CN102802405A - 原位核酸短暂表达的一种方法 - Google Patents

Abstract

列出在一种植物中短暂表达蛋白的组成和方法。组成包括表达一种蛋白的植物、种子、植物组织和植物部分，其中这种蛋白是短暂表达的，且就定性和定量数据来说，该蛋白的短暂表达可用作所述蛋白在稳定转基因植物中如何表达的预测模型。这种预测模型可用于(但不限于)：启动子评价，最佳功能表达盒构建(如加入增强子或基因沉默抑制子)的评价，表达异源基因(如点突变、靶向)最佳方式的评价，内源基因敲除的快速评价，蛋白表达水平的评价，细胞靶向，组织靶向，转录增强子，转译增强子蛋白毒性，代谢概况。将进一步列出关于应用的方法。

Description

原位核酸短暂表达的一种方法

对相关申请的交叉参考

下述申请声明优先于美国临时申请第61/186025号(于2009年6月11日归档)的利益。

本发明的领域

本发明一般涉及转基因植物。更具体地说，本发明涉及在植物中表达转基因的方法和组成。

本发明的背景

分子生物学的进步增强了科学家处理动物和植物基因组的能力。控制植物和动物分子过程各个方面的基因，可以从这些相应生物的基因组中鉴别和分离出来。例如，可以从各种生物分离出赋予抗生素耐药性、除草剂耐药性、抗虫性或抗旱性的基因。更重要的是，获得了从一种生物分离一个基因并将所述基因引入另一种生物(异源转化)的能力。即使接受生物是与从其获得基因的生物属于不同的门、属或种，这种结合也可能完成。

一般说来，植物转化依赖于植物中外来基因传递和表达的两种方法：稳定的遗传转化和短暂表达。已采用若干基因工程技术，把需要的特征稳定引入植物基因组中。引入这些需要的特征是通过诸如下述方法完成的：土壤杆菌属(Agrobacterium)感染(Nester等，1984)，聚乙二醇(PEG)-介导的DNA摄取(Lorz等，1985)，原生质体的电穿孔(Fromm等，1986)，微粒轰击(Klein等，1987)。目前，可以采用前述方法或其变异方法，稳定地常规转化许多植物种类(欲知综述内容，请参见下述文献：Christou等，1996，TrendsPlant Sci[植物科学趋势].1，423-431)。植物短暂表达可以通过土壤杆菌浸润法、粒子轰击法或病毒感染法(欲知综述内容，请参见下述文献：Fischer等，1999：Biotechnol.Appl.Biochem.[生物化学与应用生化学]，30，113-116)。

核酸的短暂表达具有较大的前景，可以作为预测某个基因、启动子或其它元件在一种稳定转基因植物中如何发挥功能的一种方法。原位(in planta)分析法的开发，可以在植物中进行异源基因快速评价的短暂表达是非常可取的。一个稳定转基因植物系的传统建立和表征涉及一个较长的过程，常常需要两年以上时间。拥有一种快速的短暂表达分析法或许是理想的，可以快速评价一个表达盒或其有关元件(即启动子、基因、增强子)在稳定植物系中是如何发挥功能的。例如，具有这样的一种短暂表达分析法可能是理想的，其中技术人员可以通过采用短暂数据快速关联在稳定植物系中要采用的最佳表达方法(即细胞靶向、增强子组合、启动子选择等)。这种方法也可能用于快速鉴别表达问题，如蛋白切割、组织毒性、不利的表型、以及可以鉴别的其它问题，以后才投入时间和资源在稳定植物系中表达候选基因。短暂表达可以采用标准表达盒通过土壤杆菌浸润植物组织而完成，这是在一个组成型启动子控制下进行的；组成型启动子如35S启动子，可以驱动重要基因的表达(Vaquero等，1999：Proc.Natl.Acad.Sci.US(美国国家科学院院刊)，96，11128-11133)。采用土壤杆菌浸润法进行重要基因短暂表达的一个优点是，该方法可以获得非常低的蛋白表达水平。较低的蛋白表达使之难于关联某一个基因或表达盒原位(in planta)如何发挥功能。人们已发现，在土壤杆菌浸润法中纳入使抑制子沉默的转录后基因，如p19或HcPro，可以使短暂表达蛋白升高50倍(Voinnet等，2003：Plant J.(植物杂志)，33，549-556)。虽然蛋白的短暂表达水平是更高的，但是土壤杆菌浸润后的短暂表达采用转录后基因沉默抑制子，在一些情况下可能与蛋白表达不一致，并不是在所有情况下都能预测在稳定植物一个既定基因或表达盒如何发挥功能。也可以使用病毒载体短暂表达重要的蛋白。病毒载体能克服产生较高短暂表达水平的问题(欲知综述内容，请参见下述文献：Porta和Lomonossoff，1996：Mol.Biotechnol.[分子生物学杂志]，5，209-221；Yusibov等1999：Curr.Top.Microbiol.Immunol.[微生物学和免疫学最新主题]，240 81-94)。但是，病毒载体用于植物中短暂表达蛋白，就它们的最佳功能以及基因大小限制来说受限于较窄的宿主范围。还有一个问题，即还没有鉴别出任何一种短暂表达分析法能在众多植物种类之间一致性地发挥作用。在短暂表达中，短暂表达数据可用作一个基因或表达盒可能在稳定植物系中如何发挥功能的预测性指标；大多数植物的短暂表达都是这种方式，而单子叶植物是特别难于以这种方式一致性短暂表达重要基因的一组植物。可以在谷类作物(如玉米或小麦)、糖用甜菜、大豆、水稻以及其它商业重要作物中发挥作用的、原位(inplanta)分析法中的短暂表达，是特别重要的。

本发明的总结

列出在一种植物中短暂表达蛋白的组成和方法。组成包括表达一种蛋白的植物、种子、植物组织和植物部分，其中这种蛋白是短暂表达的，且就定性和定量数据来说，该蛋白的短暂表达可用作所述蛋白在稳定转基因植物中如何表达的预测模型。这种预测模型可用于(但不限于)：启动子评价，最佳功能表达盒构建(如加入增强子或基因沉默抑制子)的评价，表达异源基因(如点突变、靶向)最佳方式的评价，内源基因敲除的快速评价，蛋白表达水平的评价，细胞靶向，组织靶向，转录增强子，转译增强子蛋白毒性，代谢概况。将进一步列出关于应用的方法。

关于包括本文件所述方法的短暂表达分析法的下游应用，包括农业应用、制药业应用和工业应用，例如人类食物、动物饲料、生物燃料、工业酒精、发酵原料以及诸如此类。

根据后面的说明，将会更好地理解本发明的这些特点和其它特点、对象和优点。优先实施例的说明，要旨不是限制本发明覆盖所有改良方法、相当方法和替代方法。因此，为解释本发明的范围，应对本文件中列出的权利要求作出引用。

定义

需要理解的是，本发明并不限于如其所述的特定的方法、方案、细胞系、植物种或植物属、构建体、以及试剂。也要理解的是，本文件中所用的术语只是用于说明特定实施例的目的，要旨并不是要限制本发明的范围。如本文件所用，单数形式“一(a)”、“和(and)”和“这个(the)”包括复数引用，除非本文件内容明确指明其它。因此，例如，引用“一个载体”是引用一个或多个载体，并包括其中对熟悉这项技术的人员来说已知的其相当物。

本文件中所用的术语“大约(about)”，意思是“大约”、“粗略”、“约略”或“在其范围中”。当这个术语“大约(about)”与一个数字范围一起使用时，它修饰这个范围，使这个范围的边界扩展到所设定数字之上和之下的范围。一般说来，本文件中所用的术语“大约(about)”是修饰所声明值之上或之下的数字值，方差为20％。

如本文件所用，词语“或(or)”意思是一个特定列表的任何一个成员，也包括该列表中成员的任何组合。

“反义抑制”是指能够抑制目标蛋白从一个内源基因或转基因表达的反义RNA转录物产生。

“顺式作用元件”是顺式作用转录调控作用元件，它赋予基因表达总体控制一个方面。一个顺式作用元件可起着结合转录因子的作用，反式作用于调控转录的蛋白因子。一些顺式作用元件能结合一个以上的转录因子，转录因子可以不同的亲和力与一个以上的顺式作用元件发生相互作用。顺式作用元件可以采用若干技术鉴别，包括：删除分析，即从5′-端或一个启动子的内侧删除一个或多个核苷酸；DNA结合蛋白分析，采用DNA酶I足迹技术；甲基化干扰；电泳迁移率-变动分析；体外基因组足迹技术，采用结合介导PCR，及其它传统分析法；或DNA序列相似性分析法加已知的顺式作用元件基序，采用传统的DNA序列比较法。顺式作用元件的精细结构，可以采用一个或多个核苷酸的突变发生(或取代)作进一步研究，或采用其它传统方法作进一步研究。顺式作用元件可以采用化学合成法获得，或通过从含有此类元件的启动子分离获得；它们可以采用包含有用限制性内切酶位点的其它侧翼区核苷酸合成，以方便进行子序列处理。

“嵌合”用于指明，一个DNA序列如一个载体或一个基因，是由不同来源的下述两个或多个DNA序列构成的：这些序列是采用重组DNA技术融合在一起形成的一个DNA序列，所形成的这个序列不是天然发生的序列。

“染色体结合的”是指一个外源基因或DNA构建体以共价键结合于宿主DNA中。如果基因不是“染色体结合的”，则他们可能是“短暂表达的”。一个基因的短暂表达是指结合于宿主染色体但能独立发挥功能的一个基因的表达，或为一个自主复制质粒或表达盒的一部分，或例如为另一个生物系统如病毒的一部分。

“编码序列”是指一个DNA或RNA序列，它能编码特定的氨基酸序列并排除非编码序列。它可能构成一个“不间断编码序列”，即缺乏一个内含子(如在一个cDNA中的内含子)，或它可能包括由适当的剪接点结合在一起的一个或多个内含子。一个“内含子”是包含在初级转录物中的一个RNA序列，但它是通过细胞内RNA的切断和再连接、或剪接而移除的，以生成可以转译成一种蛋白的成熟mRNA。

“组成型启动子”是指能够表达一个基因的一个启动子，从而产生这个基因的“组成型表达”，这个基因在植物的所有或几乎所有发育阶段期间控制所有或几乎所有植物组织。

“协同抑制”和“有义抑制”是指能够抑制相同或大致相同的转基因或内源基因表达的有义RNA转录物产生。

本文件中所用的“邻接”，意思是或前或后的、相互间紧邻在一起的核酸序列。

“表达”是指mRNA的转录和稳定累积。表达可能也指蛋白的产生。

如在本文件中所用的“表达盒”，意思是在相应宿主细胞中能指导特定核苷酸序列表达的一个DNA序列，包括可操作连接到重要核苷酸序列的启动子，而此核苷酸序列可操作连接到终止信号。它也典型地包含核苷酸序列正确转译所需要的序列。编码区域通常编码重要蛋白，但也可能编码重要的功能性RNA，例如在有义或反义方向的反义RNA或非转译RNA。含有重要核苷酸序列的表达盒可能是嵌合基因，意味着它的至少一个成分对它的至少一个其它构件来说是异源性的。

一个启动子(有或没有一个增强子)的“表达模式”是表示这个启动子在植物中哪个地方和在哪个发育阶段开始转录的表达模式。当一个启动子的表达模式与其它启动子的表达模式几乎没有表现重叠时，则认为一组启动子的各种表达模式是互补的。

“基因”是指表达mRNA、功能性RNA或特殊蛋白的核酸片段，包括调控序列。术语“本地基因”是指天然发现的一个基因。术语“嵌合基因”是指含有下述序列部分的任何基因：1)不是天然的DNA序列，包括调控序列或编码序列；2)编码不是天然邻接的蛋白部分的序列；或3)编码不是天然邻接的启动子的部分。因此，嵌合基因可能包含从不同来源获得的调控基因和编码基因，或包含从相同来源获得的调控基因和编码基因，但其排列方式与天然发现的排列方式不同。一个“转基因”是指通过转化过程已经引入基因组中的、能稳定维持存在的基因。例如，转基因可能包括对要转化的特定植物基因来说属异源性或同源性的基因。此外，转基因可能包含已插入非本地生物的内源基因，或包含嵌合基因。术语“内源基因”是指在一种生物的基因组中的、在其天然地区的本地基因。一个“外源基因”是指在宿主生物中通常没有发现的、但通过基因转移引入该生物的一个基因。

一个“分离的”核酸序列大体上是从其它核酸序列分离或纯化出来的，这个核酸与其它核酸序列在这种生物的细胞中常规是相关的，且在这种生物中这个核酸是天然发生的，即其它染色体或染色体外DNA。这个术语涵盖以生化方法纯化以便除去污染性核酸和其它细胞组分后的核酸。这个术语也包括重组核酸和化学合成的核酸。如本文件中所用的术语“大体上纯化”，是指从其它分子分离出来的一种分子，其它分子与这个分子在其本地状态是常规相关的。更好的情况是，一个大体上纯化分子是在一种制剂中存在的优势品种。一个大体上纯化分子可能是与天然混合物中存在的其它分子(不包含溶剂)为60％以上游离，优先75％游离，90％游离更好。术语“大体上纯化”目的不是涵盖它们本地状态中存在的分子。

一个“合成核酸分子序列”，可以针对特定宿主细胞中的增强表达和为克隆于适当构建体的目的进行设计和化学合成。宿主细胞常常显示密码子用法的优先模式(Murray等，1989)。因此，在特定宿主中设计用于增强表达的合成DNA，应反映这种宿主细胞中密码子用法的模式。针对这些目的提供了计算机程序，包括但不限于：Vector NTI高级软件包发布版10.0，Invitrogen，Carlsbad California(美国加利福尼亚州卡尔斯)。

“基因沉默”是指病毒基因、转基因或内源核基因的同源依赖性抑制。基因沉默可能是转录性的(当抑制是由于受影响基因引起的)或转录后的(当抑制是由于与受影响基因同源的RNA种类代谢增加[变性]引起的)(English等，1996：Plant Cell[植物细胞]，8：179-1881)。基因沉默包括病毒诱导的基因沉默(Ruiz等，1998：Plant Cell[植物细胞]，10：937-946)。

“遗传稳定的”和“可遗传的”，是指染色体结合遗传元件可在植物中稳定维持存在，且通过连续世代由后代稳定遗传。

“异源DNA序列”是指与宿主细胞天然无关的、引入宿主细胞中的一种DNA序列，包括一个天然发生DNA序列的多个非天然发生的拷贝。

“诱导型启动子”是指可由一种外部刺激在一种或几种细胞类型中启动的那些受控启动子；外部刺激包括化学品、光、激素、应力或病原体等。

“杀昆虫的”定义为能够控制昆虫(优先通过杀死昆虫)的毒性生物活性。

“5′-端非编码序列”是指定位于编码序列5′-端(上游)的一个核苷酸序列。它存在于起始密码子的完全加工mRNA上游，可能影响初级转录物至mRNA的加工、mRNA稳定性或转译效率(Turner等，1995：Molecular Biotechnology(分子生物技术)，3：225)。

“3′-端非编码序列”是指位于一个编码序列3′-端(下游)的核苷酸序列，包括聚腺苷酸化识别序列、以及编码能影响mRNA加工或基因表达的调控信号的其它序列。聚腺苷酸化信号通常是通过影响聚腺苷酸轨道加到mRNA前体蛋白的3′-端进行表征的。不同的3′-端非编码序列的运用，是由下述作者例证的：Ingelbrecht等(1989)：Plant Cell(植物细胞)，1：671-680)。

术语“核酸”是指高分子量的多聚核苷酸，它可能是单链的或双链的，它由单体(核苷酸)组成；单体含有一个蔗糖、磷酸根和一个碱基，碱基是嘌呤或嘧啶。一个“核酸片段”是指一个既定核酸分子的一部分。在高等植物中，脱氧核糖核酸(DNA)是遗传物质，而核糖核酸(RNA)涉及把DNA中所含信息转移到蛋白中。一个“基因组”是一种微生物每个细胞中所含的全部遗传物质。术语“核苷酸序列”是指DNA或RNA聚合物，它可能是单链的或双链的，可选含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基，这些核苷酸碱基能结合于DNA或RNA聚合物中。

术语“开放阅读框架(ORF)”是指在一个编码序列的转译起始密码子和终止密码子之间编码的氨基酸序列。术语“起始密码子”和“终止密码子”是指，在分别界定蛋白合成(mRNA转译)的起始和链终止的一个编码序列中三个相邻核苷酸的一个单位(‘密码子’)。

“可操作连接”和“操作性连接”是指在一个单独核酸片段上核酸序列的结合，以使一个片段的功能可为另一个片段所影响。例如，一个启动子与一个编码序列或功能性RNA是可操作连接的，当这个启动子能够影响该编码序列或功能性RNA的表达时(即该编码序列或功能性RNA是在这个启动子的转录控制之下)。在有义方向或反义方向的编码序列，可操作连接到调控序列上。

“过度表达”是指在转基因生物中的表达水平超过在正常生物或未转化生物中的表达水平。

“植物组织”包括已分化和未分化组织或植物，包括(但不限于)根部、茎干、幼芽、叶、花粉、种子、肿瘤组织、各种形式的细胞和培养物(如单细胞、原生质体、胚胎和愈伤组织)。植物组织可能位于植物中或位于器官、组织功细胞培养物中。

“优先表达”、“优先转录”或“优先转录”是可交替使用的，是指基因产物的表达，这些基因产物在一个或几个植物发育阶段(空间限制)中以更高的水平优先表达，和/或对一个或几个植物发育阶段(时间限制)以更高的水平优先表达、同时在其它组织/发育阶段中有相对较低的表达水平。

“一级转化体”和“T0代”是指与初始转化组织具有相同遗传代的转基因植物(即自转化以来已经过减数分裂和受精)。“二级转化体”和“T1、T2、T3等代”是指通过一个或多个减数分裂和受精周期后从一级转化体获得的转基因植物。它们是通过一级转化体或次级转化体、或一级或次级转化体与其它转化或未转化植物的交叉杂交获得的。

术语“蛋白”、“肽”和“多肽”在本文件中是可交替使用的。

“启动子”或“转录调控核苷酸序列”是指这样一个核苷酸序列，它通过提供RNA聚合酶的识别和正确转录所需要的其它因素而控制一个编码序列的表达。“启动子调控序列”可以包含近端和多个远端上游元件和/或下游元件。启动子调控序列可影响转录、RNA加工或稳定性、或有关编码序列的转译。调控序列包括增强子、非转译前导序列、内含子、外显子和聚腺苷酸化信号序列。它们包括天然序列和合成序列、以及可能是合成序列和天然序列的组合序列。一个“增强子”是能刺激启动子活性的核苷酸序列，可能是启动子的一个固有元件，或是插入的一个异源基因(目的是增强启动子的水平或组织特异性)。这个一级序列可能存在于一个双链DNA分子的任何一条链上；即使位于启动子上游或下游，它都能发挥功能作用。术语“启动子”的意思涵盖“启动子调控序列”。

在本文件中所用的“参考序列”定义为用作序列比较依据的一个序列。一个参考序列可能是一个指定序列的一个子集或其整体；例如，可能是一个完整长度cDNA或基因序列的一个片段，或是这个完整长度的cDNA或基因序列。

“受控启动子”是指指导基因表达的启动子，这种指导是非组成型的、但是以时间和/空间调控方式进行的，包括组织特异性启动子和诱导型启动子二者。它包括天然序列和合成序列、以及可能是合成序列和天然序列的组合序列。不同的启动子可能在不同的组织或细胞类型中指导一个基因的表达，或在不同的发育阶段或响应环境条件而指导一个基因的表达。

“调控序列”和“适当的调控序列”各指位于一个编码序列上游(5′-端非编码序列)、在一个编码序列之内或在一个编码序列下游(3′-端非编码序列)的核苷酸序列，且能影响有关编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或转译。调控序列包括增强子、转译增强子序列、内含子和聚腺苷酸化信号序列。它们包括天然序列和合成序列、以及可能是合成序列和天然序列的组合序列。

术语“RNA转录物”是指从RNA聚合酶催化的DNA序列转录获得的产物。当这种RNA转录物是这个DNA序列的完整互补拷贝时，它优先用作一级转录物，或它可能是通过一级转录物的转录后加工获得的一个RNA序列并优先用作成熟RNA。“信使RNA(mRNA)”是指没有内含子的RNA，它可由细胞转译成蛋白。“CDNA”是指与mRNA互补的单或双链DNA，是从mRNA获得的。一个“功能性RNA”是指一个反义RNA、核酶或其它RNA，它不是转译的，但它作为一个RNA参与反应或过程。

“内含子”是指DNA的一个介入部分，它几乎只在真核基因中发生，但它在基因产物中不是转译成氨基酸序列的。内含子是通过叫做“剪接”的过程从未成熟mRNA移除的，它与外显子连接在一起形成mRNA。为目前披露的主题的目的，术语“内含子”的定义包括对从一个目标基因所得内含子的核苷酸序列的改良。

“外显子”是指携带某一种蛋白或其部分的编码序列的DNA部分。外显子是由非编码性介入序列(内含子)间隔开的。为目前已披露的主题的目的，术语“外含子”的定义包括对从一个目标基因所得外含子的核苷酸序列的改良。

一个“可选择的标记基因”是指这样一个基因，这个基因在一种植物细胞中的表达能使这种细胞获得一种选择性的优点。采用这种可选择的标记基因转化的细胞所具有的优点，可能是由于他们在一种选择性消极药物存在(如一种抗生素或一种除草剂)时生长的能力(与非转化细胞的生长能力比较)所引起的。由这种转化细胞具有的这种选择性优点，也可能是由于它们利用附加化合物作为营养、生长因子或能量来源的能力增强(相对于非转化细胞来说)引起的。由一种转化细胞具有的选择性优点也可能是由于以前具有的基因损失引起的，其中这种已有基因损失的情况叫做“消极选择”。在这种情况下，加入一种只有没有损失特异性基因(一种可选择的消极标记基因，这种特异基因只存在于母体细胞中，典型地是一个转基因)的细胞有毒性的化合物。

