CN105209634A - 酶停滞方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及移动解旋酶穿过多核苷酸上的间隔区以及控制解旋酶在多核苷酸上装载的新方法。本发明还涉及使用解旋酶表征目标多核苷酸的新方法。

Description

酶停滞方法
技术领域
本发明涉及移动解旋酶穿过多核苷酸上的间隔区以及控制解旋酶在多核苷酸上的装载的新方法。本发明还涉及使用解旋酶表征目标多核苷酸的新方法。
背景技术
目前需要一种具有广泛的应用范围的快速且廉价的多核苷酸(如DNA或RNA)测序和鉴定技术。现有的技术是缓慢的且昂贵的，这主要由于它们依赖于扩增技术以产生大量的多核苷酸，且需要大量特定的用于信号检测的荧光化学物质。
跨膜孔(纳米孔)作为用于聚合物和各种小分子的直接的、电生物传感器，具有很大的潜力。特别是，目前作为一种有潜力的DNA测序技术的纳米孔得到了许多关注。
当跨纳米孔施加电势时，在特定的时间段内，当分析物如核苷酸片刻停留在桶(barrel)中时，会产生电流的变化。所述核苷酸的纳米孔检测能产生已知特征和持续时间的电流变化。在“链测序”方法中，单个多核苷酸链穿过所述孔并能实现对核苷酸的鉴定。链测序可包括使用核苷酸处理蛋白例如解旋酶，以控制所述多核苷酸穿过所述孔的移动。
发明内容
多核苷酸的间隔区通常能够使解旋酶停滞，即防止解旋酶穿过间隔区沿所述多核苷酸进一步移动。本发明人已令人惊讶地证明，通过将所述解旋酶和多核苷酸与跨膜孔接触并施加电势，可以移动一个或多个停滞的解旋酶穿过多核苷酸上的间隔区。由于所述解旋酶通常太大而不适合穿过所述孔，所述多核苷酸沿电势移动穿过所述孔产生的力将所述解旋酶移动穿过所述间隔区。这是对控制多核苷酸的移动和表征例如测序多核苷酸的重要应用。本发明人还令人惊奇地证明，也可以使用一个或多个间隔区控制一个或多个解旋酶在多核苷酸上的装载。
因此本发明提供了移动一个或多个停滞的解旋酶穿过目标多核酸上的一个或多个间隔区的方法，该方法包括(a)将所述一个或多个停滞的解旋酶和所述目标多核苷酸与跨膜孔接触；以及(b)跨所述孔施加电势，从而移动所述一个或多个解旋酶穿过在所述目标多核苷酸上的所述一个或多个间隔区。
本发明还提供了：
-控制目标多核酸穿过跨膜孔的移动的方法，该包括：(a)提供具有一个或多个间隔区的所述目标多核苷酸；(b)将所述目标多核苷酸与一个或多个解旋酶接触，使得所述一个或多个解旋酶在所述一个或多个间隔区处停滞；(c)将所述目标多核苷酸和所述一个或多个停滞的解旋酶与所述孔接触；以及(d)跨所述孔施加电势，使得所述一个或多个解旋酶移动穿过所述一个或多个间隔区，并控制所述目标多核苷酸穿过该孔的移动；
-表征目标多核苷酸的方法，该方法包括(a)实施本发明的控制目标多核苷酸穿过跨膜孔的移动的方法；以及(b)随着所述多核苷酸相对于所述孔移动，获取一个或多个测量值，其中所述测量值代表所述多核苷酸的一个或多个特征，从而表征所述目标多核苷酸；
-控制一个或多个解旋酶在目标多核苷酸上加载的方法，该方法包括(a)提供具有一个或多个间隔区的所述多核苷酸；以及(b)将在(a)中提供的所述多核苷酸与所述一个或多个解旋酶接触，使得所述一个或多个解旋酶结合到所述多核苷酸并在每个间隔区处停滞；
-控制目标多核苷酸的移动的适配器，其中所述适配器包括(a)在5'至3'方向上的(L-S-D)n或(D-S-L)n，其中L是单链多核苷酸或非杂交的多核苷酸，S是间隔区，D是双链多核苷酸，其中n是整数，以及(b)停滞在每个适配器上的一个或多个解旋酶；以及
-控制目标多核苷酸的移动的试剂盒，其中所述试剂盒包括(a)一个或多个间隔区，(b)一个或多个解旋酶，以及(c)跨膜孔。
附图说明
图1显示了在实施例1中使用的λDNA构建体的示意图。SEQIDNO：9(标记为A)在其3'末端处连接至4个iSpC3间隔区(标记为B)。该4个iSpC3间隔区连接到SEQIDNO：10(标记为C)的5'末端。SEQIDNO：10连接到4个iSpC3间隔区(标记为D)，该4个iSpC3间隔区连接到SEQIDNO：11(标记为E)的5'末端。SEQIDNO：10与SEQIDNO：12(标记为F，其具有3'胆固醇连接(cholesteroltether))杂交。
图2显示了当解旋酶(T4Dda-E94C/A360C(SEQIDNO：8，具有突变E94C/A360C，然后(ΔM1)G1G2))控制λDNA构建体(0.2nM如图1中所描述和解释的)穿过纳米孔(MS(B1-G75S/G77S/L88N/Q126R)8MspA(MspA-B2C)(具有突变G75S/G77S/L88N/Q126R)的SEQIDNO：2))易位时的示例电流轨迹(y-轴坐标＝电流(pA，20到120)，x-轴坐标＝时间(秒，3500至8000)。
图3显示了图2中显示的解旋酶控制的DNA移动的电流轨迹的放大区域(y-轴坐标＝电流(pA，上轨迹20至80，下轨迹20至60)，x-轴坐标＝时间(s，上轨迹2995至3020，下轨迹8140至8170)，对于上轨迹和下轨迹)。A)显示了由解旋酶控制的DNA移动的起点；B)显示了由解旋酶控制的DNA移动的终点。标记为1的箭头对应当第一组4个iSpC3间隔区(用于在被纳米孔捕捉前停滞酶的移动)移动穿过纳米孔时。标记为2的箭头对应当第二组4个iSpC3间隔区移动穿过纳米孔时。
图4(a)显示了实施例2中使用的发卡MuA底物和Y-型MuA底物的设计。SEQIDNO：19中的dUMP被突出显示为三角形且所述iSpC3间隔区显示为x。图4(b)显示了实施例2中详述的样品制备过程中制备的λDNA构建体。λDNA构建体的5-10kB片段标记为X，由聚合酶插入并由连接酶结合到该构建体的其余部分的DNA片段标记为y(且以点线示出)，且所述iSpC3间隔区显示为x。连接体序列(tethersequence)(SEQIDNO：16)与所示DNA构建体杂交。在SEQIDNO:16的3'末端连接6个iSp18间隔区，该6个iSp18间隔区连接2个胸腺嘧啶残基和3'胆固醇TEG(显示为灰色圆圈)。
图5显示了当解旋酶(TrwcCba(SEQIDNO：9)控制λDNA构建体(如图4b中所示)穿过纳米孔(MS(B1-G75S/G77S/L88N/Q126R)8MspA(具有突变G75S/G77S/L88N/Q126R的SEQIDNO：2))的易位时的示例电流轨迹(y-轴坐标＝电流(pA)，x-轴坐标＝时间(s)，对于上轨迹和下轨迹)。上轨迹显示了由解旋酶控制的整个λDNA构建体穿过纳米孔的DNA移动，标记为X1的第一个iSpC3间隔区产生标记为1的电流的尖峰，标记为X2的第二个iSpC3间隔区产生标记为2的电流的尖峰。下轨迹显示了由解旋酶控制的DNA移动穿过纳米孔的终点的放大的区域，标记为X3的第三个iSpcC3产生标记为3的电流的尖峰。
图6(a)显示了在实施例3中使用的发卡MuA底物和Y-型MuA底物的设计。5'磷酸标记为圆形，SEQIDNO：18中的肌苷突出显示为矩形，iSpC3间隔区显示为x。图6(b)显示了实施例3中所述的样品制备过程中制备的λDNA构建体。λDNA构建体的5-10kB片段标记为X，已被连接到x的肌苷标记为矩形，iSpC3间隔区显示为x。连接体序列(SEQIDNO：16)与所示DNA构建体杂交。SEQIDNO:16的3'末端连接6个iSp18间隔区，该6个iSp18间隔区连接到2个胸腺嘧啶残基和3'胆固醇TEG(显示为灰色圆圈)。
图7显示了当解旋酶(TrwcCba(SEQIDNO：17)控制λDNA构建体(如图6b所示)穿过纳米孔(MS(B1-G75S/G77S/L88N/Q126R)8的MspA(SEQIDNO：2具有突变G75S/G77S/L88N/Q126R))易位时的示例电流轨迹(y-轴坐标＝电流(pA)，x-轴坐标＝时间(s)，对于上轨迹和下轨迹)。上轨迹显示了由解旋酶控制的整个λDNA构建体穿过纳米孔的DNA移动，标记为X1的第一个iSpC3间隔区产生标记为1的电流的尖峰，标记为X2的第二个iSpC3间隔区产生标记为2电流中的尖峰，标记为X3的第三个iSpC3间隔区产生标记为3的电流的尖峰。下轨迹显示了由解旋酶控制的DNA移动穿过纳米孔的后半部分放大的区域，标记为X2的第二个iSpC3间隔区产生标记为2的电流的尖峰，标记为X3的第三个iSpC3间隔区产生标记为3的电流的尖峰。
图8为用于测试酶活性的荧光测定法。设定的荧光底物用于测定解旋酶(标记为a)取代杂交dsDNA的能力。1)所述荧光底物链(48.751nM最终，SEQIDNO：25和SEQIDNO：26)具有3'ssDNA突出部分(20个碱基)，和40个碱基的杂交的dsDNA部分。上链(b)在SEQIDNO：25的5'末端具有羧基荧光基(c)，以及杂交互补链(d)在SEQIDNO：26的3'末端具有黑洞猝灭剂(BHQ-1)基。当杂交时，源自荧光素的荧光被局部BHQ-1猝灭，底物基本上无荧光。与荧光底物的下链部分地互补的0.975μM的捕获链(f，SEQIDNO：27)包含在测定中。2)在ATP(0.975mM)和MgCl2(10mM)存在下，解旋酶Hel308Mbu(12nM，SEQIDNO：28)结合到荧光底物的3'突出部分，沿着所述上链移动，取代所示的互补链(d)。3)一旦具有BHQ-1的互补链被完全取代，则主链上的荧光素发荧光(显示为星形)。4)所置换的下链(d)优先与过量的捕获链(f)退火，以防止初始底物的再退火和荧光的丢失。
图9为用于测试酶活性的荧光测定。两种可行的荧光底物用于测定解旋酶(标记为a)取代杂交的dsDNA的能力，两种可行的荧光底物显示在图9(a)中(标记为1C-3C)具有4个Sp9间隔区(显示为黑色三角形)，该4个Sp9间隔区将SEQIDNO:27DE3'末端连接到SEQIDNO:29的3'末端；以及(b)(标记为1B-3B)具有一个Sp9间隔区(显示为黑色三角形)，该1个Sp9间隔区将SEQIDNO：27的3'末端连接到SEQIDNO：29的3'末端。荧光底物链(之前所描述的a)或者b)最终48.75nM)具有3'ssDNA突出部分(20个碱基)，以及40个碱基的杂交dsDNA部分。上链(b)在SEQIDNO:27的5'末端处具有羧基荧光基(c)，杂交互补链(d)在SEQIDNO：26的3'末端处具有黑洞猝灭剂(BHQ-1)基(e)。当杂交时，源自荧光素的荧光被局部BHQ-1猝灭，且底物基本上无荧光。与荧光底物的下链部分互补的1μM的捕获链(f，SEQIDNO：27)包含在测定中。2a和b)在ATP(0.975mM)和MgCl2的(10mM)的存在下，解旋酶Hel308MbU(SEQIDNO：28)结合到所述荧光底物的3'突出部分，沿上链移动直到所述Sp9基团。所述Sp9基团(B中1个和C中4个)停止所述解旋酶移动穿过它且解旋酶不能置换互补链(SEQIDNO：26)。因此，荧光素和黑洞猝灭剂保持彼此靠近且观察不到荧光。
图10为在400mM的氯化钾下的Hel308Mbu解旋酶(标记为A，SEQIDNO：28)在缓冲液中(100mMHEPESpH8，0.975mMATP，10mMMgCl2，1mg/mLBSA，48.75nM荧光底物DNA(A＝SEQIDNO：25和SEQIDNO：26，B＝SEQIDNO：27，其通过一个Sp9间隔区在其3'末端连接到SEQIDNO：29的5'末端，并与SEQIDNO：26杂交，C＝SEQIDNO：27，其通过4个Sp9间隔区在其3'末端处连接到SEQIDNO：29的5'末端并与SEQIDNO：26杂交)，0.975μM捕获DNA(SEQIDNO：27))的相对dsDNA转换率的图(y轴＝相对dsDNA转换率，x轴＝荧光底物)。
图11为在400mM的氯化钾下的Hel308Mbu解旋酶(标记为A，SEQIDNO：28)在缓冲液中(100mMHEPESpH8，0.975mMATP，10mMMgCl2，1mg/mLBSA，48.75nM荧光底物DNA(D＝SEQIDNO：32和SEQIDNO：26，E＝SEQIDNO：27，其通过一个idSp基团在其3'末端连接到SEQIDNO：30的5'末端，并与SEQIDNO：26杂交，F＝SEQIDNO：27，其通过4个idSp基团在其3'末端处连接到SEQIDNO：31的5'末端并与SEQIDNO：26杂交，G＝SEQIDNO：33，其与SEQIDNO：26杂交)，0.975μM捕获DNA(SEQIDNO：27)的相对dsDNA转换率的图(y轴＝相对dsDNA转换率，x轴＝荧光底物)。
图12显示了不含停滞解旋酶(标记为1)的iSpC3或iSp18间隔区的对比链的实验步骤。对比链(SEQIDNO：34)不包含间隔区或阻断基团且与DNA(SEQIDNO：35，具有连接到其5'末端的羧荧光基，显示为灰色圆圈)的较短的互补链杂交。这产生部分双链构建体，其具有50个核苷酸突出部分。构建体(SEQIDNO：34与SEQIDNO：35杂交)与T4Dda-E94C/A360预培育以使酶结合到突出部分。突出部分的长度超过一个酶可以结合的长度，如其所示。提供给酶必须的组分(ATP和MgCl2)以促进解旋酶移动。除了ATP和MgCl2，还加入额外的捕获链(SEQIDNO：37)。随后解旋酶沿着对比链易位，置换较短的互补链，使对比链没有解旋酶或互补的链结合(标记为A)。随后互补链形成发卡，使得其不能重新退火到对比链(标记为B)。解旋酶或游离在溶液中或沿着对照DNA移动并且在末端脱落，然后由过量的捕获链(SEQIDNO：37，标记为C的复合体)结合。任何未结合解旋酶的DNA保持完整(仍为种类F)。样品混合物然后在凝胶上进行跑胶，并通过在凝胶上产生的条带鉴别分离的种类。
图13显示了含有iSpC3或iSp18间隔区(图中以X表示)的链停滞解旋酶(标记为1)的实验步骤。实施如图12所示的相同的步骤，将酶与DNA构建体(较短的互补链具有连接到其5'端的羧荧光基)预培养。所述间隔区基团位于双链区域的前部并且解旋酶能够与所示的DNA结合。一旦加入ATP，MgCl2和捕获DNA(标记为2)，解旋酶被提供给必要组分以促进解旋酶移动。如果间隔区能够停滞解旋酶，那么该解旋酶将保持与DNA构建体的结合，该DNA构建体仍含有所述短的互补链(标记为D)。如果间隔区不能停滞解旋酶，那么该解旋酶将移动穿过间隔区且取代互补链(标记为B)，产生无解旋酶结合的种类A。然后游离的酶将结合到过量的捕获链(标记为C)，且置换的互补链将形成发卡(标记为B)。如果间隔区能够停滞一个解旋酶而不能停滞两个解旋酶，则第一个解旋酶将被后面的解旋酶推过间隔区，且将取代互补链。然而，第二个解旋酶将不能移动穿过间隔区，产生标记为E的复合物。任何不结合解旋酶的DNA保持完整且不结合解旋酶(种类F)。样品混合物然后在凝胶上进行跑胶，并通过在凝胶上产生的条带确定分离的种类。
图14显示了针对对比链(表11中的1)进行的凝胶测定。标记为M的泳道显示作为参考DNA标准物(条带相应的从最低质量(凝胶的底部)到最高质量(凝胶的顶部)200bp(碱基对)，300bp，400bp，500/517bp，600bp，700bp，800bp，900bp，1000bp，1200bp和1517bp)。泳道1仅包含退火的DNA(SEQIDNO：34与SEQIDNO：35杂交)。泳道2包含预先连接到对比链(未给燃料)的解旋酶(TdDda-E94C/A360C)。泳道3显示了在缓冲液1中添加了燃料(ATP和MgCl2)后的对比链。泳道4显示了在缓冲液2中添加了燃料(ATP和MgCl2)后的对比链。条带X对应仅SEQIDNO：34，条带Y对应于与SEQIDNO：35杂交的SEQIDNO：34。标记为1Y的区域对应于1个解旋酶结合与SEQIDNO：35杂交的SEQIDNO：34。标记为2Y的区域对应于2个解结合与SEQIDNO：35杂交的SEQIDNO：34。标记为3Y的区域对应于3个解旋酶结合与SEQIDNO：35杂交的SEQIDNO：34。标记为4Y的区域对应于4个解旋酶结合与SEQIDNO：35杂交的SEQIDNO：34。标记为5Y的区域对应于5个解旋酶结合与SEQIDNO：35杂交的SEQIDNO：34。
