CN104698043A - 检测大肠杆菌的dna电化学生物传感器及其制备方法 - Google Patents
检测大肠杆菌的dna电化学生物传感器及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104698043A CN104698043A CN201310656003.6A CN201310656003A CN104698043A CN 104698043 A CN104698043 A CN 104698043A CN 201310656003 A CN201310656003 A CN 201310656003A CN 104698043 A CN104698043 A CN 104698043A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- escherichia coli
- dna
- electrode surface
- add
- preparation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 title claims abstract description 34
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 25
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 22
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 13
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 claims description 11
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 2
- 238000007306 functionalization reaction Methods 0.000 claims 3
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 claims 1
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 claims 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 claims 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 abstract description 14
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 abstract description 7
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 abstract description 7
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 abstract description 7
- 238000006479 redox reaction Methods 0.000 abstract description 4
- 108020001027 Ribosomal DNA Proteins 0.000 abstract description 3
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 abstract description 3
- 240000003291 Armoracia rusticana Species 0.000 abstract description 2
- YOBPOURUWHBKMQ-UHFFFAOYSA-N OO.CN(C1=CC=C(C2=CC=C(N(C)C)C=C2)C=C1)C Chemical compound OO.CN(C1=CC=C(C2=CC=C(N(C)C)C=C2)C=C1)C YOBPOURUWHBKMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 8
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 4
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- GWOLZNVIRIHJHB-UHFFFAOYSA-N 11-mercaptoundecanoic acid Chemical compound OC(=O)CCCCCCCCCCS GWOLZNVIRIHJHB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 2
- 229910001873 dinitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 238000005498 polishing Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 208000019331 Foodborne disease Diseases 0.000 description 1
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000000369 enteropathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000004381 surface treatment Methods 0.000 description 1
- 238000004506 ultrasonic cleaning Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明属于分析化学和化学传感器技术领域，涉及一种检测大肠杆菌16SrDNA(核糖体DNA)核酸的电化学生物传感器及其制备方法，用于检测大肠杆菌；本发明针对大肠杆菌16SrDNA的特异性序列区间，分别合成HRP-Avidin(辣根过氧化物酶-亲和素)功能化的DNA检测探针和生物素化的DNA捕获探针序列，加入TMB-H2O2(四甲基联苯胺-过氧化氢)后通过HRP对TMB-H2O2催化作用产生氧化还原反应信号，制备出检测大肠杆菌16SrDNA(核糖体DNA)核酸的电化学生物传感器。
Description
技术领域
本发明属于分析化学和化学传感器技术领域，涉及一种检测大肠杆菌16SrDNA(核糖体DNA)核酸的电化学生物传感器及其制备方法，用于检测大肠杆菌。
