CN103704202A - 一种矮马精液冷冻保存的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种矮马精液冷冻保存的方法，将矮马精液与特别研制的冷冻保存稀释液混合后，进行程序化降温，最后保存于液氮中。本发明的冷冻保存稀释液可以有效延长矮马精子的使用寿命；通过程序化降温有效地控制降温速度，避免精子受到损伤，提高冷冻效果和解冻后精子的质量。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种动物精液保存的方法，尤其涉及一种矮马精液冷冻保存的方法。
背景技术
精液冷冻保存是利用超低温抑制精子细胞的代谢活动，使之处于几乎静止的状态，进行长期保存，解冻后又能回复到正常生理状态。精液冷冻解冻后结合人工授精技术能充分扩大优秀种公畜的利用率，加快品种改良进程和快速扩繁良种畜禽。精液冷冻保存方法的完善对现代畜牧业发展起着非常重要促进作用。
动物精液冷冻保存技术领域研究的历史悠久，已经开发出许多种动物的精液冷冻保存方法，但不同物种的保存方法存在差异。关于马的精液冷冻保存，国外已经有数十种马精液冷冻稀释液配方的文献报道，国内新疆农业大学、新疆畜牧科学院畜牧研究所、塔里木大学等开展了马精液的冷冻保存方面的研究。现有的马精液的冷冻保存液和冷冻方法仍然不够成熟，主要通过液氮熏蒸进行冷冻，降温速度不能很好地控制，剧烈降温可能会导致精子损伤甚至死亡，冷冻精子质量差，复苏率低，冷冻效果不稳定，难以规模化推广应用。
矮马指成年体高在106厘米以下的马，英文中称之为pony（与专指大马的horse相对应）。因其小巧玲珑、天资聪颖、性情温顺而深受人们的喜爱。可用于观赏、娱乐、实验和劳役，也是小朋友和老年人很好的“朋友”。因为数量稀少，更显得尤为珍贵，可以说是马中之宝。从文献检索来看，目前还没有涉及矮马精液冷冻保存方面的研究。
发明内容
本发明的目的在于针对上述技术问题，提供一种可以有效提高矮马精液冷冻保存的质量和效果的矮马精液冷冻保存的方法。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种矮马精液冷冻保存的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将鸡蛋的卵黄经高速离心后，取上层卵黄备用；
（2）制备冷冻保存稀释液，每100mL冷冻保存稀释液中，包括葡萄糖3.4～3.8g、乳糖7.0～7.4g、柠檬酸钠0.2～0.6g、上层卵黄4.8～5.2mL、二甲基酰胺4.8～5.2mL、维生素E0.04～0.08g、青霉素8～12万单位、链霉素8～12万单位；制备时先将除上层卵黄以外的其他组分溶解于适量无菌蒸馏水中，再加入上层卵黄，搅拌25～35min，再用孔径0.3～0.5μm的滤器过滤，即得冷冻保存稀释液。
（3）采集矮马精液后，过滤去除胶状物质，经离心后除去上层精清；
（4）按精液、冷冻保存稀释液的体积比3:1的比例，将冷冻保存稀释液缓慢倒入预处理后的精液中，轻轻摇晃使精液与稀释液充分接触、混匀；
（5）将稀释后的矮马精液分装至细管中封口，使用程序降温仪进行程序化降温，降温程序为：预设20℃启动程序，缓慢降温至5℃停留5min，快速降温至-10℃停留2min，随后快速降温，当温度降至-43℃后，快速取出细管转入液氮中保存。
优选地，步骤（1）中，鸡蛋的卵黄离心时的转速为10000r/m，离心时间为30min。
优选地，步骤（2）中，每100mL冷冻保存稀释液中，包括葡萄糖36g、乳糖7.2g、柠檬酸钠0.4g、上层卵黄5.0mL、二甲基酰胺5.0mL、维生素E0.06g、青霉素10万单位、链霉素10万单位；制备时制备时先将除上层卵黄以外的其他组分溶解于适量无菌蒸馏水中，再加入上层卵黄，搅拌30min，再用孔径0.4μm的滤器过滤，即得冷冻保存稀释液。
