CN103149111A - 一种基于嗅觉受体传感器检测气味物质丁二酮的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于嗅觉受体传感器检测气味物质丁二酮的方法，首先在HEK-293细胞表面表达了带有His₆-tag标签的嗅觉受体蛋白ODR-10，并提取出来将其利用适配体有效地固定在石英晶体微天平表面构建成嗅觉受体传感器；通过测试一系列确定浓度气味物质丁二酮，得到丁二酮浓度-谐振频率改变量标准曲线；然后测试未知浓度待测气体，根据石英晶体微天平谐振频率的改变量和丁二酮浓度-谐振频率改变量标准曲线得到待测气体中气味物质丁二酮的浓度。本发明方法所需仪器简单、操作方便，解决了敏感元件嗅觉受体蛋白ODR-10与石英晶体微天平的稳定耦合，实现了快速、特异地检测气味物质丁二酮。

Description

一种基于嗅觉受体传感器检测气味物质丁二酮的方法

技术领域

本发明涉及一种检测技术，尤其涉及一种基于嗅觉受体传感器检测气味物质丁二酮的方法。

背景技术

生物嗅觉系统能够快速、灵敏地感受并分辨出空气中的气味物质，这得益于嗅觉受体能够与空气中气味分子特异性地结合。传统气体传感器设计中，敏感材料多采用导电聚合物、高分子材料等，缺点是特异性差。气味分子种类繁多，多是结构各异的小分子量挥发性有机气体，尤其当检测环境中的空气中含有多种气味时，特异性地检测某种气味变得相对困难。新兴的生物传感器拟从仿生的角度解决这一问题，模仿生物嗅觉系统利用嗅觉受体对气味分子的特异性识别，为特异性检测气体提供了新的技术途径。因此，如何获得高度特异的气体敏感材料，并将其与二级传感器的有效稳定耦合，实现气味分子的特异性检测是目前气体传感器进一步发展亟需解决的难题。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种利用嗅觉受体蛋白作为敏感材料结合石英晶体微天平构建嗅觉受体传感器进行气体特异性检测的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的： 一种基于嗅觉受体传感器检测气味物质丁二酮的方法，该方法包括以下步骤：

（1）制备嗅觉受体蛋白ODR-10；

（2）固定嗅觉受体蛋白ODR-10在石英晶体微天平表面构建嗅觉受体传感器；

（3）将洁净空气以1mL/s的流速泵入检测腔内，待石英晶体微天平传感器的谐振频率达到一个稳定的状态后，再将浓度确定的含有气味物质丁二酮的待测气体泵入检测腔，待石英晶体微天平传感器的谐振频率再次稳定后，谐振频率的改变量即为嗅觉受体传感器对此浓度下的气体物质丁二酮的响应值；最后再将洁净空气泵入检测腔内，清洗检测腔，即完成一次检测过程；至少间隔10min后，待石英晶体微天平传感器的谐振频率稳定后可泵入另一浓度待测气体到检测腔进行下一次检测；重复上述步骤，得到一系列浓度的气体物质丁二酮引起的传感器谐振频率改变量，得到丁二酮浓度-谐振频率改变量曲线；

（4）对于未知浓度的气体物质丁二酮的检测，首先将洁净空气以1mL/s的流速泵入检测腔内，待石英晶体微天平传感器的谐振频率达到一个稳定的状态F₀后，再将浓度未知的待测气体泵入检测腔，待石英晶体微天平传感器的谐振频率再次稳定到F₁后，得到谐振频率改变量F₁- F₀，根据上述步骤得到的丁二酮浓度-谐振频率改变量曲线推算出待测气体物质丁二酮的浓度，实现对丁二酮的浓度测定。

进一步地，所述步骤（1）包括以下子步骤：

（1.1）构建表达载体：首先采用基因工程技术对含有嗅觉受体蛋白ODR-10基因和rho-tag信号肽序列全长cDNA的质粒PEGFP-N1/rho-tag/odr-10（其基因序列如SEQ ID NO.1所示）进行适当改造，构建适用于嗅觉受体传感器使用的嗅觉受体蛋白的表达载体，使其N末端带有融合表达的His₆-tag标签；首先，设计相应的引物，获取和扩增嗅觉受体蛋白ODR-10基因和rho-tag信号肽序列全长cDNA，并在N末端添加融合表达的His₆-tag标签，上游引物序列SEQ ID NO.2；下游引物序列如SEQ ID NO.3所示；聚合酶链式反应（PCR）在50μL反应体系中进行，包括1μL PEGFP-N1/rho-tag/odr-10质粒，1μL上游引物，1μL下游引物，4μL浓度为10mM的dNTP混合物，0.5μL高保真聚合酶STAR^TM（Takara， 日本）， 10μL PCR缓冲液（含Mg²⁺）和32.5μL去离子水，温度循环首先是95℃预变性3分钟，接着进行30循环的94℃ 变性30秒、60℃退火30秒、72℃延伸70秒，最后是10℃降温10秒。扩增后获得的产物his₆-tag/rho-tag/odr-10通过限制性内切酶的双酶切反应亚克隆到表达载体pcDNA3.1(+)的多克隆位点Kpn I和BamH I之间，完成嗅觉受体蛋白的表达载体pcDNA3.1(+)/his₆-tag/rho-tag/odr-10的构建，其基因序列如SEQ ID NO.4通过测序进行鉴定；

（1.2） 转染人胚胎肾细胞HEK-293：HEK-293细胞培养液为添加了体积百分比为10％的胎牛血清、青霉素（100 U/mL）和链霉素（100 μg/mL）的DMEM高糖培养基，培养条件为37℃、体积百分比为5% CO₂的培养箱。转染之前一天，HEK-293细胞被接种于六孔培养皿中，每孔接种500 μL 浓度为0.5～2×10⁵ cells/mL的细胞，在不含抗生素的DMEM高糖培养基里生长至融合度约为80-90%，待转染；转染试剂为lipofectamin 2000，使用步骤1.1构建好的表达载体pcDNA3.1(+)/his₆-tag/rho-tag/odr-10转染HEK-293细胞；用无血清DMEM培养液把4 μg表达载体稀释至50 μL，混匀；再用无血清DMEM培养液稀释10 μL 的脂质体转染试剂lipfectamin 2000至50 μL，在室温下孵育5 分钟；接着把稀释后的表达载体和lipfectamin 2000混合至总体积为100 μL，摇匀，室温孵育20 分钟；六孔板的每个孔中加入100 μL表达载体和lipfectamin 2000的混合液，前后摇板混匀后，在37℃、体积百分比为5% CO₂的培养箱孵育24-48小时后，嗅觉受体蛋白即表达在HEK-293细胞膜表面，以备用作嗅觉受体传感器的敏感材料；

