CN103100112B - 一种双膜结构移植材料的制备方法及用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于组织工程和生物材料领域，为一种双膜结构移植材料的制备方法及用途，移植材料由干细胞膜片片段、富血小板纤维蛋白膜颗粒组成，干细胞经扩大培养后采用膜片诱导液诱导培养得到干细胞膜片，剪碎后制备成细胞膜片片段；富血小板纤维蛋白凝胶挤压后去除其中液体成分，即可得富血小板纤维蛋白膜，后者剪碎成为颗粒形式；将细胞膜片片段与富血小板纤维蛋白膜颗粒按照体外筛选的最佳配比关系进行混合后，即制得所需移植材料。本材料可广泛用于口腔及全身其他部位中小范围缺损的组织修复及再生，提高了组织修复的效果。

Description

一种双膜结构移植材料的制备方法及用途

技术领域

本发明属于组织工程和生物材料领域，涉及一种双膜结构移植材料，特别涉及一种干细胞膜片片段复合富血小板纤维蛋白膜双膜结构移植材料的制备方法及用途。

背景技术

目前，利用干细胞技术进行组织缺损修复通常采用干细胞悬液和外源性支架材料复合的方法，主要形式有三种：单纯细胞悬液局部移植；细胞悬液接种于外源性支架材料；细胞悬液接种于支架材料后体外行三维培养。然而，上述移植方法存在诸多不足：首先，细胞在用胰酶消化获得悬液的过程中，细胞间信号分子和细胞外基质的结构遭到破坏，细胞本身的活性也受到了影响；其次，细胞移植的量难以控制，细胞量太少，细胞难以迅速定植于移植局部，细胞量太多，又会造成局部细胞堆积，不利于细胞伸展和营养供应；最后，支架材料的移植和降解可能造成宿主毒性反应和免疫反应，而未降解的支架材料会造成纤维包裹，影响血供和组织结构重建。因此，需要寻找一种制备干细胞复合支架材料的新方法，减少干细胞的流失，提高其生物学活性，减少支架材料的吸收和宿主的免疫反应，提高组织缺损修复的效果。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种CSF复合PRF的双膜结构的移植材料及其制备方法和用途，CSF (cell sheet fragment)即细胞膜片片段，PRF(platelet-rich fibrin)为富血小板纤维蛋白，本发明的移植材料能够应用于如软骨、软组织缺损的修复及牙髓、牙周膜组织的再生，有效提高组织修复的效果。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种双膜结构移植材料，其特征在于：由干细胞膜片片段和富血小板纤维蛋白膜颗粒组成。

优选的，所述干细胞选自骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞、牙髓干细胞或牙周膜干细胞。

优选的，所述富血小板纤维蛋白膜片颗粒经由血液离心后获得。

优选的，细胞膜片采用六孔板进行制备，细胞膜片片段和富血小板纤维蛋白膜的比例如下：每张六孔板细胞膜片数量∶用于离心获得富血小板纤维蛋白膜片的血液毫升数＝1∶3.5～4.0。

优选的，所述干细胞和富血小板纤维蛋白均来源于同一个体。

优选的，干细胞必须制备成细胞膜片片段的形式。

一种移植材料的制备方法，其特征在于其制备过程包括以下步骤：

第一步，干细胞膜片的培养：原代干细胞经扩大培养后接种于六孔板，待生长融合至80％时以膜片诱导液予以培养，3天换液一次，待细胞膜片周围出现卷曲时认为细胞膜片成熟；

第二步，制备干细胞膜片片段：用机械剥离的方法将细胞膜片从培养皿中剥离，用无菌眼科剪将其剪碎，制备成细胞膜片片段(大小约0.5mm×0.5mm)；

第三步，提取富血小板纤维蛋白膜片颗粒：根据所需比例，以10ml为单位，将血液(不加任何抗凝剂)置于无菌玻璃离心管或塑料套管的玻璃离心管中，立即以3000rpm/min的速度离心10分钟，静置5分钟后，无菌镊钳夹取出离心管中间部分的富血小板纤维蛋白凝胶，将其底部红细胞端于无菌纱布上轻蘸以去除多余红细胞，保留完整的淡黄色凝胶部分及底部少量粘附牢固的红细胞，将后者平铺置于无菌纱布之间，轻压挤出其中液体成分，制备成一淡黄色坚韧膜状结构，用无菌眼科剪将其剪碎，制备成大小约0.5mm×0.5mm×0.5mm的富血小板纤维蛋白膜片颗粒；

第四步，将制备的细胞膜片片段和富血小板纤维蛋白膜片颗粒置于无菌培养皿中，按照比例手动将其混匀，保证二者充分混合，即可得到干细胞膜片片段与富血小板纤维蛋白膜复合后形成的双膜结构移植材料。