图15显示了在ssDNA和dsDNA之间结合处的含有3个(表11中的7，对应泳道＝1-4)，4个(表11中的8，对应泳道5-8)，5个(表11中的9，对应泳道＝9-12)iSp18间隔区的DNA构建体的凝胶测试。标记为M的泳道显示了作为参考(条带对应从最低质量(凝胶的底部)到最高质量(凝胶的顶部)200bp(碱基对)，300bp，400bp，500/517bp，600bp，700bp，800bp，900bp，1000bp，1200bp和1517bp)的DNA标准物。泳道1仅包含退火的DNA(SEQIDNO：9在其3'末端连接3个iSp18间隔区，该iSp18间隔区被连接到与SEQIDNO：35杂交的SEQIDNO：36的5'末端。泳道2含有预先结合DNA构建体且未给燃料(SEQIDNO：9在其3'末端处连接到3个iSp18间隔区，该iSp18间隔区连接与SEQIDNO：35杂交的SEQIDNO：36的5'末端)的解旋酶(T4Dda-E94C/A360C)。泳道3显示了添加到缓冲液1中的给了燃料(ATP和MgCl2)后的DNA构建体(SEQIDNO：9在其3'末端处连接3个iSp18间隔区，该3个iSp18间隔区在与SEQIDNO：35杂交的SEQIDNO：36的5'末端处连接)。泳道4显示了添加到缓冲液2中的给了燃料(ATP和MgCl2)后的DNA构建体(SEQIDNO：9在其3'末端处连接3个iSp18间隔区，该3个iSp18间隔区在与SEQIDNO：35杂交的SEQIDNO：36的5'末端处连接)。泳道5仅含退火的DNA(SEQIDNO：9在其3'末端连接4个iSp18间隔区，该4个iSp18间隔区连接与SEQIDNO：35杂交的SEQIDNO：36的5'末端)。泳道6含有解旋酶(T4Dda-E94C/A360C)预先结合，且未给燃料的DNA构建体(SEQIDNO：9在其3'末端处连接到4个iSp18间隔区，该4个iSp18间隔区连接与SEQIDNO：35杂交的SEQIDNO：36的5'末端)。泳道7显示了添加到缓冲液1中的给了燃料(ATP和MgCl2)后的DNA构建体(SEQIDNO：9在其3'末端处连接4个iSp18间隔区，该4个iSp18间隔区在连接与SEQIDNO：35杂交的SEQIDNO：36的5'末端)。泳道8显示了添加到缓冲液2中的给了燃料(ATP和MgCl2)后的DNA构建体(SEQIDNO：9在其3'末端处连接4个iSp18间隔区，该4个iSp18间隔区连接与SEQIDNO：35杂交的SEQIDNO：36的5'末端)。泳道9仅含退火的DNA(SEQIDNO：9在其3'末端连接5个iSp18间隔区，该5个iSp18间隔区连接与SEQIDNO：35杂交的SEQIDNO：36的5'末端)。泳道10含有解旋酶(T4Dda-E94C/A360C)预先结合且未给燃料的DNA构建体(SEQIDNO：9在其3'末端处连接到5个iSp18间隔区，该5个iSp18间隔区连接与SEQIDNO：35杂交的SEQIDNO：36的5'末端)。泳道11显示了添加到缓冲液1中的给了燃料(ATP和MgCl2)后的DNA构建体(SEQIDNO：9在其3'末端处连接5个iSp18间隔区，该5个iSp18间隔区在与SEQIDNO：35杂交的SEQIDNO：36的5'末端处连接)。泳道12显示了添加到缓冲液2中的给了燃料(ATP和MgCl2)后的DNA构建体(SEQIDNO：9在其3'末端处连接5个iSp18间隔区，该5个iSp18间隔区在与SEQIDNO：35杂交的SEQIDNO：36的5'末端处连接)。条带X对应仅ssDNA构建体(例如SEQIDNO：9在其3'末端连接3个，4个或5个连接到SEQIDNO：36的5'末端的iSp18间隔区)，条带Y对应仅dsDNA构建体(例如SEQIDNO：9在其3'末端连接3个，4个或5个iSp18间隔区，该iSp18间隔区连接到与SEQIDNO：35杂交的SEQIDNO：36的5'末端)。标记为1X的区域对应一个解旋酶结合SEQIDNO：9，SEQIDNO：9在其3'末端连接3个，4个或5个iSp18间隔区，该iSp18间隔区连接到SEQIDNO：36。标记为1Y的区域对应1个解旋酶结合SEQIDNO：9，在其3'末端连接3个，4个或5个iSp18间隔区，该iSp18间隔区连接到与SEQIDNO：35杂交的SEQIDNO：36。标记为2Y的区域对应2个解旋酶结合SEQIDNO：9，在其3'末端连接3个，4个或5个iSp18间隔区，该iSp18间隔区连接到与SEQIDNO：35杂交的SEQIDNO：36。标记为3Y的区域对应3个解旋酶结合SEQIDNO：9，在其3'末端连接3个，4个或5个iSp18间隔区，该iSp18间隔区连接到与SEQIDNO：35杂交的SEQIDNO：36。标记为4Y的区域对应4个解旋酶结合SEQIDNO：9在其3'末端连接3个，4个或5个iSp18间隔区，该iSp18间隔区连接到与SEQIDNO：35杂交的SEQIDNO：36。标记为5Y的区域对应5个解旋酶结合SEQIDNO：9，在其3'末端连接3个，4个或5个iSp18间隔区，该iSp18间隔区连接到与SEQIDNO：35杂交的SEQIDNO：36。
图16显示了在实施例9中使用的标准DNA构建体。x代表解旋酶不能结合至其上的间隔区基团。可以改变标记为1的区域的长度以控制可结合到该区域的解旋酶的数量。该图所示，作为实施例，一个或2个解旋酶的结合在区域1中。
图17显示了表12中标记为3的DNA构建体的示例凝胶测试(5个iSpC3间隔区连接到SEQIDNO：9的5'末端，该SEQIDNO：9在其3'末端连接4个iSpC3间隔区，该4个iSpC3间隔区连接到与SEQIDNO：35杂交的SEQIDNO：36的5'末端)。标记为M的泳道显示了作为参考的DNA标准带(条带对应从最低质量(凝胶的底部)到最高质量(凝胶的顶部)200bp(碱基对)，300bp，400bp，500/517bp，600bp，700bp，800bp，900bp，1000bp，1200bp和1517bp)。泳道1-6对应不同浓度的T4Dta-E94C/A360C-1＝5000nM，2＝2500nM，3＝1250nM，4＝625nM，5＝312.5nM和6＝0nM。在水平线X观察到的条带对应于未结合dsDNA构建体。在凝胶的左侧中的数字对应结合到DNA的酶的数量。对于这种DNA构建体，可以在其加入的酶的最高浓度结合多达6个解旋酶。在凝胶顶部显示的数字对应加入的T4Dda-E94C/A360C的浓度。
图18显示出实施例9中所使用的DNA构建体。标记为A和B的区域是设计为以便一个解旋酶可以结合到每个区域(如右侧所示)的短DNA链(SEQIDNO：37)。区域1对应25个SpC3间隔区，区域2对应2个iSp18间隔区，区域3对应2个iSp18间隔区，区域4是与其它DNA链杂交的DNA(SEQIDNO：10)的部分，该其它DNA的其它链可以由不分叉的或分叉的DNA构成(如SEQIDNO：42＝不分叉(标记为7的缺失片段)，连接6个iSp18间隔区的SEQIDNO：12(所示标记为7的片段)＝分叉)，区域5对应4个5-硝基吲哚，区域6对应与其互补段(SEQIDNO：43)杂交的另一个DNA区域(SEQIDNO：41)。
图19显示了图18中所描述和显示的DNA构建体的凝胶测试。在水平线X观察到的条带对应未结合的dsDNA构建体。标记为M的泳道显示了作为参考的DNA标准带(条带对应从最低质量(凝胶的底部)到最高质量(凝胶的顶部)200bp(碱基对)，300bp，400bp，500/517bp，600bp，700bp，800bp，900bp，1000bp，1200bp和1517bp)。在凝胶的左侧中的数字对应结合到DNA的酶的数量。对于这种DNA构建体，可以观察到酶浓度为475nM及以上，能结合两个解旋酶(一个在区域A，第二个在区域B，如图18中所示)。凝胶的顶部的数字对应T4Dda-E94C/A360C的浓度。
图20显示了实施例10中所使用的DNA构建体(称为DNA构建体X1)。具有25个连接SEQIDNO：38的5'端的SpC3间隔区(示为x)，该SEQIDNO：38在其3'末端连接至4个iSp18间隔区(显示为黑色正方形)。4个iSp18间隔区物连接到SEQIDNO：10的5'末端，SEQIDNO：10在其3'末端连接4个5-硝基吲哚(示为灰色三角形)。4个硝基吲哚然后连接到SEQIDNO：41的5'末端。与SEQIDNO：41杂交的互补DNA链是SEQIDNO：43。与SEQIDNO：10杂交的互补DNA链是SEQIDNO：12(SEQIDNO：12的3'末端连接6个iSp18间隔区，该6个iSp18间隔区连接2个胸腺嘧啶残基和3'胆固醇TEG(显示为灰色圆圈))。标记为A的区域对应其中T4Dda-E94C/A360C能够结合的构建体的区域。
图21显示了当解旋酶(T4Dda-E94C/A360C)控制DNA构建体(0.1nM,见图20描述)穿过纳米孔(MspA-B2C)的易位时的示例电流轨迹(y-轴坐标＝电流(pA，50至250)，x-轴坐标＝时间(s，238至252))。标记为1的区域显示了由解旋酶控制的聚T区域(SEQIDNO：38，所述酶结合至其上的区域)穿过纳米孔的易位。标记为2的区域对应由解旋酶控制的iSp18间隔区穿过纳米孔的易位。
图22显示了实施例4中所使用的DNA构建体的图。2个胸腺嘧啶在3'末端连接至28iSpC3间隔区(标记为A)。28个iSpC3在另一端连接至SEQIDNO：23的5'末端(对应于区域B的序列＝聚T部分，区域C＝与连接体序列(SEQIDNO：12)互补的序列)。SEQIDNO：23的3'末端连接4个iSpC3间隔区(标记为D)。4iSpC3间隔区的另一端连接到SEQIDNO：24的5'末端。连接体序列(SEQIDNO：12)在其3'端连接到6个iSp18间隔区，该iSp18间隔区连接到2个胸腺嘧啶和3'胆固醇TEG。
序列表的说明
SEQIDNO：1显示了编码MS-B1突变体MspA单体的密码子优化的多核苷酸序列。该突变体缺少信号序列，并包含下列突变：D90N，D91N，D93N，D118R，D134R和E139K。
SEQIDNO：2显示了由MspA单体的MS-B1突变体的成熟形式的氨基酸序列。该突变体缺少信号序列，并包含下列突变：D90N，D91N，D93N，D118R，D134R和E139K。
SEQIDNO：3显示了编码α-溶血素-E111N/K147N(α-HL-NN；Stoddart等人,PNAS,2009；106(19):7702-7707)的一个单体的多核苷酸序列。
SEQIDNO：4显示了α-HL-NN的一个单体的氨基酸序列。
SEQIDNO：5至SEQIDNO：7显示了MspB，C和D的氨基酸序列。
SEQIDNO：8显示了来自肠杆菌噬菌体(Enterobacteriaphage)T4的解旋酶Dda1993的氨基酸序列。
SEQIDNO：9显示了实施例1、2、3、7和8中使用的多核苷酸序列。
SEQIDNO：10显示了实施例1和9中使用的多核苷酸序列。
SEQIDNO：11显示了实施例1中使用的多核苷酸序列。SEQIDNO：11在其5'末端由3个iSpC3间隔区连接至SEQIDNO:10的3'末端。
SEQIDNO：12显示了实施例1和9中使用的多核苷酸序列。实施例1中的SEQIDNO:12在其3'末端连接到6个iSp18间隔区，该iSp18间隔区连接至2个胸腺嘧啶残基和3'胆固醇TEG。实施例9中的SEQIDNO：12在其3'末端仅连接6个iSp18间隔区。
SEQIDNO：13显示了肠杆菌噬菌体λ的多核苷酸序列。该序列包含连接在正义链的5'末端的附加的12碱基突出部分。此处所示的序列仅为正义链的序列。
SEQIDNO：14显示了实施例2和3中所使用的多核苷酸序列。SEQIDNO：14在其3'末端由4个iSpC3间隔区单元连接至SEQIDNO：15的5'末端。
SEQIDNO：15显示了实施例2和3中所使用的多核苷酸序列。SEQIDNO：15在其5'末端由4个iSpC3间隔区单元连接到SEQIDNO：14的3'末端。
SEQIDNO：16显示了实施例2和3中所使用的多核苷酸序列，在该序列的3'末端具有6个iSp18间隔区，该6个iSp18间隔区连接2个胸腺嘧啶残基和3'胆固醇TEG。
SEQIDNO：17显示了TrwcCba解旋酶的氨基酸序列。
SEQIDNO：18显示了实施例3中所使用的多核苷酸序列。SEQIDNO：18在其3'末端由4个iSpC3间隔区单元连接到SEQIDNO：9的5'末端。该序列具有连接到其5'末端的磷酸和在位置1至5的5个脱氧肌苷。
SEQIDNO：19显示出实施例2中所使用的多核苷酸序列。
SEQIDNO：20显示出实施例2中所使用的多核苷酸序列。
SEQIDNO：21和SEQIDNO：22是保持以下序列的编号的占位符。
SEQIDNO：23显示了实施例4中使用的多核苷酸序列。连接到该序列5'末端的是28个iSpC3间隔区单元，其中最后一个间隔区单元具有2个附加的连接到间隔区基团的5'末端的T'。连接到该序列的3'末端是4个连接到SEQIDNO：24的5'末端的iSpC3间隔区单元。
SEQIDNO：24显示了实施例9中所使用的多核苷酸序列。连接到该序列的5'末端的是4个4iSpC3间隔区单元，其最后一个间隔区单元连接到SEQIDNO：23。连接到SEQIDNO：23的5'末端的是28个iSpC3间隔区单元，其最后一个间隔区单元具有2个附加的连接到间隔区基团的5'末端的T'。
SEQIDNO：25显示了实施例5中使用的多核苷酸序列。在其5'末端具有羧基荧光(FAM)基团。
SEQIDNO：26显示了实施例5和6中所使用的多核苷酸序列。在其3'末端具有黑洞猝灭剂(BHQ-1)基团。
SEQIDNO：27显示了实施例5和6中所使用的多核苷酸序列。
SEQIDNO：28显示了Hel308Mbu的氨基酸序列。
SEQIDNO：29显示了实施例5中所使用的多核苷酸序列。该序列在其5'末端通过一个或4个iSp9间隔区基团连接到SEQIDNO：27。
SEQIDNO：30显示了实施例6中所使用的多核苷酸序列。该序列在其5'末端通过1个idSp间隔区基团连接到SEQIDNO：27。
SEQIDNO：31显示了实施例6中所使用的多核苷酸序列。该序列在其5'末端通过4个idSp间隔区基团连接到SEQIDNO：27。
SEQIDNO：32显示了实施例6中使用的多核苷酸序列。在其5'末端具有羧基荧光(FAM)基团。
SEQIDNO：33显示了实施例6中使用的多核苷酸序列。在其5'末端具有羧基荧光(FAM)基团。
SEQIDNO：34显示了实施例7中使用的多核苷酸序列。
SEQIDNO：35显示了实施例7和8中使用的多核苷酸序列。在其5'末端具有羧基荧光(FAM)基团。
SEQIDNO：36显示了实施例7和8中使用的多核苷酸序列。
SEQIDNO：37显示了实施例7、8和9中使用的多核苷酸序列。
SEQIDNO：38显示了实施例8和10中使用的多核苷酸序列。
SEQIDNO：39显示了实施例8中使用的多核苷酸序列。
SEQIDNO：40显示了实施例8中使用的多核苷酸序列。
SEQIDNO：41显示了实施例9中使用的多核苷酸序列。
SEQIDNO：42显示了实施例9中使用的多核苷酸序列。
SEQIDNO：43显示了实施例9中使用的多核苷酸序列。
具体实施方式
应该理解的是，所公开的产品和方法的不同应用可以适用于本领域中的特定需要。也应理解的是，这里使用的术语仅用于描述本发明的具体实施方案的目的，并且不意于对本发明的限制。
此外，用于本说明书和所附权利要求书中的单数形式“一”，“一个”，和“所述”包括复数对象，除非内容另外明确指出。因此，例如，关于“多核苷酸”包括两个或多个多核苷酸，关于“间隔区”包括两个或多个间隔区，关于“解旋酶”包括两个或多个解旋酶，关于“跨膜孔”包括两个或多个孔等。
所有在此引用的出版物、专利和专利申请，无论在上文或下文，以全文参考的方式引入本文。
移动解旋酶穿过间隔区的方法
本发明提供了移动一个或多个停滞的解旋酶穿过一个或多个目标多核苷酸上的间隔区的方法。如果解旋酶已经停止了沿多核苷酸移动，则它是停滞的。每个间隔区通常停滞一个或多个解旋酶。将在下面讨论确定一个或多个解旋酶是否被停滞的方法。一个或多个解旋酶可在间隔区之前被停滞。一个或多个解旋酶可被一个间隔区停滞。一个或多个解旋酶可在间隔区上被停滞。本发明涉及移动一个或多个停滞的解旋酶穿过，即越过，一个或多个间隔区。
将所述一个或多个停滞的解旋酶和目标多核苷酸与跨膜孔接触并施加电势。如下面更详细描述的，所施加的电势产生的场的作用下，所述目标多核苷酸移动穿过所述孔。所述一个或多个解旋酶通常太大而不能移动穿过所述孔。当目标多核苷酸的一部分进入所述孔并沿所施加的电势而产生的场移动，所述一个或多个解旋酶随着所述目标多核苷酸移动通过所述孔而通过所述孔移动穿过间隔区。这是因为，目标多核苷酸(包括一个或多个间隔区)移动通过所述孔且所述一个或多个解旋酶停留在孔的顶部。
这使得一个或多个解旋酶在目标多核苷酸上的位置被控制。在将一个或多个停滞的解旋酶和目标多核苷酸与跨膜孔接触和施加电势之前，一个或多个解旋酶停留在它们被停滞的位置。甚至在存在必要的组分(例如ATP和Mg2+)以促进解旋酶的移动，所述一个或多个解旋酶将不会移动穿过目标多核苷酸上的间隔区，也不会沿间隔区另一侧上的目标多核苷酸的部分移动，直到有跨膜孔和所施加的电势的存在。
所述一个或多个解旋酶在存在跨膜孔，但没有施加电势的情况也仍将停留在它们被停滞的位置。在这种情况下，施加电势将移动一个或多个解旋酶穿过间隔区。施加电势因此可以用于激起一个或多个解旋酶穿过间隔区以及沿间隔区的另一侧上的目标多核苷酸部分的移动。例如，增加电压可用于移动一个或多个解旋酶穿过间隔区。
本发明还提供控制目标多核苷酸穿过跨膜孔的方法。目标多核苷酸具有一个或多个间隔区。目标多核苷酸与一个或多个解旋酶接触且一个或多个解旋酶在一个或多个间隔区处停滞。这确保了所述一个或多个解旋酶停滞在多核苷酸上的一个或多个特定位置。这在下面更详细地讨论。目标多核苷酸和所述一个或多个停滞的解旋酶与跨膜孔接触。一旦施加电势，所述一个或多个解旋酶移动穿过一个或多个间隔区，并沿间隔区的另一侧上的多核苷酸部分的移动。这使一个或多个解旋酶控制多核苷酸穿过孔的移动。电势也通常用于将多核苷酸穿入所述孔。
解旋酶可以控制多核苷酸的至少两个活动运转模式的移动(当解旋酶具有所有能促进移动的组分，例如ATP和Mg2+)和一个非活动运转模式(当解旋酶不具有能促进移动的组分)。当提供了所有能促进移动必要的组件时，解旋酶沿着所述多核苷酸5'至3'方向或3'至5'的方向(取决于解旋酶)移动，而不是孔中的多核苷酸的取向(这取决于多核苷酸的哪一端被孔捕获)，这意味着解旋酶可用于逆施加的场将多核苷酸移动出孔或顺着施加的场将多核苷酸移动进孔中。当解旋酶朝着其移动的多核苷酸的端被孔捕获时，解旋酶逆着施加的电势所产生的场的方向工作，并将螺旋状多核苷酸从孔中拉出并进入顺式(cis)腔室。然而，当解旋酶远离其移动的多核苷酸的一端被孔捕获时，解旋酶顺着所施加的电势而产生的场方向工作，且将螺旋状多核苷酸推入所述孔中并进入反式(trans)腔室。
当未提供给解旋酶促进移动必要的组分时，解旋酶可以结合多核苷酸并作为制动器减缓多核苷酸的移动，当其通过所施加的电势而产生的场被拉入孔时。在非活动模式中，多核苷酸的哪一端被捕获是不重要的，在解旋酶作为制动器条件下施加的场将多核苷酸朝着的相反侧拉入孔中。当在非活动模式中，由解旋酶控制的多核苷酸的移动可以以多种方式描述，包括棘轮(ratcheting)、滑动和制动。
在本发明的方法中，所述一个或多个解旋酶优选顺着施加的电势产生的场控制目标多核苷酸穿过所述孔的移动。在一个优选的实施例中，一个或多个解旋酶在活动模式中使用，且解旋酶远离其移动的多核苷酸的一端被孔捕获，以使得一个或多个解旋酶顺着施加的电势所产生的场工作，且将多核苷酸推过所述孔。如果所述一个或多个解旋酶沿5'至3'方向移动，目标多核苷酸的5'末端优选被孔捕获。在这样的实施例中，一个或多个解旋酶以5'至3'方向移动穿过一个或多个间隔区。如果所述一个或多个解旋酶以3'至5'的方向移动，目标多核苷酸的3'末端优选被孔捕获。在这样的实施例中，一个或多个解旋酶以3'至5'方向移动穿过一个或多个间隔区。
在另一个优选的实施例中，一个或多个解旋酶在非活动模式中使用，使得所施加的场将目标多核苷酸牵拉穿过所述孔并且所述一个或多个解旋酶充当制动器。在本发明的方法中，一个或多个解旋酶优选减缓或暂停目标多核苷酸顺着由施加的电势产生的场的方向穿过所述孔的移动。在任何情况下，一个或多个解旋酶通常太大而不能穿过所述孔，随着多核苷酸顺着由施加的电势产生的场的方向移动穿过所述孔，所述孔推动所述一个或多个解旋酶穿过在多核苷酸上的一个或多个间隔区。
