CN103103251A - 荧光pcr毛细管电泳检测flt3-itd基因突变的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及检测FLT3(Fms-like tyrosine kinase 3)基因近膜区的序列内部串联重复(internal tandem duplications，ITD)突变的试剂盒，特别是涉及以荧光PCR毛细管电泳技术检测临床样品中FLT3-ITD的试剂盒。本试剂盒主要包括PCR扩增反应液、阴性质控品、阳性质控品并加盖密封的多个试剂瓶或管，以及分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒、以电泳法确定扩增片段的大小和基因剂量。本试剂盒对全血或骨髓样品中的FLT3-ITD的检测和分析具有很高的灵敏度和特异性，可广泛应用于白血病判断预后，指导治疗和预测疾病复发等多个领域。
Description
技术领域
本发明涉及检测FLT3(Fms-like tyrosine kinase 3)基因近膜区的序列内部串联重复(internal tandem duplications，ITD)突变的试剂盒，特别是涉及以荧光PCR毛细管电泳技术检测临床样品中FLT3-ITD的试剂盒。由于本试剂盒对全血或骨髓样品中的FLT3-ITD的检测和分析具有很高的灵敏度和特异性，可广泛应用于白血病判断预后，指导治疗和预测疾病复发等多个领域。
背景技术
FLT3(Fms-like tyrosine kinase 3)是III型受体酪氨酸激酶家族中的一员，其突变与白血病的发生密切相关。FLT3与其配体(FL)在造血干/祖细胞的增殖和分化中起重要的调节作用。FL与FLT3的细胞外结构域结合介导一系列细胞内信号传导途径，调节细胞增殖和活化。当FLT3发生基因突变时，可导致FLT3非配体依赖性磷酸化，破坏正常血细胞的增殖、分化与凋亡。FLT3突变有两种形式：一种为发生在FLT3基因近膜区的序列内部串联重复(internaltandem duplications，ITD)，称为FLT3-ITD突变，ITD的大小和位置都存在多态性，典型的ITD位于第14外显子，也可累及第14内含子和第15外显子；一种为发生在酪氨酸激酶结构区域的点突变，称为FLT3-TKD突变。目前有关于FLT3-ITD突变的研究表明FLT3-ITD突变最常出现在急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia，AML)患者中，突变发生率为15％～35％，其次为骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndromes，MDS)，突变发生率约为2％～5％。FLT3-ITD在急性淋巴细胞白血病(ALL)患者中发生率极低(低于1％)，而在慢性髓性白血病(CML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、多发性骨髓瘤、成人体细胞白血病中尚未发现FLT3-ITD突变。
AML是一组起源于造血干细胞的恶性血液病，具有高度异质性。在影响AML预后危险度的众多因素中，细胞遗传学已被认为是最重要的独立预后因素，一些特异性染色体核型异常，不仅成为AML诊断中的重要标志物，并常被认为是判断预后的标志。但是大约40％～50％的AML患者未检测到染色体核型异常，这些患者预后变异较大，5年生存率24％～42％。所以寻找核型正常AML患者的预后分子标志成为人们关注的焦点。随着分子遗传学检测方法的应用，学者们发现正常核型的AML患者在分子学水平上是存在异质性的，包括基因突变或某些特定基因的表达异常，为AML患者的进一步预后分级及分子靶向治疗提供了依据FLT3基因突变是已发现的影响AML患者预后的分子标志之一，可作为AML患者预后不良的独立指标。FLT3-ITD突变是AML患者中最常见的一种突变类型，约15％～35％AML病例存在FLT3-ITD突变，另外还有约7％的AML病例存在FLT3-TKD突变。但是目前大部分研究认为FLT3-TKD突变与AML预后无关，而FLT3-ITD突变与AML发病和发展密切相关，是一个重要的独立预后因素。FLT3-ITD阳性患者具有较独特的临床特征，目前针对于此突变的靶向治疗也已经进入不同的临床试验阶段。而且，不同ITD患者的预后也存在差别，这与ITD-AR(internal tandem allelic ratio，内部串联重复等位基因比例)值有关，即ITD：WT(FLT3野生型基因)比值，ITD-AR值增加可能导致预后不良，因此ITD-AR值也是AML患者的很强的独立预后因素。
MDS患者FLT3-ITD突变相比于没有突变的患者，FLT3-ITD阳性患者转为AML的概率有增高趋势，进展为AML的时间有缩短趋势，且总体生存期缩短，MDS转为AML后，FLT3-ITD阳性率增高，因此FLT3-ITD是MDS转化为AML的高危因素，为预后不良因素。
综上，FLT3-ITD可作为AML和MDS患者预后不良的独立指标，对FLT3-ITD基因突变进行检测可以帮助判断预后，用于指导治疗、判断疗效和疾病复发，对增加患者的长期生存率和生存质量有着非常重要的意义。
FLT3-ITD基因突变检测试剂盒(荧光PCR毛细管电泳法)提供一种快速检测FLT3-ITD基因突变的方法。本方法根据PCR引物设计原理，分别在FLT3-ITD发生的14外显子和15外显子的两端设计上下游引物，对于发生FLT3-ITD基因突变的DNA标本，将会出现大于正常片段的扩增产物。本方法通过毛细管电泳方法检测PCR产物的长度来确定是否存在FLT3-ITD基因突变，并可以通过软件分析计算ITD-AR值，以期为AML和MDS的临床诊断、预后判断及分子靶向治疗提供理论依据。相比普通的琼脂糖凝胶电泳，该方法更加灵敏，且能准确判断突变条带的片段大小及基因剂量。
发明内容
本发明的目的是提供一种使用荧光PCR毛细管电泳技术检测白血病临床样品中FLT3-ITD基因突变的试剂盒。该试剂盒通过提取患者血液或骨髓的DNA，使用PCR方法扩增FLT3的ITD区域，然后使用荧光PCR毛细管电泳技术对ITD片段大小及剂量进行检测。
为了实现本发明，我们采用了以下技术方案：
(1)使用适当的核酸分析软件对已知的FLT3基因核苷酸序列进行同源性比较并找出同源区段的基础上，进一步使用适当的引物设计软件(例如Primer 3)选择并设计寡核苷酸引物。由于所设计的引物在FLT3-ITD发生的14外显子和15外显子的两端，而且与其他基因表达mRNA的核苷酸序列没有同源性，也不包括任何常见的核酸内切酶，所以避免了FLT3-ITD检测的假阴性和假阳性，提高了检测的可靠性和准确度；
(2)使用DNA合成装置合成所需的寡核苷酸引物，用分子筛和快速蛋白质液相层析法(FPLC)纯化后进行氨解处理。同样合成所需的引物序列，氨解处理后分别在其5’端标记作为荧光发生基团(报告基团)的6-FAM amidite。以FPLC层析法纯化荧光标记的引物。然后，可使用变性条件下的聚丙烯酰胺凝胶(20％)电泳法和分光光度法物理鉴定所合成的引物和探针；
(3)从得自受试者的外周血或者骨髓中提取DNA，然后使用PCR反应体系将其扩增；
(4)提供包括(a)待检样品，(b)耐热DNA聚合酶和(c)2-脱氧核苷三磷酸(dNTPs)的扩增反应体系，以及包括(d)能够与待检双链靶多核苷酸的第一条互补链结合的正向引物，(e)能够与待检双链靶多核苷酸的第二条互补链结合的反向引物。通过一次或多次聚合酶链反应扩增所说的靶多核苷酸；通过荧光PCR毛细管电泳技术以检测靶多核苷酸的片段长度。
本发明所提供的荧光PCR毛细管电泳技术检测临床样品中FLT3-ITD的试剂盒包括：(1)PCR扩增反应液、阴性质控品、阳性质控品并加盖密封的多个试剂瓶或管，和(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，(3)以电泳法确定扩增片段的大小和基因剂量。
本发明的一个优选实施方案，其中PCR扩增反应液包括5’端结合有荧光发生基团的正向引物、反向引物、dNTPs、耐热DNA聚合酶、PCR缓冲液和水，特征在于所使用的引物序列分别为：5’-FAM-TCTCCTCTTCATTGTCGTTTTA -3’(SEQ ID NO：1)、5′-ATGGTGAGTACGTGCATTTTA-3′(SEQ ID NO：2)，其中SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2匹配在一起可以检测FLT3-ITD。
本发明的另一个优选实施方案，PCR扩增反应液中还可以使用的引物序列分别为：5’-FAM-TTCATTATTCTTTCCTCTATCTGC-3’(SEQ ID NO：3)、5′-TGTTGCGTTCATCACTTTTC-3′(SEQ ID NO：4)，其中SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4匹配在一起可以检测FLT3-ITD。
本发明的另一个优选实施方案，PCR扩增反应液中还可以使用的引物序列分别为：5’-FAM-AACTGCCTATTCCTAACTGACTC-3’(SEQ ID NO：5)，5’-TCCATAAGCTGTTGCGTTC-3’(SEQ ID NO：6)，其中SEQ ID NO：：5，SEQ ID NO：6匹配在一起可以检测FLT3-ITD。
本发明的另一个优选实施方案，PCR扩增反应液中还可以使用的引物序列分别为：5’-FAM-GCCAGCTACAGATGGTACAGG-3’(SEQ ID NO：7)，5’-AGCATTTTGACGGCAACC-3’(SEQID NO：8)，其中SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8匹配在一起可以检测FLT3-ITD。
本发明的一个优选实施方案，其中PCR扩增反应液，特征在于每25微升的PCR缓冲液中加入2单位Taq酶，缓冲液包含10mM Tris-HCl(pH8.0)、150mM KCl、3mM MgCl2。
本发明的另一个优选实施方案，其中PCR扩增反应体系由PCR缓冲液、耐热DNA聚合酶、dNTPs，引物所组成，其特征在于引物的序列组合为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，或SEQID NO：3和SEQ ID NO：4，或SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6，或SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8。
本发明的一个优选实施方案，其中阴性质控品为去离子水，阳性质控品为携带有FLT3-ITD序列的重组质粒，质粒由上下游引物扩增的PCR产物通过市售的载体克隆构建而成，所使用的上下游引物的序列组合可以是SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：：2，或SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：：4，或SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6，或SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8。
本发明的一个优选实施方案，根据复合扩增产物片段大小来分析样本中FLT3正常基因和FLT3-ITD和剂量变化，任何可以分离核酸片段大小的方法例如过滤，高效液相色谱，电泳，亲和收集等方法均可用于本发明，其中通过凝胶电泳的方法进行分离并定量，优选使用毛细管电泳法分离FLT3正常基因和FLT3-ITD。
本发明的一个优选实施方案，可以根据引物扩增产物的累计荧光值定量FLT3正常基因和FLT3-ITD的相对量，并通过计算FLT3正常基因和FLT3-ITD相对剂量来分析ITD-AR值。
本发明的一个优选实施方案，其中试剂盒的待检样品可选自但不局限于白血病患者的临床样品。
本发明的一个优选实施方案，其中试剂盒的靶多核苷酸来自FLT3基因。
本发明的一个优选实施方案，其中试剂盒的核酸扩增系统是采用聚合酶链反应，并且所说的扩增反应循环是重复30-50次的聚合酶链反应循环。
特别值得说明的是，为了确保本发明的FLT3-ITD检测方法的准确性，我们还使用携带有FLT3-ITD序列的重组质粒作为阳性质控品。借助这些阳性质控品，使用本发明的试剂盒在相同条件下进行平行检测，以进一步验证本发明试剂盒的检测精密度和准确性，并作为生产本发明试剂盒附加的质量控制标准。
本技术与现有技术相比，优点为：①反应灵敏高，DNA浓度为10ng/μl时即可检出②结合毛细管电泳能对基因进行精确定量③能对突变型基因与野生型基因比例进行分析统计④在大量野生型基因存在下，亦能检测出低频突变型基因。
附图说明
图1显示一个正常男性样本多重扩增产物电泳图。图中片段大小约为330bp的蓝色条带为一个正常男性样本的扩增产物。
图2显示一个正常女性样本多重扩增产物电泳图。图中片段大小约为330bp的蓝色条带为一个正常女性样本的扩增产物。
图3显示一个男性AML患者的FLT3-ITD样本扩增产物电泳图。图中片段大小约为330bp和360bp的两条蓝色条带，显示一个男性AML患者的FLT3-ITD样本扩增产物。
图4显示一个女性AML患者的FLT3-ITD样本扩增产物电泳图。图中片段大小约为330bp和360bp的两条蓝色条带，显示一个女性AML患者的FLT3-ITD样本扩增产物。
图5显示一个MDS患者样本的FLT3-ITD的扩增产物的电泳图。图中片段大小约为330bp和360bp的两条蓝色条带，显示一个MDS患者样本的FLT3-ITD的扩增产物的电泳图。
具体实施方式
下列实施例旨在举例说明而不是限制本发明。
实施例1：检测试剂盒及其使用
1、制备包括下列组成成分的试剂盒：ITD PCR反应液A(内含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：：2)(500μl/管)、ITD PCR反应液B(75μl/管)、ITD阳性质控品(50μl/管)、阴性质控品(50μl/管)。
2、标本采集、运送和保存：
(1)标本采集：标本为外周血或骨髓。抽取受检者静脉血或骨髓3-5ml，注入含EDTA(乙二胺四乙酸二钠)或枸橼酸钠抗凝剂的玻璃管，立即轻轻颠倒玻璃管混合5～10次，使抗凝剂与静脉血充分混匀。
(2)保存：可立即检测，4℃保存一周，-20℃保存期可达一年。
(3)运输：标本运送应采用0℃冰壶。
3、检测步骤和结果分析：
DNA提取建议使用Qiagen DNA提取试剂盒。
(1)取200μl外周血或骨髓至1.5ml离心管。
(2)加入20μl的蛋白酶。
(3)加入200μl的Buffer AL，振荡15秒。
(4)56℃温育10分钟。
(5)加入200μl乙醇，振荡15秒。
(6)将混合液吸入QIAamp Mini spin column，6000g离心1分钟。
(7)将内柱放入一个新的套管中，加入500μl的Buffer AW1，6000g离心1分钟。
(8)将内柱放入一个新的套管中，加入500μl的Buffer AW2，6000g离心1分钟。
(9)将内柱放入一个新的1.5ml离心管中，最大离心速度离心1分钟。
(10)加入200μl的Buffer AE，室温静置1分钟，6000g离心1分钟。
(11)得到200μl DNA溶液
QF-PCR操作步骤：
1、对于每一个PCR反应体系，混合以下成分到总体积为25ul。设置阴阳性对照。
2、PCR反应条件：95℃预变性15分钟，然后94℃30秒，62℃30秒，72℃30秒，共30个循环；最后72℃5分钟。
扩增产物电泳
对于每一个分析，1ul PCR产物和13.5ul Hi-DiTM formamide、0.5ul GeneScan ROX-500Sizestandard混合。95℃加热变性混合物5分钟。放置冰上至少1分钟。瞬时离心混合物。上样ABI310/ABI3100遗传分析仪，然后应用软件进行结果分析。结果图谱如图1，图2，图3，图4，图5所示。其中图1，图2为正常男性和正常女性的结果分析图谱。
实施例2：通过QF-PCR扩增FLT3位点检测AML患者的FLT3-ITD
来自AML患者的血液或骨髓样本，按照Qiagen DNA提取试剂盒的标准程序进行DNA提取纯化。应用试剂盒中提供的ITD PCR反应液A、ITD PCR反应液B按照试剂盒检测规程进行扩增反应并上样分析。上样结果的分析图谱如图3，图4。如图所示，FLT3基因上野生型和ITD位点。在FLT3基因产生ITD突变，会出现大于野生型片段的扩增条带。因而可以快速检测FLT3-ITD。
实施例3：通过QF-PCR扩增FLT3位点检测MDS患者的FLT3-ITD
来自MDS患者的血液或骨髓样本，按照Qiagen DNA提取试剂盒的标准程序进行DNA提取纯化。应用试剂盒中提供的ITD PCR反应液A、ITD PCR反应液B按照试剂盒检测规程进行扩增反应并上样分析。上样结果的分析图谱如图5。如图所示，FLT3基因上野生型和ITD位点。在FLT3基因产生ITD突变，会出现大于野生型片段的扩增条带。因而可以快速检测FLT3-ITD。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种检测样品中FLT3-ITD的试剂盒，试剂盒包括：(1)PCR扩增反应液、阴性质控品、阳性质控品并加盖密封的多个试剂瓶或管，和(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，其中PCR扩增反应液包括5’端结合有荧光发生基团的正向引物、反向引物、dNTPs、耐热DNA聚合酶、PCR缓冲液和水，(3)以电泳法确定扩增片段的大小和基因剂量，其特征在于所使用的正反向引物的序列可以为：
5’-FAM-TCTCCTCTTCATTGTCGTTTTA-3’、5′-ATGGTGAGTACGTGCATTTTA-3′；
5’-FAM-TTCATTATTCTTTCCTCTATCTGC-3’、5′-TGTTGCGTTCATCACTTTTC-3′；
5’-FAM-AACTGCCTATTCCTAACTGACTC-3’、5’-TCCATAAGCTGTTGCGTTC-3’；
5’-FAM-GCCAGCTACAGATGGTACAGG-3’、5’-AGCATTTTGACGGCAACC-3’。
2.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于PCR缓冲液包含10mM Tris-HCl(pH8.0)、150mMKCl、3mM MgCl2，每25微升的PCR缓冲液中加入2单位Taq酶。
3.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于PCR扩增反应体系由PCR缓冲液、耐热DNA聚合酶、dNTPs，引物所组成，其特征在于引物的序列组合为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4，或SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6，或SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8。
4.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于阳性质控品为携带有FLT3-ITD序列的重组质粒，质粒由上下游引物扩增的PCR产物通过市售的载体克隆构建而成，所使用的上下游引物的序列组合可以是SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4，或SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6，或SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8。
5.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于试剂盒的核酸扩增系统是采用聚合酶链反应，并且所说的扩增反应循环是重复30-50次的聚合酶链反应循环。
6.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于所检测样品为全血或骨髓等白血病临床样品。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20130515 |