优选的，细胞膜片片段和富血小板纤维蛋白膜的比例如下：每张六孔板细胞膜片数量∶用于离心获得富血小板纤维蛋白膜片的血液毫升数＝1∶3.5～4.0。

本发明的移植材料在口腔颌面部或全身中小范围组织缺损修复中的应用。

本发明的移植材料在制备口腔颌面部或全身中小范围组织缺损修复用移植材料中的用途。

本发明的移植材料与其他生物材料组成的复合材料在制备组织缺损修复用移植材料中的用途。

一种干细胞膜片片段复合富血小板纤维蛋白膜的双膜结构移植材料，由干细胞膜片片段、富血小板纤维蛋白膜颗粒组成。干细胞形式根据修复组织的类型可不同，包括骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞、牙髓干细胞及牙周膜干细胞等，富血小板纤维蛋白膜为血液经离心后制备获得。体外进行二者配比的筛选，以干细胞的增殖、分化作为评价指标，确定二者最佳体积比为：六孔板获得细胞膜片∶用于离心获得富血小板纤维蛋白膜片的血液＝1∶3.5～4.0。按照该配比进行移植物的制备，再将其移植至实验动物体内，进行体内实验的验证，结果证明，该配比下的双膜结构移植物具有良好的组织修复与组织再生作用。

移植材料两组分混合的方式是：将干细胞制备成膜片片段形式，富血小板纤维蛋白膜制备成颗粒状(大小约0.5mm×0.5mm×0.5mm)，二者于无菌培养皿中手动机械混匀，使二组分充分混合。

本发明还提供了所述干细胞膜片片段及富血小板纤维蛋白膜颗粒的制备方法，包括以下步骤：

第一步，干细胞膜片的培养：原代干细胞经扩大培养后接种于六孔板，待生长融合至80％时以膜片诱导液予以培养，3天换液一次，待细胞膜片周围出现卷曲时认为细胞膜片成熟；

第二步，制备干细胞膜片片段：用机械剥离的方法将细胞膜片从培养皿中剥离，用无菌眼科剪将其剪碎，制备成细胞膜片片段(大小约0.5mm×0.5mm)；

第三步，提取富血小板纤维蛋白膜片颗粒：根据所需比例，以10ml为单位，将血液(不加任何抗凝剂)置于无菌玻璃离心管或塑料套管的玻璃离心管中，立即以3000rpm/min的速度离心10分钟，静置5分钟后，无菌镊钳夹取出离心管中间部分的富血小板纤维蛋白凝胶，将其底部红细胞端于无菌纱布上轻蘸以去除多余红细胞，保留完整的淡黄色凝胶部分及底部少量粘附牢固的红细胞，将后者平铺置于无菌纱布之间，轻压挤出其中液体成分，制备成一淡黄色坚韧膜状结构，用无菌眼科剪将其剪碎，制备成大小约0.5mm×0.5mm×0.5mm的富血小板纤维蛋白膜片颗粒；

第四步，将制备的细胞膜片片段和富血小板纤维蛋白膜片颗粒置于无菌培养皿中，按照比例手动将其混匀，保证二者充分混合，即可得到干细胞膜片片段复合富血小板纤维蛋白膜双膜结构移植材料。

所述的干细胞膜片片段复合富血小板纤维蛋白膜颗粒的双膜结构移植材料可用于中小范围的软骨及软组织缺损的修复，对于操作视野较好部位可直接将复合物置于缺损处，对于操作视野不佳或无法完全暴露缺损区的病例，亦可将移植材料置于注射器或采用内窥镜方法将其注射于缺损处。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

现有组织工程技术使用的支架材料几乎全部是外源性材料，而种子细胞则以细胞悬液的形式接种于外源性材料上，再添加一种或几种外源性生长因子，这种方法的不足之处在于：外源性的支架材料降解需要一定时间，且存在降解不充分的可能；而种子细胞以悬液形式接种并移植到组织局部后，极易流失，使得能够局部定植稳定发挥作用的细胞量明显变少；而且，外源性添加的生长因子种类较少，与生理状况下多种生长因子比例协调、协同发挥作用的模式完全不同，这些都会影响组织工程技术临床应用的效果。本发明最突出的特点是从根本上解决了上述现有技术的缺点，具体表现在以下几点：

1)低排斥。本法制备的复合移植材料中的两种成分，即干细胞膜片片段(CSF)和富血小板纤维蛋白膜(PRF)来源充足，具有极佳的生物学活性，几乎不存在免疫排斥反应及毒性反应。

2)配比佳。本发明的重要特点之一是筛选出了干细胞数量和富血小板纤维蛋白膜的最佳配比。该配比条件下，细胞具有良好的增殖和分化能力，有利于组织修复和再生，且该配比以六孔板获得细胞膜片数量和血液的毫升数作为配比的基本单位，容易准确掌握，便于操作。

3)高效率。富血小板纤维蛋白膜来自于血液，操作简单，极易获得；其本身含有大量的生长因子，包括转化生长因子β-1(TGF β-1)、血小板源性生长因子(PDGF)、胰岛素样生长因子(IGF)，上述三种生长因子可以促进细胞迁移、增殖，诱导纤维蛋白基质进行重塑，并促进胶原基质的分泌，在最初的组织愈合中起到了重要的作用；除此而外，PRF还含有表皮生长因子(EGF)和血管内皮生长因子(VEGF)等与创伤愈合和骨再生相关的生长因子。PRF本身就是纤维蛋白网状交联形成的三维支架结构，这种结构可以使得其中的生长因子缓慢释放。所以，PRF的组织修复和组织再生作用主要通过两方面实现，即生长因子的调节作用和纤维蛋白支架作用。