在利用所述孔表征多核苷酸的过程中，例如在链测序过程中，控制目标多核苷酸穿过跨膜孔的移动的方法是有帮助的。本发明还提供表征目标多核苷酸的方法。目标多核苷酸具有一个或多个间隔区。目标多核苷酸与一个或多个解旋酶接触且所述一个或多个解旋酶在一个或多个间隔区处停滞。这确保了所述一个或多个解旋酶仍停留在多核苷酸上的一个或多个特定位置。这在下面更详细地讨论。目标多核苷酸和所述一个或多个停滞的解旋酶与跨膜孔接触。一旦施加电势，所述一个或多个解旋酶移动穿过一个或多个间隔区，并沿间隔区的另一侧上的多核苷酸部分移动。这使一个或多个解旋酶控制多核苷酸穿过孔的移动。该方法还包括当多核苷酸相对于所述孔移动时获取一个或多个测量值。测量值代表多核苷酸的一个或多个特征。
将一个或多个解旋酶停滞在目标多核苷酸上以及利用跨膜孔和施加的电势将一个或多个解旋酶移动穿过一个或多个间隔区的能力是有利的，由于其允许目标多核苷酸的有效的表征，如目标多核苷酸的测序。例如，所述一个或多个解旋酶可以朝着在前导序列中的目标核苷酸的一端被停滞，该前导序列被被设计为被孔捕获且不需表征(如下所述)。在前导序列中的一个或多个解旋酶被停滞表明一个或多个解旋酶不以远离前导序列的方式，沿待表征的多核苷酸的部分移动，直到它/它们与孔接触并施加了的电势。一旦一个或多个解旋酶和多核苷酸与所述孔接触且施加了电势，前导序列通常被孔捕获并移动穿过孔移动。这个移动使所述一个或多个解旋酶移动穿过间隔区且沿待表征的多核苷酸的部分移动(如上所述)。然后一个或多个解旋酶可以控制待表征的多核苷酸的部分的移动。
如果所述一个或多个解旋酶不在前导序列被停滞，它/它们将沿多核苷酸以远离前导序列的方式，并沿待表征的多核苷酸的部分移动。当所述一个或多个解旋酶和多核苷酸与所述孔接触且在这种情况下施加电势，前导序列和一些，也许不是全部的待表征的多核苷酸将以不受控制的方式沿所施加电势产生的场穿过所述孔。仅当一个或多个解旋酶与所述孔接触时，它/它们将开始控制上述待表征的多核苷酸部分的移动。任何以不受控制的方式移动穿过孔的多核苷酸不能进行如下所述的表征。如果一个或多个解旋酶以远离前导序列的方式且沿大多数量标多核苷酸的其余部分移动很少，如果有的话，多核苷酸将被表征。
根据本发明的一个或多个间隔区的使用使一个或多个解旋酶在目标多核苷酸上的数量和位置可以被控制，如下面更详细讨论。例如，特定数量的解旋酶可被停滞在适配器上的特定位置，适配器可在表征前连接到目标多核苷酸。这种适配器由本发明提供，也可以在用于表征的试剂盒中提供。一个或多个间隔区的使用确保了解旋酶停留在特定位置，直到开始表征，即使适配器和/或目标多核苷酸在表征前存在能促进解旋酶移动的必要组分(例如ATP和Mg2+)。
多核苷酸
多核苷酸如核酸是含有两个或更多个核苷酸的大分子。多核苷酸或核酸可包括任何核苷酸的任意组合。核苷酸可以是天然存在的或人工合成的。多核苷酸中的一个或多个核苷酸可以被氧化或甲基化。多核苷酸中的一个或多个核苷酸的可被损坏。例如，多核苷酸可包含嘧啶二聚体。此类二聚体通常与紫外线导致的损坏相关联，且是皮肤黑素瘤的首要原因。多核苷酸中的一个或多个核苷酸可被修饰，例如用标记物或标签。合适的标记物如下所述。
核苷酸通常包含核碱基、糖和至少一个磷酸基团。核碱基和糖形成核苷。
核碱基通常为杂环。核碱基包括但不限于：嘌呤和嘧啶，更具体的腺嘌呤(A)，鸟嘌呤(G)，胸腺嘧啶(T)，尿嘧啶(U)和胞嘧啶(C)。
糖通常为戊糖。核苷酸的糖包括但不限于，核糖和脱氧核糖。所述糖优选是脱氧核糖。
多核苷酸中的核苷酸通常为核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。所述多核苷酸可包含以下核苷：腺苷，尿苷，鸟苷和胞苷。所述核苷酸优选脱氧核糖核苷酸。所述多核苷酸优选包括下列核苷：脱氧腺苷(dA)，脱氧尿苷(dU)和/或胸苷(dT)，脱氧鸟苷(dG)和脱氧胞苷(dC)。
核苷酸通常含有单磷酸、二磷酸或三磷酸。磷酸盐可连接在核苷酸的5'或3'侧上。
合适的核苷酸包括但不限于，单磷酸腺苷(AMP)，单磷酸鸟苷(GMP)，单磷酸胸苷(TMP)，单磷酸尿苷(UMP)，单磷酸胞苷(CMP)，环磷酸腺苷(cAMP)，环磷酸鸟苷(cGMP)，脱氧单磷酸腺苷(dAMP)，脱氧单磷酸鸟苷(dGMP)，脱氧单磷酸胸苷(dTMP)，脱氧单磷酸尿苷(dUMP)和脱氧单磷酸胞苷(dCMP)。所述核苷酸优选选自AMP，TMP，GMP，CMP，UMP，dAMP，dTMP，dGMP，dCMP和dUMP。所述核苷酸最优选自dAMP，dTMP，dGMP，dCMP和dUMP。所述多核苷酸优选包括以下核苷酸：dAMP,dUMP和/或dTMP和dCMP。
所述多核苷酸中的核苷酸可以任何方式彼此连接。核苷酸通常被它们的糖和的磷酸基连接，如在核酸中。所述核苷酸可通过它们的核碱基的连接，如嘧啶二聚体中。
所述多核苷酸可以是核酸。所述多核苷酸可以是任何本领域已知的合成的核酸，例如肽核酸(PNA)，甘油核酸(GNA)，苏糖核酸(TNA)，锁核酸(LNA)，或其它具有核苷酸侧链的合成聚合物。该PNA骨架由通过肽键连接的重复的N-(2-氨基乙基)-甘氨酸单元组成。该GNA骨架由通过磷酸二酯键连接的重复的乙二醇单元组成。该TNA骨架由通过磷酸二酯键连接在一起的重复的苏糖组成。该LNA是由如上所讨论的具有在核糖中连接2'氧和4'碳的额外的桥的核苷酸形成。
该多核苷酸是最优选核糖核酸核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)。
所述多核苷酸优选不包括任何无碱基核苷酸(即缺少核碱基的核苷酸)，除了在一个或多个间隔区中的无碱基核苷酸。所述多核苷酸优选不包括任何C3间隔区(C3spacers)(即缺乏核碱基和糖的核苷酸)，除了在一个或多个间隔区中的C3间隔区。
所述多核苷酸可以为任何长度。例如，多核苷酸可以为至少10个，至少50个，至少100，至少150，至少200，至少250，至少300，至少400或至少500个核苷酸长度。所述多核苷酸可以为1000或更多个核苷酸，5000或更多个核苷酸长度或100000或更多个核苷酸长度。
解旋酶可沿本发明的方法中的全部或仅部分目标多核苷酸移动。全部或部分目标多核苷酸可以使用本发明的方法进行表征。
目标多核苷酸可以是单链的。所述目标多核苷酸的至少一部分优选为双链。解旋酶通常结合至单链多核苷酸。如果目标多核苷酸的至少一部分是双链的，所述目标多核苷酸优选地包括单链区域或非杂交区域。所述一个或多个解旋酶能够结合到单链区域或非杂交区域的一条链上。所述目标多核苷酸优选地包括一个或多个单链区域或一个或多个非杂交的区域。
所述一个或多个间隔区优选地包括在单链区域或目标多核苷酸的非杂交的区域中。目标多核苷酸可以包括一个以上的单链区域或一个以上的非杂交区域。目标多核苷酸可以包括在其序列内的和/或在两端的单链区域或非杂交区域。所述一个或多个间隔区可包括在目标多核苷酸的双链区域中。
如果所述方法中使用的一个或多个解旋酶以5'至3'方向移动，目标多核苷酸优选在其5'末端包含单链区域或非杂交区域。如果所述方法中使用的一个或多个解旋酶以3'至5'方向移动，目标多核苷酸优选在其3'末端包括单链区或非杂交区域。如果所述一个或多个解旋酶以非活动模式(即作为制动)使用时，所述单链区域或非杂交区域位于何处是不重要的。
该单链区域优选包括优先旋入孔的前导序列。前导序列有利于本发明的方法。该前导序列被设计为优先地旋入所述跨膜孔，从而有助于目标多核苷酸穿过孔的移动。前导序列通常包括聚合物。该聚合物优选带负电荷。聚合物优选为多核苷酸，例如DNA或RNA，修饰的核苷酸(例如无碱基的DNA)，PNA，LNA，聚乙二醇(PEG)或多肽。前导序列优选包含多核苷酸，更优选包含单链多核苷酸。前导序列可以包括任一如上所述的多核苷酸。单链前导序列最优选地包括单链DNA，如聚dT(polydT)部分。前导序列优选地包括一个或多个间隔区。
该前导序列可以是任何长度，但其通常为10至150个核苷酸长度，例如20至150个核苷酸长度。前导序列的长度通常取决于方法中使用的跨膜孔。
如果目标多核苷酸的至少一部分是双链的，所述双链部分的两条链优选使用桥连部分如发卡连接。这有利于本法明的表征方法。通过桥连部分将目标多核苷酸的两条链连接，使多核苷酸的两条链都被表征，如都通过跨膜孔测序。当多核苷酸移动穿过孔时，两条链去杂交化作为单链多核苷酸。这种方法是有利的，因为成倍增长了从单一双链目标多核苷酸获得的信息的量。而且，由于互补的“反义”链中的序列必然正交于“正义”链的序列，可以信息化地组合两条链中的信息。因此，这种机制提供了正交校对功能，以提供更高的置信观察(confidenceobservations)。
可以使用任何在国际申请No.PCT/GB2012/051786(公开为WO2013/014451)中公开的实施例。桥连部分通常共价连接多核苷酸的两条链。桥连部分可以是能够将多核苷酸的两条链连接的任何物质，条件是桥接基团不干扰所述多核苷酸穿过跨膜孔的移动。合适的桥连部分包括但不限于：聚合接头，化学接头，多核苷酸或多肽。优选地，该桥连部分包括DNA，RNA，修饰的DNA(如无碱基的DNA)，RNA，PNA，LNA或聚乙二醇(PEG)。桥连部分更优选为DNA或RNA。桥连部分可以包括一个或多个间隔区。
桥连部分最优选发卡环。发卡环可以由任何如上所公开的多核苷酸形成。发卡环或发卡环的环通常为约4个至约100个核苷酸长度，优选为约4个至约8个核苷酸长度。
桥连部分通过本领域中已知的任何合适的方式连接到目标多核苷酸的两条链。桥连部分可以为分别合成、化学连接或酶促地与目标多核苷酸连接。或者，桥连部分可以在目标多核苷酸的处理过程中产生。
桥连部分在目标多核苷酸的一端或接近一端的位置连接到目标多核苷酸。桥连部分优选在多核苷酸一端的10个核苷酸内位置连接到目标多核苷酸。
所述一个或多个间隔区优选地定位于，使得它/它们停滞一个或多个解旋酶，并防止它/它们沿待控制和表征的目标多核苷酸移动。例如，一个或多个间隔区优选位于前导序列和待控制和表征的目标多核苷酸之间，例如一个或多个间隔区位于在多核苷酸的一端处的前导序列内。前导序列通常顺着所施加电势产生的场进入孔中，且一个或多个解旋酶随多核苷酸移动穿过孔移动穿过一个或多个间隔区。一个或多个解旋酶然后可控制目标多核苷酸的其余部分移动穿过所述孔并有助于其表征。
在最优选的实施中，目标多核苷酸包含通过桥连部分如发卡环在目标多核苷酸一端处连接的双链部分，以及连接在目标多核苷酸远离包含前导序列的所述桥连部分的另一端处的单链部分。一个或多个间隔区可存在于前导序列和/或桥连部分中。
目标多核苷酸存在于任何合适的样品中。本发明通常在已知含有或怀疑含有目标多核苷酸的样品上实施。替换的，可以对样本实施本发明，以确认所识别的一个或多个目标多核苷酸，所述目标多核苷酸已知或预期存在于所述样本中。
所述样品可以是生物样品。本发明可以针对从任何生物体或微生物中获得或提取的样品在体外实施。所述生物体或微生物通常是古核的(archaean),原核的或真核的，并且通常属于以下五界中的一个：植物界，动物界，真菌，原核生物和原生生物。本发明针对从任何病毒中获得或提取的样品在体外实施。所述样品优选是液体样品。样品通常包括患者的体液。所述样品可以是尿液，淋巴液，唾液，粘液或羊水，但优选血液，血浆或血清。通常，所述样品是来源于人的，但可替代地可以是来自其他哺乳动物动物的，如自商业上养殖的动物如马，牛，绵羊或猪，或者可以是宠物如猫或狗。或者，植物来源的样品通常从商业作物获得，如谷类，豆类，水果或蔬菜，例如小麦，藜，大麦，燕麦，芸苔，玉米，大豆，水稻，香蕉，苹果，西红柿，土豆，葡萄，烟草，菜豆，小扁豆，甘蔗，可可，棉花。
所述样品可以是非生物样品。非生物样品优选为液体样品。非生物样品的示例包括外科手术液体，水如饮用水，海水或河水，以及用于实验室测试的试剂。
样品通常在测试前被处理，例如通过离心或通过膜滤除不需要的分子或细胞，例如红血细胞。可以在获取所述样本后立即进行检测。通常也可以在分析前储存所述样本，优选低于-70℃。
间隔区
所述一个或多个间隔区包括在目标多核苷酸中。一个或多个间隔区优选是目标多核苷酸的一部分，例如它/它们中断多核苷酸序列。一个或多个间隔区优选不为一个或多个嵌段分子的一部分，该嵌段分子如与目标多核苷酸杂交的减速带(speedbumps)。
在目标多核苷酸中具有任意数量的间隔区，如1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个，10个或更多个间隔区。优选在目标多核苷酸中具有2个，4个或6个间隔区。目标多核苷酸的不同区域中可具有间隔区，例如前导序列中的间隔区和发卡环中的间隔区。
一个或多个间隔区各提供了能量障碍，所述一个或多个解旋酶甚至在活动模式也不能克服该能量障碍。所述一个或多个间隔区可通过减少解旋酶的牵拉(例如通过除去目标多核苷酸中的核苷酸的碱基)或物理性地阻断一个或多个解旋酶的移动(例如利用庞大的化学基团)来停滞一个或多个解旋酶。
所述一个或多个间隔区可包括停滞一个或多个解旋酶的任意分子或任意分子的组合。所述一个或多个间隔区可以包括阻止所述一个或多个解旋酶沿目标多核苷酸移动的任意分子或任意分子的组合。其直接地确定在缺少跨膜孔和施加的电势的条件下，一个或多个解旋酶是否停留在一个或多个间隔区处。例如，这可如实施例中所示进行测试，例如解旋酶穿过间隔区且置换DNA的互补链的能力可以通过PAGE进行测量。
一个或多个间隔区通常包括直链分子如聚合物。所述一个或多个间隔区通常具有与目标多核苷酸不同的结构。例如，如果所述目标多核苷酸是DNA，一个或多个间隔区通常不是脱氧核糖核酸。特别是，如果目标多核苷酸是脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)，所述一个或多个间隔区优选包括肽核酸(PNA)，甘油核酸(GNA)，苏糖核酸(TNA)，锁核酸(LNA)或具有核苷酸侧链的合成聚合物。
一个或多个间隔区优选包括一个或多个硝基吲哚，例如一个或多个5-硝基吲哚，一个或多个肌苷，一个或多个吖啶，一个或多个2-氨基嘌呤，一个或多个2-6-二氨基嘌呤，一个或多个5-溴-脱氧尿嘧啶，一个或多个反向胸苷(反向dTs)，一个或多个反向脱氧胸苷(ddTs)，一个或多个二脱氧胞苷(ddCs)，一个或多个5-甲基胞苷，一个或多个5-羟甲基胞苷，一个或多个2'-O-甲基RNA碱基，一个或多个异脱氧胞苷(异-dCs)，一个或多个异脱氧鸟苷(异dGs)，一个或多个iSpC3基团(即缺少糖和碱基的核苷酸)，一个或多个光裂解(PC)基团，一个或多个己二醇基团，一个或多个间隔区9(iSp9)基团，一个或多个间隔区18(iSp18)基团，聚合物或一个或多个硫醇连接。所述一个或多个间隔区可包括这些基团的任意组合。许多这些基团可以购自(IntegratedDNA)。
所述一个或多个间隔区可包含任何数量的这些基团。例如，对于2-氨基嘌呤，2-6-二氨基嘌呤，5-溴脱氧尿苷，反向dTs，ddTs，ddCs，5-甲基胞苷，5-羟甲基胞苷，2'-O-甲基RNA碱基，异dCs，异dGs，iSpC3基团，PC基团，己二醇基团和硫醇连接，一个或多个间隔区优选包含2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个，10个，11个，12个或更多。一个或多个间隔区优选包含2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个或更多iSp9基团。一个或多个间隔区优选包含2个，3个，4个，5个或6个或更多iSp18基团。最优选的间隔区基团是4个iSp18基团。
聚合物优选为多肽或聚乙二醇(PEG)。所述多肽优选地包含2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个，10个，11个，12个或更多个氨基酸。所述PEG优选包含2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个，10个，11个，12个或更多单体单元。
一个或多个间隔区优选包括一个或多个无碱基核苷酸(即缺乏核碱基的核苷酸)，例如2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个，10个，11个，12个或更多个无碱基的核苷酸。核碱基可以被无碱基核苷酸中的-H(idSp)或-OH置换。无碱基的间隔区可以通过从一个或多个相邻的核苷酸中除去核碱基而被插入到目标多核苷酸中。例如，多核苷酸可以被修饰为包括3-甲基腺嘌呤，7-甲基鸟嘌呤，1，N6-亚乙烯基肌苷(ethenoadenineinosine)或次黄嘌呤，且可利用人烷基腺嘌呤DNA糖基化酶(hAAG)从这些核苷酸中除去核碱基。或者，多核苷酸可以被修饰为包括尿嘧啶且用尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)除去了核碱基。在一个实施例中，一个或多个间隔区不包括任何无碱基核苷酸。
所述一个或多个解旋酶可以被停滞在每个线性分子间隔区(即在间隔区之前)或在每个线性分子间隔区上被停滞。如果使用线性分子间隔区，目标多核苷酸优选具有双链多核苷酸区域，其邻近于一个或多个解旋酶要移动穿过的每个间隔区的一端。双链区通常有助于一个或多个解旋酶停滞在相邻间隔区上。如果该方法是在约100mM或更低的盐浓度实施的，特别优选存在双链区域。每个双链区域通常为至少10个，如至少12个核苷酸长度。如果在本发明中使用的目标多核苷酸是单链的，双链区域可通过将较短的多核苷酸杂交到相邻间隔区的区域而形成。较短的多核苷酸通常由作为目标多核苷酸的相同的核苷酸形成，但可以由不同的核苷酸形成。例如，较短的多核苷酸可以由LNA形成。
如果使用线性分子间隔区，目标多核苷酸优选在每个间隔区的一端具有阻断(blocking)分子，该端与一个或多个解旋酶要移动穿过的一端相反。这可以有助于确保所述一个或多个解旋酶保持停滞在每个间隔区上。这也可能有助于使一个或多个解旋酶保持在目标多核苷酸上，当它/它们在溶液中扩散的情况下。阻断分子可以是如下所讨论的物理上导致一个或多个解旋酶停滞的任何化学基团。阻断分子可以是双链多核苷酸区域。
一个或多个间隔区优选包含一个或多个物理上导致一个或多个解旋酶停滞的化学基团。所述一个或多个化学基团优选为一个或多个侧挂的化学基团。所述一个或多个化学基团可以连接到目标多核苷酸中的一个或更多个核碱基。所述一个或多个化学基团可以连接到目标多核苷酸的骨架。可存在任何数量，如2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个，10个，11个，12个或更多个这些化学基团。合适的基团包括但不限于，荧光团，链霉亲和素和/或生物素，胆固醇，亚甲基蓝，二硝基苯酚(DNPs)，洋地黄毒苷和/或抗洋地黄毒苷和二苯基环辛炔基团。
