CN102936621A - 蜡样芽孢杆菌的检测方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明的提供一种新的蜡样芽孢杆菌的检测方法，该检测方法包括：1)提取待检测样品中的DNA；2)将步骤1)获得的DNA作为模板，进行实时荧光定量PCR检测；其中，实时荧光定量PCR检测的靶标为蜡样芽孢杆菌murB基因。本发明还提供一种蜡样芽孢杆菌的检测试剂盒，所述试剂盒包括用于扩增蜡样芽孢杆菌murB基因的引物。

Description

蜡样芽孢杆菌的检测方法及试剂盒

技术领域

本发明属于食品安全领域的核酸检测。具体而言，本发明涉及蜡样芽孢杆菌快速检测的方法以及试剂盒。

背景技术

蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)作为需氧芽孢杆菌群中的一种，无荚膜、能运动、革兰氏阳性杆菌，芽孢能耐受100℃达30分钟。该菌在自然界分布极广，常见于土壤、污水和尘埃中；在16-45℃能生长繁殖，最适生长温度为35℃。常因本菌污染富含碳水化合物的淀粉制品和富含蛋白质的乳制品等食品并在其中生长繁殖而引起食物中毒。蜡样芽孢杆菌也是人和动物的各种非肠道传染病的条件致病菌，可引起人类患结膜炎、呼吸系统、心血管系统、中枢神经系统、伤口感染等疾病。蜡样芽孢杆菌主要的致病物质是两种对人致病的耐热和不耐热肠毒素、大量的活菌及代谢产物如磷脂酶、核酸酶、溶血素等。近年来在蜡样芽孢杆菌作为皮肤上的创口感染菌的病例逐渐增多。现已发现也引起烧伤创面感染症状类似气性坏疽，发展很快，出现肌肉坏死。有全身中毒症状，是由该细菌的外毒素所致。这类细菌感染，对任何抗生素无效。

在食品企业，尤其是粮油加工企业，面临着严重的蜡样芽孢杆菌的污染治理问题，然而，摆在眼前的一个严峻问题是，蜡样芽孢杆菌的检测尤其是定量检测非常困难，使该生物危害因子的防治成为空谈。

建立一种行之有效的食源性蜡样芽孢杆菌的定量检测方法，以提高对该菌的检测速度和准确性，使受污染的食品得到及时处理，在公共卫生、食品卫生和口岸检疫等中都有重要意义。

然而，传统的检测方法耗时、操作繁琐，而基于免疫学原理的产品存在检测限高、特异性不强等问题。尤其是蜡样芽孢杆菌群的6种菌，包括蜡样芽孢杆菌(B.cereus)，炭疽芽孢杆菌(B.anthracis)，苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)，蕈状芽孢杆菌(B.mycoides)，假真菌样芽孢杆菌(B.pseudomycoides)以及韦氏芽孢杆菌(B.weihenstephanensis)，表型和生化特征相似度非常高，仅在产肠毒素种类、伴胞晶体的有无等方面存在差异，尤其是一些不产肠毒素或不携带伴胞晶体的变异菌株的存在，使该群的鉴别非常困难。

为此，本发明人经过长期研究，令人意外地研究出了一种以蜡样芽孢杆菌murB为靶标的锁核苷酸探针荧光定量快速检测的方法，不但能有效监控PCR扩增，而且蜡样芽孢杆菌的种特异性强，可有效区分蜡样芽孢杆菌群的其它芽孢杆菌，快速，检测灵敏度高，并可以应用于食品中蜡样芽孢杆菌的高通量筛检。

发明内容

本发明的第一个方面是提供一种新的蜡样芽孢杆菌的检测方法。该检测方法包括：1)提取待检测样品中的DNA；2)将步骤1)获得的DNA作为模板，进行实时荧光定量PCR检测；其中，实时荧光定量PCR检测的靶标为蜡样芽孢杆菌murB基因。

本发明之所以将murB基因作为检测靶标是通过如下方法筛选得到的：

通过公用数据库检索下载搜集，建立关于蜡样芽孢杆菌和非蜡样的芽孢杆菌的基因库。选取一蜡样芽孢杆菌基因组作为目标基因组，利用程序genomecut.pl对其进行分割，片段大小为100bp。用BLAST对分割片段与种属内其他蜡样芽孢杆菌基因组进行相似性分析，利用程序cofinder.pl发掘种属内保守片段(即各蜡样芽孢杆菌基因组都含有的片段)。再用BLAST对保守片段与种属外其他非蜡样芽孢杆菌基因组进行相似性分析，利用程序spfinder.pl发掘种属特异片段(种属特异片段判断标准：种属内保守片段与其他所有已测序微生物基因组同源区域不超过25bp)，从而初步筛选到靶点序列。

运用基因组学的方法，先建立了基因组库，再在目的蜡样芽孢杆菌基因组中，通过在线BLAST一共筛选出了共100个特异性片段，即100个大小为100bp的特异性DNA序列片段。将这100个特异片段经过合并整理成87个，分别设计引物进行特异性和灵敏度的普通PCR检测评价，最后证明murB基因对应的引物特异性和灵敏度均为最佳，因此选定murB基因为检测靶标。