背景技术
大肠杆菌是严重危害健康的食源性肠道致病菌之一，实现对大肠杆菌的快速检测，是预防与控制食源性疾病的关键环节之一。16SrDNA作为研究分类学和系统进化的分子受到高度重视，16SrDNA为所有细菌所共有，分子量大小适中便于序列分析；在细菌的16SrDNA中有多个区段保守性，根据这些保守区可以设计出细菌通用物，可以扩增出所有细菌的16SrDNA片段，并且这些引物仅对细菌是特异性的；而细菌的16SrDNA可变区的差异可以用来区分不同的细菌，通过对16SrDNA基因序列设计相应核酸探针，对于食品中病原菌的快速诊断具有重要的实际意义和应用价值。
目前PCR(聚合酶链反应法)和ELISA(酶联免疫法)是目前较常用的食品病原菌快速检测手段；但是因为其两者均需要通过一系列复杂的生化处理过程，操作比较繁琐，仍未从根本上降低病原菌的检测时间提高检测速度，难以满足实际快速检测的要求。实践中需要一种更为可靠的新型检测技术，电化学生物传感检测技术作为一种新型检测技术在食品致病菌检测技术中逐步成为关注的焦点。
本发明针对大肠杆菌16S rDNA的特异性序列区间，分别合成HRP-Avidin(辣根过氧化物酶-亲和素)功能化的DNA检测探针和生物素化的DNA捕获探针序列，加入TMB-H2O2(四甲基联苯胺-过氧化氢)后通过HRP对TMB-H2O2催化作用产生氧化还原反应信号，制备出检测大肠杆菌的DNA电化学生物传感器。
发明内容
本发明目的是提供一种可以灵敏、快速及定量检测大肠杆菌的DNA电化学生物传感器及其制备方法，其具体制备步骤如下：
(1)将电极充分打磨清洗后，在电极表面加入11-巯基十一烷酸溶液，然后将电极放入温箱中孵育后，取出用无水乙醇轻轻清洗，并在氮气中烘干。
(3)在电极表面加入EDC[1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺]和NHS(N-羟基丁二酰亚胺)混合液后在室温下孵育后，用PBS缓冲液清洗，并在氮气中烘干；再分别加入BPA(生物酰胺化亲和素)后，在电极表面成功构建11-巯基十一烷酸-BPA单分子自组装层；
(4)在电极表面加入生物素化DNA捕获探针，孵育后取出用PBS轻轻冲洗，再加入大肠杆菌16S rDNA靶序列待检液后加入HRP-Avidin功能化的大肠杆菌DNA检测探针序列，然后放入水浴箱中充分孵育杂交后取出，用PBS缓冲液冲洗，再加入TMB-H2O2后通过HRP对TMB-H2O2催化作用产生氧化还原反应信号；
(5)通过差分脉冲电流图统计数据，根据所检测不同浓度的大肠杆菌16S rDNA绘制工作曲线。
本发明用于定量检测大肠杆菌的原理：
当检测食物标本中含有大肠杆菌时，通过处理食物标本形成大肠杆菌16S rDNA靶序列待检液，通过在电极表面构建生物素化DNA检测探针识别层，分别加入待检液和后HRP-Avidin功能化的DNA检测探针，待检液中的大肠杆菌16S rDNA靶序列在孵育过程中被捕获探针特异性捕获，在加入TMB-H2O2后，通过HRP-Avidin功能化的检测探针对TMB-H2O2催化作用产生氧化还原反应，该信号与待检液中的大肠杆菌16S rDNA靶序列浓度成正比，通过绘制工作曲线，可以对未知食物标本中的大肠杆菌进行检测与定量分析。
本发明所建立的检测大肠杆菌的DNA电化学生物传感器及其制备方法，其体现的特点是：
(1)从核酸分子检测大肠杆菌无需细菌培养，可以避免因长时间细菌培养所造成的检测速度缓慢；
(2)采用HRP-TMB-H2O2生物学信号放大体系，稳定性好灵敏度高，无需PCR对靶核酸分子的扩增，简化核酸检测流程。
附图说明
图1是本发明制备方法中检测大肠杆菌16S rDNA将核酸杂信息交转换电流信号的差分脉冲图。
图2是本发明制备方法中检测不同浓度的大肠杆菌16S rDNA所得的工作曲线。
图中数字代码表示不同浓度的大肠杆菌16S rDNA，其中1，2为0.01μmol／L；3，16为0.03μmol／L；5，14为0.05μmol／L；7，8为0.10μmol／L。
具体实施方案：
检测大肠杆菌的DNA电化学生物传感器及其制备方法：
(1)电极表面处理：将电极充分打磨至镜面光滑后，在双蒸水中清洗两次，再放入无水乙醇中超声清洗5分钟后取出，烘干1min；
(2)在电极表面加入5μL0.5mmol／L的11-巯基十一烷酸溶液，然后将电极放入到充满氮气的氮气箱中48h，然后取出用无水乙醇轻轻清洗30s，并在氮气中烘干1min；
(3)在电极表面加入20μL EDC和NHS混合液后在室温下孵育10min，用PBS缓冲液清洗，并在氮气中烘干1min；再在表面加入5μL BPA；
(4)在电极表面加入2μL 0.1μmol／L的生物素化DNA捕获探针，孵育10min后取出，用PBS轻轻冲洗5s，再加入食物标本中分离的靶序列待检液，再往电极表面加入1μL0.1μmol／L的HRP-Avidin功能化的大肠杆菌DNA检测探针序列，然后将电极放入65℃水浴箱中充分孵育杂交40min后取出，用PBS缓冲液冲洗5s，再加入TMB-H2O2；
(5)根据绘制的工作曲线，推算所检测的未知标本是否含有大肠杆菌及其含量浓度。
Claims (4)
1.一种检测大肠杆菌的DNA电化学生物传感器及其制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)电极表面11-巯基十一烷酸-BPA单分子自组装层的制备；
(2)电极表面HRP-Avidin功能化的DNA检测探针和生物素化的DNA捕获探针及检测体系的制备；
(3)检测大肠杆菌工作曲线的绘制。
2.根据权利要求1所述的电极表面11-巯基十一烷酸-BPA单分子自组装层的制备，其特征在于：在打磨处理后的电极表面加入EDC和NHS混合液后在室温下孵育，用PBS缓冲液清洗，并在氮气中烘干后加入BPA。
3.根据权利要求1所述的电极表面HRP-Avidin功能化的DNA检测探针和生物素化的DNA捕获探针及检测体系的制备，其特征在于：
(1)在电极表面加入生物素化DNA捕获探针，孵育后取出用PBS轻轻冲洗，再加入食物标本中分离的大肠杆菌16S rDNA靶序列待检液；
(2)在电极表面再加入HRP-Avidin功能化的大肠杆菌DNA检测探针序列，然后将修饰后的电极入水浴箱中充分孵育杂交后取出，用PBS缓冲液冲洗，加入TMB-H2O2。
4.根据权利要求1所述的检测大肠杆菌工作曲线的绘制，其特征在于：通过差分脉冲电流图统计数据，根据所检测不同浓度的大肠杆菌16S rDNA绘制工作曲线。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310656003.6A CN104698043A (zh) | 2013-12-09 | 2013-12-09 | 检测大肠杆菌的dna电化学生物传感器及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310656003.6A CN104698043A (zh) | 2013-12-09 | 2013-12-09 | 检测大肠杆菌的dna电化学生物传感器及其制备方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104698043A true CN104698043A (zh) | 2015-06-10 |