目标多核苷酸中的不同间隔区可以包含不同停滞分子。例如，一个间隔区可以包括如上讨论的一个线性分子，另一个间隔区可以包括一个或多个物理上导致一个或多个解旋酶停滞的化学基团。间隔区可包括如上讨论的任何线性分子和一个或多个物理上导致一个或多个解旋酶停滞的化学基团，例如一个或多个无碱基和荧光团。
合适的间隔区可以根据目标多核苷酸的类型而设计并且在本发明的方法条件下进行实施。大多数解旋酶结合DNA且沿DNA移动，所以可以用任何不为DNA的物质而停滞。合适的分子如上所述。
本发明的方法优选存在游离核苷酸和/或解旋酶的辅助因子的情况下实施。这在下文更详细地讨论。在不存在跨膜孔和施加的电势，所述一个或多个间隔区优选存在游离核苷酸和/或存在解旋酶辅助因子的情况下，能够停滞一个或多个解旋酶。
如果本发明的方法是在游离核苷酸和如下所述的解旋酶辅助因子(使得一个或多个解旋酶处于活动模式)的存在下实施，一个或多个间隔区通常用于确保所述一个或多个解旋酶在它们与所述跨膜孔接触和施加电势之前在目标多核苷酸上停滞。一个或多个较短的间隔区可以在不存在游离核苷酸和解旋酶辅助因子(使得一个或多个解旋酶为非活动模式)时使用。
盐浓度也影响所述一个或多个间隔区停滞一个或多个解旋酶的能力。在不存在跨膜孔和施加的电势时，所述一个或多个间隔区优选能够在约为100mM或更低的盐浓度使所述一个或多个解旋酶停滞。本发明的方法中使用的盐浓度越高，通常使用的一个或多个间隔区越短，反之亦然。
优选的特征组合显示在下方表1中。
如下文更详细地讨论的，方法可以涉及移动两个或多个解旋酶穿过间隔区。在这种情况下，通常增加间隔区的长度以防止尾部的解旋酶在不没有孔和施加的电势的情况下将前端(leading)的解旋酶推过间隔区。如果所述方法涉及移动两个或多个解旋酶穿过一个或多个间隔区，上述的间隔区长度可以增加至少1.5倍，例如2倍，2.5倍或3倍。例如，如果该方法涉及移动两个或多个解旋酶穿过一个或多个间隔区，在上述表1的第3列中间隔区的长度可以增加1.5倍，2倍，2.5倍或3倍。
两个或多个解旋酶也可以被分离，使得每个解旋酶均具有其自身的一个或多个间隔区。这在下面更详细地讨论。
解旋酶
本发明可使用任何解旋酶。解旋酶可以为或衍生自Hel308解旋酶，RecD解旋酶，如TraI解旋酶或TrwC解旋酶，XPD解旋酶或Dda解旋酶。解旋酶可以为任何在国际申请No.PCT/GB2012/052579(公开为WO2013/057495)；PCT/GB2012/053274(公开为WO2013/098562)；PCT/GB2012/053273(公开号为WO2013098561)；PCT/GB2013/051925；PCT/GB2013/051924以及PCT/GB2013/051928；以及2013年10月18日提交的英国申请No.1318464.3中公开的解旋酶，修饰的解旋酶或解旋酶构建体。
解旋酶优选包含如SEQIDNO：17(TrwcCba)或其变体所示的序列，如SEQIDNO：28(Hel308Mbu)或其变体所示的序列，如SEQIDNO：8(Dda)或其变体所示的序列。变体可以以在下面讨论的针对跨膜孔的任何方式区别于天然序列。SEQIDNO：8的优选变体包括E94C/A360C，然后(ΔM1)G1G2(即M1缺失和G1和G2添加)。
任何数量的解旋酶按照本发明可移动穿过一个或多个间隔区。例如，1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个，10个或多个解旋酶可移动穿过所述一个或多个间隔区。在一些实施例中，不同数量的解旋酶可以移动穿过每个间隔区。例如，如果使用两个分开的间隔区停滞两个解旋酶，一个解旋酶(第一个解旋酶)可移动穿过第一个间隔区，而两个解旋酶(第一个解旋酶和第二个解旋酶)可移动穿过第二间隔区。
本发明的方法优选包括移动2个或多个，例如3个或更多个，或4个或更多个，停滞的解旋穿过一个或多个间隔区。所述两个或多个解旋酶通常是相同的解旋酶。两个或更多个解旋酶可以是不同的解旋酶。
两个或多个解旋酶可以是上面提到的解旋酶的任意组合。两个或更多个解旋酶可以是两个或多个Dda解旋酶。两个或多个解旋酶可以是一个或多个Dda解旋酶和一个或多个TrwC解旋酶。两个或多个解旋酶可以为相同的解旋酶的不同变体。
所述两个或多个解旋酶优选连接彼此。所述两个或多个解旋酶更优选共价地连接彼此。解旋酶可以以任何顺序且使用任何方法连接。用于本发明的优选的解旋酶构建体在国际申请Nos.PCT/GB2013/051925；PCT/GB2013/051924和PCT/GB2013/051928；以及2013年10月18日提交的英国申请No.1318464.3中描述。
条件和跨膜孔
方法包括跨孔施加电势。所施加的电势可以是电压电势。该方法可以包括跨孔施加电压电势。该方法可以包括跨孔施加增加的电压。在本实施例中，初始电压电势通常不足以移动所述一个或多个解旋酶穿过一个或多个间隔区，而增加的电压电势通常足以移动所述一个或多个解旋酶穿过一个或多个间隔区。或者，所施加的电势可以是化学电势。这方面的例子为跨两性分子层使用盐梯度。盐梯度在Holden等人,JAmChemSoc.2007Jul.11；129(27)：8650-5中公开。在一些情况下，随着目标多核苷酸相对于所述孔移动，通过所述孔的电流来确定所述目标多核苷酸的序列。这是链测序。
跨膜孔是一定程度跨越膜的结构。它允许通过施加的电势驱动水合离子使其跨膜流动或在膜内流动。跨膜孔通常跨越整个膜以使得水合离子可以从膜的一侧流动到所述膜的另一侧。然而，跨膜孔不是必须跨越膜。其可以在一端封闭。例如，孔可以是膜中的井，水合离子可以沿着其流动或流入。
本发明可使用任何跨膜孔。该孔可以是生物的或人造的。合适的孔包括但不限于，蛋白质孔，多核苷酸孔和固态孔。
根据本发明可使用任何膜。合适的膜是现有技术中已知的。该膜优选为两性分子层。两性分子层是一种由具有至少一个亲水性部分和至少一个亲脂性或疏水性部分的两性分子诸如磷脂质形成的层。两性分子可以是合成的或天然存在的。非天然存在的两亲物质和形成单分子层的两亲物质是本领域已知的，并且包括嵌段共聚物(Gonzalez-Perezetal.,Langmuir,2009,25，10447-10450)。嵌段共聚物是其中两个或多个单体亚单元聚合在一起而形成单一聚合物链的聚合物材料。嵌段共聚物具有的性质通常由每个单体亚单元贡献。然而，嵌段共聚物可具有从各亚单元形成的聚合物不具备的独特的性质。嵌段共聚物可以被改造，使得该单体亚单元之一是疏水性的(即亲脂性)，而其它亚单元在水介质中是亲水性的。在这种情况下，该嵌段共聚物可具有两亲特性，并且可以形成模仿生物膜的结构。嵌段共聚物可以是二嵌段共聚物(由两个单体亚单元组成)，但也可以由两个以上的单体亚单元构成，以形成相当于两亲物质的更复杂的结构。所述共聚物可以为三嵌段，四嵌段或五嵌段共聚物。
所述两性分子层可以是单层或双层。两性分子层通常为平面脂质双分子层或支撑双层。
两性分子层通常是脂质双分子层。脂质双分子层为细胞膜的模型，且作为一系列实验研究的优秀的平台。例如，脂质双分子层可通过单通道记录器用于膜蛋白的体外研究。或者，脂质双分子层可作为生物传感器来检测一系列物质的存在。脂质双分子层可以为任何脂质双分子层。合适的脂质双分子层包括但不限于，平面脂质双分子层，支撑双层或脂质体。脂质双分子层优选为平面脂质双分子层。合适的脂质双分子层在国际申请No.PCT/GB08/000563(公开为WO2008/102121)，国际申请No.PCT/GB08/004127(公开为WO2009/077734)和国际申请No.PCT/GB2006/001057(公开为WO2006/100484)中公开。
用于形成脂质双分子层的方法是本领域已知的。在实施例中公开了合适的方法。脂质双分子层通常由Montal和Mueller的方法形成(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,1972；69：3561-3566)，其中的脂质单分子层在穿过孔的任一侧负载在水溶液/空气界面上，所述孔垂直于所述界面。
Montal和Mueller的方法非常受欢迎，因为其成本经济并是一种相对迅速的形成具有良好质量的适合蛋白质孔嵌入的脂质双分子层的方法。形成脂质双分子层的其它常规方法包括尖浸渍(tipdipping)，涂覆双分子层(paintingbilayers)和膜片钳。
在优选的实施例中，形成脂质双分子层如国际申请No.PCT/GB08/004127(公开为WO2009/077734)中所描述。
在另一个优选的实施方案中，膜是固态层。固态层不是生物来源的。换句话说，固态层不是由生物环境获得或分离出的，所述生物环境例如生物体或细胞，或生物学上可获得结构的合成制造形式。固态层可以由有机材料和无机材料形成，包括但不限于，微电子材料，绝缘材料，例如Si3N4，Al2O3和SiO，有机和无机聚合物如聚酰胺，塑料如特氟隆或弹性体如双组分加成固化硅橡胶，以及玻璃。固态层可由单原子层例如石墨烯，或只有几个原子厚度的层形成。合适的石墨层在国际申请No.PCT/US2008/010637(公开为WO2009/035647)中公开。
实施该方法通常利用(i)包含孔的人工两性分子层；(ii)分离的，天然存在的包含孔的脂质双分子层，或(iii)含有孔嵌入其中的细胞。该方法通常使用人工两性分子层，如人工脂质双分子层实施。除了孔，该分子层可包含其他跨膜和/或膜内蛋白以及其他分子。合适的设备和条件在下面讨论。本发明的方法通常在体外实施。
目标多核苷酸优选连接到膜上。这可以使用任何已知的方法来完成。如果膜是两性分子层，如脂质双分子层(如在上面详细讨论的)，目标多核苷酸优选通过在所述膜中存在的多肽或通过在所述膜中存在的疏水锚被连接到该膜上。疏水锚优选脂质，脂肪酸，甾醇，碳纳米管或氨基酸。
目标多核苷酸可以直接连接到膜上。其可使用在国际申请No.PCT/GB2012/051191(公开为WO2012/164270)中公开的任何方式连接到膜上。目标多核苷酸优选通过连接体(linker)连接到膜上。优选的连接体包括但不限于，聚合物，如多核苷酸，聚乙二醇(PEGs)和多肽。如果目标多核苷酸直接连接到所述膜，由于该膜和所述孔和/或解旋酶之间的距离，导致表征不能进行到所述多核苷酸的末端，则将丢失一些数据。如果使用连接体，则该目标多核苷酸能够被表征完全。如果使用连接体时，可将连接体连接到目标多核苷酸的任何位置。连接体通常连接到目标多核苷酸的尾部聚合物处。
该连接可以是稳定的或暂时的。对于某些应用，该连接的暂时性的性质是是优选的。如果稳定的连接分子直接地连接到多核苷酸的5'末端或3'末端，则由于该膜和孔和/或解旋酶之间的距离，表征不能进行到多核苷酸的末端，则将会导致数据的丢失。如果连接是暂时性的，那么当连接的末端随机变成没有膜时，则多核苷酸能被表征完全。与膜形成稳定的或暂时性的连接的化学基团将在下文进行更详细的讨论。所述多核苷酸可以例如使用胆固醇或脂酰基链的脂质双分子层，暂时性的连接到两性分子层。可以使用任何具有6至30个碳原子长度的脂酰基链，例如棕榈酸。
在优选的实施例中，多核苷酸连接到两性分子层。将多核苷酸连接到合成的脂质双分子层之前已用各种不同的连接策略(tetheringstrategies)实施。这些策略总结于下方表2中。
表2
多核苷酸可以使用修饰的亚磷酰胺在合成反应中官能化，其更容易与添加的反应性基团如硫醇，胆固醇，脂质和生物素基团并存。这些不同的连接化学给予多核苷酸一系列连接选择。每个不同的修饰基团以稍微不同的方式连接到所述多核苷酸且连接并非总是持久的，所以给予多核苷酸到膜的不同的停留时间。暂时性连接的优点如上所述。
多核苷酸的连接也可以通过若干将反应性基团添加到所述多核苷酸的其他手段来实现。将反应性基团添加到DNA任一端之前已经被报道。硫醇基团可以使用多核苷酸激酶和ATPγS被添加到ssDNA的5'端(Grant,G.P.andP.Z.Qin(2007)."Afacilemethodforattachingnitroxidespinlabelsatthe5'terminusofnucleicacids."NucleicAcidsRes35(10):e77)。可使用末端转移酶添加更多选择的化学基团，例如生物素，硫醇和荧光团，以将修饰的寡核苷酸结合到ssDNA的3'端(Kumar,A.,P.Tchen,etal.(1988)."Nonradioactivelabelingofsyntheticoligonucleotideprobeswithterminaldeoxynucleotidyltransferase."Anal Biochem169(2):376-82)。
或者，反应性基团可以被认为是多核苷酸中到一个已经连接到膜的短区域，使得连接可以通过杂交来实现。该区域可能是多核苷酸的一部分，或者与其连接的区域。使用T4RNA连接酶I进行短片段ssDNA连接已经被报道(Troutt,A.B.,M.G.McHeyzer-Williams,etal.(1992)."Ligation-anchoredPCR:asimpleamplificationtechniquewithsingle-sidedspecificity."ProcNatlAcadSciUSA89(20):9823-5)。
最优选地，所述多核苷酸使用胆固醇标记的多核苷酸连接到膜，该胆固醇标记的多核苷酸与所述多核苷酸杂交。
跨膜孔优选跨膜蛋白孔。跨膜蛋白孔是多肽或允许水合离子例如分析物从膜的一侧流动到膜的另一侧的一系列多肽。在本发明中，跨膜蛋白孔能够形成允许通过施加的电势驱动的水合离子流从所述膜的一侧流动到另一侧的孔。跨膜蛋白孔优选允许分析物如核苷酸从膜如脂质双分子层的一侧流动到膜的另一侧。跨膜蛋白孔允许多核苷酸或核酸，如DNA或RNA，被移动穿过孔。
跨膜蛋白孔可以为单体或低聚物。所述孔优选由数个重复亚基，如6个，7个，8个或9个亚基组成。所述孔优选为六聚体，七聚体，八聚体或九聚体。
跨膜蛋白孔通常包括离子可以流动的桶状体或通道。孔的亚基通常围绕中心轴线并向跨膜β桶状体或通道或跨膜α螺旋束或通道提供链(strands)。
跨膜蛋白孔的桶状体或通道通常包括促进与分析物相互作用的氨基酸，所述分析物如核苷酸，多核苷酸或核酸。这些氨基酸优选位于所述桶状体或通道的缢痕附近。跨膜蛋白孔通常包括一个或多个带正电荷的氨基酸，例如精氨酸，赖氨酸或组氨酸，或芳香族氨基酸如酪氨酸或色氨酸。这些氨基酸通常促进孔与核苷酸，多核苷酸或核酸之间的相互作用。
根据本法明使用的跨膜蛋白孔可以衍生自β-桶状孔或α-螺旋束孔。β-桶状孔包括由β-链形成的桶状体或通道。合适的β-桶状孔包括但不限于，β-毒素例如溶血素，炭疽毒素和杀白细胞素，以及细菌的外膜蛋白/孔蛋白例如耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatis)孔蛋白(MSP)，例如MspA，MspB，MspC或MspD，胞溶素(lysening)，外膜孔蛋白F(OmpF)，外膜孔蛋白G(OmpG)，外膜磷脂酶A和奈瑟氏菌(Neisseria)自转运脂蛋白(NalP)。α-螺旋束孔包括由α-螺旋形成的桶状物或通道。合适的α-螺旋束孔包括但不限于，内膜蛋白和α外膜蛋白，例如WZA和ClyA毒素。跨膜孔可衍生自胞溶素。衍生自胞溶素的合适的跨膜孔如国际申请No.PCT/GB2013/050667(公开为WO2013/153359)中所公开的。跨膜孔可衍生自Msp或衍生自α-溶血素(α-HL)。
跨膜蛋白孔优选衍生自Msp，优选衍生自MspA。该孔为低聚的且通常包含衍生自Msp的7个，8个，9个或10个单体。孔可以是衍生自含相同单体的MsP的同源寡聚孔。或者，孔可以是衍生自含至少一个不同于其他的单体的Msp的异源寡聚孔。优选地，孔衍生自MspA或其同源物或并系同源物(paralog)。
衍生自Msp的单体通常包含如SEQIDNO：2或其变体的序列。SEQIDNO：2为MspA单体的MS-(B1)8突变体。其包括以下突变：D90N，D91N，D93N，D118R，D134R和E139K。SEQIDNO：2的变体是具有从SEQIDNO：2变化而来的氨基酸序列且保留了其形成孔的能力的多肽。可以使用本领域已知的任何方法测定变体形成孔的能力。例如，变体可以连同其他合适的亚基被插入到两性分子层，且可以确定其寡聚化形成孔的能力。将亚基插入膜例如两亲膜的方法是本领域已知的。例如，亚基可以以纯化的形式悬浮在含有脂质双分子层的溶液中，从而使其扩散到脂质双分子层并通过结合到脂质双分子层而插入，并组装成功能状态。或者，可以使用如M.A.Holden,H.Bayley.J.Am.Chem.Soc.2005,127,6502-6503和国际申请No.PCT/GB2006/001057(公开为WO2006/100484)中所描述的“拾取和放置”方法将亚基直接插入膜。
对于整个长度的SEQIDNO：2的氨基酸序列，基于氨基酸同一性，变体优选与该序列具有至少50％的序列同源性。更优选地，基于氨基酸同一性，变体与整个序列的SEQIDNO：2的氨基酸序列具有至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，更优选至少95％，97％或99％的同源性。在100或更多，例如125，150，175或200或更多的连续氨基酸长度上，具有至少为80％，例如至少85％，90％或95％的氨基酸同一性(严格同源性)。
本领域的标准方法可用于确定同源性。例如，UWGCG软件包提供BESTFIT程序，该程序可以用来计算同源性，例如在其默认设置使用(Devereuxetal(1984)NucleicAcidsResearch12,p387-395)。PILEUP和BLAST算法可以用来计算同源性或比对序列(例如鉴定等价残基或相应的序列(通常在它们的默认设置))，如AltschulS.F.(1993)JMolEvol36:290-300；Altschul,S.Fetal(1990)JMolBiol215:403-10中所描述的。公众可通过国家生物技术信息中心获得用于进行BLAST分析的软件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。
