发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种真菌菌株LP-16(Fusarium oxysporum)。
本发明的第二个目的在于提供了上述真菌菌株的分离培养基。
本发明的第三个目的在于提供一种包含上述真菌菌株的菌剂。
本发明的第四个目的在于提供上述菌剂的制备方法。
本发明的第五个目的在于提供一种锌离子处理剂。
本发明的第六个目的在于提供一种处理含锌废水的方法。
为达此目的,本发明采用以下技术方案:
第一方面,本发明提供了一种真菌菌株LP-16(Fusarium oxysporum),保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,100101,保藏日期为2013年8月16日,保藏编号为CGMCC No.8037。
第二方面,本发明提供了一种如第一方面所述真菌菌株LP-16的分离培养基,用于分离所述真菌菌株LP-16;所述分离培养基包含0.1~0.4g/L乙酸钠,0.05~0.2g/L酵母提取物,5~25g/L琼脂,40~60mg/L Zn2+,0.01~0.12g/L MgSO4·7H2O,0.001~0.010g/L K2HPO4和0.05~0.2g/L氯霉素,且pH=7.0;
优选地,所述分离培养基包含0.2~0.3g/L乙酸钠,0.1~0.2g/L酵母提取物,10~20g/L琼脂,45~55mg/L Zn2+,0.03~0.1g/L MgSO4·7H2O,0.003~0.008g/L K2HPO4和0.08~0.15g/L氯霉素,且pH=7.0;
进一步优选地,所述分离培养基包含0.2461g/L乙酸钠,0.15g/L酵母提取物,15g/L琼脂,50mg/L Zn2+,0.05g/L MgSO4·7H2O,0.005g/L K2HPO4和0.1g/L 氯霉素,且pH=7.0。
优选地,在每升所述分离培养基中还加入2ml微量元素溶液,所述微量元素溶液包含1~5g/L CaCl2·2H2O,1~5g/L2.5g H3BO3,0.5~1.2g/L ZnCl2·4H2O,0.5~1.5g/L FeCl3·6H2O,0.3~0.6g/L ZnSO4·7H2O,0.1~0.4g/L Na2MoO4·2H2O和0.003~0.008g/LCuSO4·5H2O。
进一步优选地,所述微量元素溶液包含2~4g/L CaCl2·2H2O、1~3g/L H3BO3、0.7~1g/LZnCl2·4H2O、0.8~1.2g/L FeCl3·6H2O、0.4~0.5g/L ZnSO4·7H2O、0.2~0.3g/LNa2MoO4·2H2O和0.005~0.006g/L CuSO4·5H2O。
更进一步优选地,所述微量元素溶液包含3.7g CaCl2·2H2O、2.5g H3BO3、0.87gZnCl2·4H2O、1.0g FeCl3·6H2O、0.44g ZnSO4·7H2O、0.29g Na2MoO4·2H2O和0.005g CuSO4·5H2O。
第三方面,本发明提供了一种真菌菌剂,该真菌菌剂包含第一方面所述的真菌菌株LP-16。
第四方面,本发明提供了如第三方面所述的真菌菌剂的制备方法,所述方法包括:
(1)培养皿培养:将如权利要求1所述的真菌菌株LP-16在无菌条件下接种于固体培养基上,20-30℃、优选22-28℃、进一步优选25℃下培养4-6天、优选4.4-5.5天、进一步优选5天;所述固体培养基包括如下组分:马铃薯浸粉4-6g/L、优选4.5-5.5g/L、进一步优选5g/L,葡萄糖或蔗糖15-25g/L、优选17-23g/L、进一步优选20g/L,琼脂13-18g/L、优选14-17g/L、进一步优选16g/L,氯霉素0.1g/L;
(2)一级种子培养:将步骤(1)培养的菌种在无菌条件下接种于液体培养基,20-30℃,优选22-28℃,进一步优选25℃下培养5-7天,优选地5.5-6.5天,更优选地6天,制得一级种子;所述液体培养基包括如下组分:马铃薯浸粉4-6g/L、优选4.5-5.5g/L、进一步优选5g/L,葡萄糖或者蔗糖15-25g/L、优选 17-23g/L、进一步优选20g/L,氯霉素0.1g/L;
