CN104072425B - 苯并咪唑类化合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一类苯并咪唑类化合物及其应用，所述化合物具有通式(I)的结构。该通式化合物由对2‑(3,4,5‑三羟基苯基)‑1H‑苯并咪唑的1位和/或6位进行化合物修饰(即分别引入R1和R2)而获得。本发明的苯并咪唑类化合物能模拟Bim,在体外和细胞内竞争性结合和拮抗Bcl‑2/Mcl‑1蛋白，从而诱导细胞凋亡，是一类活性很高的凋亡诱导剂和抗肿瘤化合物。
Description
技术领域
本发明涉及一类苯并咪唑类化合物，特别涉及2-(3,4,5-三羟基苯基)-1H-苯并咪唑及其苄基，酮类，磺酰类取代衍生物，以及这些化合物在体外、体内的模拟BH3-only蛋白，竞争性结合和拮抗Bcl-2和Mcl-1蛋白，从而诱导细胞凋亡作用和作为抗癌化合物的应用。
背景技术
Bcl-2家族蛋白(B-cell lymphoma 2 family of proteins)是细胞凋亡线粒体内源通路的顶点和核心因子，是调控细胞凋亡的一类关键性家族蛋白。其家族成员包括三个亚族：具有抗凋亡功能的Bcl-2家族蛋白(根据结构差异程度可以进一步分为Bcl-2-like蛋白和Mcl-1-like蛋白)；具有促凋亡功能的Bax,Bak；仅含有BH3区域的BH3-only蛋白，如Bad,Bim等。这三类蛋白通过其共有的BH3结构域相互作用,Bad,Bim等BH3-only蛋白通过竞争结合具有抗凋亡功能的蛋白，释放凋亡的“执行者”－Bax,Bak，启动凋亡通路。而Bim是一个广谱的BH3-only蛋白，可以同时高亲和力的拮抗于Bcl-2-like蛋白和Mcl-1-like蛋白。因此，通过小分子模拟Bim等BH3-only蛋白可以“代替”其行使其促调往功能，并且，这种特异性拮抗Bcl-2蛋白的药物，将通过专一诱导肿瘤细胞凋亡，实现高选择性、安全、高效、低痛苦抗癌的目标。
但到目前为止，模拟Bim小分子主要分为三类。天然产物棉子酚(Gossypol)，ABT-263类化合物以及三联苯类化合物。它们都是BH3类似物，但是它们都存在严重的不足。Gossypol BH3类似程度不足，不是绝对的BH3类似物，因此，具有一定的毒副作用。ABT-263虽然是绝对的BH3类似物，但是不能与Mcl-1作用，不能广谱抑制Bcl-2家族蛋白，实验过程中发现其对Mcl-1高表达的癌细胞表现出的效果不理想和严重的抗性。而三联苯类化合物在体外竞争性结合实验中仅仅表现出微摩尔级别的亲和力，而这样的亲和力远不能高效的诱导细胞凋亡。因此，开发一类高效的，纯粹的，广谱的Bcl-2/Mcl-1抑制剂才能够克服上述分子的缺陷，实现对癌症的安全、高效、低痛苦的治疗。
发明内容
本发明旨在获得更多能够良好靶向Bcl-2家族蛋白(包括Bcl-2和Mcl-1蛋白)的Bim BH3模拟物。
本发明提供一类苯并咪唑类化合物，所述苯并咪唑类化合物具有通式I的结构：
其中：
R1选自H或XR3；
R2选自H、Cl、Br、F或C1-3烷基；
R3选自1个或2个取代基Y取代的苯基，其每一个取代基Y独立选自OH、Br、Cl、NO2、NHCH3、N(CH3)2、CN、苯基或C1-4烷基；
X选自CH2、羰基或磺酰基；
在优选的技术方案中，本发明所述的苯并咪唑类化合物中，所述的R1为H，R2选自Cl、Br、F或C1-3烷基。
再一优选的技术方案中，本发明所述的苯并咪唑类化合物中，所述的R1为XR3，R2为H。
进一步优选的技术方案中，本发明所述苯并咪唑类化合物选自下述化合物1-12：
2-(3,4,5-三羟基苯基)-1H-苯并咪唑(化合物1)；
6-甲基-2-(3,4,5-三羟基苯基)-1H-苯并咪唑(化合物2)；
6-异丙基-2-(3,4,5-三羟基苯基)-1H-苯并咪唑(化合物3)；
1-苄基-2-(3,4,5-三羟基苯基)-苯并咪唑(化合物4)；
1-(2-甲基苄基)-2-(3,4,5-三羟基苯基)-苯并咪唑(化合物5)；
1-(3-甲基苄基)-2-(3,4,5-三羟基苯基)-苯并咪唑(化合物6)；
1-(4-甲基苄基)-2-(3,4,5-三羟基苯基)-苯并咪唑(化合物7)
1-(2-羟基-5-异丙基苄基)-2-(3,4,5-三羟基苯基)-苯并咪唑(化合物9)；
1-苯甲酰基-2-(3,4,5-三羟基苯基)-苯并咪唑(化合物10)；
1-(4-叔丁基苯甲酰基)-2-(3,4,5-三羟基苯基)-苯并咪唑(化合物11)；
1-苯磺酰基-2-(3,4,5-三羟基苯基)-苯并咪唑(化合物12)。
如上述所述，本发明通式I的苯并咪唑类化合物，包括两种化合物，为了表述清楚，当R1为H，R2选自Cl、B、F或C1-3烷基的化合物由通式Ia表示；当R1为XR3，R2为H的化合物由通式Ib表示：
本发明的另一方面提供所述苯并咪唑类化合物的制备方法，其中通式Ia化合物的制备方法，包括如下步骤：
