CN102936601A - 一种内切葡聚糖酶编码基因和重组酶及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种内切葡聚糖酶编码基因和重组酶及应用，属于生物技术领域。一种内切葡聚糖酶编码基因，其序列如SEQ ID NO.1；内切葡聚糖酶的重组酶其序列如SEQ ID NO.2所述。实验证明，本发明的重组内切葡聚糖酶具有很高的羧甲基纤维素酶活性，达到2245U/mL，菌落的透明圈直径是原始菌株的30倍以上。本发明所提供的内切葡聚糖酶编码基因和重组酶可广泛应用于纤维素的降解。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种内切葡聚糖酶编码基因和重组酶及应用。
背景技术
纤维素是生物圈中产量最丰富的一种碳水化合物资源，占植物干重的35%-50%，分布广泛。纤维素呈长链状高分子，由葡萄糖苷通过β-1,4糖苷键连接而成，分子量一般为50000-2500000，相当于300-15000个葡萄糖单位，是葡萄糖的一种重要贮存形式，但是由于降解困难，导致纤维素资源的利用率非常的低。纤维素大分子可被纤维素酶所降解。纤维素酶是一个酶系，根据其催化反应功能的不同,可以把纤维素分为内切葡聚糖酶（endo-1,4-β-D-glucanase，EC3.2.1.4,即C1酶），外切葡聚糖酶（1,4-β-D-glucan cellobilhydrolase或exo-1,4-β-D-glucannase，EC.3.2.1.91），和β-葡聚糖苷酶（β-1,4-glucosidase，EC.3.2.1.21）简称BG。一般认为，内切葡聚糖酶是纤维素酶系中最重要的酶，可以作用于纤维素分子内的无定形区，随机水解糖苷键，将长链纤维素分子截成短链状，产生小分子纤维素，可以为外切酶提供大量的反应末端，同时还能水解小分子的纤维素寡糖。
纤维素酶的研究与开发是纤维素资源综合利用的基础。目前研究者对真菌的纤维素酶研究开发较多，而在细菌中开发高效纤维素酶系的研究要少很多。纤维素降解细菌的研究大多是芽胞杆菌类，在Pantoea ananatis中的研究未有报道。随着分子生物学、基因工程的迅猛发展,国内外均尝试应用基因工程技术来构建高效纤维素降解菌株、开发新型高效的纤维素酶系。由于内切葡聚糖酶在纤维素酶系中的重要地位，因此需要通过生物技术方法加大对细菌内切葡聚糖酶的研究，构建重组内切葡聚糖酶工程菌，并开展酶学性质、酶产品的研究，以推动纤维素酶的应用和纤维素资源的开发利用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新型内切葡聚糖酶编码基因eg的基因序列及其氨基酸序列。采用PCR方法克隆获得内切葡聚糖酶编码基因。
本发明的一种新型内切葡聚糖酶编码基因eg，所述内切葡聚糖酶的基因序列为SEQ ID NO.1。
所述内切葡聚糖酶的基因eg是一个完整的开放阅读框（ORF），该开放阅读框以启始密码子ATG开始，以终止密码子TGA结束，共包括1005bp。
本发明的一种新型重组内切葡聚糖酶，所述重组酶的氨基酸序列为SEQ IDNO.2。
所述内切葡聚糖酶共334个氨基酸序列。
本发明的另一目的，在于提供一种新型重组内切葡聚糖酶EG。该重组酶具有很高的酶活性，达到2245U/mL。
上述重组内切葡聚糖酶EG的制备方法，包括如下步骤：
（1）重组内切葡聚糖酶菌株EG/BL21(DE3)的构建：
以F:CATATGAGAGTTAAGCCAGTGT和R:CTCGAGACGCTTTTCCTGATAA为PCR反应的引物；以PCR方法从菌株Pantoea ananatis P5（CGMCCNO.5356）基因组中克隆获得内切葡聚糖酶编码基因eg全长，将该基因通过限制性内酶NdeI和XhoI酶切后，连接到原核表达载体pET258中，构建重组质粒pETEG，转化大肠埃希氏菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞，利用PCR反应检测（引物为F和R）和限制性内切酶NdeI和XhoI双酶切检测两种方法，筛选获得高效表达重组内切葡聚糖酶的菌株，即重组大肠埃希氏菌EG/BL21(DE3)；