为了将蜡样芽孢杆菌群的几种菌加以区分，本发明通过murB基因保守位点的分析，设计合成了将murB基因特有的保守位点加以锁核苷酸(locked nucleic acid，LNA)修饰的探针。锁核苷酸是一种人工合成的反义寡核苷酸，能够和靶核酸分子特异稳定的结合，从而增加探针的熔解温度，即Tm值，使PCR反应的特异性和稳定性得到加强。该锁核苷酸探针LNA-probe的序列为5'-FAM-TGTAAT*GG*TTGTT*CG*CAA-BHQ1-3'(标记为星号且带下划线的核苷酸为锁核苷酸)。

因此，优选地，本发明中，实时荧光定量PCR检测所用的荧光探针的核苷酸序列为5'-TGTAAT*GG*TTGTT*CG*CAA-BHQ1-3'，标记为星号且带下划线的核苷酸为锁核苷酸。

在本发明中，样品是潜在含有蜡样芽孢杆菌的离体样品，如食品、血液、血液制品、唾液、医疗用品或药品等。由于蜡样芽孢杆菌是食源性致病菌，因此优选样品来自于食品，如样品是食品，或者样品是食品的细菌平板培养物等。需要指出的是，检测来自于食品的样品，属于食品安全检测领域。

提取DNA以及实时荧光定量PCR检测中所用的试剂和仪器已经为本领域技术人员所掌握，而且目前有大量商品化的试剂和仪器可供选用。例如，在本发明的具体实施方式中，可以使用QIAamp DNA Mini Kit试剂盒来提取菌体基因组DNA，可以使用Taqman Universal PCR Master Mix II with UNG试剂盒以及ABI7500荧光定量PCR仪来进行实时荧光定量PCR检测。但是，这些试剂不提供荧光定量PCR的引物和探针。优选在本发明中，实时荧光定量PCR的引物为murB-F和murB-R，murB-F的序列为5’-CCTTCTTCAAGTTCAAATCTCG-3’，murB-R的序列为5’-GTYGTAATGACAGGTGATGGA-3’。

探针法荧光定量PCR的反应过程是本领域技术人员所能掌握的，一般为两步法，每个循环包括在95°C的变性和60°C的延伸过程，根据本发明人研究，最优选的实时荧光定量PCR的过程为40个循环，其中每个循环为95°C/15sec，60°C/1min。

探针在实时荧光定量PCR的反应体系中的含量对实时荧光定量PCR检测的结果有一定的影响。根据本发明人研究，最优选的内标在实时荧光定量PCR的反应体系中的含量为0.1μmol/L。

本发明的另一个方面是提供一种蜡样芽孢杆菌的检测试剂盒，包括用于扩增蜡样芽孢杆菌murB基因的引物。优选地，所述引物为引物murB-F(序列为5'-CCTTCTTCAAGTTCAAATCTCG-3')和murB-R(序列为5'-GTYGTAATGACAGGTGATGGA-3')。

另外，本发明所提供的试剂盒还可包括锁核苷酸荧光探针，所述荧光探针的核苷酸序列为5'-TGTAAT*GG*TTGTT*CG*CAA-BHQ1-3'，标记为星号且带下划线的核苷酸为锁核苷酸。

检测试剂盒还可以包括提取DNA和/或实时荧光定量PCR检测中所用的试剂。这些试剂可以通过市场渠道购买，如可以将现有的提取DNA和/或实时荧光定量PCR检测试剂盒中的试剂进行分装。

本发明的又一个方面是提供本发明中的试剂盒在制备用于检测蜡样芽孢杆菌的产品中的应用。所述产品包括检测试剂盒，进一步地，还可以包括记载检测蜡样芽孢杆菌的方法的说明书。

优选地，本发明中的蜡样芽孢杆菌为B.cereus。

本发明取得的有益效果在于：有效监控荧光定量PCR扩增过程；蜡样芽孢杆菌检测的种特异性强，可有效区蜡样芽孢杆菌群的其它菌种，使得检测结果更能满足实际食品安全检测的需求；检测方法快速、灵敏度高，适用于高通量筛选。

为了便于理解，以下将通过具体的附图、实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。另外，本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。

附图说明

图1显示了本发明一种具体实施方式中的实时荧光定量PCR体系检测阳性菌和阴性对照菌株的荧光定量PCR扩增曲线。

图2显示了本发明一种具体实施方式中的实时荧光定量PCR体系检测的重现性。

具体实施方式

以下结合附图详述了本发明的一种优选的具体实施方式。

以下本文将通过具体的实施例来描述发明。如未特别指明之处，可根据本领域技术人员所熟悉的《分子克隆实验指南》(第三版)(科学出版社，北京，中国，2005年)等实验手册以及本文所引用的参考文献中所列方法来实施。