Family
ID=53345390
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201310656003.6A Pending CN104698043A (zh) | 2013-12-09 | 2013-12-09 | 检测大肠杆菌的dna电化学生物传感器及其制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104698043A (zh) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105866225A (zh) * | 2016-04-01 | 2016-08-17 | 华北电力大学 | 一种检测大气颗粒物中微生物的场效应传感器及制备方法 |
| CN110907519A (zh) * | 2019-11-29 | 2020-03-24 | 中南大学 | 一种大肠杆菌电化学生物传感器的制备与检测方法 |
| CN113970586A (zh) * | 2021-09-10 | 2022-01-25 | 中国十七冶集团有限公司 | 建筑工地检测大肠杆菌的电化学传感器的制备方法 |
| CN116203227A (zh) * | 2021-11-30 | 2023-06-02 | 苏州科技大学 | 一种电化学底液放大的免疫检测方法及其应用 |
| CN116200464A (zh) * | 2021-11-30 | 2023-06-02 | 苏州科技大学 | 基于电化学信号底物放大检测核酸的方法及试剂盒 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000032813A1 (en) * | 1998-12-01 | 2000-06-08 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem | Method and system for detecting oligonucleotides in a sample |
| CN101175852A (zh) * | 2005-05-13 | 2008-05-07 | 和光纯药工业株式会社 | 堪萨斯分枝杆菌检测用的引物和探针、以及使用它们检测堪萨斯分枝杆菌的方法 |
| CN101400800A (zh) * | 2005-09-21 | 2009-04-01 | 康比麦崔克斯有限公司 | 利用酶检测电极微阵列上结合事件的方法 |
| CN101705279A (zh) * | 2009-06-29 | 2010-05-12 | 林新华 | 一种检测急性早幼粒细胞白血病PML/RARα融合基因的纳米生物传感器 |
| CN103175873A (zh) * | 2013-01-27 | 2013-06-26 | 福州市第二医院 | 基于目标dna重复序列自身增强放大信号的dna电化学传感器 |
| CN203083965U (zh) * | 2013-02-06 | 2013-07-24 | 福州市第二医院 | 一种结核杆菌dna电化学传感检测装置 |
-
2013
- 2013-12-09 CN CN201310656003.6A patent/CN104698043A/zh active Pending
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000032813A1 (en) * | 1998-12-01 | 2000-06-08 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem | Method and system for detecting oligonucleotides in a sample |
| CN101175852A (zh) * | 2005-05-13 | 2008-05-07 | 和光纯药工业株式会社 | 堪萨斯分枝杆菌检测用的引物和探针、以及使用它们检测堪萨斯分枝杆菌的方法 |
| CN101400800A (zh) * | 2005-09-21 | 2009-04-01 | 康比麦崔克斯有限公司 | 利用酶检测电极微阵列上结合事件的方法 |
| CN101705279A (zh) * | 2009-06-29 | 2010-05-12 | 林新华 | 一种检测急性早幼粒细胞白血病PML/RARα融合基因的纳米生物传感器 |
| CN103175873A (zh) * | 2013-01-27 | 2013-06-26 | 福州市第二医院 | 基于目标dna重复序列自身增强放大信号的dna电化学传感器 |
| CN203083965U (zh) * | 2013-02-06 | 2013-07-24 | 福州市第二医院 | 一种结核杆菌dna电化学传感检测装置 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 赵朝辉 等: "基于微机械电子系统的电化学电极阵列的研制", 《分析化学》 * |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105866225A (zh) * | 2016-04-01 | 2016-08-17 | 华北电力大学 | 一种检测大气颗粒物中微生物的场效应传感器及制备方法 |
| CN105866225B (zh) * | 2016-04-01 | 2018-08-28 | 华北电力大学 | 一种检测大气颗粒物中微生物的场效应传感器及制备方法 |
| CN110907519A (zh) * | 2019-11-29 | 2020-03-24 | 中南大学 | 一种大肠杆菌电化学生物传感器的制备与检测方法 |
| CN113970586A (zh) * | 2021-09-10 | 2022-01-25 | 中国十七冶集团有限公司 | 建筑工地检测大肠杆菌的电化学传感器的制备方法 |
| CN116203227A (zh) * | 2021-11-30 | 2023-06-02 | 苏州科技大学 | 一种电化学底液放大的免疫检测方法及其应用 |
