CN103804380B - 以IKK-β为靶点的2-氨基-8-取代鸟嘌呤衍生物、应用及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了以IKK-β为靶点的2-氨基-8-取代鸟嘌呤衍生物、应用及其制备方法，本发明的化合物对A549细胞的抑制活性随着给药浓度的增加，其抑制率也会增加，但该类化合物对b16-f10，H460和U251细胞株基本无抑制作用，这种选择性的抑制作用对于其作为特定抗肿瘤药物具有特殊的意义。
Description
技术领域
本发明属于抗肿瘤药物和有机合成领域，具体而言，涉及一种以IKK-β为靶点的2-氨基-8-取代鸟嘌呤衍生物、应用及其制备方法。
背景技术
蛋白酪氨酸激酶（proteintyrosinekinases,PTKs）是一类催化ATP上γ-磷酸转移到蛋白酪氨酸残基上的激酶，能催化多种底物蛋白质酪氨酸残基磷酸化，在细胞生长、增殖、分化中具有重要作用。因此在包括癌症和其他许多疾病的治疗研究中,酪氨酸激酶都是研究的目标和对象。通过发展选择性的酪氨酸激酶抑制剂（tyrosinekinaseinhibitor，TKI）来阻断或调控由这些信号通路异常产生的疾病已成为抗肿瘤研究的一个有前景的策略。
成纤维细胞生长因子受体（FibroblastGrowthFactorReceptor，FGFRs）是一类穿膜的酪氨酸激酶受体，研究表明，FGFRs的基因变化及其表达量的变化与多种疾病的发生有关。例如：对正常乳腺上皮细胞和乳腺癌细胞表达FGFR-1进行了检测，发现乳腺癌细胞表达FGFR-1远比正常乳腺细胞高；RitaS等发现软骨发育不全性侏儒症(A-ehondroplasia，ACH)的病因和FGFR-3基因的点突变有关；有报道，在形成增殖性玻璃体视网膜病的成纤维细胞、神经胶质细胞和视网膜色素上皮细胞上均有FGFR的表达；另外，在膀胱癌、胃癌、结肠癌、子宫内膜癌、前列腺癌、纤维瘤、横纹肌肉瘤、神经胶质瘤和黑色素瘤等多种肿瘤细胞中，均发现FGF/FGFR的突变或高水平表达。因此，FGFR被视为肿瘤等疾病的治疗靶标之一而备受关注。
而FGFR与成纤维细胞生长因子(FibroblastGrowthFactor，FGFs)结合所构成的FGF/FGFR信号传递能够介导多条信号转导通路，对正常细胞和肿瘤细胞的增殖、分化，以及肿瘤的生长和转移、血管生成、神经形成等方面均发挥重要的调节作用。在FGF/FGFR信号转导通路中，主要的信号途径是ras→MAPK和PI3K/AKT途径。当配体FGF与受体结合后，触发受体二聚体化，使受体发生自身磷酸化，从而与下游的接头蛋白Grb2的SH2结构域结合，然后依次与SOS、ras结合，从而使ras激活，再依次激活Raf、MEK、MAPK等，该途径的激活主要与细胞增殖和分化有关。受体磷酸化后，还能与PLCγ结合，激活PI3K和AKT等信号途径，或者通过ras偶联激活PI3K/AKT途径，该途径的激活主要是促进细胞生存、抵抗细胞凋亡。
因此如果能研发高选择性的成纤维细胞生长因子酪氨酸激酶小分子抑制剂(FGFRTKI)，则能够抑制FGFR信号传递，抑制肿瘤细胞的损伤修复、使细胞分裂阻滞在G1期、诱导和维持细胞凋亡、抗新生血管形成等，从而达到抗肿瘤的效果。因此，研发高选择性、高效率的FGFR抑制剂是当前医药工作者的追求目标与迫切任务。
发明内容
本发明的目的是提供一种2-氨基-8-取代鸟嘌呤衍生物、应用及其制备方法，为了实现本发明的目的，拟采用如下技术方案。
本发明一方面涉及一种以IKK-β为靶点的2-氨基-8-取代鸟嘌呤衍生物，其特征在于所述的2-氨基-8-取代鸟嘌呤衍生物具有如下式所示的结构：
在本发明的一个优选实施方式中，所述的R选自：苯基、2'，4'-二甲基苯基、2'-甲氧基苯基、吲哚-3'-基、2'，3'-二甲氧基苯基、4'-溴吲哚-3'-基。
本发明另一方面还涉及上述2-氨基-8-取代鸟嘌呤衍生物的制备方法，其特征在于通过如下所示的反应进行：
本发明另一方面还涉及上述2-氨基-8-取代鸟嘌呤衍生物的应用，所述的应用为在体外选择性抑制人肺腺癌细胞生长中的应用。
在本发明的另一方面，还涉及上述2-氨基-8-取代鸟嘌呤衍生物的应用，所述的应用为在制备选择性治疗肺腺癌的药物中的应用。
在本发明的另一方面，还涉及上述2-氨基-8-取代鸟嘌呤衍生物的应用，所述的应用为在制备与FGFR-1受体相关疾病的药物中的应用。
本发明的化合物对A549细胞的抑制活性随着给药浓度的增加，其抑制率也会增加，但该类化合物对b16-f10，H460和U251细胞株基本无抑制作用，这种选择性的抑制作用对于其作为特定抗肿瘤药物具有特殊的意义。
具体实施方式
实施例1：
合成路线
M1：R=苯基M4：R=2'，4'-二甲基苯基
M2：R=2'-甲氧基苯基M5：R=吲哚-3'-基
M3：R=2'，3'-二甲氧基苯基M6：R=4'-溴吲哚-3'-基
实验操作
（1）2,4,5-三氨基-6-羟基嘧啶硫酸盐具体操作参见文献（邵伟清,毛宏伟.2,4,5-三氨基-6-羟基嘧啶硫酸盐的合成.中国医药工业杂志2002,33(12):579.）。
（2）2-氨基-8-取代鸟嘌呤衍生物合成方法：以合成M2为例：称取2,4,5-三氨基-6-羟基嘧啶硫酸盐0.239g（1.0mmol）,2-甲氧基苯甲醛0.136g(1.0mmol)于100ml圆底烧瓶中，加入40ml二甲基亚砜。置于80℃油浴内,加回流装置，恒温磁力搅拌反应。用薄层层析硅胶板跟踪反应，待反应结束后,将反应液冷却至室温，加水至沉淀析出，抽滤（溶剂DMSO收集于废液缸中），用热乙醇洗涤，置于干燥器中干燥得粗产品M2。用NaOH溶液溶解所得干燥产物，再用盐酸调PH至7，即可得到重结晶后的产物，产品颜色为浅黄色。因此本实验选用80℃为反应条件，5小时后反应基本完成。反应液冷却加水，即可使产物以沉淀形式析出。对产物用NaOH溶解后，盐酸调PH至中性，即可纯化产物使之重新析出，均有较高产率。M1-M6的产率以及相关的表征参见表1和表2
表1
表2
目标化合物的性状及其溶解性：化合物M（1-6）都为浅黄色固体；化合物M（1-6）溶于DMSO、NaOH、浓盐酸、微溶于DMF，不溶于二氯甲烷、石油醚、乙醚、丙酮、甲醇、乙醇及水。
药效学活性实验方法
1A549细胞株的培养、冻存、复苏
A549细胞为人肺腺癌细胞，属于传代细胞系，可稳定地传代培养。
A549细胞株的培养：A549细胞从液氮罐取出，迅速至于37℃恒温水中，在2-3min中内将内部培养基完全融化，800r/min离心3-5min，加入含10%FBS、1%双抗的RPMIMEDIUM1640和DMEM培养基，置37℃、5%CO2温箱培养中培养24使细胞贴壁后更换新鲜培养基，每隔3天0.5%胰酶消化后按1:3比例传代。
A549细胞株的冻存：按常规消化法处于对数生长期的细胞培养物，制成单细胞悬液，计算细胞总数，活细胞数量不能少于90%，将细胞悬液800r/min离心5min，弃去上清液，加入冷冻液后分装在冻存小管内，分级冷冻，最后投入液氮保存。
A549细胞株的复苏：从液氮罐中取出存有A549细胞的冻存管，放入水浴中融化。将细胞悬液800r/min离心5min。用1ml枪头将上清液去除，加入1ml预热的细胞培养液将细胞吹散开，再加入新鲜培养液重新悬浮细胞转入培养盒，倒置显微镜下观察，37℃、5%CO2培养。24h后，更换新的培养液。常规传代培养。
上述方法同样可用于b16-f10（小鼠皮肤黑色素瘤细胞）、H460（人肺癌细胞）、U251（胶质瘤细胞）的培养、冻存和复苏。
2所得化合物的细胞毒性实验（MTT法）
A549细胞长满至80%-90%后，用0.5%胰酶消化后制备成单细胞悬液，收集对数期细胞，细胞计数后调整细胞悬液浓度。分于96孔板内，5×103/孔，置于CO2孵箱（37℃、5%CO2）培养24h后，细胞贴壁且生长良好，吸除全部培养液。加入不同浓度的药物，每个浓度设6个复孔，每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），于CO2孵箱中继续培养4h后，小心吸去孔内培养液，每孔加入150ul二甲基亚砜（DMSO），置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光值（OD）,记录结果（DMSO为对照组），用GraphpadPrims处理数据得IC50。实验数据均以均数±标准差（x±s）表示；所得结果见表3。
3筛选所得化合物对FGFR-1的抑制率实验
在该实验中，通过CaliperMobilityShiftAssay方法，在体外对所得的12个化合物进行了对FGFR-1的抑制活性测试。测试药物分为0.1uM,1uM,10uM三个浓度，Staurosporine为参考物。
实验方法如下：
（1）将化合物浓度最终稀释至50uM,5uM和0.5uM，于384孔板中备用，以100%DMSO为对照组，250mMEDTA为lowcontrol。
（2）将FGFR1酶加入1.25x的缓冲液中制备2.5x酶溶液。
（3）将ATP和含FAM标记的多肽加入1.25x缓冲液中制备2.5x多肽溶液。
（4）每个孔中加入10μl2.5x上述制备的酶溶液，室温孵育10min。
（5）然后每个孔中加入10μl2.5x上述制备的2.5x多肽溶液，28℃下孵育一段时间后，加入25μlstopbuffer停止反应。
（6）于Caliper上读取数据，并将数据转为抑制率。百分比抑制率=（max-读取数据）/（max-min）*100。Max代表DMSO对照组，min代表lowcontrol。最终所得结果见表4。
表3化合物对A549细胞生长的抑制率
由于计算出的b16-f10（小鼠皮肤黑色素瘤细胞）、H460（人肺癌细胞）、U251（胶质瘤细胞）的MTT结果为负值，说明该类药物对这三种细胞生长并没有抑制作用，而只能对A549细胞产生生长抑制作用。从表3可以看出，随药物浓度增加，药物对A549（人肺腺癌细胞）的生长抑制效果也同时增加，其中M6的效果相对较好，可达到44.61%。根据计算出的对照药物的IC50为12.82μmol/l，对比所合成的化合物，其IC50均大于对照药，说明该类化合物对A549细胞的生长抑制作用不如阳性对照药5-氟脲嘧啶。
表4化合物对FGFR-1的抑制活性
从表4可以看出，M1-6都表现出相对较好的抑制FGFR-1的活性。
以上所述是本发明的优选实施例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (5)
1.一种2-氨基-8-取代鸟嘌呤衍生物，其特征在于所述的2-氨基-8-取代鸟嘌呤衍生物具有如下式所示的结构：
所述的R选自：吲哚-3’-基、4’-溴吲哚-3’-基。
2.权利要求1所述的2-氨基-8-取代鸟嘌呤衍生物的制备方法，其特征在于通过如下所示的反应进行：
3.根据权利要求1所述的2-氨基-8-取代鸟嘌呤衍生物的应用，所述的应用为在体外选择性抑制人肺腺癌细胞生长中的应用。
4.根据权利要求1所述的2-氨基-8-取代鸟嘌呤衍生物的应用，所述的应用为在制备选择性治疗肺腺癌的药物中的应用。
5.根据权利要求1所述的2-氨基-8-取代鸟嘌呤衍生物的应用，所述的应用为在制备与FGFR-1受体相关疾病的药物中的应用。
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