CN103055352B - 磷酸钙/胶原蛋白复合生物陶瓷材料及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种磷酸钙陶瓷(CaP)与胶原蛋白(Collagen)复合的生物活性陶瓷材料及其制备工艺。该复合生物陶瓷以多孔磷酸钙陶瓷为基体，I-型胶原蛋白为增韧补强相，经真空负压灌注交联而成。其工艺过程如下：首先制备一类互穿贯通的多孔磷酸钙陶瓷，孔隙率60%～95%。将多孔磷酸钙陶瓷浸没于5～20mg/ml浓度的胶原蛋白溶液中，常温抽真空至0～10Pa进行灌注，保压1～3小时后，经超声波震荡。真空负压灌注过程可根据需要重复进行。灌注胶原蛋白的磷酸钙陶瓷经交联后，再冷冻干燥制得复合生物陶瓷。本发明制备的生物陶瓷具有良好的生物相容性和生物活性，同时具有比纯磷酸钙陶瓷材料更好的力学强度，可用作人工骨以及骨组织工程支架材料，在骨科临床上具有广阔的应用前景。

Description

磷酸钙/胶原蛋白复合生物陶瓷材料及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种多孔磷酸钙陶瓷和胶原蛋白复合的生物陶瓷材料及其制备方法，属于生物医学材料领域。

背景技术

磷酸钙生物陶瓷材料(Calcium Phosphate Bioceramics，CaP)，由于其具有和人体骨组织相似的无机成分，以及兼备多种优良的生物学特性而被广泛用作骨修复材料。常见的磷酸钙系生物陶瓷材料包括羟基磷灰石（Hydroxyapatite, HA）、β相磷酸三钙(beta-Tricalcium phosphate,β-TCP)以及它们的复合物双相磷酸钙陶瓷(Biphasic calcium phosphate,BCP)等。已有研究证实，多孔磷酸钙系生物陶瓷具备众多骨修复材料所需求的生物学特性，如生物相容性、骨传导及骨诱导能力、可生物降解吸收等。它们在临床中以颗粒或小块体的形式广泛应用于非承力部位骨缺损的修复填充，然而因其在力学性能方面不能满足负重骨缺损修复的应用要求，因此此类生物陶瓷材料用于承力部位骨组织的修复仍然是一个亟待解决的难点。在保证磷酸钙生物陶瓷材料优良生物学性能的基础上，进一步提高其力学性能，结合生物体内骨组织应力环境，快速诱导新骨形成并最终修复重建缺损部位骨组织，是有望解决承力部位骨缺损修复重建的一条理想途径。

理想的承力骨修复生物材料应同时兼备良好的生物学性能和力学性能。生物学性能主要希望其具有良好的生物相容性、骨传导性、骨诱导性和骨生成能力。力学性能包括抗压、抗弯强度，弹性模量等多个综合指标能够最大限度地接近或与天然骨的力学性能相匹配。现有研究认为，材料的组成、界面和微观孔隙结构对磷酸钙陶瓷的骨诱导能力具有决定作用。临床研究证实，尽管大部分磷酸钙陶瓷表现出优良的生物学特性，能很好地与人体硬组织及软组织生物相容，但研究结果同时表明致密磷酸钙陶瓷不能够有效诱导新骨组织的形成，只有具有多孔结构的磷酸钙陶瓷才具备骨诱导生成能力。多孔磷酸钙陶瓷植入生物体内后在其微观孔隙中能够吸附/富集新骨生成所需的相关基因和蛋白，同时促进新生毛细血管组织的生成，而早期血管化能够提供成骨所需的养分条件和输送代谢产物，利于成骨细胞的分化和增殖，进而诱导新骨组织的生成。因此，微孔结构对磷酸钙系生物陶瓷材料的骨诱导性和骨生成能力至关重要。基于此，已有相关专利技术（制备多孔结构陶瓷人工骨的方法,专利号：CN1903384；可控微结构的多孔生物陶瓷、其制备方法及应用，专利号：CN 1268583C）对磷酸钙多孔结构的制备和优化进行了报道。显而易见，由于孔隙结构的介入及磷酸钙陶瓷自身的脆性特点，势必会降低此类材料的力学性能，从而制约将此类生物陶瓷材料用作承力骨组织的修复应用。因此有技术报道通过材料复合技术以提高陶瓷材料的力学性能。例如专利CN1935270A报道了一种以羟基磷灰石为基体，透辉石和氧化铝为增韧补强体的复合生物陶瓷材料及其制备技术，该技术制备的复合生物陶瓷具有比纯HA更好的断裂韧性、抗弯强度等力学性能。