(1)3,4,5-三甲氧基苯甲酸与二氯亚砜按照投料比1g:2.0-4.0mL回流反应0.5-1.5h，得化合物ⅰ；
其中，3,4,5-三甲氧基苯甲酸在二氯亚砜作用下生成酰氯(如化合物ⅰ)，所述二氯亚砜既做反应原料，也可以做反应溶剂；
(2)化合物ⅰ与化合物ⅱ按照投料摩尔比1:2-1:5反应，得化合物ⅲ；
反应时间为7-10h，反应温度为50-70℃，反应溶剂为四氢呋喃；
(3)化合物ⅲ和铁粉按照投料摩尔比1:2-1:4回流反应0.5-1h，得化合物ⅳ；
反应溶剂为冰醋酸；
(4)化合物ⅳ在溴化氢的作用下回流反应0.5～1h,得式Ia的化合物；其中化合物ⅳ在溴化氢的作用下脱甲基,反应溶剂为醋酸/氢溴酸按体积比1:1的混合溶剂，按每100mg化合物ⅳ加入5-10mL醋酸/氢溴酸(1:1)的混合溶剂，所述氢溴酸既做反应原料，也做溶剂，醋酸为溶剂。
通式Ib化合物的制备方法，包括如下步骤：
①按照权利要求5所述的步骤(1)～(3)的方法制备得到化合物ⅴ，其中在步骤(2)中所述的化合物ⅱ为邻硝基苯胺；
化合物ⅴ即为R2为H时的化合物ⅳ；
②化合物ⅴ在钠氢作用下，与化合物ⅵ、ⅶ、ⅷ、ⅸ或ⅹ反应，反应产物经分离后，在BBr3作用下脱甲基，得式Ib的化合物；
上述对本发明的苯并咪唑类化合物制备方法的描述中，各个取代基的定义，即对R1、R2、R3、X、Y的定义，均与上述对化合物的描述中的定义相同。
对通过上述方法获得的化合物，本发明通过多种手段检测了它们的BH3类似程度，以及他们对Mcl-1和Bcl-2的抑制能力。结果表明，本发明的上述具有通式I的化合物具有极高的BH3类似程度，可以有效的抑制Mcl-1和Bcl-2蛋白。在通式I的化合物中，2-(3,4,5-三羟基苯基)具有保守性和特殊性。分子对接结果显示，该基团可以模拟Bimα-螺旋的D67，与Mcl-1蛋白的N260和R263形成三个氢键。这一“氢键网络”对本发明化合物与Mcl-1蛋白的结合至关重要。
对上述通式I的化合物，本发明通过细胞实验检测了它们对多种肿瘤细胞系的抑制作用。结果表明，本发明的上述化合物可以高效的诱导多种肿瘤细胞系凋亡，而对正常细胞没有杀伤作用。
基于此，本发明指出上述通式I的苯并咪唑类化合物可以用于制备BH3的α-螺旋模拟物Bcl-2家族蛋白抑制剂，并进一步用于制备抗肿瘤药物。所述的Bcl-2家族蛋白抑制剂或相应的抗肿瘤药物可以是化合物的单质剂型也可以是有效量的通式I的苯并咪唑类化合物与适量的药用辅剂混合形成的组合制剂。
本发明所述的2-苯基苯并咪唑类化合物模拟BH3-only蛋白α-螺旋，竞争性结合和拮抗Bcl-2和Mcl-1蛋白，从而诱导细胞凋亡作用，实现其作为抗癌化合物的应用。
附图说明
图1是化合物6对诱导U937细胞凋亡的流式细胞仪分析结果；
图2是化合物7与Bim/Mcl-1晶体中Bim结构对比示意图；
图3是化合物1与Mcl-1结合模式预测图(Docking结合模式图)；
图4是化合物4中与Mcl-1结合模式预测图(Docking结合模式图)；
图5是化合物4依赖Bax/Bak的细胞毒性实验结果，其中Gossypol为非特异性阳性对照。
具体实施方式
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用试剂等均可从化学或生物试剂公司购买。
本发明提供的一类苯并咪唑类化合物，具有通式I的结构：
其中：
R1选自H或XR3；
R2选自H、Cl、Br、F、或C1-3烷基；
R3选自1个或2个取代基Y取代的苯基，其每一个取代基Y独立选自OH、Br、Cl、NO2、NHCH3、N(CH3)2、CN、苯基或C1-4烷基；
X选自CH2、羰基或磺酰基；
在本发明优选的技术方案中，所述及的R1为H，R2选自H、Cl、Br、F、或C1-3烷基；其中优选地R2选自C1-3烷基。在本发明的技术方案中，R2为异丙基时，制备得到的苯并咪唑类化合物也具有很好的BH3类似程度，可以有效的抑制Mcl-1和Bcl-2蛋白。
在本发明优选的技术方案中，所述及的R1为XR3，R2为H；其中优选地X选自CH2、羰基，R3选自Ph-p-Y、Ph-m-Y，Y选自C1-4烷基、Br、羟基；进一步优选地X选自CH2、羰基，R3选自Ph-p-Y，Y选自C1-4烷基、Br；最优选地X选自CH2、羰基，R3选自Ph-p-Y，Y选自C1-4烷基。
本发明以上所述及的所有技术方案中，使用的术语“烷基”包括直链烷基和支链烷基。如提及单个烷基如“丙基”，则只特指直链烷基，如提及单个支链烷基如“异丙基”，则只特指支链烷基。又如“C1-4烷基”包括C1-3烷基、甲基、乙基、正丙基、异丙基和叔丁基。类似的规则也适用于本说明书中使用的其它基团。
本发明以上所述及的所有技术方案中，所述Ph-(o,m,p)Y中的o﹑m﹑p是分别指邻位取代、间位取代和对位取代；即m-Y是指间位的取代基Y，p-Y是指对位的取代基Y。
实施例1：2-(3,4,5-三羟基苯基)-1H-苯并咪唑(化合物1)的制备