SEQIDNO：2是MspA单体的MS-(B1)8突变体。变体与MspA比较，可包括MspB，MspC或MspD单体中的任何突变。MspB，MspC和MspD的成熟形式在SEQIDNO：5至SEQIDNO：7中示出。特别地，变体可以包括存在于MspB中的下列取代:A138P。变体可以包括存在于MspC中的下列取代中的一个或多个:A96G,N102E和A138P。所述变体可包含存在于MspD中的下列突变中的一个或多个:G1缺失，L2V，E5Q，L8V，D13G，W21A，D22E，K47T，I49H，I68V，D91G，A96Q，N102D，S103T，V104I，S136K和G141A。所述变体可以包括来自MspB，MspC和MspD的突变体和取代物中的一个或多个的组合。变体优选包含突变L88N。SEQIDNO：2的变体具有突变L88N还具有MS-(B1)的所有突变，并被称为MS-(B2)8。在本发明中使用的孔优选MS-(B2)8。进一步优选的变体包括突变G75S/G77S/L88N/Q126R。SEQIDNO：2的变体具有突变G75S/G77S/L88N/Q126R还具有MS-(B1)8的所有突变，并被称为MS-(B2C)8。在本发明使用的孔优选MS-(B2)8或MS-(B2C)8。
除了以上讨论的，可对SEQIDNO：2的氨基酸序列进行氨基酸取代，例如高达1，2，3，4，5，10，20或30个氨基酸的取代。保守取代用相似化学结构，相似化学性质或相似侧链的体积的其他氨基酸替代氨基酸。引入的氨基酸可以与它们要替代的氨基酸具有相似的极性，亲水性，疏水性，碱性，酸性，中性或带电性。或者，所述保守取代可在预先存在的芳香族或脂肪族氨基酸的位置引入其他芳香族或脂肪族氨基酸。保守氨基酸的改变是本领域公知的，并且可以根据表3中所定义的20种主要氨基酸的特性进行选择。其中，氨基酸具有相似极性，该极性可以通过参考表4中的氨基酸侧链的亲水性值而确定。
表3-氨基酸的化学性质
Ala 脂肪族，疏水，中性 Met 疏水，中性
Cys 极性，疏水，中性 Asn 极性，亲水，中性
Asp 极性，亲水，带电荷(-) Pro 疏水，中性
Glu 极性，亲水，带电荷(-) Gln 极性，亲水，中性
Phe 芳香族，疏水，中性 Arg 极性，亲水，带电荷(+)
Gly 脂肪族，中性 Ser 极性，亲水性，中性
His 芳香族，极性，亲水性，带电荷(+) Thr 极性，亲水性，中性
Ile 脂肪族，疏水，中性 Val 脂肪族，疏水，中性
Lys 极性，亲水，带电荷(+) Trp 芳香族，疏水，中性
Leu 脂肪族，疏水，中性 Tyr 芳香族，极性，疏水
表4-亲水性大小
SEQIDNO：2的序列的一个或多个氨基酸残基可另外从上述多肽中缺失。可缺失高达1，2，3，4，5，10，20或30个或更多个氨基酸残基。
变体可包括SEQIDNO：2的片段。这些片段保持孔形成活性。片段可以至少为50，100，150或200个氨基酸长度。这类片段可用于产生孔。片段优选包含SEQIDNO：2的孔形成域。片段必须包含SEQIDNO：2的残基88、90、91、105、118和134之一。通常，片段包括SEQIDNO：2的所有残基88、90、91、105、118和134。
一个或多个氨基酸可以替代地或额外地添加到上述多肽中。可在SEQIDNO：2或多肽变体或其片段的氨基酸序列的氨基末端或羧基末端提供延伸。所述延伸可以很短，例如，1到10个氨基酸长度。或者，延伸可以更长，例如长达50或100个氨基酸。载体蛋白可以根据本发明被融合到氨基酸序列。其他融合蛋白在下文中更详细地讨论。
如上所讨论的，变体具有从SEQIDNO：2的氨基酸序列变化而来的氨基酸序列且保留其形成孔能力的多肽。变体通常包含负责孔形成的SEQIDNO：2的区域。包含β-桶状体的Msp的孔形成能力由每个亚基中的β-折叠(β-sheets)提供。SEQIDNO：2的变体通常包含SEQIDNO：2中形成β-折叠的的区域。可对SEQIDNO：2中形成β-折叠的区域进行一个或多个修饰，只要得到的变体保留了其形成孔的能力。SEQIDNO：2的变体优选地包括一个或多个修饰，如在α-螺旋和/或环状区域内取代，添加或缺失。
衍生自Msp的单体可以被修饰以辅助它们的鉴定或纯化，例如通过加入组氨酸残基(组氨酸标签)，天冬氨酸残基(天冬氨酸标签)，链亲和素标签或Flag标签，或通过加入信号序列以促进它们从细胞中分泌，该细胞中的多肽不天然地含有该信号序列。引入遗传标签的替换方式是通过化学反应将标签连到孔上天然的或人工位点。这方面的例子是将凝胶迁移试剂与人工连接在孔外的半胱氨酸进行反应。这已被证明是用于分离溶血素异源寡聚物的方法(ChemBiol.1997Jul；4(7):497-505)。
衍生自Msp的单体可以用可显示标记物进行标记。所述显示标记物可为任何使孔可被检测的合适的标记。合适的标记物如下所述。
衍生自Msp的单体也可以使用D-氨基酸生产。例如，衍生自Msp的单体可包含L-氨基酸和D-氨基酸的混合物。这是本领域中用于生产这类蛋白质或肽常规的。
衍生自Msp的单体含有一个或多个特异性修饰以促进核苷酸区别。衍生自Msp的单体也可以含有其它非特异性修饰，只要它们不干扰孔的形成。一些非特异性侧链修饰是本领域已知的，并可以对衍生自Msp的单体的侧链进行修饰。该修饰包括，例如，通过与醛反应然后用NaBH4还原进行氨基酸的还原性烷基化，用甲基乙酰亚胺酯(methylacetimidate)进行脒基化，或用乙酸酐进行酰化。
衍生自Msp的单体可以使用本领域中已知的标准方法来制备。衍生自Msp的单体可以通过合成或重组方式制成。例如，所述孔可通过体外翻译和转录(IVTT)合成。制造孔的合适的方法在国际申请Nos.PCT/GB09/001690(公开为WO2010/004273)，PCT/GB09/001679(公开为WO2010/004265)或PCT/GB10/000133(公开为WO2010/086603)中描述。讨论了将孔插入膜的方法。
跨膜蛋白孔还优选衍生自α-溶血素(α-HL)。野生型α-HL孔由7个相同的单体或亚基(即它是七聚体)形成。α-溶血素-NN的一个单体或亚基的序列示于SEQIDNO：4中。跨膜蛋白孔优选包括七个单体，每个包含SEQIDNO：4或其变体所示的序列。SEQIDNO：4的1，7至21，31至34，45至51，63至66，72，92至97，104至111，124至136，149至153，160至164，173至206，210至213，217，218，223至228，236至242，262至265，272至274，287至290和294位氨基酸形成环状区域。SEQIDNO：4的残基113和147形成α-HL的桶状体或通道的缢痕部分。
在该实施例中，本发明的方法优选使用包括7个蛋白质或单体，所述蛋白质或单体各自包含SEQIDNO：4或其变体所示的序列的孔。7个蛋白质可以是相同的(同源七聚体)或不同的(异源七聚体)。
SEQIDNO：4的变体是具有从SEQIDNO：4的氨基酸序列变化而来的氨基酸序列的蛋白质，并保留其形成孔能力。可以使用本领域已知的任何方法来测定变体形成孔的能力。例如，变体可以连同其他合适的亚基被插入到两性分子层如脂质双分子层，并可确定其寡聚形成孔的能力。将亚基插入两性分子层例如脂质双分子层的方法是本领域中已知的。合适的方法如上所述。
所述变体可以包括促进共价连接到解旋酶或与解旋酶作用的修饰。该变体优选地包括一个或多个反应性的半胱氨酸残基，以促进连接到解旋酶。例如，变体可包括在SEQIDNO：4的8，9，17，18，19，44，45，50，51，237，239和287位点中的一个或多个，和/或在氨基或羧基末端的半胱氨酸。优选的变体包含在SEQIDNO：4的8，9，17，237，239和287位残基用半胱氨酸进行取代(A8C，T9C，N17C，K237C，S239C或E287C)。所述变体优选为在国际申请No.PCT/GB09/001690(公开为WO2010/004273)，PCT/GB09/001679(公开为WO2010/004265)或PCT/GB10/000133(公布为WO2010/086603)中所描述的任何变体。
变体还可以包括任何能促进与核苷酸的相互作用的修饰。
所述变体可以是由生物体例如由葡萄球(Staphylococcus)菌天然表达的天然存在的变体。或者，变体可以体外表达或由细菌如大肠杆菌(Escherichiacoli)重组表达。变体还包括由重组技术产生的非天然存在的变体。在SEQIDNO：4整个长度的氨基酸序列上，基于氨基酸同一性，变体将优选与该序列具有至少50％的同源性。更优选地，基于氨基酸的相似性，相比于SEQIDNO：4的整个序列的氨基酸序列，变体多肽可与该序列具有至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，以及更优选至少95％，97％或99％的同源性。在200或或更长，例如230，250，270或280或更长长度的连续氨基酸上，可以具有至少80％，例如至少85％，90％或95％的氨基酸同一性(“严格同源性”)。同源性可以如上所讨论的来确定。
除了以上讨论的，可对SEQIDNO：4的氨基酸序列进行氨基酸取代，例如，高达1，2，3，4，5，10，20或30的取代。可以进行如上所讨论的保守取代。
SEQIDNO：4的氨基酸序列的一个或多个氨基酸残基可以额外地从上述多肽中缺失。可以缺失高达1，2，3，4，5，10，20或30个或更多个残基。
变体可以是SEQIDNO：4的片段。这些片段保留孔形成活性。片段可以为至少50，100，200或250个氨基酸长度。片段优选包含SEQIDNO：4的孔形成域。片段通常包括SEQIDNO：4的残基119，121，135，113和139。
一个或多个氨基酸可以替代地或额外地添加到上述多肽中。可在SEQIDNO：4或变体或其片段的氨基酸序列的氨基末端或羧基末端提供延伸。所述延伸可以很短，例如，1-10个氨基酸长度。或者，延伸可以更长，例如长达50或100个氨基酸。载体蛋白可以被融合到孔或变体。
如上所述，SEQIDNO：4的变体是具有与SEQIDNO：4的氨基酸序列不同的氨基酸序列的亚基，并且保留其形成孔能力。变体通常包含SEQIDNO：4的负责孔形成的区域。包含β-桶状体的α-HL的孔形成能力由每个亚基中的β-链提供。SEQIDNO：4的变体通常包括SEQIDNO：4的形成β-链的区域。SEQIDNO：4的形成β-链的氨基酸序列如上所讨论。可对SEQIDNO：4的形成β-链的区域进行一个或多个修饰，只要得到的变体保留了其形成孔的能力。可对SEQIDNO：4的β-链区域进行如上所述的特异性修饰。
SEQIDNO：4的变体优选包括一个或多个修饰，如在其α-螺旋和环状区域内取代，添加或缺失。形成α-螺旋和环的氨基酸如上所述。
所述变体可以被修饰以帮助对其进行如上所述的鉴定和纯化。
从α-HL衍生的孔可以参照自Msp衍生的孔进行讨论。
在一些实施例中，跨膜蛋白孔是化学修饰的。孔可以任何方式在任何位点进行化学修饰。所述跨膜蛋白孔优选通过下述进行化学修饰：将分子连接到一个或多个半胱氨酸(半胱氨酸键)，将分子连接到一个或多个赖氨酸，将分子连接到一个或多个非天然氨基酸，表位的酶修饰或末端的修饰。适用于进行这些修饰的方法是本领域已知的。跨膜蛋白孔可通过连接任何分子被化学修饰。例如，孔可以通过连接染料或荧光团被化学修饰。
孔中任何数量的单体可以被化学修饰。一个或多个，例如2，3，4，5，6，7，8，9或10个单体优选进行如上所述的化学修饰。
半胱氨酸残基的反应性可以通过相邻残基的修饰而增强。例如，侧翼精氨酸，组氨酸残基或赖氨酸残基的碱性基团将半胱氨酸硫醇基团的pKa改变为更大反应性的S-基团的pKa。半胱氨酸残基的反应性可通过硫醇保护基如dTNB得到保护。这些可在连接体连接之前与孔的一个或多个半胱氨酸残基反应。
所述分子(使用其对孔进行化学改性)可以直接地连接到孔或通过连接体连接到孔，如国际申请Nos.PCT/GB09/001690(公开为WO2010/004273)，PCT/GB09/001679(公布为WO2010/004265)或PCT/GB10/000133(公开为WO2010/086603)所公开的。
解旋酶可以共价结合到所述孔。解旋酶优选不共价结合到所述孔。
本文所描述的任何蛋白质可以被修饰以帮助它们的鉴定和纯化，例如通过加入组氨酸残基(His标签)，天冬氨酸残基(asp标签)，链亲和素标签，或Flag标签，SUMO标签，GST标签或MBP标签，或通过加入信号序列以促进它们从细胞中分泌，该细胞中的多肽不天然地含有该信号序列。引入遗传标签的替换方式是通过化学反应将标签连到解旋酶或孔上天然或人工位点。这方面的例子是将凝胶迁移试剂与人工连接在所述孔外的的半胱氨酸反应。这已被证明是用于分离溶血素异源寡聚物的方法(ChemBiol.1997Jul；4(7):497-505)。
目标多核苷酸，解旋酶或孔可以用显示标记物标记。所述显示标记物可以是可被检测的任何合适的标记物。合适的标记物包括，但不限于，荧光分子，放射性同位素，例如125I，35S，酶，抗体，抗原，多核苷酸和配体例如生物素。
蛋白质可以通过人工合成或重组手段制备。例如，蛋白质可通过体外翻译和转录(IVTT)合成。该蛋白质的氨基酸序列可以被修饰为包括非天然存在的氨基酸或被修饰以提高蛋白质的稳定性。当通过合成手段制备蛋白质时，可以在制备过程引入所述氨基酸蛋白质也可随合成或重组生产被改变。
蛋白质还可以使用D-氨基酸生产。例如，孔或解旋酶可包含L-氨基酸和D-氨基酸的混合物。这是本领域中用于生产这类蛋白质或肽常规的。
本发明中使用的蛋白质还可以包含其他非特异性修饰，只要它们不干扰蛋白质的功能。一些非特异性侧链修饰是本领域中已知的，并且可以对蛋白质的侧链进行修饰。这样的修饰包括，例如，通过与醛反应然后用NaBH4还原进行氨基酸的还原性烷基化，用甲基乙酰亚胺酯进行的脒基化，或用乙酸酐进行的酰化。
可以使用本领域的标准方法衍生和复制编码蛋白质的多核苷酸序列。可以使用本领域的标准技术在细菌宿主细胞中表达编码蛋白质的多核苷酸序列。该蛋白质可在细胞中由重组表达载体原位表达多核苷酸而产生。所述表达载体可选地携带诱导型启动子以控制所述多肽的表达。这些方法在Sambrook,J.和Russell,D.(2001)。分子克隆:实验手册，第3版。冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约(MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rdEdition.ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY)中描述。
编码目的序列的基因可以使用包含特异性引物的PCR来扩增。扩增序列可以随后被导入到重组的可复制载体例如克隆载体中。该载体可用于在相容的宿主细胞中复制多核苷酸。因此，可以通过将编码目的序列的多核苷酸引入可复制载体，将该载体引入相容的宿主细胞，并在引起载体复制的条件下培育宿主细胞来制备多核苷酸序列。载体可以从宿主细胞中回收。用于多核苷酸克隆的合适的宿主细胞是本领域已知的，并且在下面更详细描述。
多核苷酸序列可以被克隆到合适的表达载体中。在表达载体中，所述多核苷酸序列通常可操作地连接到控制序列，该控制序列能够提供由宿主细胞对编码序列的表达。这种表达载体可用于表达构建体。
术语“可操作地连接”是指并置(juxtaposition)，其中所述组分处于允许它们以其预期方式发挥功能的关系。控制序列“可操作地连接”到编码序列指的是，使得在与控制序列相容的条件下，可以实现编码序列的表达的连接方式。相同或不同的多核苷酸的多个复制可以被引入到载体中。
表达载体然后可以被引入到合适的宿主细胞。因此，可以通过将编码构建体的多核苷酸插入表达载体，将该载体引入到相容的细菌宿主细胞，并在引起多核苷酸序列表达的条件下培育宿主细胞，而产生构建体。
该载体可以为例如质粒，病毒或噬菌体载体，提供复制的起点，可选地用于所述多核苷酸序列表达的启动子，以及可选的启动子的调控因子。所述载体可含有一个或多个选择性标记基因，例如氨苄青霉素抗性基因。启动子和其它表达调节信号可以选择与宿主细胞相容，所述表达载体针对该宿主细胞而设计。通常使用T7，trc，lac，ara或λL启动子。
所述宿主细胞通常以较高的水平表达构建体。选择用多核苷酸序列转化的宿主细胞与用于转化所述细胞的表达载体相容。所述宿主细胞通常是细菌，优选大肠杆菌。具有λDE3溶素原的任何细胞，例如Rosetta2(DE3)pLys，C41(DE3)，BL21(DE3)，JM109(DE3)，B834(DE3)，TUNER，Origami和OrigamiB，可以表达包含T7启动子的载体。
蛋白质可以从制备蛋白质的生物体或在重组表达后，通过任何蛋白质液相色谱系统进行纯化，而大规模制备。通常的蛋白质液相色谱系统包括FPLC、AKTA系统、Bio-Cad系统、Bio-RadBioLogic系统和GilsonHPLC的系统。
本发明的方法包括测量所述目标多核苷酸的一个或多个特征。该方法可以包括测量2个，3个，4个，5个或更多个目标多核苷酸的特征。所述一个或多个特征，优选选自(i)目标多核苷酸的长度，(ii)所述目标多核苷酸的同一性，(iii)所述目标多核苷酸的序列，(iv)所述目标多核苷酸的二级结构；以及(v)目标多核苷酸是否是经修饰的。(i)至(v)的任何组合可以根据本发明进行测量。
对于(i)，多核苷酸的长度例如可以通过确定所述目标多核苷酸和所述孔的相互作用数量，以及目标多核苷酸与所述孔相互作用之间的持续时间来测定。
对于(ii)，所述多核苷酸的同一性可以通过多种方式测定。多核苷酸的同一性可以联合目标多核苷酸的序列的测定，或不联合目标多核苷酸的序列的测定进行测定。前者是直接的；对所述多核苷酸进行测序，并由此进行鉴定。后者可以以几种方式来完成。例如，可以测定多核苷酸中特定模序的存在(而无需测定该多核苷酸的其余序列)。或者，方法中测定的特定的电和/或光信号可鉴定来自特定来源的目标多核苷酸。
对于(iii)，多核苷酸的序列可以如前所述确定。合适的测序方法，特别是那些使用电测量的方法，描述于StoddartDetal.,ProcNatlAcadSci,12；106(19):7702-7,LiebermanKRetal,JAmChemSoc.2010；132(50):17961-72,和国际申请WO2000/28312中。
对于(iv)，所述二级结构可以以多种方式测量。例如，如果该方法包含电测量，二级结构可以利用穿过孔的停留时间的改变或电流变化进行测量。这使得单链和双链多核苷酸的区域能够得到识别。
对于(v)，可以测定任何存在或不存在修饰。该方法优选包括确定所述目标多核苷酸是否通过甲基化，氧化，损伤，用一个或多个蛋白质或一个或多个标记物，标签或间隔区进行了修饰。特异性修饰将导致与孔的特异性相互作用，其可以使用下面描述的方法来测定。例如，可以基于孔与每个核苷酸的相互作用过程中穿过孔的电流，识别胞嘧啶与甲基化的胞嘧啶。