(3)二级种子培养:按液体培养基的体积比为5-15%、优选8-12%、更优选10%的接种量,将步骤(2)所得一级种子接种到发酵罐中,曝气,培养5-7天、优选5.5-6.5天、进一步优选6天,制得二级种子;
(4)混合发酵培养:按液体培养基的体积比为10-20%、优选12-18%、更优选15%的接种量,将二级种子接种到发酵罐中,进行高密度发酵培养,获得菌剂。
培养皿培养中,培养温度可以为20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃;培养时间可以为4天、4.5天、110小时、5天、130小时、5.5天或6天;所用的固体培养基中马铃薯浸粉可以为4g/L、4.2g/L、4.5g/L、4.7g/L、4.9g/L、5g/L、5.lg/L、5.3g/L、5.5g/L、5.8g/L或6g/L,葡萄糖或者蔗糖可以为15g/L、16g/L、17g/L、18g/L、19g/L、20g/L、21g/L、22g/L、23g/L、24g/L或25g/L,琼脂可以为13g/L、14g/L、15g/L、16g/L、17g/L或18g/L。
一级种子培养中,培养温度可以为20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃;培养时间可以为5天、5.5天、140小时、6天、150小时、6.5天或7天;所用的液体培养基中马铃薯浸粉可以为4g/L、4.2g/L、4.5g/L、4.7g/L、4.9g/L、5g/L、5.lg/L、5.3g/L、5.5g/L、5.8g/L或6g/L,葡萄糖或者蔗糖可以为15g/L、16g/L、17g/L、18g/L、19g/L、20g/L、21g/L、22g/L、23g/L、24g/L或25g/L。
二级种子培养中,接种量按液体培养基的体积比可以为5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%或15%;培养时间可以为5.5天、140 小时、6天、150小时或6.5天。
混合发酵培养中,接种量按液体培养基的体积比可以为10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%或20%。
第五方面,本发明提供了一种锌离子处理剂,所述锌离子处理剂包括如第一方面所述的真菌菌株LP-16;优选地,所述处理为去除或回收。
第六方面,本发明提供了一种处理含锌废水的方法,所述方法包括:将如第一方面所述的真菌菌株LP-16、如第三方面所述的真菌菌剂或如第五方面所述的锌离子处理剂与所述含锌废水接触。
优选地,本发明的处理含锌废水的方法包括:
(1)将含锌废水的pH值调节至5.0-8.0,优选5.5-7,进一步优选6.0;
(2)向水体中加入如第一方面所述的真菌菌株LP-16、如第三方面所述的真菌菌剂或如第五方面所述的锌离子处理剂,于10-35℃,优选15-30℃,进一步优选25℃,震荡4-8小时,优选5-7小时,进一步优选6小时,震荡速度90-180rpm,优选100-160rpm,进一步优选120rpm;
(3)静置8-16小时,优选10-14小时,进一步优选12小时。
在本发明的处理含锌废水的方法中,含锌废水的pH值可以为5.0、5.5、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.5、7.0、7.5或8.0;处理温度可以为10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃或35℃;震荡时间可以为4小时、4.5小时、5小时、5.5小时、6小时、6.5小时、7小时、7.5小时或8小时;震荡速度可以为90rpm、100rpm、110rpm、120rpm、130rpm、140rpm、150rpm、160rpm、170rpm或180rpm;静 置时间可以为8小时、8.5小时、9小时、9.5小时、10小时、10.5小时、11小时、11.5小时、12小时、12.5小时、13小时、13.5小时、14小时、14.5小时、15小时、15.5小时或16小时。