（2）重组菌株EG/BL21(DE3)的发酵培养与诱导表达：
将重组菌株EG/BL21(DE3)按1%接种量转接到50mL LB（含30μg/mL卡那霉素）液体培养基中于37℃震荡培养；待OD600为0.5时，加入0.1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导4h终止发酵；将发酵液在-80℃速冻，放冰水中缓慢融化完全，使用超声波破碎细胞，10000r/min离心5min，取上清即为粗酶液；
（3）重组内切葡聚糖酶的纯化：
将上清加到Ni-NTA柱上，使带有His标签的重组内切葡聚糖酶结合到柱子上；使用pH8.0的洗脱溶液（含50mM NaH2PO4、300mM NaCl、250mMimidazole）将重组内切葡聚糖酶从柱子上洗脱下来，并将酶液在超离心浓缩管中浓缩，获得纯度高于95%以上的内切葡聚糖酶蛋白。
本发明的再一目的，在于提供上述新型重组内切葡聚糖酶EG的应用。所述内切葡聚糖酶能够应用于生产纤维素酶，应用于纤维素的降解。
本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：
（1）根据酶基因序列BLAST分析结果结合酶的分子量、等电点和酶学特性等特性与已知蛋白的差异判断，该重组内切葡聚糖酶EG是一种新型β-1，4-内切葡聚糖酶基因。这是首次从Pantoea ananatis菌株中开发出重组β-1，4-内切葡聚糖酶基因。
（2）该重组内切葡聚糖酶EG具有适应温度范围广、耐较强酸碱性的特点，在生物能源、洗衣纺织、食品加工、发酵生产等多个行业中具有应用潜力。
附图说明
图1是内切葡聚糖酶基因的克隆与检测的琼脂糖凝胶电泳图。
1：内切葡聚糖酶基因PCR扩增结果；2：菌落PCR鉴定阳性结果；3：NdeI和Xho I双酶切割过的重组质粒，小带是切出的目的基因，大带是空载体；4：NdeI单酶切的重组质粒；5：Xho I单酶切的重组质粒；6：没切割的重组质粒对照；M1：1KB，从上到下一次大小为；10kb，8kb，7kb，6kb，5kb，4kb，3kb，2kb，1kb；M2：D2000，从上到下一次大小为2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；重组内切葡聚糖酶基因以左侧箭头标出。
图2是重组菌株EG/BL21(DE3)在羧甲基纤维素钠培养基上形成的透明圈图。
图3是重组菌株EG/BL21(DE3)内切葡聚糖酶蛋白诱导表达的SDS-PAGE图。
图中：1：诱导前；2：诱导3hr；3：诱导4hr；4：诱导5hr；M：蛋白Marker，大小标于左侧；重组内切葡聚糖酶蛋白以右侧箭头标出）
图4是重组内切葡聚糖酶纯化的SDS-PAGE图。
图中：1：诱导前；2：诱导4hr；3：纯化的重组内切葡聚糖酶蛋白。
具体实施方式
1、主要材料
（1）培养基
LB液体培养基：每L培养基中含有蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g；
LB固体培养基：每L培养基中含有蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g琼脂粉12g；
产透明圈培养基：每1L培养基中含有羧甲基纤维素钠10g，蛋白胨10g，酵母粉5g，KH2PO4 1g，MgSO4 0.2g，NaCl 10g，葡萄糖2g，琼脂粉12g；
（2）实验仪器设备
YXQ-LS-75立式压力蒸汽灭菌锅——上海博讯实业有限公司医疗设备厂
PCR扩增仪——美国ABI公司
FA2004电子天平——上海越平科学仪器有限公司