“特异性表达”是基于产物的表达，这种基因产物仅限于一种或几种植物组织(空间限制)和/或一种或几个植物发育阶段(时间限制)。

大体上相同：在两个核酸或蛋白序列的情况下，术语“大体上相同”是指两个或多个序列或子序列，当针对最大一致性进行比较和分配时，具有至少60％(优先80％、90％更好、95％甚至更好、至少99％最好)的核苷酸或氨基酸残基一致性，如采用下述序列比较算法之一或采用肉眼检查法进行测定。优先在长度至少约50个残基的序列的区域上存在大体一致性，在至少约100个残基的区域上存在大体一致性更好，在至少约150个残基的区域上存在大体一致性最好。在一种特别优先的实施例中，这些序列在编码区域的整个长度大体上相同。此外，大体上相同的核酸或蛋白序列，大体上发挥相同的功能。

对序列比较，典型的情况是一个序列用作参考序列，把试验序列与之进行比较。当使用序列比较算法时，把试验序列和参考序列输入电脑中，必要时指定子序列的坐标，并指定序列算法程序参数。然后，根据指定的程序参数，这个序列比较算法计算试验序列相对于参考序列的百分率序列一致性。对本门技术熟练的人员理解，要避免由于纳入多聚核苷酸序列中间隙引起的、与参考序列的较高相似性，典型地要引入间隙罚分并从匹配数字中减去之。

关于比较，可以进行序列的最佳比对，例如采用下述方法进行：局部同源性算法，Smith和Waterman，1981：Adv.Appl.Math.(应用数学进展)，2：482)；同源性比对算法，Needleman和Wunsch，1970：J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)，48：443；相似性方法搜索，Pearson和Lipman，1988：Proc.Nat′l.Acad.Sci.(美国国家科学院院刊)，85：2444；关于这些算法的计算机化实施(GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Wisconsin遗传学软件包，Genetics ComputerGroup[遗传学计算机集团公司]，575 Science Dr.，Madison，WI)；或采用肉眼检查法(一般观察，Ausubel等infra)。

适用于确定百分率序列一致性和序列相似性的一种算法的实例是BLAST算法，这种算法在下述文献中说明：Altschul等，1990：J.Mol.Biol[分子生物学杂志]，215：403-410。执行BLAST分析的软件是通过美国国家生物技术信息中心公布的。这种算法涉及首先鉴别高评分序列对(HSP)，即通过鉴别查询序列中长度W的较短词语进行：当与一个数据库序列中相同长度的一个词语比对时，这些较短的词语或匹配或满足一些正值阈值评分T。T叫做相邻词语评分阈值(Altschul等，1990)。这些初始相邻词语命中，起着种子的作用，以便开始搜索以寻找含HSP的更长序列。然后，这些词语命中，沿每个序列在两个方向延伸至累积比对评分可能增加的那个长度。对核苷酸序列，累积评分是采用参数M(一对匹配残基的奖赏评分，总是＞0)和N(错误匹配残基的罚分，总是＜0)计算的。对氨基酸序列，采用一个评分矩阵来计算累积评分。在下述情况下，则词语命中在每个方向的延伸停止：累积比对评分与它的最大获得值偏离数量X时；由于一个或多个负值评分残基比对，导致累积评分变为0或以下；或达到任何一个序列的末端。BLAST的算法参数W、T和X决定了比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)采用的默认值如下：词语长度(W)11，预期(E)10，截止值100，M＝5，N＝-4，以及双链比较。对氨基酸序列，BLASTP程序采用的默认值如下：词语长度(W)3，预期(E)10，BLOSUM62评分矩阵(请参见Henikoff和Henikoff，1989：Proc.Natl.Acad.Sci.[美国国家科学院院刊]，89：10915)。

除计算百分率序列一致性外，BLAST算法也进行两个序列之间相似性的统计分析(请参见，例如Karlin和Altschul：Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]，90：5873-5787(1993))。由BLAST算法提供的一个相似性指标是最小总和概率(P(N))，这个指标是两个核苷酸序列或两个氨基酸序列之间可能偶然发生的匹配的概率指征。例如，一个试验核酸序列被认为与一个参考序列是相似的，如果在试验核酸序列与参考核酸序列的比较中最小总和概率小于约0.1，小于约0.01更好，小于约0.001最好。

针对本发明的目的，本文件中所披露的、确定启动子序列百分率序列一致性的核苷酸序列比较，优先采用BLASTN程序(版本1.4.7或更新版)在其默认参数下进行，或采用任何相当的程序进行。任何序列比较程序目的是采用“相当的程序”进行，其中对存疑的任何两个序列，当与这个优先程序产生的相应比较进行比较时，这个程序能产生具有相同核苷酸或氨基酸残基匹配的一个比对和一个相同百分率序列一致性。

两个核酸序列大体上相同的另一个指征是，这两个分子在严格的杂交条件下互相杂交。短语“特异性杂交”是指在严格的杂交条件下，一个分子只结合、复制或杂交到一个特定的核苷酸序列上，当这个序列存在于一种DNA或RNA的复合混合物(如总细胞)中时。“大体上结合”是指在一个探针核酸和一个靶标核酸之间的互补杂交，包含较少的错误匹配，这种情况可以通过减少杂交介质的严紧性加以调节，以便对靶标核酸进行需要的检测。

在核酸杂交实验(如Southern和Northern杂交)中，“严格杂交条件”和“严格杂交洗涤条件”是依赖于序列的，在不同的实验参数下是不同的。更长的序列要在更高的温度下进行特异性杂交。关于核酸杂交的广泛指南列在下述文献中：Tijssen(1993)生物化学和分子生物学的实验室技术-采用核酸探针进行杂交，第I部分第2章，“杂交的原则概述和核酸探针分析法的策略”，Elsevier，New York。一般情况下，对在规定离子强度和pH条件下的特定序列，所选择的高严紧性杂交和洗涤条件约为比热熔点(Tm)低约5℃。典型的情况是，在高严紧性条件下，一个探针将杂交到它的靶标子序列上，但不会杂交到任何其它序列上。

T_m是50％靶标序列杂交到一个完美匹配探针上的温度(在规定的离子强度和pH条件下)。选择非常高严紧性条件为等于一个特定探针的T_m。对在Southern或Northern印迹膜上有100个互补残基以上的互补核酸，其杂交的高严紧性杂交条件的一个实例是：50％甲酰胺+肝素1mg，在42℃下进行，杂交过夜进行。非常高严紧性洗涤条件的一个实例是：0.15M氯化钠，在72℃下进行，持续约15分钟。高严紧性洗涤条件的一个实例是0.2xSSC洗涤，在65℃下进行，持续15分钟(请参见Sambrook，infra，了解SSC缓冲液的说明)。高严紧性洗涤常常在低严紧性洗涤之后进行，以除去背景探针信号。对例如100个核苷酸以上的双链体，中严紧性洗涤的一个实例是，1xSSC，在45℃下进行，持续15分钟。对例如100个核苷酸以上的双链体，低严紧性洗涤的一个实例是，4-6xSSC，在40℃下进行，持续15分钟。对较短的探针(如约为10-50个核苷酸)，高严紧性条件典型地涉及小于约1.0M Na离子盐浓度，典型为约0.01-1.0M Na离子浓度(或其它盐)，pH 7.0-8.3，温度温度为至少约30℃。通过加入去稳定剂甲酰胺，也可以达到高严紧性条件。一般说来，在一个特定杂交分析法中，对一个无关探针，信噪比为观察值的2x(或以上)，则表明检测到特异性杂交。在高严紧性条件下不互相杂交的核酸，仍是大体上相同的，如果它们编码的蛋白是大体上相同的。例如，当采用遗传密码允许的最大密码子变性产生一个核酸的一个拷贝时，这种情况发生。

低严紧性条件包括：采用30％-35％甲酰胺缓冲液、1M氯化钠、1％十二烷基硫酸钠、37℃下进行杂交，在1x至2xSSC(20xSSC＝3.0M氯化钠/0.3M枸橼酸三钠)、50-55℃下洗涤。典型的中严紧性条件包括：在40％-45％甲酰胺、1.0M氯化钠、1％十二烷基硫酸钠、37℃下进行杂交，在0.5xSSC、55-60℃下洗涤。典型的高严紧性条件包括：在0％甲酰胺、1M氯化钠、1％十二烷基硫酸钠、37℃下进行杂交，在0.1xSSC、60-65℃下洗涤。

下述实例是杂交/洗涤条件集的实例，它们可用于克隆与本发明中参考核苷酸序列大体上相同的同源核苷酸序列：在下述条件下，一个核苷酸参考序列优先杂交这个核苷酸参考序列上：在7％十二烷基硫酸钠、0.5M NaPO₄[磷酸钠]、1mM乙二胺四乙酸、50℃下进行，在2xSSC、0.1％十二烷基硫酸钠、50℃下洗涤；在7％十二烷基硫酸钠、0.5M NaPO₄[磷酸钠]、1mM乙二胺四乙酸、50℃进行及在1xSSC/0.1％十二烷基硫酸钠、50℃下洗涤，则更好；在7％十二烷基硫酸钠、0.5M NaPO₄[磷酸钠]、1mM乙二胺四乙酸、50℃下进行及在0.5xSSC、0.1％十二烷基硫酸钠、50℃下洗涤，尤其更好；优先在7％十二烷基硫酸钠、0.5M NaPO₄[磷酸钠]、1mM乙二胺四乙酸、50℃下进行及在0.1xSSC、0.1％十二烷基硫酸钠、50℃下洗涤；在7％十二烷基硫酸钠、0.5MNaPO₄[磷酸钠]、1mM乙二胺四乙酸、50℃下进行及在0.1xSSC、0.1％十二烷基硫酸钠、65℃下洗涤，则更好。

专属性典型地是杂交后洗涤的函数，临床因素是离子强度和最终洗涤液的温度。对DNA-DNA杂种，T_m可以从Meinkoth和Wahl(Anal.Biochem.[生物化学分析]，138：267-284(1984))的方程式近似推算出来：TM 81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L；其中M是单子阳离子的摩尔浓度，％GC是在DNA中鸟苷酸和和胞嘧啶核苷酸百分率，％form是杂交溶液中甲酰胺的百分率，L是杂种的长度(以碱基对为单位)。TM是50％靶标互补序列杂交到一个完美匹配探针上的温度(在规定的离子强度和pH条件下)。对每1％的错误匹配，则T减少约1℃；因此，可以调节T_m、杂交和/或洗涤液，以便杂交到所需要一致性的序列上。例如，如果寻找＞90％一致性的序列，T_m可降低10℃。一般情况下，对在规定离子强度和pH条件下的特定序列及其补体，所选择的高严紧性杂交和洗涤条件约为比热熔点(T_m)低约19℃。但是，非常高严紧性条件可以利用比热熔点(T_m)低1、2、3或4℃的一种杂交和/或洗涤；中严紧性条件可以利用比(T_m)低6、7、8、9或10℃的一种杂交和/或洗涤；低严紧性条件可以利用比(T_m)低11、12、13、14、15或20℃的一种杂交和/或洗涤。采用这个方程式、杂交和洗涤组分和需要的T，普通技术人员会理解本质上所述的杂交和/或洗涤液的严紧性的差异。如果在一个T中错误匹配结果的需要温度度数小于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺)，优先增加SSC浓度以便可以使用一个更高的温度。关于核酸杂交的广泛指南列在下述文献中：Tijssen(1993)：生物化学和分子生物学的实验室技术-采用核酸探针的杂交，第1部分第2章(Elsevier，New York)；Ausubel等，编辑(1995)：分子生物学的最新方案，第2章(Greene Publishing and Wiley-Interscience，NewYork)。请参见下述文献：Sambrook等(1989)：分子克隆：实验室手册(第2版)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York)。

两个核酸序列或蛋白大体上相同的一个另外的指征是，由第一个核酸编码的蛋白能与由第二核酸编码的蛋白发生免疫交叉反应，或能特异性地与第二个核酸编码的蛋白结合。因此，一种蛋白与另一种蛋白典型地大体上相同，例如这两种蛋白只在保守性取代方面不同。

“组织特异性启动子”是指不在所有植物细胞中表达但只在特殊器官(如叶、根或种子)的一种或几种细胞类型、特殊组织(如胚胎或子叶)或特殊细胞类型(如叶实质或种子储藏细胞)中表达的受控启动子。这些启动子也包括时间上受控的启动子，如在早期或晚期胚胎发生之中、在发育种子或果实的颗粒成熟期间、在完全分化的叶子中或在老化发生时。

“反式激活基因”是指编码一种反式激活蛋白的基因。它可以编码一种转录因子。它可以是一个天然基因(例如一种植物转录激活子)或一个嵌合基因(例如，当植物调控序列可操作连接到从另一种生物获得的一种转录因子的开放阅读框架时)。“反式激活基因”可以染色体结合或短暂表达。“反式激活”是指通过另一个(调控)反式基因的表达而打开一个基因。

在5′-端至3′-端转录方向中，“转录盒”将包含一个转录和转译开始区域、一个DNA重要序列、一个转录和转译终止区域，它们在植物中都是有功能的。终止区域可能与转录开始区域是本地的，可能与DNA重要序列是本地的，或可能从另一种来源获得。

“转录开始位点”是在第一个核苷酸周围的位置；第一个核苷酸是被转录序列的一部分，也被定义为位置+1。针对这个位点，这个基因的所有其它序列及其控制区域都加以编号。下游序列(即在3’端方向的更远的蛋白编码序列)均指定为正值，而上游序列(在5′端方向的大部分控制区域)均指定为负值。

术语“转化”是指一个核酸片段转移到一种宿主细胞的基因组中，导致遗传学稳定的遗传。“短暂转化”是指已将转基因和外源DNA(例如，采用诸如土壤杆菌属(Agrobacterium)-介导转化或基因枪轰击等方法)引入其中的细胞，但这些转基因和外源DNA不是选择作为稳定维持存在的。在多聚核苷酸环境中的“短暂转化”，目的是表示把一个多聚核苷酸引入这种植物中、但没有结合在这种植物的基因组中。

“稳定转化”是指在转化后已选择的和在选择介质上再生的细胞。

“转化/转基因/重组”是指诸如细菌或植物的、在其中已引入一种异源核酸分子的一种宿主生物。这种核酸分子可以稳定结合于宿主的基因组中，或这种核酸分子也可能作为一种细胞体外分子存在。如此一种染色体外分子是可以自动复制的。转化细胞、组织或植物应理解为不仅涵盖一个转化过程的最终产物，而且也涵盖其中的转基因后代。一个“未转化的”、“非转基因的”或“非重组的”宿主是指一种野生型生物，如一种细胞或植物，它不含有异源核酸分子。

“短暂表达”是指在下述细胞中的表达：一种病毒或一个转基因已通过病毒感染或采用诸如土壤杆菌属(Agrobacterium)-介导转化、电穿孔或基因枪轰击引入这种细胞中，但它不是选择作为稳定维持存在的。

如本文件中所用，“遗传构件”或“基因构件”是指任何核酸序列或遗传元件，它们也可能是一种表达构建体的一个构件或一个部分。基因构件的实例包括(但不限于)启动子区域、5’-端非转译前导序列、内含子、基因、3’-端非转译区域、转译或转录增强子、其它调控序列或可能影响一个或多个核酸序列转录或转译的序列。一个遗传构件可能是位于一个编码序列上游(5′-端非编码序列)、在一个编码序列这内或在一个编码序列下游(3′-端非编码序列)的核苷酸序列，且能影响有关编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或转译。它们包括天然序列和合成序列、以及可能是合成序列和天然序列的组合序列。

术语“转译增强子序列”是指在启动子和转译成RNA的编码序列之间一个基因的DNA序列部分，它存在于转译起始密码子的完全加工mRNA上游(5′)。转译增强子序列可能影响主要转录物至mRNA的加工，

“载体”定义为包括(尤其是)任何质粒、粘粒、噬菌体或土壤杆菌属(Agrobacterium)二元载体(以双链或单链线性或圆形形式存在)，它们可能是或可能不是自身可传播的或可动员的，它们能够通过结合于细胞基因组或存在于染色体外(如具有复制来源的自主复制质粒)而转化原核生物宿主或真核生物宿主。具体包括穿梭载体，它的意思是一种DNA载体能够自然发生或通过设计而在两种不同的宿主生物中复制，这些宿主可以从放线菌和相关种类、细菌和真核生物(如高等植物、哺乳动物、酵母细胞或真菌细胞)中选择。

“可见标记物”是指其表达不对一种转化细胞赋予一种优点的基因，但可以制备成可检测的或可见的。可见标记物的实例包括(但不限于)β-葡萄糖苷酸酶(GUS)、荧光素酶(LUC)和绿色荧光蛋白(GFP)。

“野生型”是指在自然界中发现的、没有任何已知突变的天然基因、病毒或生物。

术语“植物”是指任何植物，特别是农艺学方面有用的植物(如种子植物)；术语“植物细胞”是指植物的一个结构性和生理性单位(它含有细胞壁)，但也可能是指一种原生质体。植物细胞可能以孤立单细胞或培养细胞的形式存在，或作为高等组织单位的一部分，例如植物组织、或分化成在一种植物发育任何阶段存在的一种结构的植物器官。本文件中说明的启动子和组成可用于任何植物。可能在本文件中所含实施例中所用的植物的实例包括(但不限于)：玉米(包谷)，小麦，水稻，大麦，大豆，棉花，高梁，一般豆类，油菜/芸苔，苜蓿，亚麻，向日葵，红花，黍(小米)，黑麦，甘蔗，糖用甜菜，可可，茶树，热带糖用甜菜，芸苔属(Brassica spp.)，棉花，咖啡，甘薯，亚麻，花生；植物诸如：莴苣，番茄，瓜类，木薯，马铃薯，胡萝卜，萝卜，豌豆，小扁豆，卷心菜，花椰菜，花茎甘蓝，芽甘蓝菜，胡椒，菠萝；树木水果诸如：柑橘，苹果，梨，桃子，杏，核桃，鳄梨，香蕉，椰子；花类诸如：兰花，康乃馨，玫瑰。在本发明的工作中，其它有用的植物包括多年生草类，诸如柳枝稷、大草原草类、假高粱属、大蓝茎草、细叶芒以及诸如此类。公认可以使用植物的混合物。

如本文件中所用，“植物材料”、“植物部分”或“植物组织”表示植物细胞、植物原生质体、从其可以再生植物的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物块、在植物或植物部分(如胚胎、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、穗叶、苞叶、茎梗、茎梗、根、根尖、块茎、根茎以及诸如此类)中完好的植物细胞。

术语“幼株植物叶组织”或“幼株植物叶材料”是指可以采用土壤杆菌属(agrobacterium)菌株进行土壤杆菌浸润的叶组织；这种土壤杆菌属(agrobacterium)菌株包含一个二元载体，这个二元载体是由采用一种土壤杆菌浸润法仪器的表达盒构成的，其中所述表达盒包含至少一个基因和在所述叶组织中短暂转录的这个基因。术语“幼株植物叶组织”和“幼株植物叶材料”是交替使用的，目的是用于指在最大25天龄的植物叶组织，假定这种植物是在传统温室或生长室条件下生长的。可以理解的是，这种植物可能在非最佳条件下生长，且如本文件所述方法中所用的、来自非最佳生长植物的幼株植物组织可能超过最大天龄25天。术语“幼株植物叶组织”或“幼株植物叶材料”也可能是指一种植物的第一片叶、第二片叶、第三片叶、第四片叶或第五片叶。例如，在本文件中所述实施例的工作中，一种成熟玉米植物的第一片叶、第二片叶或第三片叶，会被认为是“幼株植物叶组织”。此外，在本文件所述的实施例工作中，例如，在V1-V6发育阶段的玉米叶，以及其它单子叶植物的相当发育阶段的玉米叶，会被认为是“幼株植物组织”。

如本文件所用，“离轴的”是指一种植物叶的下侧。术语“离轴的”目的是包括植物叶的下侧的任何部分。

如本文件所用，一种“土壤杆菌浸润法仪器”是指可用于浸润一种溶液到叶子下侧的任何仪器。术语“土壤杆菌浸润仪器”目的是涵盖无针注射器，如在本文件的方法中所述。术语“土壤杆菌浸润法仪器”也可能是指可用于把土壤杆菌属(agrobacterium)溶液浸润于叶子下侧的任何仪器，是通过对所述溶液施加压力和使所述溶液进入叶的间质细胞间隙。

本发明的一个转录调控核苷酸序列优先含有至少一个启动子序列，此类启动子序列位于相应基因转录开始处的上游，且能诱导下游序列的转录。转录调控核苷酸序列可能含有所述基因的启动子序列，但可能进一步含有其它序列，如5’-非转译序列、增强子序列、内含子、外显子和/或甚至含有有关基因组基因的内含子和外显子。

启动子可能含有几个区域，这些区域在启动子的功能中起着一定的作用。在这些区域中，有一些区域是模块化的；换句话说，它们可以孤立地用于赋予启动子活性，或它们可与其它元件组装在一起构建新的启动子。这些启动子区域的第一个区域位于编码序列的尾上游，构成“核心启动子区域”，包含共有序列，共有序列一般是位于编码序列转录起始位点尾上游的20-70个碱基对。核心启动子区域典型地含有一个TATA盒和常常含有一个起始子元件以及起始位点。核心启动子区域的准确长度不是固定的，但通常是极易识别的。在大多数启动子中通常存在这样一个区域，它有一些变化。核心启动子区域常常是指一个极小的启动子区域，因为它本身是有功能的，可以启动基础水平的转录。

