温混合搅拌。颜色立刻改变，固体析出。在室温放置过夜后，用pH试纸测定pH为2。通过离心分离（1000rpm、10分钟）取出固体，进行减压干燥，得到0.006g的还原体固体。

实施例5

将0.01mol／l浓度的吡咯并喹啉醌二钠溶液（pH3.5）0.5g和0.5mol／l浓度的L－抗坏血酸钠溶液0.5g混合。此时的pH为6－7。相对于吡咯并喹啉醌1，L－抗坏血酸为50倍的摩尔量。将这两种溶液在室温混合，将该混合溶液添加在人工胃液10ml中（pH1.2）。在室温放置过夜，还原体的固体析出。通过制成酸性条件，反应变得易于进行。另外，可以认为即使在生物体内也可以被还原。

实施例6

将0.01mol／l浓度的吡咯并喹啉醌二钠溶液（pH3.5）1g和0.011mol／l浓度的L－抗坏血酸溶液1g混合（pH2.5）。此时的摩尔比为1:1.1。通过在30℃反应8天（pH2.5），82％的PQQ发生反应，能够得到还原体含有物。

比较例2

将0.01mol／l浓度的吡咯并喹啉醌二钠溶液0.5g和0.5mol／l浓度的L－抗坏血酸钠溶液0.5g在室温混合。此时的pH为6－7。相对于吡咯并喹啉醌1，L－抗坏血酸为50倍的摩尔量。将混合液在室温放置3天，在溶液中没有变化（pH7），未得到还原体。

保存试验

实施例7

将1.53g吡咯并喹啉醌二钠溶解在500g水中，得到0.01mol／l的浓度。将3.51g L－抗坏血酸溶解在100g水中，得到0.2mol／l的浓度。

将上述的0.01mol／l浓度的吡咯并喹啉醌二钠溶液（pH3.5）20g和0.2mol／l浓度的L－抗坏血酸溶液20g在室温混合。相对于吡咯并喹啉醌1，L－抗坏血酸为20倍的摩尔量。用pH试纸测定，结果pH为2。使该混合溶液在室温反应一晩（pH2）。反应后，还原体固体析出。在该状态下，考虑到还原反应中所使用的量和被空气氧化的量，L-抗坏血酸存在15倍摩尔。然后，在室温保存1周，维持还原状态。

比较例3

将在实施例6中得到的还原体固体通过离心分离取出，弃去上清，用水清洗。通过该处理，除去了L－抗坏血酸。在其中加入氢氧化钠水溶液达到pH7。30分钟后全部变化为氧化体。

实施例8

将0.01mol／l浓度的吡咯并喹啉醌二钠溶液（pH3.5）1g和0.014mol／l浓度的L－抗坏血酸溶液1g混合。将该混合液1g加入15ml的容器中，使其与空气接触，结果含有14％的氧化型PQQ（pH3）。将该含有氧化型的还原型PQQ在30℃放置1周，含有18％的氧化型PQQ。

pH条件确认试验

实施例9

将吡咯并喹啉醌二钠溶解在水中，调节为2g／l。使用盐酸和NaOH，将水溶液的pH调节为pH1以下。另外，将L－抗坏血酸溶解在水中，调节为4g／l。

将上述2种水溶液各0.5ml在1.5m容器中混合，在室温使其反应24小时。反应后的pH为1。然后，对于得到的混合液进行离心分离（1000rpm、10分钟），弃去上清，得到固体。将得到的固体用约9％的盐酸清洗，溶解在二甲基亚砜中，通过UV测定算出还原体收率，结果为68％。

实施例10

将吡咯并喹啉醌二钠溶解在水中，调节为2g／l。使用盐酸和NaOH，将水溶液的pH调节为pH2.2。另外，将L－抗坏血酸溶解在水中，调节为4g／l。

将上述2种水溶液各0.5ml在1.5m容器中混合，在室温使其反应24小时。反应后的pH为2.6。然后，对于得到的混合液进行离心分离（1000rpm、10分钟），弃去上清，得到固体。将得到的固体用约9％的盐酸清洗，溶解在二甲基亚砜中，通过UV测定算出还原体收率，结果为100％。