DNP-9162型电热恒温培养箱——上海精宏实验设备有限公司
YXJ-2高速离心机——常州国华电器有限公司
Sigma3-16pk台式高速冷冻离心机——德国SIGMA公司
低速离心机——常州国华电器有限公司
数显式电热恒温水浴锅——上海跃进医疗器械厂
7230G可见分光光度计——上海精密科学仪器有限公司
HYG型摇床——上海欣蕊自动化设备有限公司
Haier冰箱——青岛海尔集团
三洋超低温冰箱——日本三洋电子有限公司
DYY-12型电泳仪——北京市六一仪器厂
DYCZ-24DN双垂直电泳仪——北京市六一仪器厂
Gel Doc XR+凝胶成像系统——美国BIO-RAD公司
移液器——大龙医疗设备(上海)有限公司
2、内切葡聚糖酶基因的克隆
用于克隆P.ananatis内切葡聚糖酶基因引物序列为：
F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，R：GGTTACCTTGTTACGACTT。
PCR反应的实验方法是：取三个PCR小管，依次加入下列试剂：
PCR反应体系（50μL）
PCR反应条件是：①95℃预变性5min；②95℃变性30s；③57℃退火60s；④72℃延伸90s，重复步骤2-4，反应24个循环；⑤72℃延伸10min。内切葡聚糖酶基因PCR扩增结果见图1涌道1。
3、重组测序质粒的构建与测序
（1）基因和测序载体的连接
使用T4DNA Ligase将基因片段eg与测序载体pGMT进行连接。
连接的体系如下：
将连接体系中的各成份依次加入后，混合均匀，10000r/min离心到塑料离心管底部，连接条件是16℃水浴中连接过夜，构建重组测序载体。-20℃保存连接产物。
（2）重组测序质粒的转化
将5μL连接反应物加入50μL Dh5α感受态细胞中，轻轻快速混匀，冰浴30min。然后在42℃水浴中热激90s，迅速转入冰浴中放置2min，加入950μL的LB培养基，于37℃摇床180r/min震荡培养1hr。取菌液离心后涂布于含还有筛选标记Amp的LB固体平板培养基上，37℃倒置培养过夜。次日，根据蓝白斑实验原理，挑选白色转化子。下午，将白色转化子转接到Amp的LB液体培养基中，于37℃摇床180r/min震荡培养过夜。
（3）重组测序质粒的鉴定和测序
将震荡培养过夜的菌液保藏菌种，剩余菌液采用PCR方法进行鉴定。具体鉴定方法是：以菌液为模板，以F和R两个引物进行PCR扩增，如果可以扩增出目的基因，则初步说明eg基因已经连接到pGMT载体上。将PCR检测为阳性结果的菌液提取质粒，以pGMT载体上的已经序列为引物，送上海生工生物公司进行测序。
4、重组表达质粒的构建与验证
（1）目的基因片段的双酶切和胶回收
将生物公司测序获得的eg基因序列进行拼接，获得eg全基因序列。利用DNAMAN程序分析序列特征，确定序列的正确性。
将测序正确的重组测序质粒pGMTEG上的eg基因切割下来，连接到表达载体pET258上。具体方法是：
使用NdeI，XhoI酶切重组测序质粒pGMTEG，获得eg基因。
pGMTEG酶切体系（20μL）如下：
将pGMTEG酶切体系各成份轻轻混合均匀，离心到离心管底部，置于37℃温水浴中酶切2hr。
将酶切产物进行电泳。在紫外凝胶观察仪下，观测凝胶电泳结果。确定目的基因eg已经被酶切下来。使用DNA胶回收试剂盒回收目的基因eg。
（2）pET258质粒的双酶切、胶回收
使用NdeI和XhoI酶切pET258质粒。酶切体系如下（20μL）：
将酶切体系各成份轻轻混合均匀，离心到离心管底部，置于37℃温水浴中酶切2hr。将质粒酶切产物进行电泳。胶回收酶切后的质粒。
（3）重组表达质粒pETEG的构建与转化
将胶回收的目的基因eg连接到pET载体上，构建表达质粒pETEG。表达质粒连接体系（10μL）是：
将连接体系中的各成份依次加入后，混合均匀，10000r/min离心到塑料离心管底部，连接条件是16℃水浴中连接过夜，构建重组表达质粒pETEG。-20℃保存连接产物。
