CN103184246B - 麦角硫因的生物合成制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种麦角硫因的生物合成制备方法，包括如下步骤：将大型真菌的菌丝体斜面菌种接种至装有培养基的三角瓶后，摇床振荡条件下，培养；将发酵液于80～110℃，搅拌6～200min，使菌丝体内的麦角硫因从细胞内转移到发酵液中；本发明的方法可以保证产品的安全性；原料来源广泛，价廉易得，可以满足食品安全的要求，没有原料养殖或栽培的季节性和不易储藏的限制，可实现常年规模化生产，生产周期短，生产效率高；通过优化菌丝体的发酵条件，提高和稳定麦角硫因的产率，工艺可以控制，生产规范，技术经济性好，生产成本低，为医药、食品饮料、功能食品、动物饲料、化妆品及生物技术等领域提供安全便宜的麦角硫因。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵技术和手性化合物生物合成领域，具体地涉及一种麦角硫因的生物合成制备方法。
背景技术
麦角硫因(L-Ergothioneine，EGT)，化学名为2-巯基组氨酸三甲基内盐，是至今唯一为人们所知的天然2-硫代咪唑氨基酸(2-thio-imidazole)。麦角硫因的化学结构式如下：
麦角硫因最初发现于黑麦麦角菌(Claviceps purpurea)中(TANRET C.，Sur unebase nouvelle retiree du seigle ergote，L-Ergothioneine Compt.Rend.Acad.Sci.，1909.149：222-224.)。其后报导，麦角硫因广泛分布于包括人类在内的动物红血球、肝脏等组织器官中(MELVILLE D.B.L-Ergothioneine.Vitam & Horm，1958.17：155-204.)，它具很强的有抗氧化活性：清除活性氧族，螯合二价金属离子，激活抗氧化物酶，抑制超氧化物歧化酶(ARUOMA OI，Whiteman M，England TG，Halliwell B，Antioxidant Action ofErgothioneine assessment of its ability to scavenge peroxynitrite.BBRC，1997.231：389-391.)，抑制各种血红素蛋白发生氧化反应等。由于麦角硫因的上述特性，决定了它在医药、食品饮料、功能食品、动物饲料、化妆品及生物技术等领域具有广泛的用途和市场前景。
研究发现麦角硫因是许多微生物细胞的成分，合成麦角硫因的微生物主要有细菌目的分枝杆菌、蓝藻细菌(螺旋藻)(Carolin Pfeiffer，Tim Bauer，Barbara Surek，EdgarDirk Gründemann，Cyanobacteria produce high levels ofergothioneine.Food Chemistry，2011：1-4.)、真菌目的担子菌和子囊菌等。虽然人体内存在麦角硫因，但人类、动物及高等植物体自身无法合成麦角硫因，必须通过饮食等方式从外界环境中摄取。
麦角硫因的制备方法有三种：化学合成法、提取法以及生物发酵合成法。化学方法合成左旋的麦角硫因十分困难，几种合成方法都因局部或全部外消旋化而没有达到预期的产量，合成的难点是很难制备原料2-巯基咪唑，并且α位碳的酸性会使反应很容易发生外消旋作用。OXIS国际公司第一个研制出了高效、商业化合成麦角硫因的方法(XU J.and YADANJ.C.，A new and convenient synthesis of imidazole-2-thiones fromImidazole.Synlett，1995.3：239-241.)，并于1995年申请了专利，其方法是将巯基导入咪唑环。