可进行各种不同类型的测量。这包括但不限于：电测量和光测量。可行的电测量包括：电流测量，阻抗测量，测量隧道(IvanovAP等人,NanoLett.2011Jan12；11(1):279-85)，以及FET测量(国际申请WO2005/124888)。光测量可以与电测量结合使用(SoniGV等人,RevSciInstrum.2010Jan；81(1):014301)。所述测量可以是跨膜电流测量例如流经所述孔的离子电流的测量。
电测量可如StoddartD等人,ProcNatlAcadSci,12；106(19):7702-7,LiebermanKR等人,JAmChemSoc.2010；132(50):17961-72,和国际申请WO-2000/28312所描述的使用标准单声道记录设备进行。或者，电测量可以使用多通道系统进行，例如如在国际申请WO-2009/077734和国际申请WO-2011/067559中所描述的。
所述方法可以使用任何适于研究膜/孔系统(其中孔嵌入膜中)的设备进行实施，该方法可以使用适合于感测跨膜孔的设备实施。例如，所述设备包括一个室，所述室包括水溶液和将该室分割为两部分的屏障(barrier)。所述屏障通常具有缝隙，其中在缝隙中形成包括孔的膜。或者由该屏障形成其中存在孔的膜。
该方法可以使用在国际申请No.PCT/GB08/000562(WO2008/102120)中描述的设备实施。
该方法可以包括随着多核苷酸相对于所述孔移动，测量通过所述孔的电流。因此该装置也可以包括能够跨膜和孔施加电势并测量电流信号的电路。该方法可以使用膜片钳或电压钳实施。所述方法优选包含使用电压钳。
本发明的方法可以包含随着多核苷酸相对于孔移动，测量通过孔的电流。用于测量通过跨膜蛋白孔的离子电流的合适的条件是本领域已知的，并且在实施例中公开。该方法通过跨膜和孔施加的电压进行实施。使用的电压通常为+2V到-2V，通常-400mV到400mV。所使用的电压优选在具有以下下限和上限的范围内，所述下限的选自在-400mV，-300mV，-200mV，-150mV，-100mV，-50mV，-20mV和0mV的范围内，所述上限独立地选自+10mV，+20mV，+50mV，+100mV，+150mV，+200mV，+300mV，+400mV。所用的电压更优选在100mV到240mV的范围内并最优选在120mV到220mV的范围内。可通过对孔施加提高的电势来提高对不同核苷酸的分辨力。
该方法通常在任何载荷子，如金属盐，例如碱金属盐，卤盐，例如氯盐，如碱金属氯盐的存在下实施。载荷子可包括离子型液体或有机盐，例如四甲基氯化铵，三甲基氯化铵，氯化苯甲基铵，或1-乙基-3-甲基咪唑鎓氯化物。在上面讨论的示例性设备中，所述盐存在于所述室中的水溶液中。通常使用氯化钾(KCl),氯化钠(NaCl)或氯化铯(CsCl)或亚铁氰化钾和铁氰化钾的混合物。优选氯化钾，氯化钠和亚铁氰化钾和铁氰化钾的混合物。盐浓度可为饱和的。盐浓度可以是3M或更低，通常为0.1M至2.5M，0.3M至1.9M，0.5M至1.8M，0.7M至1.7M，0.9M至1.6M或1M至1.4M。优选盐浓度为150mM到1M。Hel308，XPD，RecD，TraI和Dda解旋酶出乎意料的能在高的盐浓度下工作。所述方法优选使用至少为0.3M，例如至少为0.4M，至少为0.5M，至少为0.6M，至少为0.8M，至少为1.0M，至少为1.5M，至少为2.0M，至少为2.5M，或者至少为3.0M的盐浓度进行实施。高盐浓度提供了高信噪比，比并使得在正常电流波动的背景下，代表核苷酸存在的电流能被识别。
该方法通常在缓冲剂存在下实施。在上面讨论的示例性设备中，缓冲剂存在所述室的水溶液中。本发明的方法可使用任何缓冲剂。通常地，缓冲剂是磷酸盐缓冲液。其他合适的缓冲剂是HEPES和Tris-HCl缓冲剂。该方法通常在pH值为4.0至12.0，4.5至10.0，5.0至9.0，5.5至8.8，6.0至8.7，7.0至8.8，或7.5至8.5下实施。所使用的pH优选约为7.5。
该方法可在0至100℃，15℃至95℃，16℃至90℃，17℃至85℃，18℃至80℃，19℃至70℃，或20℃至60℃下实施。该方法通常在室温下进行。该方法可选地在支持解旋酶功能的温度下，例如约37℃实施。
该方法可以在游离核苷酸或游离核苷酸类似物和/或辅助解旋酶功能发挥的辅助因子存在下实施。该方法也可以在游离核苷酸或游离核苷酸类似物不存在且解旋酶的辅助因子不存在下实施。所述游离核苷酸可以为如上面讨论的单个核苷酸的任意一个或多个。游离核苷酸包括，但不限于，单磷酸腺苷(AMP)，二磷酸腺苷(ADP)，三磷酸腺苷(ATP)，单磷酸鸟苷(GMP)，二磷酸鸟苷(GDP)，三磷酸鸟苷(GTP)，单磷酸胸苷(TMP)，二磷酸胸苷(TDP)，三磷酸胸苷(TTP)，单磷酸尿苷(UMP)，二磷酸尿苷(UDP)，三磷酸尿苷(UTP)，单磷酸胞苷(CMP)，二磷酸胞苷(CDP)，三磷酸胞苷(CTP)，环磷酸腺苷(cAMP)，环单磷酸鸟苷(cGMP)，脱氧单磷酸腺苷(dAMP)，脱氧二磷酸腺苷(DADP)，脱氧三磷酸腺苷(dATP)，脱氧单磷酸鸟苷(dGMP)，脱氧二磷酸鸟苷(dGDP)，脱氧三磷酸鸟苷(dGTP)，脱氧单磷酸胸苷(dTMP)，脱氧二磷酸胸苷(dTDP)，脱氧三磷酸胸苷(dTTP)，脱氧二磷酸尿苷(dUMP)，脱氧二磷酸尿苷(dUDP)，脱氧三磷酸尿苷(dUTP)，脱氧单磷酸胞苷(dCMP)，脱氧二磷酸胞苷(dCDP)和脱氧三磷酸胞苷(dCTP)。该游离核苷酸优选选自AMP，TMP，GMP，CMP，UMP，dAMP，dTMP，dGMP或dCMP。该游离核苷酸优选三磷酸腺苷(ATP)。解旋酶辅助因子是使解旋酶或构建体发挥功能的因子。解旋酶辅助因子优选为二价金属阳离子。所述二价金属阳离子优选为Mg2+，Mn2+，Ca2+或Co2+。解旋酶辅助因子最优选Mg2+。
控制在目标多核苷酸上装载一个或多个解旋酶的方法
本发明还提供了控制一个或多个解旋酶在目标多核苷酸上装载的方法。该方法包括提供具有一个或多个间隔区的目标多核苷酸。该方法优选地包括修饰所述目标多核苷酸，使得它包括一个或多个间隔区。所有以上讨论的间隔区例子等同地适用于该方法。
该方法还包括将目标多核苷酸与一个或多个解旋酶接触，使得所述一个或多个解旋酶结合到目标多核苷酸且一个或多个解旋酶停滞在每个间隔区上。可以如上所述测定解旋酶在间隔区上的停滞。
目标多核苷酸可以如上所述包括任何数量的间隔区。目标多核苷酸优选地包括两个或更多个间隔区，如3，4，5，6，7，8，9，10个或更多个间隔区。任何数量的解旋酶的可以如上所述在每个间隔区处停滞。以这种方式，可以控制解旋酶在目标多核苷酸装载的位置和数量，由此帮助目标多核苷酸的表征。可使用上面讨论的任何方法将一个或多个解旋酶移动穿过一个或多个间隔区。
目标多核苷酸优选具有一个或多个间隔区S以及一个或多个单链区域或一个或多个非杂交区域L(L用于装载位置)。每个区域L的长度取决于要结合到每个L的和要在每个间隔区S处停滞的解旋酶的数量。一个或多个间隔区S和一个或多个区域L可以相互邻接(即毗邻)或通过目标多核苷酸的一部分隔开。每个间隔区通常位于或靠近每个区域L的末端，该末端为解旋酶朝着其移动的末端。例如，如果解旋酶是5'至3'解旋酶，每个间隔区通常位于或靠近每个区域的3'端，即5'-L-S-3'的3'端。如果解旋酶是3'至5'解旋酶，每个间隔区通常位于或靠近每个区域的5'端，即5'-S-L-3'的5'端。
目标多核苷酸优选具有5'至3'方向的(L-S)n或(S-L)n，其中L是单链多核苷酸或非杂交的多核苷酸，S是间隔区，n是整数，如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或更多。n优选1，2，3或4。所述5'至3'的方向针对目标多核苷酸。
目标多核苷酸优选具有一个或多个单链区域或一个或多个非杂交区域L，每个局域具有位于或邻近任一端的间隔区S，即具有(S-L-S)n。
在优选的实施例中，间隔区如上所述接近双链区域D，即5'-L-S-D-3'对应5'至3'解旋酶或以非活动模式使用的解旋酶，5'-D-S-L-3'对应3'至5'解旋酶或以非活动模式使用的解旋酶。目标多核苷酸优选地具有5'至3'方向上的(L-S-D)n或(D-S-L)n，其中L是单链多核苷酸或非杂交的多核苷酸，S是间隔区，D是双链多核苷酸，并且n是整数，如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或更多。n优选1，2，3或4。L可以是与D为相同种类的多核苷酸，也可以是与D不同种类的多核苷酸。L和/或D可以是与目标多核苷酸相同种类的多核苷酸或可以是与所述目标多核苷酸不同种类的多核苷酸。
在优选的实施例中，阻断分子B提供在各自间隔区的末端处，该末端是与一个或多个解旋酶要移动穿过的末端相反的一端，即5'-B-L-S-3'对应5'至3'解旋酶或以非活动模式使用的解旋酶，或5'-S-L-B-3'对应3'至5'解旋酶。目标多核苷酸最优选具有5'至3'方向的(B-L-S)n或(S-L-B)n，其中L是单链多核苷酸或非杂交的多核苷酸，S是间隔区，B是阻断分子并且n是整数，如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或更多。n优选1，2，3或4。
在最优选的实施例中，目标多核苷酸上同时具有D和B，即5'-B-L-S-D-3'对应5'到3'解旋酶或以非活动模式使用的解旋酶，或5'-D-S-L-B-3'对应3'至5'解旋酶。目标多核苷酸是最优选具有5'至3'方向的(B-L-S-D)n或(D-S-L-B)n，其中L是单链多核苷酸或非杂交的多核苷酸，S是间隔区，B是阻断分子，D是双链多核苷酸，n是整数，如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或更多。n优选1，2，3或4。
目标多核苷酸可以具有任何数量的这些含间隔区的单元。例如，目标多核苷酸可具有(5'-L-S-3')n，(5'-S-L-3')n，(S-L-S)n，(5'-L-S-D-3')n，(5'-D-S-L-3')n，(5'-B-L-S-3')n，(5'-S-L-B-3')n，(5'-B-L-S-D-3')n或(5'-D-S-L-B-3')n，其中n为2或以上时，如3，4，5，6，7，8，9，10或更多。这样的实施例允许在目标多核苷酸上停滞多个解旋酶。
通过在目标多核苷酸上连接本发明的适配器，可以提供具有以上所有实施例讨论的L，S，D和B的目标多核苷酸。
在优选的实施例中，目标多核苷酸与一个或多个解旋酶接触，使得一个解旋酶(即只有一个解旋酶)在每个间隔区上停滞。这可以通过提供具有一个或多个间隔区S以及一个或多个单链区域或一个或多个非杂交区域L1，并且各区域仅对结合一个解旋酶是足够长的目标多核苷酸而实现。目标多核苷酸优选地具有5'至3'的方向的(L1-S)n或(S-L1)n，其中L1是单链多核苷酸或非杂交多核苷酸，其仅对于结合一个解旋酶是足够长的，S是间隔区，n是整数，如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或更多。n优选1，2，3或4。
区域L1的长度取决于解旋酶的足迹，并且可以直接计算。区域L1可以是目标多核苷酸的一部分，或者可以被添加到目标多核苷酸，例如作为本发明的适配器的一部分。区域L1通常为8，9，10，12，13，14或15个核苷酸长度。一个或多个间隔区S和一个或多个L1区域可以是彼此相邻的(即毗邻)或者可通过目标多核苷酸的一部分被隔开。每个间隔区S通常位于或靠近每个区域L1末端，该末端为解旋酶朝着其移动的末端。例如，如果解旋酶是5'到3'解旋酶，每个间隔区S通常位于或靠近每个区域L1的3'末端，即5'-L1-S-3'的3'末端。如果解旋酶是3'至5'解旋酶，每个间隔区S通常位于或靠近各自区域L1的5'末端，即5'-S-L1-3'的5'末端。目标多核苷酸优选具有一个或多个单链区域或一个或多个非杂交区域L1，各区域仅对结合一个解旋酶是足够长的，且在位于或靠近每个区域的任一端具有间隔区S，即(S-L1-S)n。
目标多核苷酸可以具有(5'-L1-S-3')n，(5'-S-L1-3')n，(S-L1-S)n，(5'-L1-S-D-3')n，(5'-D-S-L1-3')n，(5'-B-L1-S-3')n，(5'-S-L1-B-3')n，(5'-B-L1-S-D-3')n或(5'-D-S-L1-B-3')n，其中n是整数，如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10个或更多个。n优选1，2，3或4。该实施例允许在目标多核苷酸上停滞n个解旋酶。每个间隔区停滞一个解旋酶。
在另一个优选的实施例中，目标多核苷酸与一个或多个解旋酶接触，使得两个解旋酶(即只有两个解旋酶)在每个间隔区上停滞。这可以通过提供具有一个或多个间隔区S以及一个或多个单链区域或一个或多个非杂交区域L2并且每个区域仅对于结合两个解旋酶是足够长的目标多核苷酸而实现。目标多核苷酸优选地具有5'至3'的方向的(L2-S)n或(S-L2)n，其中L是单链多核苷酸或非杂交多核苷酸，其仅对于结合两个解旋酶是足够长的，S是间隔区，n是整数，如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或更多。n优选1，2，3或4。
区域L2的长度取决于解旋酶的足迹，并且可以直接计算。区域L2可以是目标多核苷酸的一部分，或者可以被添加到目标多核苷酸，例如作为本发明的适配器的一部分。区域L2通常是16，17，18，19，20，21或22个核苷酸长度。一个或多个间隔区S以及一个或多个区域L2可以彼此邻近(即毗邻)，或者可以由多核苷酸的一部分被隔开。每个间隔区通常位于或靠近每个区域的末端，该末端为解旋酶朝着其移动的末端。例如，如果解旋酶是5'到3'解旋酶，每个间隔区通常位于或靠近每个区域的3'末端。所述多核苷酸优选具有一个或多个单链区域或者一个或多个非杂交区域L2，每个区域对结合两个解旋酶是足够长的，且在位于或靠近每个区域的任一端具有间隔区S，即(S-L2-S)n。
目标多核苷酸可以具有(5'-L2-S-3')n，(5'-S-L2-3')n，(S-L2-S)n，(5'-L2-S-D-3')n，(5'-D-S-L2-3')n，(5'-B-L2-S-3')n，(5'-S-L2-B-3')n，(5'-B-L2–S-D-3')n或(5'-D-S-L2-B-3')n，其中n是一个整数，如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10个或更多。n优选1，2，3或4。这种实施例允许在目标多核苷酸上停滞2n解旋酶。每个间隔区上停滞两个解旋酶。
在每个间隔区处停滞的两个解旋酶优选彼此不同的。这可以以多种方式来控制。例如，两个不同的解旋酶可以相互连接，例如共价相互连接，然后在每个间隔区处停滞。合适的构建体如上所述。或者，也可以使用阻断多核苷酸，以确保每个间隔区停滞不同的解旋酶。如果该方法包括提供具有一个或多个间隔区S以及一个或多个单链区域或一个或多个非杂交区域L2，每个区域仅对结合两个解旋酶是足够长的的目标多核苷酸，该方法优选包括将阻断(blocking)多核苷酸杂交到每个区域L2的一部分，使得每个区域的其余(即非阻断)的部分仅对结合一个解旋酶是足够长的。阻断多核苷酸通常为2，3，4，5，6，7或8个核苷酸的长度。阻断多核苷酸防止两个解旋酶同时结合到同一区域。包含阻断多核苷酸的多核苷酸优选与一个或多个解旋酶接触，使得一个解旋酶结合到每个区域L2的其余(即非阻断的)部分。每个解旋酶然后可以用来除去每个阻断多核苷酸。一个或多个结合的解旋酶优选地具有游离核苷酸和解旋酶辅因子，使得它们除去每个阻断多核苷酸并在每个间隔区S上停滞。以这种方式产生的多核苷酸，然后优选与一个或多个解旋酶接触，该解旋酶与先前在方法使用的解旋酶是不同的，使得一个不同的解旋酶结合到每个区域，并通过间隔区和其它停滞的解旋酶而停滞。
该方法优选包括(a)提供具有5'至3'的方向的(L2-S)n或(S-L2)n的目标多核苷酸，其中L是单链多核苷酸或非杂交多核苷酸，其仅对于结合两个解旋酶是足够长的，S是间隔区，n是整数，如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或更多；(b)将阻断多核苷酸到每个区域L2的部分，使得每个区域L2的剩余部分仅对结合一个解旋酶是足够长的；(c)将在(b)中产生目标多核苷酸与一个或多个解旋酶接触，使得一个解旋酶结合到每个区域L2中的剩余部分；(d)向(c)中的一个或多个结合的解旋酶提供游离核苷酸和解旋酶辅因子，使得它们除去每个阻断多核苷酸并且停滞在每个间隔区S上；以及(e)将(d)中产生的目标多核苷酸与一个或多个解旋酶接触，该每个解旋酶不同于在(c)中使用的那些解旋酶，使得一个不同的解旋酶结合到每个区域L2并且由每间隔区和每个解旋酶停滞在(d)中。n优选1，2，3或4。S和L2的其它设置，如上面讨论的(S-L2-S)n，(5'-L2-S-D-3')n，(5'-D-S-L2-3')n，(5'-B-L2-S-3')n，(5'-S-L2-B-3')，(5'-B-L2-S-D-3')n和(5'-D-S-L2-B-3')n也可用于本实施例。
如上所讨论的，间隔区的长度可以用于控制被停滞的解旋酶的数量，和/或被移动穿过间隔区的解旋酶的数量。较长的间隔区可以用于停滞更多解旋酶。两个或更多个例如3，4或5个解旋酶串也可以移动穿过较长的间隔区，因为尾部解旋酶可推动前端(leading)解旋酶穿过间隔区。涉及上述L1和L2的的实施例也可以被修改，使得每个间隔区上停滞3，4或5个解旋酶。例如，可以提供具有一个或多个间隔区S以及一个或多个单链区域或一个或多个非杂交区域，每个区域仅对于结合3个(L3)，4个(L4)或5个(L5)解旋酶是足够长的多核苷酸。
适配器
本发明还提供了用于控制目标多核苷酸的移动的适配器。该适配器优选用于表征目标多核苷酸。该适配器包括：(a)5'至3'方向的(LSD)n或(DSL)n，其中L是单链多核苷酸或非杂交的多核苷酸，S是间隔区，D是双链多核苷酸并且其中n是整数，如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或更多，以及(b)在每个适配器上停滞的一个或多个解旋酶。n优选1，2，3或4。5'至3'的方向是指适配器中的L和D多核苷酸的方向。
所述一个或多个解旋酶可以在间隔区S之前停滞，可以停滞到间隔区S，或停滞在间隔区S上。