1.1 主要试剂和仪器

以下描述中提到的QIAamp DNA Mini Kit试剂盒，购自美国Qiagen公司(Cat.No.51304)；Taqman Universal PCR Master Mix II with UNG荧光定量PCR Kit购自美国Invitrogen公司(Cat.No.4440038)；ABI7500荧光定量PCR仪，购自ABI公司。

1.2 菌株以及DNA的抽提

菌株均可以购自于中国农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)、中国医学微生物菌种保藏中心(CMCC)以及美国典型微生物保藏中心(ATCC)，菌株编号如表1所示。培养方法可以按照上述菌株提供单位推荐的方法进行，参照厂商说明，用QIAamp DNA Mini Kit试剂盒来提取细菌基因组DNA。

表1 蜡样芽孢杆菌及非蜡样芽孢杆菌标准菌株以及用本发明的PCR方法检测的结果

*注：+表示PCR扩增结果为阳性；-表示PCR扩增结果为阴性

1.3 实时荧光定量PCR反应

PCR反应体系(本文中PCR体系均参照此)：Taqman Universal PCR MasterMix II with UNG，10.0μL，引物murB-F(5’-CCTTCTTCAAGTTCAAATCTCG-3’)(10μmol/L)，1μL，引物murB-R(5’-GTYGTAATGACAGGTGATGGA-3’)(10μmol/L)，1μL，锁核苷酸探针LNA-probe(5'-FAM-TGTAAT*GG*TTGTT*CG*CAA-BHQ1-3')(2μmol/L)，1μL，ROX荧光校正试剂(50×)，0.5μL，超纯水，4.5μL；加入2.0μL模板(即，上述各自抽提的菌株DNA)。在ABI7500荧光定量PCR仪上进行PCR扩增和荧光检测，扩增条件为：40个循环：95°C/15sec,68°C/1min。实时荧光定量PCR体系检测阳性菌和阴性对照菌株的荧光定量PCR扩增曲线如图1所示。实时荧光定量PCR体系检测的重现性如图2所示。

1.4 方法特异性

将表1所列菌株培养后提取总DNA，进行1.3节所述的实时荧光定量PCR法。结果如表1所示，所有蜡样芽孢杆菌菌株均能得出阳性的检测结果，而所有非蜡样芽孢杆菌菌株检测结果均为阴性。

1.5 方法灵敏度

蜡样芽孢杆菌ATCC14579在LB平板上划线后，挑取单克隆接种于1mL LB液体培养基培养18~24小时，培养物10倍梯度稀释，每个稀释梯度取1mL抽提总DNA，按1.3节所述的实时荧光定量PCR法。另各取1mL进行平板计数。

当蜡样芽孢杆菌纯培养物稀释后得到的平板计数浓度为10²CFU/mL时，PCR检测的Ct值为38.5；而浓度为10CFU/mL时，Ct值大于40，超越仪器分辨极限，即检测限为10²CFU/mL。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思做出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域的技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (10)

1.蜡样芽孢杆菌的检测方法，其特征在于，所述方法包括：

1)提取待检测样品中的DNA；

2)将步骤1)获得的DNA作为模板，进行实时荧光定量PCR检测；

其中，实时荧光定量PCR检测的靶标为蜡样芽孢杆菌murB基因。

2.如权利要求1所述的方法，其中，实时荧光定量PCR检测所用的荧光探针的核苷酸序列为5′-TGTAAT*GG*TTGTT*CG*CAA-BHQ1-3′，标记为星号且带下划线的核苷酸为锁核苷酸。

3.如权利要求2所述的方法，其中，所述的荧光探针中的荧光素为FAM。

4.如权利要求2所述的方法，其中，实时荧光定量PCR检测所用的引物为引物murB-F和murB-R；其中，

murB-F的序列为5′-CCTTCTTCAAGTTCAAATCTCG-3′；

murB-R的序列为5′-GTYGTAATGACAGGTGATGGA-3′。

5.如权利要求1所述的方法，其中，所述待检测样品来自于食品。

6.蜡样芽孢杆菌的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于扩增蜡样芽孢杆菌murB基因的引物。

7.如权利要求6所述的蜡样芽孢杆菌的检测试剂盒，其中，所述引物为引物murB-F和murB-R；其中，

murB-F的序列为5′-CCTTCTTCAAGTTCAAATCTCG-3′；

murB-R的序列为5′-GTYGTAATGACAGGTGATGGA-3′。

8.如权利要求6所述的蜡样芽孢杆菌的检测试剂盒，其中，所述试剂盒还包括锁核苷酸荧光探针，所述荧光探针的核苷酸序列为5′-TGTAAT*GG*TTGTT*CG*CAA-BHQ1-3′，标记为星号且带下划线的核苷酸为锁核苷酸。

9.如权利要求8所述的试剂盒，其中，所述的荧光探针中的荧光素为FAM。

10.如权利要求6-9中任一所述的试剂盒在制备用于检测蜡样芽孢杆菌的产品中的应用。

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