但由于化学合成产品的安全性难以得到保证，合成原料昂贵，合成成本高，产品的售价高，以至于限制了麦角硫因的应用。提取法是从食用菌的子实体、猪血、动物组织、麦角和谷物中提取麦角硫因，但上述原料中麦角硫因的含量仍然很低，且存在原料的杂质多，药物残留，提取成本高及民族禁忌等问题。许多大型真菌具有合成麦角硫因的能力，但其子实体中麦角硫因的含量低，从大型真菌的子实体中提取麦角硫因的成本高。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种麦角硫因的生物合成制备方法。
本发明的技术方案概述如下：
一种麦角硫因的生物合成制备方法，包括如下步骤：
(1)将大型真菌的菌丝体斜面菌种接种至装有培养基的三角瓶后，在16～35℃，100～300rpm摇床振荡条件下，培养6～11天，大型真菌的菌丝体内大量合成积累麦角硫因；
(2)将步骤(1)获得的发酵液于80～110℃，转数为1～500rpm的条件下，搅拌6～200min，使菌丝体内的麦角硫因从细胞内转移到发酵液中；
所述培养基按重量份数由下述组分组成：10～60份的碳源、5～30份的有机氮源、0.5～10份的无机盐，加水至1000份，调节pH＝5.0～6.5。
所述大型真菌为野生紫孢侧耳(Pleurotus sapidus)、肺形侧耳(Pleurotuspulmonarius)或花脸香蘑(Lepista sordida)。
所述碳源是以下物质的一种或多种的组合：蔗糖、果糖、山梨糖、甘露糖、乳糖、半乳糖、甘露醇、麦芽糖醇、山梨醇、甘油、脂肪、糊精、麦芽糊精、甜菜糖蜜、甘蔗糖蜜、马铃薯、玉米粉、木薯粉、芭蕉芋、红薯粉、大米粉、小麦粉、高粱粉、大麦粉和燕麦粉。
所述有机氮源是以下物质的一种或多种的组合：酵母粉、玉米浆、麸皮、大豆蛋白、豆粕粉、豆饼粉、棉籽粉、花生饼粉、玉米蛋白粉、牛肉膏、蛋白胨、酪蛋白胨和胰蛋白胨。
所述无机盐为K2SO4、MgCl2和(NH4)H2PO4至少一种。
本发明的优点：
与目前的化学合成方法相比，这种发酵生产方式可以保证产品的安全性；原料来源广泛，价廉易得，可以满足食品安全的要求，没有民族禁忌；没有原料养殖或栽培的季节性和不易储藏的限制，可实现常年规模化生产，生产周期短，生产效率高；通过优化菌丝体的发酵条件，提高和稳定麦角硫因的产率，工艺可以控制，生产规范，技术经济性好，生产成本低，为医药、食品饮料、功能食品、动物饲料、化妆品及生物技术等领域提供安全便宜的麦角硫因。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明：
实施例1
一种麦角硫因的生物合成制备方法，包括如下步骤：
(1)培养基制备：按重量份数称取30份的糊精、15份的酪蛋白胨、3份的K2SO4、2份的(NH4)H2PO4和1.5份的MgCl2，加水至1000份，调pH＝5.5。
(2)摇瓶培养：在500mL三角瓶装入150mL培养基，121℃灭菌20min；每个三角瓶接种花脸香蘑(Lepista sordida)的菌丝体斜面菌种1cm2，于25℃，150rpm的条件下，摇床振荡培养9天，花脸香蘑的菌丝体内大量合成积累麦角硫因；
(3)培养结束后，将发酵液升温至90℃，300rpm搅拌30min，菌丝体内的麦角硫因从细胞内转移到细胞外的发酵液中，发酵液中麦角硫因含量为48mg/L。
实施例2
(1)培养基制备：按重量份数称取40份的甘油、15份的豆粕粉、3份的K2SO4、3份的(NH4)H2PO4和1.5份的MgCl2，加水至1000份，调pH＝5.8；
(2)摇瓶培养：在500mL三角瓶装入150mL培养基，121℃灭菌30min；每个三角瓶接种野生紫孢侧耳(Pleurotus sapidus)的菌丝体斜面菌种2cm2，于26℃，140rpm的条件下，摇床振荡培养10天，野生紫孢侧耳的菌丝体内大量合成积累麦角硫因。