天然骨的主要成分包含无机磷酸钙和有机胶原蛋白，其中无机磷酸钙以生物矿化的磷灰石为主（Biological apatite），骨头中含有约60～75质量百分比的生物磷灰石。胶原蛋白(Collagen)是一种天然的聚合物，它是人体皮肤和骨头的主要有机成分，是骨基质中含量最丰富的蛋白质。胶原蛋白具有优良的生物相容性及低免疫力，适合作为新骨细胞贴附生长的基质，是一种用于骨组织修复的理想材料。最近已有研究致力于开发制备胶原蛋白基或以其作为添加相的生物材料用作骨组织的修复。外国专利WO 93/12736中公开了一种矿化胶原蛋白用作骨组织修复的方法。但其仅适用于非承力部位骨组织创伤修复。

基于磷酸钙系生物陶瓷的特性和缺点，本发明的目的在于提供一种制备磷酸钙和胶原蛋白复合生物材料的方法。本发明制备的复合材料可提高生物陶瓷的力学性能，并能进一步模拟骨基质的成分，以此类陶瓷作为骨组织修复支架材料，将具有优良的力学性能和诱导组织再生的功能，有望促进承力部位骨组织的修复重建应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种磷酸钙和胶原蛋白复合生物材料。

本发明是通过以下技术方案来实现的：

一种磷酸钙/胶原蛋白复合生物陶瓷材料，由多孔磷酸钙陶瓷与胶原蛋白复合而成。

作为优选方式，该复合生物陶瓷以多孔磷酸钙陶瓷为基体，胶原蛋白为增韧补强相，各原料的质量百分比（Wt%）为：磷酸钙陶瓷80%～98%，胶原蛋白2～20%。

作为优选方式，所述多孔磷酸钙陶瓷孔隙结构特征为陶瓷总体孔隙率为60%～95%，大孔孔径为100～500微米，大孔之间有微孔相互贯通，大孔内壁布满毛细微孔。

作为优选方式，所述多孔磷酸钙陶瓷采用双氧水发泡法或微球占位法或注浆法制备，陶瓷材料成分为：羟基磷灰石、β相磷酸三钙或双相磷酸钙陶瓷。

作为优选方式，所述胶原蛋白为I-型胶原蛋白。

作为优选方式，所述胶原蛋白在陶瓷孔隙中形成三维胶原蛋白纤维网状结构。

本发明的另一目的在于提供一种上述的磷酸钙/胶原蛋白复合生物陶瓷材料的制备方法，其操作步骤包括：

（a）制备互穿贯通多孔磷酸钙陶瓷：制备陶瓷多孔结构胚体，然后经烧结成瓷。

（b）灌注：配制胶原蛋白溶液，以胶原蛋白溶液浸没步骤（a）中制备的多孔陶瓷，常温下进行真空灌注，然后，对产物进行超声波震荡搅拌。

（c）交联：将灌注胶原蛋白的磷酸钙陶瓷经物理或化学方法进行交联，最后对产品进行冷冻干燥。

作为优选方式，步骤（a）中所述胚体采用双氧水发泡法或微球占位法或注浆法制备，所述烧结的温度为1000～1200℃；步骤（b）中所述的胶原蛋白溶液浓度为5～20 mg/ml，所述真空灌注过程为抽真空至0～10 Pa，保压1～3小时，所述真空灌注和超声振荡过程可根据需要重复进行，所述震荡搅拌的时间为5～20分钟；步骤（c）中所述的交联方法为京尼平交联（J Mech Behav Biomed, 2012,15:176-189.）、紫外交联(J Biomed Mater Res. 1995,29(11):1373-1379)、辐照交联 (Radiat Res. 1964,22(4):606-621)、戊二醛交联(J Mater Sci-Mater M, 1995,6:460-472 )中的一种，所述冷冻干燥的温度为-60℃～-20℃，时间为24～48小时。

本发明还提供了一种所述的磷酸钙/胶原蛋白复合生物陶瓷材料的用途：将其用作人体硬组织缺损的修复或骨组织工程用支架材料。特别是将其用于承力部位骨组织创伤修复。

本发明的有益效果：

1、本发明所述的复合材料模拟自然骨基质的成分，既显著提高了生物陶瓷的力学性能，又促进了其骨组织修复再生功能。在生物医学领域中具有巨大的应用前景，尤其是用于硬组织缺损的修复和重建，在硬骨缺损部位作为修复填充支架材料，迅速诱导新骨组织的生成，增强骨连接和愈合功能。

2、所述复合材料采用已烧结成瓷的多孔磷酸钙陶瓷作为基体，其大孔之间有微孔相互贯通，大孔内壁布满毛细微孔，这种结构一方面使复合材料具有优良的骨诱导性和骨生成能力，另一方面有利于容纳更多的胶原蛋白，使其进入材料内部，并形成三维网状结构。

3、所述复合材料中胶原蛋白在陶瓷孔隙中相互交联形成三维胶原蛋白纤维网状结构，这种结构一方面有利于提高材料的力学性能，提升增韧补强的效果，另一方面与陶瓷基体材料的多孔结构形成锁合，使两者的结合更牢固，材料更稳定，同时也有利于细胞其上黏附生长。

4、采用I-型胶原蛋白。胶原蛋白是一种多糖蛋白，含有少量的半乳酸和葡萄糖，是细胞外基质的主要成分，同时也是人体中最重要的成分之一。它广泛存在于人体的皮肤、骨骼、肌肉、软骨、关节等组织之中。其中在人体硬骨组织中主要存在I-型胶原蛋白，它起着支撑、保护和修复等多重功效。I-型胶原蛋白主要由成纤维细胞或与其来源类似的细胞如成骨细胞合成，它在促进骨细胞增殖、分化，诱导骨组织再生重建方面有着重要的生物功效。

5、本发明所述复合材料的制备方法中，通过真空负压灌注一定粘度的胶原蛋白，实现多孔陶瓷与胶原蛋白的复合，整个工艺为物理复合过程，无化学反应及有机溶剂参与，避免了制备工艺中外掺和有毒、有害物质对生物陶瓷的污染。通过超声波震荡及重复灌注有利于提高胶原蛋白填充量，同时使其均匀地吸附填充于陶瓷孔隙之中。交联过程有利于胶原蛋白形成三维纤维网状结构。

附图说明

图1为本发明的制备工艺流程图；

图2为本发明制备的部分产品图，共3组，每组两个样品，从左至右分别为磷酸三钙/胶原蛋白复合陶瓷、双相磷酸钙/胶原蛋白复合陶瓷和羟基磷灰石/胶原蛋白复合陶瓷；

图3为实施例中磷酸钙/胶原蛋白复合陶瓷材料的SEM形貌图，其中(a)微纯羟基磷灰石多孔陶瓷的SEM形貌图；(b)为实施例1羟基磷灰石/胶原蛋白复合陶瓷生物材料的SEM形貌图；(c)为实施例2磷酸三钙/胶原蛋白复合陶瓷生物材料的SEM形貌图；(d)为实施例3双相磷酸钙/胶原蛋白复合陶瓷生物材料的SEM形貌图；

图4为磷酸钙/胶原蛋白复合生物陶瓷材料的力学性能测试图；

图5为双相磷酸钙/胶原蛋白复合陶瓷材料体外培养骨髓间充质干细胞（MSCs）激光共聚焦显微图片，其中(a)为细胞种植1天；(b)为细胞种植3天；(c)为细胞种植7天；(d)为细胞种植21天。

具体实施方式

下面结合附图对本发明工艺作进一步详述。

本发明的制备工艺流程如图1所示。原材料的准备分为两方面，其一是适宜孔隙的磷酸钙陶瓷体的准备，其二是I型胶原蛋白溶液的配制准备。本发明所适用的磷酸钙陶瓷主要包括下列三类：羟基磷灰石（Hydroxyapatite,HA）、磷酸三钙(beta-Tricalcium phosphate,β-TCP)、以及双相磷酸钙陶瓷(Biphasic calcium phosphate,BCP)，涉及的多孔陶瓷体的制作可经由双氧水发泡法 (中国专利：CN1903384)、微粒占位法(中国专利：CN 1268583C)、注浆法（美国专利：No.3090094）或其他方法制备多孔陶瓷胚体，然后经煅烧形成的多孔磷酸钙陶瓷。本发明实施例使用的陶瓷由双氧水发泡法制备胚体，陶瓷总体孔隙率为60%～95%，大孔孔径为100～500微米，大孔之间有微孔相互贯通。本发明适用的胶原蛋白为所有种类胶原蛋白，本发明实施例使用经灭菌、纯化、去免疫端氨基酸的第一型小牛牛皮胶原蛋白来示范本发明。复合物陶瓷体中所使用的胶原蛋白含量为5～20%质量百分比，按5～20 mg/ml的浓度来配制使用胶原蛋白溶液。

以下所列为本发明的几个最佳实施例，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。

实施例1

以羟基磷灰石粉末为原料，制备5×5×20 mm的长方体多孔磷酸钙陶瓷产品。产品孔隙结构要求：整体孔隙率85%±5%、大孔孔径为400±50μm、互穿贯通微孔孔径为80±20μm。具体步骤如下：

1）将经湿法反应制得的羟基磷灰石粉末用标准型号筛子，筛选出直径为80～160μm的羟基磷灰石干粉，随后采用双氧水发泡法制备出多孔陶瓷胚体，低温＜100 ℃烘干；

2）将陶瓷胚体放入马弗炉中烧结，从常温以5 ℃/min的速率升温至1100 ℃持续2小时烧结，然后随炉冷却。随后将得到多孔羟基磷灰石陶瓷切割成5×5×20 mm的长方体；

3）将经灭菌、纯化、去免疫端氨基酸的I-型小牛牛皮胶原蛋白，以去离子水稀释并按5 mg/ml的浓度配制胶原蛋白溶液；

4）以配制好的胶原蛋白溶液浸没多孔陶瓷，常温抽真空至＜10 Pa进行灌注，保压3小时，再经超声波震荡搅拌10分钟，重复抽真空负压灌注过程一次。

5）将灌注胶原蛋白的陶瓷用10 mg/ml的京尼平交联48小时，再以-20 ℃温度冷冻干燥24小时。

所得的羟基磷灰石/胶原蛋白复合生物陶瓷材料的扫描电镜图片如图3所示，经万能材料试验机测得其最大抗压强度为8.7 MPa（测试方法参见GB/T 1964-1996），较纯羟基磷灰石多孔生物陶瓷材料提升3.1倍。

实施例2：

以多孔β-磷酸三钙陶瓷为基体，制备磷酸三钙/胶原蛋白（TCP/Collagen)复合陶瓷材料。陶瓷整体孔隙率85%±5%、大孔孔径为400±50μm、互穿贯通微孔孔径为80±20μm，其余产品制备工艺及步骤与实施例1相同。所得的磷酸三钙/胶原蛋白复合生物陶瓷材料的扫描电镜图片如图3所示，经万能材料试验机测得其最大抗压强度为5.4 MPa，较复合胶原蛋白前的多孔β-磷酸三钙陶瓷材料的力学性能提升约2.9倍，比实施例1中羟基磷灰石/胶原蛋白（HA/Collagen)复合陶瓷的抗压强度低3.8 MPa，这是因为纯磷酸三钙陶瓷本身力学性能就比纯羟基磷灰石陶瓷差。

实施例3

以多孔双相磷酸钙陶瓷为基体，制备双相磷酸钙/胶原蛋白（BCP/Collagen)复合陶瓷材料。陶瓷整体孔隙率85%±5%、大孔孔径为400±50μm、互穿贯通微孔孔径为80±20μm，其余产品制备工艺及步骤与实施例1相同。所得的双相磷酸钙/胶原蛋白复合生物陶瓷材料的扫描电镜图片如图3所示，经万能材料试验机测得其最大抗压强度为6.7 MPa，较复合胶原蛋白前的多孔双相磷酸钙陶瓷材料的力学性能提升约3.0倍，比实施例1中羟基磷灰石/胶原蛋白（HA/Collagen)复合陶瓷的抗压强度低，但比实施例2中磷酸三钙/胶原蛋白（TCP/Collagen)复合陶瓷的抗压强度高，这是因为纯磷酸钙陶瓷的力学性能在相同条件下，其机械强度排序为：HA＞BCP＞TCP。

实施例4

其它条件及工艺同实施例1，不同之处在于采用不同孔隙结构的羟基磷灰石陶瓷为基体进行胶原蛋白灌注复合，其陶瓷孔隙率95%±5%、大孔孔径为500±100μm、互穿贯通微孔孔径为100±20μm。所得的羟基磷灰石/胶原蛋白复合生物陶瓷材料经万能材料试验机测得最大其抗压强度为8.2 MPa，较复合胶原蛋白前的羟基磷灰石陶瓷材料的力学性能提升约2.9倍，但较实施例1中所得的羟基磷灰石/胶原蛋白复合陶瓷的抗压强度低0.5 MPa,该结果说明磷酸钙陶瓷的多孔骨架结构在复合材料的力学性能方面具有重要作用。尽管陶瓷整体孔隙率和孔径的增大，促进了复合材料中胶原蛋白含量的增加，因其孔隙率与孔径增加的同时，牺牲了材料本身的力学强度，因而最终复合后的材料的力学性能较实施例1有所下降。

实施例5

其它条件及工艺同实施例1，不同之处在于采用不同浓度的胶原蛋白进行灌注复合，其胶原蛋白浓度为20 mg/ml，并经京尼平交联72小时。所得的羟基磷灰石/胶原蛋白复合生物陶瓷材料，经万能材料试验机测得其最大抗压强度为9.1 MPa，较为复合胶原蛋白前陶瓷材料的力学性能提升约3.3倍，该结果说明磷酸钙陶瓷孔隙结构中复合较多的胶原蛋白有利于材料最终力学性能的提升。

实施例6

将实施例3制备的双相磷酸钙/胶原蛋白复合陶瓷材料灭菌后与骨髓间充质干细胞（MSCs）在体外共培养3周，分别在培养1天、3天、7天和21天时，采用二乙酸荧光素/碘化丙啶(FDA/PI)对细胞进行染色，然后采用激光共聚焦显微镜观察并拍照，结果显示（如图5所示），细胞贴附于陶瓷/胶原内壁生长，在该材料上分化、增殖明显。材料具有诱导骨组织再生和增快骨缺损修补重建的功能。

以本发明的方法，制备出的磷酸钙/胶原蛋白复合生物陶瓷材料，大为提升了纯磷酸钙多孔陶瓷材料的力学性能。经交联后的胶原蛋白，在陶瓷孔隙内呈三维的胶原蛋白纤维网状结构，赋予材料足够的机械强度和韧度，同时通过复合胶原蛋白模拟骨基质的成分，使材料具有较好的生物相容性和生物活性。

以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性的；本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围。 

Claims (9)

1.一种磷酸钙/胶原蛋白复合生物陶瓷材料，其特征在于，以多孔磷酸钙陶瓷为基体，胶原蛋白为增韧补强相，其中胶原蛋白的质量百分比（wt%）为5～20%，所述多孔磷酸钙陶瓷孔隙结构特征为陶瓷总体孔隙率为60%～95%，大孔孔径为100～500微米，大孔之间有微孔相互贯通，大孔内壁布满毛细微孔，所述胶原蛋白增韧补强相为胶原蛋白溶液经真空灌注和超声波震荡搅拌以及交联后在所述陶瓷孔隙中形成的三维胶原蛋白纤维网状结构，所述复合生物陶瓷材料仿生天然骨组织成分，具有优良的骨诱导性和骨生成能力。

2.根据权利要求1所述的复合生物陶瓷材料，其特征在于，所述多孔磷酸钙陶瓷采用双氧水发泡法或微球占位法或注浆法制备，陶瓷材料成分为：羟基磷灰石、β相磷酸三钙或双相磷酸钙陶瓷。

3.根据权利要求1所述的复合生物陶瓷材料，其特征在于，所述胶原蛋白为I-型胶原蛋白。

4.一种如权利要求1所述的磷酸钙/胶原蛋白复合生物陶瓷材料的制备方法，其特征在于,其操作步骤包括：

（a）制备互穿贯通多孔磷酸钙陶瓷：制备陶瓷多孔结构胚体，然后经烧结成瓷；

（b）灌注：配制胶原蛋白溶液，以胶原蛋白溶液浸没步骤（a）中制备的多孔陶瓷，常温下进行真空灌注，然后，对产物进行超声波震荡搅拌；

（c）交联：将灌注胶原蛋白的磷酸钙陶瓷经物理或化学方法进行交联，最后对产品进行冷冻干燥。

5.根据权利要求4所述的磷酸钙/胶原蛋白复合生物陶瓷材料的制备方法，其特征在于,步骤（a）中所述胚体采用双氧水发泡法或微球占位法或注浆法制备，所述烧结的温度为1000～1200℃；步骤（b）中所述的胶原蛋白溶液浓度为5～20 mg/ml，所述真空灌注过程为抽真空至0～10 Pa，保压1～3小时，所述真空灌注和超声振荡过程至少进行一次，所述震荡搅拌的时间为5～20分钟；步骤（c）中所述的交联方法为京尼平交联、辐照交联、戊二醛交联中的一种，所述冷冻干燥的温度为-60℃～-20℃，时间为24～48小时。

6.根据权利要求5所述的磷酸钙/胶原蛋白复合生物陶瓷材料的制备方法，其特征在于，所述辐照交联具体为紫外光辐照交联。

7.一种如权利要求1所述的磷酸钙/胶原蛋白复合生物陶瓷材料的用途，其特征在于，将其用于制作人体硬组织缺损的修复材料。

8.根据权利要求7所述的磷酸钙/胶原蛋白复合生物陶瓷材料的用途，其特征在于，将其用于制作骨组织工程用支架材料。

9.根据权利要求7所述的磷酸钙/胶原蛋白复合生物陶瓷材料的用途，其特征在于，将其用于制作承力部位骨组织创伤修复材料。