适配器可以连接到目标多核苷酸，使得目标多核苷酸可以在上述讨论的任何方法中使用。
L可以为上述讨论的L1或L2。适配器可包括L1和L2的组合。
所有上述讨论的间隔区的实施例等同地适用于该方法。
上述讨论的任何涉及L，S和D的实施例同样适用于本发明的适配器。该适配器可包括5'至3'方向的(5'-L1-S-D-3')n，(5'-D-S-L1-3')n，(5'-B-L1-S-D-3')n或(5'-D-S-L1-B-3')n，(5'-L2-S-D-3')n，(5'-D-S-L2-3')n，(5'-B-L2-S-D-3')n或(5'-D-S-L2-B-3')n，其中n是整数，如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或更多。n优选1，2，3或4。L1或L2可以被替换为L3，L4或L5。
最优选n是1并且在一个适配器上停滞一个或两个解旋酶。
试剂盒
本发明还提供了一种控制目标多核苷酸移动的试剂盒。所述试剂盒优选用于表征目标多核苷酸。所述试剂盒包括(a)一个或多个间隔区，(b)一个或多个解旋酶；以及(c)跨膜孔。参考本发明的方法，上述所讨论的所有间隔区实施例同样适用于本发明的试剂盒。例如，一个或多个间隔区可以是多核苷酸适配器，优选单链多核苷酸适配器的一部分，其可以被连接到目标多核苷酸，且包括优先旋入孔中的前导序列。所述试剂盒可包括上面讨论的任何解旋酶和孔。
所述一个或多个间隔区和所述一个或多个解旋酶可以是本发明的适配器的一部分。
所述试剂盒还可以包括膜的成分，如形成两性分子层需要的磷脂如脂质双分子层。
本发明的试剂盒可以另外包含使得上述提及的任何实施例能够实施的一个或多个其它试剂或仪器。这类试剂或仪器包括以下试剂或仪器中的一个或多个：合适的缓冲液(水溶液)，从受体(subject)中得到样品的工具(例如包含针的容器或仪器)，扩增和/或表达多核苷酸的工具，上文定义的膜或压力钳或膜片钳装置。试剂在试剂盒中可以干燥状态存在，使得流体样品重新悬浮试剂。所述试剂盒还可，可选地，包括使本发明的方法中如何使用试剂盒的说明书，或者该方法可用于何种患者的详细信息。所述试剂盒可选地包括促进解旋酶移动的必要的组分(例如ATP和Mg2+)。下列实施例说明本发明。
实施例
实施例1
本实施例描述T4Dda-E94C/A360C(SEQIDNO：8，具有突变E94C/A360C，然后(ΔM1)G1G2)解旋酶如何控制完整DNA链的移动穿过单个MspA纳米孔(MS(B1-G75S/G77S/L88N/Q126R)8(MspA-B2C)(具有突变G75S/G77S/L88N/Q126R的SEQIDNO：2)。λDNA构建体(SEQIDNO：9在其3'末端连接4个iSpC3间隔区，该4个iSpC3间隔区连接到SEQIDNO：10的5'末端，SEQIDNO：10的5'末端连接到SEQIDNO：11的3'末端连接的3个iSpC间隔区，该构建体的SEQIDNO：10区域与SEQIDNO：12杂交(SEQIDNO：12在其3'末端连接6个iSp18间隔区，该iSp18间隔区连接到2个胸腺嘧啶残基和3'胆固醇TEG)中的iSpC3间隔区用于停滞酶直到所述构建体被纳米孔捕获。一旦捕获施加的电势的力，酶T4Dda-E94C/A360C被移动穿过其停滞的间隔区，并使受酶控制的λDNA构建移动穿过纳米孔。
材料和方法
建立实验前，λDNA构建体(SEQIDNO：9在其3'端连接4个iSpC3间隔区，该4个iSpC3间隔区连接到SEQIDNO：10的5'末端，SEQIDNO：10在其3'末端连接到SEQIDNO：11，该构建体的SEQIDNO：10区域与SEQIDNO：12(其具有3'胆固醇连接)杂交，和T4Dda-E94C/A360C一起在23℃的缓冲液(20mMCAPS，pH值10.0，500mM氯化钠，5％甘油，2mMDTT)中预培育15分钟。
在20℃(通过将实验系统放置在冷却器板上)由在缓冲液(600mM氯化钾，25mM磷酸钾，75mM亚铁(II)氰化钾，25mM铁(III)氰化钾，pH8)中，插入嵌段共聚物的单一MspA纳米孔(MspA-B2C)获得电测量值。实现单一的孔插入嵌段共聚物后，使缓冲液(1mL，600mM氯化钾，25mM磷酸钾，75mM亚铁(II)氰化钾，25mM铁(III)氰化钾，pH8)流过该系统中以除去任何过量的MspA纳米孔(MspA-B2C)且最后试验缓冲液流入系统(2mL960mM氯化钾，25mM磷酸钾，3mM亚铁(II)氰化钾，1mM铁(III)氰化钾，pH8)中。氯化镁(10mM的最终浓度)和ATP(1mM的最终浓度)与缓冲液(960mM氯化钾，25mM磷酸钾，3mM亚铁(II)氰化钾，1mM铁(III)氰化钾，pH8)混合在一起，然后加入到λDNA构建体(0.2nM的最终浓度)，T4-Dda-E94C/A360C(10nM的最终浓度)缓冲液(20mMCAPS，pH10.0，500mM氯化钠，5％甘油，2mMDTT)预混合。预混物然后加入到单个纳米孔的实验系统。实验进行了四个小时后进行电势翻转过程(在cis侧施加+100mV2秒，然后0V2秒，然后-120mV14500秒)并监测了解旋酶控制的DNA的移动。
结果与讨论
图1中示出该DNA构建体。当与该DNA构建体预培养时，T4Dda-E94C/A360C能够结合到构建体的标记为A(SEQIDNO：9)的区域。然而，当在游离溶液中时，酶不能驱动穿过停滞的基团(图1中标记为B和D)。因此，该酶停滞在iSpC3间隔区(图1中标记为B)直到该DNA构建体由纳米孔捕获。一旦被纳米孔捕获，施加的电势的力将酶T4Dda-E94C/A360C穿过停滞间隔区并使由酶控制的λDNA构建体移动穿过纳米孔。解旋酶控制的DNA移动的例子示于图2中。解旋酶控制DNA的移动为5170秒长且对应约为30kB的λ构建体穿过纳米孔的易位。图3显示了解旋酶控制的DNA移动的放大的开始区域(a)和结束区域(b)，1和2示出解旋酶的控制下的iSpC3间隔区易位穿过纳米孔。
实施例2
本实施例中所用的DNA构建体是使用MuA使λDNA片段化为5-10kB的片段制成的。由样品制备产生的所述片段，然后由解旋酶控制它们移动穿过纳米孔。在跨纳米孔施加的电势的力驱动下解旋酶移动穿过dsDNA区域(其中，连接物与构建体杂交)和间隔区。观察到由解旋酶控制的标记物移动穿过纳米孔而产生的特征性的区块(blocks)表明样品制备过程是成功的，并且如图4(b)中所示该酶已停滞。这意味着酶具有限定的开始点且无法移动穿过dsDNA区域(其中，连接物与构建体杂交)和间隔区直到被纳米孔捕获。
材料和方法
2.1DNA链退火以形成Y-型及发卡MuA底物
下表5中显示了制备Y-型MuA底物和发卡MuA底物。含有形成Y-型MuA底物和发卡MuA底物的DNA的样品混合物发卡加热至95℃2分钟，然后以每分钟2℃的速率冷却至16℃。这使SEQIDNO：14和SEQIDNO：15(其中SEQIDNO：14在其3'末端由4个iSpC3间隔区单元连接至SEQIDNO：15的5'末端)退火到SEQIDNO：19和SEQIDNO：9(其中SEQIDNO：19在其3'末端由4个iSpC3间隔区单元连接至SEQIDNO：9的5'末端)，以形成Y-型MuA底物，且对于SEQIDNO：19和SEQIDNO：20(其中SEQIDNO：19在其3'末端由4个iSpC3间隔区单元连接至SEQIDNO：15的5'末端)以形成发卡环状MuA底物。图4(a)中显示出形成的两个MuA底物的DNA底物设计。
表5
2.2使用MuA转座酶的DNA模板的片段化
将双链λDNA(SEQIDNO：13对应于正义链的序列)使用MuA转座酶片段化为约5-10kB长度的链。MuA转座酶插入MuA底物(Y-型和发卡MuA底物)，其进行如3.1节中的退火。下表6中显示了样品的制备。然后将样品在30℃下培养1小时并且在75℃下进行热失活10分钟。然后样品使用QIAquickTMPCR纯化试剂盒(Qiagen)进行进一步纯化并在26μL中洗脱。
表6
2.3具有插入的MuA底物的片段化λDNA的USER消化(USERdigest)
为了从SEQIDNO：19除去dUMP，从步骤3.2中得到的纯化的样品体积1随后使用USERTM消化进行处理。见下表7中适当的体积和浓度。然后将样品在37℃下培育30分钟，随后将其在冰块中冷却。
表7
试剂 样品体积2 最终浓度
样品体积1 26μL 8pmol的U
10x DNA连接酶缓冲液 3μL
USER(1U/uL) 1μL 1U
总计 30μL
2.4修复在λDNA构建体双链片段中的的单链缺口
经用USERTM处理后产生的样品体积2，然后用DNA聚合酶和连接酶处理，以闭合单链缺口。样品体积3(见下表8中适当的体积和浓度)在16℃培育30分钟，然后将EDTA(0.5M，10μL)加入到样品体积3中。然后用QIAquickTMPCR纯化试剂盒来纯化各样品，将其在50μL的水中洗脱。将纯化的样品的试样(1μL)在Agilent12000芯片仪上运行以对样品进行定量，添加Tris-HCl和氯化钠(pH7.5)到剩余样品直到其浓度分别为10mM和50mM。最后，SEQIDNO：16(序列的3'末端具有6个iSp18间隔区，该间隔区连接到2个胸腺嘧啶残基和3'胆固醇TEG，0.5μM)退火到纯化的样品。
表8
试剂 样品体积3 最终浓度
水 6.2μL
样品体积2 30μL
10x DNA连接酶缓冲液 1μL
dNTPs(10mM) 0.8μL 200μm
T4DNAP exo()(Lucigen) 1μL
连接酶(NEB；M0202M) 1μL
40μL
2.5显示由解旋酶控制的纯化的和片段化的λDNA构建体的DNA移动的电生理学实验
在建立实验前，λDNA构建体(0.2nM，具有Y-型MuA底物和发卡MuA底物的λDNA的5-10kB片段在其任一端连接到MuA转座酶(见图4(b)示例构建体)和TrwcCBA(SEQIDNO：9，1μM)在缓冲液(50mMCAPS，pH10.0(pH值通过加入氢氧化钠改变为pH10.0)，100mM氯化钠)中一起预培育1小时。
在缓冲液中(600mM氯化钾，25mM磷酸二氢钾，75mM亚铁(II)氰化钾，25mM铁(III)氰化钾，pH值8)插入到嵌段共聚物中的单一MspA纳米孔(MspA-B2C)取得电测量值。在双分子层中实现单孔后，则缓冲液(1mL，600mM氯化钾，25mM磷酸二氢钾，75mM亚铁(II)氰化钾中，25mM铁(III)氰化钾，pH8)流过系统以去除任何过量的MspA纳米孔(MspA-B2C)，且实验系统被放置在设置为8℃的冷却板上，给予系统约15℃的温度。将氯化镁(10mM)和dTTP(5mM)与缓冲液(600mM的氯化钾，25mM的磷酸二氢钾，75mM的亚铁(II)氰化钾，25mM的铁(III)氰化钾，pH8)混合在一起，然后加入到λDNA构建体(0.2nM)，TrwcCba(SEQIDNO：9，1μM)缓冲液(50mM的CAPS，pH值10.0(pH值通过加入氢氧化钠改变为pH10.0)，100mM氯化钠)预混。然后将预混物加入到单个纳米孔实验系统。进行2个小时的实验，然后进行电势翻转过程(+120mV持续30分钟，然后-100mV持续2秒钟，然后0mV持续2秒)，并监控解旋酶控制的DNA的移动。
2.6结果与讨论
对于λDNA构建体观察由解旋酶控制的DNA的移动，图5中示出由解旋酶控制的DNA的移动的例子。存在于λDNA构建体中的iSpC3间隔区产生了图5中的数字1,2和3显示的特征区块水平。Y-型MuA底物在任意链中具有4个iSpC3间隔区，发卡MuA底物也具有4个iSpC3间隔区，每个iSpC3间隔区随着λDNA构建体的区域易位通过纳米孔，使更多的电流流过。如果样品制备已经成功，则可以在λDNA构建体的初始位置、中间位置(标记正义序列和反义序列之间的过渡)，并在最后位置观察到iSpC3间隔区事件。图5清楚地显示了对应于iSpC3间隔区的增加的电流流动的三种情况。因此，该样品制备过程有效地将MuA底物引入λDNA以产生在图4(b)中所示的λDNA构建体。一旦DNA被纳米孔捕获，在跨纳米孔施加的电势的力驱动下酶(标记为A)移动穿过dsDNA区域(其中连接物与构建体杂交)和间隔区。
实施例3
本实施例中所使用的λDNA构建体通过使用MuA将λDNA片段化为5-10kB的片段产生。本实施例类似于实施例2中所描述的，然而，样品制备过程是不同的(不要求上述的步骤2.3和2.4)因为本实施例中转座酶序列含肌苷。在跨纳米孔施加的电势的力驱动下酶被移动穿过dsDNA区域和间隔区。
材料和方法
3.1DNA链退火以形成Y-型和发卡MuA底物
上述文实施例2.1制备Y-型2底物和发卡2MUA底物。在本实施例中使用的体积，浓度和序列在下表9中详述。2个形成的构建体的DNA构建体设计示于图6(a)中。
表9
3.2使用MuA转座酶的DNA模板片段化
使用MuA转座酶，将双链λDNA(SEQIDNO：13仅显示正义链的序列)片段化为约5-10kB长度的链。MuA转座酶插入MuA底物(Y-型2和发卡2MuA底物)，其在3.1节中退火。除了所用的MuA底物为Y-型2底物和发卡2MuA底物，用如2.2节和上文表6中所描述的等同程序制备样品。在这种情况下，纯化的样本X在20μL的体积中洗脱。
3.3DNAλ构建体双链片段中的切口修复(Nickrepair)
一旦Y-型2底物和发卡2MuA底物已插入片段化的λDNA，有必要修复链中的切口并将肌苷加入λDNA片段以产生完整的双链λDNA片段。如下表10中描述的反应物在冰上配制。在将EDTA(10μL，0.5M)加入到样品前，将样品在16℃下培养60分钟。将得到的样品混合物使用QiaQuickTM纯化试剂盒进行纯化并在50μL的水中洗脱。纯化的样品的试样(1μL)在Agilent12000芯片仪上运行以对样品进行定量，将Tris-盐酸和氯化钠(pH7.5)加入到该样品的其余部分，直到浓度分别为10mM和50mM。最后，SEQIDNO：16(序列的3'末端具有连接到2个胸腺嘧啶残基和3'胆固醇的TEG的6个iSp18间隔区，0.5μM)退火到纯化的λDNA构建体。
表10
试剂 样品Z 最终浓度
样品X 16μL
2x DNA连接酶缓冲液 20μL 1x
连接酶(NEB；M0202M) 4μL
总计 40μL
3.4显示由解旋酶控制的纯化的和片段化的λDNA构建体的DNA移动的电生理学实验
在建立实验前，λDNA构建体(0.2nM，具有Y-型2底物和发卡2MuA底物的λDNA的5-10kB片段在其任一端连接到由MuA转座酶(见图6(b)示例构建体)和TrwcCBA(SEQIDNO：17，1μM)在缓冲液(50mMCAPS，pH10.0(pH值通过加入氢氧化钠改变为pH10.0)，100mM氯化钠)中一起预培育1小时。
在缓冲液中(600mM氯化钾，25mM磷酸二氢钾，75mM亚铁(II)氰化钾，25mM铁(III)氰化钾，pH值8)插入到嵌段共聚物中的单一MspA纳米孔(MspA-B2C)取得电测量值。在双分子层中实现单孔后，则缓冲液(3mL，600mM氯化钾，25mM磷酸二氢钾，75mM亚铁(II)氰化钾中，25mM铁(III)氰化钾，pH8)流过系统以去除任何过量的MspA纳米孔(MspA-B2C)，且实验系统被放置在设置为8℃的冷却板上，给予系统约15℃的温度。将氯化镁(10mM)和dTTP(5mM)与缓冲液(600mM的氯化钾，25mM的磷酸二氢钾，75mM的亚铁(II)氰化钾，25mM的铁(III)氰化钾，pH8)混合在一起，然后加入到λDNA构建体(0.2nM)，TrwcCba(SEQIDNO：17，1μM)缓冲液(50mM的CAPS，pH值10.0(pH值通过加入氢氧化钠改变为pH10.0)，100mM氯化钠)预混。然后将预混物加入到单个纳米孔实验系统。进行2个小时的实验，然后进行电势翻转过程(+120mV持续30分钟，然后-100mV持续2秒钟，然后0mV持续2秒)，并监控解旋酶控制的DNA的移动。
3.5结果与讨论
对于λDNA构建体观察由解旋酶控制的DNA的移动，图7中示出由解旋酶控制的DNA的移动的例子。存在于λDNA构建体中的iSpC3间隔区产生了图7中的数字1-3显示的特征区块水平。Y-型2MuA底物在任意链中具有4个iSpC3间隔区，发卡2MuA底物也具有4个iSpC3间隔区，每个iSpC3间隔区随着λDNA构建体的区域易位通过纳米孔，使更多的电流流过。如果样品制备已经成功，则可以在λDNA构建体的初始位置、中间位置(标记正义序列和反义序列之间的过渡)，并在最后位置观察到iSpC3间隔区事件。图7清楚地显示了对应于iSpC3间隔区的增加的电流流动的三种情况。因此，该样品制备过程有效地将MuA底物引入λDNA以产生在图6(b)中所示的λDNA构建体。一旦DNA被纳米孔捕获，在跨纳米孔施加的电势的力驱动下酶(标记为A)移动穿过dsDNA区域(其中连接体与构建体杂交)和间隔区。由于在Y-型2MuA底物和发卡2MUA底物中使用了肌苷，样品制备程序中的步骤被减少，因为一旦MuA底物已被全部插入，仅需要封闭接近双链DNA构建体中的切口是必要的。
实施例4
本实施例比较了TrwCCba单体(SEQIDNO：17)和TrwCCbaQ276C-3.4kDa二聚体(其中各单体单元包含具有突变Q276C的SEQIDNO：17，并且一个单体单元使用3.4kDa的PEG连接体经各单体单元的276位被连接到另一个单体单元)控制完整DNA链(SEQIDNO：23连接到其5'末端的是28个iSpC3间隔区单元，其最后一个间隔区单元具有额外的2个T's连接到间隔区基团的5'末端，连接到SEQIDNO：23的3'末端具有另外4个iSpC3间隔区，该4个iSpC3间隔区连接到SEQIDNO:24的5'末端的，其中SEQIDNO：12与SEQIDNO：23的一个区域杂交)穿过纳米孔的移动的能力。图22中示出本实施例中使用的DNA构建体(解旋酶能够结合到标记为B的区域)。当在DNA构建体被纳米孔捕获时，跨纳米孔施加的电势将酶移动穿过dsDNA区域(其中连接体与构建体杂交)和间隔区，且观察到由解旋酶控制的DNA移动。
比较单体的解旋酶控制的移动与二聚体的解旋酶控制的移动，可以观察到的二聚体比单体产生了更高比例的由解旋酶控制DNA的移动的停留时间(长的停留时间是解旋酶控制的DNA的移动，其比大部分解旋酶控制的DNA的移动的平均值多三个标准差)。
材料和方法