核心启动子区域的存在，界定某一个序列属于启动子：如果缺乏这个区域，则该启动子是无功能的。核心区域的作用是吸引一般转录机器(转录蛋白复合体)到转录起始启动子。但是，核启动子区域典型地不足以提供所需要水平的启动子活性。一序列的调控序列(常常是核心启动子的上游)构成了该启动子的其余部分。这些调控序列可以确定表达水平、表达的空间和时间模式，且对启动子子集，还确定了在诱导性条件(通过外部因素如光、温度、化学品和激素等进行调控)下的表达。调控序列可能是DNA序列6-100碱基对的较短区域，它界定了反式作用因子如转录因子的结合位点。调控序列也可能是增强子，是DNA序列的较长区域，它可能从核心启动子区域的较远距离(有时距离核心区域几千个碱基)处发挥作用。调控序列的活性可能受到反式作用因子(包括但不限于一般转录机器)、转录因子和染色质组合因子的影响。

在本文件中，术语“定量数据”是指可以表示为一个数量的任何数据。例如，一定数量的酶表示为“植物/g植物组织”。另一个实例可能是采一种报告基因(如GUS、GFP或一些其它适当的报行子基因)短暂转染细胞数量。另一个实例可能是通过PCR测定的转录的基因拷贝数。定量数据并不是准确的；在本文件中，这种数据将是指“半定量数据”。例如，通过肉眼查看例如Western印迹，技术人员可以确定一种植物比另一种植物产生更多的相关蛋白。或例如，通过短暂表达涉及淀粉合成途径的一个基因，简单地采用碘短暂转染组织，技术人员可以确定所产生的淀粉量。更深染色的组织可能比更浅染色的转染或对照组织半定量地含有更多的淀粉。

在本文件中，术语“定性数据”是指可以表示为与性质有关的任何数据。例如，在Western印迹中，与全长蛋白比较，来自短暂转染植物组织的一种蛋白被切断；对这种Western印迹的检查，可视为定性数据。定性数据也可能是一种特定表型的存在或不存在情况。例如，在植物的叶组织中，一种短暂表达的木聚糖酶可能引起这种叶组织的萎黄病。

在本文件中，术语“预测模型”、“短暂预测模型”、“基因表达预测模型”是指在稳定的转基因植物系中短暂表达基因、表达盒和/或基因构件和相应功能之间的相关关系。例如，其淀粉酶可操作连接一个叶绿体靶向序列的一个表达盒A，和其淀粉酶可操作连接到一个内质网(ER)靶向序列和所有其它遗传构件都相同的一个表达盒B，可以快速短暂比较叶组织中就酶表达水平来说基因靶向的作用，可以制定一个“预测模型”，对此模型来说基因靶向将在稳定的转基因系中发挥最佳功能。例如，这可以通过下述方法达到：a)通过7天龄叶组织的土壤杆菌浸润法，把表达盒A和表达盒B传递到不同的植物中；b)在所述叶组织中短暂表达盒A和表达盒B；c)在24、48或72小时抽取叶组织样品；d)进行淀粉酶分析法，如Ceralpha分析法(MEGAZYME同，爱尔兰)；e)收集定量数据；和f)根据每g叶组织的短暂蛋白表达，制定一个预测模型。在一些实例例中，这种短暂功能可能无法准确地匹配表达同一个基因、表达盒或遗传构件的稳定转基因植物品种的功能，但可以观察到一种趋势。例如，在上述实例中的表达盒A可能产生lμg/g淀粉酶的叶组织，在上述实例中的表达盒B可能产生10μg/g淀粉酶的叶组织，如果技术人员要稳定的转化表达盒A和表达盒B到稳定的转基因玉米系中，这种表达水平可能分别为5μg/g和50μg/g，维持了在短暂数据中观察到的趋势。在另一项实施例中，在叶组织中的短暂数据可能预测一个基因、表达盒或遗传构件在其它植物部件(例如，种子、根或生殖组织)中如何发挥功能。对熟悉这门技术的人员来说，在这种情况下的预测模型将表明，把一种淀粉酶靶向ER是比靶向空泡更好的策略，如果技术人员要原位(in planta)产生较大量的淀粉酶。采用本文件所述方法的预测模型，并不限于蛋白表达水平，但可能也用于从短暂表达基因、表达盒或遗传构件获得的任何定量数据或定性数据。

在本文件中所用的“短暂转染”或“短暂转染的”是表示进行所述异源DNA序列的引入，但没有选择转染细胞进行所述异源DNA序列稳定结合于植物染色体中。可以采用能够把外源DNA引入植物细胞的土壤杆菌属(Agrobacterium)菌株，把一个表达盒引入一种植物部分中。一个基因和/或表达盒的短暂表达，可以观察1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天或以上。优先情况是，短暂表达可以观察到24小时时间。更好的情况是，短暂表达可以观察到48小时时间。最好的情况是，短暂表达可以观察到72小时时间。

本发明的详细说明

列出短暂表达基因、表达盒或基因构件的方法和组成。这种方法包含一种二元载体的土壤杆菌浸润法，这种二元载体包含引入一种植物部分(如植物叶)的至少一个表达盒，其中这个表达盒含有可操作连接到一个异源基因的至少一个启动子。本发明所产生的植物，原位(in planta)短暂表达基因、表达盒或基因构件，其表达水平足以用作一种预测模型，预测一个相应基因、表达盒或基因构件在稳定转基因植物系中是否可操作性地发挥功能。进一步列出对稳定转基因植物构建预测模型的应用方法，这些预测模型是通过短暂定量和定性数据或其合并数据的比较性分析构建的。

列出转基因植物、种子、植物组织和植物部分。这个过程公认可以通过应用组成型启动子、组织启动子、时间或化学受控启动子加以控制。下述实施例可以在单子叶或双子叶植物中进行。

在本发明的过程中，一个基因、表达盒和/或遗传构件是在植物部分中短暂表达的，在植物中短暂表达的更好。基因表达、启动子功能、基因活性、蛋白功能和形式是在短暂表达盒中可以评价的少数几个实例，可用作一种预测模型，预测一个特定表达盒构型、基因和/或遗传构件在稳定转基因植物系中可能如何发挥功能。在多种行业中，例如(但不限于)在商业性农业、乙醇、动物饲料、塑料、化学品、医药业和其它行业应用中，原位(in planta)短暂表达基因、表达盒或基因构件的方法可能是需要的。

为获得商业需要的、可以最佳表达一种重要基因的稳定转基因植物系的目的，本发明的方法发现了在作物植物培养的当前工作一体化中的应用。本发明涵盖了快速评价基因功能、表达盒构型、遗传构件对表达功能作用的能力。与产生稳定转基因植物系并在相应稳定转基因植物一个或多个部分中进行同样评价的传统方法比较，本发明的方法可以减少评价基因、表达盒或基因构件所需要的时间、资源和空间。在一项实施例中，本发明可以使在稳定转基因植物中选择最佳基因表达的评价时间减少6-12个月，并能快速进行基因表达的最佳表达盒构型的选择。在另一项实施例中，本发明可以使在稳定转基因植物中选择最佳基因表达的评价时间减少12-24个月或以上。在一些实施例中，本发明可以使在稳定转基因植物中选择最佳基因表达的评价时间减少1-12个月或以上。

在一项实施例中，本文件所述的方法可用于任何植物。本文件所述的方法用于作物植物则更好。本文件所述方法的另一个方面，是一个表达盒及其相关基因构件可以在所述的任何植物部分中短暂表达。更好的情况是，一个表达盒可以在光合成植物材料中短暂表达。最好的情况是，这些方法可用于在植物叶组织中短暂表达一个表达盒、基因和/或遗传构件。同样，本发明的另一个方面是，在本文件中所述的表达盒转染到1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天龄或以上叶组织中，其土壤杆菌浸润法将会引起所述表达盒的短暂表达；在如此短暂表达方式下，定性和/或定量数据可以通过这门技术众所周知的程序加以收集；这些数据可用于进一步预测，在所述表达盒或相应遗传构件转化的稳定转基因植物系中，所述表达盒将会如何发挥功能。在一项优先的实施例中，7天龄玉米叶组织用本文件所述的表达盒和遗传构件进行土壤杆菌浸润。

在本发明的一项优先实施例中，植物部分被土壤杆菌浸润于组织中，其中采用重要表达盒转化的土壤杆菌属(Agrobacteria)溶液被浸润于植物组织(如叶组织)的间质间隙中。同样可以理解的是，本发明可以采用基因枪或任何其它转化技术进行；这些转化技术或本文件所述，或对熟悉相关技术的人员来说是众所周知的。

在本发明的一项实施例中，幼株植物叶组织是从玉米获得的；这种玉米叶组织的最大叶龄是在约V1至约V6之间，或约为2个月，其中这种玉米植物是在传统温室和/或生长室条件下生长的。在另一项实施例中，玉米幼叶组织为一种玉米植物的第1片叶，这种玉米植物最大天龄为约20天至约30天龄。可以理解的是，在非最佳条件下生长的玉米植物可能含有的幼叶组织，可能是在本文件所述的实施例中所用的，其中这种玉米植物的天龄超过30、40、50、60或70天。

可与本发明一起应用的优先的玉米基因型，可能是(但不限于)：例如AX5707和FF6096。可与本发明一起应用的优先的水稻基因型，可能是(但不限于)：Nipponbare水稻198。可与本发明一起应用的优先的高梁基因型，可能是(但不限于)：brandes、della和dale。在一些实例中，可与本发明一起应用的优先的玉米基因型可能是(但不限于)：AC Nanda、TLAXCALAF2000、CALINGIRI、OMSKAYA 33、Catalido。可与本发明一起应用的优先的燕麦基因型，可能是(但不限于)：SSC-31-913200整粒。

在本发明的一项实施例中，幼株植物叶组织是从甘蔗获得的；这种甘蔗叶组织的最大叶龄是在7-12天之间，其中这种甘蔗植物是在传统温室和/或生长室条件下生长的。在另一项实施例中，甘蔗幼叶组织为一种甘蔗植物的第1片叶，这种甘蔗植物的最大天龄为约20天至约30天龄。可以理解的是，在非最佳条件下生长的甘蔗植物可能含有的幼叶组织，可能是在本文件所述的实施例中所用的，其中这种甘蔗植物的天龄超过30、40、50、60或70天。

在本发明的另一项实施例中，幼株植物叶组织是从高梁获得的；这种高梁叶组织的最大叶龄约20天龄，其中这种高梁植物是在传统温室和/或生长室条件下生长的。在另一项实施例中，高梁幼叶组织为一种高梁植物的第1片叶，这种高梁植物的最大天龄为约20天至约30天龄。可以理解的是，在非最佳条件下生长的高梁植物可能含有的幼叶组织，可能是在本文件所述的实施例中所用的，其中这种高梁植物的天龄超过30、40、50、60或70天。

在本发明的另一项实施例中，幼株植物叶组织是从水稻获得的；这种水稻叶组织的最大叶龄约40天龄，其中这种水稻植物是在传统温室和/或生长室条件下生长的。在另一项实施例中，水稻幼叶组织为一种水稻植物的第1片叶，这种水稻植物的最大天龄为约20天至约30天龄。可以理解的是，在非最佳条件下生长的水稻植物可能含有的幼叶组织，可能是在本文件所述的实施例中所用的，其中这种水稻植物的天龄超过30、40、50、60或70天。

在本发明的另一项实施例中，幼株植物叶组织是从草获得的；这种草叶组织的最大叶龄约30天龄，其中这种草植物是在传统温室和/或生长室条件下生长的。在另一项实施例中，草幼叶组织为一种草植物的第1片叶，这种草植物的最大天龄为约20天至约30天龄。

在本发明的一项实施例中，转译或转录增强子可用于增加短暂蛋白表达。在一项优先的实施例中，可以使用从玄参花叶病毒(eFMV)获得的一种增强子区域。在另一项优先的实施例中，玄参花叶病毒(eFMV)增强子是与一种35s花椰菜花叶病毒增强子一起使用的，目的是在短暂和/或稳定转化植物中增加基因的表达。

本发明的一个重要方面是，对短暂表达的基因没有任何大小方面的限制，这与病毒性短暂转染方法形成对比。病毒性短暂转染系统，在可转染到植物细胞中的基因大小方面是有限制的。在本发明的一项实施例中，通过土壤杆菌浸润法引入的异源基因可以大于0.1、0.5、0.75、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0或10.0千碱基。

在本文件中所述的方法，在评价植物中(in planta)表达的加工酶类时可能是有用的。例如，如在本文件的方法中所述，通过在植物组织中短暂表达相关加工酶，可以定量或定性评价这种加工酶。适当的“加工酶”包括(但不限于)：淀粉降解酶或淀粉异构化酶，例如α-淀粉酶、内或外-1，4或1，6-α-D、葡萄糖淀粉酶、葡萄糖异构酶、β-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶和其它外淀粉酶；和淀粉脱支酶如异淀粉酶、普鲁兰酶、新普鲁兰酶、异普鲁兰酶、淀粉普鲁兰酶以及诸如此类，糖基转移酶如环糊精葡萄糖基转移酶以及诸如此类，纤维素酶如外-1，4-β-纤维二糖水解酶、外-1，3-O-D-葡聚糖酶、半纤维素酶、β-葡萄糖苷酶以及诸如此类；内切葡聚糖酶如内-1，3-β-葡聚糖酶和内-1，4-β-葡聚糖酶以及诸如此类；L-阿拉伯糖酶，如内-1，5-α-L-阿拉伯糖酶、α-阿拉伯糖苷酶以及诸如此类；半乳聚糖酶，如内-1，4-β-D-半乳聚糖酶、内-1，3-β-D-半乳聚糖酶、1-半乳糖苷酶、α-半乳糖苷酶以及诸如此类；甘露聚糖酶，如内-1，4-β-D-甘露聚糖酶、β-甘露糖苷酶、α-甘露糖苷酶以及诸如此类；木聚糖酶，如内-1，4-1-木聚糖酶、β-D-木糖苷酶、1，3-β-D-木聚糖酶以及诸如此类；和果胶酶；非淀粉加工酶，包括蛋白酶、葡聚糖酶、木聚糖酶、硫氧还蛋白/硫氧还蛋白还原酶、酯酶、植酸酶和脂肪酶。在本发明的一个方面，可以根据加工酶和相应底物的反应性副产物，评价一种加工酶和制定一种短暂预测模型。例如，熟悉本门技术的人员可以采用本文件中所述的方法，在植物中短暂表达一种淀粉酶，把这种淀粉酶与一种底物接触，并采用HPLC(高效液相色谱法)或对熟悉这门技术人员来说已知的其它方法，测定所释放的麦芽糖糊精的量。这种底物可能存在于植物中(in planta)，或可以分离这种短暂表达的酶并使之与其相关底物在原位(in situ)接触。技术人员也可以采用本文件中所述的方法，评价几种酶对一种底物(如淀粉或纤维素)的组合效应。

植物表达盒

本发明的组成可能含有用于在重要植物中短暂或稳定转化和表达的核酸序列。这些核酸序列可能存在于DNA构建体或表达盒中。根据以前的定义，一个表达盒可能是通过指导一种特定核苷酸序列在适当宿主细胞中表达的核苷酸分子，含有可操作连接到重要核苷酸序列(如编码一种加工酶的一种核苷酸序列)的一个启动子，这个重要核苷酸序列是可操作连接到终止信号的。表达盒也典型地包含核苷酸序列正确转译所需要的序列。编码区域通常编码重要蛋白，但也可能编码重要的功能性RNA，例如在有义或反义方向的反义RNA或非转译RNA。含有重要核苷酸序列的表达盒可能是嵌合基因，意味着它的至少一个成分对它的至少一个其它构件来说是异源性的。表达盒也可能是天然发生的、但是以重组形式获得的、对异源表达有用的一个表达盒。但是，典型的情况是，表达盒对宿主来说是异源的，即表达盒的特定DNA序列不是在宿主细胞中天然发生的，必须采用一个转化事件引入宿主细胞中或或引入宿主细胞的原种中。在表达盒中核苷酸序列的表达可能是在一种组成型启动子的控制下进行的，或是在一种诱导型启动子之下进行的，这个启动子在宿主细胞暴露于一些特定外部刺激时开始转录。此外，这个启动子也可能对一种特定组织或器官或发育阶段是特异性的。

本发明涵盖采用通过短暂表达多聚核苷酸的表达盒对植物的转化。在代表性的实施例中，表达盒在转录的5′-3′方向中将包含一个转录和转译开始区域(即一个启动子)和一个重要多聚核苷酸及遗传构件(即转译增强子)。表达盒可选包含在植物中有功能的转录和转译终止区域(即终止区域)。本发明的表达盒也可能包含一个前导序列和/或允许重要多聚核苷酸诱导型表达的一个序列。请参见下述文献，了解关于允许进行诱导型表达的实例：Guo等(2003)：Plant J.(植物杂志)，34：383-92；和Chen等(2003)：Plant J.(植物杂志)，36：731-40。表达构建体的调控序列是可操作连接到重要核苷酸的。在本发明的工作中，可以使用能够在重要植物中驱动表达的任何启动子。在一项实施例中，可以定量和/或定性评价一个非叶优先启动子和/或非叶特异性启动子，且可以制定一个预测模型，以便预测一个启动子在其相应的优先组织和/或特异性组织中如何发挥功能。例如，可以采用本文件中所述的方法，在叶组织中短暂评价一个种子特异性启动子。已报告在植物中的几种组织特异性受控基因和/或启动子。所报告的一些组织特异性基因包括：编码种子贮藏蛋白(如油菜籽蛋白、十字花科蛋白、β-伴大豆球蛋白和菜豆球蛋白)、玉米蛋白或油体蛋白(如油质蛋白)的基因，或涉及脂肪酸合成(包括酰基载体蛋白、硬脂酰-ACP去饱和酶和脂肪酸去饱和酶(fad 2-1))的基因，以及在胚胎发育过程中表达的其它基因(如Bce4，例如请参见EP 255378和Kridl等：Seed Science Research(种子科学研究)，1：209(1991))。已经阐明的组织特异性启动子的实例包括：凝集素(Vodkin，Prog.Clin.Biol.Res.[临床生物学研究进展]，138；87(1983)；Lindstrom等，Der.Genet.，11：160(1990))，玉米乙醇脱氢酶1(Vogel等，1989；Dennis等：Nucleic Acids Res.[核酸研究]，12：3983(1984))，玉米集光叶绿素复合物(Simpson，1986；Bansal等：Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]，89：3654(1992))，玉米热休克蛋白(Odell等，1985；Rochester等，1986)，碗豆小亚单位RuBP羧化酶(Poulsen等，1986；Cashmore等，1983)，Ti质粒甘露碱合酶(Langridge等，1989)，Ti质粒胭脂碱合成酶(Langridge等，1989)，矮牵牛花苯基丙乙烯酮异构酶(vanTunen等，EMBO J.，7；1257(1988))，大豆甘氨酸富蛋白1(Keller等：Genes Dev.[基因开发]，3：1639(1989))，截断CaMV 35s(Odell等，Nature[自然]，313：810(1985))，马铃薯块茎特异蛋白(Wenzler等，Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]，13：347(1989))，根细胞(Yamamoto等：Nucleic Acids Res.[核酸研究]，18：7449(1990))，玉米蛋白(Reina等：Nucleic Acids Res.[核酸研究]，18：6425(1990)；Kriz等：Mol.Gen.Genet.[分子遗传学与普通遗传学]，207：90(1987)；Wandelt等：Nucleic Acids Res.[核酸研究]，17：2354(1989)；Langridge等：Cell[细胞]，34：1015(1983)；Reina等：Nucleic Acids Res.[核酸研究]，18：7449(1990))，球蛋白-1(Belanger等，Genetics[遗传学]，129：863(1991))，α-微管蛋白，cab(Sullivan等：Mol.Gen.Genet.[分子遗传学与普通遗传学]，215：431(1989))，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(Hudspeth和Grula，1989)，R基因复合体相关启动子(Chandler等：Plant Cell[植物细胞]，1：1175(1989))，和查耳酮合成酶启动子(Franken等：EMBO J.[EMBO杂志]，10：2605(1991))。豌豆球蛋白启动子对种子特异性表达是特别有用的(Czako等：Mol.Gen.Genet.[分子遗传学与普通遗传学]，235：33(1992))。(也请参见美国专利号5,625,136；它通过引用而结合于本文件中。)在成熟叶中对表达有用的其它启动子包括在老化发生时打开的那些启动子，如从拟南芥属获得的SAG启动子(Gan等：Science[科学]，270：1986(1995))。这个启动子对植物宿主是本地的或相似的、或外源的或异源的。

采用本文件所述的方法制定的短暂预测模型，可以根据几种因素评价启动子；这几种包括(但不限于)效率、可选择性、诱导性、需要的表达水平、细胞或组织优先表达。对熟悉本门技术的人员来说，调节一个序列的表达是一种常规工作，即通过适当选择和定位启动子和相对于一个序列的其它调控区域。本文件中所述的方法允许进行启动子选择和定位的快速评价。