优选地，步骤（3）中，采集矮马精液后，用灭菌的双层200目尼龙网过滤去除胶状物质，离心时的转速为1200r/min，离心时间为7min。
优选地，步骤（4）中，冷冻保存稀释液需先预热到37℃。
优选地，步骤（5）中，稀释后的矮马精液先在25℃静置1h，再分装至细管中封口。
通过以上技术方案，本发明的有益效果如下：
本发明使用的冷冻保存稀释液可以有效延长矮马精子的使用寿命；通过程序化降温有效地控制降温速度，避免精子受到损伤，提高冷冻效果和解冻后精子的质量。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
实施例
1.配制冷冻保存稀释液
（1）用75%的酒精擦拭消毒鸡蛋壳，待酒精挥发干后，敲破蛋壳，去除蛋清后把完整的卵黄倒在无菌滤纸上，用干净的滤纸把残余的蛋清吸干，用不带针头的一次性注射器刺破卵黄膜，吸取卵黄。把卵黄装入10ml离心管中，10000r/m高速离心30分钟，吸取中上层卵黄备用；
（2）配制冷冻保存稀释液，每100mL矮马精液冷冻保存稀释液中，各组分的含量为：葡萄糖3.6g、乳糖7.2g、柠檬酸钠0.4g、上层卵黄5.0mL、二甲基酰胺5.0mL、维生素E0.06g、青霉素10万单位、链霉素10万单位；配制方法：将上述除上层卵黄以外的组分先溶解于适量的无菌蒸馏水中，再加入上层卵黄，然后用磁力搅拌器搅拌稀释液30min，再用孔径0.4μm的滤器过滤，制成冷冻基础稀释液。
2.矮马精液的冷冻保存
（1）采精前30min左右，将精液冷冻保存稀释液置于37℃水浴中预热。
（2）采用假阴道法收集矮马精液，用灭菌的双层200目尼龙网过滤去除胶状物质，然后分装入离心管中，1200r/min离心7min,去除上层精清。活力即直线运动精子比例达到70%以上，可以冷冻；其中，所述矮马为德保矮马。
（3）按精液、稀释液的体积比3:1的比例，将冷冻保存稀释液沿容器壁缓慢倒入预处理后的精液中，轻轻摇晃使精液与稀释液充分接触、混匀。
（4）将稀释后的精液混合溶液置于室温（25℃）中静置1小时后，分装于0.5mL细管中封口。
（5）将程序降温仪提前工作预冷至程序设定设定的起始温度，将装有精液的细管插入降温仪的冷冻槽，进行程序化降温冷冻，降温程序为：预设20℃启动程序，缓慢降温至5℃停留5min，快速降温至-10℃停留2min，随后快速降温，当温度降至-43℃后，快速取出细管转入液氮中保存。所述程序降温仪的型号为CL5500，产地澳大利亚。
试验例1冻精用于人工授精试验
将按实施例所得的德保矮马冻精解冻后，采用直肠把握法输精入发情母马的子宫体深部。试验人工授精发情母马16匹，3月后妊娠检查确定7匹母马怀孕。
试验例2冻保存稀释液的研制
（1）按表1中5种配方分别配制精液冷冻保存基础稀释液，冷冻保存德保矮马精液，并对解冻后的精子活力和精子运动速度（平均直线速度VSL、平均曲线速度VCL、平均路径速度VAP）进行评价，确定较优基础稀释液配方。
表1矮马精液冷冻保存基础稀释液配方
注：以上5种配方中上层卵黄、甘油和DMSO的单位是mL，其他成分的单位是g，各个配方的基础稀释液体积为100mL，用无菌蒸馏水溶解，都添加青霉素、链霉素各10万单位。
表2不同的冷冻稀释液配方对德保矮马精液的冷冻保存效果
注：同一行中具有不同上标字母者表示差异显著（P＜0.05），相同表示差异不显著（P＞0.05）.
根据表2数据，综合考虑解冻后精液的活力和精子运动速度参数，配方Ⅱ冷冻保存基础稀释液用于冷冻保存德保矮马的效果最佳，可作为后续研究的基础配方。
（2）在配方Ⅱ冷冻保存基础稀释液中添加不同浓度的甘油或二甲基酰胺（DMF）对德保矮马精液冷冻保存效果的影响。
表3添加不同浓度甘油对矮马精液冷冻保存效果的影响
注：同一行中具有不同上标字母者表示差异显著（P＜0.05），相同表示差异不显著（P＞0.05）.