在本发明的处理含锌废水的方法中,所述处理为去除或回收所述含锌废水中的锌离子。
本发明的有益效果:
(1)本发明的真菌菌株LP-16具有生长快,菌丝表面积大,吸附量大,吸附能力强的优点,可以有效去除或回收含锌废水中的锌离子。
(2)本发明的处理含锌废水的方法具有“低投入,高产出”的优点。
(3)本发明的处理含锌废水的方法中,无需添加大量的化学药剂,从而避免了后续的大量沉淀泥渣等废物的产生。
保藏信息
分类命名:尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum);
保藏日期:2013年8月16日;
保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称:CGMCC),地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,100101;
保藏编号:CGMCC No.8037。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。
实施例1真菌菌株LP-16的分离
本发明的真菌菌株LP-16的分离包含以下步骤:
(1)将10克受重金属污染的新鲜土样装入含有90毫升无菌水的三角瓶中;
(2)用玻璃珠打散,搅匀,制成土壤悬液;
(3)利用涂布法将土壤悬液涂布在分离培养基平板上,所述分离培养基的组成为:无水醋酸钠0.2406g/L,酵母抽提物0.15g/L,琼脂15g/L,氯霉素0.1g/L,Zn2+50mg/L,0.05g/L的MgSO4·7H2O和0.005g/L的K2HPO4,其余为去离子水,且pH=7.0,120℃高温高压灭菌30分钟;
(4)将所涂布的分离培养基在30℃的条件下培养2~4天,获得单个菌株;
(5)将所述单个菌株接入新鲜的所述分离培养基中继续进行分离培养,获得纯化的菌株;
(6)对步骤(5)中得到的纯化菌株重复步骤(5)的操作3~5次,以确保所得到的菌株为完全纯化的单个菌株,获得本发明的真菌菌株并且于4℃保存。
实施例2菌剂的制备
本发明中的菌剂的制备包含以下步骤:
1)Petri Dishes培养:将已经纯化的原始菌种(Fusarium oxysporum)在无菌条件下分别接种于固体培养基上,室温(25℃)条件下培养5天;固体培养基具有以下组成:马铃薯浸粉5g/L,葡萄糖20g/L,琼脂15g/L,氯霉素0.1g/L;
2)一级种子培养:将步骤1)培养的菌种在无菌条件下分别接种于液体培养基,室温(25℃)条件下培养6天,制得一级种子悬液;液体培养基具有以下组成:马铃薯浸粉5g/L,葡萄糖20g/L,氯霉素0.1g/L;
3)二级种子培养:按液体培养基的体积比为10%的接种量,将一级种子 分别接种到2.5L的发酵罐中,发酵罐内培养液的总体积为1.5L,适当曝气,培养6天,制得二级种子;
4)混合发酵培养:按液体培养基的体积比为15%的接种量,将二级种子接种到10L的发酵罐中,发酵罐内的培养基总体积为7L,进行高密度发酵培养,获得菌剂。
实施例3废水中锌离子浓度对真菌LP-16吸附锌离子能力的影响
配制pH值为6.0的液态扩大培养基6等份,每份培养基体积为150mL,装入250mL三角瓶中。这6瓶溶液中分别含有Zn2+浓度为12、24、36、48、60、120mg/L。在这6瓶液体培养基中接种本发明真菌LP-16菌体,反应温度为25℃,振荡培养6小时,转速为120RPM,将含菌体的溶液进行离心,测量离心后液体中Zn2+浓度,观察菌体生长状态以及菌体进行吸附的程度,不同锌离子浓度的废水中真菌LP-16菌株吸附Zn2+的效果如表1所示。
表1、废水中锌离子浓度对菌株吸附锌离子能力的影响