一些适当的启动子只在或主要在特定细胞类型中开始转录。因此，如本文件中所用，一种细胞类型或组织特异性启动子是在目标组织中优先驱动表达的启动子，但也可能在其它细胞类型或组织中引起一定的表达。可以理解的是，在目标组织中表现优先靶向表达的一些启动子，可能也会在非优先靶向组织中表现“泄漏性”表达。一个实例是其表达谱在玉米种子中表现优先表达、但在成熟叶组织中也表现强表达的一个启动子。例如，在植物基因组DNA中鉴别和表征的启动子区域的方法，包括下述在下述参考文献中所述的那些方法：Jordano等：Plant Cell(植物细胞)，1：855-866(1989)；Bustos等：Plant Cell(植物细胞)，1：839-854(1989)；Green等：EMBO J.(EMBO杂志)，7，4035-4044(1988)；Meier等：Plant Cell(植物细胞)，3，309-316(1991)；和Zhang等：Plant Physiology(植物生理学)，110：1069-1079(1996)。已说明若干植物启动子具有各种表达特征。已说明的一些组成型启动子的实例包括：水稻肌动蛋白1(Wang等：Mol.Cell.Biol.[分子与细胞生物学]，12：3399(1992)；美国专利号5,641,876)、CaMV.sup.35S(Odell等：Nature[自然]，313：810(1985))、CaMV 19S(Lawton等，1987)、nos(Ebert等，1987)、Adh(Walker等，1987)，蔗糖合成酶(Yang和Russell，1990)和泛素等启动子。

在本发明中可能较重的要是在光合成组织中有活性的启动子，以便能在绿色组织(如叶和茎柄)中驱动转录。此类启动子的实例包括核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(RbcS)启动子，如：从美洲落叶松(美加落叶松(Larix laricina))获得的RbcS启动子，松树cab6启动子(Yamamoto等(1994)：Plant CellPhysiol.[植物和细胞生理学]35：773-778)，从小麦获得的Cab-1基因启动子(Fejes等(1990)：Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]，15：921-932)，从菠菜获得的CAB-1启动子(Lubberstedt等(1994)：Plant Physiol.[植物生理学]，104：997-1006)，从水稻获得的cab1R启动子(Luan等(1992)：Plant Cell[植物细胞]，4：971-981)，从玉米获得的丙酮酸正磷酸二激酶(PPDK)启动子(Matsuoka等(1993)：Proc Natl Acad Sci USA[美国国家科学院院刊]，90：9586-9590)，烟草Lhcb1*2启动子(Cerdan等(1997)：Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]，33：245-255)，拟南芥SUC2蔗糖-H+共输送体启动子(Truernit等(1995)：Planta 196：564-570)，和从菠菜获得的类囊体膜蛋白启动子(psaD，psaF，psaE，PC，FNR，atpC，atpD，cab，rbcS)。在茎柄、叶和绿色组织中驱动转录的其它启动子，在美国专利公布号2007/0006346中说明；此专利通过引用而结合于本文件整体中。在本发明的一些实施例中，可以短暂评价在光合成组织中有活性的启动子，并制定预测模型。

在本发明的一些其它实施例中，诱导型启动子的评价可能是需要的。诱导型启动子能响应外部刺激(如化学药品或环境刺激)而驱动转录。例如，诱导型启动子可以响应激素(如赤霉酸或乙烯)、或响应光或干旱而赋予转录。已报告几种诱导型启动子。许多诱导型启动子在下述综述中说明：Gatz：Current Opinion in Biotechnology(生物技术最新观点)，7：168(1996)；和Gatz，C.：Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.(植物生理学和植物分子生物学年鉴)，48：89(1997)。实例包括四环素阻遏子系统、Lac阻遏子系统、铜-诱导型系统、水杨酸诱导型系统(如PR1a系统)、糖皮质激素诱导型系统(Aoyama T.等，N-H Plant Journal[N-H植物杂志]，11：605(1997))和蜕皮激素诱导型系统。其它诱导型启动子包括ABA-和充实诱导型启动子、茁长素结合蛋白基因启动子(Schwob等：Plant J.[植物杂志]，4：423(1993))、UDP类黄酮葡萄糖基转移酶基因启动子(Ralston等：Genetics[遗传学]，119：185(1988))、MPI蛋白酶抑制剂启动子(Cordero等：Plant J.[植物杂志]，6：141(1994))和甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子(Kohler等：Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]，29；1293(1995)；Quigley等：J.Mol.Evol.[分子进化杂志]，29：412(1989)；Martinez等：J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]，208：551(1989))。也包括苯磺胺诱导型系统(美国专利号5364,780)和乙醇诱导型(WO97/06269和WO 97/06268)系统、及谷胱甘肽S-转移酶启动子。其它研究重点考察能响应环境应力或刺激(如盐度增加、干旱、病原体和创伤)而诱导性控制的基因。(Graham等：J.Biol.Chem.[生物化学杂志]，260：6555(1985)；Graham等：J.Biol.Chem.[生物化学杂志]，260：6561(1985)；Smith等：Planta，168：94(1986))。已报告在创伤马铃薯植物的叶中金属羧肽酶抑制蛋白累积(Graham等，Biochem.Biophys.Res.Comm.[生物化学与生物物理学研究通讯]，101：1164(1981))。已报告可为茉莉酮酸甲酯、刺激剂、热休克、厌氧胁迫或除草剂安全剂诱导的其它植物基因。嵌合反式作用病毒复制蛋白的受控表达，可进一步为其它遗传策略控制，如Cre介导基因激活(Odell等：Mol.Gen.Genet.[分子遗传学与普通遗传学]，113：369(1990))。启动子中含有一种嵌合复制基因，有一种复制蛋白编码序列能阻断这种嵌合基因的表达；lox位点介于启动子和阻断这个启动子嵌合复制基因表达的复制蛋白编码序列之间；因此，含有lox位点结合的3′-端调控序列的DNA片段，可以通过Cre-介导的切除而除去，从而导致这种反式作用复制基因的表达。在这种情况下，这种嵌合Cre基因、嵌合反式作用复制基因、或它们二者都受到组织特异性和发育特异性启动子或诱导型启动子的控制。一种替代遗传策略是应用tRNA抑制基因。例如，tRNA抑制基因的受控表达，可以条件性的控制含有适当终止密码子的反式作用复制蛋白编码序列的表达(Ulmasov等：PlantMol.Biol.[植物分子生物学]，35：417(1997))。同样，或为嵌合tRNA抑制基因、嵌合反式作用复制基因、或它们二者都受到组织特异性和发育特异性启动子或诱导型启动子的控制。优先的情况是，在多细胞生物案例中，启动子也可能对某一种特定组织、器官或发育阶段是特异性的。此类启动子的实例包括(但不限于)玉米ADP-gpp和玉米γ-玉米蛋白启动子和玉米球蛋白启动子。本发明的一个实施例可能是这样一种快速方式，即采用本文件所述的方法进行短暂表达，根据从短暂表达获得的定量和/或定性数据制定预测模型，从而在稳定转基因植物系中评价诱导型启动子对重要基因表达的功能。一个基因在一种植物中的短暂表达，可能仅在这种植物发育过程中的某一个特定时间阶段是需要的。发育时间程序频繁与组织特异性基因表达相关。例如，玉米贮藏蛋白的表达是在授粉后约15天的胚乳中开始的。

若干转录终止子可供用于表达盒。这些终止子负责在超过转基因时终止转录，并纠正mRNA聚腺苷酸化。这种终止区域可能对转录开始区域是本地的，可能对可操作连接的重要DNA序列是本地的，可能对植物宿主是本地的，或可能是从另一种来源获得的(即对启动子、重要DNA序列、植物宿主、或它们的任何组合是外源的或异源的)。适当的转录终止子是已在在植物中能发挥功能的那些转录终止子，包括CAMV 35S终止子、tml终止子、胭脂碱合成酶终止子和豌豆rbcs E9终止子。这些终止子均可用于单子叶植物和双子叶植物。此外，可以使用一个基因的本地转录终止子。本发明的一个实施例可能是这样一种快速方式，即采用本文件所述的方法进行短暂表达，根据从短暂表达获得的定量和/或定性数据制定预测模型，从而在稳定转基因植物系中评价终止子序列对重要基因表达的作用。

已发现众多序列可以从转录单位内部增强基因表达，这些序列可与本发明的基因一起用于增加他们在转基因植物中的表达。

已表明各种内含子序列能增强表达，特别是在单子叶植物细胞中。例如，已发现玉米Adhl基因内含子当引入玉米细胞中时，在其同源启动子控制下能显著增加野生型基因的表达。有人发现内含子1是特别有效的，在与氯霉素乙酰基转移酶基因的融合构建体中能增加表达(Callis等：GenesDevelop.[基因开发]1：1183-1200(1987))。在相同的实验系统中，从玉米bronze1基因获得的内含子具有类似的增强表达作用。内含子序列常规结合于植物转化载体中，典型地在非转译前导序列内。

同样，已知从病毒获得的若干非转译前导序列能增强表达。具体地说，已表明从烟草花叶病毒(TMV，“W-序列”)、玉米萎黄斑驳病毒(MCMV)和苜蓿花叶病毒(AMV)获得的前导序列在增强表达时是有效的(Gallie等：Nucl.Acids Res.[核酸研究]，15：8693-8711(1987)；Skuzeski等：Plant Molec.Biol.[植物分子生物学]，15：65-79(1990))。在本门技术中已知的其它前导序列包括(但不限于)：微小核糖核酸病毒前导序列，例如EMCV前导序列(脑心肌炎5′-端非编码区域)(Elroy-Stein，O.、Fuerst，T.R.和Moss，B.：PNASUSA[美国国家科学院院刊]，86：6126-6130(1989))；马铃薯Y病毒组前导序列，例如TEV前导序列(烟草蚀刻病毒)(Allison等，1986)；MDMV前导序列(玉米矮花叶病毒)；人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)前导序列(Macejak，D.G.和Samow，P.：Nature[自然]，353：90-94(1991))；来自苜蓿花叶病毒外壳蛋白mRNA的非转译前导序列(AMV RNA 4)(Jobling，S.A.和Gehrke，L.：Nature[自然]，325：622-625(1987))；烟草花叶病毒前导序列(TMV)(Gallie，D.R.等：Molecular Biology of RNA[RNA分子生物学]，第237-256页(1989))；和玉米玉米褪绿斑驳病毒前导序列(MCMV)(Lommel，S.A.等：Virology[病毒学]，81：382-385(1991))。也请参见下述文献：Della-Cioppa等：Plant Physiology(植物生理学)，84：965-968(1987)。本发明的一个实施例可能是这样一种快速方式，即采用本文件所述的方法进行短暂表达，根据从短暂表达获得的定量和/或定性数据制定预测模型，从而在稳定转基因植物系中评价增强子或遗传构件序列对重要基因表达的作用。本文件所述的方法可用于制定关于预测模型，用于预测基因靶向和蛋白表达的作用。已知靶向基因产物的各种机制存在于植物中，已相当详细地表征了控制这些机制功能作用的序列。例如，对叶绿体基因产物的靶向为各种蛋白氨基酸末端发现的一种信号序列所控制，这个序列是在叶绿体输入过程中切断的，以便产生成熟蛋白(如Comai等：J.Biol.Chem.[生物化学杂志]，263：15104-15109(1988))。这些信号序列可以融合到异源基因产物中，以便使异源产物输入到叶绿体中(van den Broeck等：Nature[自然]，313：358-363(1985))。对适当信号序列的DNA编码，可以从编码下述蛋白的cDNAs的5′-端分离出来：RUBISCO蛋白，CAB蛋白，EPSP合成酶，GS2蛋白，及已知为叶绿体定位的其它许多蛋白。也请参见美国专利号5,639,949中实例37中标题为“叶绿体靶向的表达”一节。

关于细胞靶向的上述机制，不仅可与它们的同源启动子一起使用，而且也可与异源启动子一直使用，以便在一个启动子(这个启动子具有的表达模式与靶向信号驱动的那个启动子的表达模式是不同的)的转录控制下发挥特异性细胞靶向目标的作用。

为确保在质粒中的定位，使用下述一种运送肽是可以理解的：质体铁氧化还原蛋白：NADP+菠菜的氧化还原酶(FNR)；后者在下述文献中披露：Jansen等：Current Genetics(最新遗传学)，13(1988)，517-522)。特别是，可以使用在本文件中披露的、介于cDNA核苷酸(-171)至165范围的序列，这个序列包含5′-端非转译区域以及编码运送肽的序列。另一个实例是玉米蜡质蛋白的运送肽，它含有成熟蜡质蛋白的头34个氨基酸残基(Klosgen等：Mol.Gen.Genet.[分子遗传学与普通遗传学]，217(1989)，155-161)。也可能使用不含成熟蛋白头34个氨基酸的这种运送肽。另外，也可以使用下述酶类的信号肽：二磷酸核酮糖羧化酶小亚单位(Wolter等：Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]，85(1988)，846-850；Nawrath等：Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]，91(1994)，12760-12764)；NADP苹果酸脱氢酶(Galiardo等：Planta[植物]，197(1995)，324-332)；谷胱甘肽还原酶(Creissen等：Plant J.[植物杂志]，8(1995)，167-175)；或R1蛋白(Lorberth等：Nature Biotechnology[自然生物技术]，16，(1998)，473-477)。

在本发明的一个方面，可以在表达中纳入基因沉默的抑制子，以便增加基因表达。在本门技术中，已知纳入此类基因沉默抑制子可以在双子叶植物中增加短暂基因表达(例如，请参见Voinnet等，2003：Plant J.[植物杂志]，33，549-556)。

关于在本文件中所述的、在本发明中可以使用的蛋白类型，没有任何预想的限制。

一方面，这种方法是采用编码需要蛋白的核酸序列实施的，而这些核酸序列设计为提供植物优先可用的密码子，以便用于短暂转化。关于几种植物的密码子用法的特征，已在下述文献中列出和说明：Wada等：“从GenBank遗传序列数据制表列出的密码子用法”。Nucleic Acids Research[核酸研究]，19：1981-1986(1991)。

在一方面，对表达盒来说没有必要含有可选择的标记物，和/或并不要求DNA构建体排除肿瘤诱导基因。

在本发明中，在一些实施例中可以使用可选择的标记物，以便进行短暂转化植物和植物组织的选择。技术人员可能需要采用可选择的或可筛查的标记基因，作为重要的可表达基因，或除重要的可表达基因外而使用。“标记基因”是对表达标记基因的细胞赋予明显不同的表型，从而使此类转化细胞与没有这种标记物的细胞区别开来。此类基因可能编码一种可选择的或可筛查的标记物，取决于这种标记物是否赋予一种属性(技术人员可以采用化学方法选择这种属性，即通过使用一种选择性药物来选择，如一种除草剂、抗生素以及诸如此类)，或它是否只是技术人员可以通过观察或试验(即筛查，如R-位点属性)鉴别的一种属性。当然，适当标记基因的许多实例对本门技术来说是已知的，可在本发明的工作中加以采用。

术语“可选择的或可筛查的标记基因”，也包括编码一种“可分泌标记物”的基因，这种“可分泌标记物”的分泌是可以检测的，因此可用作鉴别或选择短暂转化细胞的一种方法。实例包括编码一种可分泌抗原的标记基因或甚至一种可分泌酶：可分泌抗原可以采用抗体相互作用鉴别，可分泌酶可以采它们的催化活性加以检测。可分泌蛋白有若干类别，包括：较小的扩散性蛋白，可以采用ELISA法检测到；较小的活性酶，可以在细胞外溶液中检测到(如α-淀粉酶、β-内酰胺酶、草丁膦乙酰转移酶)；和插入或捕获于细胞壁中的蛋白(如包含一种前导序列的蛋白，这种前导序列如在伸展蛋白或烟草PR-S的表达单位中发现的那种前导序列)。

关于可选择的可分泌标记物，可以认为应用编码一种蛋白的基因是特别有利的，如果这种蛋白是螯合在细胞壁中的和这种蛋白含有一个独特的表位。此类一种分泌抗原标记物，可以理想地应用一种表位序列，这个序列可在植物组织中提供较低背景；它是一个启动子前导序列，可在质膜上赋予有效表达和靶向，并产生结合于细胞壁且能为抗体达到的蛋白。一种正常分泌的细胞壁蛋白如改良为含有一个独特的表位，可以满足所有此类要求。

适合于以这种方式改良的一种蛋白的一个实例是伸展蛋白，或是富羟脯氨酸糖蛋白(HPRG)。例如，就分子生物学、表达和蛋白结构来说，玉米HPRG(Steifel等：The Plant Cell[植物细胞]，2：785(1990))分子是良好表征的。但是，若干伸展蛋白和/或富甘氨酸壁蛋白(Keller等：EMBO Journal[EMBO杂志]，8：1309(1989))，可以通过加入一个抗原位点进行改良，以生成一种可筛查标记物。

a.可筛查标记物

与本发明一起应用的可能的可选择标记物包括(但不限于)：一个neo或nptll基因(Potrykus等：Mol.Gen.Genet.[分子遗传学与普通遗传学]，199：183(1985))，它编码卡那霉素耐药性，可为应用卡那霉素、G418以及诸如此类加以选择；一个bar基因，它赋予对除草剂草丁膦的耐药性；编码一种改变的EPSP合成酶蛋白的一个基因(Hinchee等：Biotech.[生物技术]，6：915(1988))，从而赋予草甘膦耐药性；一个腈水解酶基因，如从臭鼻克雷白杆菌(Klebsiella ozaenae)获得的bxn，它赋予对溴苯腈的耐药性(Stalker等：Science[科学]，242：419(1988))；一个突变体乙酰乳酸合成酶基因(ALS)，它赋予对咪唑啉酮、磺酰脲或其它ALS抑制性化学药品的耐药性(欧盟专利申请号154,204,1985)；一个甲氨喋呤耐药性DHFR基因(Thillet等，J.Biol.Chem.[生物化学杂志]，263：12500(1988))；一个茅草枯脱卤素酶基因，它赋予对除草剂茅草枯的耐药性；一个磷酸甘露糖异构酶(PMI)基因；一个突变的邻氨基苯甲酸合成酶基因，它赋予对5-甲基色氨酸的耐药性；hph基因，它赋予对抗生素潮霉素的耐药性；或甘露糖-6-磷酸异构酶基因(在本文件中也叫做磷酸甘露糖异构酶基因)，它产生代谢甘露糖的能力(美国专利号5,767,378和5,994,629)。对本发明的应用，熟悉本门技术的技术人员能够选择适合的可选择标记基因。如果采用一种突变体EPSP合成酶基因，则可以通过结合一种适合的叶绿体运送肽CTP(欧洲专利号0,218,571,1987)获得其它利益。

关于能在选择转化体的系统中应用的可选择标记基因，一个示范性实施例是编码草丁膦乙酰转移酶的基因，如从吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)获得的bar基因或从绿色产色链霉菌获得的pat基因。这种酶即草丁膦乙酰转移酶(PAT)，能使除草剂双丙氨磷、草丁膦(PPT)中的活性成分失活。PPT能抑制谷氨酰胺合成酶(Murakami等：Mol.Gen.Genet.[分子遗传学与普通遗传学]，205：42(1986)；Twell等：Plant Physiol.[植物生理学]，91：1270(1989))，导致氨的快速累积和细胞死亡。由于在谷类作物转化中报告的重大困难(Potrykus：Trends Biotech.[生物技术趋势]，7：269(1989))，这种选择性系统与单子叶植物一起应用获得成功，这是惊人的。

在本发明的工作中，如果技术人员需要采用一种双丙氨磷耐药性基因，为此目的的一个特别有用的基因是从链霉菌属(Streptomyces)(如ATCC号21,705)可获得的bar或pat基因。已说明bar基因的克隆技术(Murakami等：Mol.Gen.Genet.[分子遗传学与普通遗传学]，205：42(1986)；Thompson等：EMBO Journal[EMBO杂志]，6：2519(1987))，如在除单子叶植物外的植物中bar基因的应用(De Block等：EMBO Journal[EMBO杂志]，6：2513(1987)；De Block等：Plant Physiol.[植物生理学]，91：694(1989))。

b.可筛查标记物

可以采用的可筛查标记物包括(但不限于)：一个葡萄糖苷酸酶或uidA基因(GUS)，它编码已知有各种显色底物的一种酶；一个R-位点基因，它编码调控植物组织中花青素色素(红色)产生的一种产物(Dellaporta等：inChromosome Structure and Function[关于染色体结构和功能]，第263-282页(1988))；一个β-内酰胺酶基因(Sutcliffe：PNAS USA[美国国家科学院院刊]，75：3737(1978))，它编码已知有各种显色底物的一种酶(如PADAC，一种显色头孢菌素)；一个xylE基因(Zukowsky等：PNAS USA[美国国家科学院院刊]，80：1101(1983))，它编码一种儿茶酚双加氧酶，这种酶能转化显色儿茶酚；一个α-淀粉酶基因(Ikuta等：Biotech.[生物技术]，8：241(1990))；一个酪氨酸酶基因(Katz等：J.Gen.Microbiol.[普通微生物学杂志]，129：2703(1983))，它编码能够使酪氨酸氧化成DOPA和多巴醌的一种酶，多巴醌依次浓缩形成一种容易检测的化全物即黑色素；一个β-半乳糖苷酶基因，它编码有显色底物的一种栈道；一个荧光素酶(lux)基因(Ow等：Science[科学]，234：856(1986))，它允许进行生物发光检测；或一个水母发光蛋白基因(Prasher等：Biochem.Biophys.Res.Comm.[生物化学与生物物理研究通讯]，126：1259(1985))，它可用于钙敏感性生物发光检测；或一个绿色荧光蛋白基因(Niedz等，Plant Cell Reports[植物细胞报告]，14：403(1995))。