表4添加不同浓度DMF对矮马精液冷冻保存效果的影响
注：同一行中具有不同上标字母者表示差异显著（P＜0.05），相同表示差异不显著（P＞0.05）。
由表3可知，在冷冻保存基础稀释液中添加6%甘油冷冻保存德保矮马精液，冻精解冻后精子的活力、平均运动速度、畸形率、顶体完整率均好于添加其它浓度甘油的稀释液。
根据表4数据，综合分析德保矮马冻精解冻后各项评价指标，发现基础稀释液中添加5%DMF的冷冻保存效果最好。
（3）在上述改进的冷冻保存基础稀释液中，添加不同浓度的维生素E（Vit E）对德保矮马精液冷冻保存效果的影响。
表5添加不同浓度维生素E对德保矮马精液冷冻保存效果的影响
注：同一行中具有不同上标字母者表示差异显著（P＜0.05），相同表示差异不显著（P＞0.05）。
根据表5数据，综合分析德保矮马冻精解冻后各项评价指标，发现在基础稀释液中添加600μg/mL维生素E能显著提高解冻后精子的顶体完整率和体外成活时间。
通过上述三个试验的对比优化，确定德保矮马精液冷冻保存稀释液的配方：每100mL稀释液中，包括葡萄糖3.6g、乳糖7.2g、柠檬酸钠0.4g、上层卵黄5.0mL、二甲基酰胺5.0mL、维生素E0.06g、青霉素10万单位、链霉素10万单位。
Claims (6)
1.一种矮马精液冷冻保存的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将鸡蛋的卵黄经高速离心后，取上层卵黄备用；
（2）制备冷冻保存稀释液，每100mL冷冻保存稀释液中，包括葡萄糖3.4～3.8g、乳糖7.0～7.4g、柠檬酸钠0.2～0.6g、上层卵黄4.8～5.2mL、二甲基酰胺4.8～5.2mL、维生素E0.04～0.08g、青霉素8～12万单位、链霉素8～12万单位；制备时先将除上层卵黄以外的其他组分溶解于适量无菌蒸馏水中，再加入上层卵黄，搅拌25～35min，再用孔径0.3～0.5μm的滤器过滤，即得冷冻保存稀释液。
（3）采集矮马精液后，过滤去除胶状物质，经离心后除去上层精清；
（4）按精液、冷冻保存稀释液的体积比3:1的比例，将冷冻保存稀释液缓慢倒入预处理后的精液中，轻轻摇晃使精液与稀释液充分接触、混匀；
（5）将稀释后的矮马精液分装至细管中封口，使用程序降温仪进行程序化降温，降温程序为：预设20℃启动程序，缓慢降温至5℃停留5min，快速降温至-10℃停留2min，随后快速降温，当温度降至-43℃后，快速取出细管转入液氮中保存。
2.按照权利要求1所述的矮马精液冷冻保存的方法，其特征在于：步骤（1）中，鸡蛋的卵黄离心时的转速为10000r/m，离心时间为30min。
3.按照权利要求1所述的矮马精液冷冻保存的方法，其特征在于：步骤（2）中，每100mL冷冻保存稀释液中，包括葡萄糖36g、乳糖7.2g、柠檬酸钠0.4g、上层卵黄5.0mL、二甲基酰胺5.0mL、维生素E0.06g、青霉素10万单位、链霉素10万单位；制备时制备时先将除上层卵黄以外的其他组分溶解于适量无菌蒸馏水中，再加入上层卵黄，搅拌30min，再用孔径0.4μm的滤器过滤，即得冷冻保存稀释液。
4.按照权利要求1所述的矮马精液冷冻保存的方法，其特征在于：步骤（3）中，采集矮马精液后，用灭菌的双层200目尼龙网过滤去除胶状物质，离心时的转速为1200r/min，离心时间为7min。
5.按照权利要求1所述的矮马精液冷冻保存的方法，其特征在于：步骤（4）中，冷冻保存稀释液需先预热到37℃。
6.按照权利要求1所述的矮马精液冷冻保存的方法，其特征在于：步骤（5）中，稀释后的矮马精液先在25℃静置1h，再分装至细管中封口。
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| CN201310674230.1A Pending CN103704202A (zh) | 2013-12-11 | 2013-12-11 | 一种矮马精液冷冻保存的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103704202A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104161036A (zh) * | 2014-07-15 | 2014-11-26 | 西北农林科技大学 | 家畜精液冷冻保存用抗冻剂、稀释液及其应用 |
| CN106259307A (zh) * | 2016-08-24 | 2017-01-04 | 新疆畜牧科学院畜牧研究所 | 一种马精子低温及冷冻保存稀释液 |
| CN107232179A (zh) * | 2016-03-29 | 2017-10-10 | 中国农业大学 | 一种提高精液低温/冷冻保存品质的精液稀释液及其应用 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| EP0969850B1 (fr) * | 1997-02-25 | 2001-06-20 | Institut National De La Recherche Agronomique | Dilueur de sperme comprenant du phosphocaseinate natif ou de la beta-lactoglobuline, son procede de preparation et ses utilisations |
| CN101647427A (zh) * | 2009-08-26 | 2010-02-17 | 塔里木大学 | 马属动物精液保存稀释液及其生产方法和使用方法 |
| CN102578079A (zh) * | 2012-02-08 | 2012-07-18 | 青岛德瑞骏发生物科技有限公司 | 马属动物精液稀释基础液及其配制方法和使用方法 |
| CN103120155A (zh) * | 2013-02-05 | 2013-05-29 | 新疆维吾尔自治区畜牧科学院畜牧科学研究所 | 一种马精子冷冻保存液及其冷冻方法 |
-
2013
- 2013-12-11 CN CN201310674230.1A patent/CN103704202A/zh active Pending
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| CN106259307B (zh) * | 2016-08-24 | 2019-03-01 | 新疆畜牧科学院畜牧研究所 | 一种马精子低温及冷冻保存稀释液 |
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Application publication date: 20140409 |