(1)中间体A的合成
取10.61g 3,4,5-三甲氧基苯甲酸，加入25mL氯化亚砜，回流至固体消失(大约30min)，蒸去多余的氯化亚砜，稍冷至温度低于70℃，得中间体A(3,4,5-三甲氧基苯甲酰氯)加入一定量的四氢呋喃(下一步反应的溶剂)，倒入锥形瓶，密封，放入-20℃冰箱备用。
(2)中间体B的合成
取690mg(5mmol)邻硝基苯胺,加入10mL THF，4mL三乙胺，冰浴下滴加15mmol中间体A(滴加时，生产大量白色固体，并有白烟)，滴加完毕，70℃，氮气保护下，反应7h，倒入水中，析出固体，过滤固体，固体用乙醇/水(1：1)重结晶，过滤得1050mg中间体B(3,4,5-三甲氧基苯甲酰-2-硝基苯胺)，为棕黄色絮状晶体，产率65％。
(3)中间体C的合成
取650mg中间体B，加入448mg(4.0eqv.)还原铁粉和10mL醋酸溶液，氮气保护下回流30min，倒入水中，析出固体，过滤，滤出的固体用乙酸乙酯(250mL)溶解，滤去不溶物，滤液用氢氧化钠溶液洗涤两次，再用饱和食盐水洗涤2次，无水硫酸钠干燥，旋干，固体用乙醇/水(1：1)重结晶，析出固体，过滤得白色固体，中间体C(2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1H-苯并咪唑)，产率61％。
(4)化合物1的合成
取241mg中间体C，加入6mL HBr和6mL AcOH，氮气保护下回流，点板跟踪反应(大约反应3.5h)，冷却，析出固体，过滤，固体用二氯甲烷洗涤，得灰黑色产品，化合物1，产率73％。
化合物1的1H NMR测定结果以及质谱测定结果如下：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:14.98(s,1H,NH),9.73(s,2H,2OH),9.60(s,1H,OH),7.76(d,J＝4Hz,2H,Ar-CH),7.50-7.52(m,2H,Ar-CH),7.25(s,2H,Ar-CH).TOF MS(EI+):C13H10N2O3,理论值：242.0691,实测值：242.0694.
实施例2：2-(3,4,5-三羟基苯基)-6-甲基-1H-苯并咪唑(化合物2)的制备
(1)中间体A的合成
按照实施例1步骤(1)的方法制备得中间体A。
(2)中间体B的合成
取760mg(5mmol)4-甲基-2-硝基苯胺，加入10mL THF，4mL三乙胺，冰浴下滴加15mmol中间体A(滴加时，生产大量白色固体，并有白烟)，滴加完毕，70℃，氮气保护下，反应7h，倒入水中，析出固体，过滤固体，固体用乙醇/水(1：1)重结晶，过滤得1125mg产品，中间体B(3,4,5-三甲氧基苯甲酰-2-硝基-4-甲基苯胺)，为棕黄色絮状晶体，产率65％.
(3)中间体C的合成
取692mg中间体B加入448mg(4.0eqv.)还原铁粉和10mL醋酸溶液，氮气保护下回流30min,倒入水中，析出固体，过滤,滤出的固体用乙酸乙酯(250mL)溶解,滤去不溶物，滤液用氢氧化钠溶液洗涤两次，再用饱和食盐水洗涤2次，无水硫酸钠干燥，旋干，固体用乙醇/水(1：1)重结晶，析出固体，过滤得白色固体352mg，中间体C(2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-6-甲基-1H-苯并咪唑)，产率59％.
(4)化合物2的合成
取220mg中间体C，加入5mL HBr和5mL AcOH,氮气保护下回流，点板跟踪反应(大约反应3.5h)，冷却，析出固体，过滤，固体用二氯甲烷洗涤，得灰黑色产品134mg，化合物2，产率78％。
化合物2的1H NMR测定结果以及质谱测定结果如下：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:14.98(s,1H,NH),9.73(s,2H,2OH),9.60(s,1H,OH),7.72(d,J＝4Hz,1H,Ar-CH),7.66(s,1H,Ar-CH)7.56(d,J＝4Hz,1H,Ar-CH),7.25(s,2H,Ar-CH),2.42(s,3H,CH3).TOF MS(EI+):C14H12N2O3,理论值：256.0848,实测值：256.0845。
实施例3：2-(3,4,5-三羟基苯基)-6-异丙基-1H-苯并咪唑(化合物3)的制备
(1)中间体A的合成
按照实施例1步骤(1)的方法制备得中间体A。
(2)中间体B的合成
取900mg(5mmol)4-异丙基-2-硝基苯胺,加入10mL THF,4mL三乙胺，冰浴下滴加15mmol酰氯(滴加时，生产大量白色固体，并有白烟)，滴加完毕，70℃，氮气保护下，反应7h，倒入水中，析出固体，过滤固体，固体用乙醇/水(1：1)重结晶，过滤得1103mg产品，中间体B(3,4,5-三甲氧基苯甲酰-2-硝基-4-异丙基苯胺)，为棕黄色絮状晶体，产率59％.