预期从玉米R基因复合体获得的基因作为可筛查标记物是特别有用的。在玉米中的这种R基因复合体编码一种蛋白，这种蛋白在大多数种子和植物组织中起着调控花青素色素产生的作用。从R基因复合体获得的一个基因适用于玉米转化，因为在转化细胞中这个基因的表达不会损害细胞。因此，在此类细胞中引入一种R基因，会引起红色素的表达；且如果是稳定结合的，则可以用肉眼检查法评分为红色区域。如果一种玉米系携带在花青素生物合成途径中编码这种酶促中间体的基因的显性等位基因(C2、A1、A2、Bz1和Bz2)，但在R位点携带一种隐性等位基因，则从具有R位点的这种玉米系获得的任何细胞转化，都会导致红色素形成。典型的玉米系包括Wisconsin22，它含有rg-Stadler等位基因和TR112，后者是属于r-g，b，P1的一种K55衍生物。或者，如果同时引用C1和R等位基因，则可以使用玉米的任何基因型。对在本发明中应用，预期另一个可筛查标记物是荧火虫荧光素酶，它是由lux基因编码的。在转化细胞中，lux基因的存在情况可以采用下述方法检测：例如，X光照相、闪烁计数法、荧光分光光度法、低光视频照相机、光子计数照相机或多孔发光测定法。可以想象，可以开发这种系统用于生物发光的群组筛查(如在组织培养皿上)或甚至用于全株植物筛查。

用于转化植物的多聚核苷酸可能包括(但不限于)：从植物基因和非植物基因(如从细胞、酵母、动物或病毒获得的那些基因)获得的DNA。引入的DNA可能包括改良基因、基因部分或嵌合基因，包括从相同或不同基因型获得的基因。术语“嵌合基因”或“嵌合DNA”定义为含有至少两个DNA序列或片段的一个基因或DNA序列或片段，这些DNA序列或片段来自在天然条件下不结合DNA的那些物种，或其DNA序列或片段定位或连接的方式在未转化植物的本地基因组中不是正常发生的。

在本发明的一个实施例中，可以制定一种短暂预测模型，用于评价基因抑制的作用。在本文件中所用的术语“抑制”、“抑制作用”、“下调”和“抑制性”，是指一种靶标基因产物表达或功能的任何降低，包括达到这种靶标基因产物表达或功能的完全终止的任何相对减量，包括这种靶标基因产物表达或功能的完全终止。

关于一种靶标基因产物(即重要基因产物)表达或功能的抑制作用，可能是在任何两种植物之间比较的背景下发生的，例如，靶标基因产物在一种遗传转化植物中的表达或功能，对比这种靶标基因产物在相应野生型植物中的表达或功能。或者，这种靶标基因产物表达或功能的抑制作用，可能是在同种植物或植物之间的植物细胞、器官、组织或植物部分之间比较的情况下发生的，包括在同种植物或植物之间的发育阶段或时间阶段之间比较的情况。

在本门技术中，抑制或消除一个基因在一种植物中的表达是众所周知的，任何此类方法均可用于本发明的方法。可以采用与靶标序列的信使RNA(mRNA)至少一部分互补的反义构建。构建反义核苷酸与相应的mRNA进行杂交。可以进行反义序列的改良，只要这些序列能杂交到相应的mRNA上或干扰相应mRNA的表达。采用这种方式，可以使用与相应有义序列具有至少约70％、至少约80％、至少约85％或以上序列的反义构建体。此外，可以使用反义核苷酸的部分来破坏靶标基因的表达。一般说来，可以采用下述情况的序列：至少约10个核苷酸，至少约20个核苷酸，至少约30个核苷酸，至少约40个核苷酸，至少约50个核苷酸，至少约100个核苷酸，至少约200个核苷酸，至少约300个核苷酸，至少约400个核苷酸，至少约450个核苷酸，至少约500个核苷酸，至少约550个核苷酸或以上。在本门技术中，反义方法是已知的。例如，请参见Sheehy等(1988)：Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院院刊)85：8805-8809和美国专利号5,107,065、5,453,566及5,759,829；它通过引用而结合于本文件中。

可以采用协同抑制，来抑制靶标基因的表达。以这种方式，在一种重要植物中在有义方向表达一种异源基因序列，以抑制这种植物中这个内源基因的表达。在本门技术中，协同抑制的方法是已知的。例如，请参见下述文献：Taylor(1997)Plant Cell(植物细胞)，9：1245；Jorgensen(1990)Trends Biotech(生物技术趋势)，8(12)：340-344；Jorgensen等(1996)：Plant Mol.Biol.(植物分子生物学)，31：957-973；Johansen和Carrington(2001)：Plant Physiol.(植物生理学)，126：930-938；Broin等(2002)：Plant Cell(植物细胞)，14：1417-1432；Stoutjesdijk等(2002)：Plant Physiol.(植物生理学)，129：1723-1731；Yu等(2003)：Phytochemistry(植物化学)，63：753-763；Flavell(1994)：Proc.Natl.Acad. Sci.USA(美国国家科学院院刊)，91：3490-3496；Finnegan等(1994)：Bio/Technology(生物技术)，12：883-888；Neuhuber等(1994)：Mol.Gen.Genet(分子遗传学与普通遗传学)，244：230-241；和美国专利号5,034,323、5,283,184及5,942,657；所有这些文献均通过引用而结合于本文件中。

协同抑制涉及具有一种DNA构建体的植物的转化，这种DNA构建含有一个启动子，这个启动子在一种植物中可驱动表达、可操作连接到一个多聚核苷酸至少一部分，这个多聚核苷酸相当于重要基因或靶标基因的转录物。这个核苷酸序列构建或选择为与内源基因转录物的序列具有大体上的序列一致性，典型的情况为大于约60％一致性，更典型的情况为大于约80％序列一致性，更典型的情况是大于约90％序列一致性，在一些实例中大于约95％序列一致性。

也可以采用RNA干扰(RNAi)来下调基因。一般说来，请参见下述文献：Napoli等(1990)：Plant Cell(植物细胞)，2：279-289；美国专利号5,034,323；Sharp(1999)：Genes Dev(基因开发)，13：139-141；Zamore等(2000)：Cell(细胞)，101：25-33；和Montgomery等(1998)：Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院院刊)，95：15502-15507。在RNAi中，可以采用较长的双链RNAs(dsRNAs)(典型为＞200核苷酸)使一种植物中一个靶标基因的表达沉默。在引入时，这种较长的dsRNAs进入细胞途径，这种途径通常叫做RNA干扰(RNAi)途径。首先，采用RNase III样酶把这种dsRNAs处理为20-25个核苷酸(nt)的较小的干扰RNAs(siRNAs)。这些siRNAs组装成含核糖核酸内切酶的复合体，这种复合体叫做RNA诱导沉默性复合物(RISCs)，它们在这个过程中是解旋的。随后，这种siRNA链引导RISCs至互补RNA分子，其中它们切断和破坏同源RNA。同源RNA的切断在接近siRNA链结合区域的中间发生。

以这种方式，可以采用双链RNA(dsRNA)。对dsRNA干扰，与有义RNA分子完全或部分互补的一个有义和一个反义RNA在同一细胞中表达，导致相应内源信使RNA表达的抑制作用。

这种有义和反义分子可以从单独一个或不同的表达盒表达。或者，那么可以筛查采用dsRNA干扰的一个或多个表达盒转化的多种植物系，从而鉴别表现基因表达最大抑制作用的植物系。采用dsRNA干扰抑制植物内源基因表达的方法，在下述文献中说明：Waterhouse等(1998)：Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院院刊)，95：13959-13964；Liu等(2002)：Plant Physiol.(植物生理学)，129：1732-1743；和WO 99/49029、WO 99/53050、WO99/61631及WO 00/49035；它们每个都经引用而结合于本文件中。

在本发明的一些实施例中，对一种基因的抑制，可以通过肝素RNA(hpRNA)干扰或含内含子的肝素RNA(ihpRNA)干扰获得。一种短发夹RNA(shpRNA)是形成一种紧密发夹弯结构的RNA序列，它可用于使基因表达沉默。这些方法在抑制内源基因表达方面是高度有效的。请参见下述文献：Waterhouse和Helliwell(2003)：Nat.Rev.Genet.(自然评论：遗传学)，4：29-38以及本文件中的参考文献。

对hpRNA干扰，表达盒设计为表达一种RNA分子，这种分子可与它本身杂交而形成含有一个单链环区域和一个碱基对主干的一种发夹结构。这个碱基对主干区域包含：一个有义序列，这个有义序列相当于内源信使RNA(它编码其表达被抑制的基因)的全部或部分；一个反义序列，这个反义序列与这个有义序列完全或部分互补。因此，该分子的碱基对主干区域一般确定了RNA干扰的专属性。hpRNA在抑制内源基因的表达方面是高度有效的，它们诱导的RNA干扰被植物的后代继承。例如，请参见下述文献：Chuang和Meyerowitz(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院院刊)，97：4985-4990；Stoutjesdijk等(2002)：Plant Physiol.(植物生理学)，129：1723-1731；和Waterhouse和Helliwell(2003)：Nat.Rev.Genet.(自然评论：遗传学)，4：29-38。采用hpRNA干扰抑制或沉默基因表达的方法在下述文献中说明，例如：Chuang和Meyerowitz(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院院刊)，97：4985-4990；Stoutjesdijk等(2002)：PlantPhysiol.(植物生理学)，129：1723-1731；Waterhouse和Helliwell(2003)：Nat.Rev.Genet.(自然评论：遗传学)，4：29-38；Pandolfini等：BMCBiotechnology(BMC生物技术)，3：7；和美国专利公布号20030175965；它们每个均通过用引而结合于本文件中。关于在体内hpRNA构建体沉默基因表达的效率的一种短暂分析法已在下述文献中说明：Panstruga等(2003)：Mol.Biol.Rep.(分子生物学报告)，30：135-140；通过引用而结合于本文件中。

在本发明的方法，也可以使用干扰性发夹RNA(ihpRNA)。ihpRNA与hpRNA具有相同的一般结构，但这种RNA分子另外含有一个内含子，这个内含子在表达ihpRNA的细胞中能够被剪接。一个内含子的应用，可以尽量减少发夹RNA分子在剪接后的环长度，从而增加干扰的效率。例如，请参见下述文献：Smith等(2000)：Nature(自然)，407：319-320。关于采用ihpRNA干扰抑制植物内源基因表达的方法在下述文献中说明，例如：Smith等(2000)：Nature(自然)，407：319-320；Wesley等(2001)：Plant J.(植物杂志)，27：581-590；Wang和Waterhouse(2001)：Curr.Opin.Plant Biol.(植物生物学最新观点)，5：146-150；Waterhouse和Helliwell(2003)：Nat.Rev.Genet.(自然评论：遗传学)，4：29-38；Helliwell和Waterhouse(2003)：Methods(方法)，30：289-295；和美国专利公布号20030180945；它们每个经引用而结合于本文件中。也请参见WO 02/00904，其中hpRNA设计为这种环区域可以确定RNA干扰的专属性。

在本发明的一些实施例中，可以采用通过编码一种微RNA(miRNA)的基因短暂表达的RNA干扰。miRNAs是调控剂，由约22个核糖核苷酸构成。miRNA在抑制内源基因表达方面是高度有效的。例如，请参见下述文献：Javier等(2003)：Nature(自然)，425：257-263；它通过引用而结合于本文件中。关于miRNA干扰，表达盒设计为表达一种RNA分子，这种RNA分子是根据一种内源miRNA基因制成模型的。miRNA基因能编码形成一种发夹结构的RNA，这种发夹结构含有一个约22核苷酸的序列，这个序列与目标转录物是互补的。例如，一种22个核苷酸的序列是从目录转录物序列选择的，含有所述靶标序列的在有义方向的22个核苷酸和与这个有义序列互补的22个核苷酸的相应反义序列。

关于下述一种靶标蛋白活性的其它方法包括：病毒诱导基因沉默(Burton等(2000)：Plant Cell(植物细胞)12：691-705；和Baulcombe(1999)Curr.Op.Plant Bio[植物生物学最新观点]，2：109-113)；核酶(Steinecke等(1992)：EMBO J[EMBO杂志]，11：1525；和Perriman等(1993)：AntisenseRes.Dev(反义研究和开发)，3：253)；寡聚核苷酸介导靶向改良(如WO03/076574和WO 99/25853)；锌指靶向分子(如WO 01/52620、WO03/048345和WO 00/42219)；转座子标记技术(Maes等(1999)：Trends PlantSci.[植物科学趋势]，4：90-96；Dharmapuri和Sonti(1999)：FEMS Microbiol.Lett.[FEMS微生物学通讯]，179：53-59；Meissner等(2000)：Plant J.[植物杂志]，22：265-274；Phogat等(2000)：J.Biosci.[生物科学杂志]，25：57-63；Walbot(2000)：Curr.Opin.Plant Biol.[植物生物学最新观点]，2：103-107；Gai等(2000)：Nucleic Acids Res.[核酸研究]，28：94-96；Fitzmaurice等(1999)：Genetics[遗传学]，153：1919-1928；Bensen等(1995)：Plant Cell[植物细胞]，7：75-84；Mena等(1996)：Science[科学]，274：1537-1540；和美国专利号5,962,764)；它们每个都通过引用而结合于本文件中。

此外，根据本发明，编码能在一种植物细胞中特异性识别蛋白或其类似物的抗体的核酸分子，即此类一种蛋白的特异性片段或表位，可用于抑制这种蛋白的活性。这些抗体可能是单克隆抗体、多克隆抗体或合成抗体以及抗体片段，如Fab、Fv或scFv片段等。例如，可以通过Kohler和Milstein(Nature[自然]，256(1975)，495)和Galfre(Meth.Enzymol.[酶学方法]，73(1981)3)最先说明的技术制备单克隆抗体，它们是由小鼠骨髓瘤细胞与免疫哺乳动物所得脾细胞融合构成的。此外，可以采用如下述文献所述的方法，获得对前述肽类的抗体或其片段：Harlow和Lane：“Antibodies，A LaboratoryManual(抗体：实验室手册)”，CSH Press，Cold Spring Harbor，1988。在植物抗体或抗体样分子的表达，可以采用本门技术中众所周知的方法达到，例如：全尺寸抗体(During：Plant.Mol.Biol.[植物分子生物学]，15(1990)，281-293；Hiatt：Nature[自然]，342(1989)，469-470；Voss：Mol.Breeding[分子育种]，1(1995)，39-50)、Fab-片段(De Neve：Transgenic Res.[转基因研究]，2(1993)，227-237)、scFvs(Owen：Bio/Technology[生物技术]，10(1992)，790-794；Zimmermann：Mol.Breeding[分子育种]，4(1998)，369-379；Tavladoraki：Nature[自然]，366(1993)，469-472)和dAbs(Benvenuto：PlantMol.Biol.[植物分子生物学]，17(1991)，865-874)已在烟草、马铃薯(Schouten：FEBS Lett.[FEBS通讯]，415(1997)，235-241)或拟南芥属(Arabidopsis)中成功表达，达到了高达6.8％总蛋白的水平(Fiedler：Immunotechnology[免疫技术]，3(1997)，205-216)。

此外，根据本发明，编码一种蛋白的一种突变体形式(如一种酶)的核酸分子，可用于干扰野生型蛋白的活性。此类一种突变体形式优先失去其活性，可以通过该蛋白的氨基酸删除、取代和/或加入其氨基酸序列等方式从相应的野生型蛋白获得。除失去活性外，此类蛋白的突变体形式可以表现底物亲和力增加和/或在细胞中的稳定性增加，例如由于结合了使蛋白在细胞环境中稳定的氨基酸所致。这些突变体形式可以天然发生，或优先为遗传工程设计的突变体。

植物转化

只要一个表达盒、基因和/或重要基因构件已被克隆到表达系统中，它就被转化到植物细胞中。这个表达盒、基因和/或基因构件可以在植物中短暂表达或稳定表达。术语“引入”多聚核苷酸环境(例如一种重要核苷酸构建体)中，目的是表示使这种植物具有这种多聚核苷酸，以致这种多聚核苷酸能进入这种植物一个细胞的内部。当引入一个以上的多聚核苷酸时，这些多聚核苷酸可组装成单独一个核苷酸构建体的一部分，或作为不同的核苷酸构建体，可位于相同的或不同的转化载体上。于是，可在单独一个转化事件和不同的转化事件中、或例如作为育种方案一部分在植物中，把多聚核苷酸引入重要宿主细胞中。本发明的方法不依赖于引入一个或多个多聚核苷酸到一种植物中的一种特定方法，只要这种多聚核苷酸能进入这种植物的至少一个细胞中。

a.植物的短暂转化

在本文件中的方法是指原位(in planta)短暂表达一个表达盒、基因和/或重要遗传构件的方法，以便制定预测模型，用于预测所述表达盒、基因和/或重要遗传构件在稳定转基因植物中如何发挥功能。土壤杆菌(Agrobacterium)浸润法(Agro-infiltration)用于短暂表达的早期应用，是根据白杨和菜豆(Kapila等1997)进行的，后来扩展到烟草(Vaquero等1999)。在本门技术中，在植物中基因的短暂表达是已知的，如早期所述；请参见下述文献了解一篇综述：Fischer等，1999：Biotechnol.Appl.Biochem.[生物技术与应用生物化学]，30，113-116。但是，过去的短暂分析法在他们形成下述预测模型的能力方面受到限制：这种模型用于预测一个相关基因、表达盒和/或重要遗传构件在稳定转基因系中如何发挥功能。同样，还存在一些限制，包括(但不限于)：一种蛋白将被短暂表达的天数，能够被表达的蛋白的量，在分析中的一致性以及要被短暂表达的基因长度。本文件中所披露的方法可以克服这些限制。此外，本发明提供了一种大体上改良的过程，即采用商业用植物原位(in planta)中产生蛋白质，无需建立植物生长机构。这种方法可用于产生至少约0.1-1.0mg、至少约5mg或至少约10mg蛋白，以备分析用。在一项实施例中，采用含有一个表达盒的一种二元载体对1-7天龄叶组织进行土壤杆菌浸润，这个表达盒含有一个启动子、一个内含子和一个重要基因有。在一些实施例中，这个表达盒可能含有转译增强子和/或转录增强子。在另一例实施例中，这种植物叶组织是一种玉米植物叶组织，是采用土壤杆菌浸润的1-7天龄叶组织。在一些实施例中，可对1-20天龄植物组织进行土壤杆菌浸润法。

在一项实施例中，携带一个表达盒(这个表达盒具有一个异常基因或重要基因)的土壤杆菌属细胞，用于传递一个或多个异源基因到一种植物组织中，以便在这种植物组织的细胞和/或细胞外空间进行短暂表达。一般说来，一种合适的表达构件体含有：至少一个T-DNA边缘序列，一个调控序列(如启动子)，一个可操作连接到这个调控序列的重要基因。在一方面，一个表达构建体是一种载体的一部分，这种载体含有一个或多个复制起点，其中至少一个复制起点适用于复制含有土壤杆菌属(Agrobacterium)中表达盒的载体。

把含有本文件所述的表达盒的土壤杆菌属(Agrobacterium)细胞培养物浸润到植物组织中。在优先实施例中，表达盒浸润于1-7天龄的完好植物叶组织。优先情况是，浸润在抽真空条件下进行。在这种植物组织于适当条件(这种条件允许表达盒在大量植物细胞中表达这种蛋白)下进行培养，可以从这些细胞中分离出这种蛋白或蛋白-底物副产物。这种方法要求使植物组织与含有一种二元载体(含有要在植物细胞中短暂表达的一个表达盒)的土壤杆菌属(Agrobacterium)接触，使植物组织用所述土壤杆菌属(Agrobacterium)(含有要在植物细胞中短暂表达的一个表达盒)浸润，以便获得约500μg-约500mg产率的一种相关蛋白。如果需要更多的蛋白以制定预测模型，则可以另外进行一个或多个土壤杆菌浸润法和纯化的回合，或可以使用更多的完好植物组织则更好。

所用的土壤杆菌属(Agrobacterium)可能属野生型(如有毒型)或去毒型。可以使用多种土壤杆菌属(Agrobacterium)菌株(它们每种表达一个不同的基因)，以便产生个别蛋白或heteromultimeri蛋白(如抗体)，或再现一种途径，如一种代谢途径、一种化合合成途径或一种信号转导途径。或者或另外，单独一种土壤杆菌属(Agrobacterium)可能含有大量序列，这些序列含有用于评价相互作用的不同的异源基因。在一项实施例中，至少一种土壤杆菌属(Agrobacterium)菌株含有根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)。

采用土壤杆菌属(Agrobacterium)对一种植物的转化，及其在产生稳定转基因植物中的应用，已有良好的文献记录证实。含有一个T-DNA边界序列的土壤杆菌属(Agrobacterium)细胞与一种植物细胞相互作用，引起蛋白复合的土壤杆菌属(Agrobacterium)T-DNA单链拷贝转移到植物细胞核中。要进行稳定转化，把T-DNA结合于这种核DNA中。虽然这个过程是明显相当高效的，但T-DNA的非结合拷贝能够短暂转录，产生T-DNA基因的短期表达和同时转化的任何其它基因。因为短暂表达并不依赖于DNA的结合或植物的再生，有可能应用更多的土壤杆菌属(Agrobacterium)毒性菌株，无需使用去毒型载体(即不再含有肿瘤诱导基因的载体)，虽然后者也可以使用。

土壤杆菌属(Agrobacterium)的适当菌株包括野生型菌株(如根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens))、或其一个或多个基因突变以增加转化效率的菌株，如vir基因表达和/或其诱导由于突变体或嵌合virA或virG基因存在而改变的土壤杆菌属(Agrobacterium)菌株(如Chen和Winans，1991，J.Bacteriol.[细菌学杂志]，173：1139-1144；和Scheeren-Groot等，1994，J.Bacteriol.[细菌学杂志]，176：6418-6246)。在另一项实施例中，土壤杆菌属(Agrobacterium)菌株可能含有一个额外的virG基因拷贝，如从pTiBo542获得的超virG基因，优先连接到一个多拷贝质粒，例如美国专利号6,483,013所述。