（4）重组表达质粒转化受体菌E.coli Dh5ɑ
将连接产物转化大肠杆菌E.coli Dh5ɑ中，使用kan LB固体培养基筛选插入目的基因的重组菌pETEG/Dh5ɑ。具体转化实验方法是：连接液5μL加入感受态细胞50μL→在冰水混合物中放30min→42℃热击90s→放冰水浴中2min，之后加入1ml的LB液体培养基→放37℃摇床摇1h→涂布kan LB固体培养基。
（5）重组表达质粒pETEG的酶切验证
提取重组表达质粒pETEG，采用NdeI和XhoI双酶切电泳检测质粒。酶切体系是（20μL）：
置于37℃温水浴中酶切2hr。电泳检测pETEG酶切产物。
5、构建重组内切葡聚糖酶原核表达菌株pETEG
提取重组表达质粒pETEG，转化入E.coli BL21(DE3)中，构建重组内切葡聚糖酶EG原核表达菌株。涂布于含有筛选标记kan的琼脂平板培养基上，37℃倒置培养过夜，挑选转化子，以PCR检测和NdeI，XhoI双酶切来筛选阳性克隆（图1）。保藏筛选到的菌种。
6、重组菌株EG/BL21(DE3)产透明圈
将EG/BL21(DE3)接种到添加kan产透明圈培养基中，于37℃培养温箱中培养1d。将0.5%的刚果红倒入培养后的产透明圈培养基中染色5min，倒掉刚果红后，使用5%的NaCl溶液浸泡脱色1h。结果显示，重组菌株EG/BL21(DE3)产透明圈直径是原始菌株的30倍以上（图2）。
7、重组菌株EG/BL21(DE3)内切葡聚糖酶蛋白诱导表达与纯化
利用重组菌株EG/BL21(DE3)进行重组蛋白的表达。诱导表达方法是：晚上，接重组菌株EG/BL21(DE3)细胞于LB(Kan:30μg/mL)液体培养基中37℃摇起。按1%接种量转接到20mL LB(Kan:30μg/mL)液体培养基中培养。待OD600约为0.5时，取出5mL菌液做对照组。剩下菌液中加入0.1mM适量IPTG开始诱导。诱导不同时间（3hr、4hr和5hr）后，分别取样，做SDS-PAGE蛋白电泳分析。
蛋白样品的准备与电泳：取裂解液加入3×上样缓冲液混合，煮沸5min，6,000×g离心10s，取上清电泳。在电泳槽中加满电泳缓冲液，用移液器上样，稳压120V电泳约1.5hr，待溴酚蓝迁移至凝胶下缘停止电泳。电泳结束后小心取出凝胶，置于染色器皿中，倒入染色液浸没凝胶，在水平摇床上染色1hr。倒净染色液，加入少量蒸馏水洗一次，再倒入脱色液浸没凝胶，在水平摇床上脱色约4hr至蓝色背景消失。脱色后拍照记录电泳结果，结果显示，内切葡聚糖酶蛋白EG已经成功诱导表达（图3）。
重组内切葡聚糖酶蛋白纯化：将10ml诱导后的菌液10,000×g离心沉淀，弃上清，向沉淀中加入2ml Lysis buffer（含50mM NaH2PO4、300mM NaCl、10mM imidazole、1mg/mL溶菌酶），在冰水中放置30min，随后放-80℃速冻完全。将速冻后的溶液放冰水中缓慢融化，待融化完全后，使用超声波破碎（功率300W，2s/次，工作60次，每次间隔15s）。4℃10,000×g离心20min，弃沉淀，将上清加到Ni-NTA柱上，使带有His标签的重组蛋白结合到柱子上。向结合蛋白的Ni-NTA柱加入4ml Wash buffer（含50mM NaH2PO4、300mM NaCl、20mMimidazole），清洗柱子，重复此步骤一次。加入2ml Elution buffer（含50mMNaH2PO4、300mM NaCl、250mM imidazole）将结合的重组蛋白从柱子上洗脱下来。将洗脱下来的蛋白放入浓缩管中浓缩（7,400×g，30min）。取少量浓缩液电泳鉴定纯度，剩下的加入等体积灭菌高纯甘油，放-80℃保存备用。SDS-PAGE显示，纯化获得了纯度在95%以上的重组内切葡聚糖酶蛋白（图4）
8、重组内切葡聚糖酶活测定
（1）葡萄糖标准曲线制作
取6支洗净烘干的具塞刻度试管，编号后按0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL加入标准葡萄糖溶液，并分别使用蒸馏水定容至1mL，配制成一系列不同浓度的葡萄糖溶液。充分摇匀后，向各试管中加入2mLDNS溶液，摇匀后沸水浴5min，取出冷却后用蒸馏水定容至25mL，充分混匀。在540nm波长下，以0号试管中的溶液作为空白对照，调零点，测定其它各管溶液的光密度值并记录结果。以葡萄糖含量(mg)为横坐标，以对应的吸光度值为纵坐标绘制出葡萄糖标准曲线。
（2）酶活测定
取4支具塞试管按0到3编号，0号管作为空白对照。向各试管加入2mL缓冲液和1mL酶液，空白管置于沸水浴中失活10min，样品管同时在42℃水浴中预热，在试管中分别加入2mL的底物溶液，20min后取出。迅速向各试管加入2mL DNS显色液，摇匀后迅速置于沸水浴中，10min后立即取出，流水冷却，冷却后用蒸馏水定容至25mL，以0号试管中的溶液为空白对照，在540nm处测OD值。
酶活计算：
将在42℃条件下单位时间(1min)内水解底物产生1μmol还原糖所需粗酶液量定义为一个酶活单位(U/mL)。
酶活力计算公式见下式：
式中k——表示葡萄糖标准曲线的斜率；
n——表示稀释倍数；
1000——表示mg转换成μg；
180——表示葡萄糖标准分子量；
t——表示反应时间(min)；
V——表示参与反应的粗酶液体积(mL)。
上述实验的结果表明，本发明的重组内切葡聚糖酶具有很高的羧甲基纤维素酶活性，达到2245U/mL，菌落的透明圈直径是原始菌株的30倍以上。本发明所提供的内切葡聚糖酶编码基因和重组酶可广泛应用于纤维素的降解。
Claims (4)
1.一种重组内切葡聚糖酶编码基因，其特征在于：所述酶基因序列为SEQ IDNO.1。
2.根据权利要求1所述的一种内切葡聚糖酶编码基因，其特征在于：所述重组内切葡聚糖酶基因编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。
3.一种权利要求1或2所述的一种重组内切葡聚糖酶的制备方法，其特征在于：
（1）重组内切葡聚糖酶菌株EG/BL21(DE3)的构建：
使用引物F:CATATGAGAGTTAAGCCAGTGT，R:CTCGAGACGCTTTTCCTGATAA；以PCR方法从菌株Pantoea ananatis P5（CGMCC NO.5356）基因组中克隆获得内切葡聚糖酶编码基因全长，将该基因通过限制性内酶NdeI和XhoI酶切后，连接到原核表达载体pET258中，构建重组质粒pETEG，转化大肠埃希氏菌E.coli BL21(DE3)细胞，筛选获得高效表达重组内切葡聚糖酶的菌株，即重组大肠埃希氏菌EG/BL21(DE3)；
（2）重组菌株EG/BL21(DE3)的发酵培养与诱导表达：
将重组菌株EG/BL21(DE3)按1%接种量转接到50mL LB（含30μg/mL卡那霉素）液体培养基中于37℃震荡培养；待OD600为0.5时，加入0.1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导4h终止发酵；将发酵液在-80℃速冻，放冰水中缓慢融化完全，使用超声波破碎细胞，10000r/min离心5min，取上清即为粗酶液；
（3）重组内切葡聚糖酶的纯化：
将上清加到Ni-NTA柱上，使带有His标签的重组内切葡聚糖酶结合到柱子上；使用pH8.0的洗脱溶液（含50mM NaH2PO4、300mM NaCl、250mMimidazole）将重组内切葡聚糖酶从柱子上洗脱下来，并将酶液在超离心浓缩管中浓缩，获得纯度高于90%以上的酶蛋白。
4.一种重组内切葡聚糖酶的应用，所述内切葡聚糖酶能够应用于生产纤维素酶，应用于纤维素的降解。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20130220 |