| 锌离子浓度(mg/L) |
吸附后浓度(mg/L) |
吸附效率 |
| 12 |
3.33 |
72.25% |
| 24 |
9.1 |
62.08% |
| 36 |
14.7 |
59% |
| 48 |
27.9 |
41.88% |
| 60 |
29.9 |
50.17% |
| 120 |
68.3 |
43.08% |
表1结果表明,随着锌离子浓度的增加,该菌体对锌离子的吸附逐渐降低,锌离子浓度的继续增加反而会影响该菌种的生长,继而影响对锌离子的吸 附效率。
实施例4菌体投加量对真菌LP-16吸附废水中锌离子能力的影响
配制pH值为6.0的液态扩大培养基,体积为150mL,装入250mL三角瓶中。溶液中含有Zn2+浓度为60mg/L。在培养液中分别添加0.5、1、2、5、10g的真菌LP-16菌体,反应温度为25℃,振荡培养6小时,转速120RPM,将培养好的菌悬液离心,测量离心后液体中Zn2+浓度,观察菌体生长状态以及菌体进行吸附的程度,不同菌体投加量下真菌LP-16吸附废水中锌离子的效果见表2。
表2、菌体投加量对菌株吸附锌离子能力的影响
由表2结果可知,在投加量为5g菌体时最为经济,性价比最高。
实施例5反应pH值对真菌LP-16从废水中回收锌离子能力的影响
配制pH值分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0的液态扩大培养基,体积为150mL,装入250mL三角瓶中。溶液中含有Zn2+浓度为60mg/L。在培养液中接种2g的真菌LP-16菌体,反应温度为25℃,振荡培养6小时,转120RPM,速将培养好的菌悬液离心,测量离心后液体中Zn2+浓度,观察菌体生长状态以及菌体 进行吸附的程度,不同反应pH值下真菌LP-16吸附锌离子的效果见表3。
表3、pH值对菌株吸附锌离子能力的影响
表3结果可见,菌株在pH为5.0时,吸附效率最高,PH为6.0和7.0时次之,说明:真菌LP-16在pH为5.0-7.0之间的吸附效率最好。
实施例6反应温度对真菌LP-16吸附废水中锌离子能力的影响
配制pH值为6.0的液态扩大培养基,体积为150mL,装入250mL三角瓶中。溶液中含有Zn2+浓度为60mg/L,在培养液中接种2g真菌LP-16菌体,反应温度分别为15、20、25、30℃,振荡培养6小时,转速120RPM,将培养好的菌悬液离心,测量离心后液体中Zn2+浓度,观察菌体生长状态以及菌体进行吸附的程度,不同反应温度下真菌LP-16吸附锌离子的效果见表4。
表4、反应温度对菌株吸附锌离子能力的影响
表4结果表明,在反应温度在15-30℃之间时,真菌LP-16菌体对于废水中锌离子的吸附均有不错的效果,尤其是在20-30℃之间,表现出吸附效率逐渐提升,表明该温度区间内,具体吸附效果越来越好。
实施例7振荡时间对真菌LP-16吸附废水中锌离子能力的影响
配制pH值为6.0的液态扩大培养基,体积为150mL,装入250mL三角瓶中。溶液中含有Zn2+浓度为60mg/L。在培养液中接种2g的真菌LP-16菌体,反应温度为25℃,分别振荡培养10min、30min、2h、4h、6h,转120RPM,速将培养好的菌悬液离心,测量离心后液体中Zn2+浓度,观察菌体生长状态以及菌体进行吸附的程度,不同振荡时间的条件下真菌LP-16吸附锌离子的效果见表5。
表5、不同振荡时间对菌株吸附锌离子能力的影响
表5结果表明,在振荡时间为10min-6h的范围内,菌体的吸附效果较好;特别是,在震荡时间为2h时吸附效率最高,表明此时的菌体吸附效果最好。
申请人声明,本发明通过上述实施例来说明本发明的,但本发明并不局限于上述,即不意味着本发明必须依赖上述才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了,对本发明的任何改进,对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等,均落在本发明的保护范围和公开范围之内。