在本门技术中，已经完全了解的是，可以采用例如电穿孔或化学诱导法，土壤杆菌属(Agrobacterium)可用一种既定的重要二元载体进行转化。例如，请参见下述文献：Mersereau M.，Pazour G.J.，Das A.1990：采用电穿孔的根癌土壤杆菌高效转化。Gene(基因)，90：149-151；或R.Nishiguchi等(1987)：Mol.Gen.Genetics(分子遗传学与普通遗传学)，2061-8。

土壤杆菌属(Agrobacterium)的其它适当菌株包括(但不限于)：根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)C58C1(Van Larebeke等，Nature[自然]，252：169-170(1974))、A136(Watson等：J.Bacteriol[细菌学杂志]，123：255-264(1975))、LBA401(Klapwijk等，J Bacteriol[细菌学杂志]141：128-136(1980))、LBA4404(Hoekema等：Nature[自然]303：179-180(1983))、EHA101(Hood等：J.Bacteriol.[细菌学杂志]，168：1291-1301(1986))、EHA105(Hood等：Trans.Res.[转基因研究]，2：208-218(1993))、AGLl(Lazo等：Bio/Technology[生物技术]，2：963-967(1991))和A281(Hood等：supra(1986))。

在本发明的一项实施例中，土壤杆菌属(Agrobacterium)培养物(即根据本发明，含有一个表达盒)在YEB培养基或其任何变化培养基条件(如酵母提取物6g/L、蛋白胨5g/L、硫酸镁2mM和蔗糖5g/L)下生长约2天，培养基中添加适当的抗生素以选择在载体和宿主上发现的耐药性决定子。为培养用于短暂表达的细胞，土壤杆菌属(Agrobacterium)起始培养物可以1∶50比例稀释于新鲜配制YEB培养基中。可以加入抗生素、50mM磷酸钾缓冲液(pH5.8)和20μM乙酰丁香酮。在28℃下培养18-24小时，细胞在600nm波长处达到吸光率为2.5-3.5；吸光率又称为光密度(O.D.)。必要时，采用YEB培养优先把这种细胞稀释到在600nm波长处吸光率为2.5。

在本发明的一项优先实施例中，土壤杆菌属(Agrobacterium)培养物(即根据本明，含有一个表达盒)是在LB培养基或其任何变化培养基条件中生长约24-48小时，在培养基中补加适当的抗生素以选择在载体和宿主上发现的耐药性决定子。为培养用于短暂表达的细胞，土壤杆菌属(Agrobacterium)起始培养物可以1∶50比例稀释于新鲜配制LB培养基中。可以加入抗生素10μM MES(pH 5.6)和100μM乙酰丁香酮。土壤杆菌属在搅拌器中、在250RPM下生长过夜。在28℃下培养18-24小时，细胞在600nm波长处达到吸光率为2.5-3.5；吸光率又称为光密度(O.D.)。必要时，采用LB培养优先把这种细胞稀释到在600nm波长处吸光率为2.5。在培养后，采用在4000g速度下离心10分钟使土壤杆菌属形成小丸。然后把这种小丸再悬浮于感染培养基(Murashige和Skoog盐+维生素、2％蔗糖、500μM MES(pH 5.6)、10μM MgSO₄[硫酸镁]和100μM乙酰丁香酮)至在600nm波长下光学密度等于0.5，随后在28℃下保温2-3小时。

本发明的一个实施例是，在含有一个二元载体(根据本发明，这个二元载体含有一个表达盒)的土壤杆菌属(Agrobacterium)培养物生长和制备后，可以进行单个完好叶的浸润。土壤杆菌浸润法优先在1-9天龄接受植物中进行。土壤杆菌浸润法在3-7天龄植物中进行则更好，或在7天龄植物中进行最好，采用一个5mL注射器，按压注射针头(没有针头)靠着叶子下侧表面。然后把土壤杆菌属(Agrobacterium)培养物浸润于局部植物细胞的细胞外空间中，其中表达盒最终可以进入植物细胞，并被转译成一种蛋白。浸润后的植物可在约25℃下、在16小时照明和8小时黑暗循环的光周期下培养。叶组织可在土壤杆菌浸润法后1-10天之间进行分析，在土壤杆菌浸润法后3-7天之间分析则更好，在土壤杆菌浸润法后7天分析则最好。在一项优先实施例中，单子叶植物的叶组织按本文件说明进行土壤杆菌浸润；在一项更好的实施例中，玉米叶组织可按本文件说明进行土壤杆菌浸润。

本发明进一步涵盖在一种植物部分中短暂表达一种重要核苷酸序列的方法，包含下述步骤：a)一个二元载体经土壤杆菌浸润法浸润于一种植物中，这个二元载体含有一个表达盒，这个表达盒含有至少一个核苷酸序列；和b)在这种植物部分短暂表达至少一个核苷酸序列。在本发明的实施例中，这种方法包含一个表达盒经土壤杆菌浸润法浸润于植物中(in planta)的一种植物部分，这个表达盒含有至少一个核苷酸序列。如熟悉这门技术的人员所理解，土壤杆菌浸润法一般包含一种土壤杆菌属(Agrobacterium)培养物的浸润法，这种培养物含有一个二元载体，这个二元载体含有这个表达盒。

表达盒和植物部分将在本文件的其它章节中详细说明。在本发明的实施例中，这种植物部分是叶组织。

此外，至少一种重要核苷酸序列可以编码一种蛋白或功能性RNA(各在本文件的其它章节中详细说明)。

在代表性的实施例中，这种植物是一种单子叶植物，可选为一种谷类植物。谷类植物如在本文件中说明，包括(但不限于)：玉米、小麦、高梁、大麦、黍、燕麦、水稻和/或黑麦。在本发明的实施例中，这种谷类植物是一种玉米植物或一种高梁植物。在本发明的实施例中，这种谷类植物不是一种水稻植物。

在本发明的典型实施例中，这种方法可有利地在相对幼龄的幼株植物中进行。作为示范，这种植物可为1天至约2、3、4、5、6、7、8或9天龄或其任何天龄组合子集，如从约3天至约4、5、6、7、8或9天龄，或从约5天至约6、7、8或9天龄。在本发明的实施例中，这种植物约为7天龄。

如其它典型实施例，一种谷类植物可在约1叶、2叶、3叶、4叶、5叶、6叶或7叶阶段，或其任何阶段组织子集，如约1叶阶段至约2叶、3叶、4叶、5叶、6叶或7叶阶段，约2叶阶段至约3叶、4叶、5叶、6叶或7叶阶段，约3叶阶段至约4叶、5叶、6叶或7叶阶段。在本发明的实施例中，这种谷类植物在约2叶或约3叶阶段。在一些实施例中，这种谷类植物在约2叶阶段。在一些实施例中，这种谷类植物在约3叶阶段。

玉米的发育阶段是良好界定的，熟悉本门技术的人员能够确定这种情况。例如，玉米发育阶段已区分为营养阶段(V)和生殖阶段(R)。V阶段可以再细分为VE(出苗)、随后是V1、V2、V3、V4、V5、V6等直至V(n)，其中(n)代表在抽穗之前的最后一叶阶段(VT)(特殊报告号48：玉米植物如何发百，Iowa State University of Science and Technology Cooperative ExtensionService[爱荷华州科技大学农业技术合作推广部]，Ames，IA(2005))。叶阶段是根据可见叶领的最高叶界定的；可见叶领的第一部分是背部，它作为介于叶片和叶鞘(Id.)之间的变色线出现。第一片叶一般具有特征性的椭圆形，可用作向上计数至可见最高叶领的参考点(Id.)。如果已发生下面叶损失(一般在约V6时开始)，则下茎梗可能纵向分裂，在第个延长茎梗节间之上的第一节一般是第五叶节，它可用作参考点(Id.)。已为玉米开发了这个命名系统，但也可以推广于其它谷类植物，如对在2叶阶段的一种植物，最高叶是第二叶，其叶领是可见的，如上关于V2阶段的详细说明。

相应地，特别是关于玉米植物，玉米植物可在约V1、V2、V3、V4、V5、V6或V7阶段，或其任何阶段组合子集，如约V1阶段至约V2、V3、V4、V5、V6或V7阶段，约V2阶段至约V3、V4、V5、V6或V7阶段，约V3阶段至约V4、V5、V6或V7阶段。在本发明的实施例中，这种玉米植物是在约V2阶段或约V3阶段。在一些实施例中，这种玉米植物在约V2阶段。在一些实施例中，这种玉米植物在约V3阶段。

在本文件中所述的植物阶段、植物天龄和其它范围的列表目的是包含所有情况的。例如，术语“V1至V3阶段”(和类似术语)包括V1、V2和V3阶段。

土壤杆菌浸润法可选采用一种注射器进行。在代表性的实施例中，这种注射器是一种无针头注射器。在没有针头的注射器情况下，注射器的尖部可靠着植物部分(如叶，可选为该叶的离轴表面)的下侧放置。在代表性的实施例中，这种注射器是一种5mL注射器。然后可以把土壤杆菌属(Agrobacterium)培养物浸润于植物部分，其中这个表达盒最终可以进入植物细胞中并被表达。从已浸润植物培养和收割组织的方法，在本门技术中是已知的，并在本文件中说明。在本发明的实施例中，这种方法不包括摩擦叶(如下述文献所述：Grimsley等：Nature[自然]，325：177-179(1987))。

在代表性实施例中，本发明可能列出了允许更大量液体浸润于植物部件的优点。这个技术对细菌培养物浸润是特别需要的，如土壤杆菌属(Agrobacterium)培养物。在本发明的实施例中，这种方法包含一种液体土壤杆菌属培养物0.1、0.25或0.5mL至约1、2或甚至3mL的土壤杆菌浸润法，这种培物含有这个表达盒。例如，可以把一种土壤杆菌属(Agrobacterium)培养物0.25或0.5mL至约1或2mL经土壤杆菌浸润法浸润于植物部分中，这种培养物含有一种二元载体，这个二元载体含有这个表达盒。相比之下，在以前的、采用二元载体传递一种病毒或病毒载体的技术方法中，土壤杆菌属(Agrobacterium)培养物是被注射到(即采用连接到注射器的一个针头)玉米叶中的，只能注射较小的体积(如2至20μL；例如，请参见下述文献：Grimsley等：Nature[自然]，325：177-179(1987)；Grimsley等：BioTechnology[生物技术]，6：185-189(1988)；Martin等：Virology[病毒学]，89：695-700(1999))。

通过使更大量液体的传递方便化，本发明可以有利地用于把含有一个重要核苷酸序列的细菌载体(如土壤杆菌属(Agrobacteria))传递到原位(inplanta)的一种植物部分。例如，在本发明的实施例中，这种方法允许使用二元载体的土壤杆菌属浸润法，其中这种二元载体不含有一种病毒或病毒载体。

通过避免使用一种病毒系统的需要，本发明也可以提供其它优点。已知病毒载体如玉米条纹病毒(MSV)对他们可以传递的核酸大小有限制(Shene等：Plant J.[植物杂志]5：227-236(1994))。相比之下，本发明可用于传递大于1、1.5、2、3、4或5千碱基或甚至10千碱基和/或小于约7、8、9、10、12、15或20千碱基(包括前述数字的任何组合，只要下限小于上限)的一个表达盒。在本发明的实施例中，这种方法可以采用在大小约3至约10千碱基范围的表达盒实施。

根据代表性的实施例，一种谷类植物(如玉米)的叶采用一种注射器(如一种无针头注射器)在单个位点进行土壤杆菌浸润法，可能导致这种叶组织至少约5％、10％、15％、20％、25％、35％、50％或以上的浸润，典型地限于中脉的一侧。可选的情况是，可以把约50、100、150、200、250或500μL浸润于单独一个位点。在本发明的实施例中，根据叶的尺寸，全叶可以通过移到注射器达到少至2、3、4、5或6个位点而进行浸润。因此，根据本发明，在代表性的实施例中，一种全叶可以采用一种注射器(如一种无针头注射器)在少于约30、20、15或甚至10秒的时间内进行土壤杆菌属浸润。根据叶的尺寸，典型地使用土壤杆菌属(Agrobacterium)约0.25或0.5mL至约1或2mL浸润全叶。

在一些实施例中，可以采用无针头注射器在幼株植物叶组织的下侧进行土壤杆菌浸润法。例如，可以采用下述无针头注射器或相当的商用注射器任何一种，用于实施如本文件所述的本发明的实施例：1mL Tuberculine slip tip(Becton Dickinson Medical，法国)；5ml Luer-slip塑料注射器(NationalScientific)；5mL、10mL或60mL Luer-lok tip塑料注射器(Becton DickinsonMedical，法国)。

可以采用本文件所述的方法，预筛查最适合于在一种生长植物中蛋白表达的表达载体。在一方面，这种方法用于快速筛查能获得最佳蛋白表达的遗传构件或调控序列的变异体。或者或另外，筛查变异体序列，以鉴别能编码具有增加稳定性(或热稳定性)或其它商业属性蛋白的序列。

b.植物的稳定转化

本发明提供了制定预测模型的一种快速方法，即通过原位(in planta)短暂表达一个表达盒、基因和/或基因构件，然后收入收集可以预测所述表达盒、基因和/或基因构件如何在稳定转基因植物系中发挥功能的定量数据和/或定性数据，从而制定预测模型。对熟悉植物转化技术的普通技术人员来说，已知有众多的转化载体可供用于植物转化，适合于本发明的基因可与任何此类载体一起使用。一种载体的选择将取决于优先的转化技术和转化的目标种类。欲知一些目标种类，可以优先采用不同的抗生素或除草剂选择标记物。在转化中常规应用的选择标记物包括：nptll基因，它赋予对卡那霉素和相关抗生素的耐药性(Messing和Vierra：Gene[基因]，19：259-268(1982)；Bevan等：Nature[自然]，304：184-187(1983))；bar基因，它赋予对除草剂草丁膦的耐药性(White等：Nucl.Acids Res[核酸研究]，18：1062(1990)；Spencer等：Theor.Appl.Genet[理论和应用遗传学]，79：625-631(1990))；hph基因，它赋予对抗生素潮霉素的耐药性(Blochinger和Diggelmann：Mol CellBiol[分子与细胞生物学]，4：2929-2931)；和dhfr基因，它赋予对甲氨喋呤的耐药性(Bourouis等：EMBO J[EMBO杂志]，2(7)：1099-1104(1983))；EPSPS基因，它赋予对草甘膦的耐药性(美国专利号4,940,935和5,188,642)；和甘露糖-6-磷酸异构酶基因，它赋予代谢甘露糖的能力(美国专利号5,767,378和5,994,629)。

在本门技术中，再生植物的方法也是众所周知的。例如，Ti质粒载体可用于传递外源DNA，以及直接DNA摄取、电穿孔、微量注射和微粒。此外，从土壤杆菌属(Agrobacterium)获得的细菌可用于转化植物细胞。下面是转化双子叶植物和单子叶植物的代表性方法的说明，以及代表性质粒转化技术的说明。

许多载体提供用于采用根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的转化。这些载体典型地携带至少一个T-DNA边界序列，包括诸如pBIN19(Bevan：Nucl.Acids Res[核酸研究]，(1984))等的载体。欲知在土壤杆菌属(Agrobacterium)转化中有用的载体的构建，例如请参见美国专利号2006/0260011；此文献通过引用而结合于本文件中。

没有应用根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的转化，规避了在所选择转化载体中T-DNA序列的要求，因此除上述含有T-DNA序列的载体外，可以使用缺乏这些序列的载体。不依赖于土壤杆菌属(Agrobacterium)的转化技术包括通过粒子轰击法、原生质体摄取(如PEG和电穿孔)和微量注射的转化。载体的选择主要取决于要转化的种类的优先选择。欲知此类载体的构件，例如请参见美国专利号20060260011；此文献通过引用而结合于本文件中。

欲知关于在植物质粒中一个序列的表达，可以使用质粒转化载体pPH143(WO 97/32011，实例36)。把这个核苷酸序列插入pPH143中，从而取代PROTOX编码序列。然后这个载体用于质粒转化和壮观霉素耐药性转化体的选择。或者，把这种核苷酸序列插入pPH143中，使它取代aadH基因。在这种情况下，可以选择对PROTOX抑制药耐药性的转化体。

在本门技术中，双子叶植物的转化技术是众所周知的，包括基于土壤杆菌属(Agrobacterium)的技术和不需要土壤杆菌属(Agrobacterium)的技术。非土壤杆菌属(Agrobacterium)介导的技术涉及原生质体或细胞直接摄取外源遗传物质。这可以采用PEG或电穿孔介导摄取、粒子轰击介导传递或微量注射完成。这些技术的实例由下述文献说明：Paszkowski等：EMBO J(EMBO杂志)，3：2717-2722(1984)；Potrykus等：Mol.Gen.Genet.(分子遗传学与普通遗传学)，199：169-177(1985)；Reich等：Biotechnology(生物技术)，4：1001-1004(1986)；和Klein等：Nature(自然)，327：70-73(1987)。在每种情况下，采用本门技术中已知的标准技术，可以把转化的细胞再生为全株植物。

由于转化的较高效率和对许多不同种类的广泛可用性，土壤杆菌属(Agrobacterium)介导的转化是双子叶植物的一种优先转化技术。土壤杆菌属(Agrobacterium)介导的转化典型地涉及把携带重要外源DNA(如pCIB200或pCIB2001)的二元载体传递到一种适当的土壤杆菌属(Agrobacterium)菌株，这种菌株可能依赖于由这种宿主土壤杆菌属(Agrobacterium)在共居Ti质粒上或在染色体上携带的vir基因，例如用于pCIB200和pCIB2001的CIB542菌株(Uknes等：Plant Cell[植物细胞]，5：159-169(1993))。这种重组二元载体转移到土壤杆菌属(Agrobacterium)中，是采用携带这种重组二元载体的大肠杆菌(E.coli)三亲株交配程序完成的；这种大肠杆菌(E.coli)是一种大肠杆菌(E.coli)协助菌株，它携带诸如pRK2013的一种质粒，它也能动员这种重组二元载体到目标土壤杆菌属(Agrobacterium)菌株中。或者，这种重组二元载体可以通过DNA转化而转移到土壤杆菌属(Agrobacterium)中(Hofgen & Willmitzer：Nucl.Acids Res.[核酸研究]，16：9877(1988))。

采用重组土壤杆菌属(Agrobacteria)进行目标植物种类的转化，通常涉及这土壤杆菌属(Agrobacteria)与来自这种植物的外植体共同培养，并遵守在本门技术中众所周知的方案。转化的组织是在携带一种抗生素或除草剂耐药性标记物的可选择培养基中再生的，这种标记物存在于二元质粒T-DNA边界之间。

采用一个基因转化植物细胞的方法，涉及在植物组织和细胞中推进惰性或生物活性粒子。这种技术在美国专利号4,945,050、5,036,006和5,100,792中披露，所有它们都属于Sanford等的专利。一般说来，这种程序涉及在细胞中推进惰性或生物活性粒子，在对穿过细胞外表面和实施其内部的结合有效的条件下进行。当采用惰性粒子时，可以采用含有所需要基因的载体涂层这种颗粒，把这种载体引入细胞中。或者，目标细胞可为载体包围，以便载体被颗粒的尾流引入细胞中。也可以把生物活性粒子(如干酵母细胞、干细菌或噬菌体，各含有需要引入的DNA)推进到植物细胞组织中。

目前，大多数单子叶种类的转化已成为常规程序。优先的技术包括采用PEG或电穿孔技术进行直接基因转移至原生质体中，采用粒子轰击进入愈伤组织中。转化也可以采用单DNA种类或多DNA种类(即共转化)进行。共转化可能具有下述的优点：避免完整的载体构建，对重要基因和可选择的标记物采用未连接的位点产生转基因植物，使在后代中可以除去可选择标记物(假如这种情况是需要的)。但是，采用共转化的一个缺点是，DNA种类结合于基因组的频率小于100％；单个DNA种类分别结合时，结合于基因组的频率是100％(Schocher等：Biotechnology[生物技术]，4：1093-1096(1986))。

专利申请号EP 0292435、EP 0392225和WO 93/07278，说明从一种玉米精英纯系制备愈伤组织和原生质体、采用PEG或电穿孔法转化原生质体、从转化的原生质体再生玉米植物。Gordon-Kamm等(Plant Cell[植物细胞]，2：603-618(1990))和Fromm等(Biotechnology[生物技术]，8：833-839(1990))已发布采用粒子轰击法进行A188获得玉米系转化的技术。此外，WO93/07278和Koziel等(Biotechnology[生物技术]，11：194-200(1993))描述采用粒子轰击法进行玉米精英纯系转化的技术。这种技术采用在授粉和PDS-1000He Biolistics仪器进行轰击后14-15天从玉米穗叶上切下的1.5-2.5mm长度的、未成熟的玉米胚胎。

也可以采用原生质体或粒子轰击法，通过直接基因转移技术进行水稻的转化。对Japonica-类型和Indica-类型已说明原生质体介导的转化(Zhang等：Plant Cell Rep[植物细胞报告]，7：379-384(1988)；Shimamoto等：Nature[自然]，338：274-277(1989)；Datta等：Biotechnology[生物技术]，8：736-740(1990))。采用粒子轰击法，这两种类型也是可以常规转化的(Christou等：Biotechnology[生物技术]，9：957-962(1991))。此外，WO 93/21335说明了采用电穿孔法进行水稻转化的技术。

专利申请号EP 0332581说明早熟禾亚科(Pooideae)原生质体的产生、转化和再生的技术。这些技术允许鸭茅属和小麦的转化。此外，小麦转化已为Vasil等所说明(Biotechnology[生物技术]，10：667-674(1992))，即采用粒子轰击法进入C型长期可再生愈伤组织的细胞中；小麦转化也为Vasil等(Biotechnology[生物技术]，11：1553-1558(1993))和Weeks等(PlantPhysiol.[植物生理学]102：1077-1084(1993))所说明，即采用未成熟胚胎和胚胎获得未成熟愈伤组织的粒子轰击法进行。但是，小麦转化的一项优选技术涉及采用未成熟胚胎的粒子轰击法进行小麦转化，在基因传递之前包括一个较高级蔗糖步骤和一个较高级麦芽糖步骤。在轰击之前，把任意数量的胚胎(长度0.75-1mm)在的MS培养基上制成平板，此培养基含有3％蔗糖(Murashiga和Skoog：Physiologia Plantarum[植物生理学]，15：473-497(1962))和3mg/L 2，4-D，用于诱导体细胞胚胎，这可以在黑暗环境中进行。在所选择的轰击法当天，从诱导培养基人取下胚胎，放在渗压剂上(即诱导培养基加有所需要浓度的蔗糖或麦芽糖，此浓度典型为15％)。允许胚胎进行胞浆分泌2-3小时，然后进行轰击。每个目标平板20个胚胎是典型的，虽然不是临界的。采用标准程序，把一种适当的、携带质粒(pCIB3064或pSOG35)沉淀于微米尺寸的金粒子上。胚胎的每个平板采用DuPont

氦仪器、采用标准80目筛网在约1000psi的爆裂压力下轰击。在轰击后，把胚胎放回黑暗环境中，恢复约24小时(仍在渗压剂上)。在24小时后，从渗压剂上取下胚胎，放回诱导培养基中，其中它们培养约1个月，然后进行再生。约1个月后，把具有正在发育胚胎发生愈伤组织的胚胎外植物体转移到再生培养基(MS+1mg/L NAA，5mg/L GA)中，此培养基另外还含有适当的选择剂(在pCIB3064情况下为10mg/L basta，在pSOG35情况下为2mg/L甲氨喋呤)。在约1个月后，把已发育的幼芽转移到更大的无菌容器中，这种容器叫做“GA7s”，它含有半含量MS、2％蔗糖和相同浓度的选择剂。

已说明采用土壤杆菌属(Agrobacterium)进行单子叶植物的转化。请参见WO 94/00977和美国专利号5,591,616；它们二者均通过引用而结合于本文件中。也请参见下述文献：Negrotto等：Plant Cell Reports(植物细胞报告)，19：798-803(2000)；此文献通过引用而结合于本文件中。

例如，可以使用水稻(Oryza sativa)来产生转基因植物。可以使用各种水稻栽培品种(Hiei等：1994，Plant Journal[植物杂志]，6：271-282；Dong等，1996：Molecular Breeding[分子育种]，2：267-276；Hiei等，1997：PlantMolecular Biology[植物分子生物学]，35：205-218)。同样，下述各种培养基成分可以不同的量使用或用其它成分代替。通过培养在MS-CIM培养基(MS基础盐培养基，4.3g/L；B5维生素(200X)，5mL/L；蔗糖，30g/L；脯氨酸，500mg/L；谷氨酸，500mg/L；酪蛋白水解物，300mg/L；2，4-D(1mg/mL)，2mL/L；用1N氢氧化钾调节pH至5.8；Phytagel，3g/L)上培养，开始胚胎发生反应和/或建立培养物。用含有所需载体构建的根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株LBA4404(土壤杆菌属(Agrobacterium))，在初级培养阶段接种成熟胚或接种已建立的培养系，并共同培养。把土壤杆菌属(Agrobacteria)用固定YPC培养基(100mg/L壮观霉素和任何其它适当的抗生素)上的甘油原料于28℃下培养约2天。把土壤杆菌属(Agrobacteria)再悬浮于液体MS-CIM培养基中。把土壤杆菌属(Agrobacterium)稀释至OD600为0.2-0.3，加入乙酰丁香酮使成最终浓度200uM。在该溶液与水稻培养物混合之前，加入乙酰丁香酮以诱导土壤杆菌属进行至植物细胞的DNA转移。为进行接种，把植物培养物浸入细菌混悬液中。除去液体细菌混悬液，把接种的培养物放在共同培养基上，于22℃下培养2天。然后把这种培养物转移到含有替卡西林(400mg/L)的MS-CIM培养基中，以抑制土壤杆菌属(Agrobacteria)的生长。为获得采用PMI可选择标记物基因的构件体(Reed等：In Vitro Cell.Dev.Biol.-Plant[体外细胞和发育生物学-植物]，37：127-132)，在7天后把培养物转移到含有甘露糖作为碳水化合物来源的选择培养基(MS加2％甘露糖、300mg/L替卡西林)上，在黑暗环境中培养3-4周。然后把耐药性菌落转移到再生诱导培养基(MS不含2，4-D，0.5mg/L IAA，1mg/L玉米素，200mg/L特美汀[替卡西林-克拉维酸钾]，2％甘露糖，3％山梨醇)上，并在黑暗环境中生长14天。然后把正在繁殖的菌落转移到另一回合再生诱导培养基上，并移到明亮的生长室中。把再生的幼芽转移到加有GA7-1培养基(MS不含激素，加2％山梨醇)的GA7容器中培养2周；然后，当它们足够大和有充分的根系时，把它们移到温室中。把植物移栽到温室的土壤中(至产生)，生长至成熟，然后收割T1种子。

通过采用本发明的一个核苷酸序列进行转化获得的植物，可能属于较大范围植物种类中的任何一种，包括单子叶植物和双子叶植物；但是，在本发明的方法中使用的植物优先从上述提出的农艺学重要目标作物列表中选择。通过育种，可以把本发明的一个基因的表达，与对生产和质量重要的其它特征一起结合于植物系中。在本门技术中，育种方法和技术是已知的。例如，请参见下述文献：Welsh J.R.：Fundamentals of Plant Genetics and Breeding(植物遗传学和育种基础)，John Wiley & Sons，NY(1981)；Crop Breeding(作物育种)，Wood D.R.(编辑)，American Society of Agronomy(美国农学会)，Madison，Wis.(1983)；Mayo O.：The Theory of Plant Breeding(植物育种理论)，第二版，Clarendon Press，Oxford(1987)；Singh，D.P.：Breeding forResistance to Diseases and Insect Pests(抗疾病和抗虫害育种)，Springer-Verlag，NY(1986)；和Wricke and Weber：Quantitative Genetics andSelection Plant Breeding(植物育种定量遗传学和选择，Walter de Gruyter andCo.，Berlin(1986)。

为进行质粒的转化，把烟草(简称“Xanthienc”)的种子在l″环形阵列中、在T琼脂培养基上发芽7株/平板，在播种后12-14天用1um钨粒子(M10，Biorad，Hercules，Calif.)轰击；如所述(Svab，Z.和Maliga，P.(1993)PNAS[美国科学院院刊]，90，913-917))，钨粒子采用主要从质粒pPH143和pPH145获得的DNA涂层。在切下叶后，轰击过的幼苗在T培养基上培养2天，并在强光(350-500μmol光子/m²/s)下、放在含有500ug/mL二盐酸壮观霉素(Sigma，St.Louis，Mo.)RMOP培养基(Svab，Z.，Hajdukiewicz，P.和Maliga，P.(1990)：PNAS[美国国家科学院院刊]，87，8526-8530)上，离轴一侧向上放置。在轰击后3-8周，把发生下部叶和漂白叶的耐药性幼芽亚克隆在相同的选择性培养基上，使之形成愈伤组织，然后分离次生幼芽并亚克隆。采用标准Southern印迹法(Sambrook等(1989)：Molecular Cloning：ALaboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor)评估独立亚克隆中的转化质粒基因组副本(同质性)的完全分离情况。从1％氨丁三醇硼酸(TBE)分离BamHI/EcoRI-消化的细胞总DNA(Mettler，I.J.(1987)：Plant Mol Biol Reporter[植物分子生物学导报]，5,346349)，并转移到尼龙膜(Amersham)上，用³²P-标记随机启动DNA序列进行探针检测；这个DNA序列相当于0.7kb BamHI/HindIII DNA片段，来自含有一部分rps 7/12质粒靶向序列的pC8。同质幼芽在无菌条件下种植在含壮观霉素的MS/IBA培养基上(McBride，K.E.等(1994)：PNAS[美国科学院院刊]，91，7301-7305)，并转移到温室中。

通过有性生殖或营养生长，遗传特性经基因工程设计于上述转基因种子和植物中而传递，从而可在后代植物中维持和繁殖。一般说来，维持和繁殖可以应用已知的、开发适合于特殊目的的农业方法，如耕作、播种或收割。

根据本发明，在植物育种中可以进一步应用转基因植物和种子的有利的遗传特性。根据需要的特性，可以采用不同的育种措施。在本门技术中相关技术是众所周知的，包括(但不限于)杂交、同系交配、回交育种、多系育种、品种混合、种间杂交、异倍体技术等。因此，根据本发明，转基因种子和植物可用于改良植物系的育种，例如，这种植物系能增加传统方法如除草剂或杀虫剂处理，或由于它们改良的遗传特性可使技术人员可以采用所述方法进行调配。

在本规范中引用的所有专利和非专利申请，都提示对与本发明有关技术熟悉的技术人员的技术水平。所有这些出版物和专利申请都通过引用而结合于本文件中，其程度就如同专门和个别指出每个个别出版物或专利申请通过引用而结合于本文件中一样。

实例

本文件中所用的标准重组DNA和分子克隆技术在本门技术中是众所周知的，在下述文献中说明：J.Sambrook、E.F.Fritsch和T.Maniatis：MolecularCloning：A Laboratory manual(分子克隆：实验室手册)，Cold Spring Harborlaboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)；和T.J.Silhavy、M.L.Berman和L.W.Enquist：Experiments with Gene Fusions(基因融合)，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.(1984)；及Ausubel，F.M.等：CurrentProtocols in Molecular Biology(分子生物学实验方法汇编)，由GreenePublishing Assoc.和Wiley-Interscience出版(1987)。

现在，我们通过几个工作实例说明本发明。这些实例是用作示范目的，无论如何并不表示限制本发明。

实例1：二元载体的构建

总共构建29个二元载体，以试验短暂分析法的各种参数，以及它产生一个表达盒短暂表达和/或表达元件之间预测性相关关系的能力和相同的表达盒和/或表达元件如何在稳定转基因植物系中发挥功能。请参见表1，了解表达盒构件的总结以及每个二元构建体的总结。

表1：二元载体表达盒的总结

表1概述了稳定转基因植物产生以及完好幼株植物叶组织短暂表达两种情况所用的二元表达构建体。编码蛋白的DNA序列是针对适当宿主进行密码子优化的。例如，设计用于烟草和玉米转基因植物短暂和稳定表达的表达构建体，是针对双子叶植物进行密码子优化的，而设计用于甘蔗或玉米转基因植物短暂和稳定表达的表达构建体，是对针单子叶植物进行密码子优化的。密码子优化表是通过商业软件应用程序提供的，如Vector NTI 11.0(Invitrogen，美国)。

标准克隆技术如PCR、限制性内切酶消化、凝胶电泳和子序列片段纯化、DNA连接、细菌细胞转化和选择以及诸如此类，用于产生表1所述的载体(请参见Sambrook 1985，了解标准方法)。在表1中所述表达载体的一些构件，是通过商业DNA合成实验室(GeneArt，德国)合成的。

二元载体18505含有的表达盒具有可以这种顺序操作连接的下述构件：玉米磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPC)启动子(SEQ ID NO：1)；β-葡萄糖苷酸酶(GUS)基因(SEQ ID NO：14)；和玉米PEPC终止序列(SEQ ID NO：21)。除下述情况外，18506与18505相同：两个转录增强子，即来自玄参花叶病毒(FMV)(SEQ ID NO：11)的增强子区域和花椰菜花叶病毒35s(e35S)增强子区域(SEQ ID NO：12)，纳入这个启动子的上游。除下述情况下，18507与18505相同：一个烟草花叶烟草病毒组ω(TMV)转译增强子(SEQ ID NO：13)纳入GUS基因的上游。除下述情况下，18545与18505相同：两个转录增强子即FMV和e35S纳入这个启动子的上游，转译增强子TMV纳入GUS基因的上游。

二元载体18508含有的表达盒具有可以这种顺序操作连接的下述构件：玉米范素361(ZmUbi361)启动子(SEQ ID NO：2)；GUS基因和ZmUbi361终止序列(SEQ ID NO：22)。除下述情况外，18509与18508相同：两个转录增强子即FMV和e35S纳入这个启动子的上游。除下述情况外，18633与18505相同：TMV纳入GUS基因的上游。除下述情况外，17282与18633相同：两个转录增强子即FMV和e35纳入这个启动子的上游。

二元载体18503含有的表达盒具有可以这种顺序操作连接的下述构件：洋丁香属黄曲叶病毒(CMP)启动子(SEQ ID NO：3)；GUS基因；和胭脂碱合成酶(NOS)终止序列(SEQ ID NO：23)。除下述情况下，18504与18503相同：两个转录增强子即FMV和e35S纳入这个启动子的上游，转译增强子TMV纳入GUS基因的上游。

二元载体17313含有的表达盒具有可以这种顺序操作连接的下述构件：玉米色氨酸合成酶α亚单位(ZmTrpA)启动子(SEQ ID NO：4)；GUS基因和ZmTrpA终止序列(SEQ ID NO：24)。除下述情况下，17319与17313相同：两个转录增强子即FMV和e35纳入这个启动子的上游，转译增强子TMV纳入GUS基因的上游。

二元载体18550含有的表达盒具有可以这种顺序操作连接的下述构件：玉米ZmUbi1-10启动子(SEQ ID NO：5)；GUS基因和NOS终止序列。除下述情况外，18746与18550相同：玉米Kozak序列(TAAACC)已终止，它常规在GUS基因的ATG密码子之前。除下述情况外，18874与18550相同：玉米prZmUbi1-4(SEQ ID NO：6)启动子用于代替玉米prZmUbi1-10启动子，两个转录增强子FMV和e35S纳入这个启动子的上游，转译增强子TMV纳入GUS基因的上游。

二元载体17084含有的表达盒具有可以这种顺序操作连接的下述构件：ZmPEPC启动子；一个内切葡聚糖酶(EG)编码序列(SEQ ID NO：15)+一个γ玉米蛋白；在5′-端的一个19氨基酸信号肽和在3′-端的一个ER保留序列(SEKDEL)；和PepC终止序列(SEQ ID NO：25)。除下述情况外，17085和17084相同：EG基因含有一个种子蛋白储藏空泡靶向序列。除下述情况外，17086与17084相同：EG基因靶向质外体。除下述情况外，15944与17084相同：含有一个ER保留序列的一个纤维二糖水解酶I基因(SEQ ID NO：16)，用于代替EG基因。除下述情况外，15942与17084相同：含有一个空泡靶向序列的一个纤维二糖水解酶I基因(SEQ ID NO：17)，用于代替EG基因。

二元载体17305含有的表达盒具有可以这种顺序操作连接的下述构件：水稻MADs盒基因启动子区域(OsMADs13)(SEQ ID NO：7)；一个葡聚糖水合二激酶(R1)RNAi表达盒(SEQ ID NO：18)；和OsMADS13终止序列(SEQID NO：26)。二元载体17308含有的表达盒具有可以这种顺序操作连接的下述构件：玉米PepC启动子；一个R1 RNAi表达盒；和NOS终止序列。二元载体18286含有的表达盒具有可以这种顺序操作连接的下述构件：玉米TrpA启动子；R1 RNAi表达盒；和一个玉米TrpA终止序列。

二元载体18221含有的表达盒具有可以这种顺序操作连接的下述构件：两个转录增强子，即FMV和e35S；ZmUbi361-01启动子；转译增强子即TMV；一个木聚糖酶基因(SEQ ID NO：19)；和ZmUbi361终止序列。除下述情况外，18216与18221相同：EG基因用于代替木聚糖酶基因。除下述情况外，17632与18221相同：CBHI空泡靶向基因用于代替木聚糖酶基因。

二元载体15060含有的表达盒具有可以这种顺序操作连接的下述构件：玉米PepC启动子；一个苏云金芽孢杆菌(Bacillus thurengiensis)Cry1Ab基因(SEQ ID NO：20)；和一个NOS终止序列。

实例2：短暂的原位分析法

如实例1所述，把表达盒克隆于一个二元载体中。采用一种冷冻-解冻法，把这种构建体转移到含有协助质粒(pSBI)的根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株LBA4404中[An等：二元载体。在：Gelvin SB，Schilproot RA(编辑)，Plant molecular biology manual(植物分子生物学手册)。KluwarAcademic Publishers，Dordrecht，第A31-19页(1988)]。土壤杆菌属(Agrobacterium)培养物的制备，如下述文献所述：Azhakanandam等：Plant Mol.Biol.(植物分子生物学)，63：393-404(2007)。简言之，把遗传改良的土壤杆菌属(agrobacteria)在YP培养基50mL中培养过夜，该培养基含有100μM乙酰丁香酮和10μM MES(pH 5.6)；随后在4000Xg离心10分钟制成小丸。把这种小丸再悬浮于感染培养基中[Murashige和Skoog盐加维生素，2％蔗糖，500μM MES(pH 5.6)，10μM MgSO4(硫酸镁)，和100μM乙酰丁香酮]，调节至OD600＝0.5，随后于28℃下培养2-3小时。

采用玉米幼苗建立原位(In-planta)的短暂表达系统。在温室条件下，种子在采用Fafard发芽混合物填装的2.5”钵中发芽。幼苗保持在14/10的白天/黑夜周期，白天照明强度2000μ-mol-m-2.s-1，用补充照明维持。稳定在23℃-26℃之间维持稳定。土壤杆菌浸润法采用在V1至V3阶段的、具有2-6个可见叶的幼苗培养(Ritchie S.W.，Hanway J.J.Benson G.O.[编辑]：如何开发玉米植物：爱荷华州大学特别报告号48，2005年7月)。根据这项工作，我们确定具有3个可见叶的V2阶段进行土壤杆菌浸润法最好。土壤杆菌浸润法实验主要是采用V2阶段的初生叶和次生叶进行的。为使浸润法更容易进行，在土壤杆菌浸润法之前使幼苗浸水1-2小时，保持叶膨胀和气孔打开。单个叶的浸润法，是采用一个5mL注射器体(带Luer-LokTM尖的BD 5mL注射器，Franklin Lakes，NJ 07427，美国)在玉米幼苗上进行的。V2阶段的第一片和第二片可见叶采用下述溶液浸润：土壤杆菌属(agrobacterium)混悬液1mL/28秒/叶。高梁和水稻幼苗也以和玉米同样的方式浸润，但水稻幼苗为45天龄。浸润后的植物转移，并在生长室条件下培养；生长室条件设置为：25℃，16/8的白天/夜间周期，照明强度1900μ-mol-m-2.s-1。在浸润后3-7天收割植物组织，以备后来分析。

为确保所测定的酶活性是由于酶的植物表达引起的，表达构建体也结合在编码该酶的多聚核苷酸序列中的一个内含子。与土壤杆菌属(agrobacterium)表达(不能加工内含子，因此不能表达一种功能性酶/蛋白)比较，存在内含子，可以确保该酶的表达是由于植物表达引起的(能够在内含子外加工，因此表达一种完全加工的酶)。

实例3：植物的稳定转化

为便于比较对稳定转基因植物的稳定表达，如实例1所述的每个二元构建体，均稳定转化于玉米中。玉米转化如报告那样进行(Negrotto等，2000；Li等，2003；Ishida，1996)。转基因事件发到温室进行各种分析，如DNA、RNA和蛋白表达，并从一级转化体收集种子。

实例4：关于稳定转基因系表达盒功能和后代相关关系的短暂分析

表2-4总结了含有表达盒的短暂和稳定转化体的数据，这个表达盒含有各种启动子连同转录增强子和转译增强子二者。对所有样品，均采用GUS组织化学分析法和GUS定量ELISA进行GUS染色分析。GUS组织化学分析用于定位GUS蛋白是否存在于植物组织中。

从含有GUS基因的转基因植物收割叶，也浸润含有GUS基因的植物，并采用GUS缓冲液染色，如Azhakanandam等(2000)所述。GUS定量ELISA是通过进行萃取步骤而进行的，萃取步骤是采用收割的叶样品在BB/PVP/Tw萃取缓冲液(0.1M硼酸、pH 7.5，含0.5％吐温-20和0.2％聚乙烯基吡咯烷酮)中进行萃取。叶组织约50mg采用萃取缓冲液0.5mL进行萃取。对上清液进行分析。可溶性蛋白总量是采用BCA法(Pierce BCA蛋白分析试剂盒，Cat#23223and 23224)测定的，使用卵白蛋白作为标准品。高结合率96-孔平板(NuncMaxisorp)在4℃下、用2μg/ml兔抗GUS IgG(Sigma G5545)的25mM硼酸、75mM氯化钠、pH 8.5(100μL/孔)溶液中涂层过夜。平板用含0.05％吐温-20和0.2％NaN3(叠氮化钠)的10mM氨丁三醇、pH 8.0溶液洗涤三次。把样品或标准品(GUS VII-A型，Sigma G7646)加到平板(100μL/孔)，在室温、搅拌下培养1小时，并洗涤5次。然后，把100μL/孔的2μg/mL HRP标记兔抗GUS IgG(Invitrogen A5790结合于HRP)添加到平板上，在室温、搅拌下培养1小时，并洗涤，如前述。通过加入100μL/孔四甲基联苯胺(TMB，SigmaT0440)和在室温下发育30分钟，检测HRP结合抗体。通过加入100μL/孔的0.1N HCl(盐酸)而停止反应。采用一个全自动定量绘图酶标仪(Tecan Sunrise，Research Triangle Park，NC)，在450nm处测定吸光度为620时作为对照。GUS标准曲采用4参数曲线拟合。在从0-320ng/mL的范围，该曲线对比对数值绘图成线性。

PEPC启动子评价

构建体18505、18506、18507和18545在实验上用于确定，当与稳定转化玉米叶组织(请参见表2)进行比较时，在短暂转化玉米叶组织中有关表达盒的功能(相对于GUS表达)之间是否存在相关关系。为进行短暂分析，采用4种植物/构建体。对每种植物，两种叶经土壤杆菌浸润法浸润，如实例2所述。组织是从浸润叶收集的，并采用定量ELISA进行分析，如前面测定GUS蛋白所述。

表2：关于含有PEPC启动子和各种表达元件组合的短暂玉米叶组织和稳定转基因玉米叶组织二者GUS染色数据的总结

根据表2中的数据，这种短暂系统可预测对稳定转基因植物的、在低/中/高基础上的蛋白表达。构建体18506含有PEPC启动子连同FMV和e35s转录增强子，在短暂和稳定转基因玉米样品中能发挥最佳功能。惊人的是，在短暂和稳定转化体中已表明TMV能抑制GUS的表达。或者，FMV和e35s(不与TMV组合)组合能显著增加GUS在短暂和稳定转基因植物中的GUS表达。

ZmUbi361启动子评价

构建体18508、18509、18633和17282在实验上用于确定，当与稳定转化玉米叶组织(请参见表3)进行比较时，在短暂转化玉米叶组织中有关表达盒的功能(相对于GUS表达)之间是否存在相关关系。为进行短暂分析，采用4种植物/构建体。对每种植物，两种叶经土壤杆菌浸润法浸润，如实例2所述。组织是从浸润叶收集的，并采用定量ELISA进行分析，如前面测定GUS蛋白所述。

表3：关于含有ZmUbi361启动子和各种表达元件组合的短暂玉米叶组织和稳定转基因玉米叶组织二者GUS染色数据的总结

如表3中所见，短暂数据与稳定玉米转基因植物中产生的数据有相关关系。如采用PEPC启动子所见，在短暂和稳定转基因试验组中，相对于GUS表达的最佳组合是Ubi361启动子与FMV和Ee35ss转录增强子二者组合。在短暂和稳定试验组两组中，第二最高GUS表达的是含有Ubi361启动子、FMV和e35s转录增强子、TMV转译增强子的组合。惊人的是，TMB看来再次抑制GUS表达，如PEPC实验中所见(表2)。

CMP启动子评价

构建体18503和18504在实验上用于确定，当与稳定转化玉米叶组织(请参见表4)进行比较时，在短暂转化玉米叶组织中有关表达盒的功能(相对于GUS表达)之间是否存在相关关系。为进行短暂分析，采用4种植物/构建体。对每种植物，两种叶经土壤杆菌浸润法浸润，如实例2所述。组织是从浸润叶收集的，并采用定量ELISA进行分析，如前面测定GUS蛋白所述。

表4：关于含有CMP启动子和各种表达元件组合的短暂玉米叶组织和稳定转基因玉米叶组织二者GUS染色数据的总结

如表4所见，对稳定转基因玉米植物，短暂数据再次预测相对于GUS表达的最佳表达盒(18504)。

总之，如表2-4所见，短暂分析法能成功预测(相对于GUS表达水平)所有三个启动子与FMV和e35s转录增强子组合将会在稳定转基因玉米系中发挥最佳功能。短暂的原位分析法的这种同样的预测能力，也可以在TRPA茎柄优选启动子的短暂分析中观察到，如表5所见。与T0玉米植物的分析(可能需要几个月生长植物和分析)比较，短暂分析可以在约1周的过程中进行。这种短暂方法也能快速鉴别(如在稳定转基因植物中验证)，在许多情况下TMV转译增强子能抑制基因(GUS)表达，它是由于TMV区域的假定功能引起的，这是惊人的。如上表2-4所述，至少在试验样品，TMV的存在能抑制GUS表达。再者，这种观察可通过应用短暂的原位方法所预测，如本文件所示范。预测在稳定转基因植物中发生情况的另一项观察，是FMV和e35s转录增强子二者组合能引起GUS表达的显著增加的事实。如上表2-4所示，短暂的原位方法可以定量和快速预测产生稳定转基因玉米系的启动子/增强子组合。在评价任何一个既定重要基因表达的最佳表达盒时，短暂的原位方法可以显著节约时间、资源、温室空间和费用。

表5：含有TrpA启动子的短暂玉米叶组织和稳定转基因玉米叶组织的GUS染色数据的总结

实例5：与对稳定转基因系的细胞靶向和后代相关关系有关的定量蛋白 表达的短暂分析

Western印迹分析在表达一种内切葡聚糖酶基因的短暂和稳定转基因植物中进行。如表6所见，内切葡聚糖酶靶向到ER、叶绿体和质外体。采用一个Kleco研磨机，把每个植物ID的约200mg新鲜叶组织磨碎成细粉，然后在100mM醋酸钠、0.02％吐温、0.02％叠氮化钠pH 4.75和完整蛋白酶抑制药混合片剂(罗氏制药公司)等的1mL溶液中进行萃取。把样品放在工作台旋转机上旋转30-60分钟，然后在3000rpm转速下离心10分钟。所萃取总蛋白的量，是采用Pierce BCA方案测定的，如产品文献所概述。在内切葡聚糖酶萃取后，采用标准方案进行Western印迹分析。EG蛋白是采用Western印迹法、用抗EG抗体探针检测的。

表6：表达靶向各种亚细胞器的异源内切葡聚糖酶基因的短暂和稳定转基因玉米植物的Western印迹分析

如表6所见，短暂分析法能够预测，根据在短暂和稳定转基因玉米系中的Western印迹分析，靶向ER或质外体中的内切葡聚糖酶，将获得比预期值更大尺寸的蛋白。这可能是由于(例如)蛋白的糖化作用引起的。或者，短暂分析能成功地预测，靶向叶绿体的内切葡聚糖酶，将获得预期蛋白尺寸，如在稳定转基因玉米系中的Western印迹分析所表明。总之，根据定性数据(即Western印迹分析)，原位(in-planta)分析法能够预测在植物中表达一种蛋白的最佳方法。可以设想，采用本文件所述的、短暂的原位方法，可以同样方式预测蛋白切割情况。

此外，如表7所示，内切葡聚糖酶活性可在短暂转化体中测定。关于酶活性分析，采用一个Kleco研磨机，把一种转基因植物的约200mg新鲜叶组织磨碎成细粉，然后在100mM醋酸钠、0.02％吐温、0.02％叠氮化钠pH 4.75和完整蛋白酶抑制药混合片剂(罗氏制药公司)等的1mL溶液中进行萃取。把样品放在工作台旋转机上旋转30-60分钟，然后在3000rpm转速下离心10分钟。所萃取总蛋白的量，是采用Pierce BCA方案测定的，如产品文献所概述。EG活性分析是采用羧甲基纤维素底物(Megazyme)进行的。所有样品均进行三次重复试验。在萃取后，把样品20uL与245ug CMC-4M在40℃下培养120分钟。立即处理零时间点样品。在培养后，采用GOPOD分析试剂盒(Megazyme)测定葡萄糖释放量。酶活性是以纤维素底物至葡萄糖的水解情况进行检测的。GOPOD分析是如下进行的：把样品反应液20uL或已知浓度的葡萄糖标准液与200uL GlucoseOx试剂(Megazyme)在一个96孔分析平板(Costar 3370)上合并，并在37℃培养20分钟。在510nm波长处的吸光度是采用SpectraMax384 Plus全自动定量绘图酶标仪测定的。通过绘制吸光度值对比已知葡萄糖标准液浓度的图形获得葡萄糖标准曲线，采用从这个葡萄糖标准曲线获得的方程式，把样品反应液的吸光度值转化为葡萄糖浓度。酶活性以“umol葡萄糖/分钟/g组织”为单位记录。

表7：从短暂叶组织获得的内切葡聚糖酶活性测定值

实例6：玉米R1基因下调的快速短暂分析

二元构建体17305、17308和18286包含表达盒，这个表达盒含有玉米内源淀粉降解基因葡聚糖水合二激酶(R1)的RNAi。如表8所示，短暂转化的叶片组织可用于预测一个特定的RNAi实际上是否能下调一个特定的内源性基因，在本案例中这个特定内源性基因是玉米R1。对于短暂转化的玉米幼叶组织，可采用qRT-PCR分析R1 mRNA水平。为进行这项分析，可先从叶片样品中提取RNA，随后进行DNA消化。根据关注的靶点选择TaqMan分析法，该靶点由一个正向引物、一个反向引物和一个FAM标记探针构成，这个标记探针对于这个靶序列是特异性的。为进行相对表达计算，对每个样品还采用一个物种特异性的、TET标记的参考靶点。采用384孔PCR平板，将一步RT-PCR反应设置为三次重复试验(内源参考基因重复三次，靶基因重复三次)。每个平板上均纳入一个野生型对照和一个无RT阴性对照，以分别检测非特异性扩增和DNA污染。在实时温度循环器上捕获结果，由分析器对每个指示器设置阈值，从而报告所得的结果。对每个样品计算相对表达(2^-deltaCt，其中deltaCt＝靶点-参考)。如表8所见，与野生型(未浸润)组织相比，所有RNAi构建体均能成功下调R1。这种原位(in-planta)的方法能够惊人地快速验证每个RNAi表达盒就R1基因下调来说是否能发挥功能。构建体17305含有一个OSMADs13启动子，如美国专利申请号2007/0006344A1所述，它是一种玉米穗轴特异性启动子。惊人的是，这种短暂的原位(in-planta)分析法能够得出结论，即在OsMADs13启动子后的RNAi能够下调叶片中的R1基因。这表明，原位(in planta)分析法或许不仅能够评价叶片中有活性的启动子，也能评价属于非叶片启动子的启动子，例如种子特异性启动子、穗轴特异性启动子或根特异性启动子。

表8：玉米R1基因下调的短暂评价

构建体ID-植物ID	R1基因-mRNA转录物水平
		17305-1	313.24
17305-2	312.82
		17305-3	277.89
17305-4	266.42
		17305-5	405.33
17305-6	311.46
		17308-1	272.63
17308-2	203.89
		17308-3	290.11
17308-4	271.68
		17308-5	256.96
17308-6	268.37
		18286-1	464.96
18286-2	381.51
		18286-3	258.22
18286-4	203.87
		18286-5	256.57
18286-6	260.63
		野生型(未浸润)	540.74

实例7：应用短暂的原位(In-Planta)方法预测与一个异源基因表达有关的 阴性植物表型和/或毒性

构建体18221含有由Ubi361组成型表达的一种木聚糖酶。如表9所示，采用构建体18221转化的短暂玉米组织观察结果导致明显的细胞死亡。具体地说，在木聚糖酶表达盒短暂浸润后几天，较大圈的死亡叶组织出现在转化的完好叶上。这表明，这个基因可能对植物细胞具有某种毒性作用。当这个相同的基因在玉米种子中表达时，已知(数据没有显示)种子会具有枯萎表型伴较低的发芽率。这个数据表明，在稳定转基因植物中预评价关于毒性和/或阴性表型的候选基因时，短暂的原位分析法可能是一种有用的工具。

表9：与一个异源基因表达有关的阴性表型的预测

“++++”：表明观察到一种表型

“-“：表明没有观察到任何表型

实例8：应用短暂的原位分析方法预测蛋白效率

构建体15060包含一个表达盒，这个表达盒含有一个Cry1Ab基因，已知这个基因当在转基因作物中表达时，在控制各种鳞翅昆虫时是有效的，如美国专利号6,075,185所述。应用欧洲玉米螟(ECB)的昆虫生物分析法，是采用植物提取物进行的，这种植物提取物含有从冻干植物组织获得的Cry1Ab，这种植物组织是采用Cry1Ab基因转化的。如表10所示，短暂表达的Cry1Ab效果可以下述结果确证：与对照(空载体)比较(对照没有表现死亡或死亡极少)，在分析法7天后，发生93.75％ECB死亡率。

表10：Cry1Ab基因短暂的原位(In-Planta)表达

实例8：应用短暂的原位(In-Planta)方法预测代谢概况

在玉米叶中酶的短暂表达是采用二元载体pEB47进行的，这个二元载体含有编码一种蔗糖异构酶的单子叶植物优化核苷酸序列(SEQ ID NO：27)。二元载体pEB47含有的表达盒具有可以这种顺序操作连接的下述构件：FMV增强子；一个35S增强子；一个玉米泛素启动子；一个玉米γ-玉米蛋白ER靶向序列，它指导这个蔗糖异构体多肽至ER；一个甘薯贮藏蛋白空泡靶向序列，它指导这个蔗糖异构体多肽多ER到这个空泡；一个玉米优化多聚核苷酸序列，它编码一种蔗糖异构酶；一个NOS终止子。

收割和分析玉米叶中是否存在异麦芽酮糖和海藻糖(蔗糖异构酶活性在玉米叶中的产物)。由胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)表达的一种蔗糖异构酶的氨基酶序列，已列在基因库(GeneBank)中，访问号是YP049947。蔗糖异构酶活性是这样分析的：把这种酶与底物和蔗糖结合，并测定异麦芽酮糖和海藻糖产生情况。分析从重组大肠杆菌(E.coli)获得的总可溶蛋白提取物的蔗糖异构酶活性，即如上所述，把大肠杆菌(E.coli)溶解产物上清液10μL与292mM蔗糖和50mM磷酸钠缓冲液(pH 6.0)的90μL溶液在30℃下培养20小时。采用，筛查反应产物是否存在异麦芽酮糖和海藻糖(HPLC)。TLC是这样进行的：把生长培养基上清液3μL点到AL SIL G硅胶平板(Whatman)上，在含有3份醋酸乙酯∶3份醋酸∶1份蒸馏水的溶剂中展开两次。在干燥后，平板用一种染料混合物喷洒；这种染料混合物由下述成分组成：苯胺4mL，二苯胺4g，丙酮200mL，和80％磷酸30mL。异麦芽酮糖和海藻糖当与苯胺染料反应时，以它们的相对迁移率和产生的明显颜色与其它糖类(如蔗糖)进行区分。黄绿色表明存在异麦芽酮糖，红色表明存在海藻糖，褐色/黑色表明存在蔗糖。由于蔗糖水解产生的单糖、葡萄糖和果糖，分别为蓝色或橙红色。

通过比较样品中存在糖类的相对迁移率及采用苯胺染料的染色颜色，与糖标准品的相对迁移率和染色颜色，鉴别在展开的TLC平板每个道中存在的糖类是可能的。如上所述，蔗糖异构酶与蔗糖培养的反应产物是三个色带。最高迁移率色带具有紫色，与葡萄糖和果糖标准品具有相同迁移率的色带分别是蓝色和红色，因此可以解释为共同迁移的葡萄糖和果糖的混合物，葡萄糖和果糖是通过下述双糖之一水解释放的：蔗糖，异麦芽酮糖，或海藻糖。中间色带就颜色和相对迁移率来说相当于异麦芽酮糖，因此可鉴别为异麦芽酮糖。最慢的迁移色带具有红色颜色，比异麦芽酮糖或蔗糖标准迁移慢。这个蔗糖色带的相对迁移率，与在类似的TLC分析法(Cho等：BiotechnologyLetters[生物技术通讯](2007)，29：453-458：从传统韩国食物中分离出来的一种产异麦芽酮糖微生物)中关于海藻糖迁移的发表报告对应很好。因此，我们得出结论认为这个蔗糖色带是海藻糖。在进行TLC分析法之时，没有获得海藻糖标准品；但是，对后来获得的蔗糖异构酶反应产物和标准品进行后续HPLC(Dionex)分析，表明这个色带确实是海藻糖。同样，重要的是要注意，反应产物6不含有任何蔗糖；蔗糖比异麦芽酮糖和海藻糖有更高的相对迁移率，比单糖葡萄糖和果糖有较慢的迁移率。由于蔗糖异构酶活性导致蔗糖完全转化为异麦芽酮糖和海藻糖，所以预期不存在蔗糖。或者，采用16nM氢氧化钠的HPLC法筛查上清液，分离蔗糖异构酶反应产物，随后在配备ED50电化学检测器的Dionex DX-600系统(Dionex公司)上，采用200nM氢氧化钠以1mL/min的速度、从10-40分钟线性梯度进行筛查。

表12概述的数据，表明蔗糖异构酶在短暂表达蔗糖异构酶的玉米叶中活跃表达，导致糖类异麦芽酮糖和海藻糖在玉米叶中累积。这些数据表明，短暂的原位暂分析法可用于预测代谢概况，例如关于糖类的代谢概况。

表12：短暂表达蔗糖异构酶(SEQ ID NO：24)的玉米叶的碳水化合物分析(HPAEC)

实例9：在各种植物中应用短暂的原位方法

短暂的原位方法可用于各种植物，如以前的实例(玉米及表13(高粱)和表14(水稻)所示。AmCyan是一种荧光报告基因，它可以采用本门技术中众所周知的方法进行分析。短暂水稻系将采用含GUS的方法进行分析。

表13：AmCyan基因在高粱中的短暂表达

表14：GUS基因在水稻(简称Nipponbare)中的短暂表达

虽然为简单和理解的目的，前述的发明已通过示范和实例方式进行详细说明，但对本门技术的技术人员来说应该清楚，在所附权利要求的范围内可以实施一定的改变和改良。

Claims (27)

1.原位(in planta)即在一种单子叶植物的植物部分中短暂表达一个核苷酸序列的一种方法，包含下述步骤：

a)一个表达盒的土壤杆菌浸润法，这个表达盒含有至少一个核苷酸序列，这个或这些核苷酸序列原位(in planta)可操作连接到一种单子叶植物的一种植物部分，其中这种植物部分是幼株植物叶组织；

b)在这种植物部分中短暂表达所述的至少一个核苷酸序列。

2.权利要求1的方法，其中这种植物的发育阶段是2叶阶段或3叶阶段。

3.权利要求1的方法，其中这种幼株植物叶组织为不大于约5、6、7、8、9或10天龄的叶组织。

4.权利要求1的方法，其中这种幼株植物叶组织是一种成熟单子叶植物的第1片叶或第2片叶，其中这种成熟单子叶植物是不大于30天龄的植物。

5.权利要求1的方法，其中这个启动子是组成型启动子或叶优先启动子。

6.权利要求1的方法，其中这种核苷酸序列被短暂表达至少约5、6、7、8、9或10天。

7.权利要求1的方法，其中这种单子叶植物是从含有下述植物的小组选择的：玉米、小麦、高梁、大麦、黍、燕麦、甘蔗和/或水稻。

8.权利要求1的方法，其中土壤杆菌浸润法是采用一种注射器进行的。

9.权利要求1的方法，其中这种方法包含一种液体0.25-2mL的土壤杆菌浸润法，这种液体含有这个表达盒。

10.权利要求1的方法，其中所述表达盒的大小大于1.5千碱基。

11.权利要求1的方法，其中这种方法包含一个二元载体的土壤杆菌浸润法。

12.权利要求1的方法，其中土壤杆菌浸润法是在所述幼株植物叶组织的下侧进行的。

13.原位(in planta)即在一种植物部分中短暂表达一个重要核苷酸序列的一种方法，包含下述步骤：

a)原位(in planta)，一个表达盒经土壤杆菌浸润法浸润于一种玉米植物的一种植物部分，这个表达盒含有至少一个核苷酸序列，其中这种植物部分是幼株植物叶组织；

b)在这种植物部分中短暂表达所述的至少一个核苷酸序列。

14.权利要求12的方法，其中这种幼株植物叶组织是V2或V3玉米叶组织。

15.建立一种基因表达预测模型的一种方法，这个预测模型可以定性或定量预测至少一个基因在稳定转基因植物系中的相对功能；所述方法包含下述步骤：

a)一个表达盒的土壤杆菌浸润法，这个表达盒含有至少一个基因，这个或这些基因原位(in planta)可操作连接到一种谷类植物的一种植物部分，其中这种植物部分是幼株植物叶组织；

b)在植物部分中短暂表达所述异源基因；

c)测定定量数据、定性数据、或定量和定性数据；

d)建立所述基因的预测模型。

16.权利要求15的方法，其中定量数据包括测定的蛋白表达水平。

17.权利要求15的方法，其中定量数据包括测定的、所述短暂表达异源基因蛋白对一种底物的蛋白活性。

18.权利要求15的方法，其中定量数据包括昆虫生物分析法。

19.权利要求15的方法，其中定量数据包括ELISA分析。

20.权利要求15的方法，其中定量数据包括转录物拷贝数的PCR分析。

21.权利要求15的方法，其中定量数据包括从下述任何一种方法获得的数据：一种Northern印迹法、一种Southern印迹法或一种Western印迹法。

22.权利要求15的方法，其中定量数据包括从酶分析法获得的数据。

23.权利要求15的方法，其中定量数据包括从一种Western印迹法获得的数据。

24.建立一种表达盒预测模型的一种方法，这个预测模型可以定性或定量预测至少一个表达盒在稳定转基因植物系中的相对功能；所述方法包含下述步骤：

a)一个表达盒的土壤杆菌浸润法，这个表达盒含有至少一个基因，这个或这些基因原位(in planta)可操作连接到一种谷类植物的一种植物部分，其中这种植物部分是幼株植物叶组织；

b)在植物部分中短暂表达所述异源基因；

c)测定定量数据、定性数据、或定量和定性数据；

d)建立所述基因的预测模型。

25.权利要求24的方法，其中定量数据可以预测一个增强子序列的相对功能。

26.权利要求24的方法，其中定量数据可以预测一个启动子序列的相对功能。

27.权利要求24的方法，其中定量数据可以预测一个表达盒的相对功能，这个表达盒含有至少一个启动子，这个或这些启动子可操作连接到至少一个增强子。