（1.3）提取嗅觉受体蛋白ODR-10：为将步骤1.2中制备的嗅觉受体蛋白ODR-10用作嗅觉受体传感器的敏感材料，使用膜蛋白提取试剂盒从转染后的HEK-293细胞中提取嗅觉受体蛋白ODR-10；先收集转染48小时的HEK-293细胞，用4℃的去离子水离心洗3次，每次5分钟；然后加入1mL蛋白提取缓冲液、1μL 蛋白酶抑制剂、1μL DDT，超声破碎4次，然后4℃14000g离心10分钟，弃沉淀，上清液转至一新的离心管中水浴10分钟，室温下13000离心5分钟，样品分为上下两层，下层含有细胞膜蛋白；取下层样品，加入500μL 4℃灭菌水，4℃放置5分钟，然后37℃水浴10分钟，室温下13000离心5分钟，样品分为上下两层，重复此步骤5次；最终得到的下层样品即为膜蛋白混合物，其中包含带有融合His₆-tag标签的嗅觉受体蛋白ODR-10；-70℃保存待用。

所述步骤（2）具体为：本发明的嗅觉受体传感器制备过程如下：将石英晶体微天平置于乙醇中浸泡10分钟，氮气干燥；然后1M NaOH水溶液中浸泡20分钟，去离子水清洗；1M HCl溶液中浸泡5分钟；新配置的浓H₂SO₄与H₂O₂（体积比2:3）混合液浸泡1分钟，氮气干燥，以完成石英晶体微天平的彻底清洁；利用金巯键自组装反应在石英晶体微天平的金电极上共价固定一层可以特异性识别融合表达的His₆-tag标签的巯基化单链DNA适配体，该适配体由5’末端共价修饰了HS-(CH₂)₆基团的SEQ ID NO.5所示的基因序列组成，室温下反应21 小时；然后封闭分子（11-MUA）封闭石英晶体微天平传感器的金电极表面未反应的位点，封闭条件为室温下1 小时；把步骤1.5制备的含有嗅觉受体蛋白的细胞膜蛋白混合液均匀孵育在石英晶体微天平传感器的金电极表面，并放在室温孵育过夜，使嗅觉受体蛋白通过融合表达的His₆-tag标签与适配体发生特异性的结合反应，实现嗅觉受体蛋白在石英晶体微天平传感器的金电极表面特异性固定和纯化；细胞膜的磷脂双分子层有利于保持嗅觉受体蛋白ODR-10的天然构象；N₂吹干后将表面固定有嗅觉受体蛋白的石英晶体微天平安装在检测系统中，完成嗅觉受体传感器的构建，以用于气味物质的检测。

本发明的有益效果，本发明采用现代分子克隆技术，制备出能特异性结合气味分子丁二酮的嗅觉受体蛋白ODR-10，用作气体传感器的敏感材料，克服了传统的气体检测中敏感材料特异差、灵敏度低的缺点。采用适配体自组装固定技术实现嗅觉受体在二级传感器表面的有效耦合固定，不仅可以提高传感器的稳定性，而且适配体特异有效结合嗅觉受体蛋白的能力实现嗅觉受体蛋白在传感器芯片上的一步纯化，其它无关膜蛋白由于缺乏与适配体的亲和力不能被固定在传感器表面，进而提高了嗅觉受体蛋白在传感器表面的固定效率和分布密度，克服了传统敏感材料不能有效与二级传感器耦合的问题，最终有助于提高传感器的灵敏度、特异性和稳定性。该检测方法采用有效固定了嗅觉受体蛋白的石英晶体微天平作为嗅觉受体传感器，可以实现对气味分子丁二酮的实时、快速、特异性检测，克服了传统检测技术流程复杂、特异性低、敏感性差、无法实现现场检测的缺点，适用于复杂气体环境中气体的实时特异性监测。该嗅觉受体作为敏感材料特异性检测气体的这些优点和功能可以满足复杂气体环境中气味分子的特异性实时快速检测，可广泛用于生物医学、环境保护和食品行业等相关领域。

附图说明

图1是本发明制备嗅觉受体蛋白ODR-10的基因结构图；

图2是本发明将固定嗅觉受体蛋白ODR-10在石英晶体微天平上的示意图；

图3是本发明嗅觉受体传感器检测系统结构图；

图4是本发明制备嗅觉受体蛋白ODR-10的RT-PCR结果图；

图5是本发明制备嗅觉受体蛋白ODR-10的Western blot结果图；

图6是本发明嗅觉受体传感器检测几种气味物质的结果图；

图7是本发明嗅觉受体传感器检测不同浓度丁二酮的结果图；

图中，融合表达的His₆-tag基因1、rho-tag信号肽基因2、嗅觉受体蛋白ODR-10基因3、脂质双分子层4、嗅觉受体蛋白5、融合表达的His₆-tag标签6、封闭分子7、适配体8、金电极9、石英晶体10、第一气阀11、注射泵12、废气气袋13、气体管路14、检测腔的盖子15、检测腔体16、橡胶密封圈17，石英晶体微天平18、信号输出电极19、QCM200检测系统20、洁净空气气袋21、待测气体气袋22、第二气阀23。

具体实施方式

下面详细介绍以嗅觉受体蛋白ODR-10作为敏感元件结合石英晶体微天平传感器制备嗅觉受体传感器检测气体的基本原理以及具体步骤。

本发明基于嗅觉受体传感器检测气味物质丁二酮的方法，包括以下步骤：

1、制备嗅觉受体蛋白ODR-10

1.1表达载体的构建

首先采用基因工程技术对含有嗅觉受体蛋白ODR-10基因3和rho-tag信号肽2序列全长cDNA的质粒PEGFP-N1/rho-tag/odr-10（其基因序列如SEQ ID NO.1所示）进行适当改造，构建适用于嗅觉受体传感器使用的嗅觉受体蛋白5的表达载体，使其N末端带有融合表达的His₆-tag标签6；首先，设计相应的引物，获取和扩增嗅觉受体蛋白ODR-10基因3和rho-tag信号肽2序列全长cDNA，并在N末端添加融合表达的His₆-tag标签，上游引物序列SEQ ID NO.2：5’-AGAGGTACCGATGCACCACCACCACCACCACATGAACGGGACCGAGGGCCCAA-3’，其中下划线部分为Kpn I酶切位点，虚线部分为融合表达的His₆-tag基因1序列，以便使后续表达的嗅觉受体蛋白5的N末端含有融合表达的His₆-tag标签6，有助于嗅觉受体蛋白5在传感器表面的有效固定；下游引物序列如SEQ ID NO.3所示：5’- cgcggatcctcacgtcggaacttgagacaaat-3’，其中下划线部分为BamH I酶切位点；聚合酶链式反应（PCR）在50μL反应体系中进行，包括1μL PEGFP-N1/rho-tag/odr-10质粒，1μL上游引物，1μL下游引物，4μL浓度为10mM的dNTP混合物，0.5μL高保真聚合酶STAR^TM， 10μL 的PCR缓冲液（含Mg²⁺）和32.5μL去离子水，温度循环首先是95℃预变性3分钟，接着进行30循环的94℃ 变性30秒、60℃退火30秒、72℃延伸70秒，最后是10℃降温10秒。扩增后获得的产物his₆-tag/rho-tag/odr-10通过限制性内切酶的双酶切反应亚克隆到表达载体pcDNA3.1(+)的多克隆位点Kpn I和BamH I之间，完成嗅觉受体蛋白5的表达载体pcDNA3.1(+)/his₆-tag/rho-tag/odr-10的构建，其基因序列如SEQ ID NO.4通过测序进行鉴定。

1.2 转染人胚胎肾细胞HEK-293

HEK-293细胞培养液为添加了体积百分比为10％的胎牛血清、青霉素（100 U/mL）和链霉素（100 μg/mL）的DMEM高糖培养基，培养条件为37℃、体积百分比为5% CO₂的培养箱。转染之前一天，HEK-293细胞被接种于六孔培养皿中，每孔接种500 μL 浓度为0.5～2×10⁵ cells/mL的细胞，在不含抗生素的DMEM高糖培养基里生长至融合度约为80-90%，待转染；转染试剂为lipofectamin 2000，使用步骤1.1构建好的表达载体pcDNA3.1(+)/his₆-tag/rho-tag/odr-10转染HEK-293细胞；用无血清DMEM培养液把4 μg表达载体稀释至50 μL，混匀；再用无血清DMEM培养液稀释10 μL 的脂质体转染试剂lipfectamin 2000至50 μL，在室温下孵育5 分钟；接着把稀释后的表达载体和lipfectamin 2000混合至总体积为100 μL，摇匀，室温孵育20 分钟；六孔板的每个孔中加入100 μL表达载体和lipfectamin 2000的混合液，前后摇板混匀后，在37℃、体积百分比为5% CO₂的培养箱孵育24-48小时后，嗅觉受体蛋白5即表达在HEK-293细胞膜表面，以用备作嗅觉受体传感器的敏感材料。

1.3逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）

采用RT-PCR的方法检测嗅觉受体蛋白5在细胞内mRNA水平的表达水平以验证其成功表达制备；HEK-293细胞在转染48 小时后，按Trizol一步法提取细胞的总RNA；先取出六孔板细胞至灭好菌的超净工作台，吸弃培养基，用磷酸盐缓冲液（PBS， pH7.4）轻轻地洗一遍；然后向每孔加入0.5 mL Trizol试剂，用移液器吹打细胞使之脱落、裂解；再将上述Trizol裂解后细胞液转入1.5 mL EP管中，在室温（15℃～30℃）下放置5分钟；向上述EP管中按照每1 mL Trizol加0.2 mL氯仿的比例加入氯仿，盖上盖子，在手中用力震荡15 秒，室温下（15℃～30℃）放置2～3分钟后，12000 g（2℃～8℃）离心18 分钟；从离心机中取出EP管后样品分为三层，底层的黄色有机相、中间层和上层的水相；将上层水相取出至一新的1.5 mL EP管中，按照每1 mL Trizol加0.5 mL异丙醇的比例加入异丙醇，在室温下（15℃～30℃）放置10 分钟，12000 g （2℃～8℃）离心10分钟，然后弃去上清液；再按照每1 mL Trizol加1 mL 75%乙醇的比例进行涡旋混合洗涤，之后7500 g（2℃～8℃）离心5 分钟，弃去上清液；沉淀物即为细胞的总RNA，使之室温下自然干燥；用不含RNA酶的去离子水溶解RNA沉淀，置于-70℃冰箱保存待用；然后取5 μL RNA溶液，通过检测260 nm及280 nm波长下紫外吸光度，估算其纯度，并计算核酸含量（RNA在260 nm波长下吸光度为1时，浓度相当于40 μg/mL）。

将RNA溶液稀释至浓度为0.2 μg/μL，然后从中取5 μL至PCR小管，再加入1 μL随机六聚引物、1 μL浓度均为10 mM的dNTP混合物、3 μL不含RNA酶的去离子水混匀，短暂离心数秒，在PCR仪上70℃反应5分钟进行变性；于冰浴下冷却退火；再依次加入4 μL 5倍浓度PrimerScript®缓冲液、0.5 μL 浓度为40 U/μL 的RNA酶抑制剂、1μL浓度为200 U/μL的PrimeScript^®RTase和4.5 μL 不含RNA酶的去离子水，混匀为20μL的逆转录反应液；于PCR仪上进行逆转录反应，反应条件为：30℃反应10 分钟、42°C反应45 分钟、95℃反应5 分钟；停止反应后，取出逆转录反应产物立即置于冰上；产物放在-20℃保存。

之后以上述获得的逆转录产物作为模板进行PCR扩增，上游引物基因序列如SEQ ID NO.2：5’-AGAGGTACCGATGCACCACCACCACCACCACATGAACGGGACCGAGGGCCCAA-3’；下游引物基因序列如SEQ ID NO.3所示： 5’-cgcggatcctcacgtcggaacttgagacaaat-3’；冰浴下，1μL逆转录合成的cDNA模板、1μL上游引物、1μL下游引物、4μL浓度为10mM的dNTP混合物、0.5μL高保真聚合酶STAR^TM、10μL PCR缓冲液（含Mg²⁺）和32.5μL去离子水混合为总量为50 μL的反应体系，95℃预变性3分钟，接着进行30循环的94℃ 变性30秒、60℃退火30秒、72℃延伸70秒，最后是10℃降温10秒；PCR产物电泳后通过紫外成像系统观察电泳条带确定嗅觉受体蛋白ODR-10基因3在细胞内mRNA水平的表达。

1.4 Western blot鉴定

采用Western blot技术从蛋白水平鉴定嗅觉受体5在HEK-293细胞内的表达情况；首先在RIPA强裂解液加入PMSF，使PMSF终浓度为1mM待用；取出转染后48小时的HEK-293细胞至超净工作台，吸弃培养基，磷酸盐缓冲液洗一次，弃掉废液，置于冰上；向六孔板的每个孔中加入200μL裂解液，反复吹打细胞，使裂解液与细胞充分接触30分钟；细胞充分裂解后，14000g离心5分钟，取上清至离心管中即获得嗅觉受体蛋白样品；取50μL样品至1.5mL的EP管中，加入12.5μL 5倍loading缓冲液混匀，100℃煮沸10分钟，12000g室温离心1分钟，上清液加入蛋白SDS-PAGE凝胶，120V电压下进行蛋白电泳；然后转至PVDF膜，浸于质量百分比为2.5%的牛血清白蛋白溶液中，室温摇床孵育1小时，完成封闭；然后用TBST溶液洗3遍，每次10分钟，加入一抗（抗His₆-tag鼠IgG），4℃孵育过夜；取出PVDF膜用TBST溶液洗3遍，每次10分钟，加入1：500的二抗（DyLight680标记山羊抗小鼠IgG）室温避光摇床孵育1小时；置于Odyssey双色红外激光成像系统下扫描分析；预计目标蛋白大小为45kD；通过Western blot蛋白电泳条带的位置鉴定嗅觉受体蛋白5是否在HEK-293细胞内成功表达。

1.5提取嗅觉受体蛋白ODR-10

为将步骤1.2中制备的嗅觉受体蛋白5用作嗅觉受体传感器的敏感材料，使用膜蛋白提取试剂盒从转染后的HEK-293细胞中提取嗅觉受体蛋白ODR-10；先收集转染48小时的HEK-293细胞，用4℃的去离子水离心洗3次，每次5分钟；然后加入1mL蛋白提取缓冲液、1μL 蛋白酶抑制剂、1μL DDT，超声破碎4次，然后4℃14000g离心10分钟，弃沉淀，上清液转至一新的离心管中水浴10分钟，室温下13000离心5分钟，样品分为上下两层，下层含有细胞膜蛋白；取下层样品，加入500μL 4℃灭菌水，4℃放置5分钟，然后37℃水浴10分钟，室温下13000离心5分钟，样品分为上下两层，重复此步骤5次；最终得到的下层样品即为膜蛋白混合物，其中包含带有融合His₆-tag标签的嗅觉受体蛋白ODR-10；-70℃保存待用。

本步骤1中，子步骤1.3和1.4用于验证嗅觉受体蛋白已成功表达在细胞膜表面，并非本步骤1的必要子步骤。

2、固定嗅觉受体蛋白ODR-10在石英晶体微天平表面构建嗅觉受体传感器

本发明中嗅觉受体传感器以嗅觉受体蛋白ODR-10为敏感材料，固定在石英晶体微天平表面，具体构建过程如下；将石英晶体微天平18置于乙醇中浸泡10分钟，氮气干燥；然后1M NaOH水溶液中浸泡20分钟，去离子水清洗；1M HCl溶液中浸泡5分钟；新配置的浓H₂SO₄与H₂O₂（体积比2:3）混合液浸泡1分钟，氮气干燥，以完成石英晶体微天平18的彻底清洁；利用金巯键自组装反应在石英晶体微天平18的金电极9上共价固定一层可以特异性识别融合表达的His₆-tag标签6的巯基化单链DNA适配体8，该适配体8由5’末端共价修饰了HS-(CH₂)₆基团的SEQ ID NO.5所示的基因序列组成（5’-HS-(CH₂)₆-GCTATGGGTGGTCTGGTTGGGATTGGCCCCGGGAGCTGGC-3’），室温下反应21 小时；然后封闭分子7（11-MUA）封闭石英晶体微天平传感器的金电极17表面未反应的位点，封闭条件为室温下1 小时；把步骤1.5制备的含有嗅觉受体蛋白5的细胞膜蛋白混合液均匀孵育在石英晶体微天平传感器的金电极9表面，并放在室温孵育过夜，使嗅觉受体蛋白5通过融合表达的His₆-tag标签6与适配体8发生特异性的结合反应，实现嗅觉受体蛋白5在石英晶体微天平传感器的金电极9表面特异性固定和纯化；细胞膜的磷脂双分子层4有利于保持嗅觉受体蛋白ODR-10的天然构象；N₂吹干后将表面固定有嗅觉受体蛋白5的石英晶体微天平18安装在检测系统中，完成嗅觉受体传感器的构建，以用于气味物质的检测。

3、气味物质丁二酮的检测

3.1 石英晶体微天平传感器原理

本发明中使用石英晶体微天平作为嗅觉受体传感器的二级传感器，石英晶体微天平是一种质量敏感型传感器，基本原理是石英晶体的谐振频率与其表面的表面微小的压力改变相关，通过记录石英晶体谐振频率的改变监测石英晶体表面微小的压力变化。基于此原理，也可以通过监测石英晶体谐振频率的变化来检测石英晶体表面微小的质量变化。利用这个原理将石英晶体微天平与嗅觉受体蛋白结合构建嗅觉受体传感器，嗅觉受体蛋白作为敏感元件固定在石英晶体微天平敏感电极表面，与待测物质发生特异性吸附作用后，石英晶体微天平可以到检测这一过程。当气味物质被固定于石英晶体表面的嗅觉受体蛋白所吸附时，石英晶体微天平表面的质量也发生变化，引起石英晶体谐振频率的改变，而且频率的改变与石英晶体表面质量的改变成正比，满足公式：Δ F=K Δ m，其中Δ F为石英晶体谐振频率的变化（Hz），Δ m为石英晶体表面的质量变化（g），K为相关系数，K=-F/(Art)， F为石英晶体的初始频率（MHz）， A为电极总的表面积（cm²），r为晶体的密度（g/cm³），t为晶体的厚度（cm）。因此，通过监测石英晶体谐振频率的变化可以计算出其表面的质量变化，获得气味物质与表面嗅觉受体蛋白相互作用信息，间接计算出气味物质的浓度，最终实现对气味物质的特异性检测。

3.2 嗅觉受体传感器检测气体的过程

石英晶体微天平传感器18谐振频率的信号通过传感器电极接口19传送到QCM200检测系统20（Stanford Research Systems， Inc.， USA），以记录气味物质与嗅觉受体蛋白5相互作用引起的石英晶体微天平传感器18谐振频率的改变量；首先打开第一气阀11并关闭第二气阀23，由注射泵12通过气体管路14将洁净空气气袋21中的空气以1mL/s的流速泵入检测腔内，待石英晶体微天平传感器18的谐振频率达到一个稳定的状态后，再打开第二气阀23并关闭第一气阀11将浓度确定的含有气味物质丁二酮的待测气体从待测气体气袋22泵入检测腔，待石英晶体微天平传感器18的谐振频率再次稳定后，谐振频率的改变量即为传感器对此浓度下的气体物质丁二酮的响应值；最后再打开第一气阀11并关闭第二气阀23，将洁净空气泵入检测腔内，清洗气体检测腔，即完成一次检测过程；至少间隔10min后，待石英晶体微天平传感器18的谐振频率稳定后可泵入另一待测气体到检测腔进行下一次检测；重复上述步骤，得到一系列浓度的气体物质丁二酮引起的传感器谐振频率改变量，得到丁二酮浓度-谐振频率改变量曲线。