(3)中间体C的合成
取675mg中间体B，加入404mg(4.0eqv.)还原铁粉和10mL醋酸溶液，氮气保护下回流30min,倒入水中，析出固体，过滤,滤出的固体用乙酸乙酯(250ml)溶解,滤去不溶物，滤液用氢氧化钠溶液洗涤两次，再用饱和食盐水洗涤2次，无水硫酸钠干燥，旋干，固体用乙醇/水(1：1)重结晶，析出固体，过滤得白色固体364mg,中间体C(2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-6-异丙基-1H-苯并咪唑)，产率62％.
(4)化合物3的合成
取220mg中间体C,加入5mLHBr和5mL AcOH,氮气保护下回流，点板跟踪反应(大约反应3.5h)，冷却，析出固体，过滤，固体用二氯甲烷洗涤，得灰黑色产品149mg，为化合物3，产率78％。
化合物3的1H NMR测定结果以及质谱测定结果如下：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:14.98(s,1H,NH),9.73(s,2H,2OH),9.60(s,1H,OH),7.72(d,J＝4Hz,1H,Ar-CH),7.66(s,1H,Ar-CH)7.56(d,J＝4Hz,1H,Ar-CH),7.25(s,2H,Ar-CH),2.82-2.78(m,2H,CH2),1.24(s,6H,2CH3).TOF MS(EI+):C16H16N2O3,理论值：284.1161,实测值：284.1163.
实施例4：1-苄基-2-(3,4,5-三羟基苯基)-苯并咪唑(化合物4)的制备
(1)中间体A的合成
取200mg 2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-1H-苯并咪唑(实施例1合成得到的中间体C)加入20mL THF，再加入258μL(3.0eqv.)溴化苄和500mg NaH，氮气保护，常温搅拌48h，倒入冰中，析出固体，过滤，固体用二氯甲烷溶解，饱和食盐水洗涤两次，无水硫酸镁干燥，旋去溶剂，硅胶柱(CH2Cl2:石油醚＝3：1)分离或者乙酸乙酯/石油醚(1：1)重结晶，固体析出，过滤得产物为白色粉末169mg，中间体A(1-苄基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-苯并咪唑)，产率64％。
(2)化合物4的合成
取150mg中间体A，加入5mL二氯甲烷(NaH蒸馏干燥过的无水二氯甲烷)，-70℃下滴加4mmol 2mL无水二氯甲烷稀释过的三溴化硼，加毕，封闭体系，自然升温，反应过夜，加甲醇/冰淬灭，终止反应，过滤，用水/乙醇(5：1)重结晶，得产物白色絮状晶体66mg，化合物4，产率49.5％.
化合物4的1H NMR测定结果以及质谱测定结果如下：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:9.71(s,2H,2OH),9.37(s,1H,OH),7.84(d,J＝8Hz,1H,Ar-CH),7.67(d,J＝8Hz,1H,Ar-CH),7.51-7.61(m,2H,Ar-CH),7.34-7.39(m,3H,Ar-CH),7.22(d,J＝4Hz,2H,Ar-CH),6.82(s,2H,Ar-CH),5.76(s,2H,CH2).TOF MS(EI+):C20H16N2O3,理论值：332.1161,实测值：332.1165.
实施例5：1-(2-甲基苄基)-2-(3,4,5-三羟基苯基)-苯并咪唑(化合物5)的制备
(1)中间体A的合成
按照实施例4步骤(1)所述的合成和分离的方法制备得到中间体A(1-(2-甲基苄基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-苯并咪唑)，其中将实施例4中的溴化苄代替为2-甲基苄氯；中间体A为橘黄色固体，产率55％。
(2)化合物5的合成
取150mg中间体A(1-(2-甲基苄基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-苯并咪唑)为起始原料，制备得到化合物5，合成和分离的方法同实施例4的步骤(2)；化合物5为橘黄色固体，产率54％.
化合物5的1H NMR测定结果以及质谱测定结果如下：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:9.89(s,2H,2OH),9.39(s,1H,OH),7.84(d,J＝8Hz,1H,Ar-CH),7.67(d,J＝8Hz,1H,Ar-CH),7.34-7.40(m,3H,Ar-CH),7.27(m,1H,Ar-CH),7.24(d,J＝8Hz,1H,Ar-CH),7.18(m,1H,Ar-CH),6.83(s,2H,Ar-CH),5.75(s,2H,CH2),2.29(s,3H,CH3).TOF MS(EI+):C21H18N2O3,理论值：346.1317,实测值：346.1314.
实施例6：1-(3-甲基苄基)-2-(3,4,5-三羟基苯基)-苯并咪唑(化合物6)的制备
(1)中间体A的合成
按照实施例4步骤(1)所述的合成和分离的方法制备得到中间体A(1-(3-甲基苄基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-苯并咪唑)，其中将实施例4中的溴化苄代替为3-甲基苄氯；中间体A为橘黄色固体，产率53％。
(2)化合物6的合成
取150mg中间体A(1-(3-甲基苄基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-苯并咪唑)为起始原料，制备得到化合物6，合成和分离方法同实施例4的步骤(2)；化合物6为橘黄色固体，产率59％.
化合物6的1H NMR测定结果以及质谱测定结果如下：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:9.89(s,2H,2OH),9.39(s,1H,OH),7.86(d,J＝8Hz,1H,Ar-CH),7.69(d,J＝8Hz,1H,Ar-CH),7.56-7.68(m,1H,Ar-CH),7.35-7.37(m,2H,Ar-CH),7.23(d,J＝4Hz,1H,Ar-CH),7.18(s,1H,Ar-CH),6.98(d,J＝4Hz,1H,Ar-CH),6.84(s,2H,Ar-CH),5.75(s,2H,CH2),2.31(s,3H,CH3).TOF MS(EI+):C21H18N2O3,理论值：346.1317,实测值：346.1319.
实施例7：1-(4-甲基苄基)-2-(3,4,5-三羟基苯基)-苯并咪唑(化合物7)的制备
(1)中间体A的合成
按照实施例4步骤(1)所述的合成和分离的方法制备得到中间体A(1-(4-甲基苄基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-苯并咪唑)，其中将实施例4中的溴化苄代替为4-甲基苄氯；中间体A为橘黄色固体，产率57％。
(2)化合物7的合成
取150mg中间体A(1-(4-甲基苄基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-苯并咪唑)为起始原料，制备得到化合物7，合成和分离方法同实施例4的步骤(2)；化合物7为橘黄色固体，产率55.5％。
化合物7的1H NMR测定结果以及质谱测定结果如下：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:9.98(s,2H,2OH),9.45(s,1H,OH),7.83(d,J＝8Hz,1H,Ar-CH),7.66(d,J＝8Hz,1H,Ar-CH),7.33-7.39(m,2H,Ar-CH),7.22(d,J＝4Hz,2H,Ar-CH),7.11(d,J＝4Hz,2H,Ar-CH),6.82(s,2H,Ar-CH),5.75(s,2H,CH2),2.16(s,3H,CH3).TOF MS(EI+):C21H18N2O3,理论值：346.1317,实测值：346.1315.
实施例8：1-(2-羟基-5-甲基苄基)-2-(3,4,5-三羟基苯基)-苯并咪唑(化合物8)的制备
(1)中间体A的合成
按照实施例4步骤(1)所述的合成和分离的方法制备得到中间体A(1-(2-羟基-5-甲基苄基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-苯并咪唑)，其中将实施例4中的溴化苄代替为2-羟基-5-甲基苄氯；中间体A为橘黄色油状物，产率59％。
(2)化合物8的合成
取150mg中间体A(1-(2-羟基-5-甲基苄基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-苯并咪唑)为起始原料，制备得到化合物8，合成和分离方法同实施例4的步骤(2)；化合物8为橘黄色固体，产率52.5％。
化合物8的1H NMR测定结果以及质谱测定结果如下：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:10.28(s,1H,OH),9.76(s,2H,2OH),9.39(s,1H,OH),7.80(d,J＝8Hz,1H,Ar-CH),7.70(d,J＝8Hz,1H,Ar-CH),7.57(m,2H,Ar-CH),7.01(d,J＝8Hz,1H,Ar-CH),6.81-6.83(m,2H,Ar-CH),6.71-6.76(m,2H,Ar-CH),5.61(d,J＝8Hz,2H,CH2),2.25(s,3H,CH3).TOF MS(EI+):C21H18N2O4,理论值：362.1267,实测值：362.1269.
实施例9：1-(2-羟基-5-异丙基苄基)-2-(3,4,5-三羟基苯基)-苯并咪唑(化合物9)的制备
(1)中间体A的合成
按照实施例4步骤(1)所述的合成和分离的方法制备得到中间体A(1-(2-羟基-5-异丙基苄基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-苯并咪唑)，其中将实施例4中的溴化苄代替为2-羟基-5-异丙基苄氯；中间体A为橘黄色油状物，产率52％。
(2)化合物9的合成
取150mg中间体A(1-(2-羟基-5-异丙基苄基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-苯并咪唑)为起始原料，制备得到化合物，合成和分离方法同实施例4的步骤(2)；化合物9为橘黄色固体，产率54％。
化合物9的1H NMR测定结果以及质谱测定结果如下：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:10.19(s,1H,OH),9.65(s,2H,2OH),9.30(s,1H,OH),7.80(d,J＝8Hz,1H,Ar-CH),7.70(d,J＝8Hz,1H,Ar-CH),7.57(m,2H,Ar-CH),7.01(d,J＝8Hz,1H,Ar-CH),6.81-6.83(m,2H,Ar-CH),6.71-6.76(m,2H,Ar-CH),5.62(d,J＝8Hz,2H,CH2),2.61(m,H,CH),1.05(s,6H,2CH3).TOF MS(EI+):C23H22N2O4,理论值：390.1580,实测值：390.1584.
实施例10：1-苯甲酰基-2-(3,4,5-三羟基苯基)-苯并咪唑(化合物10)的制备
(1)中间体A的合成
按照实施例4步骤(1)所述的合成和分离的方法制备得到中间体A(1-(苯甲酰基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-苯并咪唑)，其中将实施例4中的溴化苄代替为苯甲酰氯；中间体A为砖红色固体，产率62％。
(2)化合物10的合成
取150mg中间体A(1-(苯甲酰基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-苯并咪唑)为起始原料，制备得到化合物，合成和分离方法同实施例4的步骤(2)；化合物10为棕红色固体，产率52％。
化合物10的1H NMR测定结果以及质谱测定结果如下：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:9.71(s,2H,2OH),9.37(s,1H,OH),7.94-7.90(m,2H,Ar-CH),7.84(d,J＝8Hz,1H,Ar-CH),7.67(d,J＝8Hz,1H,Ar-CH),7.50-7.46(m,3H,Ar-CH),7.22(d,J＝4Hz,2H,Ar-CH),6.82(s,2H,Ar-CH).TOF MS(EI+):C20H14N2O4,理论值：346.0954,实测值：346.0957.
实施例11：1-(4-叔丁基苯甲酰基)-2-(3,4,5-三羟基苯基)-苯并咪唑(化合物11)的制备
(1)中间体A的合成
按照实施例4步骤(1)所述的合成和分离的方法制备得到中间体A(1-(4-叔丁基苯甲酰基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-苯并咪唑)，其中将实施例4中的溴化苄代替为4-叔丁基苯甲酰氯；中间体A为深红色固体，产率62％。
(2)化合物11的合成
取150mg中间体A(1-(4-叔丁基苯甲酰基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-苯并咪唑)为起始原料，制备得到化合物，合成和分离方法同实施例4的步骤(2)；化合物11为深红色固体，产率50.5％。
化合物11的1H NMR测定结果以及质谱测定结果如下：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:9.71(s,2H,2OH),9.37(s,1H,OH),7.94-7.90(m,2H,Ar-CH),7.84(d,J＝8Hz,1H,Ar-CH),7.67(d,J＝8Hz,1H,Ar-CH),7.44-7.42(d,J＝4Hz,2H,Ar-CH),7.22(d,J＝4Hz,2H,Ar-CH),6.82(s,2H,Ar-CH),1.34(s,9H,3CH3).TOFMS(EI+):C24H22N2O4,理论值：402.1580,实测值：402.1576.
实施例12：1-苯磺酰基-2-(3,4,5-三羟基苯基)-苯并咪唑(化合物12)的制备
(1)中间体A的合成
按照实施例4步骤(1)所述的合成和分离的方法制备得到中间体A(1-苯磺酰基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-苯并咪唑)，其中将实施例4中的溴化苄代替为苯磺酰氯；中间体A为深红色固体，产率62％。
(2)化合物12的合成
取150mg中间体A(1-苯磺酰基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-苯并咪唑)为起始原料，制备得到化合物，合成和分离方法同实施例4的步骤(2)；化合物12为深红色固体，产率50.5％。
化合物12的1H NMR测定结果以及质谱测定结果如下：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:9.71(s,2H,2OH),9.37(s,1H,OH),7.98-7.94(m,2H,Ar-CH),7.84(d,J＝8Hz,1H,Ar-CH),7.66(d,J＝8Hz,1H,Ar-CH),7.52-7.48(m,3H,Ar-CH),7.22(d,J＝4Hz,2H,Ar-CH),6.82(s,2H,Ar-CH).TOF MS(EI+):C19H14N2O5S,理论值：382.0623,实测值：382.0621.
实施例13：通过荧光偏振分析法检测化合物的BH3类似程度
合成一个带有21个氨基酸的Bid BH3肽段(氨基酸：79-99：QEDIIRNIARHLAQVGDSMDR)，并在N端标记上6-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(FAM)作为荧光标签(FAM-Bid)。竞争结合实验中所用的反应体系为GST-Bcl-2蛋白(40nM)或Mcl-1蛋白(40nM)，和FAM-Bid多肽(5nM)溶于反应缓冲液中(100mM K3PO4,pH 7.5；100μg/mL牛γ白蛋白；0.02％叠氮化钠)。在96孔板中，每孔加入100μL反应体系，然后加入1μL不同浓度的溶于DMSO的待检测化合物8的母液(10mM)，终浓度为100μM。同时设立两个对照组，一个对照组为反应体系中只含有Bcl-2或Mcl-1和FAM-Bid(相当于0％抑制率)，另一对照组中的反应体系只含有FAM-Bid肽段。96孔板经过4个小时的避光孵育后，进行酶标仪上检测。荧光极化值(mP)在由530nm波长激发产生的485nm发射波长下测量。Ki值通过Wang等人报道的计算方程得到。计算Ki的程序可以通过以下网址免费的获得：http://sw16.im.med.umich.edu/software/calc ki/。
按照上述相同的试验方法检测其他化合物的BH3类似程度，它们与Bcl-2和Mcl-1蛋白的竞争结合常数(Ki)在也多是nM级，以(-)-Gossypol为阳参对照。具体结果如表1所示。
表1.本发明化合物的荧光偏振分析法实验结果
表1的结果可知，化合物4-12均表现出对抗凋亡蛋白—Mcl-1和Bcl-2蛋白—亚微摩尔级亲和力，其中，化合物6，7，11表现出最好的对Mcl-1和Bcl-2蛋白的亲和力。说明本发明中涉及的苯并咪唑骨架系列化合物能够高效的在体外解离抗凋亡蛋白与BH3-only蛋白的相互作用。
实施例14：通过流式细胞技术检测化合物6诱导U937细胞系的凋亡情况
本实验通过Annexin-V/propidium iodide staining by flow cytometry试剂盒(碧云天，苏州，中国C1063)检测化合物6(5μM和10μM)作用于人类白血病U937细胞系24h细胞凋亡情况。
实验步骤如下：
1.细胞收集：悬浮细胞直接收集到10mL的离心管中，每样本细胞数为5×106/mL，1000r/min离心5min，弃去培养液；
2.用孵育缓冲液洗涤1次，500～1000r/min离心5min；
3.用100μL的标记溶液重悬细胞，室温下避光孵育10～15min；
4.500～1000r/min离心5min沉淀细胞孵育缓冲液洗1次；
5.加入荧光(SA-FLOUS)溶液4℃下孵育20min，避光并不时振动，通过流式细胞仪，检测化合物6对诱导U937细胞的凋亡情况。以未加入检测化合物的作为对照组。
流式细胞仪分析：流式细胞仪激发光波长用488nm，用一波长为515nm的通带滤器检测FITC荧光，另一波长大于560nm的滤器检测PI。
结果判断：凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如PI有抗染性，坏死细胞则不能。细胞膜有损伤的细胞的DNA可被PI着染产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。因此，在细胞凋亡的早期PI不会着染而没有红色荧光信号。正常活细胞与此相似。在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为(FITC-/PI-)；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为(FITC+/PI+)；而右下象限为凋亡细胞，显现(FITC+/PI-)(见图1)。图1的结果显示，相对于对照组(control)，加入化合物6的U937细胞的凋亡细胞明显增多，且随着化合物浓度的增加凋亡细胞也增多，24h时，5μM，10μM的化合物6分别诱导35％和60％的人类白血病U937细胞系细胞的凋亡。
本发明的化合物1-12对于其他肿瘤细胞如K562、KU812等，也能够高效的诱导肿瘤细胞凋亡。
实施例15：化合物1和化合物4的分子对接实验
实验方法：
(1)小分子的处理：用Chembio3D Ultra 11.0软件通过能量极小化来得到配体小分子化合物化合物1和化合物4的三维结构，保存为mol2格式。然后通过加氢，计算电荷等处理方式保存为pdbqt格式。
(2)大分子处理：Mcl-1蛋白(hMcl-1；PDB ID:2PQK)以及Bcl-2蛋白(hBcl-2；PDB ID:1GJH)的结构是由蛋白质数据库RCSB中来获得。在ADT软件然后通过加氢，计算电荷等处理方式保存为pdbqt格式。
(3)盒子建立：分子对接中要设置合适的网格点数，间距设为网格的中心就是活性位点的中心。保存为gpf文件，再通过格点运算(Autogrid)转换为glg文件。
(4)对接：使用了AutoDock4.2软件的GA算法进行分子计算对接，设置对接次数，收集1000个构象，其它参数取值为默认值，然后用ADT软件显示对接结果。小分子可以进行柔性对接，即小分子中的自由旋转化学键是可以自由旋转的，从而得到目标小分子与Mcl-1蛋白的结合模式。
图2为小分子-Mcl-1蛋白分子对接本发明化合物7的构象与Bim/Mcl-1复合物晶体中Bim的结构的重叠对比图。如图2所示，化合物7很好的模拟了Bim上位于α-螺旋两面的D67、I65和L62三个氨基酸残基。2-(3,4,5-三羟基苯基)可以模拟Bim的D67，苯并咪唑基团可以模拟Bim的I65，1-(4-甲基苄基)可以模拟Bim的L62。
如图3所示，化合物1能够与Mcl-1蛋白上N260，R263和P3口袋相互作用，很好的模拟了Bim上D67和I65。2-(3,4,5-三羟基苯基)可以模拟Bim的D67，与Mcl-1蛋白的N260和R263形成氢键。苯并咪唑基团可以模拟Bim的I65，占据Mcl-1蛋白的P3口袋。
如图4所示，化合物4能够与Mcl-1蛋白上N260、R263、P3和P2口袋相互作用，很好的模拟了Bim上D67、I65和L62。2-(3,4,5-三羟基苯基)可以模拟Bim的D67，与Mcl-1蛋白的N260和R263形成氢键。苯并咪唑基团可以模拟Bim的I65，占据Mcl-1蛋白的P3口袋。1-苄基可以模拟Bim的L62，占据Mcl-1蛋白的P2口袋。