(3)培养结束后，过滤收集菌丝体，每克干燥菌丝体中麦角硫因含量为2.7mg。将1份体积的菌丝体和5份体积的水混合，升温至100℃，80rpm搅拌抽提20min，菌丝体内的麦角硫因被萃取到细胞外。
实施例3：
麦角硫因的检测方法：
麦角硫因萃取液的前处理：麦角硫因萃取液于10000×g离心15min，进行固液分离，收集上清液，将上清液经孔径为3000Da分子量的超滤膜超滤，超滤的透过液用HPLC检测。
麦角硫因的检测：检测仪器为高压液相色谱；Eclipse XDB-C18色谱柱(250mm×4.6mm，粒径5μm)，采用两根柱串联进行检测；流动相为乙腈-水，乙腈∶水为1∶99；流速1.0mL/min，柱温30℃，检测波长254nm；进样量10μL。麦角硫因对照品溶液的浓度33mg/L。通过比较对照品和萃取液麦角硫因的峰面积，计算萃取液中的麦角硫因含量。
菌丝体中麦角硫因含量的计算方法：每克干燥菌丝体中的麦角硫因含量(mg)＝1L萃取液中麦角硫因的含量(mg)÷1L萃取液中干燥菌丝体的含量(g)。
实施例4～28，培养基按重量份数的组成
实施例29
一种麦角硫因的生物合成制备方法，包括如下步骤：
(1)将花脸香蘑(Lepista sordida)的菌丝体斜面菌种接种至装有培养基的三角瓶后，在16℃，200rpm振荡条件下，培养10天；
(2)将发酵液于50℃，转数为500rpm的条件下，搅拌200min，菌丝体内的麦角硫因从细胞内转移到发酵液中，经检测，发酵液中麦角硫因含量为17mg/L。
本实施例的培养基是实施例8的配方制备的培养基。
实施例30
一种麦角硫因的生物合成制备方法，包括如下步骤：
(1)将花脸香蘑(Lepista sordida)的菌丝体斜面菌种接种至装有培养基的三角瓶后，在35℃，100rpm振荡条件下，培养9天，使大型真菌的菌丝体内大量合成积累麦角硫因；
(2)将发酵液于110℃，转数为1rpm的条件下，搅拌6min，菌丝体内的麦角硫因从细胞内转移到发酵液中，经检测，发酵液中麦角硫因含量为14mg/L。
本实施例的培养基是实施例5的配方制备的培养基。
实施例31
一种麦角硫因的生物合成制备方法，包括如下步骤：
(1)将花脸香蘑(Lepista sordida)的菌丝体斜面菌种接种至装有培养基的三角瓶后，在25℃，300rpm振荡条件下，培养6天；
(2)将发酵液于80℃，转数为300rpm的条件下，搅拌60min，菌丝体内的麦角硫因从细胞内转移到发酵液中，经检测，发酵液中麦角硫因含量为15mg/L。
本实施例的培养基是实施例12的配方制备的培养基。
实施例32
一种麦角硫因的生物合成制备方法，包括如下步骤：
(1)将花脸香蘑(Lepista sordida)的菌丝体斜面菌种接种至装有培养基的三角瓶后，在23℃，250rpm振荡条件下，培养11天，使大型真菌的菌丝体内大量合成积累麦角硫因；
(2)将发酵液于100℃，转数为100rpm的条件下，搅拌10min，菌丝体内的麦角硫因从细胞内转移到发酵液中，经检测，发酵液中麦角硫因含量为15mg/L。
本实施例的培养基是实施例14的配方制备的培养基。
实施例33
一种麦角硫因的生物合成制备方法，包括如下步骤：
(1)将花脸香蘑(Lepista sordida)的菌丝体斜面菌种接种至装有培养基的三角瓶后，在25℃，150rpm振荡条件下，培养9天，使大型真菌的菌丝体内大量合成积累麦角硫因；
(2)将发酵液于90℃，转数为500rpm的条件下，搅拌30min，使菌丝体内的麦角硫因从细胞内转移到发酵液中，经检测，发酵液中麦角硫因含量为51mg/L。
本实施例的培养基是实施例27的配方制备的培养基。
实施例34
一种麦角硫因的生物合成制备方法，包括如下步骤：