| CN116200464A (zh) * | 2021-11-30 | 2023-06-02 | 苏州科技大学 | 基于电化学信号底物放大检测核酸的方法及试剂盒 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Bu et al. | Ultrasensitive detection of pathogenic bacteria by CRISPR/Cas12a coupling with a primer exchange reaction | |
| Li et al. | Recombinase polymerase amplification coupled with a photosensitization colorimetric assay for fast Salmonella spp. testing | |
| Escamilla-Gomez et al. | Gold screen-printed-based impedimetric immunobiosensors for direct and sensitive Escherichia coli quantisation | |
| CN106525940B (zh) | 基于g-四链体-血红素复合物和聚合链式放大反应检测单链目标dna浓度的电化学方法 | |
| WO2016062101A1 (zh) | 检测ndm-1的修饰电极及其制备方法和应用 | |
| Sharma et al. | Biosensors: tool for food borne pathogen detection | |
| Ahangari et al. | Advanced nano biosensors for rapid detection of zoonotic bacteria | |
| CN104698043A (zh) | 检测大肠杆菌的dna电化学生物传感器及其制备方法 | |
| Yang et al. | Accurate identification of SARS-CoV-2 variant delta using graphene/CRISPR-dCas9 electrochemical biosensor | |
| Chen et al. | Amplified UCNPs-Mitoxantrone dihydrochloride fluorescence PCR sensor based on inner filter for ultrasensitive and rapid determination of Salmonella typhimurium | |
| Xiang et al. | Sensitive detection of microRNAs using hemin/G-quadruplex concatamers as trace labels and RNA endonuclease-aided target recycling for amplification | |
| Bonaldo et al. | Influence of BSA protein on electrochemical response of genosensors | |
| CN107345961A (zh) | 基于核酸层析生物传感技术检测阪崎肠杆菌的方法 | |
| Zhang et al. | Rapid 16S rDNA electrochemical sensor for detection of bacteria based on the integration of target-triggered hairpin self-assembly and tripedal DNA walker amplification | |
| Dunbar et al. | Advanced techniques for detection and identification of microbial agents of gastroenteritis | |
| CN107502653A (zh) | 一种检测凝血酶蛋白浓度的方法 | |
| CN110456051B (zh) | 猪流行性腹泻病毒无标记的阻抗型免疫传感器及其制备方法 | |
| Sembranti et al. | Laser-induced graphene-based aptasensor for the selective detection of Escherichia coli in urine samples | |
| CN108120708B (zh) | 一种利用便携式拉曼光谱仪快速检测金黄色葡萄球菌的方法 | |
| Zheng et al. | Amplification-free and label-free rapid detection of Staphylococcus aureus using solution-gated graphene transistor-based DNA biosensor with hybridization enhancement by interface engineering | |
| Pei et al. | Exonuclease III-aided autonomous cascade signal amplification: a facile and universal DNA biosensing platform for ultrasensitive electrochemical detection of S. typhimurium | |
| Yu et al. | Rapid, sensitive and highly specific diagnosis of Moraxella catarrhalis by recombinase polymerase amplification-based biosensor and fluorescence detection | |
| CN109856211B (zh) | 一种同时检测Exo I和TdT的电化学生物传感器的制备方法及其应用 | |
| CN116497145A (zh) | 一种果生炭疽菌rpa检测引物及其应用 | |
| Cao et al. | Aptamer-based DNAzyme walker electrochemical biosensing strategy for Acinetobacter baumannii detection |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20150610 |
|
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |