CN105209603A - 微载体灌注培养方法及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供哺乳动物细胞的方法和利用这些培养方法的多种方法。

Description

微载体灌注培养方法及其用途

相关文献的交叉引用

本发明要求申请日为2013年2月22日的美国临时专利申请No.61/768,085的优先权，其全部内容在此通过提述并入。

技术领域

本发明涉及分子生物学方法、细胞培养工艺开发方法、以及重组蛋白的制造方法。

发明背景

含有编码重组蛋白的核酸的哺乳动物细胞经常用于生产治疗上或商业上重要的蛋白质。虽然有几种高通量(HT)的细胞培养系统已在生物技术工业中用于补料分批工艺数年，但是没有已知存在的使用摇瓶和微载体用于基于灌注的细胞培养的HT模型。

含有微载体的摇瓶已在短期分批(非灌注)培养工艺中使用，用于生产病毒疫苗。这些制造病毒疫苗的方法中的细胞密度低，这是由于微载体造成了剪切应力。此外，病毒产品难以从培养物进行回收。

发明概述

本发明(至少部分上)基于如下发现，即在以本文描述的具体方式培养哺乳动物细胞导致实质性改进的活细胞密度和重组蛋白产生，并能有效地模拟(比如精确地按比例缩小的模型)大规模连续灌注生物反应器的重组蛋白生产。因此，本说明书包括了培养哺乳动物细胞的方法，其包括：提供摇瓶，其含有置于第一液体培养基中的哺乳动物细胞，其中所述第一液体培养基占据例如约20％至约30％的摇瓶体积，并含有浓度为约1.0g/L至约15.0g/L的多种微载体；在约32℃至约39℃(例如约32℃至约37℃)并伴随约85转每分钟(RPM)至约125RPM的旋转搅拌将所述摇瓶温育一段时间；和在所述一段时间的最初48-96小时后，连续地或周期性地去除第一体积的第一液体培养基并向所述第一液体培养基添加第二体积的第二液体培养基，其中所述第一和第二体积大致相等。还提供了多种利用这些培养方法的方法。

本文提供了培养哺乳动物细胞的方法。这些方法包括：提供摇瓶，其含有置于第一液体培养基中的哺乳动物细胞，其中所述第一液体培养基占据例如约20％至约30％的摇瓶体积，并含有浓度为约1.0g/L至约15.0g/L的多种微载体；在约32℃至约39℃并伴随约85转每分钟(RPM)至约125RPM的旋转搅拌将所述摇瓶温育一段时间；和在所述一段时间的最初48-96小时后，连续地或周期性地去除第一体积的第一液体培养基并向所述第一液体培养基添加第二体积的第二液体培养基，其中所述第一和第二体积大致相等。在这些方法的任一种的一些实施方案中，第一体积的第一液体培养基是基本不含微载体的。在这些方法的任一种的一些实施方案中，其中所述第一液体培养基占据约25％至约30％的摇瓶容积。在这些方法的任一种的一些实施方案中，在所述一段时间的开始时，所述第一液体培养基含有0.1x10⁶细胞/mL-0.5x10⁶细胞/mL。在这些方法的任一种的一些实施方案中，所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在这些方法的任一种的一些实施方案中，所述CHO细胞含有编码重组蛋白的核酸。在这些方法的任一种的一些实施方案中，其中所述重组蛋白是免疫球蛋白、酶、生长因子、蛋白片段或工程化蛋白。在这些方法的任一种的一些实施方案中，去除第一体积的第一液体培养基和添加第二体积的第二液体培养基是同时进行的。在这些方法的任一种的一些实施方案中，去除第一体积的第一液体培养基和添加第二体积的第二液体培养基是连续进行的。在这些方法的任一种的一些实施方案中，所述去除第一体积的第一液体培养基和添加第二体积的第二液体培养基是周期性地进行的。在这些方法的任一种的一些实施方案中，去除的第一液体培养基的第一体积和添加的第二液体培养基的第二体积是随时间增加的。在这些方法的任一种的一些实施方案中，所述第一液体培养基与第二液体培养基相同。在这些方法的任一种的一些实施方案中，所述第一液体培养基与第二液体培养基不同。在这些方法的任一种的一些实施方案中，所述摇瓶是透气性的且容积为约20mL至约1L。在这些方法的任一种的一些实施方案中，所述哺乳动物细胞悬浮于约40mL至约80mL的第一液体培养基中。在这些方法的任一种的一些实施方案中，所述第一液体培养基和/或第二液体培养基选自下组：化学成分确定的液体培养基、无血清液体培养基、含血清液体培养基、无动物来源组分的液体培养基和无蛋白质的培养基。在这些方法的任一种的一些实施方案中，在所述一段时间的最初48-96小时后，在每个24小时的时段中，去除的第一液体培养基的第一体积和添加的第二液体培养基的第二体积为第一液体培养基的体积的约30％至约95％。在这些方法的任一种的一些实施方案中，在去除第一体积的第一液体培养基之前中止搅拌至少30秒的一段时间。在这些方法的任一种的一些实施方案中，所述多个微载体的平均直径为约150μm至约800μm。在这些方法的任一种的一些实施方案中，所述多个微载体含有一个或多个孔。在这些方法的任一种的一些实施方案中，所述一个或多个孔的平均直径为约25μm至约35μm。在这些方法的任一种的一些实施方案中，所述摇瓶以距水平约25度至约90度的反应器角度进行温育，或以相对于台面或水平约45度的角度进行温育。

此处还提供培养哺乳动物细胞的方法，所述方法包括：(a)提供摇瓶，其含有置于第一液体培养基中的哺乳动物细胞，其中所述第一液体培养基占据约20％至约30％的摇瓶容积并含有浓度为约1.0g/L至约15.0g/L的多个微载体；(b)在约35℃至约39℃并伴随约85转每分钟(RPM)至约125RPM的旋转搅拌将所述摇瓶温育第一时间段，并在所述第一时间段的最初约48-96小时后，在随后的每个24小时的时段中，(i)连续地或周期性地从摇瓶去除第一体积的基本不含微载体的第一液体培养基，其中所述第一体积是第一液体培养基体积的约10％至约95％；和(ii)向摇瓶添加第二体积的第二液体培养基，其中所述第一和第二体积大致相等；(c)在细胞浓度达到约目标细胞密度后，于约32℃至约39℃处伴随旋转搅拌将摇瓶温育约2天至约7天的第二时间段，并在每个24小时的时段中进行步骤(b)(i)和(b)(ii)，其中步骤(b)中所使用的第一和第二液体培养基与步骤(c)中使用的那些是基本不同类型的；和(d)于约35℃至约39℃处伴随旋转搅拌将摇瓶温育大于2天的第三时间段，并在每个24小时的时段中进行步骤(b)(i)和(b)(ii)，其中步骤(c)中所使用的第一和第二液体培养基与步骤(d)中使用的那些是相同类型的。在这些方法的任一种的一些实施方案中，其中所述第一液体培养基占据约25％至约30％的摇瓶容积。在这些方法的任一种的一些实施方案中，在所述第一段时间的开始时，第一液体培养基含有0.1x10⁶细胞/mL-0.5x10⁶细胞/mL。在这些方法的任一种的一些实施方案中，所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在这些方法的任一种的一些实施方案中，所述CHO细胞含有编码重组蛋白的核酸。在这些方法的任一种的一些实施方案中，所述重组蛋白是分泌的免疫球蛋白、分泌的酶、分泌的生长因子、分泌的蛋白片段或分泌的工程化蛋白。在这些方法的任一种的一些实施方案中，在所述第一时间段、第二时间段和第三时间段的一个或多个中去除第一体积的第一液体培养基和添加第二体积的第二液体培养基是同时进行的。在这些方法的任一种的一些实施方案中，在所述第一时间段、第二时间段和第三时间段的一个或多个中去除第一体积的第一液体培养基和添加第二体积的第二液体培养基是连续进行的。在这些方法的任一种的一些实施方案中，在所述第一时间段、第二时间段和第三时间段的一个或多个中去除第一体积的第一液体培养基和添加第二体积的第二液体培养基是周期性地进行的。在这些方法的任一种的一些实施方案中，其中所述摇瓶是透气性的且容积为约20mL至约1L。在这些方法的任一种的一些实施方案中，所述第一液体培养基的体积是约40mL至约80mL。在这些方法的任一种的一些实施方案中，所述第一时间段中使用的第一液体培养基和第二液体培养基是含血清液体培养基或含动物来源组分的液体培养基，而所述第二时间段和第三时间段中使用的第一液体培养基和第二液体培养基是无血清液体培养基、无动物来源组分的液体培养基或无蛋白质的培养基。在这些方法的任一种的一些实施方案中，在所述第一时间段、第二时间段和第三时间段一个或多个的期间，在从摇瓶去除第一体积的第一液体培养基之前中止搅拌至少30秒。在这些方法的任一种的一些实施方案中，所述多个微载体的平均直径为约200μm至约800μm。在这些方法的任一种的一些实施方案中，所述多个微载体含有一个或多个孔。在这些方法的任一种的一些实施方案中，所述一个或多个孔的平均直径为约25μm至约35μm。在这些方法的任一种的一些实施方案中，在所述第三时间段去除的第一体积的第一液体培养基含有显著数量的微载体。在这些方法的任一种的一些实施方案中，在所述第三时间段去除的第一体积的第一液体培养基是基本不含微载体的。在这些方法的任一种的一些实施方案中，在所述第一时间段、第二时间段和第三时间段的一个或多个中去除的第一液体培养基的第一体积和添加的第二液体培养基的第二体积是第一液体培养基体积的约70％。在这些方法的任一种的一些实施方案中，所述摇瓶在(b)、(c)和(d)的一个或多个中以距水平约25度至约90度的反应器角度进行温育，或以相对于台面或水平约45度的角度进行温育。

本文还提供生产重组蛋白的方法。这些方法包括：提供含有置于第一液体培养基中的哺乳动物细胞的摇瓶，所述哺乳动物细胞含有编码重组蛋白的核酸，其中所述第一液体培养基占据约20％至约30％的摇瓶容积并含有浓度为约1.0g/L至约15.0g/L的多个微载体；在约32℃至约39℃并伴随约85转每分钟(RPM)至约125RPM的旋转搅拌将所述摇瓶温育一段时间；和在所述一段时间的最初48-96小时后，连续地或周期性地去除第一体积的第一液体培养基并向所述第一液体培养基添加第二体积的第二液体培养基，其中所述第一和第二体积大致相等；和从所述哺乳动物细胞或从所述第一和/或第二液体培养基回收重组蛋白。在这些方法的任一种的一些实施方案中，所述重组蛋白是从哺乳动物细胞回收的。在这些方法的任一种的一些实施方案中，所述重组蛋白是从哺乳动物细胞回收的。在这些方法的任一种的一些实施方案中，所述重组蛋白是从第一和/或第二液体培养基回收的。在这些方法的任一种的一些实施方案中，去除的第一体积的第一液体培养基是基本不含微载体的。在这些方法的任一种的一些实施方案中，所述第一液体培养基占据约25％至约30％的摇瓶容积。在这些方法的任一种的一些实施方案中，在所述一段时间的开始时，所述第一液体培养基含有0.1x10⁶细胞/mL-0.5x10⁶细胞/mL。在这些方法的任一种的一些实施方案中，所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在这些方法的任一种的一些实施方案中，所述重组蛋白是免疫球蛋白、酶、生长因子、蛋白片段或工程化蛋白。在这些方法的任一种的一些实施方案中，所述重组蛋白分泌至第一和/或第二液体培养基中。在这些方法的任一种的一些实施方案中，去除第一体积的第一液体培养基和添加第二体积的第二液体培养基是同时进行的。在这些方法的任一种的一些实施方案中，去除第一体积的第一液体培养基和添加第二体积的第二液体培养基是连续进行的。在这些方法的任一种的一些实施方案中，去除第一体积的第一液体培养基和添加第二体积的第二液体培养基是周期性地进行的。在这些方法的任一种的一些实施方案中，去除的第一液体培养基的第一体积和添加的第二液体培养基的第二体积是随时间增加的。在这些方法的任一种的一些实施方案中，所述第一液体培养基与第二液体培养基相同。在这些方法的任一种的一些实施方案中，所述第一液体培养基与第二液体培养基不同。在这些方法的任一种的一些实施方案中，所述摇瓶是透气性的且容积为约20mL至约1L。在这些方法的任一种的一些实施方案中，所述哺乳动物细胞悬浮于约40mL至约80mL的第一液体培养基中。在这些方法的任一种的一些实施方案中，所述第一液体培养基和/或第二液体培养基选自下组：化学成分确定的液体培养基、无血清液体培养基、含血清液体培养基、无动物来源组分的液体培养基和无蛋白质的培养基。在这些方法的任一种的一些实施方案中，在所述一段时间的最初48-96小时后，在每个24小时的时段中，去除的第一液体培养基的第一体积和添加的第二液体培养基的第二体积为第一液体培养基的体积的约30％至约95％。在这些方法的任一种的一些实施方案中，在去除第一体积的第一液体培养基之前中止搅拌至少30秒的一段时间。在这些方法的任一种的一些实施方案中，所述多个微载体的平均直径为约200μm至约800μm。在这些方法的任一种的一些实施方案中，所述多个微载体含有一个或多个孔。在这些方法的任一种的一些实施方案中，所述一个或多个孔的平均直径为约25μm至约35μm。在这些方法的任一种的一些实施方案中，所述摇瓶以距水平约25度至约90度的反应器角度进行温育，或以相对于台面或水平约45度的角度进行温育。

还提供了生产重组蛋白的方法，所述方法包括：(a)提供含有置于第一液体培养基中的哺乳动物细胞的摇瓶，所述哺乳动物细胞含有编码重组蛋白的核酸，其中所述第一液体培养基占据约20％至约30％的摇瓶容积并含有浓度为约1.0g/L至约15.0g/L的多个微载体；(b)在约35℃至约39℃并伴随约85转每分钟(RPM)至约125RPM的旋转搅拌将所述摇瓶温育第一时间段，并在所述第一时间段的最初48-96小时后，在随后的每个24小时的时段中，(i)连续地或周期性地从摇瓶去除第一体积的基本不含微载体的第一液体培养基，其中所述第一体积是第一液体培养基体积的约10％至约95％；和(ii)向摇瓶添加第二体积的第二液体培养基，其中所述第一和第二体积大致相等；(c)在细胞浓度达到约目标细胞密度后，于约32℃至约39℃处伴随旋转搅拌将摇瓶温育约2天至约7天的第二时间段，并在每个24小时的时段中进行步骤(b)(i)和(b)(ii)，其中步骤(b)中所使用的第一和第二液体培养基与步骤(c)中使用的那些是基本不同类型的；和(d)于约35℃至约39℃处伴随旋转搅拌将摇瓶温育大于2天的第三时间段，并在每个24小时的时段中进行步骤(b)(i)和(b)(ii)，其中步骤(c)中所使用的第一和第二液体培养基与步骤(d)中使用的那些是相同类型的；和(e)从所述哺乳动物细胞或从所述第一、第二和/或第三时间段期间使用的第一和/或第二液体培养基回收重组蛋白。在这些方法的任一种的一些实施方案中，所述重组蛋白是从哺乳动物细胞回收的。在这些方法的任一种的一些实施方案中，所述重组蛋白是从所述第一、第二和第三时间段的一个或多个期间使用的第一和/或第二液体培养基回收的。在这些方法的任一种的一些实施方案中，所述第一液体培养基占据约25％至约30％的摇瓶容积。在这些方法的任一种的一些实施方案中，在所述第一时间段的开始时，所述第一液体培养基含有0.1x10⁶细胞/mL-0.5x10⁶细胞/mL。在这些方法的任一种的一些实施方案中，所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在这些方法的任一种的一些实施方案中，所述重组蛋白是免疫球蛋白、酶、生长因子、蛋白片段或工程化蛋白。在这些方法的任一种的一些实施方案中，所述重组蛋白分泌至所述第一时间段、第二时间段和第三时间段的一个或多个期间使用的第一和/或第二液体培养基中。在这些方法的任一种的一些实施方案中，在所述第一时间段、第二时间段和第三时间段的一个或多个中，去除第一体积的第一液体培养基和添加第二体积的第二液体培养基是同时进行的。在这些方法的任一种的一些实施方案中，在所述第一时间段、第二时间段和第三时间段的一个或多个中，去除第一体积的第一液体培养基和添加第二体积的第二液体培养基是连续进行的。在这些方法的任一种的一些实施方案中，在所述第一时间段、第二时间段和第三时间段的一个或多个中，去除第一体积的第一液体培养基和添加第二体积的第二液体培养基是周期性地进行的。在这些方法的任一种的一些实施方案中，所述摇瓶是透气性的且容积为约20mL至约1L。在这些方法的任一种的一些实施方案中，所述第一液体培养基的体积是约40mL至约80mL。在这些方法的任一种的一些实施方案中，所述第一时间段中使用的第一液体培养基和第二液体培养基是含血清液体培养基或含动物来源组分的液体培养基，而所述第二时间段和第三时间段中使用的第一液体培养基和第二液体培养基是无血清液体培养基、无动物来源组分的液体培养基或无蛋白质的培养基。在这些方法的任一种的一些实施方案中，在所述第一时间段、第二时间段和第三时间段的一个或多个期间，在从摇瓶去除第一体积的第一液体培养基之前中止搅拌至少30秒。在这些方法的任一种的一些实施方案中，所述多个微载体的平均直径为约200μm至约800μm。在这些方法的任一种的一些实施方案中，所述多个微载体含有一个或多个孔。在这些方法的任一种的一些实施方案中，所述一个或多个孔的平均直径为约25μm至约35μm。在这些方法的任一种的一些实施方案中，在所述第三时间段去除的第一体积的第一液体培养基含有显著数量的微载体。在这些方法的任一种的一些实施方案中，在所述第三时间段去除的第一体积的第一液体培养基是基本不含微载体的。在这些方法的任一种的一些实施方案中，在所述第一时间段、第二时间段和第三时间段的一个或多个中去除的第一液体培养基的第一体积和添加的第二液体培养基的第二体积是第一液体培养基体积的约70％。在这些方法的任一种的一些实施方案中，所述摇瓶在(b)、(c)和(d)的一个或多个中以距水平约25度至约90度的反应器角度进行温育，或以相对于台面或水平约45度的角度进行温育。

本文还提供用于测试用于制备重组蛋白的制造过程的方法。这些方法包括：提供含有置于第一液体培养基中的哺乳动物细胞的摇瓶，所述哺乳动物细胞含有编码重组蛋白的核酸，其中所述第一液体培养基占据约20％至约30％的摇瓶容积并含有浓度为约1.0g/L至约15.0g/L的多个微载体；在约32℃至约39℃并伴随约85转每分钟(RPM)至约125RPM的旋转搅拌将所述摇瓶温育一段时间；和在所述一段时间的最初48-96小时后，连续地或周期性地去除第一体积的第一液体培养基并向所述第一液体培养基添加第二体积的第二液体培养基，其中所述第一和第二体积大致相等；检测细胞中的或第一和/或第二培养基中的重组蛋白；和将细胞中的或第一和/或第二培养基中存在的重组蛋白的量与重组蛋白的参考水平进行比较。在这些方法的任一种的一些实施方案中，所述第一体积的第一液体培养基是基本不含哺乳动物细胞的。在这些方法的任一种的一些实施方案中，所述重组蛋白的参考水平是用不同的培养方法生产的重组蛋白的水平。在这些方法的任一种的一些实施方案中，所述不同的培养方法利用不同的第一或第二液体培养基、不同的哺乳动物细胞、不同的温度、不同的搅拌水平、不同的摇瓶或不同的微载体。在这些方法的任一种的一些实施方案中，所述不同的培养方法利用不同的原料成分、抗结块剂或化学成分确定的液体培养基。在这些方法的任一种的一些实施方案中，所述方法用于进行高通量细胞培养实验来执行实验设计(design-of-experiment；DOE)或质量源于设计(quality-by-design；QBD)研究。在这些方法的任一种的一些实施方案中，所述第一液体培养基占据约25％至约30％的摇瓶容积。在这些方法的任一种的一些实施方案中，所述摇瓶是透气性的且容积为约20mL至约1L。在这些方法的任一种的一些实施方案中，所述哺乳动物细胞悬浮于约40mL至约80mL的第一液体培养基中。在这些方法的任一种的一些实施方案中，所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在这些方法的任一种的一些实施方案中，所述重组蛋白是分泌的免疫球蛋白、分泌的酶、分泌的生长因子、分泌的蛋白片段或分泌的工程化蛋白，并且其中所述重组蛋白是从第一或第二培养基回收的。在这些方法的任一种的一些实施方案中，所述重组蛋白是从哺乳动物细胞回收的。在这些方法的任一种的一些实施方案中，所述重组蛋白是免疫球蛋白、酶、生长因子、蛋白片段或工程化蛋白。在这些方法的任一种的一些实施方案中，去除第一体积的第一液体培养基和添加第二体积的第二液体培养基是同时进行的。在这些方法的任一种的一些实施方案中，去除第一体积的第一液体培养基和添加第二体积的第二液体培养基是连续进行的。在这些方法的任一种的一些实施方案中，去除第一体积的第一液体培养基和添加第二体积的第二液体培养基是周期性地进行的。在这些方法的任一种的一些实施方案中，去除的第一液体培养基的第一体积和添加的第二液体培养基的第二体积是随时间增加的。在这些方法的任一种的一些实施方案中，所述第一液体培养基和/或第二液体培养基选自下组：化学成分确定的液体培养基、无血清液体培养基、含血清液体培养基、无动物来源组分的液体培养基和无蛋白质的培养基。在这些方法的任一种的一些实施方案中，所述摇瓶以距水平约25度至约90度的反应器角度进行温育，或以相对于台面或水平约45度的角度进行温育。

还提供了测试用于在生产重组蛋白的方法中使用的第一或第二液体培养基、存在于第一或第二液体培养基中的原料成分或补充物或哺乳动物细胞来源的效力的方法。这些方法包括：提供摇瓶，其含有置于第一液体培养基中的哺乳动物细胞，其中所述第一液体培养基占据约20％至约30％的摇瓶容积并含有浓度为约1.0g/L至约15.0g/L的多个微载体；在约32℃至约39℃并伴随约85转每分钟(RPM)至约125RPM的旋转搅拌将所述摇瓶温育一段时间；和在所述一段时间的最初48-96小时后，连续地或周期性地去除第一体积的第一液体培养基并向所述第一液体培养基添加第二体积的第二液体培养基，其中所述第一和第二体积大致相等；检测细胞中的或第一和/或第二培养基中的重组蛋白；将细胞中的或第一和/或第二培养基中存在的重组蛋白的量与通过不同的方法生产的重组蛋白的参考水平进行比较，所述不同的方法使用了一种或多种不同的第一或第二液体培养基、存在于第一或第二液体培养基中的不同的原料成分或补充物或不同的哺乳动物细胞来源；和鉴定与重组蛋白量的增加有关的所述第一或第二液体培养基、存在于第一或第二液体培养基中的不同的原料成分或补充物或哺乳动物细胞来源，将其鉴定为用于生产重组蛋白的方法中是有效的，其中所述重组蛋白量的增加是与参考水平相比。在这些方法的任一种的一些实施方案中，所述摇瓶以距水平约25度至约90度的反应器角度进行温育，或以相对于台面或水平约45度的角度进行温育。

本文还提供对生产重组蛋白的制造工艺进行优化的方法。这些方法包括：提供摇瓶，其含有置于第一液体培养基中的哺乳动物细胞，其中所述第一液体培养基占据约20％至约30％的摇瓶容积并含有浓度为约1.0g/L至约15.0g/L的多个微载体；在约32℃至约39℃并伴随约85转每分钟(RPM)至约125RPM的旋转搅拌将所述摇瓶温育一段时间；和在所述一段时间的最初48-96小时后，连续地或周期性地去除第一体积的第一液体培养基并向所述第一液体培养基添加第二体积的第二液体培养基，其中所述第一和第二体积大致相等；检测细胞中的或第一和/或第二培养基中的重组蛋白；将细胞中的或第一和/或第二培养基中存在的重组蛋白的量与通过不同的方法生产的重组蛋白的参考水平进行比较；和鉴定并去除或修改制造工艺中任何与产生的重组蛋白量的减少有关的培养组分或参数，所述重组蛋白量的减少是与参考水平相比；或是鉴定并增加制造工艺中任何与产生的重组蛋白量的增加有关的培养组分或参数，所述重组蛋白量的增加是与参考水平相比。在这些方法的任一种的一些实施方案中，所述摇瓶以距水平约25度至约90度的反应器角度进行温育，或以相对于台面或水平约45度的角度进行温育。

还提供了测试第一或第二液体培养基中、用于产生第一或第二液体培养基的原料成分中或哺乳动物细胞来源中污染物的存在的方法，所述方法包括：提供摇瓶，其含有置于第一液体培养基中的哺乳动物细胞，其中所述第一液体培养基占据约20％至约30％的摇瓶容积并含有浓度为约1.0g/L至约15.0g/L的多个微载体；在约32℃至约39℃并伴随约85转每分钟(RPM)至约125RPM的旋转搅拌将所述摇瓶温育一段时间；和在所述一段时间的最初48-96小时后，连续地或周期性地去除第一体积的第一液体培养基并向所述第一液体培养基添加第二体积的第二液体培养基，其中所述第一和第二体积大致相等；检测细胞中的或第一和/或第二培养基中的重组蛋白；将细胞中的或第一和/或第二培养基中存在的重组蛋白的量与通过不同的方法生产的重组蛋白的参考水平进行比较，所述不同的方法使用不同的第一或第二液体培养基、用于产生第一或第二液体培养基的不同的原料成分或不同的哺乳动物细胞来源；和当产生的重组蛋白水平低于参考水平时，将第一或第二液体培养基、用于产生第一或第二液体培养基的原料成分或哺乳动物细胞来源鉴定为含有污染物。在这些方法的任一种的一些实施方案中，其中所述污染物是生物污染物。在这些方法的任一种的一些实施方案中，所述生物污染物选自下组：分枝杆菌、真菌、细菌、病毒和不想要的哺乳动物细胞。在这些方法的任一种的一些实施方案中，所述摇瓶以距水平约25度至约90度的反应器角度进行温育，或以相对于台面或水平约45度的角度进行温育。

如用于本文，名词前的词语“一”或“多个(plurality)”代表一个或多个该特定名词。例如，短语“一哺乳动物细胞”代表“一个或多个哺乳动物细胞”，而短语“多个微载体”意为“一个或多个微载体”。

术语“哺乳动物细胞”意指任何来自或源自任何哺乳动物(例如，人、仓鼠、小鼠、绿猴、大鼠、猪、牛或兔)的细胞。在一些实施方案中，哺乳动物细胞可以是例如永生化细胞、分化的细胞或未分化的细胞。

术语“目标细胞密度”意为每个培养基体积特定的细胞浓度，其用于在培养物中产生重组蛋白。目标细胞密度可以根据所培养的具体哺乳动物细胞而变化。例如，目标细胞密度可以是约1.0x10⁶细胞/mL至约50x10⁶细胞/mL(例如约2.0x10⁶细胞/mL至约3.0x10⁶细胞/mL)。

术语“基本不含”意指至少或约90％不含(例如，至少或约95％、96％、97％、98％，或至少或约99％不含或约100％不含)特定物质(例如，哺乳动物细胞或微载体)的组合物(例如液体培养基)。

术语“培养”或“细胞培养”意指在一组受控的物理条件下在液体培养基中个维持哺乳动物细胞或使哺乳动物细胞生长。

术语“摇瓶”意指能保持有一定体积的液体培养基的容器(例如无菌容器)，其具有至少一个透气性表面(例如具有至少一个透气性元件(例如膜)的末端，其还可起到无菌屏障的作用)和/或至少一个通气帽，并且其形状至少一部分是近似截头圆锥形的(frustoconical)。例如，摇瓶可以是细胞培养瓶，如T-瓶(T-flask)、锥形瓶(Erlenmeyerflask)或其本领域内公认的任何修改版本。

术语“液体培养基”意指含有足以允许哺乳动物细胞在体外在介质中生长的营养物的流体。例如，液体培养基可以含有下列一种或多种：氨基酸(例如20种氨基酸)、嘌呤(例如次黄嘌呤)，嘧啶(例如胸苷)、胆碱、肌醇、硫胺素、叶酸、生物素、钙、烟酰胺、吡哆醇、核黄素、胸苷、氰钴胺素、丙酮酸(盐)、硫辛酸、镁、葡萄糖、钠、钾、铁、铜、锌、硒、及其他必需微量金属元素(tracemetal)和碳酸氢钠。液体培养基可以含有来自哺乳动物的血清。在一些例子中，液体培养基不含血清或来自哺乳动物的另一提取物(确定的液体培养基)。在一些实施方案中，液体培养基可含有微量金属元素、哺乳动物生长激素和/或哺乳动物生长因子。液体培养基的非限制性实例在本文中描述，并且另外的实例是本领域已知的，并且是市售的。

短语“基本不同类型的液体培养基”意指含有与另一液体培养基基本不同的营养物概貌(profile)的液体培养基。例如，含有一种或多种哺乳动物血清、哺乳动物蛋白或哺乳动物蛋白级分或提取物(例如含血清的液体培养基)的液体培养基与不含任何哺乳动物血清、哺乳动物蛋白或哺乳动物蛋白级分或提取物的液体培养基(例如无动物来源组分的培养基、无血清的液体培养基、化学成分确定的液体培养基和无蛋白质的液体培养基)是基本不同类型的液体培养基。

术语“基本相同类型的液体培养基”意指含有与另一液体培养基大致相同的营养物概貌的液体培养基。例如，若液体培养基A和液体培养基B均含有一种或多种哺乳动物血清、哺乳动物蛋白和哺乳动物蛋白级分或提取物(例如含血清的液体培养基)，则它们是基本相同的。在另一个实例中，若液体培养基A和液体培养基B均不含任何哺乳动物血清、哺乳动物蛋白和哺乳动物蛋白级分或提取物(例如无动物来源组分的培养基、无血清的液体培养基、化学成分确定的液体培养基和无蛋白质的液体培养基)，则它们是基本相同的。

术语“微载体”意指尺寸为20μm至约1000μm的含有表面的颗粒(例如有机聚合物)，所述表面是容许性(permissive)的或是促进哺乳动物细胞(例如本文描述的或本领域已知的哺乳动物细胞的任一种)附着的。微载体可以含有一个或多个孔(例如平均直径为约10μm至约100μm的孔)。微载体的非限制性实例在本文中描述。微载体的其他例子是本领域已知的。微载体可以含有例如聚合物(例如纤维素、聚乙二醇或聚-(乳酸-羟基乙酸共聚物))。

术语“无动物来源组分的液体培养基”意指不含任何源自动物的组分(例如蛋白质或血清)的液体培养基。

术语“无血清液体培养基”意指不含哺乳动物血清的液体培养基。

术语“含血清液体培养基”意指含有哺乳动物血清的液体培养基。

术语“化学成分确定的液体培养基”意指其中基本上全部化学成分均已知的液体培养基。例如，化学成分确定的液体培养基不含胎牛血清、牛血清白蛋白或人血清白蛋白，因为这些制备物通常含有白蛋白和脂质的复杂混合物。

术语“无蛋白质液体培养基”意指不含任何蛋白质(例如任何可检测的蛋白)的液体培养基。

“旋转搅拌”是本领域所熟知的术语，其意指为了例如增加摇瓶所含的液体培养基中的溶解O₂浓度而使摇瓶进行的圆形方式的运动，例如顺时针或逆时针运动。搅拌可以用任何本领域已知方法来进行，例如，以圆形或椭圆形运动来移动摇瓶的设备，如旋转摇床(rotaryshaker)。能用于进行旋转搅拌的示例性装置在本文中描述。这些装置的其他实例是本领域已知的，并且是市售的。

术语“免疫球蛋白”意指含有免疫球蛋白的至少15个氨基酸(例如，至少20、30、40、50、60、70、80、90或100个氨基酸)的氨基酸序列的多肽(例如可变结构域序列、框架序列或恒定结构域序列)。例如，免疫球蛋白可包括轻链免疫球蛋白的至少15个氨基酸，例如重链免疫球蛋白的至少15个氨基酸。免疫球蛋白可以是分离的抗体(例如IgG、IgE、IgD、IgA或IgM)。免疫球蛋白可以是IgG的亚类(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)。免疫球蛋白可以是抗体片段，例如，Fab片段、F(ab′)₂片段或scFv片段。免疫球蛋白也可以是双特异性抗体或三特异性抗体，或二聚体、三聚体或多聚体抗体，或双抗体、或免疫球蛋白还可以是含有至少一个免疫球蛋白结构域的工程化蛋白(例如融合蛋白)。免疫球蛋白的非限制性实例在本文描述，并且免疫球蛋白的其他实例是本领域已知的。

术语“蛋白片段”或“多肽片段”意指多肽序列的一部分，其长度为至少或约4个氨基酸、至少或约5个氨基酸、至少或约6个氨基酸、至少或约7个氨基酸、至少或约8个氨基酸、至少或约9个氨基酸、至少或约10个氨基酸、至少或约11个氨基酸、至少或约12个氨基酸、至少或约13个氨基酸、至少或约14个氨基酸、至少或约15个氨基酸、至少或约16个氨基酸、至少或约17个氨基酸、至少或约18个氨基酸、至少或约19个氨基酸或至少或约20个氨基酸，或长度超过20个氨基酸。重组蛋白片段可以使用任何本文描述的方法产生。

术语“工程化蛋白”意指不是由生物体(例如，哺乳动物)内存在的内源核酸天然编码的多肽。工程化蛋白的实例包括酶(例如具有导致工程化的酶的稳定性和/或催化活性增加的一个或多个氨基酸取代、缺失、插入或添加)、融合蛋白、抗体(例如，二价抗体、三价抗体或双抗体)和含有至少一种重组支架序列的抗原结合蛋白。

术语“回收(recover)”或“回收(recovering)”在一些语境中意指将重组蛋白的至少部分从细胞培养基中存在的一种或多种其他组分(例如哺乳动物细胞或培养基蛋白)或从哺乳动物细胞裂解物中存在的一种或多种其他组分(例如DNA、RNA或其他蛋白)纯化或分离(按重量计，例如至少或约5％纯、例如至少或约10％、15％、20％、25％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或至少或约95％纯)。从液体培养基或从哺乳动物细胞裂解物回收蛋白的非限制性方法在本文中描述，并且是本领域已知的。

术语“分泌的蛋白”或“分泌的重组蛋白”意指这样的蛋白质或重组蛋白，当其在哺乳动物细胞内被翻译时最初含有至少一个分泌信号序列，并且在哺乳动物细胞中通过(至少部分通过)酶促切割分泌信号序列释放到胞外空间(例如液体培养基)中。

短语“梯度灌注”是本领域已知的，其意指在培养期间随递增的时间段(例如，约24小时的时间段、约1分钟至约24小时的时间段或大于24小时的时间段)从初始培养物去除的和对其添加的培养基体积的增量变化(例如增加或减少)(例如，每日的培养基再补料速率)。每天去除和替换的培养基所占分数可以根据所培养的具体细胞、初始接种密度和特定时间的细胞密度而变化。

术语“补料分批培养”意指向初始细胞培养物递增或连续添加第二液体培养基，而不实质性地或显著地从细胞培养物去除第一液体培养基。在一些实例中，所述第二液体培养基与所述第一液体培养基相同。在其他实例中，所述第二液体培养基浓缩自所述第一液体培养基，和/或作为干粉添加。

术语“反应器角度”意指在本文所述培养方法期间，含有哺乳动物细胞的摇瓶放置的距水平位置的偏向角。例如，当含有哺乳动物细胞的摇瓶相对于实验台或地面垂直立置，反应器角度为90°，而当含有哺乳动物细胞的摇瓶相对于实验台或地面水平放置，反应器角度为0°。在另一个实例中，当含有哺乳动物细胞的摇瓶置于垂直和水平位置(相对于实验台或地面)之间等距处时，反应器角度为45°。

“比生产率(specificproductivityrate)”或“SPR”如本文所用意指每天每个哺乳动物细胞产生的重组蛋白的质量或酶活性。重组抗体的SPR通常测量为质量/细胞/天。重组酶的SPR通常测量为单位/细胞/天或(单位/质量)/细胞/天。

“体积生产率”或“VPR”如本文所用意指每天每体积的培养物(例如每L的生物反应器、容器或管体积)产生的重组蛋白的质量或酶活性。重组抗体的VPR通常测量为质量/L/天。重组酶的VPR通常测量为单位/L/天或质量/L/天。

除非另行限定，本文使用的科技术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。本文描述了用于本发明中的用途的方法和材料；也可以使用其他本领域已知的合适的方法和材料。所述材料、方法和实例仅为说明性的而不意图进行限制。将本文提及的全部出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目和其他参考文献通过提述以其整体并入。如有冲突，以包括定义在内的本发明说明书为准。

本发明的其他特征和优势从如下详述和附图以及从请求范围中将是显而易见的。

附图说明

图1是显示了示例性的瓶架(rack)示意图，所述瓶架能用于将摇瓶置于相对于台面或水平面约45度的角度，其能在本文所述方法的任一种中使用。

图2是显示随时间经过的重组人α-半乳糖苷酶摇瓶微载体分批再补料细胞培养工艺运行(n＝5)和2000-L生物反应器细胞培养工艺运行(n＝9)中的平均活细胞浓度的图表。阴影区域代表数据的标准差。

图3是显示随时间经过的重组人α-半乳糖苷酶摇瓶微载体分批再补料细胞培养工艺运行(n＝5)中活细胞的平均百分比的图表。阴影区域代表数据的标准差。

图4是显示随时间经过的重组人α-半乳糖苷酶摇瓶微载体分批再补料细胞培养工艺运行(n＝5)中悬浮细胞的平均浓度(未粘附在液体培养基中微载体上的细胞浓度)的图表。阴影区域代表数据的标准差。

图5是显示随时间经过的重组人α-半乳糖苷酶摇瓶微载体分批再补料细胞培养工艺运行(n＝5)和2000-L生物反应器细胞培养工艺运行(n＝9)中的平均体积生产率的图表。阴影区域代表数据的标准差。

图6是显示随时间经过的重组人α-半乳糖苷酶摇瓶微载体分批再补料细胞培养工艺运行(n＝3)中和重组人α-半乳糖苷酶2000-L生物反应器细胞培养工艺运行(n＝3)中的累积体积生产率(单位/L)的图表。

图7是随时间经过的摇瓶微载体分批再补料细胞培养工艺运行的活细胞浓度的示意图，其含有：不同类型的液体培养基(液体培养基A或B)、不同的微载体浓度(1.0g/L或1.5g/L的微载体浓度)和/或不同的旋转频率(85RPM或125RPM)。

图8是生长期和收获期卫星摇瓶培养研究的示意图。

图9是随时间经过的生长期卫星摇瓶培养和40-L生物反应器培养中的活细胞浓度的图表。误差线代表数据的+/-1标准差(n＝2)。“1”代表当搅拌频率从85RPM增加至95RPM时的时间点。将生长期卫星摇瓶培养数据移动-1天，以便更精确地将其数据与40-L生物反应器培养数据进行比较。

图10是随时间经过的生长期卫星摇瓶培养和40-L生物反应器培养中的活细胞百分比的图表。误差线代表数据的+/-1标准差(n＝2)。“1”代表当搅拌频率从85RPM增加至95RPM时的时间点。将生长期卫星摇瓶培养数据移动-1天，以便更精确地将其数据与40-L生物反应器培养数据进行比较。

图11是随时间经过的生长期卫星摇瓶培养和40-L生物反应器培养中的悬浮细胞浓度的图表。误差线代表数据的+/-1标准差(n＝2)。“1”代表当搅拌频率从85RPM增加至95RPM时的时间点。将生长期卫星摇瓶培养数据移动-1天，以便更精确地将其数据与40-L生物反应器培养数据进行比较。

图12是随时间经过的生长期卫星摇瓶培养和40-L生物反应器培养中的重组人α-半乳糖苷酶滴度(单位/L)的图表。误差线代表数据的+/-1标准差(n＝2)。将生长期卫星摇瓶培养数据移动-1天，以便更精确地将其数据与40-L生物反应器培养数据进行比较。

图13是随时间经过的生长期卫星摇瓶培养和40-L生物反应器培养的重组人α-半乳糖苷酶的比生产率(单位每1x10⁶细胞)的图表。误差线代表数据的+/-1标准差(n＝2)。将生长期卫星摇瓶培养数据移动-1天，以便更精确地将其数据与40-L生物反应器培养数据进行比较。

图14是随时间经过的生长期卫星摇瓶培养和40-L生物反应器培养的从葡萄糖生成乳酸盐的产量(乳酸盐的摩尔数/葡萄糖摩尔数)的图表。误差线代表数据的+/-1标准差(n＝2)。将生长期卫星摇瓶培养数据移动-1天，以便更精确地将其数据与40-L生物反应器培养数据进行比较。

图15是随时间经过的收获期卫星摇瓶培养和40-L生物反应器培养的活细胞浓度的图表。显示了平均数据(40-L，n＝3；68mL以95RPM，n＝3；60mL以95RPM，n＝2；以及60mL以110RPM，n＝2)，误差线代表数据的+/-1标准差。

图16是随时间经过的收获期卫星摇瓶培养和40-L生物反应器培养中的活细胞百分比的图表。显示了平均数据(40-L，n＝3；68mL以95RPM，n＝3；60mL以95RPM，n＝2；以及60mL以110RPM，n＝2)，误差线代表数据的+/-1标准差。

图17是随时间经过的收获期卫星摇瓶培养和40-L生物反应器培养中的悬浮细胞浓度的图表。显示了平均数据(40L，n＝3；68mL以95RPM，n＝3；60mL以95RPM，n＝2；以及60mL以110RPM，n＝2)，误差线代表数据的+/-1标准差。

图18是随时间经过的收获期卫星摇瓶培养和40-L生物反应器培养中的重组人α-半乳糖苷酶(单位/L)的图表。显示了平均数据(40L，n＝3；68mL以95RPM，n＝3；60mL以95RPM，n＝2；以及60mL以110RPM，n＝2)，误差线代表数据的+/-1标准差。

图19是随时间经过的收获期卫星摇瓶培养和40-L生物反应器培养中的重组人α-半乳糖苷酶(单位每1x10⁶细胞)的图表。显示了平均数据(40L，n＝3；68mL以95RPM，n＝3；60mL以95RPM，n＝2；以及60mL以110RPM，n＝2)，误差线代表数据的+/-1标准差。

图20是随时间经过的收获期卫星摇瓶培养和40-L生物反应器培养的每克葡萄糖的重组人α-半乳糖苷酶(单位/g)的产量的图表。显示了平均数据(40L，n＝3；68mL以95RPM，n＝3；60mL以95RPM，n＝2；以及60mL以110RPM，n＝2)，误差线代表数据的+/-1标准差。

图21是随时间经过的收获期卫星摇瓶培养和40-L生物反应器培养的从葡萄糖生成乳酸盐的产量(乳酸盐的摩尔数/葡萄糖摩尔数)的图表。显示了平均数据(40L，n＝3；68mL以95RPM，n＝3；60mL以95RPM，n＝2；以及60mL以110RPM，n＝2)，误差线代表数据的+/-1标准差。

图22是随时间经过的收获期卫星摇瓶培养和40-L生物反应器培养中存在的凋亡细胞百分比的图表。显示了平均数据(40L，n＝3；68mL以95RPM，n＝3；60mL以95RPM，n＝2；以及60mL以110RPM，n＝2)，误差线代表数据的+/-1标准差。

图23是随时间经过的收获期卫星摇瓶培养和40-L生物反应器培养中存在的非凋亡细胞百分比的图表。显示了平均数据(40L，n＝3；68mL以95RPM，n＝3；60mL以95RPM，n＝2；以及60mL以110RPM，n＝2)，误差线代表数据的+/-1标准差。

图24是显示收获期卫星摇瓶培养CD-水解产物研究设计的示意图。

图25是随时间经过的每个收获期卫星摇瓶培养和每个40-L生物反应器培养中的活细胞浓度的图表。

图26是随时间经过的每个收获期卫星摇瓶培养和每个40-L生物反应器培养中的活细胞百分比的图表。

图27是随时间经过的每个收获期卫星摇瓶培养和每个40-L生物反应器培养中的悬浮细胞浓度的图表。

图28是随时间经过的每个收获期卫星摇瓶培养和每个40-L生物反应器培养中存在的重组人α-半乳糖苷酶滴度(单位/L)的图表。

图29是随时间经过的每个收获期卫星摇瓶培养和每个40-L生物反应器培养的重组人α-半乳糖苷酶比生产率(SPR)(单位/[1x10⁹细胞·天])的图表。

发明详述

本发明提供了改进的在摇瓶中培养哺乳动物细胞的方法，所述方法使用多个微载体和分批再补料灌注。本文所述的培养方法能达到哺乳动物细胞的高浓度水平，进而改进培养方法的总体效率并提供高产量的想要的细胞产物，如重组蛋白。例如，所述方法能提供大于2x10⁶细胞每mL、大于3x10⁶细胞/mL、大于4x10⁶细胞/mL、大于5x10⁶细胞/mL、大于6x10⁶细胞/mL、大于7x10⁶细胞/mL、大于8x10⁶细胞/mL、大于9x10⁶细胞/mL、大于10x10⁶细胞/mL、大于12x10⁶细胞/mL、大于14x10⁶细胞/mL、大于16x10⁶细胞/mL、大于18x10⁶细胞/mL、大于20x10⁶细胞/mL、大于25x10⁶细胞/mL、大于30x10⁶细胞/mL、大于35x10⁶细胞/mL、大于40x10⁶细胞/mL、大于45x10⁶细胞/mL或大于50x10⁶细胞/mL的活哺乳动物细胞浓度(例如在第一和/或第二液体培养基中，或在第一、第二和第三时间段的一个或多个中的第一和/或第二液体培养基中)。例如，所述培养方法能得到1x10⁶细胞/mL至3x10⁶细胞/mL、3x10⁶细胞/mL至5x10⁶细胞/mL、5x10⁶细胞/mL至7x10⁶细胞/mL、7x10⁶细胞/mL至9x10⁶细胞/mL、9x10x10⁶细胞/mL至11x10⁶细胞/mL、10x10⁶细胞/mL至12x10⁶细胞/mL、11x10⁶细胞/mL至13x10⁶细胞/mL、12x10⁶细胞/mL至14x10⁶细胞/mL、14x10⁶细胞/mL至16x10⁶细胞/mL、16x10⁶细胞/mL至18x10⁶细胞/mL、18x10⁶细胞/mL至20x10⁶细胞/mL、20x10⁶细胞/mL至25x10⁶细胞/mL、25x10⁶细胞/mL至30x10⁶细胞/mL,30x10⁶细胞/mL至35x10⁶细胞/mL、35x10⁶细胞/mL至40x10⁶细胞/mL、40x10⁶细胞/mL至45x10⁶细胞/mL、45x10⁶细胞/mL至50x10⁶细胞/mL或大于50x10⁶细胞/mL的活哺乳动物细胞浓度。在一些实例中，本文所述的方法导致重组蛋白生物活性的增加(例如与通过不同方法产生的重组蛋白的生物活性相比)。

多种不同的确定细胞密度或活细胞密度的方法都是可以使用的，并且是本领域所熟知的。例如，可以对含有微载体的细胞培养物样品进行处理以将细胞从微载体表面释放，并且任选地能将被释放的细胞稀释于生理缓冲液中，并将细胞悬液(例如经稀释的细胞悬液)置于血细胞计数器中并用光学显微镜进行计数。在另一个方法中，活细胞密度可以用类似的方法来确定，但在生理缓冲液中包括燃料，所述染料被非活细胞选择性地占据(例如台盼蓝，如来自BeckmanCoulter的Vi-CELL方法(参见BeckmanCoulter网站))。在又一个实例中，细胞密度或活细胞密度能用荧光辅助的流式细胞术(例如来自MerckMillipore的GUAVA(参见Millipore网站))和其他细胞计数方法来确定。

在一些实例中，培养方法导致了显著提高的比生产率。例如，本文所提供的方法达到的比生产率能够比用本领域已知培养方法(例如不同的摇瓶培养方法)所达到的比生产率大至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、110倍、120倍、130倍、140倍、150倍、160倍、170倍、180倍、190倍或200倍。本文所述方法所达到的体积生产率能够是至少300单位/L/天、至少400单位/L/天、至少500单位/L/天、至少600单位/L/天、至少约800单位/L/天、至少约1,000单位/L/天、至少约1,200单位/L/天、至少约1,400单位/L/天、至少约1,600单位/L/天、至少约1,800单位/L/天、至少约2,000单位/L/天、至少约2,200单位/L/天、至少约3,000单位/L/天、至少4,000单位/L/天、至少5,000单位/L/天、至少6,000单位/L/天、至少7,000单位/L/天、至少8,000单位/L/天、至少9,000单位/L/天、至少10,000单位/L/天或高于10,000单位/L/天(例如在第一和/或第二液体培养基中，或在第一、第二和第三时间段的一个或多个中所使用的第一和/或第二液体培养基中)。在一些实施方案中，本方法所达到的生产率能够是至少0.2g/L、至少0.5g/L、至少0.75g/L、至少1.0g/L、至少1.25g/L、至少1.5g/L、至少1.75g/L、至少2.0g/L、至少2.5g/L、至少3.0g/L、至少3.5g/L、至少4.0g/L、至少4.5g/L或至少5.0g/L(例如在第一和/或第二液体培养基中，或在第一、第二和第三时间段中所使用的第一和/或第二液体培养基中)。

重组蛋白的生物学活性可以用多种本领域已知方法来评估，并取决于具体的重组蛋白的活性。例如，作为免疫球蛋白(例如，抗体或抗体片段)的重组蛋白的生物活性可以通过测量所述抗体与其特异性表位的亲和力来测定(例如，使用Biocore或竞争性酶联吸附测定法)。所述重组蛋白可以是酶(例如，重组半乳糖苷酶，例如，重组α-半乳糖苷酶)，而生物活性可以通过测量酶的活性测定(例如，通过测量可检测底物的浓度的减少或可检测产物的浓度的增加(例如，使用分光光度法或光发射)来测定酶的催化速率常数)。例如，重组半乳糖苷酶的生物活性可以通过测量神经酰胺三己糖苷(GL-3)或半乳糖二糖基神经酰胺(galabiosylceramide)水平的减少，或神经酰胺二己糖苷或半乳糖水平的增加来检测。

培养哺乳动物细胞的方法

在本文所述方法的示例性的方法中，提供摇瓶。向摇瓶添加第一液体培养基，从而使所述培养基占据约10％至约40％，例如约20％至约30％(例如约20％至约22％、约22％至约24％、约24％至约26％、约26％至约28％、约28％至约30％、约20％至约25％或约25％至约30％)的摇瓶容积。向第一液体培养基添加(即在将培养基添加至摇瓶之前或之后)至少一个哺乳动物细胞和多个微载体(摇瓶中的终浓度是约1.0g/L至约15.0g/L，例如摇瓶中的终浓度是约1.0g/L至约2.5g/L、约1.0g/L至约2.0g/L、约1.0g/L至约1.75g/L、约1.0g/L至约1.5g/L、约1.0g/L至约1.25g/L、约2.5g/Lto5.0g/L、约5.0g/L至约7.5g/L、约7.5g/L至约10.0g/L、约10.0g/L至约12.5g/L、约12.5g/L至约15.0g/L、约1.0g/L至约5.0g/L、约5.0g/L至约10.0g/L、约10.0g/L至约15.0g/L、约2.5g/L至约3.5g/L、约3.0g/L至约4.0g/L、约4.0g/L至约5.0g/L、约5.0g/L至约6.0g/L、约6.0g/L至约7.0g/L、约7.0g/L至约8.0g/L、约8.0g/L至约9.0g/L、约9.0g/L至约10.0g/L、约10.0g/L至约11.0g/L、约11.0g/L至约12.0g/L、约12.0g/L至约13.0g/L、约13.0g/L至约14.0g/L或约14.0g/L至约15.0g/L)。本领域技术人员能够理解，向摇瓶添加液体培养基、哺乳动物细胞以及液体培养基的步骤可以按任意顺序发生。在约32℃至约39℃(例如32℃至34℃、32℃至37℃、34℃至37℃、37℃至39℃)将摇瓶温育一段时间，并在旋转振动装置上以约85RPM至约125RPM(例如约85RPM至约120RPM、约85RPM至约110RPM、约85RPM至约100RPM、约85RPM至约95RPM、约85RPM至约105RPM、约90RPM至约110RPM、约95RPM至约115RPM、约100RPM至约120RPM、约105RPM至约125RPM、约110RPM至约125RPM或约100RPM至约125RPM)进行搅拌。例如，细胞可以在培养箱中温育，如抛掷(轨道)直径为25mm或约3mm至约50mm的摇动培养箱，并相应地修改RPM。在一段温育时间的最初48-96小时后，在所述时间段连续地或周期性地去除第一体积的第一液体培养基(例如含有任意哺乳动物细胞浓度的，例如基本不含哺乳动物细胞和/或微载体的或是制成基本不含哺乳动物细胞和/或微载体的第一体积的第一液体培养基)，并向所述第一液体培养基添加第二体积的第二液体培养基。通常，第一和第二体积是大致相等的，但可以有少量变化，例如第一与第二体积相比多至约10％的变化。在一些实施方案中，添加的第二体积的第二液体培养基比去除的第一体积的第一液体培养基少(例如最多约少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％)或多(例如最多约多1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％)。如本领域所知，术语“温育”可以包括短时间段(例如10秒至约10分钟、10秒至约20分钟、10秒至约30分钟、10秒至约40分钟、约10秒至约50分钟或10秒至约1小时)，其中将含有哺乳动物细胞和液体培养基的摇瓶从培养箱中移走，以便去除第一体积的第一液体培养基和添加第二体积的第二液体培养基。

在另一个示例性的方法中，首先提供摇瓶。向摇瓶添加第一液体培养基，以使所述培养基占据约10％至约40％，例如约20％至约30％(例如约20％至约22％、约22％至约24％、约24％至约26％、约26％至约28％、约28％至约30％、约20％至约25％或约25％至约30％)的摇瓶容积。向第一液体培养基添加(即在将培养基添加至摇瓶之前或之后)至少一个哺乳动物细胞和多个微载体(摇瓶中的终浓度是约1.0g/L至约15.0g/L，例如摇瓶中的终浓度是约1.0g/L至约2.5g/L、约1.0g/L至约2.0g/L、约1.0g/L至约1.75g/L、约1.0g/L至约1.5g/L、约1.0g/L至约1.25g/L、约2.5g/Lto5.0g/L、约5.0g/L至约7.5g/L、约7.5g/L至约10.0g/L、约10.0g/L至约12.5g/L、约12.5g/L至约15.0g/L、约1.0g/L至约5.0g/L、约5.0g/L至约10.0g/L、约10.0g/L至约15.0g/L、约2.5g/L至约3.5g/L、约3.0g/L至约4.0g/L、约4.0g/L至约5.0g/L、约5.0g/L至约6.0g/L、约6.0g/L至约7.0g/L、约7.0g/L至约8.0g/L、约8.0g/L至约9.0g/L、约9.0g/L至约10.0g/L、约10.0g/L至约11.0g/L、约11.0g/L至约12.0g/L、约12.0g/L至约13.0g/L、约13.0g/L至约14.0g/L或约14.0g/L至约15.0g/L)。如上文所看到的，向摇瓶添加液体培养基、哺乳动物细胞以及液体培养基的步骤可以任意顺序发生。然后，在第一时间段中，在约35℃至约39℃(例如35℃至37℃、36℃至39℃或37℃至39℃)伴随约85RPM至约125RPM(例如约85RPM至约120RPM、约85RPM至约110RPM、约85RPM至约100RPM、约85RPM至约95RPM、约85RPM至约105RPM、约90RPM至约110RPM、约95RPM至约115RPM、约100RPM至约120RPM、约105RPM至约125RPM、约110RPM至约125RPM或约100RPM至约125RPM)的旋转搅拌对摇瓶进行温育。例如，细胞可以在培养箱中温育，如抛掷(轨道)直径为约3mm至约50mm的摇动培养箱。在所述第一时间段的最初48-96小时后，在每个随后的24小时时段里，(i)连续地或周期性地从摇瓶去除第一体积的基本不含微载体的第一液体培养基，其中所述第一体积是第一液体培养基体积的约10％至约95％(例如约10％至20％、约20％至约30％、约30％至约40％、约40％至约50％、约50％至约60％、约60％至约70％、约70％至约80％、约80％至约95％、约50％至约95％、约50％至约90％或约60％至约90％)；和(ii)向摇瓶添加第二体积的第二液体培养基，其中所述第一和第二体积大致相等。如上文所看到的，所述第一和第二体积大致相等，但有少量变化，例如第一与第二体积相比多至约10％的变化。当细胞浓度达到约目标细胞密度时(例如约1.0x10⁶细胞/mL、约1.5x10⁶细胞/mL、约2.0x10⁶细胞/mL、约2.2x10⁶细胞/mL、约2.4x10⁶细胞/mL、约2.6x10⁶细胞/mL、约2.8x10⁶细胞/mL、约3.0x10⁶细胞/mL、约3.2x10⁶细胞/mL、约3.4x10⁶细胞/mL、约3.6x10⁶细胞/mL、约3.8x10⁶细胞/mL、约4.0x10⁶细胞/mL、约1.0x10⁶细胞/mLto4.0x10⁶细胞/mL、约2.0x10⁶细胞/mL至约4.0x10⁶细胞/mL、约2.0x10⁶细胞/mL至约4.0x10⁶细胞/mL、约4.0x10⁶细胞/mL至约6.0x10⁶细胞/mL、约6.0x10⁶细胞/mL至约8.0x10⁶细胞/mL、约8.0x10⁶细胞/mL至约10.0x10⁶细胞/mL、约10.0x10⁶细胞/mL至约15.0x10⁶细胞/mL、约15.0x10⁶至约20.0x10⁶细胞/mL、约20.0x10⁶细胞/mL至约25.0x10⁶细胞/mL、约25.0x10⁶细胞/mL至约30.0x10⁶细胞/mL、约30.0x10⁶细胞/mL至约35.0x10⁶细胞/mL、约35.0x10⁶细胞/mL至约40.0x10⁶细胞/mL、约40.0x10⁶细胞/mL至约45.0x10⁶细胞/mL或约45.0x10⁶细胞/mL至约50.0x10⁶细胞/mL)，于约32℃至约39℃(例如约32℃至约35℃、约32℃至约37℃、约32℃至约38℃、约34℃至约39℃、约34℃至约37℃、约35℃至约38℃、约35℃至约39℃、约36℃至约39℃或约37℃至约39℃)伴随旋转搅拌将摇瓶温育约2天至约7天(例如约2天至约4天、约3天至约5天、约4天至约6天和约5天至约7天)的第二时间段，并在每个24小时时段中，进行如上所述的步骤(i)和(ii)，其中第一时间段中使用的第一和第二液体培养基与第二时间段中所使用的那些是基本不同类型的。然后，在大于2天(例如2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100天、大于100天、110天、120天、130天、140天、150天、160天、170天、180天、190天或200天或最多100天、125天、150天、175天、200天、225天、250天、275天或300天)的第三时间段中在约35℃至约39℃(例如约35℃至约37°、36℃至约38℃、约37℃至约39℃或约36℃至约39℃)伴随旋转搅拌将摇瓶进行温育，并在每个24小时时段中，进行如上所列出的步骤(i)和(ii)，其中第二时间段中使用的第一和第二液体培养基与第三时间段中所使用的那些是相同类型的。

这些培养方法的每个方面的多种非限制性的实例在下文描述。本文提供的方法的示例性的方面能无限制地在任何组合中使用。

哺乳动物细胞

本文提供的方法可以用于培养多种不同的哺乳动物细胞。在本文所述所有方法的一些实例中，哺乳动物细胞是贴壁细胞。能够用本文描述的任何方法培养的哺乳动物细胞的非限定性实例包括：中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(例如CHODG44细胞、CHO-K1s细胞)、Sp2.0、黑素瘤细胞(例如，NS/0)、B细胞、杂交瘤细胞、T细胞、人胚肾(HEK)细胞(例如HEK293E和HEK293F)、非洲绿猴肾上皮细胞(Vero)细胞和Madin-Darby犬(可卡犬(CockerSpaniel))肾上皮细胞(MDCK)细胞。能够使用本文描述的方法培养的其他哺乳动物细胞是本领域已知的。在本文所述方法的任一种的非限制性实例中，在本文所述培养方法的任一种开始时摇瓶中存在的哺乳细胞浓度为约0.1x10⁶细胞/mL至约0.5x10⁶细胞/mL(例如约0.25x10⁶细胞/mL至约0.5x10⁶细胞/mL)。

哺乳动物细胞可以含有编码重组蛋白(例如由哺乳动物细胞分泌的重组蛋白)的重组核酸(例如稳定整合到哺乳动物细胞的基因组的核酸)。编码示例性重组蛋白的重组核酸的非限定性实例在下文描述，因为重组蛋白可以使用本文描述的方法产生。在一些情况中，置于用于培养的摇瓶中的哺乳动物细胞来源自较大的培养。例如，摇瓶中的哺乳动物细胞可以源自大规模生物反应器培养，即，可以使用本所述方法的任一种来制备卫星培养物。

培养基

液体培养基是本领域已知的。所述第一和/或第二组织培养基(例如第一时间段或第二和第三时间段中使用的第一和第二液体培养基)可以补充有哺乳动物血清(例如胎牛血清和牛血清)和/或生长激素或生长因子(例如胰岛素、转铁蛋白和表皮生长因子)。作为另一种选择或另外地，第一和/或第二液体培养基(例如第一和/或第二液体培养基，例如第一时间段或第二和第三时间段中使用的第一和/或第二液体培养基)可以是化学成分确定的液体培养基、无动物来源组分的液体培养基、无血清液体培养基或含血清的液体培养基。化学成分确定的液体培养基、无动物来源组分的液体培养基、无血清液体培养基和含血清液体培养基的非限定性实例是市售的。

液体培养基通常含有能量源(例如碳水化合物，如葡萄糖)、必需氨基酸(例如基本组的二十种氨基酸加上半胱氨酸)、维生素和/或其他以低浓度需要的有机化合物、游离脂肪酸和/或微量元素。如有需要，第一和/或第二液体培养基(例如第一时间段或第二和第三时间段中使用的第一和第二液体培养基)可以补充有例如哺乳动物激素或生长因子(例如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐和缓冲液(例如钙、镁和磷酸盐)、核苷和碱基(例如腺苷、胸苷和次黄嘌呤)、蛋白质和组织水解物和/或这些添加剂的任意组合。

在本文描述的方法中特别有用的液体培养基的非限定性实例包括，例如，CDCHO、OptiCHO和FortiCHO(全部可从LifeTechnologies；GrandIsland,NY获得)、HycellCHO培养基(ThermoFisherScientific,Inc.；Waltham,MA)、Ex-cellCDCHO融合培养基(Sigma-AldrichCo.；St.Louis,MO)和PowerCHO培养基(LonzaGroup,Ltd.；Basel,Switzerland)。在本方法中也可能有用的培养基组分包括但不限于化学成分确定的(CD)水解物，例如，CD蛋白胨、CD多肽(两个或多个氨基酸)和CD生长因子。液体组织培养基和培养基组分的其他实例是本领域已知的。

技术人员会理解本文描述的第一液体培养基和第二液体培养基可以是相同类型的培养基或是不同类型的培养基。例如，在所述方法(所述方法包括第一时间段、第二时间段和第三时间段)的实例中，第一时间段中使用的第一和第二液体培养基与第二和第三时间段中使用的第一和第二液体培养基是基本不同的，并且第二和第三时间段中使用的第一和第二液体培养基是基本相同的。例如，第一时间段中使用的第一和第二液体培养基可以选自含血清的液体培养基或含哺乳动物蛋白或哺乳动物蛋白级分或提取物的液体培养基，并且第二和第三时间段中使用的第一和第二液体培养基可以选自：无动物来源组分的液体培养基、无血清的液体培养基、化学成分确定的液体培养基和无蛋白质的液体培养基。

微载体

在本文所述的方法中，将多个微载体添加至液体培养基(例如第一和/或第二液体培养基)。例如，所述多个微载体的平均直径可以是约20μm至约1mm(例如约20μm至约250μm、约100μm至约250μm、约150μm至约250μm、约250μmand500μm、约200μm至约300μm、约750μmand1mm、约200μm至约800μm、约200μm至约500μm、约500μm至约800μm)，其中所述微载体具有表面，所述表面是容许性(permissive)的或是促进哺乳动物细胞(例如本文描述的或本领域已知的哺乳动物细胞的任一种)附着的。在一些实例中，微载体可以含有一个或多个孔(例如一个或多个平均直径为约10μm至约100μm(例如约10μm至20μm、约20μm至约30μm、约30μm至约40μm、约50μm至约60μm、约60μm至约70μm、约70μm至约80μm、约80μm至约90μm、约90μm至约100μm、约10μm至约45μm、约45μm至约80μm、约25μM至约35μm或约30μm)的孔)。在一些实施方案中，所述多个微载体的表面和/或所述多个微载体中一个或多个孔的表面是涂覆有促进哺乳动物细胞附着至微载体的试剂的(例如附着至微载体的外表面和/或微载体中的孔的表面)。此类可用于促进哺乳动物细胞附着的试剂的实例包括但不限于明胶、胶原、多聚-L-鸟氨酸、聚苯乙烯和层粘连蛋白。

在一些实例中，所述微载体的平均有效细胞结合表面积为约0.5m²/g干物质(dry)至2.0m²/g干物质(例如约0.75m²/g干物质至1.25m²/干物质、约1.0m²/g干物质至约1.5m²/干物质、约1.25m²/dry至约1.5m²/干物质、约1.5m²/干物质和约2.0m²/干物质和约1.1m²/干物质)。在一些实例中，所述微载体的平均体积为约10mL/g干物质至约70mL/g干物质(例如约10mL/g干物质至约20mL/g干物质、约20mL/g干物质至约30mL/g干物质、约30mL/g干物质至约40mL/g干物质、约40mL/g干物质至约50mL/g干物质、约50mL/g干物质至约60mL/g干物质、约60mL/g干物质至约70mL/g干物质、约10mL/g干物质至约40mL/g干物质、约30mL/g干物质至约40mL/g干物质、约40mL/g干物质至约70mL/g干物质或约40mL/g干物质)。在一些实施方案中，所述微载体的平均相对密度是0.8g/mL至约1.2g/mL(例如约0.8g/mL至约0.9g/mL、约0.9g/mL至约1.0g/mL、约1.0g/mL至约1.1g/mL、约1.0g/mL、约1.1g/mL至约1.2g/mL、约0.95g/mL至约1.05g/mL或约1.03g/mL)。

在一些实施方案中，所述微载体大致是球形或椭圆形的形状。在其他实例中，所述微载体具有经刮擦的或粗糙的表面，其带有增加微载体的外表面总面积的小突起。在一些实施方案中，微载体具有网络状结构。在一些实例中，微载体是吸湿性的。在一些实例中，微载体含有纤维素。

在一些实施方案中，微载体具有的外表面和/或微载体孔具有的表面是带正电荷的(例如，由于N,N-二乙基氨基乙基基团的存在而带正电荷)。在一些实例中，微载体具有网络或网状或网样结构。微载体可具有约0.5me/g至约2.5me/g(例如约0.5me/g至约1.5meq/g、约0.75meq/g至约1.25meq/g、约1.1meq/g、约1.5meq/g至约2.5meq/g、约1.5meq/g至约2.0meq/g、约1.8meq/g、约0.5meq/g至约1.0meq/g或约1.0meq/g至约1.5meq/g)的平均电荷密度。

在一些情况中，微载体可以含有天然聚合物和/或合成聚合物。合成聚合物的非限定性实例包括聚乙二醇(PEG)、聚环氧乙烷(polyethyleneoxide)、聚乙烯亚胺(polyethyleneimine)、二甘醇(diethyleneglycol)、三甘醇(triethyleneglycol)、聚亚烷基二醇(polyalkaleneglycol)、聚氧化烯(polyalkalineoxide)、聚乙烯醇(polyvinylalcohol)、多聚磷酸钠(sodiumpolyphosphate)、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone)、聚乙烯基甲基醚(polyvinylmethylether)、聚甲基噁唑啉(polymethyloxazoline)、聚乙基噁唑啉(polyethyloxazoline)、聚羟丙基噁唑啉(polyhydroxypropyloxazoline)、聚羟基丙基甲基丙烯酰胺(polyhydroxypropylmethacrylamide)、聚甲基丙烯酰胺(polymethacrylamide)，聚二甲基丙烯酰胺(polydimethylacrylamide)、聚甲基丙烯酸羟丙基酯(polyhydroxypropylmethacrylate)、聚丙烯酸羟乙酯(polyhydroxyethylacrylate)、羟甲基纤维素(hydroxymethylcellulose)、羟乙基纤维素(hydroxyethylcellulose)、聚甘油(polyglycerine)、聚天冬酰胺(polyaspartamide)、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物(polyoxyethlene-polyoxypropylenecopolymer)(泊洛沙姆(poloxamer))、羧酸(例如，丙烯酸、甲基丙烯酸、衣康酸和马来酸)、聚氧乙烯类(polyoxyethylenes)、聚环氧乙烷(polyethyleneoxide)、不饱和烯属一元二羧酸(unsaturatedethylenicmonodicarboxylicacids)、聚乳酸(polylacticacid；PLA)、聚环氧丙烷(polypropyleneoxide)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactide-co-glycolide))(PLGA)、聚(ε-己内酯)、聚(乙基乙烯)(poly(ethylethylene))、聚丁二烯(polybutadiene)、聚乙醇酸(polyglycolide)、聚甲基丙烯酸酯(polymethylacrylate)、聚乙烯基丁基醚(polyvinylbutylether)、聚苯乙烯、聚环戊二烯基甲基降冰片烯(polycyclopentadienylmethylnorbornene)、聚乙烯丙烯(polyethylenepropylene)、聚乙基乙烯(polyethylethylene)、聚异丁烯(polyisobutylene)、聚硅氧烷(polysiloxane)、丙烯酸甲酯(methylacrylate)、丙烯酸乙酯(ethylacrylate)、丙烯酸丙酯(propylacrylate)、丙烯酸正丁酯(n-butylacrylate)、丙烯酸异丁酯(isobutylacrylate)、丙烯酸2-乙酯(2-ethylacrylate)、丙烯酸叔丁酯(t-butylacrylate)、甲基丙烯酸酯类(methacrylates)(例如，甲基丙烯酸乙酯(ethylmethacrylate)、甲基丙烯酸正丁酯(n-butylmethacrylate)和甲基丙烯酸异丁酯(isobutylmethacrylate))、丙烯腈类(acrylonitriles)、甲基丙烯腈(methacrylonitrile)、乙烯基类(vinyl)(例如，乙酸乙烯酯(vinylacetate)、叔碳酸乙烯酯(vinylversatate)、丙酸乙烯酯(vinylpropionate)、乙烯基甲酰胺(vinylformamide)、乙烯基乙酰胺(vinylacetamide)、乙烯基吡啶(vinylpyridines)和乙烯基咪唑(vinyllimidazole))、氨基烷类(aminoalkyls)(例如，氨基烷基丙烯酸酯(aminoalkylacrylates)、氨基烷基甲基丙烯酸酯(aminoalkylsmethacrylates)和氨基烷基(甲基)丙烯酰胺(aminoalkyl(meth)acrylamides))、苯乙烯、聚亚烷基二醇(polyalkaleneglycol)、多碱氧化物(polyalkalineoxide)和乳酸。天然聚合物的非限定性实例包括纤维素、卵磷脂和透明质酸。微载体可以含有不同聚合物以相同或不同比例混合的混合物(例如，本文描述的或本领域已知的一种或多种聚合物的任意组合)。本文描述的任何微载体都可以含有核心和外层，所述核心含有一种或多种聚合物(例如本文描述的或本领域已知的任何聚合物)，所述外层含有一种或多种不同的聚合物(例如本文描述的或本领域已知的任何聚合物)。

能够在本文描述的任何方法中使用的非限定性示例性微载体包括CytoPore^TM1和CytoPore^TM2(可从GEHealthcare,LifeSciences,Piscataway,NewJersey获得)。能够在本文描述的任何方法中使用的微载体的其他实例是公众可以获得的和本领域已知的。

摇瓶

所述摇瓶可以是无菌的且体积为约125mL至约3L(例如3-L、2.5-L、2-L、1.5-L、1-L、750-mL、500-mL、400-mL、300-mL、250-mL、200-mL、150-mL或125-mL摇瓶)。例如，摇瓶的体积可以是约250mL至约300mL、约300mL至约400mL、约400mL至约500mL、约500mL至约600mL、约600mL至约700mL、约700mL至约800mL、约800mL至约900mL、约900mL至约1L、约100mL至约500mL、约500mL至约1L、约600mL至约1L、约1L至约3L、约1L至约2L、约2L至约3L、约1.5L至约2.5L。摇瓶可以包含至少一个透气性的表面(例如至少一个具有透气性膜的表面，其还可起到无菌屏障的作用)和/或至少一个通气帽。摇瓶在其外表面上可以具有允许摇瓶稳固放置于组织培养培养箱(例如旋转培养箱)中的结构。

摇瓶的内表面可以有至少一个涂层(例如至少一个明胶、胶原、多聚-L-鸟氨酸、聚苯乙烯和层粘连蛋白的涂层)。能用于本文所述任何的方法任一种的示例性的摇瓶可以购自CorningInc.(Tewsbury,MA)、Presens(Brondby,Denmark)、Nalge-NuncInternational(Rochester,NY)。示例性的摇瓶包括T-瓶、锥形瓶或其本领域内公认的任何修改版本。摇瓶的其他实例(例如不同形状和尺寸的摇瓶)和摇瓶的内表面涂层的其他实例是本领域已知的且可以用于本方法中。

搅拌

本文描述的方法涉及对含哺乳动物细胞、多个微载体和第一和/或第二液体培养基的培养物进行搅拌。搅拌可以约85RPM至约125RPM(例如约85RPM至约120RPM、约85RPM至约110RPM、约85RPM至约100RPM、约85RPM至约95RPM、约85RPM至约105RPM、约90RPM至约110RPM、约95RPM至约115RPM、约100RPM至约120RPM、约105RPM至约125RPM、约110RPM至约125RPM、约100RPM至约125RPM、约95RPM至约105RPM、约95RPM至约105RPM、约105RPM至约115RPM或约115RPM至约125RPM)的频率进行(例如在培养箱中进行，如抛掷(轨道)直径为约3mm至约50mm的摇动培养箱)。

如本领域所能够理解的，搅拌的水平(例如RPM速度)可依赖于摇瓶的大小和形状(例如摇瓶的直径)、用于进行搅拌的培养箱的抛掷(轨道)直径以及所述多个微载体的平均尺寸、形状、密度和浓度而变化。例如，较小的抛掷(轨道)直径可能需要更高水平的搅拌(例如较高的RPM速度)，而较大的抛掷(轨道)直径可能需要较低水平的搅拌(例如较低的RPM速度)来达到要获得最优的细胞密度和重组蛋白生产所必需的条件。在另一实例中，直径较大的摇瓶可能需要较低的RPM速度，而直径较小的摇瓶可能需要较高的RPM速度来达到要获得最优的细胞密度和重组蛋白生产所必需的条件。搅拌频率可以依赖细胞培养条件(例如微载体的浓度、密度和/或尺寸和/或表面形状)而变化。如本领域所能够理解的，如果第一和/或第二液体培养基中存在的微载体(例如所述第一、第二和第三时间段中使用的第一和/或第二液体培养基)质量高、密度高、外表面积大或速率相对较高，由这些微载体产生的剪切力能对培养中的细胞存活力和重组蛋白生产具有负面影响。此外，本领域技术人员理解，搅拌速率应当高到足以避免显著的和/或不想要的微载体沉积(settling)于摇瓶底部。

在一些实施方案中，可以用旋转培养箱以约25mm至约50mm的抛掷(轨道)直径和约85RPM至约125RPM(例如约85RPM至约120RPM、约85RPM至约110RPM、约85RPM至约100RPM、约85RPM至约95RPM、约85RPM至约105RPM、约90RPM至约110RPM、约95RPM至约115RPM、约100RPM至约120RPM、约105RPM至约125RPM、约110RPM至约125RPM、约100RPM至约125RPM或本文所述的RPM范围中的任何值)的搅拌来进行温育。在一些实施方案中，用旋转培养箱以约3mm至约25mm的抛掷(轨道)直径和约85RPM至约125RPM(例如约85RPM至约120RPM、约85RPM至约110RPM、约85RPM至约100RPM、约85RPM至约95RPM、约85RPM至约105RPM、约90RPM至约110RPM、约95RPM至约115RPM、约100RPM至约120RPM、约105RPM至约125RPM、约110RPM至约125RPM、约100RPM至约125RPM或本文所述的RPM范围中的任何值)的搅拌来进行温育。

例如，搅拌可以用旋转的圆形摇动以约85RPM至约125RPM(例如约85RPM至约120RPM、约85RPM至约110RPM、约85RPM至约100RPM、约85RPM至约95RPM、约85RPM至约105RPM、约90RPM至约110RPM、约95RPM至约115RPM、约100RPM至约120RPM、约105RPM至约125RPM、约110RPM至约125RPM、约100RPM至约125RPM或本文所述的RPM范围中的任何值)的频率来进行。作为另一种选择或另外地，可以用椭圆形旋转摇动或水平和/或垂直摆动摇瓶来对摇瓶进行搅拌。搅拌可以连续地或周期性地进行。

可以用带有机械装置的湿润气氛的受控培养箱(例如湿度约为或大于20％，例如约为或大于30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或湿度为100％)来进行搅拌，所述机械装置提供对一个或多个摇瓶的搅拌，所述摇瓶含有哺乳动物细胞、多个微载体和液体培养基(例如第一和/或第二液体培养基，和第一、第二和第三时间段的一个或多个中使用的第一和/或第二液体培养基)。

反应器角度

在一些实施方案中，摇瓶可以距水平约25度至约90度(例如约25度至约55度、约25度至约90度、约35度至约90度、约45度至约90度或约35至约65度)的反应器角度进行温育。例如，可以将摇瓶置于距水平约60度至约85度、距水平约70度至约85度、距水平约25度至约60度、约25度至约55度、距水平约30度至约55度、距水平约40度至约55度或距水平约40度至约50度的反应器角度。可以将摇瓶置于距水平约45度至约50度或距水平约40度至约45度。可以将摇瓶置于明确地且稳固地(securely)将摇瓶以距水平约25度至约90度的反应器角度放置(例如明确地将容器以约25度至约90度、约35度至约90度、约45度至约90度、约35度至约65度或距水平约40度至约55度的反应器角度放置)的装置中。对摇瓶的放置可以用任何本领域已知方法来进行，例如通过使用支架或锁定元件来进行。

温度

本文所述的培养方法可以在32℃至约39℃的温度进行，例如约32℃至约37℃。例如，在一些方法中，从培养运行开始至结束，摇瓶可以在约37℃的温度进行温育。本文所述方法的一些实例包括第一时间段、第二时间段和第三时间段，在所述第一时间段期间摇瓶在约35℃至约39℃，例如约35℃至约37℃进行温育，在所述第二时间段期间摇瓶在约32℃至约39℃，例如约32℃至约37℃进行温育，在所述第三时间段期间摇瓶在约35℃至约39℃，例如约35℃至约37℃进行温育。技术人员会理解，温度在培养方法中的特定时间点处可以变化(例如在第一时间段、第二时间段和第三时间段的一个或多个期间)，例如基于按小时或按天的变化。例如，温度可以在用哺乳动物细胞初始接种摇瓶后约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、14天、15天、16天、17天、18天、19天或约20天或更多天或是在本文所述第一、第二和/或第三时间段内的任意时间点发生变化或移动(例如提高或降低)。例如，温度可以上移(例如多至或约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5或10.0℃的变化)。例如，温度可以下移(例如多至或约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5或10℃的变化)。

培养基去除和替换

本文所述的方法包括从摇瓶去除第一体积的第一液体培养基(例如含有任意浓度的哺乳动物细胞和任意重组蛋白的，例如基本不含细胞和/或微载体的第一体积的第一液体培养基)，和向摇瓶添加第二体积的第二液体培养基，其中所述第一体积和第二体积大致相等。去除和添加可以同时或序贯地进行，或以二者的组合进行。此外，去除和添加可以连续地进行(例如以在任何给定的时间段内(例如在24小时时段内、在约1小时至约24小时的递增的时间段内或大于24小时的递增的时间段内)去除和替换摇瓶容积或第一液体培养基体积的0.1％至800％(例如1％至700％、1％至600％、1％至500％、1％至400％、1％至350％、1％至300％、1％至250％、1％至100％、100％至200％、5％至150％、10％至50％、15％至40％、8％至80％、至4％至30％)的体积)，或是周期性地进行(例如每隔两天1次(onceeverythirdday)、每隔一天1次、每天1次、每天2次、每天3次、每天4次、每天5次或每天多于5次)，或是以二者的组合进行。当周期性地进行时，去除或替换(例如约24小时时段内、约0.1小时至约24小时的递增的时间段内或大于24小时的递增的时间段内)的体积可以是例如摇瓶容积或第一液体培养基体积的0.1％至800％(例如1％至700％、1％至600％、1％至500％、1％至400％、1％至300％、1％至200％、1％至100％、100％至200％、5％至150％、10％至50％、15％至40％、8％至80％和4％至30％)。在一些情况下，在整个或部分的培养期，去除的第一体积的第一液体培养基和添加的第二体积的第二液体培养基在可以每个24小时时段(或是约0.1小时至约24小时的递增的时间段或大于24小时的递增的时间段)内可以保持大致相同。如本领域所知的，第一体积的第一液体培养基的去除速率(体积/时间单位)和第二体积的第二液体培养基的添加速率(体积/时间单位)可以是变化的。第一体积的第一液体培养基的去除速率(体积/时间单位)和第二体积的第二液体培养基的添加速率(体积/时间单位)可以是大致相同的或可以是不同的。

或者，在培养期间，去除的或添加的体积可以在每个24小时时段(或是约0.1小时至约24小时的递增的时间段或大于24小时的递增的时间段)内变化(例如逐渐增加)。例如，在培养期间，每个24小时时段(或是约1小时至24小时以上的递增的时间段或大于24小时的递增的时间段)内去除的第一液体培养基的体积和添加的第二液体培养基的体积可以是增加的(例如逐渐增加或是通过交错增量增加)，从摇瓶容积或第一液体培养基体积的0.5％至约20％增至摇瓶容积或第一液体培养基体积的约25％至约150％。

在本文所述方法的一些实例中，在48-96小时的培养期后，在每个24小时时段中，去除的第一液体培养基的第一体积(例如在第一、第二和/或第三时间段中去除的)和添加的第二液体培养基的第二体积(例如在第一、第二和/或第三时间段中添加的)是第一液体培养基体积的约10％至约95％(例如约10％至约20％、约10％至约20％、约20％至约30％、约30％至约40％、约40％至约50％、约50％至约60％、约60％至约70％、约70％至约80％、约80％至约90％、约85％至约95％、约60％至约80％或约70％)。

技术人员会理解，所述第一液体培养基和第二液体培养基可以是同类型的培养基。在其他实例中，所述第一液体培养基和第二液体培养基可以是基本不同的(substantiallydifferent)。在一些包含了第一时间段、第二时间段和第三时间段的实施方案中，第一时间段中使用的第一和第二液体培养基与第二时间段中使用的第一和第二液体培养基相比是基本不同类型的培养基，而第二时间段中使用的第一和第二液体培养基与第三时间段中使用的第一和第二液体培养基相比是相同类型的培养基。如本领域会理解的，第一时间段中使用的第一和第二液体培养基不一定要完全相同(只要它们是相同类型的培养基)；第二时间段和/或第三时间段中使用的第一和第二液体培养基中的任一种都不一定是完全相同的(同样地，只要它们是相同类型的培养基并且与第一时间段中使用的第一和第二液体培养基是基本不同培养基类型的)。

例如，可以通过离心(例如慢速摆动桶离心)摇瓶或用任何其他自动化系统、并从上清去除第一体积的第一液体培养(例如基本不含细胞和/或微载体的第一体积的第一液体培养基)，从而去除第一体积的第一液体培养基。作为另一种选择或另外地，可以通过第一体积的第一液体培养基的渗漏作用(seeping)或重力流，经过带有排除哺乳动物细胞和/或微载体的分子量截留的无菌膜来去除第一体积的第一液体培养基。作为另一种选择或另外地，可以通过停止搅拌或显著减降低搅拌速率一段时间(至少10秒(例如至少30秒、40秒、50秒、1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、40分钟、50分钟或1小时))并从摇瓶的顶部去除或抽取第一体积的第一液体培养基(例如从一部分液体培养基去除，所述部分液体培养基中微载体未因重力而沉淀)，从而去除第一体积的第一液体培养基。在停止搅拌期间，摇瓶可以置于培养箱中。本领域技术人员会理解，当第一液体培养基已从摇瓶移除时，可以将摇瓶从培养箱移开一段短时间(例如少于30分钟、20分钟、15分钟、10分钟、8分钟、6分钟、4分钟、2分钟或1分钟)。

可以例如通过灌注泵向第一液体培养基添加第二体积的第二液体培养基。可以以手动的(例如通过直接将第二体积的第二液体培养基吸移至第一液体培养基上)或自动的方式向第一液体培养基添加第二液体培养基。

在一些情况下，去除第一体积的第一液体培养基(例如基本不含哺乳动物细胞和/或微载体的第一体积的第一液体培养基)和向第一液体培养基添加第二体积的第二液体培养不在用哺乳动物细胞接种摇瓶至少1小时内(例如2小时内、3小时内、4小时内、5小时内、6小时内、7小时内、8小时内、9小时内、10小时内、12小时内、14小时内、16小时内、18小时内、24小时内、36小时内、48小时内、72小时内、96小时内或96小时后)进行。

CO₂

本文描述的方法可以进一步包括在含有至多或大约15％CO₂(例如至多或大约14％CO₂、12％CO₂、10％CO₂、8％CO₂、6％CO₂、5％CO₂、4％CO₂、3％CO₂、2％CO₂或至多或大约1％CO₂)的气氛中温育摇瓶。另外，本文描述的任何方法可包括在湿润气氛(例如，至少或大约20％、30％、40％、50％、60％、70％、85％、80％、85％、90％或至少或大约95％湿度，或大约100％湿度)中温育摇瓶。

示例性设备

能够用于进行本文描述的培养方法的设备的非限制性实例包括：AppropriateTechnicalResources(Maryland,USA)分销的INFORSMultiron摇动培养箱(INFORS；Basel,Switzerland)，和Kuhner摇动培养箱(KuhnerAG；Basel,Switzerland)。能够用于进行培养方法的设备的非限制性实例包括具有约3mm至约50mm(例如，约1mm至约25mm或约25mm至约50mm)的抛掷(轨道)直径的旋转培养箱。摇动培养箱和滚动培养箱的其他实例是本领域已知的。

产生重组蛋白的方法

本文还提供产生重组蛋白的方法，其包括培养使用本文描述的方法能够产生重组蛋白的细胞。在执行所述方法之后，可以从哺乳动物细胞(例如，附着于所述微载体的哺乳动物细胞)和/或从第一或第二培养基(例如，在第一、第二和第三时间段中的一个或多个中使用的第一和/或第二液体培养基)回收所述重组蛋白。在一些实施方案中，在培养方法期间任何给定的时间点(例如在培养的第0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100天或在超过100天的培养中的一天或数天，或是在第一时间段、第二时间段和第三时间段的一个或多个期间的任何时间点)从第一和/或第二液体培养基回收重组蛋白。

技术人员会理解可以以任意组合使用多种培养参数(例如，本文描述的摇瓶、体积、替换培养物体积的速率或频率、搅拌频率、微载体类型、温度、培养基和CO₂浓度)中的任何参数来进行这些方法。另外，本文描述的或本领域已知的任何哺乳动物细胞都可以用于产生重组蛋白。

可以使用分子生物学和分子遗传学中已知的多种多样的方法将编码重组蛋白的核酸引入哺乳动物细胞。非限定性实例包括转染(例如，脂质转染)、转导(例如，慢病毒、腺病毒或逆转录病毒感染)和电穿孔。在一些情况中，编码重组蛋白的核酸不是稳定地整合在哺乳动物细胞的染色体中的(瞬时转染)；而在其他方法中核酸是整合的。作为另一种选择或者此外，编码重组蛋白的核酸可以存在于质粒和/或哺乳动物人工染色体(例如，人的人工染色体)中。作为另一种选择或者此外，可以使用病毒载体(例如，慢病毒、逆转录病毒或腺病毒载体)将核酸引入细胞中。可以将核酸与启动子序列(例如，强启动子，如β-肌动蛋白启动子和CMV启动子或诱导型启动子)可操作地连接。如有需要，含有核酸的载体可以还含有选择标记(例如，为哺乳动物细胞赋予潮霉素、嘌呤霉素或新霉素抗性的基因)。

在一些情况中，重组蛋白是分泌蛋白并且由哺乳动物细胞释放至胞外培养基(例如第一和/或第二液体培养基，例如第一、第二和第三时间段的一个或多个中使用的第一和/或第二液体培养基)中。例如，编码可溶性重组蛋白的核酸序列可以含有编码在重组蛋白的N或C末端的分泌信号肽的序列，其通过哺乳动物细胞中存在的酶被切割，并且随后释放至胞外培养基(例如第一和/或第二液体培养基，或第一、第二和第三时间段的一个或多个中使用的第一和/或第二液体培养基)中。在其他情况中，所述重组蛋白是不被分泌的可溶性蛋白，并且所述重组蛋白从哺乳动物细胞内回收(例如从附着至微载体的哺乳动物细胞内回收，例如从附着至微载体的哺乳动物细胞在其从微载体脱离后进行回收)。

能够通过本文提供的方法产生的重组蛋白的非限定性实例包括免疫球蛋白(包括轻链和重链免疫球蛋白、抗体或抗体片段(例如本文描述的任何抗体片段)、酶(例如半乳糖苷酶(例如α-半乳糖苷酶)、Myozyme或Cerezyme)、蛋白质(例如人促红细胞生成素、肿瘤坏死因子(TNF)或干扰素α或β)或免疫原性或抗原性蛋白或蛋白片段(例如用于在疫苗中使用的蛋白质))。在一些实施方案中，重组蛋白是工程化的抗原结合多肽，其含有至少一个多功能重组蛋白支架(参见例如，在Gebauer等,CurrentOpin.Chem.Biol.13:245-255,2009；和美国专利申请公开号2012/0164066(通过提述以其整体并入本文)中描述的重组抗原结合蛋白)。作为抗体的重组蛋白的非限定性实例包括：帕尼单抗(panitumumab)、奥马珠单抗(omalizumab)、abagovomab、阿昔单抗(abciximab)、actoxumab、阿达木单抗(adalimumab)、adecatumumab、阿非莫单抗(afelimomab)、afutuzumab、alacizumab、alacizumab、阿仑单抗(alemtuzumab)、alirocumab、altumomab、amatuximab、anatumomab、apolizumab、atinumab、托珠单抗(tocilizumab)、basilizimab、bectumomab、贝利单抗(belimumab)、贝伐单抗(bevacizumab)、biciromab、canakinumab、西妥昔单抗(cetuximab)、达珠单抗(daclizumab)、densumab、艾库组单抗(eculizumab)、依决洛单抗(edrecolomab)、依法利珠单抗(efalizumab)、efungumab、ertumaxomab、etaracizumab、戈利木单抗(golimumab)、英夫利昔单抗(infliximab)、他珠单抗(natalizumab)、帕利珠单抗(palivizumab)、帕尼单抗(panitumumab)、培妥珠单抗(pertuzumab)、兰尼单抗(ranibizumab)、利妥昔单抗(rituximab)、托珠单抗(tocilizumab)和曲妥单抗(trastuzumab)。能够通过本领域描述的方法产生的治疗性抗体的其他实例是本领域已知的。能够通过本发明的方法产生的重组蛋白的其他非限定性实例包括：阿葡糖苷酶α(alglucosidasealfa)、laronidase、阿贝西普(abatacept)、加硫酶(galsulfase)、促黄体素α、抗血友病因子、阿加糖酶-β(agalsidasebeta)、干扰素β-1a、阿法达贝泊汀(darbepoetinalfa)、替奈普酶(tenecteplase)、伊纳西普(etanercept)、凝血因子IX、促卵泡激素、干扰素β-1a、伊米苷酶(imiglucerase)、阿法链道酶(dornasealfa)、阿法依伯汀(epoetinalfa)和阿替普酶(alteplase)。

分泌的可溶性重组蛋白可以通过将液体培养基从微载体或其结合的哺乳动物细胞去除或以其他方式在物理上分开而从液体培养基(例如第一和/或第二液体培养基，例如第一、第二和第三时间段的一个或多个中使用的第一和/或第二液体培养基)回收。用于从哺乳动物细胞去除液体培养基的多种不同的方法是本领域已知的，包括，例如，离心、过滤、移液和/或抽吸。然后可以使用多种生物化学技术从液体培养基回收并进一步纯化分泌的重组蛋白，所述技术包括多种类型的层析(例如，亲和层析、分子筛层析、阳离子交换层析或阴离子交换层析)和/或过滤(例如，分子量截留过滤)。

为了回收胞内重组蛋白，可以裂解哺乳动物细胞(例如附着至微载体的哺乳动物细胞)。在一些实例中，哺乳动物细胞在被裂解前从微载体表面释放。用于从微载体表面释放附着细胞的方法是本领域已知的(例如涡旋和搅拌)。在其他实例中，在哺乳动物细胞仍附着在微载体上时将哺乳动物细胞裂解(例如用下文列出的示例性方法的任一种来裂解)。

用于裂解哺乳动物细胞的多种多样的方法是本领域已知的，包括，例如，超声处理和/或洗涤剂、酶和/或化学裂解。可以使用多种本领域已知的生物化学方法从哺乳动物细胞裂解液纯化重组蛋白，所述方法通常以离心去除细胞碎片的步骤开始，然后是一个或多个额外步骤(例如，一种或多种类型的层析(例如，亲和层析、分子筛层析、阳离子交换层析或阴离子交换层析)和/或过滤(例如，分子量截留过滤))。

在一些实施方案中，回收的重组蛋白是按重量计至少或约50％纯的，例如，按重量计至少或约55％纯的，按重量计至少60％纯的，按重量计至少65％纯的，按重量计至少70％纯的，按重量计至少75％纯的，按重量计至少80％纯的，按重量计至少85％纯的，按重量计至少90％纯的，按重量计至少95％纯的，按重量计至少96％纯的，按重量计至少97％纯的，按重量计至少98％纯的，或按重量计至少或大约99％纯的或按重量计大于99％纯的。

在一些实施方案中，回收的重组蛋白是重组人蛋白，其与人中同样的天然蛋白相比具有一个或多个不同生物学特性(例如糖基化类型或数量上的差异、磷酸化的差异、酰化的差异、金属取代或金属化学计量学的差异和/或辅因子结合的差异)。

本文还提供由本文所述方法的任一种产生的重组蛋白。

用于测试制造工艺的方法

本文还提供用于测试制备重组蛋白的制造工艺的方法。这些方法包括执行本文所述的产生重组蛋白的方法，在所述方法期间和/或之后，检测或测量至少一个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或十一个)培养读数(例如，细胞中或第一和/或第二培养基(例如第一、第二和第三时间段的一个或多个中使用的第一和/或第二液体培养基)中的重组蛋白、葡萄糖消耗、活细胞浓度、乳酸产生、体积生产率、从葡萄糖产生乳酸的产率、谷氨酰胺浓度、谷氨酸浓度、培养基的pH、溶解CO₂的分压或浓度、溶解O₂的分压或浓度、代谢物质量转移和代谢物质量平衡)；并将所述至少一个培养读数与所述至少一个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或十一个)培养读数的参考水平(例如，细胞中或第一和/或第二培养基(例如第一、第二和第三时间段的一个或多个中使用的第一和/或第二液体培养基)中的重组蛋白、葡萄糖消耗、活细胞浓度、乳酸产生、体积生产率、从葡萄糖产生乳酸的产率、谷氨酰胺浓度、谷氨酸浓度、培养基的pH、溶解CO₂的分压或浓度、溶解O₂的分压或浓度、代谢物质量转移和代谢物质量平衡的参考水平)进行比较。

熟练的操作者会理解本文描述的多种培养参数中的任何参数(例如摇瓶、体积、替代培养物体积的速率或频率、搅拌频率、温度、培养基和CO₂暴露)能够以任何组合使用以进行这些方法。另外，本文描述的或本领域已知的任何哺乳动物细胞都可以用于所述方法中。

至少一种培养读数的参考水平(例如细胞中或第一和/或第二培养基中的(例如第一、第二和第三时间段的一个或多个中使用的第一和/或第二液体培养基)中的重组蛋白、葡萄糖消耗、活细胞浓度、乳酸产生、体积生产率、从葡萄糖产生乳酸的产率、谷氨酰胺浓度、谷氨酸浓度、培养基的pH、溶解CO₂的分压或浓度、溶解O₂的分压或浓度、代谢物质量转移和代谢物质量平衡的水平)可以是使用不同培养方法产生的水平，所述不同的培养方法例如利用至少一种不同的培养参数(例如，不同的第一和/或第二液体培养基(例如第一、第二和第三时间段的一个或多个中不同的第一和/或第二液体培养基)、不同的哺乳动物细胞、不同的频率和/或搅拌类型、不同类型或浓度的微载体、不同的分批再补料或灌注速率(例如，在培养的最初48-96小时后在每个24小时时间段内10％至95％的摇瓶容积或第一液体培养基体积)和任何本文描述的其他培养参数)的培养方法。

本文描述的方法可以用于测试制造工艺的任何组分或特征的效果。例如，本文描述的方法可以用于测试不同的原料、微载体、搅拌水平、摇瓶、抗结块剂、培养基(例如化学成分确定的培养基)或营养元素或化合物对至少一个培养读数的效果(例如本文描述的任意培养读数，例如对重组蛋白产生和/或哺乳动物细胞生长的效果)。例如，本文提供测试第一或第二液体培养基、第一或第二液体培养基中存在的原料成分或补充剂或哺乳动物细胞来源用于在产生重组蛋白的方法中的用途的效力的方法，其包括提供摇瓶，所述摇瓶含有置于第一液体培养基中的哺乳动物细胞，其中所述第一液体培养基占据摇瓶容积的约10％至约40％，例如约20％至约30％，并含有浓度为约1.0g/L至约15.0g/L的多个微载体；在约31℃至约40℃(例如约32℃至约37℃)并伴随约85转每分钟(RPM)至约125RPM的旋转搅拌将所述摇瓶温育一段时间；和在所述一段时间的最初48-96小时后，连续地或周期性地去除第一体积的第一液体培养基并向所述第一液体培养基添加第二体积的第二液体培养基，其中所述第一和第二体积大致相等；检测或测定至少一种培养读数(例如本文描述的任意培养读数，例如细胞中或第一和/或第二液体培养基中的重组蛋白)；将所述至少一个培养读数与通过不同培养方法产生的至少一个培养读数(例如本文描述的任意培养读数，例如细胞中或第一和/或第二培养基中的重组蛋白)的参考水平进行比较，所述不同培养方法使用不同的第一或第二液体培养基、第一或第二液体培养基中存在的不同的原料成分或补充物或不同的哺乳动物细胞来源中的一个或多个；和鉴定与所述至少一个培养读数相比于参考水平的有益变化(例如，增加或减少)(例如，增加的重组蛋白量)相关的第一或第二液体培养基、第一或第二液体培养基中存在的原料成分或补充剂或哺乳动物细胞来源，将其鉴定为对于在产生重组蛋白的方法中的使用而言是有效的。例如，相比于参考水平的重组蛋白水平的增加、活细胞浓度的增加、体积生产率的增加和葡萄糖消耗的增加表明该第一或第二液体培养基、第一或第二液体培养基中存在的该原料成分或补充剂或该哺乳动物细胞来源对于在产生重组蛋白的方法中的使用而言是有效的。

本文描述的方法还可用于测试改变本文描述的或本领域已知的多种细胞培养参数(例如，摇瓶的容积或形状、搅拌频率、第一和/或第二液体培养基中由多个微载体产生的剪切力、培养接种密度、第一和/或第二液体培养基的pH(例如在第一、第二和第三时间段的一个或多个中使用的第一和/或第二液体培养基的pH)、溶解O₂浓度或分压、摇瓶的内表面涂层、微载体的浓度、尺寸、形状、表面特性、密度和有孔性中的一个或多个、液体培养基(例如第一和/或第二液体培养基，例如在第一、第二和第三时间段的一个或多个中使用的第一和/或第二液体培养基)内的多种成分、搅拌的量和/或类型、哺乳动物细胞类型或细胞系、溶解CO₂浓度或分压、温度、液体培养基的体积(例如第一和/或第二液体培养基的体积)和/或去除第一体积的第一培养基和向第一培养基添加第二体积的第二培养基的速率或频率(例如在第一、第二和第三时间段的一个或多个中去除第一体积的第一培养基和添加第二体积的第二培养基的速率或频率))中的任何参数的效果。所述方法还可用于测试用于制备液体培养基(例如第一和/或第二液体培养基，例如在第一、第二和第三时间段的一个或多个中使用的第一和/或第二液体培养基)的水质和/或液体培养基中的不同微量金属元素对至少一种培养读数的效果(例如本文描述的任意培养读数，例如对重组蛋白产生和/或哺乳动物细胞生长的效果)。所述方法还可用于测试生长因子或生长激素对至少一个培养读数的效果(例如本文描述的任意培养读数，例如对重组蛋白产生和/或哺乳动物细胞生长的效果)(例如第一时间段中存在的生长因子或生长激素的效果)。所述方法还可用于测试用于制备第一和/或第二液体培养基(例如在第一、第二和第三时间段的一个或多个中使用的第一和/或第二液体培养基)的过滤方法和过滤器。所述方法还可用于测试液体培养基稳定性和液体培养基对于至少一个培养读数(例如本文描述的任意培养读数，例如对重组蛋白产生和/或哺乳动物细胞生长的效果)的效果。所述方法还可用于筛选多种重组细胞系和细胞库产生期望的重组蛋白(例如期望的分泌的治疗蛋白)的能力。如本文所注意到的，所述方法还可用于筛选任何细胞培养方法参数，包括但不限于，搅拌的类型和频率、由微载体产生的剪切力、灌注速率和体积、培养物接种密度等等。

本文描述的方法还可用于测试第一或第二液体培养基、用于生成第一或第二液体培养基的原料成分或哺乳动物细胞来源中污染物的存在。例如，本文提供测试第一或第二液体培养基、用于生成第一或第二液体培养基的原料成分或哺乳动物细胞来源中污染物的存在的方法，所述方法包括提供摇瓶，其含有置于第一液体培养基中哺乳动物细胞，所述第一液体培养基占据约10％至约40％的摇瓶容积(例如约20％至约30％的摇瓶容积)并含有浓度为约1.0g/L至约15.0g/L的多个微载体；在约32℃至约39℃(例如约32℃至约37℃)并伴随约85转每分钟(RPM)至约125RPM的搅拌将所述摇瓶温育一段时间；和在所述一段时间的最初约48-96小时后，连续地或周期性地去除第一体积的第一液体培养基并向所述第一液体培养基添加第二体积的第二液体培养基，其中所述第一和第二体积大致相等；检测或确定至少一个培养读数(例如本文描述的任意培养读数，例如细胞中或第一和/或第二培养基中存在的重组蛋白的量)；将所述至少一个培养读数与通过不同培养方法产生的至少一个培养读数(例如本文描述的任意培养读数，例如细胞中或第一和/或第二培养基中的重组蛋白)的参考水平比较，所述不同培养方法使用不同的第一或第二液体培养基、生成所述第一或第二液体培养基的不同原料成分或不同的哺乳动物细胞来源中的一个或多个；和当所述至少一个培养参数的水平相比于参考水平有不利变化(例如增加或减少)时，将该第一或第二液体培养基、用于生成该第一或第二液体培养基的原料成分或该哺乳动物细胞来源鉴定为含有污染物。例如，与参考水平比较重组蛋白产量的减少(例如，细胞中或第一和/或第二培养基中的重组蛋白的减少)、体积生产率的减少或活细胞浓度的减少是不利的变化，其表明在该第一或第二液体培养基、用于生成该第一或第二液体培养基的原料成分或该哺乳动物细胞来源中存在污染物。一些方法进一步包括一种或多种测定该第一或第二液体培养基、用于生成该第一或第二液体培养基的原料成分或该哺乳动物细胞来源中存在的污染物的身份的测定法。污染物可能是生物污染物(例如分枝杆菌、真菌、细菌、病毒或不想要的哺乳动物细胞)。污染物可以是无机污染物。污染物也可能是物理上未表征的物质。

所述方法可用于进行高通量细胞培养实验来执行对细胞培养方法的实验设计(design-of-experiment；DOE)或质量源于设计(quality-by-design；QBD)优化。例如，本文提供对生产重组蛋白的制造工艺进行优化的方法，所述方法包括提供摇瓶，其含有置于第一液体培养基中的哺乳动物细胞，所述第一液体培养基占据约10％至约40％的摇瓶容积(例如约20％至约30％的摇瓶容积)并含有浓度为约1.0g/L至约15.0g/L的多个微载体；在约32℃至约39℃(例如约32℃至约37℃)并伴随约85转每分钟(RPM)至约125RPM的搅拌将所述摇瓶温育一段时间；和在约48-96的第一时间段后，连续地或周期性地去除第一体积的第一液体培养基并向所述第一液体培养基添加第二体积的第二液体培养基，其中所述第一和第二体积大致相等；检测至少一个培养读数(例如本文描述的任意培养读数，例如细胞中或第一和/或第二液体培养基中的重组蛋白的量)；将所述至少一个培养读数与通过不同培养方法产生的至少一个培养读数(例如本文描述的任意培养读数，例如细胞中或第一和/或第二培养基中存在的重组蛋白的量)的参考水平比较；和鉴定并去除或改变制造工艺中与相比于至少一个培养读数(例如本文描述的任意培养读数，例如产生的重组蛋白)的参考水平的至少一个培养读数的不利变化(例如增加或减少)相关的任何培养组分或参数，或鉴定并向制造工艺添加与相比于至少一个培养读数(例如本文描述的任何培养读数，例如产生的重组蛋白)的参考水平的至少一个培养读数的有利变化(例如增加或减少)相关的任何培养组分或参数。例如，产生的重组蛋白量、体积生产率或活细胞浓度的增加是培养读数中的有利变化，而产生的重组蛋白量、体积生产率或活细胞浓度的减少是培养读数中的不利变化。在一些情况中，所述方法用于以高通量方式鉴定能够用于重组蛋白的规模放大(例如生物反应器)生产的优化的细胞培养条件。

在本节描述的方法的任一种中，至少一个培养读数的参考水平可以来自较大规模培养(例如灌注生物反应器，例如2000-L灌注生物反应器、40-L灌注生物反应器或12-L灌注生物反应器)。在本节描述的方法的任一种的一些实施方案中，使用本文描述的方法的任一种将哺乳动物细胞培养在摇瓶中，经历与实施较大规模培养相同的时间段(平行培养)。例如，在本文描述的方法的任一种中用于接种摇瓶的接种物也用于在大致相同的时间接种较大规模灌注生物反应器。

在一个实施方案中，用于接种摇瓶的接种物获取自较大规模培养(例如较大规模灌注生物反应器)。例如，在任意时间点将来自较大规模培养的小份试样(例如来自较大规模灌注生物反应器的小份试样(aliquot))取出(例如在本文所述的生长期、过渡期或收获期期间取出)并用于接种摇瓶(例如用于起始卫星摇瓶培养)。小份试样可以在生长期期间自较大规模培养取出并用于接种(inoculate)或接种(seed)含有液体培养基和多个微载体(例如本文所述的)的摇瓶，随后将所述摇瓶在复制了或类似于较大规模培养中采用的生长期条件的条件下进行温育。作为另一种选择或者此外，小份试样可以取自过渡期期间的较大规模培养并用于接种(inoculate)或接种(seed)含有液体培养基和多个微载体(例如本文所述的)的摇瓶，随后将所述摇瓶在复制了或类似于较大规模培养中采用的过渡期条件的条件下温育。作为另一种选择或者此外，小份试样可以取自收获期期间的较大规模培养并用于接种(inoculate)或接种(seed)含有液体培养基和多个微载体(例如本文所述的)的摇瓶，并随后将所述摇瓶在复制了或类似于较大规模培养中采用的收获期条件的条件下温育。在这些方法的任一种中，可以改变在用于在摇瓶中培养哺乳动物细胞的方法中的一个或多个培养参数(与在较大规模培养中用于培养所述哺乳动物细胞的培养参数或组分相比)，测量至少一个培养读数，并将所述至少一个培养读数与针对所述较大规模培养所测定的至少一个培养读数进行比较。正如本领域技术人员能够理解的，这些方法能够用于测试特定培养参数或组分对培养方法中一个或多个具体阶段期间的至少一个培养读数的效果(例如，一个或多个培养参数和/或培养组分对生长期、过渡期和/或收获期期间至少一个培养读数的效果)。

在一些实施方案中，可以执行这些方法以确定较大规模生物反应器中是否存在污染物，其通过确定或检测摇瓶培养中的至少一个培养读数，将所述至少一个培养读数与至少一个培养读数的参考水平(例如来自基本不含污染的培养物的至少一个培养读数的水平)相比，并且当与所述至少一个培养读数的参考水平相比摇瓶培养中的至少一个培养读数指示摇瓶中存在污染物时，将较大规模生物反应器鉴定为含有污染物。例如，所述污染物可以是生物污染物，如病毒、真菌、不想要的哺乳动物细胞或细菌，如分枝杆菌。例如，所述污染物可以是水疱疹病毒(vesivirus)。

实施例

本发明通过如下实施例进一步描述，所述实施例不限制本发明在权利要求中所描述的范围。

实施例1：示例性的使用摇瓶和微载体的培养方法

人重组形式的人α-半乳糖苷酶可以用已经建立的重组工程技术在CHO细胞系中生产。目前重组人α-半乳糖苷酶的制造生产利用2000-L连续灌注微载体细胞培养工艺技术。通常，生产细胞培养工艺包括三个阶段：生长期、过渡期和收获期。存在对于高通量细胞培养工艺系统的需求，其会精确地模拟2000-L生物反应器细胞培养工艺运行中的细胞培养工艺条件。本实施例中描述了摇瓶微载体分批再补料细胞培养工艺，其模拟重组人α-半乳糖苷酶2000-L生物反应器灌注细胞培养工艺。

材料与方法

重组人α-半乳糖苷酶细胞培养

用编码分泌形式的人重组α-半乳糖苷酶的核酸来稳定转化用于实验的细胞。在细胞库培养扩大工艺期间使用生长培养基(925培养基，含有10％DBS，pH7.3，和0.1％PluronicF-68)。

设备

用Multiron摇动培养箱(AppropriateTechnicalResources,Inc.,ModelnumberAGCH-4103)来培养细胞。用BeckmanCoulterVi-CellXR细胞存活率分析仪(型号XR，货号#731050)来测量培养中的活细胞密度和活细胞百分比。

方法

用于示例性的摇瓶微载体分批再补料细胞培养工艺运行的接种物是从解冻的小瓶的产生重组人α-半乳糖苷酶的CHO细胞的种子培养扩大产生的。将解冻的细胞在含有10％DBS，pH7.3，和0.1％PluronicF-68的925培养基中扩大培养5天后，将种子培养物用于接种含有无菌微载体浆料(CytoPore2,GEHealthcare,Piscataway,NJ；终浓度为1.5g/L；平均尺寸200-280μm；平均孔尺寸30μm)和生长培养基(含有6％DBS，pH7.0，和0.1％PluronicF-68的925培养基)的摇瓶(摇瓶中终浓度为0.25x10⁶活细胞/mL)，其启动细胞培养的生长期。将培养维持在37℃或36℃、95RPM、80％相对湿度和5％CO₂。当培养达到2.5x10⁶至3.0x10⁶活细胞/mL的目标细胞密度时，通过将液体培养基改成不同的生产培养基(925培养基，pH6.85-7.05，和0.1％PluronicF-68)并将温度移至32℃来启动过渡期。过渡期5天后，将温度移回至37℃或36℃，并用生产液体培养基来维持培养物。培养基更换是在生长期的第三天起始的，并持续直到培养结束，每天分批再补料更换培养开始时摇瓶中初始体积的液体培养基的70％。从生长期的第三天开始，每天在生物安全罩(biosafetyhood)中进行培养基更换，其通过简短停止搅拌摇瓶、使微载体沉淀至摇瓶底部来进行。在一些情况下，当微载体沉淀至摇瓶底部时，将摇瓶置于瓶架中，所述瓶架将摇瓶置于相对于水平或台面45度的位置，从而改进培养基更换。这种瓶架的非限制性实例示于图1中。在微载体已沉淀至摇瓶底部后，将体积为摇瓶中存在的液体培养基初始体积的70％的液体培养基从摇瓶去除，然后迅速将与去除的液体培养基体积基本相同体积的液体培养基添加至摇瓶。在预先确定的培养日，分析如下的培养参数：活细胞和悬浮细胞密度以及活细胞百分比、pCO₂、pO₂、pH、葡萄糖和乳酸浓度和谷氨酰胺和谷氨酸浓度。收集滴度样品并保持在-20℃直至进行测定来测量重组人α-半乳糖苷酶活性。每个运行使用一式三套的瓶子，总共进行了两个完整的细胞培养工艺运行。计算所得数据的平均差和标准差，并示于图2-6的每一个中。

结果与讨论

生长期持续时间和过渡密度

生长期期间的细胞培养性能对于成功生产重组蛋白是至关重要的。表1提供了在两个用上文所述接种物启动的摇瓶微载体分批再补料细胞工艺运行的生长期终点处所达到的生长期持续时间和活细胞密度的概要。生长期持续时间在两个细胞培养工艺运行之间是一致的，其在生长8天后达到的活细胞密度为2.5x10⁶细胞/mL至3.0x10⁶细胞/mL(示例性的用于开始过渡期的目标活细胞密度范围)。

表1.两个重组人α-半乳糖苷酶摇瓶微载体分批再补料细胞培养工艺运行的过渡期开始处的生长期持续时间和活细胞密度概要

细胞培养生长

通过一些不同的量度来监控细胞培养物的生长和健康性能。通过对活细胞浓度的测量来追踪细胞生长(图2)。所得的结果显示在整个生长期和过渡期早期细胞浓度一直增长，并在生长期终点处达到约3.0x10⁶细胞/mL的最大活细胞浓度。因为培养是适应于无血清培养基的(从过渡期的开端开始，经过整个收获期)，收获期早期期间的活细胞浓度有轻微的降低。此后，培养物稳定下来，并在大部分的收获期维持2.0x10⁶至4.0x10⁶的活细胞浓度，并在收获期晚期期间活细胞密度进一步增加。在大部分的收获期中，活细胞的百分比大于80％(图3)。

通过测量培养物中的悬浮细胞浓度，在细胞培养工艺运行全程中还监测到了细胞分离(图4)。培养物中的悬浮细胞浓度在收获期开始处达到顶峰，这最可能的是由于血清剥夺(serumwithdrawal)对细胞的影响。在细胞培养工艺运行全程中悬浮细胞浓度维持在低浓度(0.1x10⁶至0.3x10⁶细胞/mL)。

培养生产率

在细胞培养工艺运行全程监测体积生产率(单位/L/天)，以获得对摇瓶微载体分批再补料模型的生产率性能的了解。如图5所示，培养生产率在过渡期晚期/收获期早期处达到顶峰。然而，随着培养适应于血清的缺乏，观察到了生产率的急剧下降。细胞培养在收获期早期从这个低谷恢复，培养生产率在收获期全程得到提高。约在收获期的半途处(收获期的约第20天)，细胞培养生产率维持在稳定水平(体积生产率(VPR)在600单位/L/天以上)直至运行结束。申请人注意到活细胞浓度未出现与观察到的细胞培养生产率低谷期对应的低谷期(图2)，。

当把这个示例性的摇瓶微载体分批再补料工艺的生产率概貌与2000-L工艺相比时，观察到了两个独特的差异。第一，与示例性的摇瓶微载体分批再补料工艺相比，2000-L工艺中过渡期晚期/收获期早期过程中的生产率峰更高。第二，2000-L工艺的低谷期延至收获期中期，而不是在示例性的摇瓶微载体分批再补料工艺中观察到的收获期早期。2000-L工艺中低谷后培养生产率的恢复也比示例性的摇瓶微载体分批再补料工艺中更慢。这些性能差异可能是由于两种培养工艺中使用的培养基更换方法不同。2000-L灌注工艺中的培养基更换以连续方式进行，其中细胞连续暴露于经调整的/新鲜的培养基。另一方面，本实施例中所描述的示例性的摇瓶微载体分批再补料模型中每天进行一次培养基更换，其中去除了第一液体培养基的体积的70％并用约相同体积的第二液体培养基来替换，所述替换以大剂量方式(bolusfashion)进行。然而，本实施例中所描述的示例性的摇瓶细胞培养工艺运行的累积体积生产率和2000-L生物反应器细胞培养工艺运行显示出相似的趋势(图6)。

培养物代谢

在细胞培养工艺运行期间，通过葡萄糖和乳酸盐浓度测量来监测细胞代谢。从收获期样品的葡萄糖和乳酸盐分析来计算葡萄糖消耗速率和乳酸盐产生速率。收获期期间较低的乳酸盐水平说明了培养的细胞对葡萄糖的有效利用。总体来看，葡萄糖消耗和乳酸盐的产生与细胞生长曲线是一致的(图2)。培养物最有活力的时期发生在两个不同的培养阶段：i)当细胞增殖与含血清培养基一起出现时，和ii)向着收获期的末端，当出现再生长期时(通过活细胞密度和代谢活性二者的增强而注意到)。谷氨酰胺和谷氨酸浓度概貌说明了收获期早期过程中谷氨酰胺的消耗和谷氨酸的生产的减少，这对应于所观察到的低谷期。

培养pH、pCO₂和pO₂

在采样期间用血液气体分析仪来监测培养pH、pCO₂和pO₂概貌。pH和pCO₂概貌均与活细胞浓度概貌一致。pCO₂概貌显示pCO₂水平维持在30-35mmHg，其对应于培养箱的5％CO₂的设定。

结果总结

本实施例中描述的示例性的重组α-半乳糖苷酶摇瓶微载体分批再补料细胞培养工艺运行，实现了一些有益的结果，例如在仅仅7-9天内得到了2.5x10⁶活细胞/mL至3.0x10⁶活细胞/mL的过渡期细胞密度，在整个收获期将活细胞浓度维持在2.0x10⁶细胞/mL至6.0x10⁶细胞/mL的成就，在整个培养工艺期间低悬浮细胞浓度(<0.5x10⁶细胞/mL)的成就(除了从培养物去除血清后不久出现的悬浮细胞密度短期上升)，以及培养生产率在过渡期晚期达到顶峰的成就。注意到当收获期早期过程中培养生产率经历短暂低谷时，从这个低谷的恢复是迅速的，收获期全程的体积生产率为600单位/L/天以上。

摇瓶微载体细胞培养工艺运行的可变性程度可以归因于液体培养基/原材料的小差异和实验可变性。然而，培养性能趋势应当更相似。这种示例性的摇瓶微载体分批再补料工艺已经用于一些其他的应用，如用于支持生物反应器运行(40-L和2000-L细胞培养工艺运行)的卫星培养、对重组人α-半乳糖苷酶生产的微量金属和转变温度研究以及细胞培养工艺的理解和开发。

生物技术领域技术人员会理解，本实施例中所描述的用于生产α-半乳糖苷酶的示例性的摇瓶微载体分批再补料工艺可以延伸至其他应用，如对细胞培养工艺的测试和设计改进，以及对制造工艺的监控或故障排查。本文所述的小规模摇瓶微载体工艺还允许将较大生物反应器工艺所需的资源和材料最小化。

实施例2.确定微载体浓度和搅拌频率对摇瓶中活细胞浓度的影响的实验

进行了一套实验来检测不同微载体浓度和不同搅拌频率对摇瓶中哺乳动物细胞培养生长表现的影响。

方法

在如实施例1中所述的生长期条件下培养细胞，区别仅在于使用不同的微载体浓度和不同的旋转搅拌频率。

通过将解冻的细胞库置于带有50mL生长培养基的250-mL尺寸的摇瓶中，来制备用于接种盛有微载体的摇瓶的培养物。所得的种子培养物在摇瓶中于37℃、125RPM、6％CO₂和80％相对湿度进行温育，直至将它们用于接种含有微载体的摇瓶。接种之后，用下文所述的参数来培养含有微载体的摇瓶。在所有实验中均使用含有10％Dulbecco’s牛血清、pH7.0、0.1％PluronicF-68的925培养基。

表2.细胞培养条件

微载体制备于磷酸盐缓冲盐水中，并进行高压灭菌。然后在无菌条件下将所得的无菌微载体添加至每个摇瓶中，以在每个细胞瓶中达到1g/L、1.5g/L或2g/L的终浓度。然后将摇瓶微载体培养物培养6天，并确定随时间经过的活细胞密度。

结果

图7中的数据显示，当以85RPM或125RPM的频率搅拌时，哺乳动物细胞能在含有微载体的摇瓶中生长。数据还显示当使用85RPM或125RPM的搅拌频率时，含有1.0g/L和1.5g/L微载体的摇瓶具有较高的活细胞密度。

实施例3.作为40-L生物反应器工艺的模型的摇瓶培养

这项研究是设计来用于探索本文所述的摇瓶培养方法用于40-L重组人α-半乳糖苷酶生物反应器的卫星培养的用途，以及用于比较卫星摇瓶培养中所达到的性能和产量以及40-L生物反应器培养中达到的性能和产量。

程序

规模降低模型描述

这些实验中使用的40-L生物反应器是不锈钢的、搅拌罐容器，其开发用于模拟2000-L制造生产生物反应器。这种全自动的容器是经过原地蒸汽灭菌的，并具有与2000-L生产生物反应器相似的控制基本构架和实用构型。

250-mL卫星摇瓶培养采用带有通气帽的一次性的γ-灭菌的Corning非致热聚碳酸酯锥形瓶。在AppropriateTechnicalResources,Inc.(ATR)培养箱中，于受控的CO₂、湿度和温度温育卫星摇瓶培养物。ATR培养箱同时控制和监控卫星摇瓶培养的环境条件。

方法

40-L生物反应器培养

为本研究而取样的40-L重组人α-半乳糖苷酶生物反应器培养物用两个工作细胞库(09TP040和09TP038)进行接种。含有编码重组人α-半乳糖苷酶的核酸的重组细胞首先在悬浮培养中生长，直至将其用于接种含有终浓度为1.5g/L的CytoporeII微载体的40-L生物反应器。在含有10％血清的培养基中培养细胞，所述培养基在N-1期下降至含6％血清的培养基。在40-L生物反应器中，于含6％血清的培养基中培养细胞直至生长期结束。在生长期结束时以1.2RV/天的速率去除和替换含血清的生长培养基进行120小时，以将40-L生物反应器培养物转换为不含血清的生产培养基。操作40-L生物反应器，以模拟具有受控参数(溶解氧、pH、温度和pCO₂)的2000-L生产生物反应器，其维持在制造规格/范围内，并将除氮喷雾、覆盖物浓度和表面积比体积之外的物理参数(灌注速率、搅拌、喷雾气体排出速度和锥冲洗率(coneflushrate))规模调整至匹配2000-L生物反应器。

在卫星摇瓶培养研究中在40-L生物反应器中调查了多种实验条件。取样用于收获期卫星培养物的40-L生物反应器培养物使用细胞系WCB09TP040，并在向无血清生产培养基添加或不添加微量A元素(TraceAElements(Invitrogen))的情况下进行操作。将无微量A元素的40-L生物反应器培养数据列入与卫星摇瓶培养数据的比较，这是由于其与微量A元素40-L生物反应器培养数据和卫星摇瓶培养数据均相似的性能。取样用于生长期卫星培养物的40-L生物反应器培养物使用细胞系WCB09TP038并辐照(irradiated)生长培养基中的血清。

250mL摇瓶卫星培养

250-mL卫星摇瓶培养物在重组人α-半乳糖苷酶40-L生物反应器培养的两个时间点开始：生长期和收获期(图8)。用取样口(sampleport)从40-L生物反应器培养去除无菌的250-mL活细胞培养含有微载体的样品。然后将来自该样品的充分混合的培养物无菌转移至带有搅拌子的250-mL摇瓶或无菌的平底容器，其用于合并(pool)来自多个反应器的培养物。如果培养物首先进行了合并，则将来自这个合并物的充分混合的样品转移至250-mL摇瓶。当培养物被转移至250-mL摇瓶，则取样品用于细胞计数、代谢物和滴度。在取样后，如果在40-L生物反应器培养物中尚在进行灌注，在摇瓶上进行再补料然后将它们转移至ATR摇动培养箱。

卫星摇瓶培养工作体积和培养箱转动RPM是多样化的。将工作体积从初始的68mL减少至60mL，然后再到50mL。在接种后第0天检查瓶重量，然后每天检查以验证在分批再补料后瓶体积保持恒定。将旋转的频率从95RPM增加至110RPM，以确定更有效的混合是否对培养性能具有有益效果。据此前的实验观察，在95RPM处，微载体趋于集中在250-mL摇瓶的中心，而在110RPM处，微载体更为均匀分布至整个摇瓶。在实验全程用恒定的频率对收获期卫星摇瓶培养物进行搅拌。与实验条件无关的是，生长期卫星摇瓶培养最初以85RPM开始，然后在生长第3天攀升至95RPM。选择这种搅拌策略来将适应摇瓶生长条件的前几天期间对这些培养物的剪切应力最小化，然后将其增加以提供充分的混合。

对于所有卫星摇瓶培养，将ATR培养箱维持在5.0％CO₂、37℃和80％相对湿度(RH)。5.0％CO₂浓度比不上40-L生物反应器培养CO₂浓度，但选择了前者是因为没有pH控制和操作容易。卫星摇瓶培养的温度停留在37℃的标准培养箱温度，而不是匹配36℃的40-L生物反应器培养温度。假设这对卫星摇瓶培养性能没有大的影响。

为了复制卫星摇瓶培养中40-L灌注生物反应器培养的生产条件，每天进行0.7X瓶容积分批再补料，从而用新鲜培养基来取代用过的培养基。通过用专门的瓶架将250-mL摇瓶倾斜并保持在45°角度，来完成分批再补料。允许附着/含有细胞的微载体沉淀约1分钟，然后将用过的培养基取出，并用新鲜培养基取代。新鲜的培养基在使用前储存于4℃，并在再补料之前，在ATR摇动培养箱中的250-mL摇瓶中将其平衡约1-3小时至5.0％CO₂和37℃。在每日再补料之前，每2-3天对所有卫星摇瓶培养取样，用于pH、pO₂和pCO₂(Bayer248血液气体分析仪)、活细胞密度(VicellXR)、活细胞百分比(活细胞/总细胞；VicellXR)、代谢物浓度(葡萄糖、乳酸盐、谷氨酰胺、谷氨酸；YSI2700)、细胞凋亡(番石榴连接蛋白测定(GuavaNexinAssay))和重组人α-半乳糖苷酶的滴度。

收获期卫星摇瓶培养取样自两个40-L生物反应器：IDsP403-38和P407-33。通过对生产培养基添加微量A元素(Invitrogen)来操作40-L生物反应器培养。在收获第二天，从由P407-33生物反应器培养取出的培养物开始三个收获期卫星培养，并以68mL的工作体积将其直接转移至三个250-mL摇瓶。在收获第4天，从由P403-38生物反应器培养取出的培养物开始两个收获期卫星摇瓶培养，并在收获第四天，从由P407-33生物反应器培养取出的培养物开始两个卫星收获期摇瓶培养。从这些40-L生物反应器培养取出的样品被直接以60mL的工作体积转移至250-mL收获期卫星摇瓶培养，而没有进行合并。在转移后对所有收获期卫星摇瓶培养进行采样，然后以0.7X摇瓶容积进行再补料，然后置于ATR培养箱中。收获期卫星摇瓶培养中使用的培养基与40-L生物反应器培养中使用的培养基是不同货号的，但其组成是相同的并且含有1X微量A元素(Invitrogen)。将这些收获期卫星摇瓶培养维持直至工艺结束(收获第53天)。

用于生长期卫星摇瓶培养的培养物取样自两个40-L生物反应器培养：IDsP405-29和P408-29，所述取样是在G0(接种日)的接种后约1小时内进行的。将两个40-L生物反应器培养样品合并，然后以2个工作体积转移至4个250-mL摇瓶(表3)。在G4(比开始40-L灌注生物反应器培养(G3)晚一天)开始进行分批再补料，这是由于卫星摇瓶培养细胞计数和代谢物消耗中观察到1天的滞后。这些生长期卫星摇瓶培养从G0-G8维持，但在收获期早期终止，这是由于过渡偏差造成了超出可接受范围的高过渡细胞密度和在37℃额外的一天。仅使用来自这个实验的生长数据。

表3.用于250-mL摇瓶卫星研究的条件

结果

生长期卫星培养

生长期卫星摇瓶培养中所有条件的活细胞生长都滞后，这是由于转移压力(transferstress)和搅拌变化，但在恢复之后，其活细胞生长与平行培养的40-L母反应器培养物是相似的(图9)。生长期卫星摇瓶培养中具有细胞生长初始日的滞后。这种生长滞后最可能是由对培养物的压力引起的，所述压力是在从40-L生物反应器培养的转移过程期间发生的。此前已经观察到摇瓶模型需要额外的生长天数来达到3.0x10⁶细胞/mL的过渡密度。当在生长第2天将搅拌从85RPM改变为95RPM时，观察到了额外的一天滞后。在50-mL生长期卫星摇瓶培养中观察到了较大效果。在培养物存活率数据中也观察到了这种滞后(图10)，并认为这种滞后的原因是额外的剪切应力，所述剪切应力是因为50-mL生长期卫星摇瓶培养的工作体积与瓶容积的比率较小。增加的剪切应力最可能导致50-mL生长期卫星摇瓶培养中增加的悬浮细胞浓度(图11)。

生长期卫星摇瓶培养中所有条件中的生产趋向于与平行培养的40-L母生物反应器培养物相似(图12)。在生长期卫星摇瓶培养中观察到的较低的滴度是由于细胞浓度较低。比生产率最初比生长期卫星摇瓶培养稍高，但随着生长期卫星摇瓶培养恢复，其与40-L生物反应器培养数据靠拢(图13)。由于细胞浓度较低，50-mL生长期卫星摇瓶培养具有与68-mL生长期卫星摇瓶培养相比较低的滴度，这通过两种类型的生长期卫星摇瓶培养之间重组人α-半乳糖苷酶的相似比生产率而得到了支持(图13)。

生长期卫星摇瓶培养的葡萄糖、乳酸盐、谷氨酸和谷氨酰胺代谢最初趋向于与来自40-L生物反应器培养的数据相似，但从第5天开始偏离。生长期卫星摇瓶培养中的葡萄糖和谷氨酰胺浓度随着第3天的第一批再补料而增高，然后随细胞继续生长而下降，并且乳酸盐生产增加至超出40-L生物反应器培养范围。生长期卫星摇瓶培养中的乳酸盐生产在第5天较高，然后保持在比40-L生物反应器培养更高。生长期卫星摇瓶培养中由乳酸盐至葡萄糖的产率保持与40-L生物反应器培养相似，这说明葡萄糖/乳酸盐代谢与生长期卫星摇瓶培养和40-L生物反应器培养中类似(图14)。生长期卫星摇瓶培养中的谷氨酸浓度从40-L生物反应器培养偏离，然后在第8天出现靠拢。40-L生物反应器培养在生长第5天温度下降，这抑制了细胞代谢和生长。在生长期卫星摇瓶培养中没有出现类似的温度移动，这导致了生长第8天的代谢偏离。生长期卫星摇瓶培养中较高的乳酸盐生产导致了第5天葡萄糖和谷氨酰胺的偏离。与60-mL生长期卫星摇瓶培养相比，50-mL生长期卫星摇瓶培养中的乳酸盐生产受到抑制，但这最可能是由于该培养物中细胞密度较低的结果。

生长期卫星摇瓶培养中的pH最初与40-L生物反应器培养是相似的，但所述pH在第3天由于缺乏主动pH控制而发生偏离，并且由于较高的乳酸盐生产而保持在比40-L生物反应器培养更低。40-L生物反应器培养用添加NaOH来将pH维持在高于6.80。在第4天生长期卫星摇瓶培养pH增加回至40-L生物反应器培养的范围内，这是由于在第3天再补料抑制/稀释了乳酸盐。生长期卫星摇瓶培养中的pO₂和pCO₂与40-L生物反应器培养是非常不同的，这是由于缺乏对这些参数的主动控制。生长期卫星摇瓶培养中pCO₂较低，这是由于更有效的清除(sweep)和5.0％CO₂培养箱设定点。生长期卫星摇瓶培养中的pO₂比40-L生物反应器培养更高，但其随着生长期卫星摇瓶培养中细胞生长的增高而降低。较低的pO₂代表了60-mL生长期卫星摇瓶培养中较高的细胞量(cellmass)。

收获期卫星摇瓶培养

收获期卫星摇瓶培养中所有条件的活细胞生长与平行培养的40-L母生物反应器培养是相似的(图15)。在转移至250-mL收获期卫星摇瓶培养后2-3天内，活细胞浓度出现初始下降。在60-mL收获期卫星摇瓶培养这种下降更加显著。在重组人α-半乳糖苷酶40-L生物反应器培养中，这种下降比相应的活细胞浓度低谷早6-8天(图15)。收获期卫星摇瓶培养中的存活率遵循与40-L生物反应器培养相同的趋势，并且收获期卫星摇瓶培养中的存活率在低谷期期间降低(图16)。这种活细胞浓度低谷被认为是由于对无血清培养基的适应，并且分批再补料工艺可能增强这种有害作用。低谷期期间，收获期卫星摇瓶培养中的悬浮细胞浓度与40-L生物反应器培养相比也较低(图7)。这说明了较低的总细胞浓度，但也可能说明所述分批再补料工艺更有效地从收获期卫星摇瓶培养洗涤细胞和较小的聚集体。随着收获期卫星摇瓶培养进入低谷期，更有效地去除细胞也可能有助于活细胞浓度更快降低。

与条件无关的是，收获期卫星摇瓶培养从低谷期开始恢复，所述恢复在H27-28处，与40-L生物反应器培养同时发生(图15)。40-L生物反应器培养显示出较强的活细胞密度增高，但这个时期内用于细胞计数的仪器可能存在问题，并因而收获期卫星摇瓶培养数据和40-L生物反应器培养数据的差异可能被夸大了。同样更困难的是将代表性的充分混合的样品与伴随微载体的收获期卫星摇瓶培养拉开(pull)，并且这可能也已导致测得的细胞浓度的差异。这一类误差在较高的细胞密度处得到增强，因为微载体变得更重。

这个时间框架期间在收获期卫星摇瓶培养中的悬浮细胞计数也开始增长，并且这些数据与40-L生物反应器培养中观察到的悬浮细胞计数是一致的(图17)。含有60mL培养基且以110RPM搅拌的收获期卫星摇瓶培养物与其他收获期卫星摇瓶培养物相比具有较高的悬浮细胞浓度。这说明这种搅拌有更多的剪切应力，这导致脱离的细胞水平的增加。含有60mL培养基且以95RPM搅拌的收获期卫星摇瓶培养在离开低谷(trough)时也具有稍微较高的悬浮细胞浓度，这说明在较低的工作体积处剪切应力的增加可能使得脱离的细胞比用更大工作体积的培养基的收获期卫星摇瓶培养更多。然而，滴度产量(图18)表明60-mL收获期卫星摇瓶培养中的细胞量(cellmass)比Vicell活细胞计数所表现的那些更多。这种较高的细胞量和生长可能也增加了较高的悬浮细胞计数。所有收获期卫星摇瓶培养里的收获期中晚期中的存活率是变化的，但其保持较高并且与来自40-L生物反应器培养的数据相当(图16)。

收获期卫星摇瓶培养中的滴度产生与40-L生物反应器培养相似(图18)。在收获期卫星摇瓶培养中的头3-5天后，生产率增加至比40-L生物反应器培养中所观察到的生产率更高的水平。收获期卫星摇瓶培养中的比生产率也增加至超出40-L生物反应器培养中所观察到的范围(图19)，这是由于对收获期卫星摇瓶培养中比40-L生物反应器培养中更高的温度的生长响应，或是对更高的百分比氧的响应(图16)。收获期卫星摇瓶培养中每克葡萄糖的产物产率最初与40-L生物反应器培养是相似的，但随着收获期卫星摇瓶培养中乳酸盐生产的增加而出现差异(图20)。收获期卫星摇瓶培养中来自有氧葡萄糖的产物产率在收获期晚期中较低，这说明葡萄糖在收获期卫星摇瓶培养中并未有效利用。较高的RPM收获期卫星摇瓶培养产生较少的乳酸盐且具有与40-L生物反应器培养相比更为相当的每克葡萄糖产物产率，以及具有较高的消耗有氧葡萄糖的产物产率。这说明，这些收获期卫星摇瓶培养中使用的较高的搅拌速率(RPM)提高了对葡萄糖的利用。

不管条件如何，所有的收获期卫星摇瓶培养在与40-L生物反应器培养于H9-10处相同的时间段进入生产低谷。与其他收获期卫星摇瓶培养相比，含有68mL培养基并以95RPM搅拌的收获期卫星摇瓶培养，在低谷前较高的生产增加之后，其低谷更深(图18)。这可能是由于生长增加(此前从任一的较低剪切应力发现其负面地影响40-L生物反应器培养中的低谷深度)、在低谷期前较长地暴露于较高的O₂而导致的，或是因为它们是在40L生物反应器培养的活跃生长期期间取样而导致的。

60-mL收获期卫星摇瓶培养具有与40-L生物反应器培养相似的低谷深度，并且比68-mL收获期卫星摇瓶培养更早进入低谷恢复(图18)。这些培养物在静止/衰退生长期期间取样自40-L生物反应器培养。这可能避免了低谷前收获期卫星摇瓶培养中扩大的细胞生长。由于较低的工作体积而造成的较高的剪切应力可能也抑制了低谷前的细胞生长。

所有收获期卫星摇瓶培养都与40-L生物反应器培养相似地进入低谷恢复(图18)。在收获期卫星摇瓶培养中还观察到了较大量级的比生产率的增加，但其趋向于与40-L生物反应器培养相似(图19)。不管条件如何，所有收获期卫星摇瓶培养在收获晚期衰退前的低谷至峰生产恢复程度和恢复长度都是相似的。收获期卫星摇瓶培养中的收获期晚期衰退趋向于与40-L生物反应器培养相似，但前者更为陡峭。这可能是由于随着收获期卫星摇瓶培养代谢在这一相同的时间框架附近开始大大偏离40-L生物反应器培养的营养物的积累或是消耗(图21)。

收获期卫星摇瓶培养的葡萄糖、乳酸盐、谷氨酸和谷氨酰胺代谢趋向于与40-L生物反应器培养相似，但其规模变化是不同的。收获期卫星摇瓶培养中的葡萄糖消耗随着培养物进入低谷期而减少，然后随着培养物恢复而增加，这与40-L生物反应器培养相似。然而，收获期卫星摇瓶培养中的乳酸盐生产在低谷期之前和之后要高很多。乳酸盐生产的增加导致收获期卫星摇瓶培养中葡萄糖和谷氨酸消耗增加至大大超出40-L生物反应器培养中所观察到的范围。对于以95RPM搅拌的收获期卫星摇瓶培养，由于乳酸盐生产高，收获期晚期谷氨酸变得有限。收获期卫星摇瓶培养中的谷氨酰胺消耗维持在高于40-L生物反应器培养，但具有与之相似的趋势。收获期卫星摇瓶培养中从葡萄糖生成乳酸盐的产率也比40-L生物反应器培养中的范围更高，这说明收获期卫星摇瓶培养中的代谢有变化。

68-mL收获期卫星摇瓶培养具有延迟的乳酸盐生产增加，这与滴度产生增加的延迟是一致的(图18)。不管搅拌频率如何，60-mL收获期卫星摇瓶培养的乳酸盐生产较早达到顶峰，这与这些培养物中的滴度产生峰相对应。这说明乳酸盐生产是由于收获期卫星摇瓶培养在培养恢复期间在低谷后(post-trough)被激发的代谢导致的。然而观察到以110RPM搅拌收获期卫星摇瓶培养抑制乳酸盐生产、葡萄糖消耗和谷氨酸消耗，而对滴度产生没有抑制性作用。这可能是由于提高的细胞与细胞相互作用动力学(kinetics)、聚集和/或提高的氧可用性(这是由于更充分的混合)造成的。当细胞量增加时，收获期卫星摇瓶培养中观察到了较高的乳酸盐生产，这说明收获期卫星摇瓶培养中可能存在局部化的缺氧事件，其将培养向无氧代谢推动，或是在细胞生长期间较低的旋转速度促进了异常的聚集体形成和微载体粘附。

与以110RPM的频率搅拌的收获期卫星摇瓶培养相比，以95RPM的频率搅拌的收获期卫星摇瓶培养中较低的pO₂测量结果，支持了氧气在乳酸盐抑制中所起的作用。收获期卫星摇瓶培养中pO₂的水平从未降至40-L生物反应器培养水平以下，但混合不良使得细胞量集中于摇瓶的底部中心处，这可能在局部位点产生了没有得到测量的较低pO₂浓度。用于血液气体分析仪(BGA)测量的取样方法涉及允许培养物沉淀，然后测试顶层上清。这种技术可能提供了比培养物中存在的高细胞浓度的局部位点更高pO₂的值。

收获期卫星摇瓶培养中的凋亡细胞群体趋于与40-L生物反应器培养相似。收获期卫星摇瓶培养和40-L生物反应器培养中随着培养物进入低谷期，细胞凋亡有一个初始的上升。然后，随着培养物恢复，接着是细胞凋亡的降低和稳定化(图22和23)。60-mL收获期卫星摇瓶培养最初具有较高的凋亡细胞百分比，然后在低谷期期间与收获期卫星摇瓶培养和40-L生物反应器培养靠拢。60-mL收获期卫星摇瓶培养是从40-L生物反应器培养取样的，其取样比68-mL收获期卫星摇瓶培养更接近低谷期，并且这可能导致了较高的凋亡群体。以110RPM的频率搅拌的收获期卫星摇瓶培养表现为在收获期晚期具有较低的凋亡群体，但在H41之后未产生数据，这可能在测定的噪声之内。

收获期卫星摇瓶培养中的pH、pO₂和pCO₂与40-L生物反应器培养极为不同，这是由于对这些参数缺乏主动控制。由于pCO₂概貌低很多，收获期卫星摇瓶培养pH最开始比40-L生物反应器培养高很多，然后主要由乳酸盐的生产来驱动。收获期卫星摇瓶培养中的pO₂比40-L生物反应器培养更高，但其趋势随细胞浓度变化，当培养物进入低谷时增高，而在收获期晚期随着收获期卫星摇瓶培养恢复而朝着40-L生物反应器培养的水平降低。收获期卫星摇瓶培养中的pCO₂浓度比40-L生物反应器培养中低很多，这是由于收获期卫星摇瓶培养极高的清除效率(sweepefficiency)和培养箱5.0％CO₂的低设定值。收获期卫星摇瓶培养之间pCO₂概貌的差异是由于培养箱差异而造成的。

总结

这些数据证明用于重组人α-半乳糖苷酶40-L生物反应器工艺的卫星培养的250-mL摇瓶模型的成功使用。在生长和收获期期间成功完成了对活的(live)重组人α-半乳糖苷酶微载体细胞培养从40-L生物反应器至250-mL卫星摇瓶培养的转移。

收获期250-mL卫星摇瓶培养与母40-L生物反应器培养平行地运行，并产生了相当的细胞生长和滴度产生。收获期卫星摇瓶培养中的细胞浓度较低，这说明重组人α-半乳糖苷酶的比生产率比40-L生物反应器培养中更高，但这可能还是由于从收获期卫星摇瓶培养物获得微载体的代表性样本困难而导致的。生长期卫星摇瓶培养显示出与40-L生物反应器培养相比在细胞生长和生产的最初一日上有一天的滞后，然后在搅拌变化后有一天的滞后。卫星摇瓶培养较慢的生长可以归因于从40-L生物反应器培养转移期间的应力，以及由于搅拌变化引起的剪切应力的增加。与40-L生物反应器培养相比，250-mL卫星摇瓶培养中的比生产率较高，但这在细胞计数中可能由于不准确而表现失实。另一方面，当卫星摇瓶培养中的乳酸盐生产增加到高于40-L生物反应器培养的水平时，卫星摇瓶培养中利用有氧葡萄糖的产物产率低于40-L生物反应器培养中所观察到的产率。

在卫星摇瓶培养和40-L生物反应器培养之间观察到了培养pH、pO₂和pCO₂的明显差异，这是由于卫星摇瓶培养中缺乏对这些参数的主动控制。与40-L生物反应器培养相比，pCO₂浓度低很多，pO₂较高，而pH波动到正常操作范围外。在250-mL卫星摇瓶培养中还使用了较高的温度设定点。有趣的是，这些差异对培养物生长、生产率和凋亡几乎没有可观测的影响，这说明在40-L生物反应器培养中此类参数可能也更有弹性。然而，这些参数差异可能是卫星摇瓶培养葡萄糖、乳酸盐、谷氨酸和谷氨酰胺代谢差异的原因。

两个其他参数，40-L生物反应器培养和250-mL卫星摇瓶培养之间的混合/搅拌和灌注速率也不同，这可能促进了培养物代谢中所观察到的差异。这得到了以较高频率搅拌的卫星摇瓶培养中提高的葡萄糖、乳酸盐和谷氨酸代谢的支持。以较高频率搅拌的卫星摇瓶培养中，收获期晚期利用有氧葡萄糖的产物产率较高而谷氨酸消耗较低。这说明导致较低的有效葡萄糖消耗的机制和对其他碳/氮源的利用可以通过改进的混合策略来加以抑制。

综上所述，这些数据表明250-mL摇瓶培养物(如本文所述)能用于精确模拟较大的生物反应器培养中实现的生长和重组蛋白生产。

实施例4.用于测试多种培养基的卫星摇瓶培养

为了缓和病毒污染的风险和促进持续的细胞培养性能，使哺乳动物细胞培养工艺过度到远离使用动物来源的培养基组分。在这项研究中，在重组人α-半乳糖苷酶收获阶段卫星摇瓶培养(本文中描述)中对化学成分确定的、无动物组分的CD水解产物补充剂进行了评估。水解产物补充剂是未确定的水解产物的合成替代方案，并且含有纯来源的可溶氨基酸、肽、维生素和必需元素，并且其也被配制成在添加至基本培养基时具有最小pH和摩尔渗透压浓度(osmolarity)影响。在这项研究中，在8个瓶中测试了四种不同的培养基，所述测试使用了来自2个销售商的CD水解产物补充剂：Sigma-Aldrich和Becton,Dickinson,andCo.(BD)。四个条件是1XCD水解产物(来自Sigma-Aldrich)、1XCD水解产物(BD)、10％酵母提取物(BD，在瓶中1.5g/L)和对照(无补充剂的925培养基)。在H27从P404和P407(40-L重组人α-半乳糖苷酶生物反应器培养物)取收获期重组人α-半乳糖苷酶培养物，并将其用于接种8个卫星摇瓶(在H28)。使用配制的培养基的第一批再补料(有或没有CD水解产物或酵母提取物)在H29进行。

流程

250-mL卫星摇瓶培养

以40-L生物反应器的规模将这项研究使用的培养物从种子复苏培养至收获期。在收获期第27天将充分混合的微载体细胞培养样品(400mL)从两个40-L生物反应器培养转移至一个摇瓶(图24)。随后在H28用该培养物接种8个250-mL摇瓶(每个测试的培养基2个)。在H29用经调整的培养基(有或没有CD水解产物补充剂)进行第一再补料。对于四种培养基的每一种，用工作体积为50mL摇瓶按一式两份来与40L生物反应器培养平行地运行(表4)。在36℃、95RPM、5％CO₂和80％湿度将卫星摇瓶培养物维持在ATR培养箱中。

在实验过程期间，制成了2批培养基在整个实验过程中使用。一批是在卫星摇瓶培养开始前的H28制成。第二批在H37制成，但用于取样后在H42的第一再补料。因此，图上反映第二批培养基的第一个点是H44。密切监控如下参数以评估每个培养物的健康：细胞生长和存活率、代谢和生产率。

表4.卫星摇瓶研究中测试的四个生长培养基

结果

来自Sigma-Aldrich的1XCD水解产物补充剂显示出最高的活细胞密度，在低谷恢复后达到20x10⁶细胞/mL的密度。925对照卫星摇瓶培养和40-L生物反应器培养对应物的数据一直是相似的。阳性对照(10％酵母提取物补充剂)也显示出比对照更高的生长，达到10x10⁶细胞/mL的密度，虽然其没有用来自Sigma-Aldrich的CD水解产物补充的培养物那么高。虽然来自BD的CD水解产物补充剂也在H29的再补料后显示出细胞生长，但在H36后停止生长且培养物开始进入平台期或是下坠(图25)。

在来自Sigma-Aldrich的CD水解产物补充剂和10％酵母提取物处观察到了最高的存活率(>95％)。阴性对照培养(仅有925培养基)和来自BD的CD水解产物补充剂显示了相对高的存活率直至H36，之后二者都开始衰退(图26)。当对照摇瓶(仅有925培养基)中保持相对低的总悬浮细胞浓度，以及更低的活细胞浓度时，用BDCD水解产物补充的瓶中悬浮细胞浓度增加，然后降低，并且悬浮细胞浓度在SigmaAldrichCD水解产物补充的瓶中保持在相对较低，这与高活细胞浓度(这显示SigmaAldrichCD水解产物补充的培养物是健康的)有关系。用10％酵母提取物补充的卫星摇瓶培养物具有最高的悬浮细胞浓度(图27)。

葡萄糖浓度概貌反映了活细胞密度生长概貌，其中在SigmaAldrichCD水解产物补充的培养物和10％酵母提取物补充的培养物中消耗葡萄糖最多。葡萄糖消耗在H36从阳性转变为阴性，此时BDCD水解产物补充的培养物中的细胞生长衰退。

在卫星摇瓶培养开始时所有条件的乳酸盐浓度都高，这是由于CO₂下降(至5％)导致的，其在ATR培养箱中无法主动控制。随着SigmaAldrichCD水解产物补充的和10％酵母提取物补充的卫星摇瓶培养中葡萄糖代谢的攀升，乳酸盐浓度也在增长。在BDCD水解产物补充的卫星摇瓶培养和酵母提取物补充的卫星摇瓶培养中的乳酸盐浓度在H36后随着代谢衰退而下降。所有卫星摇瓶培养中的谷氨酰胺消耗趋于与40-L生物反应器培养相似，虽然其消耗比SigmaAldrichCD水解产物补充的卫星摇瓶培养和酵母提取物补充的卫星摇瓶培养(其中活细胞密度更高)中更高。

四种不同培养基的滴度概貌揭示了SigmaAldrichCD水解产物补充剂将滴度推高至～3700U/L直到H42(四个测试的培养基中最高的)，然后在H52前显示出稳定的衰退至～1500U/L。仅有925培养基的对照的卫星摇瓶培养滴度显示出稳定的增长，在H52前增多至～1500U/L，这与40-L母反应器培养相似。10％酵母提取物补充剂引起滴度的最初攀升，其在H42后下降。与其他参数相一致的是，BDCD水解产物补充的培养物在H36后下坠。来自Sigma-Aldrich的和BD的CD水解产物补充剂都提供了直接的低谷恢复(图28)。

所有测试的培养基的比生产率(SPR)均是相似的，除了对照的925培养基之外，所述925培养基显示出与母40-L生物反应器培养相似的趋势。所有其他测试的培养基的SPR各自是相似的，且与对照瓶是相似的，虽然它们在约H40时下降(图29)。

最终，累积体积生产率(VPR)概貌显示了重组人α-半乳糖苷酶的基于摇瓶培养的稀释系数的累积生产率。这些数据显示，含有来自Sigma-Aldrich的CD水解产物补充剂的卫星摇瓶培养显示了最高的生产率，其速率仅在～H45后轻微降低。在含有酵母提取物的卫星摇瓶培养(阳性对照)中观察到了较低的累积VPR，而在含有来自BD的CD水解产物补充剂的卫星摇瓶培养中甚至观察到了进一步降低的累积VPR，其中累积VPR在H38后维持平稳(产物滴度下降)。对照的卫星摇瓶培养显示了累积VPR随着滴度增长的稳定增长，虽然其未达到与含有来自Sigma-Aldrich的CD水解产物补充剂的卫星摇瓶培养相似的水平。

卫星摇瓶培养中的pH和pO₂与40-L生物反应器培养极为不同，这是由于缺乏对这些参数的主动控制。卫星摇瓶培养在这期间的CO₂比母40-L生物反应器培养(85-95mmHg)低很多(35-45mmHg)。这是由于卫星摇瓶培养极高的清除效率和低于5.0％CO₂的ATR培养箱设定点。SigmaCD水解产物补充的卫星摇瓶培养和酵母提取物补充的卫星摇瓶培养pH从高pH开始(约7.1)，并在H53下降至约6.4–6.6，这是直接响应于乳酸盐浓度的。BDCD水解产物补充的卫星摇瓶培养物最初显示出pH随着代谢恢复(pickup)而下降，但培养物在H36开始衰退，pH也随着乳酸盐浓度下降而增长。

pO₂趋势证实了用Sigma-AldrichCD水解产物补充的卫星摇瓶培养和用10％酵母提取物补充的卫星摇瓶培养的培养性能，其显示pO₂浓度随着活细胞浓度增加而持续下降。与H36后衰退的代谢和细胞生长相一致的是，BDCD水解产物补充的卫星摇瓶培养在这个点后显示出氧浓度的增长。对照的卫星摇瓶培养显示出相对平坦的趋势，当活细胞密度在收获24天内从2.5x10⁶增长到5.0x10⁶，pH和pO₂在卫星摇瓶培养持续期间仅有轻微降低。

Sigma-AldrichCD水解产物补充剂导致了本项研究过程期间最高的细胞生长和滴度性能的增长。得到结论，1X浓度的BDCD水解产物补充剂对培养没有益处，这是因为其走出低谷期之后并未完全恢复，并在约H36时观察到严重且不可逆的培养物衰退。

总体而言，可以得到结论，向925培养基添加CD水解产物补充剂提高了重组人α-半乳糖苷酶收获期中期的生产率。测试的不同的培养基中，来自Sigma-Aldrich的CD水解产物补充剂在H28和H52得到了最高的细胞生长和滴度的增长。在测试的浓度处，来自BD的CD水解产物补充剂并没有帮助从低谷完全恢复。在测试的浓度处，CD水解产物的确表现出提高收获期中期生产率，但这个效果在收获期晚期减小。

这些数据证明本文所述方法能用于测试用于产生液体培养基的不同培养基、不同补充剂和不同原料成分对于制造重组蛋白的方法的效果。

其他实施方式

应当理解的是，当已对本发明进行描述并辅以其详细说明时，上文的描述仅是意在阐述，而非限制本发明的范围。本发明的范围在说明书所附的权利要求书中进行限定。其他的方面、优点和改良均在所附的权利要求书范围之内。

Claims (115)

1.一种培养哺乳动物细胞的方法，所述方法包括：

提供摇瓶，其含有置于第一液体培养基中的哺乳动物细胞，其中所述第一液体培养基占据约20％至约30％的摇瓶容积并含有浓度为约1.0g/L至约15.0g/L的多个微载体；

在约32℃至约39℃并伴随约85转每分钟(RPM)至约125RPM的旋转搅拌将所述摇瓶温育一段时间；和

在所述一段时间的最初48-96小时后，连续地或周期性地去除第一体积的第一液体培养基并向所述第一液体培养基添加第二体积的第二液体培养基，其中所述第一和第二体积大致相等。

2.权利要求1的方法，其中所述第一体积的第一液体培养基是基本不含微载体的。

3.权利要求1的方法，其中所述第一液体培养基占据约25％至约30％的摇瓶容积。

4.权利要求1的方法，其中在所述一段时间的开始时，所述第一液体培养基含有0.1x10⁶细胞/mL-0.5x10⁶细胞/mL。

5.权利要求1的方法，其中所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。

6.权利要求5的方法，其中所述CHO细胞含有编码重组蛋白的核酸。

7.权利要求5的方法，其中所述重组蛋白是免疫球蛋白、酶、生长因子、蛋白片段或工程化蛋白。

8.权利要求1的方法，其中所述去除第一体积的第一液体培养基和添加第二体积的第二液体培养基是同时进行的。

9.权利要求1的方法，其中所述去除第一体积的第一液体培养基和添加第二体积的第二液体培养基是连续进行的。

10.权利要求1的方法，其中所述去除第一体积的第一液体培养基和添加第二体积的第二液体培养基是周期性地进行的。

11.权利要求1的方法，其中去除的第一液体培养基的第一体积和添加的第二液体培养基的第二体积是随时间增加的。

12.权利要求1的方法，其中所述第一液体培养基与第二液体培养基相同。

13.权利要求1的方法，其中所述第一液体培养基与第二液体培养基不同。

14.权利要求1的方法，其中所述摇瓶是透气性的且容积为约20mL至约1L。

15.权利要求1的方法，其中所述哺乳动物细胞悬浮于约40mL至约80mL的第一液体培养基中。

16.权利要求1的方法，其中所述第一液体培养基和/或第二液体培养基选自下组：化学成分确定的液体培养基、无血清液体培养基、含血清液体培养基、无动物来源组分的液体培养基和无蛋白质的培养基。

17.权利要求1的方法，其中在所述一段时间的最初48-96小时后，在每个24小时的时段中，去除的第一液体培养基的第一体积和添加的第二液体培养基的第二体积为第一液体培养基的体积的约30％至约95％。

18.权利要求1的方法，其中在去除第一体积的第一液体培养基之前中止搅拌至少30秒的一段时间。

19.权利要求1的方法，其中所述多个微载体的平均直径为约150μm至约800μm。

20.权利要求19的方法，其中所述多个微载体含有一个或多个孔。

21.权利要求20的方法，其中所述一个或多个孔的平均直径为约25μm至约35μm。

22.权利要求1的方法，其中所述摇瓶以相对于台面或水平约45度的角度进行温育。

23.一种培养哺乳动物细胞的方法，所述方法包括：

(a)提供摇瓶，其含有置于第一液体培养基中的哺乳动物细胞，其中所述第一液体培养基占据约20％至约30％的摇瓶容积并含有浓度为约1.0g/L至约15.0g/L的多个微载体；

(b)在约35℃至约39℃并伴随约85转每分钟(RPM)至约125RPM的旋转搅拌将所述摇瓶温育一段时间，并在所述一段时间的最初48-96小时后，在随后的每个24小时的时段中，

(i)连续地或周期性地从摇瓶去除第一体积的基本不含微载体的第一液体培养基，其中所述第一体积是第一液体培养基体积的约10％至约95％；和

(ii)向摇瓶添加第二体积的第二液体培养基，其中所述第一和第二体积大致相等；

(c)在细胞浓度达到约目标细胞密度后，于约32℃至约39℃处伴随旋转搅拌将摇瓶温育约2天至约7天的第二时间段，并在每个24小时的时段中进行步骤(b)(i)和(b)(ii)，其中步骤(b)中所使用的第一和第二液体培养基与步骤(c)中使用的那些是基本不同类型的；和

(d)于约35℃至约39℃处伴随旋转搅拌将摇瓶温育大于2天的第三时间段，并在每个24小时的时段中进行步骤(b)(i)和(b)(ii)，其中步骤(c)中所使用的第一和第二液体培养基与步骤(d)中使用的那些是相同类型的。

24.权利要求23的方法，其中所述第一液体培养基占据约25％至约30％的摇瓶容积。

25.权利要求23的方法，其中在所述第一段时间的开始时，所述第一液体培养基含有0.1x10⁶细胞/mL-0.5x10⁶细胞/mL。

26.权利要求23的方法，其中所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。

27.权利要求26的方法，其中所述CHO细胞含有编码重组蛋白的核酸。

28.权利要求27的方法，其中所述重组蛋白是分泌的免疫球蛋白、分泌的酶、分泌的生长因子、分泌的蛋白片段或分泌的工程化蛋白。

29.权利要求23的方法，其中在所述第一时间段、第二时间段、和第三时间段的一个或多个中去除第一体积的第一液体培养基和添加第二体积的第二液体培养基是同时进行的。

30.权利要求23的方法，其中在所述第一时间段、第二时间段和第三时间段的一个或多个中去除第一体积的第一液体培养基和添加第二体积的第二液体培养基是连续进行的。

31.权利要求23的方法，其中在所述第一时间段、第二时间段和第三时间段的一个或多个中去除第一体积的第一液体培养基和添加第二体积的第二液体培养基是周期性地进行的。

32.权利要求23的方法，其中所述摇瓶是透气性的且容积为约20mL至约1L。

33.权利要求23的方法，其中所述第一液体培养基的体积是约40mL至约80mL。

34.权利要求23的方法，其中所述第一时间段中使用的第一液体培养基和第二液体培养基是含血清液体培养基或含动物来源组分的液体培养基，而所述第二时间段和第三时间段中使用的第一液体培养基和第二液体培养基是无血清液体培养基、无动物来源组分的液体培养基或无蛋白质的培养基。

35.权利要求23的方法，其中在所述第一时间段、第二时间段和第三时间段的一个或多个期间，在从摇瓶去除第一体积的第一液体培养基之前中止搅拌至少30秒。

36.权利要求23的方法，其中所述多个微载体的平均直径为约200μm至约800μm。

37.权利要求23的方法，其中所述多个微载体含有一个或多个孔。

38.权利要求23的方法，其中所述一个或多个孔的平均直径为约25μm至约35μm。

39.权利要求23的方法，其中在所述第三时间段去除的第一体积的第一液体培养基含有显著数量(substantialnumber)的微载体。

40.权利要求23的方法，其中在所述第三时间段去除的第一体积的第一液体培养基是基本不含微载体的。

41.权利要求23的方法，其中在所述第一时间段、第二时间段和第三时间段的一个或多个中去除的第一液体培养基的第一体积和添加的第二液体培养基的第二体积是第一液体培养基体积的约70％。

42.权利要求23的方法，其中所述摇瓶在(b)、(c)和(d)中以相对于台面或水平约45度的角度温育。

43.一种生产重组蛋白的方法，所述方法包括：

提供摇瓶，其含有置于第一液体培养基中的哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞含有编码重组蛋白的核酸，其中所述第一液体培养基占据约20％至约30％的摇瓶容积并含有浓度为约1.0g/L至约15.0g/L的多个微载体；

在约32℃至约39℃并伴随约85转每分钟(RPM)至约125RPM的旋转搅拌将所述摇瓶温育一段时间；和

在所述一段时间的最初48-96小时后，连续地或周期性地去除第一体积的第一液体培养基并向所述第一液体培养基添加第二体积的第二液体培养基，其中所述第一和第二体积大致相等；和

从所述哺乳动物细胞或从所述第一和/或第二液体培养基回收重组蛋白。

44.权利要求43的方法，其中所述重组蛋白是从哺乳动物细胞回收的。

45.权利要求44的方法，其中所述重组蛋白是从哺乳动物细胞回收的。

46.权利要求43的方法，其中所述重组蛋白是从第一和/或第二液体培养基回收的。

47.权利要求43的方法，其中去除的第一体积的第一液体培养基是基本不含微载体的。

48.权利要求43的方法，其中所述第一液体培养基占据约25％至约30％的摇瓶容积。

49.权利要求43的方法，其中在所述一段时间的开始时，所述第一液体培养基含有0.1x10⁶细胞/mL-0.5x10⁶细胞/mL。

50.权利要求43的方法，其中所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。

51.权利要求50的方法，其中所述重组蛋白是免疫球蛋白、酶、生长因子、蛋白片段或工程化蛋白。

52.权利要求51的方法，其中所述重组蛋白分泌至第一和/或第二液体培养基中。

53.权利要求43的方法，其中去除第一体积的第一液体培养基和添加第二体积的第二液体培养基是同时进行的。

54.权利要求43的方法，其中去除第一体积的第一液体培养基和添加第二体积的第二液体培养基是连续进行的。

55.权利要求43的方法，其中去除第一体积的第一液体培养基和添加第二体积的第二液体培养基是周期性地进行的。

56.权利要求43的方法，其中去除的第一液体培养基的第一体积和添加的第二液体培养基的第二体积是随时间增加的。

57.权利要求43的方法，其中所述第一液体培养基与第二液体培养基相同。

58.权利要求43的方法，其中所述第一液体培养基与第二液体培养基不同。

59.权利要求43的方法，其中所述摇瓶是透气性的且容积为约20mL至约1L。

60.权利要求43的方法，其中所述哺乳动物细胞悬浮于约40mL至约80mL的第一液体培养基中。

61.权利要求43的方法，其中所述第一液体培养基和/或第二液体培养基选自下组：化学成分确定的液体培养基、无血清液体培养基、含血清液体培养基、无动物来源组分的液体培养基和无蛋白质的培养基。

62.权利要求43的方法，其中在所述一段时间的最初48-96小时后，在每个24小时的时段中，去除的第一液体培养基的第一体积和添加的第二液体培养基的第二体积为第一液体培养基的体积的约30％至约95％。

63.权利要求43的方法，其中在去除第一体积的第一液体培养基之前中止搅拌至少30秒的一段时间。

64.权利要求43的方法，其中所述多个微载体的平均直径为约200μm至约800μm。

65.权利要求64的方法，其中所述多个微载体含有一个或多个孔。

66.权利要求65的方法，其中所述一个或多个孔的平均直径为约25μm至约35μm。

67.权利要求43的方法，其中所述摇瓶以相对于台面或水平约45度的角度进行温育。

68.一种生产重组蛋白的方法，所述方法包括：

(a)提供摇瓶，其含有置于第一液体培养基中的哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞含有编码重组蛋白的核酸，其中所述第一液体培养基占据约20％至约30％的摇瓶容积并含有浓度为约1.0g/L至约15.0g/L的多个微载体；

(b)在约35℃至约39℃并伴随约85转每分钟(RPM)至约125RPM的旋转搅拌将所述摇瓶温育一段时间，并在所述一段时间的最初48-96小时后，在随后的每个24小时的时段中，

(i)连续地或周期性地从摇瓶去除第一体积的基本不含微载体的第一液体培养基，其中所述第一体积是第一液体培养基体积的约10％至约95％；和

(ii)向摇瓶添加第二体积的第二液体培养基，其中所述第一和第二体积大致相等；

(c)在细胞浓度达到约目标细胞密度后，于约32℃至约39℃处伴随旋转搅拌将摇瓶温育约2天至约7天的第二时间段，并在每个24小时的时段中进行步骤(b)(i)和(b)(ii)，其中步骤(b)中所使用的第一和第二液体培养基与步骤(c)中使用的那些是基本不同类型的；和

(d)于约35℃至约39℃处伴随旋转搅拌将摇瓶温育大于2天的第三时间段，并在每个24小时的时段中进行步骤(b)(i)和(b)(ii)，其中步骤(c)中所使用的第一和第二液体培养基与步骤(d)中使用的那些是相同类型的；和

(e)从所述哺乳动物细胞或从所述第一、第二和/或第三时间段期间使用的第一和/或第二液体培养基回收重组蛋白。

69.权利要求68的方法，其中所述重组蛋白是从哺乳动物细胞回收的。

70.权利要求68的方法，所述重组蛋白是从所述第一、第二和第三时间段的一个或多个期间使用的第一和/或第二液体培养基回收的。

71.权利要求68的方法，其中所述第一液体培养基占据约25％至约30％的摇瓶容积。

72.权利要求68的方法，其中在所述第一时间段开始时，所述第一液体培养基含有0.1x10⁶细胞/mL-0.5x10⁶细胞/mL。

73.权利要求68的方法，其中所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。

74.权利要求68的方法，其中所述重组蛋白是免疫球蛋白、酶、生长因子、蛋白片段或工程化蛋白。

75.权利要求74的方法，其中所述重组蛋白分泌至所述第一时间段、第二时间段和第三时间段一个或多个期间使用的第一和/或第二液体培养基中。

76.权利要求68的方法，其中在所述第一时间段、第二时间段和第三时间段的一个或多个中，去除第一体积的第一液体培养基和添加第二体积的第二液体培养基是同时进行的。

77.权利要求68的方法，其中在所述第一时间段、第二时间段和第三时间段的一个或多个中，去除第一体积的第一液体培养基和添加第二体积的第二液体培养基是连续进行的。

78.权利要求68的方法，其中在所述第一时间段、第二时间段和第三时间段的一个或多个中，去除第一体积的第一液体培养基和添加第二体积的第二液体培养基是周期性地进行的。

79.权利要求68的方法，其中所述摇瓶是透气性的且容积为约20mL至约1L。

80.权利要求68的方法，其中所述第一液体培养基的体积是约40mL至约80mL。

81.权利要求68的方法，其中所述第一时间段中使用的第一液体培养基和第二液体培养基是含血清液体培养基或含动物来源组分的液体培养基，而所述第二时间段和第三时间段中使用的第一液体培养基和第二液体培养基是无血清液体培养基、无动物来源组分的液体培养基或无蛋白质的培养基。

82.权利要求68的方法，其中在所述第一时间段、第二时间段和第三时间段的一个或多个期间，在从摇瓶去除第一体积的第一液体培养基之前中止搅拌至少30秒。

83.权利要求68的方法，其中所述多个微载体的平均直径为约200μm至约800μm。

84.权利要求83的方法，其中所述多个微载体含有一个或多个孔。

85.权利要求84的方法，其中所述一个或多个孔的平均直径为约25μm至约35μm。

86.权利要求68的方法，其中在所述第三时间段去除的第一体积的液体培养基含有显著数量的微载体。

87.权利要求68的方法，其中在所述第三时间段去除的第一体积的液体培养基是基本不含微载体的。

88.权利要求68的方法，其中在所述第一时间段、第二时间段和第三时间段的一个或多个中去除的第一液体培养基的第一体积和添加的第二液体培养基的第二体积是第一液体培养基体积的约70％。

89.权利要求68的方法，其中所述摇瓶在(b)、(c)和(d)中以相对于台面或水平约45度的角度温育。

90.一种测试用于制备重组蛋白的制造过程的方法，所述方法包括：

提供含有置于第一液体培养基中的哺乳动物细胞的摇瓶，所述哺乳动物细胞含有编码重组蛋白的核酸，其中所述第一液体培养基占据约20％至约30％的摇瓶容积并含有浓度为约1.0g/L至约15.0g/L的多个微载体；

在约32℃至约39℃并伴随约85转每分钟(RPM)至约125RPM的旋转搅拌将所述摇瓶温育一段时间；

在所述一段时间的最初48-96小时后，连续地或周期性地去除第一体积的第一液体培养基并向所述第一液体培养基添加第二体积的第二液体培养基，其中所述第一和第二体积大致相等；

检测细胞中的或第一和/或第二培养基中的重组蛋白；和

将细胞中的或第一和/或第二培养基中存在的重组蛋白的量与重组蛋白的参考水平进行比较。

91.权利要求90的方法，其中所述第一体积的第一液体培养基是基本不含哺乳动物细胞的。

92.权利要求90的方法，其中所述重组蛋白的参考水平是用不同的培养方法生产的重组蛋白的水平。

93.权利要求92的方法，其中所述不同的培养方法利用不同的第一或第二液体培养基、不同的哺乳动物细胞、不同的温度、不同的搅拌水平、不同的摇瓶或不同的微载体。

94.权利要求92的方法，其中所述不同的培养方法利用不同的原料成分、抗结块剂或化学成分确定的液体培养基。

95.权利要求90的方法，其中所述方法用于进行高通量细胞培养实验来执行实验设计(design-of-experiment；DOE)或质量源于设计(quality-by-design；QBD)研究。

96.权利要求90的方法，其中所述第一液体培养基占据约25％至约30％的摇瓶容积。

97.权利要求90的方法，其中所述摇瓶是透气性的且容积为约20mL至约1L。

98.权利要求90的方法，其中所述哺乳动物细胞悬浮于约40mL至约80mL的第一液体培养基中。

99.权利要求90的方法，其中所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。

100.权利要求90的方法，其中所述重组蛋白是分泌的免疫球蛋白、分泌的酶、分泌的生长因子、分泌的蛋白片段或分泌的工程化蛋白，并且其中所述重组蛋白是从第一或第二培养基回收的。

101.权利要求90的方法，其中所述重组蛋白是从哺乳动物细胞回收的。

102.权利要求101的方法，其中所述重组蛋白是免疫球蛋白、酶、生长因子、蛋白片段或工程化蛋白。

103.权利要求90的方法，其中去除第一体积的第一液体培养基和添加第二体积的第二液体培养基是同时进行的。

104.权利要求90的方法，其中去除第一体积的第一液体培养基和添加第二体积的第二液体培养基是连续进行的。

105.权利要求90的方法，其中去除第一体积的第一液体培养基和添加第二体积的第二液体培养基是周期性地进行的。

106.权利要求90的方法，其中去除的第一液体培养基的第一体积和添加的第二液体培养基的第二体积是随时间增加的。

107.权利要求90的方法，其中所述第一液体培养基和/或第二液体培养基选自下组：化学成分确定的液体培养基、无血清液体培养基、含血清液体培养基、无动物来源组分的液体培养基和无蛋白质的培养基。

108.权利要求90的方法，其中所述摇瓶以相对于台面或水平约45度的角度进行温育。

109.一种测试用于在生产重组蛋白的方法中使用的第一或第二液体培养基、存在于第一或第二液体培养基中的原料成分或补充物或哺乳动物细胞来源的效力的方法，所述方法包括：

提供摇瓶，其含有置于第一液体培养基中的哺乳动物细胞，其中所述第一液体培养基占据约20％至约30％的摇瓶容积并含有浓度为约1.0g/L至约15.0g/L的多个微载体；

在约32℃至约39℃并伴随约85转每分钟(RPM)至约125RPM的旋转搅拌将所述摇瓶温育一段时间；和

在所述一段时间的最初48-96小时后，连续地或周期性地去除第一体积的第一液体培养基并向所述第一液体培养基添加第二体积的第二液体培养基，其中所述第一和第二体积大致相等；

检测细胞中的或第一和/或第二培养基中的重组蛋白；

将细胞中的或第一和/或第二培养基中存在的重组蛋白的量与通过不同的方法生产的重组蛋白的参考水平进行比较，所述不同的方法使用了一种或多种不同的第一或第二液体培养基、存在于第一或第二液体培养基中的不同的原料成分或补充物或不同的哺乳动物细胞来源；和

鉴定与重组蛋白量的增加有关的所述第一或第二液体培养基、存在于第一或第二液体培养基中的不同的原料成分或补充物或哺乳动物细胞来源，将其鉴定为用于在生产重组蛋白的方法中使用是有效的，其中所述重组蛋白量的增加是与参考水平相比。

110.一种对生产重组蛋白的制造工艺进行优化的方法，所述方法包括：

提供摇瓶，其含有置于第一液体培养基中的哺乳动物细胞，其中所述第一液体培养基占据约20％至约30％的摇瓶容积并含有浓度为约1.0g/L至约15.0g/L的多个微载体；

在约32℃至约39℃并伴随约85转每分钟(RPM)至约125RPM的旋转搅拌将所述摇瓶温育一段时间；和

在所述一段时间的最初48-96小时后，连续地或周期性地去除第一体积的第一液体培养基并向所述第一液体培养基添加第二体积的第二液体培养基，其中所述第一和第二体积大致相等；

检测细胞中的或第一和/或第二培养基中的重组蛋白；

将细胞中的或第一和/或第二培养基中存在的重组蛋白的量与通过不同的方法生产的重组蛋白的参考水平进行比较；和

鉴定并去除或修改制造工艺中任何与产生的重组蛋白量的减少有关的培养组分或参数，所述重组蛋白量的减少是与参考水平相比；或是鉴定并增加制造工艺中任何与产生的重组蛋白量的增加有关的培养组分或参数，所述重组蛋白量的增加是与参考水平相比。

111.权利要求110的方法，其中所述摇瓶以相对于台面或水平约45度的角度进行温育。

112.一种测试第一或第二液体培养基中、用于产生第一或第二液体培养基的原料成分中或哺乳动物细胞来源中污染物的存在的方法，所述方法包括：

提供摇瓶，其含有置于第一液体培养基中的哺乳动物细胞，其中所述第一液体培养基占据约20％至约30％的摇瓶容积并含有浓度为约1.0g/L至约15.0g/L的多个微载体；

在约32℃至约39℃并伴随约85转每分钟(RPM)至约125RPM的旋转搅拌将所述摇瓶温育一段时间；和

在所述一段时间的最初48-96小时后，连续地或周期性地去除第一体积的第一液体培养基并向所述第一液体培养基添加第二体积的第二液体培养基，其中所述第一和第二体积大致相等；

检测细胞中的或第一和/或第二培养基中的重组蛋白；

将细胞中的或第一和/或第二培养基中存在的重组蛋白的量与通过不同的方法生产的重组蛋白的参考水平进行比较，所述不同的方法使用不同的第一或第二液体培养基、用于产生第一或第二液体培养基的不同的原料成分或不同的哺乳动物细胞来源；和

当产生的重组蛋白水平低于参考水平时，将第一或第二液体培养基、用于产生第一或第二液体培养基的原料成分或哺乳动物细胞来源鉴定为含有污染物。

113.权利要求112的方法，其中所述污染物是生物污染物。

114.权利要求113的方法，其中所述生物污染物选自下组：分枝杆菌、真菌、细菌、病毒和不想要的哺乳动物细胞。

115.权利要求112的方法，其中所述摇瓶以相对于台面或水平约45度的角度进行温育。