4)易操作。细胞膜片片段(CSF)的细胞类型可以根据修复缺损的区域及组织类型的不同而不同，包括骨髓间充质干细胞(BMSCs)、脂肪干细胞(ASCs)、牙髓干细胞(DPSCs)、牙周膜干细胞(PDLSCs)等，上述细胞均已被证实有良好的组织再生能力，且获得相对容易，易于体外短时间内扩大培养；细胞膜片技术本身由于保留了细胞外基质和细胞活性而较悬浮细胞具有更强的组织再生潜能；同时，膜片片段技术又改变了传统的膜片移植模式，将膜片制备成一定大小的片段，一方面可使细胞片段与支架材料充分混合，细胞快速定植于支架材料表面并伸出突触延伸至支架间隙内部，二者形成一个整体(图7)，另一方面可将细胞注射至难以完全暴露操作视野的区域。

5)抗感染。PRF的红端浓缩了大量的白细胞，这些白细胞一方面在局部发挥良好的抗炎作用，另一方面调动机体的免疫功能；同时，PRF在制备过程中还网罗了血液中大量免疫调节因子，如IL-1β，IL-4，IL-6及TNF-α，共同发挥抗感染的作用，利于组织愈合。

因此，本发明方法制备的复合移植材料具有来源丰富、适应症广泛、制备简单、无免疫排斥反应及毒性反应、无伦理争议、安全有效等优点。该方法具有普遍意义，适用于每位患者。

附图说明

图1为细胞膜片培养成熟后大体观(以牙髓干细胞为例)。

图2为细胞膜片显微结构的HE染色(以牙髓干细胞为例)。

图3为细胞膜片扫描电镜结构(以牙髓干细胞为例)。

图4为富血小板纤维蛋白大体观，其中A为离心后静置5分钟大体观；B为PRF凝胶；C为PRF膜；D为PRF颗粒。

图5为富血小板纤维蛋白膜显微结构的HE染色，其中A为40倍放大，B为100倍放大。

图6为富血小板纤维蛋白膜扫描电镜结构，其中A为其上端，为纤维蛋白三维网状结构；B为其下端，可见大量血小板、白细胞聚集。

图7为牙髓干细胞膜片片段复合富血小板纤维蛋白膜颗粒后形成的双膜结构移植物的扫描电镜，可见细胞牢固粘附于PRF表面，并伸出细胞突触至PRF三维网状结构的空隙中，二者牢固结合，形成整体。

图8为不同配比条件下细胞增殖情况，其中A为PRF对牙髓干细胞增殖的影响，B为PRF对牙周膜干细胞增殖的影响。

图9为不同配比条件下牙髓干细胞向成牙本质细胞分化时DMP1的表达水平。

图10为不同配比条件下牙周膜干细胞向牙周膜细胞分化时CP23的表达水平。

图11为分别采用单纯骨髓间充质干细胞膜片片段、单纯PRF颗粒、骨髓间充质干细胞膜片片段复合富血小板纤维蛋白膜颗粒的双膜结构修复兔髁突软骨缺损的体内实验结果，该图为实验2、4、8周后髁突组织大体观察结果。

图12为图11组织行HE染色结果。

图13为图11组织行甲苯胺蓝染色结果。

图14为图13中新生软骨区甲苯胺蓝异染着色强度分析的统计图，横坐标代表组别及时间，纵坐标代表异染区着色强度的平均光密度值。

图15为分别采用单纯PRF颗粒、单纯牙髓干细胞膜片片段、牙髓干细胞膜片片段复合富血小板纤维蛋白膜颗粒双膜结构行犬牙髓再生的体内实验结果，该图为1月、2月后HE染色结果。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进行更加详尽的说明。

干细胞膜片片段复合富血小板纤维蛋白膜的双膜结构移植材料的制备方法，包括体外配比筛选和体内验证两部分。

第一部分：体外配比筛选

1.材料与设备

1.1主要试剂

α-MEM培养基(Hyclone公司，美国)；0.25％胰酶(Hyclone公司，美国)；胎牛血清(四季青，浙江天杭生物科技有限公司)。

1.2仪器设备

多管架自动平衡离心机(TD25-WS，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)；细胞培养箱(Heraeuc Hearcell，Thermo公司，中国)；六孔板(Nunc公司，美国)；超净工作台(BIOBASE，美国)。

2.操作步骤

2.1干细胞的培养：

1)将原代干细胞经扩大培养后，按照1∶2～1∶3比例进行传代；

2)取第三代干细胞接种于六孔板中，常规培养(10％FBS的α-MEM培养液)至细胞融合80％。

2.2富血小板纤维蛋白制备：

1)将根据所需比例，以10ml为单位，将血液(不加任何抗凝剂)置于无菌玻璃离心管或塑料套管的玻璃离心管中，立即以3000rpm/min的速度离心10分钟，静置5分钟；

2)无菌镊钳夹取出离心管中间部分的富血小板纤维蛋白凝胶，将其底部红细胞端于无菌纱布上轻蘸以去除多余红细胞，保留完整的淡黄色凝胶部分及底部少量粘附牢固的红细胞，将后者平铺置于无菌纱布之间，轻压挤出其中液体成分，制备成一长方形淡黄色坚韧膜状结构；