实施例11

将吡咯并喹啉醌二钠溶解在水中，调节为2g／l。使用盐酸和NaOH，将水溶液的pH调节为pH2.6。另外，将L-抗坏血酸溶解在水中，调节为4g／l。

将上述2种水溶液各0.5ml在1.5m容器中混合，在室温使其反应24小时。反应后的pH为3。然后，对于得到的混合液进行离心分离（1000rpm、10分钟），弃去上清，得到固体。将得到的固体用约9％的盐酸清洗，溶解在二甲基亚砜中，通过UV测定算出还原体收率，结果为66％。

实施例12

将吡咯并喹啉醌二钠溶解在水中，调节为2g／l。使用盐酸和NaOH，将水溶液的pH调节为pH3.5。另外，将L－抗坏血酸溶解在水中，调节为4g／l。

将上述2种水溶液各0.5ml在1.5m容器中混合，在室温使其反应24小时。反应后的pH为3.5。再加入100μl浓盐酸使pH为1。然后，对于得到的混合液进行离心分离（1000rpm、10分钟），弃去上清，得到固体。将得到的固体用约9％的盐酸清洗，溶解在二甲基亚砜中，通过UV测定算出还原体收率，结果为54％。

比较例4

将吡咯并喹啉醌二钠溶解在水中，调节为2g／l。使用盐酸和NaOH，将水溶液的pH调节为pH4.3。另外，将L－抗坏血酸溶解在水中，调节为4g／l。

将上述2种水溶液各0.5ml在1.5m容器中混合，在室温使其反应24小时。反应后的pH为3.5。然后，对于得到的混合液进行离心分离（1000rpm、10分钟），弃去上清，得到固体。将得到的固体用约9％的盐酸清洗，溶解在二甲基亚砜中，通过UV测定算出还原体收率，结果为1％。

比较例5

将吡咯并喹啉醌二钠溶解在水中，调节为2g／l。使用盐酸和NaOH，将水溶液的pH调节为pH7.6。另外，将L－抗坏血酸溶解在水中，调节为4g／l。

将上述2种水溶液各0.5ml在1.5m容器中混合，在室温使其反应24小时。反应后的pH为3.5。然后，对于得到的混合液进行离心分离（1000rpm、10分钟），弃去上清，得到固体。将得到的固体用约9％的盐酸清洗，溶解在二甲基亚砜中，通过UV测定算出还原体收率，结果为9％。

Claims (4)

1.一种还原型吡咯并喹啉醌的制造方法，其特征在于，包括：

将调节为pH 2～2.5的吡咯并喹啉醌或其盐的溶液与抗坏血酸类似物混合，得到含有还原型吡咯并喹啉醌的pH 2.6以下的溶液的工序，

所述抗坏血酸类似物选自抗坏血酸、鼠李糖型抗坏血酸、阿拉伯糖型抗坏血酸、葡萄糖型抗坏血酸、岩藻糖型抗坏血酸、葡庚糖型抗坏血酸、木糖型抗坏血酸、半乳糖型抗坏血酸、古洛糖型抗坏血酸、异抗坏血酸、红抗坏血酸、6－脱氧抗坏血酸、以及它们的酯体和盐。

2.如权利要求1所述的制造方法，其特征在于：

吡咯并喹啉醌或其盐的溶液为水溶液。

3.如权利要求1所述的制造方法，其特征在于：

吡咯并喹啉醌或其盐与抗坏血酸类似物的摩尔比为1:0.5～1000。

4.如权利要求1所述的制造方法，其特征在于：

还包括从溶液中分离还原型吡咯并喹啉醌的工序。