从以上的分子对接图中可以发现，2-(3,4,5-三羟基苯基)具有保守性和特殊性。该基团可以模拟Bimα-螺旋的D67，与Mcl-1蛋白的N260和R263形成三个氢键。这一“氢键网络”对小分子与Mcl-1蛋白的结合至关重要。
实施例16：化合物依赖Bax/Bak的细胞毒性实验验证其BH3类似物的特性
磷酸钙共沉淀转染3μg Bax/Bak干扰质粒(Santa Bio Inc.USA Bax/Bak序列分别为GCTCTGAGCAGATCATGAA和CCCATTCACTACAGGTGAA)至U937细胞中，转染24小时后，收集细胞，Western检测RNA干扰后Bax/Bak蛋白表达情况，相同处理无质粒转染的细胞组设为对照组。转染后的细胞接种于96孔板中(1×105个/孔)，平行进行未转染质粒细胞组的对照实验，按实验设计浓度梯度加入待检测化合物4，作用24小时后，MTT检测细胞活力，实验同时MTT检测不同浓度化合物4对未转染Bax/Bak干扰质粒的正常细胞HEk293细胞的毒性，结果如附图5所示，Gossypol作为非特异性BH3类似物与本发明的化合物对比平行处理，可见Gossypol对U937细胞的毒性在未转染和转染细胞中没有差异(图5A)，但本发明化合物4在未转染和转染细胞中表现出明显的差别(对U937细胞的死亡率分别为90％和10％左右)，说明化合物4具有绝对依赖Bax/Bak的细胞毒性,化合物4对未转染干扰质粒的HEk293细胞基本没有表现出杀伤力(化合物浓度50μM时细胞死亡率为10％左右)(图5B)。
按上述相同试验方法检测其他11个化合物，通过对比检测化合物作用于转染细胞和未转染细胞的IC50值变化，说明所检测化合物也均具有绝对依赖Bax/Bak的作用特点(见表2)。
表2.本发明化合物依赖Bax/Bak的细胞毒性实验结果
表2的结果表明，本发明的化合物1-12对Bax/Bak干扰质粒感染的细胞的毒性显著低于未转染细胞，可知本发明化合物对癌细胞的细胞的毒性是依赖于Bax/Bak蛋白实现的。
表2的结果表明，本发明的化合物1-12对正常细胞HEk293表现为＞50μM的IC50，基本没有表现出杀伤力。证实本发明涉及的化合物能特异性杀伤肿瘤细胞，而对正常细胞则基本没有杀伤作用。
Claims (9)
1.一类苯并咪唑类化合物，具有通式I的结构：
其中：
R1选自H或XR3；
R2选自H、Cl、Br、F或C1-3烷基；
R3选自1个或2个取代基Y取代的苯基，其每一个取代基Y独立选自OH、Br、Cl、NO2、NHCH3、N(CH3)2、CN、苯基或C1-4烷基；
X选自CH2、羰基或磺酰基。
2.根据权利要求1所述的苯并咪唑类化合物，其特征在于，R1为H，R2选自Cl、Br、F、或C1-3烷基。
3.根据权利要求1所述的苯并咪唑类化合物，其特征在于，R1为XR3，R2为H。
4.权利要求1所述的化合物，选自：
2-(3,4,5-三羟基苯基)-1H-苯并咪唑；
6-甲基-2-(3,4,5-三羟基苯基)-1H-苯并咪唑；
6-异丙基-2-(3,4,5-三羟基苯基)-1H-苯并咪唑；
1-苄基-2-(3,4,5-三羟基苯基)-苯并咪唑；
1-(2-甲基苄基)-2-(3,4,5-三羟基苯基)-苯并咪唑；
1-(3-甲基苄基)-2-(3,4,5-三羟基苯基)-苯并咪唑；
1-(4-甲基苄基)-2-(3,4,5-三羟基苯基)-苯并咪唑；
1-(2-羟基-5-甲基苄基)-2-(3,4,5-三羟基苯基)-苯并咪唑；
1-(2-羟基-5-异丙基苄基)-2-(3,4,5-三羟基苯基)-苯并咪唑；
1-苯甲酰基-2-(3,4,5-三羟基苯基)-苯并咪唑；
1-(4-叔丁基苯甲酰基)-2-(3,4,5-三羟基苯基)-苯并咪唑；
1-苯磺酰基-2-(3,4,5-三羟基苯基)-苯并咪唑。
5.权利要求2所述的苯并咪唑类化合物的制备方法，包括如下步骤：
(1)3,4,5-三甲氧基苯甲酸与二氯亚砜按照投料比1g:2.0-4.0mL回流反应0.5-1.5h，得化合物ⅰ；
(2)化合物ⅰ与化合物ⅱ按照投料摩尔比1:2-1:5反应，得化合物ⅲ；
反应时间为7-10h，反应温度为50-70℃，反应溶剂为四氢呋喃；
(3)化合物ⅲ和铁粉按照投料摩尔比1:2-1:4回流反应0.5-1h，得化合物ⅳ；
反应溶剂为冰醋酸；
(4)化合物ⅳ在溴化氢的作用下回流反应0.5～1h,得式Ia的化合物；
反应溶剂为醋酸与氢溴酸按体积比1:1的混合溶剂，按每100mg化合物ⅳ加入5-10mL醋酸-氢溴酸混合溶剂。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)-(4)，均在氮气保护下进行。
7.权利要求3所述的苯并咪唑类化合物的制备方法，包括如下步骤：
①按照权利要求5所述的步骤(1)-(3)的方法制备得到化合物ⅴ，其中在步骤(2)中所述的化合物ⅱ为邻硝基苯胺；
②化合物ⅴ在钠氢作用下，与化合物ⅵ、ⅶ、ⅷ、ⅸ或ⅹ反应，反应产物经分离后，在BBr3作用下脱甲基，得式Ib的化合物；
8.权利要求1-4的任一项所述的苯并咪唑类化合物在制备BH3类似物Bcl-2家族蛋白抑制剂中的应用。
9.权利要求1-4的任一项所述的苯并咪唑类化合物在制备抗癌药物中的应用。
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