3)将其平铺于无菌纱布上，无菌剪刀沿其长轴剪开，将其制备成1/8和1/4的PRF，置于培养液中备用。

2.3干细胞与富血小板纤维蛋白膜共培养：

1)按照1/8、1/4、3/8、1/2张PRF的比例，将剪好的PRF置于第三代干细胞的六孔板培养皿中，常规培养7日，3天换液一次；

2)二者共培养7天后去掉PRF，干细胞则继续正常培养，3天换液一次；

2.4干细胞增殖、分化的检测：

1)分别于二者共培养前和共培养后的1～7天进行干细胞数量的检测，观察PRF对细胞增殖的影响；

2)二者共培养后的7、14、21天行干细胞相关基因表达的Real-time PCR检测，观察PRF对细胞分化的影响。

3.实验结果

3.1干细胞增殖

PRF对牙髓干细胞和牙周膜干细胞的增殖具有明显的促进作用，且呈一定的时间依赖性。两种干细胞共同的特点是：PRF浓度从1/8～3/8，其对细胞增殖的影响呈现出明显的浓度依赖性，且以3/8PRF对细胞增殖的促进作用最为明显，1/2PRF对细胞增殖的虽有一定促进作用，但不及3/8PRF作用明显(如图8所示)。

3.2干细胞分化

二者共培养21天后，PRF对牙髓干细胞向成牙本质细胞方向分化的特异性蛋白DMP1的表达具有明显的上调作用，且呈明显的浓度依赖性，以1/2PRF最好，但其与3/8PRF之间的差别无统计学意义(图9)；PRF对牙周膜干细胞特异性蛋白CP23的表达也具有明显的上调，以3/8PRF的浓度最好(如图10所示)。

综合PRF对两种不同类型的干细胞增殖分化的影响的结果，我们认为3/8PRF对干细胞的增殖和分化均有明显的促进作用，故选择该浓度作为最佳浓度。由于每张PRF膜所需血液为10mL，故最终确定二者配比关系为：每张六孔板细胞膜片数量∶血液毫升数＝1∶3.75，为了简化操作，我们认为1∶3.5～4.0均可。为了验证该配比条件下的移植物的体内移植效果，我们进行体内部分实验。

第二部分：移植物体内验证

第一步，干细胞膜片的培养：原代干细胞经扩大培养后接种于六孔板，待生长融合至80％时以膜片诱导液予以培养，3天换液一次，待细胞膜片周围出现卷曲时认为细胞膜片成熟；

第二步，制备干细胞膜片片段：用机械剥离的方法将细胞膜片从培养皿中剥离，用无菌眼科剪将其剪碎，制备成细胞膜片片段(大小约0.5mm×0.5mm)；

第三步，提取富血小板纤维蛋白膜片颗粒：具体方法同体外实验部分，将制备所得的PRF膜用无菌眼科剪将其剪碎，制备成大小约0.5mm×0.5mm×0.5mm的富血小板纤维蛋白膜片颗粒；

第四步，将制备的细胞膜片片段和富血小板纤维蛋白膜片颗粒置于无菌培养皿中，按照比例手动将其混匀，保证二者充分混合，即可得到干细胞膜片片段复合富血小板纤维蛋白膜双膜结构移植材料。

对于操作视野较好的部位，使用时可将制备好的双膜结构移植材料直接置于缺损处，对于操作视野不佳或无法完全暴露缺损区的病例，亦可将移植材料置于注射器或采用内窥镜方法将其注射于缺损处。

为了验证本发明所述干细胞膜片片段复合富血小板纤维蛋白膜的双膜结构移植材料的功效，我们分别进行了不同种类干细胞细胞膜片复合富血小板纤维蛋白膜双膜结构进行组织缺损修复的实验，现分别以“兔骨髓间充质干细胞膜片片段复合富血小板纤维蛋白膜双膜结构修复兔髁突软骨缺损”和“犬牙髓干细胞膜片片段复合富血小板纤维蛋白膜双膜结构用于牙髓再生治疗”为例，进行如下试验：

实验一：兔骨髓间充质干细胞膜片片段复合富血小板纤维蛋白膜双膜结构修复兔髁突软骨缺损

1.材料与设备

1.1主要试剂

α-MEM培养基(Hyclone公司，美国)；0.25％胰酶(Hyclone公司，美国)；胎牛血清(四季青，浙江天杭生物科技有限公司)；维生素C(Sigma公司，美国)；戊巴比妥钠(德国，科昊生物工程有限责任公司分装)。

1.2仪器设备

多管架自动平衡离心机(TD25-WS，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)；细胞培养箱(Heraeuc Hearcell，Thermo公司，中国)；六孔板(Nunc公司，美国)；超净工作台(BIOBASE，美国)；尼康显微镜成像系统(XTJ30，日本)，分析电子天平(FA1004，中国)，扫描电镜(日立S-4800，日本)。

2.操作步骤

2.1兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)的培养

兔原代骨髓间充质干细胞采用含10％胎牛血清的α-MEM培养基常规培养，待细胞融合至80％时按照1∶2～1∶3的比例进行扩大培养，每2～3天换液一次；

2.2BMSCs膜片的制备

1)BMSCs培养至第三代时，传代至6孔板；更换膜片培养液(含10％胎牛血清、20mg/ml维生素C的α-MEM培养基)，常规继续培养两周，膜片培养液每2～3天更换一次，换液时注意避光；