(1)将花脸香蘑(Lepista sordida)的菌丝体斜面菌种接种至装有培养基的三角瓶后，在23℃，130rpm振荡条件下，培养10天，使大型真菌的菌丝体内大量合成积累麦角硫因；
(2)将发酵液于80℃，转数为450rpm的条件下，搅拌50min，菌丝体内的麦角硫因从细胞内转移到发酵液中，经检测，发酵液中麦角硫因含量为42mg/L。
本实施例的培养基是实施例26的配方制备的培养基。
实施例35
一种麦角硫因的生物合成制备方法，包括如下步骤：
(1)将花脸香蘑(Lepista sordida)的菌丝体斜面菌种接种至装有培养基的三角瓶后，在27℃，170rpm振荡条件下，培养8天，使大型真菌的菌丝体内大量合成积累麦角硫因；
(2)将发酵液于85℃，转数为400rpm的条件下，搅拌70min，菌丝体内的麦角硫因从细胞内转移到发酵液中，经检测，发酵液中麦角硫因含量为35mg/L。
本实施例的培养基是实施例11的配方制备的培养基。
实施例36
一种麦角硫因的生物合成制备方法，包括如下步骤：
(1)将花脸香蘑(Lepista sordida)的菌丝体斜面菌种接种至装有培养基的三角瓶后，在28℃，120rpm振荡条件下，培养10天，使大型真菌的菌丝体内大量合成积累麦角硫因；
(2)将发酵液于95℃，转数为400rpm的条件下，搅拌40min，菌丝体内的麦角硫因从细胞内转移到发酵液中，经检测，发酵液中麦角硫因含量为19mg/L。
本实施例的培养基是实施例23的配方制备的培养基。
实施例37
用肺形侧耳(Pleurotus pulmonarius)替换实施例33的花脸香蘑(Lepistasordida)，培养条件同实施例33，培养基采用的是实施例28配制的，经检测，发酵液中麦角硫因含量为22mg/L。
实施例38
用肺形侧耳(Pleurotus pulmonarius)替换实施例34的花脸香蘑(Lepistasordida)，培养条件同实施例34，培养基采用的是实施例24配制的，经检测，发酵液中麦角硫因含量为14mg/L。
实施例39
用肺形侧耳(Pleurotus pulmonarius)替换实施例35的花脸香蘑(Lepistasordida)，培养条件同实施例35，培养基采用的是实施例21配制的，经检测，发酵液中麦角硫因含量为48mg/L。
实施例40
用肺形侧耳(Pleurotus pulmonarius)替换实施例36的花脸香蘑(Lepistasordida)，培养条件同实施例36，培养基采用的是实施例19配制的，经检测，发酵液中麦角硫因含量为17mg/L。
实施例41
用肺形侧耳(Pleurotus pulmonarius)替换实施例33的花脸香蘑(Lepistasordida)，培养条件同实施例33，培养基采用的是实施例7配制的，经检测，发酵液中麦角硫因含量为15mg/L。
实施例42
用肺形侧耳(Pleurotus pulmonarius)替换实施例34的花脸香蘑(Lepistasordida)，培养条件同实施例34，培养基采用的是实施例18配制的，经检测，发酵液中麦角硫因含量为20mg/L。
实施例43
用肺形侧耳(Pleurotus pulmonarius)替换实施例35的花脸香蘑(Lepistasordida)，培养条件同实施例35，培养基采用的是实施例13配制的，经检测，发酵液中麦角硫因含量为12mg/L。
实施例44
用肺形侧耳(Pleurotus pulmonarius)替换实施例36的花脸香蘑(Lepistasordida)，培养条件同实施例36，培养基采用的是实施例16配制的，经检测，发酵液中麦角硫因含量为14mg/L。
实施例45
用肺形侧耳(Pleurotus pulmonarius)替换实施例33的花脸香蘑(Lepistasordida)，培养条件同实施例33，培养基采用的是实施例20配制的，发酵液中麦角硫因含量为16mg/L。
实施例46
用野生紫孢侧耳(Pleurotus sapidus)替换实施例34的花脸香蘑(Lepistasordida)，培养条件同实施例34，培养基采用的是实施例4配制的，经检测，发酵液中麦角硫因含量为36mg/L。
实施例47
用野生紫孢侧耳(Pleurotus sapidus)替换实施例35的花脸香蘑(Lepistasordida)，培养条件同实施例35，培养基采用的是实施例6配制的，经检测，发酵液中麦角硫因含量为20mg/L。
实施例48
用野生紫孢侧耳(Pleurotus sapidus)替换实施例36的花脸香蘑(Lepistasordida)，培养条件同实施例36，培养基采用的是实施例10配制的，经检测，发酵液中麦角硫因含量为23mg/L。
实施例49
用野生紫孢侧耳(Pleurotus sapidus)替换实施例33的花脸香蘑(Lepistasordida)，培养条件同实施例33，培养基采用的是实施例9配制的，经检测，发酵液中麦角硫因含量为13mg/L。
实施例50
用野生紫孢侧耳(Pleurotus sapidus)替换实施例34的花脸香蘑(Lepistasordida)，培养条件同实施例34，培养基采用的是实施例15配制的，经检测，发酵液中麦角硫因含量为14mg/L。
实施例51
用野生紫孢侧耳(Pleurotus sapidus)替换实施例35的花脸香蘑(Lepistasordida)，培养条件同实施例35，培养基采用的是实施例17配制的，经检测，发酵液中麦角硫因含量为15mg/L。
实施例52
用野生紫孢侧耳(Pleurotus sapidus)替换实施例36的花脸香蘑(Lepistasordida)，培养条件同实施例36，培养基采用的是实施例22配制的，经检测，发酵液中麦角硫因含量为15mg/L。
实施例53
用野生紫孢侧耳(Pleurotus sapidus)替换实施例33的花脸香蘑(Lepistasordida)，培养条件同实施例33，培养基采用的是实施例25配制的，经检测，发酵液中麦角硫因含量为37mg/L。
Claims (4)
1.一种麦角硫因的生物合成制备方法，其特征是包括如下步骤：
(1)将大型真菌的菌丝体斜面菌种接种至装有培养基的三角瓶后，在16～35℃，100～300rpm摇床振荡条件下，培养6～11天；
(2)将步骤(1)获得的发酵液于80～110℃，转数为1～500rpm的条件下，搅拌6～200min，使菌丝体内的麦角硫因从细胞内转移到发酵液中；
所述培养基按重量份数由下述组分组成：10～60份的碳源、5～30份的有机氮源、0.5～10份的无机盐，加水至1000份，调节pH＝5.0～6.5；
所述大型真菌为野生紫孢侧耳(Pleurotus sapidus)、肺形侧耳(Pleurotuspulmonarius)或花脸香蘑(Lepista sordida)。
2.根据权利要求1所述的一种麦角硫因的生物合成制备方法，其特征是所述碳源为蔗糖、果糖、山梨糖、甘露糖、乳糖、半乳糖、甘露醇、麦芽糖醇、山梨醇、甘油、脂肪、糊精、麦芽糊精、甜菜糖蜜、甘蔗糖蜜、马铃薯、玉米粉、木薯粉、芭蕉芋、红薯粉、大米粉、小麦粉、高粱粉、大麦粉或燕麦粉。
3.根据权利要求1所述的一种麦角硫因的生物合成制备方法，其特征是所述有机氮源是以下物质的一种或多种的组合：酵母粉、玉米浆、麸皮、大豆蛋白、豆粕粉、豆饼粉、棉籽粉、花生饼粉、玉米蛋白粉、牛肉膏、蛋白胨、酪蛋白胨和胰蛋白胨。
4.根据权利要求1所述的一种麦角硫因的生物合成制备方法，其特征是所述无机盐为K2SO4、MgCl2和(NH4)H2PO4至少一种。
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