对于未知浓度的气体物质丁二酮的检测，首先打开第一气阀11并关闭第二气阀23，由注射泵12通过气体管路14将洁净空气气袋21中的空气以1mL/s的流速泵入检测腔内，待石英晶体微天平传感器18的谐振频率达到一个稳定的状态F₀后，再打开第二气阀23并关闭第一气阀11将浓度未知的待测气体从待测气体气袋22泵入检测腔，待石英晶体微天平传感器18的谐振频率再次稳定到F₁后，得到谐振频率改变量F₁- F₀，根据上述步骤得到的丁二酮浓度-谐振频率改变量曲线推算出待测气体物质丁二酮的浓度，实现对丁二酮的浓度测定。

下面结合附图和实施例进一步说明本发明，本发明的目的和效果将变得更加明显。

如图1所示，本发明制备的嗅觉受体蛋白ODR-10的基因结构图，图中，融合表达的His₆-tag基因1、rho-tag信号肽基因2、嗅觉受体蛋白ODR-10基因3，这种基因结构设计表达的嗅觉受体蛋白ODR-10在N末端带有融合表达的His₆-tag标签和rho-tag信号肽，融合表达的His₆-tag标签有助于将嗅觉受体蛋白ODR-10有效地固定在石英晶体微天平的金电极，rho-tag信号肽有利于嗅觉受体蛋白ODR-10在细胞膜的正确定位；图2所示为本发明中嗅觉受体蛋白ODR-10固定在石英晶体微天平表面上的示意图，N末端融合表达有His₆-tag标签6的嗅觉受体蛋白5，通过His₆-tag标签6与适配体8之间的特异性相互结合被固定在石英晶体10表面的金电极9上，细胞膜成分的脂质双分子层4有利于保持嗅觉受体蛋白5的天然构象，封闭分子7用于封闭金电极表面的裸露位点；图3所示为嗅觉受体传感器检测系统结构图，其中石英晶体微天平18的表面即图2所示，表面已经成功固定好嗅觉受体蛋白ODR-10，通过控制第一气阀11和第二气阀23将洁净空气气袋21和待测气体气袋22由注射泵12泵入检测腔体16中，检测腔的盖子15通过螺纹旋在检测腔体16上方，废气通过气体管路14进入废气气袋13，橡胶密封圈17用于将石英晶体微天平18固定在检测腔体16中，信号输出电极19将石英晶体微天平18的谐振频率信号连接至QCM200检测系统20内进行信号的实时记录；图4是是本发明制备嗅觉受体蛋白ODR-10的RT-PCR结果图，目标条带大约在1.1kb，提示嗅觉受体蛋白5在细胞内mRNA水平上显著表达；图5本发明制备嗅觉受体蛋白ODR-10的Western blot结果图，目标条带大约在45KD，表明在蛋白质水平已经将嗅觉受体蛋白5成功表达在HEK-293细胞内；图6是本发明嗅觉受体传感器检测几种气味物质的结果图，该结果说明采用嗅觉受体蛋白ODR-10作为敏感材料的嗅觉受体传感器对气味物质丁二酮最敏感，其他几种气体引起的响应相对较小，因此该嗅觉受体传感器具有良好的特异性；图7是本发明制备的嗅觉受体传感器检测不同浓度丁二酮的结果图，最低检测下限大约为1.5ppm，检测灵敏度大约为0.55±0.024 Hz/ppm，综上所述此嗅觉受体传感器能够灵敏、特异地检测气味物质丁二酮。

<110> 浙江大学

<120> 一种基于嗅觉受体传感器检测气味物质丁二酮的方法

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 5778

<212> DNA

<213> Caenorhabditis elegans

<400> 1

tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg 60

cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 120

gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 180

atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 240

aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 300

catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac 360

catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg 420

atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg 480

ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt 540

acggtgggag gtctatataa gcagagctgg tttagtgaac cgtcagatcc gctagcgcta 600

ccggactcag atctcgagat gaacgggacc gagggcccaa acttctacgt gcctttctcc 660

aacaagacgg gcgtggtgga attcatgtcg ggagaattgt ggattaccct agttgacaca 720

gcggacattg tcggcgtcac cctcaccttc tgtgtcaaca ttgttcttct cggacttctg 780

aaaacacgtg gaaaaaactt gggcacttat aaatatctca tggcgttttt ctcagtattc 840

tcgatttttt acgccatcat cgagttcata ttacgaccta taatgcatat tgagaacacc 900

actttctttt tgatctcaag gaaaagattc aactactcca ccaaacttgg aaaaatcaac 960

tctgcgtttt actgtgcttg ttttgccacc agttttgttg tctcaggagt tcactttgtt 1020

tatcgatatt ttgcaacttg caaaccgaat ctacttcgtt tgttcaactt gccaactctt 1080

ctactttggc cacttggttg cagtgtaccc gtgacaatgt gggctagtgt ctcatatttt 1140

ttgtatccag ataccgagta cacggaagcg gctgtcacca atgtactaaa taaccactat 1200

aactggatca aaaaggagaa tgtatcgtac attgcatacg tctattacca atacgaaaac 1260

ggagtaaggc atatctacct caaaaacttg cttggatgct ttgttcatta ctttgtcatg 1320

tcgatgacgt ttgttgtgat gttctactgc ggatatgcca cgtggaaaac tatgaatgaa 1380

cacaaggatg tatctgatag aactcgagcg ctacagaaac aacttttcaa agctttagtt 1440

cttcagacac tcatcccaac tatcttcatg tacgccccaa ctggagtcat gttcatcgca 1500

ccgttttttg acgtgaattt gaatgcaaac gccaatttca ttgtgttttg ctcatttctg 1560

tacccgggac tcgatccact cattctgatt ttgatcattc gtgatttccg aagaacaata 1620

ttcaatttct tgtgtggaaa gaaaaacagt gttgatgaat cccgctcgac aacaagagcc 1680

aatttgtctc aagttccgac gtgaggatcc accggtcgcc accatggtga gcaagggcga 1740

ggagctgttc accggggtgg tgcccatcct ggtcgagctg gacggcgacg taaacggcca 1800

caagttcagc gtgtccggcg agggcgaggg cgatgccacc tacggcaagc tgaccctgaa 1860

gttcatctgc accaccggca agctgcccgt gccctggccc accctcgtga ccaccctgac 1920

ctacggcgtg cagtgcttca gccgctaccc cgaccacatg aagcagcacg acttcttcaa 1980

gtccgccatg cccgaaggct acgtccagga gcgcaccatc ttcttcaagg acgacggcaa 2040

ctacaagacc cgcgccgagg tgaagttcga gggcgacacc ctggtgaacc gcatcgagct 2100

gaagggcatc gacttcaagg aggacggcaa catcctgggg cacaagctgg agtacaacta 2160

caacagccac aacgtctata tcatggccga caagcagaag aacggcatca aggtgaactt 2220

caagatccgc cacaacatcg aggacggcag cgtgcagctc gccgaccact accagcagaa 2280

cacccccatc ggcgacggcc ccgtgctgct gcccgacaac cactacctga gcacccagtc 2340

cgccctgagc aaagacccca acgagaagcg cgatcacatg gtcctgctgg agttcgtgac 2400

cgccgccggg atcactctcg gcatggacga gctgtacaag taaagcggcc gcgactctag 2460

atcataatca gccataccac atttgtagag gttttacttg ctttaaaaaa cctcccacac 2520

ctccccctga acctgaaaca taaaatgaat gcaattgttg ttgttaactt gtttattgca 2580

gcttataatg gttacaaata aagcaatagc atcacaaatt tcacaaataa agcatttttt 2640

tcactgcatt ctagttgtgg tttgtccaaa ctcatcaatg tatcttaagg cgtaaattgt 2700

aagcgttaat attttgttaa aattcgcgtt aaatttttgt taaatcagct cattttttaa 2760

ccaataggcc gaaatcggca aaatccctta taaatcaaaa gaatagaccg agatagggtt 2820

gagtgttgtt ccagtttgga acaagagtcc actattaaag aacgtggact ccaacgtcaa 2880

agggcgaaaa accgtctatc agggcgatgg cccactacgt gaaccatcac cctaatcaag 2940

ttttttgggg tcgaggtgcc gtaaagcact aaatcggaac cctaaaggga gcccccgatt 3000

tagagcttga cggggaaagc cggcgaacgt ggcgagaaag gaagggaaga aagcgaaagg 3060

agcgggcgct agggcgctgg caagtgtagc ggtcacgctg cgcgtaacca ccacacccgc 3120

cgcgcttaat gcgccgctac agggcgcgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg 3180

aacccctatt tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata 3240

accctgataa atgcttcaat aatattgaaa aaggaagagt cctgaggcgg aaagaaccag 3300

ctgtggaatg tgtgtcagtt agggtgtgga aagtccccag gctccccagc aggcagaagt 3360

atgcaaagca tgcatctcaa ttagtcagca accaggtgtg gaaagtcccc aggctcccca 3420

gcaggcagaa gtatgcaaag catgcatctc aattagtcag caaccatagt cccgccccta 3480

actccgccca tcccgcccct aactccgccc agttccgccc attctccgcc ccatggctga 3540

ctaatttttt ttatttatgc agaggccgag gccgcctcgg cctctgagct attccagaag 3600

tagtgaggag gcttttttgg aggcctaggc ttttgcaaag atcgatcaag agacaggatg 3660

aggatcgttt cgcatgattg aacaagatgg attgcacgca ggttctccgg ccgcttgggt 3720

ggagaggcta ttcggctatg actgggcaca acagacaatc ggctgctctg atgccgccgt 3780

gttccggctg tcagcgcagg ggcgcccggt tctttttgtc aagaccgacc tgtccggtgc 3840

cctgaatgaa ctgcaagacg aggcagcgcg gctatcgtgg ctggccacga cgggcgttcc 3900

ttgcgcagct gtgctcgacg ttgtcactga agcgggaagg gactggctgc tattgggcga 3960

agtgccgggg caggatctcc tgtcatctca ccttgctcct gccgagaaag tatccatcat 4020

ggctgatgca atgcggcggc tgcatacgct tgatccggct acctgcccat tcgaccacca 4080

agcgaaacat cgcatcgagc gagcacgtac tcggatggaa gccggtcttg tcgatcagga 4140

tgatctggac gaagagcatc aggggctcgc gccagccgaa ctgttcgcca ggctcaaggc 4200

gagcatgccc gacggcgagg atctcgtcgt gacccatggc gatgcctgct tgccgaatat 4260

catggtggaa aatggccgct tttctggatt catcgactgt ggccggctgg gtgtggcgga 4320

ccgctatcag gacatagcgt tggctacccg tgatattgct gaagagcttg gcggcgaatg 4380

ggctgaccgc ttcctcgtgc tttacggtat cgccgctccc gattcgcagc gcatcgcctt 4440

ctatcgcctt cttgacgagt tcttctgagc gggactctgg ggttcgaaat gaccgaccaa 4500

gcgacgccca acctgccatc acgagatttc gattccaccg ccgccttcta tgaaaggttg 4560

ggcttcggaa tcgttttccg ggacgccggc tggatgatcc tccagcgcgg ggatctcatg 4620

ctggagttct tcgcccaccc tagggggagg ctaactgaaa cacggaagga gacaataccg 4680

gaaggaaccc gcgctatgac ggcaataaaa agacagaata aaacgcacgg tgttgggtcg 4740

tttgttcata aacgcggggt tcggtcccag ggctggcact ctgtcgatac cccaccgaga 4800

ccccattggg gccaatacgc ccgcgtttct tccttttccc caccccaccc cccaagttcg 4860

ggtgaaggcc cagggctcgc agccaacgtc ggggcggcag gccctgccat agcctcaggt 4920

tactcatata tactttagat tgatttaaaa cttcattttt aatttaaaag gatctaggtg 4980

aagatccttt ttgataatct catgaccaaa atcccttaac gtgagttttc gttccactga 5040

gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta 5100

atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa 5160

gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact ggcttcagca gagcgcagat accaaatact 5220

gtccttctag tgtagccgta gttaggccac cacttcaaga actctgtagc accgcctaca 5280

tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt 5340

accgggttgg actcaagacg atagttaccg gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg 5400

ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga acgacctaca ccgaactgag atacctacag 5460

cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc gaagggagaa aggcggacag gtatccggta 5520

agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat 5580

ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg 5640

tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc 5700

ttttgctggc cttttgctca catgttcttt cctgcgttat cccctgattc tgtggataac 5760

cgtattaccg ccatgcat 5778

<210> 2

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工设计

<400> 2

agaggtaccg atgcaccacc accaccacca catgaacggg accgagggcc caa 53

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工设计

<400> 3

cgcggatcct cacgtcggaa cttgagacaa at 32

<210> 4

<211> 6322

<212> DNA

<213> Caenorhabditis elegans

<400> 4

gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 60

ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120

cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180

ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240

gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300

tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360

cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420

attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480

atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540

atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600

tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 660

actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 720

aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 780

gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca 840

ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gctggctagc 900

gtttaaactt aagcttggta ccgatgcacc accaccacca ccacatgaac gggaccgagg 960

gcccaaactt ctacgtgcct ttctccaaca agacgggcgt ggtggaattc atgtcgggag 1020

aattgtggat taccctagtt gacacagcgg acattgtcgg cgtcaccctc accttctgtg 1080

tcaacattgt tcttctcgga cttctgaaaa cacgtggaaa aaacttgggc acttataaat 1140

atctcatggc gtttttctca gtattctcga ttttttacgc catcatcgag ttcatattac 1200

gacctataat gcatattgag aacaccactt tctttttgat ctcaaggaaa agattcaact 1260

actccaccaa acttggaaaa atcaactctg cgttttactg tgcttgtttt gccaccagtt 1320

ttgttgtctc aggagttcac tttgtttatc gatattttgc aacttgcaaa ccgaatctac 1380

ttcgtttgtt caacttgcca actcttctac tttggccact tggttgcagt gtacccgtga 1440

caatgtgggc tagtgtctca tattttttgt atccagatac cgagtacacg gaagcggctg 1500

tcaccaatgt actaaataac cactataact ggatcaaaaa ggagaatgta tcgtacattg 1560

catacgtcta ttaccaatac gaaaacggag taaggcatat ctacctcaaa aacttgcttg 1620

gatgctttgt tcattacttt gtcatgtcga tgacgtttgt tgtgatgttc tactgcggat 1680

atgccacgtg gaaaactatg aatgaacaca aggatgtatc tgatagaact cgagcgctac 1740

agaaacaact tttcaaagct ttagttcttc agacactcat cccaactatc ttcatgtacg 1800

ccccaactgg agtcatgttc atcgcaccgt tttttgacgt gaatttgaat gcaaacgcca 1860

atttcattgt gttttgctca tttctgtacc cgggactcga tccactcatt ctgattttga 1920

tcattcgtga tttccgaaga acaatattca atttcttgtg tggaaagaaa aacagtgttg 1980

atgaatcccg ctcgacaaca agagccaatt tgtctcaagt tccgacgtga ggatccacta 2040

gtccagtgtg gtggaattct gcagatatcc agcacagtgg cggccgctcg agtctagagg 2100

gcccgtttaa acccgctgat cagcctcgac tgtgccttct agttgccagc catctgttgt 2160

ttgcccctcc cccgtgcctt ccttgaccct ggaaggtgcc actcccactg tcctttccta 2220

ataaaatgag gaaattgcat cgcattgtct gagtaggtgt cattctattc tggggggtgg 2280

ggtggggcag gacagcaagg gggaggattg ggaagacaat agcaggcatg ctggggatgc 2340

ggtgggctct atggcttctg aggcggaaag aaccagctgg ggctctaggg ggtatcccca 2400

cgcgccctgt agcggcgcat taagcgcggc gggtgtggtg gttacgcgca gcgtgaccgc 2460

tacacttgcc agcgccctag cgcccgctcc tttcgctttc ttcccttcct ttctcgccac 2520

gttcgccggc tttccccgtc aagctctaaa tcgggggctc cctttagggt tccgatttag 2580

tgctttacgg cacctcgacc ccaaaaaact tgattagggt gatggttcac gtagtgggcc 2640

atcgccctga tagacggttt ttcgcccttt gacgttggag tccacgttct ttaatagtgg 2700

actcttgttc caaactggaa caacactcaa ccctatctcg gtctattctt ttgatttata 2760

agggattttg ccgatttcgg cctattggtt aaaaaatgag ctgatttaac aaaaatttaa 2820

cgcgaattaa ttctgtggaa tgtgtgtcag ttagggtgtg gaaagtcccc aggctcccca 2880

gcaggcagaa gtatgcaaag catgcatctc aattagtcag caaccaggtg tggaaagtcc 2940

ccaggctccc cagcaggcag aagtatgcaa agcatgcatc tcaattagtc agcaaccata 3000

gtcccgcccc taactccgcc catcccgccc ctaactccgc ccagttccgc ccattctccg 3060

ccccatggct gactaatttt ttttatttat gcagaggccg aggccgcctc tgcctctgag 3120

ctattccaga agtagtgagg aggctttttt ggaggcctag gcttttgcaa aaagctcccg 3180

ggagcttgta tatccatttt cggatctgat caagagacag gatgaggatc gtttcgcatg 3240

attgaacaag atggattgca cgcaggttct ccggccgctt gggtggagag gctattcggc 3300

tatgactggg cacaacagac aatcggctgc tctgatgccg ccgtgttccg gctgtcagcg 3360

caggggcgcc cggttctttt tgtcaagacc gacctgtccg gtgccctgaa tgaactgcag 3420

gacgaggcag cgcggctatc gtggctggcc acgacgggcg ttccttgcgc agctgtgctc 3480

gacgttgtca ctgaagcggg aagggactgg ctgctattgg gcgaagtgcc ggggcaggat 3540

ctcctgtcat ctcaccttgc tcctgccgag aaagtatcca tcatggctga tgcaatgcgg 3600

cggctgcata cgcttgatcc ggctacctgc ccattcgacc accaagcgaa acatcgcatc 3660

gagcgagcac gtactcggat ggaagccggt cttgtcgatc aggatgatct ggacgaagag 3720

catcaggggc tcgcgccagc cgaactgttc gccaggctca aggcgcgcat gcccgacggc 3780

gaggatctcg tcgtgaccca tggcgatgcc tgcttgccga atatcatggt ggaaaatggc 3840

cgcttttctg gattcatcga ctgtggccgg ctgggtgtgg cggaccgcta tcaggacata 3900

gcgttggcta cccgtgatat tgctgaagag cttggcggcg aatgggctga ccgcttcctc 3960

gtgctttacg gtatcgccgc tcccgattcg cagcgcatcg ccttctatcg ccttcttgac 4020

gagttcttct gagcgggact ctggggttcg aaatgaccga ccaagcgacg cccaacctgc 4080

catcacgaga tttcgattcc accgccgcct tctatgaaag gttgggcttc ggaatcgttt 4140

tccgggacgc cggctggatg atcctccagc gcggggatct catgctggag ttcttcgccc 4200

accccaactt gtttattgca gcttataatg gttacaaata aagcaatagc atcacaaatt 4260

tcacaaataa agcatttttt tcactgcatt ctagttgtgg tttgtccaaa ctcatcaatg 4320

tatcttatca tgtctgtata ccgtcgacct ctagctagag cttggcgtaa tcatggtcat 4380

agctgtttcc tgtgtgaaat tgttatccgc tcacaattcc acacaacata cgagccggaa 4440

gcataaagtg taaagcctgg ggtgcctaat gagtgagcta actcacatta attgcgttgc 4500

gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgcattaa tgaatcggcc 4560

aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact 4620

cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac 4680

ggttatccac agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa 4740

aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg 4800

acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa 4860

gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc 4920

ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac 4980

gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac 5040

cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg 5100

taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt 5160

atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagaa 5220

cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct 5280

cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtttttt tgtttgcaag cagcagatta 5340

cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc 5400

agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca 5460

cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa 5520

cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat 5580

ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct 5640

taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt 5700

tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat 5760

ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta 5820

atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg 5880

gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt 5940

tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg 6000

cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg 6060

taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc 6120

ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca catagcagaa 6180

ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac 6240

cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt 6300

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<211> 40

<212> DNA

<213> 人工设计

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Claims (3)

1.一种基于嗅觉受体传感器检测气味物质丁二酮的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

（1）制备嗅觉受体蛋白ODR-10；

（2）固定嗅觉受体蛋白ODR-10在石英晶体微天平表面构建嗅觉受体传感器；

（3）将洁净空气以1mL/s的流速泵入检测腔内，待石英晶体微天平传感器的谐振频率达到一个稳定的状态后，再将浓度确定的含有气味物质丁二酮的待测气体泵入检测腔，待石英晶体微天平传感器的谐振频率再次稳定后，谐振频率的改变量即为嗅觉受体传感器对此浓度下的气体物质丁二酮的响应值；最后再将洁净空气泵入检测腔内，清洗气体检测腔，即完成一次检测过程；至少间隔10min后，待石英晶体微天平传感器的谐振频率稳定后可泵入另一浓度待测气体到检测腔进行下一次检测；重复上述步骤，得到一系列浓度的气体物质丁二酮引起的传感器谐振频率改变量，得到丁二酮浓度-谐振频率改变量曲线；

（4）对于未知浓度的气体物质丁二酮的检测，首先将洁净空气以1mL/s的流速泵入检测腔内，待石英晶体微天平传感器的谐振频率达到一个稳定的状态F₀后，再将浓度未知的待测气体泵入检测腔，待石英晶体微天平传感器的谐振频率再次稳定到F₁后，得到谐振频率改变量F₁- F₀，根据上述步骤3得到的丁二酮浓度-谐振频率改变量曲线获得待测气体物质丁二酮的浓度，实现对丁二酮的浓度测定。

2.根据权利要求1所述一种基于嗅觉受体传感器检测气味物质丁二酮的方法，其特征在于，所述步骤1包括以下子步骤：

（1.1）构建表达载体：首先采用基因工程技术对含有嗅觉受体蛋白ODR-10基因和rho-tag信号肽序列全长cDNA的质粒PEGFP-N1/rho-tag/odr-10（其基因序列如SEQ ID NO.1所示）进行适当改造，构建适用于嗅觉受体传感器使用的嗅觉受体蛋白的表达载体，使其N末端带有融合表达的His₆-tag标签；首先，设计相应的引物，获取和扩增嗅觉受体蛋白ODR-10基因和rho-tag信号肽序列全长cDNA，并在N末端添加融合表达的His₆-tag标签，上游引物序列SEQ ID NO.2；下游引物序列如SEQ ID NO.3所示；聚合酶链式反应在50μL反应体系中进行，温度循环首先是95℃预变性3分钟，接着进行30循环的94℃ 变性30秒、60℃退火30秒、72℃延伸70秒，最后是10℃降温10秒；扩增后获得的产物his₆-tag/rho-tag/odr-10通过限制性内切酶的双酶切反应亚克隆到表达载体pcDNA3.1(+)的多克隆位点Kpn I和BamH I之间，完成嗅觉受体蛋白的表达载体pcDNA3.1(+)/his₆-tag/rho-tag/odr-10的构建，其基因序列如SEQ ID NO.4通过测序进行鉴定；

（1.2）转染人胚胎肾细胞HEK-293：HEK-293细胞培养液为添加了体积百分比为10％的胎牛血清、青霉素（100 U/mL）和链霉素（100 μg/mL）的DMEM高糖培养基，培养条件为37℃、体积百分比为5% CO₂的培养箱；转染之前一天，HEK-293细胞被接种于六孔培养皿中，每孔接种500 μL 浓度为0.5～2×10⁵ cells/mL的细胞，在不含抗生素的DMEM高糖培养基里生长至融合度约为80-90%，待转染；转染试剂为lipofectamin 2000，使用步骤1.1构建好的表达载体pcDNA3.1(+)/his₆-tag/rho-tag/odr-10转染HEK-293细胞；用无血清DMEM培养液把4 μg表达载体稀释至50 μL，混匀；再用无血清DMEM培养液稀释10 μL 的脂质体转染试剂lipfectamin 2000至50 μL，在室温下孵育5 分钟；接着把稀释后的表达载体和lipfectamin 2000混合至总体积为100 μL，摇匀，室温孵育20 分钟；六孔板的每个孔中加入100 μL表达载体和lipfectamin 2000的混合液，前后摇板混匀后，在37℃、体积百分比为5% CO₂的培养箱孵育24-48小时后，嗅觉受体蛋白即表达在HEK-293细胞膜表面，以备用作嗅觉受体传感器的敏感材料；

（1.3）提取嗅觉受体蛋白ODR-10：为将步骤1.2中制备的嗅觉受体蛋白ODR-10用作嗅觉受体传感器的敏感材料，使用膜蛋白提取试剂盒从转染后的HEK-293细胞中提取嗅觉受体蛋白ODR-10；先收集转染48小时的HEK-293细胞，用4℃的去离子水离心洗3次，每次5分钟；然后加入1mL蛋白提取缓冲液、1μL 蛋白酶抑制剂、1μL DDT，超声破碎4次，然后4℃14000g离心10分钟，弃沉淀，上清液转至一新的离心管中水浴10分钟，室温下13000离心5分钟，样品分为上下两层，下层含有细胞膜蛋白；取下层样品，加入500μL 4℃灭菌水，4℃放置5分钟，然后37℃水浴10分钟，室温下13000离心5分钟，样品分为上下两层，重复此步骤5次；最终得到的下层样品即为膜蛋白混合物，其中包含带有融合His₆-tag标签的嗅觉受体蛋白ODR-10；-70℃保存待用。

3.根据权利要求1所述一种基于嗅觉受体传感器检测气味物质丁二酮的方法，其特征在于，所述步骤2具体为：将石英晶体微天平置于乙醇中浸泡10分钟，氮气干燥；然后1M NaOH水溶液中浸泡20分钟，去离子水清洗；1M HCl溶液中浸泡5分钟；浓H₂SO₄与H₂O₂按体积比2:3组成的混合液中浸泡1分钟，氮气干燥，以完成石英晶体微天平的彻底清洁；利用金巯键自组装反应在石英晶体微天平的金电极上共价固定一层可以特异性识别融合表达的His₆-tag标签的巯基化单链DNA适配体，该适配体由5’末端共价修饰了HS-(CH₂)₆基团的SEQ ID NO.5所示的基因序列组成，室温下反应21 小时；然后封闭分子11-MUA封闭石英晶体微天平传感器的金电极表面未反应的位点，封闭条件为室温下1 小时；把步骤1.5制备的含有嗅觉受体蛋白的细胞膜蛋白混合液均匀孵育在石英晶体微天平传感器的金电极表面，并放在室温孵育过夜，使嗅觉受体蛋白通过融合表达的His₆-tag标签与适配体发生特异性的结合反应，实现嗅觉受体蛋白在石英晶体微天平传感器的金电极表面特异性固定和纯化。

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