2)待细胞膜片生长至周边细胞膜片稍卷曲时，即认为细胞膜片已成熟，将成熟的细胞膜片用眼科镊自一端剥离(如图1，图2，图3所示)，置于无菌培养皿中，采用无菌眼科剪将其剪成大小约0.5mm×0.5mm的片段，备用。

2.3PRF的制备

1)根据所需比例，以10ml为单位，将兔血液(不加任何抗凝剂)置于无菌玻璃离心管或塑料套管的玻璃离心管中，立即以3000rpm/min的速度离心10分钟，静置5分钟；

2)此时可见离心管中血液分为三层：下层为红细胞层，上层为极少量的淡黄色清液，中间层为淡黄色半透明富血小板纤维蛋白凝胶(如图4A所示)；

3)用无菌眼科镊将中间部分凝胶完整取出，将其底部红细胞端于无菌纱布上轻蘸以去除多余红细胞，保留完整的淡黄色凝胶部分及底部少量粘附牢固的红细胞(如图4B所示)，将后者平铺置于无菌纱布之间，轻压挤出其中液体成分，制备成一淡黄色坚韧膜状结构，即为富血小板纤维蛋白膜，即PRF膜(如图4C，图5，图6所示)；

4)用无菌眼科剪将其剪碎，制备成大小约0.5mm×0.5mm×0.5mm的富血小板纤维蛋白膜片颗粒，备用(如图4D所示)。

2.4BMSCs/PRF双膜结构的制备

将制备的BMSCs细胞膜片片段和PRF膜片颗粒置于无菌培养皿中，按照六孔板获得细胞膜片∶用于离心获得富血小板纤维蛋白膜片的血液＝1∶3.5～4.0的比例，手动将其混匀，保证二者充分混合，即可得到干细胞膜片片段复合富血小板纤维蛋白膜颗粒的双膜结构移植材料，备用(如图7所示)。

2.5兔颞下颌关节软骨缺损模型的建立

1)麻醉：无菌条件下，3％戊巴比妥钠(1mL/kg)耳缘静脉麻醉，另用1％利多卡因于建模侧施以局麻；

2)术前准备：术侧颞下颌关节术区备皮，碘伏消毒，铺巾；

3)于外眦外侧5mm处至外耳道方向作约2cm长的皮肤切口；

4)分离皮下组织，切开关节囊；

5)暴露髁突关节，用电动钻于髁突前斜面中央钻取1个直径约3mm的孔；

6)行关节复位，缝合关节囊，缝合皮肤层。

2.6实验分组

根据实验设计，将待植入髁突软骨缺损处的移植物分为4组：①空白对照组：髁突软骨缺损处不植入移植物；②单纯PRF颗粒组；③单纯BMSCs细胞膜片片段组；④BMSCs/PRF双膜结构组。

3.实验结果

分别于各组植入后的2w、4w、8w时使用戊巴比妥钠麻醉后取材，4％多聚甲醛固定。15％EDTA脱钙后进行大体观察，以及HE、甲苯胺蓝染色后组织显微结构的观察，结果如下：

1)大体观察可见：BMSCs/PRF双膜结构组修复情况要好于同时间点的其它组(如图11所示)；

2)HE染色结果：空白对照组在各时间点缺损区凹陷，均未见有软骨样物质充填；单独PRF组与单独细胞膜片组随着时间的延长缺损修复区逐渐有新生软骨生成，但软骨层次排列紊乱；双膜结构组，第8周时损伤区基本齐平，修复软骨层较薄、层次较清晰，与邻近正常软骨各层较连续(如图12所示)；

3)甲苯胺蓝染色结果：各组新生软骨区域呈异染现象(如图13所示)，采用IPP 6.0软件对各组甲苯胺蓝染色图片进行着色强度分析，计算平均光密度值。结果得出：除空白对照组外，其余3组在术后2、4、8周平均OD值呈逐渐增加趋势(P＜0.05)，并显著高于同时间点的空白对照组(P＜0.05)；单独PRF组与单独细胞膜片组在各个时间点平均OD值均无显著性差异。双膜结构组4、8周平均OD值显著高于同时间点的其它组(P＜0.05)(如图14所示)。

实验二：犬牙髓干细胞膜片片段复合富血小板纤维蛋白膜双膜结构用于牙髓再生治疗

1.材料与设备

1.1主要试剂

α-MEM培养基(Hyclone公司，美国)；I型胶原酶(GIBCO公司，美国)；0.25％胰酶(Hyclone公司，美国)；胎牛血清(四季青，浙江天杭生物科技有限公司)；维生素C(Sigma公司，美国)；戊巴比妥钠(德国，科昊生物工程有限责任公司分装)。

1.2仪器设备

多管架自动平衡离心机(TD25-WS，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)；细胞培养箱(Heraeuc Hearcell，Thermo公司，中国)；六孔板(Nunc公司，美国)；超净工作台(BIOBASE，美国)；尼康显微镜成像系统(XTJ30，日本)，分析电子天平(FA1004，中国)，扫描电镜(日立S-4800，日本)。

2.操作步骤

2.1犬牙髓干细胞(DPSCs)的分离与培养

犬原代牙髓干细胞采用含10％FBS的α-MEM常规培养，培养3～5天后的出现多个克隆细胞团，待克隆团内部细胞生长至80％时，以1∶2～1∶3的比例进行扩大培养，每2～3天换液一次；

2.2DPSCs膜片的制备

同实验一。

2.3PRF的制备

同实验一。

2.4犬牙髓干细胞膜片片段复合富血小板纤维蛋白膜双膜结构移植材料的制备

同实验一。

2.5犬牙髓再生模型的建立

1)犬(约6月龄)常规麻醉，方法同前；

2)术前准备：犬口内所有前磨牙采用牙周刮治器械行龈上下手动刮治，去除牙石及软垢，口腔内外碘伏严格消毒，铺巾；

3)经随机化分组后，上下颌前磨牙(除第一前磨牙)开髓，揭髓顶，暴露牙髓组织，拔髓针完整拔除牙髓后，采用30#K确定根尖孔开放后，扩大根尖孔至70#K锉，使根尖开放区直径达0.7mm；

4)一次性注射器吸取大量无菌生理盐水进行根管冲洗，确定根管内无牙髓组织及牙体组织碎屑残留；

5)依照2.6中分组，将移植物置于根管中，采用螺旋输送器将移植物送至整个根管中，达根管口处；移植物上端轻置氢氧化钙(Dycal，登士柏公司)，厚度约1mm，待氢氧化钙结固后，修整洞壁，采用玻璃离子垫底，厚度约1mm，缺损处采用光固化树脂充填；

2.6实验分组

根据实验设计，将待植入髓腔的移植物分为4组：①空白对照组：髓腔内不植入任何移植物；②单纯PRF颗粒组；③单纯DPSCs细胞膜片片段组；④DPSCs/PRF双膜结构组。

3.实验结果

HE染色结果：正常对照组可见牙髓组织、成牙本质细胞、前期牙本质及成熟牙本质有序排列，成牙本质细胞呈高柱状有序排列；各实验组均可见血管及染色较浅的前期牙本质形成，但血管数量、牙本质厚薄及细胞排列情况各组间存在差异：DPSCs/PRF双膜结构组细胞呈疏松的星网状复层排列，且细胞形态由远离牙本质的平行生长逐渐向靠近牙本质的垂直极性生长转变，形态类似成牙本质细胞，髓腔内见较多新生血管形成；单纯DPSCs细胞膜片组牙髓细胞较双膜结构组排列疏松、无序，且牙本质层较薄，但髓腔内亦可见较多的血管形成；单纯PRF颗粒组细胞大多呈圆形，无明显伸展，排列无序且牙本质壁薄，但髓腔内亦可见少量血管形成(如图15所示)。

4.机理分析

4.1干细胞膜片片段(CSF)的作用

干细胞(stem cells，SC)是一类具有自我复制能力和多向分化能力的细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，故目前作为种子细胞被广泛应用于组织工程中。

细胞膜片技术是通过体外诱导的方式促使种子细胞在短时间内产生大量细胞外基质(extracellular matrix，ECM)，将细胞紧密连结成为一种片状结构。ECM不仅为细胞和组织提供连接、营养供应以及力学性能的支持，更为重要的是能调节细胞间的沟通，对细胞的基本生命活动发挥全方位的动态调节作用。ECM具有结构和功能的多样性，其结构和成分的变化将影响细胞骨架的构建，从而决定细胞的形状和活性，影响细胞的生存，参与和控制细胞的分化与迁移，在组织器官的发生、发育、再生及维持组织器官的结构和功能的生理活动中均具有极其关键的作用。细胞膜片技术这种能够保存细胞间自分泌信号分子性能的独特优势，可以减少无效移植细胞的数量，有利于组织的重建或再生。而膜片片段技术改变了传统的膜片移植模式，将完整的细胞膜片制备为一定大小的片段，一方面保存了种子细胞的活性，并且最大程度保存了ECM及细胞间自分泌信号分子的性能，另一方面使细胞能最大程度地与支架均匀混合，便于细胞迅速定植于支架表面，使二者形成的移植物成为具有良好生物功能的整体。

4.2富血小板纤维蛋白膜(PRF)的作用

富血小板纤维蛋白(PRF)是全血经一次快速离心后形成的纤维网状结构。PRF的主要特点在于富含大量比例接近生理状况的生长因子，如转化生长因子(transforming growth factorβ，TGFβ)、血小板源性生长因子(platelet-derivedgrowth factors，PDGF)、胰岛素样生长因子(insulin-like growth factors，IGF)，上述三种生长因子在最初的组织愈合中起到了重要的作用，它们可以促进细胞迁移和增殖，诱导纤维蛋白基质进行重塑，并且促进胶原基质的分泌；除此而外，PRF中还含有与创伤愈合和骨再生相关的多种生长因子，包括表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growthfactor，VEGF)等。

作为血小板浓缩物的第二代产品，与第一代产品富血小板血浆(platelet-richplasma，PRP)相比，PRF具有以下特点：

1)制备简单。PRP的制备需要添加抗凝剂，以防止血液凝固；其制备需要两次离心，需要将离心后的上清进行转移，操作繁琐，且目前尚无标准的离心速度和时间，不同学者对其制备的方法持有不同观点。PRF的制备则很简单，抽取全血后立即以3000rprm/min的速度离心10分钟，静置5分钟，即可得到PRF凝胶。

2)安全性好。PRP在制备时首先需要加入抗凝剂，其次在两次离心结束后需要添加牛凝血酶及氯化钙加以激活，才可形成凝胶状以便体内移植，而且PRP只有在激活以后才能使得其中的血小板α链脱颗粒释放生长因子；然而，添加外源性物质有可能引起宿主的免疫反应，且过多的操作步骤也增加了污染的几率。PRF的制备不需要添加任何外源性物质，且一步操作完成，安全性好。

3)生长因子缓释。PRP是通过加入较多的凝血酶进行人为激活后迅速形成凝胶状的。大量的外源性的凝血酶使得纤维蛋白迅速聚合，形成双向致密连接结构，这就使得血小板释放出来的生长因子不能被网罗其中，而是存留在纤维网状结构之外的悬液中，从而呈现出快速、大量释放的特点。而PRF是在自身凝血酶作用下产生的缓慢的聚合方式，这种渐进性的聚合方式更大程度上将外周血中游离的生长因子网罗至PRF的三维网状结构中。游离生长因子和血小板中的生长因子在这种三维结构中的分布必然会导致其缓释效应，因为它们只会在其所在纤维结构发生改建时才得以释放，而且PRF中的纤丝和纤维蛋白形成四方形的连接方式，这种弹性基质结构也更有利于细胞迁移和可溶性分子保留。

4)三维网状结构可作为支架材料。PRP中的纤维蛋白形成的是双向的致密连接结构，这种结构不利于细胞和生长因子的迁移。PRF中的纤维蛋白则形成三维网状结构，这种结构不但利于细胞和生长因子的迁移，还为组织修复相关细胞提供了增殖分化的场所，发挥了重要的支架作用。

5)含有大量的白细胞。PRF经由全血离心得到，在离心过程中，血液中绝大多数白细胞均分布于PRF下端，即红端(如图6中B图所示)；因此，在双膜结构移植至体内时，一方面浓缩的白细胞于局部发挥良好的抗炎作用，另一方面调动机体的免疫系统，发挥良好的抗炎功能和免疫调节功能；同时，PRF在制备过程中还网罗了血液中大量免疫调节因子，如IL-1β，IL-4，IL-6及TNF-α等，这些因素在组织缺损修复后防止感染、促进愈合等方面均发挥着重要作用。

4.3干细胞膜片片段复合富血小板纤维蛋白膜的双膜结构动物移植效果的分析

本发明的第一部分应用体外实验对干细胞细胞膜片与富血小板纤维蛋白膜的配比关系进行了研究，得到了二者之间最佳配比关系。第二部分，按照该配比关系制备双膜结构移植物，将其植入实验动物体内，探究双膜结构移植物对组织修复的影响。

4.3.1实验一中，富血小板纤维蛋白膜PRF颗粒作为细胞支架及生长因子供体，与骨髓间充质干细胞膜片片段进行复合，将其按照一定比例混合后置于组织缺损处，进行软骨缺损的修复。PRF膜片极具韧性，剪碎成为颗粒状后极易操作，可将其置于任何形状的组织缺损中；骨髓间充质干细胞制作成膜片形式后，由于存在细胞外基质的连接，避免了以往的悬浮细胞易流失的缺点。我们的实验结果表明，与自然恢复组、单纯的PRF以及单纯的细胞膜片组相比，双膜结构组修复软骨缺损的效果最好，在第8周时损伤区基本齐平，修复软骨层较薄、层次较清晰，与邻近正常软骨各层较连续。这就证明了我们的猜想，即：骨髓间充质干细胞在局部发挥了种子细胞的作用，在局部微环境中能够增殖分化成特定的细胞类型，而PRF膜片颗粒一方面提供了大量的胶原基质成分，为细胞提供了支架结构，另一方面其中含有的血小板随着基质成分的改建而不断被激活，释放出大量比例接近生理状况的生长因子，为干细胞的增殖和分化及组织的修复提供营养支持。

4.3.2实验二中，以PRF膜片作为细胞支架及生长因子供体，与牙髓干细胞膜片片段进行复合，将其按照一定比例混合后置于牙髓缺如的根管腔内，进行牙髓再生的研究。结果发现，双膜结构组较单纯细胞膜片及单纯PRF组再生效果好。正常对照组犬牙纵切面HE染色观察可见牙髓、成牙本质细胞、前期牙本质及成熟牙本质有序排列，牙本质经脱矿处理后呈红色的嗜伊红胶原基质染色，靠近髓腔的前期牙本质部分染色较浅，沿牙本质层排列，单层成牙本质细胞紧接前期牙本质呈高柱状排列。DPSCs/PRF双膜结构组HE染色发现，细胞呈疏松星网状复层排列，且细胞形态由远离牙本质的平行生长逐渐向靠近牙本质的垂直极性生长转变，形态类似成牙本质细胞，髓腔内见较多血管形成。单纯细胞膜片组细胞呈疏松星网状复层排列，但较双膜结构组排列疏松、无序，未表现出明显的近牙本质垂直极性生长转变的特点，且牙本质层较薄，但细胞形态伸展明显，髓腔内亦可见较多的血管形成。单纯PRF颗粒组细胞大多呈圆形，无明显伸展，排列无序，无明显垂直极性生长转变，牙本质壁薄，但髓腔内亦可见少量血管形成。上述结果说明，在牙髓再生过程中，牙髓干细胞是理想的种子细胞，将其制成细胞膜片片段的形式，一方面最大程度上保留了细胞外基质，使得细胞间相关信号分子得以完整保存，另一方面，摆脱了细胞悬液的束缚，膜片的形式更加便于操作，保证牙髓腔局部有足够量的且不易流失的种子细胞。根尖孔开放后，保证了髓腔内有足够血运，使得种子细胞有一定的营养支持，这样，即使没有PRF提供大量的生长因子和支架作用，髓腔中也有牙髓组织再生。另一方面，根尖孔开放后，血液会充满髓腔，而循环血中本身存在未分化的间充质干细胞，干细胞归巢至牙髓腔中，在PRF颗粒释放的大量的生长因子的作用和髓腔局部微环境的双重作用下，归巢的干细胞在髓腔局部得以增殖、分化，达到牙髓再生的目的，这可能也就是在单纯PRF颗粒组也能见到排列较好的再生牙髓的原因。而髓腔中缺少了PRF提供生长因子和胶原支架，即使有归巢的干细胞，也未必能形成较好的牙髓组织。而将牙髓干细胞膜片片段复合富血小板纤维蛋白膜颗粒双膜结构的移植材料置于髓腔中，即同时满足了种子细胞、三维支架以及生长因子的要求，因此可以得到较为理想的牙髓再生，这与本实验结果相符。

综上所述，实验结果证实机理分析，本发明所示的干细胞膜片片段复合富血小板纤维蛋白膜片的新型生物材料，能够显著促进组织缺损的修复及组织再生效果。本发明方法制备的生物移植材料配比合适，来源丰富，具有普遍的适用性，适用于每位患者个体。通过该方法制备的生物移植材料，可广泛用于不同类型组织缺损的修复，还具有良好的组织再生效果，为组织工程相关实验的展开和临床修复组织缺损及组织再生提供了新思路。

Claims (9)

1.一种双膜结构移植材料，其特征在于：

由干细胞细胞膜片片段和富血小板纤维蛋白膜颗粒组成；

其中，所述干细胞选自骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞、牙髓干细胞或牙周膜干细胞；

所述细胞膜片采用六孔板进行制备，其中，所述干细胞细胞膜片片段和富血小板纤维蛋白膜的比例如下：每张六孔板的细胞膜片数量∶用于离心获得富血小板纤维蛋白膜片的血液毫升数＝1∶3.5～4.0。

2.如权利要求1所述的移植材料，其特征在于：所述富血小板纤维蛋白膜片颗粒经由血液离心后获得。

3.如权利要求1所述的移植材料，其特征在于：所述干细胞和富血小板纤维蛋白均来源于同一个体。

4.如权利要求1所述的移植材料，其特征在于：干细胞必须制备成细胞膜片片段的形式。

5.一种如权利要求1所述的移植材料的制备方法，其特征在于，所述制备过程包括以下步骤：

第一步，干细胞膜片的培养：原代干细胞经扩大培养后接种于六孔板，待生长融合至80％时以膜片诱导液予以培养，3天换液一次，待细胞膜片周围出现卷曲时认为细胞膜片成熟；

第二步，制备干细胞膜片片段：用机械剥离的方法将细胞膜片从培养皿中剥离，用无菌眼科剪将其剪碎，制备成细胞膜片片段，所述细胞膜片片段的大小为0.5mm×0.5mm；

第三步，提取富血小板纤维蛋白膜片颗粒：根据所需比例，以10ml为单位，将血液置于无菌玻璃离心管或塑料套管的玻璃离心管中，所述血液不加任何抗凝剂，立即以3000rpm/min的速度离心10分钟，静置5分钟后，无菌镊钳夹取出离心管中间部分的富血小板纤维蛋白凝胶，将其底部红细胞端于无菌纱布上轻蘸以去除多余红细胞，保留完整的淡黄色凝胶部分及底部少量粘附牢固的红细胞，将后者平铺于无菌纱布之间，轻压挤出其中液体成分，制备成一淡黄色坚韧膜状结构，用无菌眼科剪将其剪碎，制备成大小为0.5mm×0.5mm×0.5mm的富血小板纤维蛋白膜片颗粒；

第四步，将制备的细胞膜片片段和富血小板纤维蛋白膜片颗粒置于无菌培养皿中，按照比例手动将其混匀，保证二者充分混合，即可得到干细胞膜片片段复合富血小板纤维蛋白膜双膜结构移植材料。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于：细胞细胞膜片片段和富血小板纤维蛋白膜的比例如下：每张六孔板细胞膜片数量∶用于离心获得富血小板纤维蛋白膜片的血液毫升数＝1∶3.5～4.0。

7.权利要求1-3任一项所述的移植材料在制备用于口腔颌面部或全身中小范围组织缺损修复材料中的应用。

8.权利要求1-3任一项所述的移植材料在制备口腔颌面部或全身中小范围组织缺损修复用移植材料中的用途。

9.权利要求1-3任一项所述的移植材料与其他生物材料组成的复合材料在制备组织缺损修复用移植材料中的用途。

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