在建立实验前，将DNA(1nM，SEQIDNO：23连接到其5'末端的是28个iSpC3间隔区单元，该间隔区单元的最后一个具有2个额外的T’s连接到间隔区基团的5'末端，SEQIDNO：23连接到其3'末端是4个iSpC3间隔区，该4个iSpC3间隔区连接到SEQIDNO：24的5'末端，其中SEQIDNO：12与SEQIDNO：23的一个区域杂交)和酶(无论是TrwCCba单体(1nM，SEQIDNO：17)或TrwCCbaQ276C-3.4kDa二聚体(0.3nM，其中每个单体单元包含具有突变Q276C的SEQIDNO：17，并且一个单体单元使用3.4kDa的PEG连接体经各单体单元的276位被连接到另一个单体单元))一起进行>16小时的预培养。
从在缓冲液(625mM的氯化钾，100mM的Hepes，75mM的亚铁(II)氰化钾中，25mM的铁(III)氰化钾，pH8)中的插入嵌段共聚物的单一MspA纳米孔MS(G75S/G77S/L88N/Q126R)8MspA(具有突变G75S/G77S/L88N/Q126R的SEQIDNO：2)获得电测量值。氯化镁(10mM)和dTTP(5mM)与缓冲液(625mM的氯化钾，100mM的Hepes，75mM的亚铁(II)氰化钾，25mM的铁(III)氰化钾，pH8)混合在一起，然后加入到DNA(如前所述的构建体)，酶预混物(TrwCCba单体(1nM，SEQIDNO：17)或TrwCCbaQ276C-3.4kDa二聚体(1nM，其中每个单体单元包含具有突变Q276C的SEQIDNO：17，并且一个单体单元使用3.4kDa的PEG连接体经各单体单元的276位被连接到另一个单体单元))。在双分子层中实现单个孔后，将该预混物加入到单一纳米孔的实验系统。在+120mV的恒定电势进行了实验，且监控了解旋酶控制的DNA的移动。
结果与讨论
观察到解旋酶TrwCCba单体(SEQIDNO：17)和TrwCCbaQ276C-3.4kDa二聚体(其中各单体单元包含具有突变Q276C的SEQIDNO：17，并且一个单体单元使用3.4kDa的PEG连接体经各单体单元的276位被连接到另一个单体单元)控制的DNA的移动。一旦DNA构建体被纳米孔捕获，解旋酶被移动穿过dsDNA区域(其中连接体与构建体杂交)和间隔区，观察到由解旋酶控制的移动。
观察到的由解旋酶控制的DNA移动，占检测到的移动的约95％，然而，有一小部分具有显著较长的停留时间(比大部分解旋酶控制的DNA的移动的平均值多3个标准差)。这些较长停留时间的移动允许改进的数据分析。当TrwCCbaQ276C-3.4kDa二聚体(1nM)用于控制DNA的移动，然后观察到较高比例的(与TrwCCba单体5％相比，TrwCCbaQ276C-3.4kDa二聚体为20％)这些较长停留时间的移动(比大部分解旋酶控制的DNA的移动的平均值多3个标准差)。使用该二聚体解旋酶的提供优于单体的优点，因为其在纳米孔测序系统中具有改进的数据分析。
实施例5
这个实施例表明在测定酶活性的基于荧光测试中，Sp9间隔区单元可用于停滞Hel308Mbu(SEQIDNO：28)的移动(当同时提供ATP和氯化镁时)。
材料和方法
三种不同的设定的荧光底物(A＝(不含间隔区的对比链)SEQIDNO：25和SEQIDNOS：26，B＝(含有单个Sp9间隔区的链)SEQIDNO：27在其3'末端由一个Sp9间隔区连接到SEQIDNO：29的5'末端，并与SEQIDNO：26杂交，C＝(含有4个Sp9的链)SEQIDNO：27在其3'末端由4个Sp9间隔区连接SEQIDNO:29的5'末端，并与SEQIDNO：26杂交)被用于测定Hel308Mbu(SEQIDNO：28)取代杂交的dsDNA的能力。将FAM标记的DNA(用于荧光底物A＝SEQIDNO：25，B＝SEQIDNO：27在其3'末端连接一个sp9间隔区，该Sp9间隔区连接到SEQIDNO：29的3'末端，C＝SEQIDNO:27通过其3'末端连接4个Sp9间隔区，该4个Sp9间隔区连接到SEQIDNO：29的3'末端)退火到部分互补链，该部分互补链具有以1比1的比例(每条链1uM)连接到其3'末端(SEQIDNO：26)的黑洞猝灭剂，在400mM的氯化钾，100mM的HEPESpH8，10mM的氯化镁，1mg/ml的BSA中。链在室温下退火30分钟。将退火的DNA(A＝SEQIDNO：25和SEQIDNO：26，B＝SEQIDNO：27其3'末端由一个Sp9间隔区连接到SEQIDNO：29的5'末端并与SEQIDNO：26杂交，C＝SEQIDNO：27在其3'末端由4个Sp9间隔区连接SEQIDNO：29的5'末端并与SEQIDNO：26杂交)在400mM的氯化钾，100mM的HEPESpH8，10mM的氯化镁，1mg/ml的BSA，1mM的ATP(1uM的捕获DNA(还存在SEQIDNO：27)稀释到50nM。Hel308Mbu(SEQIDNO：28)样品在400mM的氯化钾，100mM的HEPESpH8，10mM的氯化镁，1mg/ml的BSA中稀释到475nM。然后，参照在400mM的氯化钾，100mM的HEPESpH8，10mM的氯化镁，1mg/ml的BSA，0.975mM的ATP(还存在0.975uM捕获DNA)中48.75nM退火的DNA，测定Hel308Mbu(12nM)(如下所述和在图8和图9中示出的)。
图8中示出对比链A，其中在1A)中，荧光底物链(48.75nM的最终浓度)具有3'ssDNA突出部分以及40个碱基的杂交的dsDNA部分。含有3'ssDNA突出部分的上部链具有羧基荧光素基，该羧基荧光素基连接到SEQIDNO：25的3'末端，且杂交的互补部分具有连接到SEQIDNO：26的3'末端的黑洞猝灭剂(BHQ-1)基。当来自荧光素的杂交的荧光被局部的BHQ-1猝灭时，底物是基本上无荧光的。与荧光底物的下部链部分互补的1μM的捕获链(SEQIDNO：27)包含在测定中。如图2A)中所示，在ATP(0.975mM)和氯化镁(10mM)存在时，添加到底物的解旋酶(12nM)结合至所述荧光底物的3’突出部分，沿着上部链移动时，取代互补链。如图3A)中所示，一旦具有BHQ-1的互补链被完全取代，则主链上的荧光素发荧光。如图4A)所示，该取代链优选与过量的捕获链退火，以防止初始底物的重新退火和荧光的丢失。图9显示出链B(1B-3B)和链C(1C-3C)的测定步骤，对于这些链，Sp9间隔区停滞解旋酶，并防止解旋酶将具有荧光素的链与连有黑洞猝灭剂的链分离。
结果与讨论
图10中的曲线显示出在缓冲液(100mM的HepespH8.0，0.975mM的ATP，10mM的氯化镁，1mg/ml的BSA，48.75nM的荧光底物DNA(上述所讨论的底物A，B和C)，0.975μM的捕获DNA(SEQIDNO：27)中在400mM的氯化钾下的Hel308Mbu(在图8和9中标记为a；SEQIDNO：28)的初始活性速率。在研究的盐浓度下，Hel308Mbu(SEQIDNO：28)显示出对比链A的dsDNA的转换。然而，图10清楚地表明对于在序列(B(1个Sp9间臂)和C(4个Sp9间臂))中具有Sp9间隔区的两种构建体，dsDNA的转换被抑制。这表明在ATP和氯化镁的存在下，在自由溶液中，Sp9间隔区停滞了Hel308Mbu酶。
实施例6
这个实施例表明了在测试酶活性的基于荧光的测试中idSp基团可用于停滞Hel308Mbu(SEQIDNO：28)(当同时具有ATP和氯化镁时)的移动。
材料和方法
4种不同的设定的荧光底物(D＝(不含间隔区的对比链)SEQIDNO：32和SEQIDNO：26，E＝(含有单个idSp间隔区的链)SEQIDNO：27在其3'末端由一个idSp基团连接到SEQIDNO：30的5'末端且与SEQIDNO：26杂交，F＝(含有4个idSp的链)SEQIDNO：27的3'末端由4个idSp基团连接SEQIDNO：31的5'末端并与SEQIDNO：26杂交，以及G＝(不含有间隔区的第二对比链)SEQIDNO：33和SEQIDNO：26)被用于测定Hel308Mbu(SEQIDNO：28)取代杂交dsDNA的能力。将FAM标记的DNA(用于荧光底物D＝SEQIDNO：32，E＝SEQIDNO：27在其3'末端由一个idSp基团连接到SEQIDNO：30的3'末端，F＝SEQIDNO：27在其3'末端由4个idSp基团连接到SEQIDNO：31的3'末端，G＝SEQIDNO：33)退火到部分互补链，该部分互补链具有以1比1.2的比例(1:1.2μM)连接到其3'末端(SEQIDNO：26)的黑洞猝灭剂，在400mM的氯化钾，100mM的HEPESpH8，10mM的氯化镁，1mg/ml的BSA。链在室温下退火15分钟。将退火的DNA(D＝SEQIDNO：32和SEQIDNO：26，E＝SEQIDNO：27在其3'末端由一个idSp基团连接到SEQIDNO：30的5'末端，并与SEQIDNO：26杂交，F＝SEQIDNO：27在其3'末端由4个idSp基团连接SEQIDNO：31的5'末端，并与SEQIDNO：26杂交，G＝SEQIDNO：33和SEQIDNO：26)在400mM的氯化钾，100mM的HEPESpH8，10mM的氯化镁，1mg/ml的BSA，1mM的ATP(1uM的捕获DNA(也存在SEQIDNO：27)中稀释至50nM。然后参照在400mM的氯化钾，100mM的HEPESpH8，10mM氯化镁，1mg/ml的BSA，0.975mM的ATP(也存在0.975uM的捕获DNA)中48.75nM退火的DNA，测定Hel308Mbu(12nM)(如之前在实施例5中描述的(除DNA构建体是不同的，以及含有idSp基团而不是Sp9间隔区)，以及在图8和图9中示出的(此外，其中在这些附图中的Sp9基团被替换为idSp基团))。
结果与讨论
图11中的曲线显示出在缓冲液(100mM的HepespH8.0，0.975mM的ATP，10mM的氯化镁，1mg/ml的BSA，48.75nM的荧光底物DNA(上述所讨论的底物D，E，F和G)，0.975μM的捕获DNA(SEQIDNO：27)中在400mM的氯化钾下的Hel308Mbu(在图8和9中标记为a；SEQIDNO：28)的初始的活性速率。在研究的盐浓度下，Hel308Mbu(SEQIDNO：28)显示出对比链D和G的dsDNA的转换。然而，图11清楚地表明在序列(F)中具有4个idSp间隔区的构建体，dsDNA的转换被抑制。这表明在ATP和氯化镁的存在下，在自由溶液中，4个idSp基团停滞了Hel308Mbu酶。
实施例7
这个实施例显示出了基于凝胶的测定被用于测量iSpC3间隔区和iSp18间隔区停滞T4Dda-E94C/A360C的移动的能力。
材料和方法
将退火的DNA复合物(测试的序列在下表11中示出)以(1：1，体积/体积)的比例与T4Dda-E94C/A360C在25mM的磷酸盐pH值8.0，200mM的氯化钾中混合，得到T4Dda-E94C/A360C的最终浓度为(2000nM)和DNA为(100nM)。解旋酶在室温下结合DNA进行2小时。将捕获链(SEQIDNO：37，20μM)加入到各样品以结合任何未结合的酶和样品，在室温下培育30分钟。将缓冲液加入到样品(表11中的DNA构建体＝50nM，捕获DNA(SEQIDNO：37)＝10μM和T4DdA-E94C/A360C＝1000nM)，在室温下培育1小时(缓冲液1＝25mM磷酸盐pH8.0，200mM的氯化钾，20mM的氯化镁，10mMATP或缓冲液2＝25mM磷酸盐pH为8.0，1M氯化钾，25mM的铁(III)氰化钾中，75mM亚铁氰化钾，20mM的氯化镁，10mMATP)。将上样缓冲液(25mM的磷酸盐pH8.0，151.5mM的氯化钾，25％甘油，125mM的EDTA)加入到每个样品以猝灭解旋酶活性。将样品上样到4-20％TBE凝胶上，并在160V跑胶1.5小时。然后将该凝胶用SYBR金染色以观察DNA条带。
表11
结果与讨论
图12显示了阳性对照实验的凝胶图，其中DNA构建体不含间隔区以停滞解旋酶(T4Dda-E94C/A360C)。图14的泳道2显示了高达5个解旋酶可以结合到SEQIDNO：34的单链部分。一旦加入ATP和氯化镁，与dsDNA构建体结合多个酶对应的更高的条带消失且与ssDNA构建体(标记为X且仅对应于SEQIDNO：34)对应的条带的强度增加。这表明，当解旋酶有供给燃料时，其沿DNA移动且取代杂交的互补链(SEQIDNO：35)。
图15显示了一个凝胶的示例，该凝胶显示表11的DNA构建体7-9(例如：在ssDNA/dsDNA结合处之前，DNA具有3个，4个或5个iSp18间隔区)的酶活性试验。泳道1-4对应3个iSp18间隔区，泳道5-7对应4个iSp18间隔区，泳道9-12对应5个iSp18间隔区。泳道2，6和10显示出，与对比类似，高达5个解旋酶可以结合到表11中的DNA构建体7-9的单链区域。一旦加入ATP和氯化镁，解旋酶将被提供给必要的组分以沿着DNA链移动。泳道3-4，7-8和11-12显示在加入ATP和氯化镁后，在两种缓冲液条件(缓冲液1和缓冲液2)下的多种DNA构建体。两个条带在标记为1Y和1X的区域清晰可见。1Y对应于具有一个解旋酶停滞和结合的dsDNA构建体。这表明在测定的条件下，3个，4个和5个iSP18间隔区能够停滞解旋酶。1X对应具有一个解旋酶停滞和结合的ssDNA构建体。该条带由多个结合到DNA构建体的解旋酶，且多个解旋酶推动前端解旋酶穿过停滞的基团，因此取代短链互补链(SEQIDNO：35)而得到。然而，该条带仍然具有一个解旋酶结合，因为单一的解旋酶不能移动穿过iSp18间隔区(例如图13中的类型E结果)。对于使用4个或5个iSp18间隔区停滞解旋酶的情况，在水平2Y有模糊条带。这表明在测试的条件下，当使用了4/5个iSp18间隔区，可以停滞高达两个解旋酶的移动。
在至少一个测试的缓冲液条件下对其他间隔区组合的研究中(表11的2-6项)，iSpC3和iSp18间隔区二者都能停滞一个解旋酶。在两个测试的缓冲液条件下，观察到缓冲液2比缓冲液1通常更高效的停滞，包含间隔区的数量更多，则在测试的条件下停滞解旋酶更有效。
实施例8
本实施例研究控制仅1个或2个T4Dta-E94C/A360C解旋酶结合在特定的区域中所需的碱基数目。
材料和方法
下表12中详述的DNA构建体(1μM或100nM最终浓度)在合适的缓冲液中培育并用T4Dda-E94C/A360C连续稀释。然后将样品上样在4-20％TBE凝胶上并在160V运行90分钟。含有项1-6的凝胶随后使用SYBR染色。图16显示出在这个实验中使用的DNA构建体的类型。将标记为1的区域长度从2到50变化以优化条件，从而可以控制T4-Dda-E94C/A360C解旋酶可以结合到DNA的数量。
表12
结果与讨论
研究了表12中列出的每个DNA构建体以确定有多少酶可以结合到区域1(图16中示出)，该区域具有从2个碱基到50个碱基的变化。对每个测试的DNA构建体，当没有加入解旋酶时，仅观察到未结合的DNA的单一条带。在研究的条件下，观察到构建体4(其具有2个胸腺嘧啶碱基的结合区)和构建体5(其具有4个胸腺嘧啶碱基的结合区)，未允许任何解旋酶以任何浓度结合(见表14)。构建体6(见表14中具有8个胸腺嘧啶碱基的结合区)和构建体1(其具有10个胸腺嘧啶碱基的结合区)仅观察到有一个解旋酶结合(见表13)。构建体2，其具有20个胸腺嘧啶碱基的结合区域，允许两个酶在较高的测试浓度下结合，构建体3，其具有50个胸腺嘧啶碱基的结合区，该结合区允许高达6个酶在最高测试浓度下结合(凝胶参见图17，表示该实验见表13)。构建体1-6中使用iSpC3间隔区防止解旋酶结合在ssDNA/dsDNA区域的结合处。构建体7和构建体8使用iSp18间隔区以防止解旋酶结合在ssDNA/dsDNA区域的结合处。在测试条件下，构建体7(其具有16个胸腺嘧啶的结合区域)和构建体8(其具有18个胸腺嘧啶的结合区域)二者允许高达2个解旋酶的结合(见表15)。因此，大于8个胸腺嘧啶碱基长度的结合区域允许至少一个酶结合到DNA构建体。
表13
表14
表15
实施例9
本实施例研究当加入到DNA构建体X(在图18中所描述和示出的)导致两个解旋酶结合的T4Dda-E94C/A360C解旋酶的浓度。
材料和方法
测试了2个DNA构建体，其中一个具有不分叉的DNA的互补链(SEQIDNO：42与图18中所示的DNA构建体杂交)，其中一个是分叉的(SEQIDNO：12(其具有6个连接到3'末端的iSp18间隔区)与图18中所示的DNA构建体杂交)。在表16中所示的多个DNA链以1μM的浓度在25mM的磷酸盐pH8.0的，1515.5mM的氯化钾退火(使用10％过量的互补链SEQIDNO：43(以下项9和项10)和SEQIDNO：12(以下项10)或SEQIDNO：42(以下项9))。
表16
T4Dda-E94C/A360C被更换缓冲盐进入25mM的磷酸盐pH值8.0，151.5mM的氯化钾中，且连续稀释。解旋酶和DNA然后与上述所描述的DNA构建体样品9和样品10(DNA最终浓度＝100nM，研究的解旋酶浓度＝3800nM，1900nM，950nM，475nM，238nM，0nM)混合(1：1，体积/体积)。然后DNA和酶混合物在室温下培育1.5小时。不含染料上样缓冲液(5×，7.5μL)加入到每个样品(30μL)中。然后将每个样品(37.5μL)上样到4-20％TBE凝胶上，并在+160V下运行90分钟。然后使用SYBR将该凝胶染色。
结果与讨论
研究了表16中列出的两个DNA构建体，以确定什么样的T4Dda-E94C/A360C解旋酶的浓度是促进2个解旋酶结合所需的。对每个测试的构建体，当没有加入解旋酶时，观察到了仅未结合DNA的单一条带。在研究的条件下，观察到构建体9(非分叉构建体)和构建体10(叉形的)从238nM浓度结合一个解旋酶，且从475nM以上浓度结合2个酶。当酶的浓度增加时，与结合2个酶相关的条带强度增加。图18中所示的DNA构建体的设计仅在浓度高达3800nM时允许结合两个酶。因此，当构建体被预培育时，研究的间隔区不允许解旋酶结合到它们。
实施例10
此实施例显示了T4Dda-E94C/A360C是如何在自由溶液中被4个iSp18间隔区停滞的，直到所述构建体(DNA构建体X1)被纳米孔捕获。一旦施加的电势产生的力将酶T4Dda-E94C/A360C移动穿过停滞的间隔区，且允许由酶控制的λ构建体DNA穿过纳米孔移动。
材料和方法
在建立实验之前，将DNA构建体X1(0.13μL，100nM)和T4Dda-E94C/A360C(15.6μL，250nM)在室温下在缓冲液(50mM磷酸钾，253mM氯化钾，pH8.0)中一起预培育1小时。
电测量值在30℃下(通过将实验系统放置在冷却器板上)在缓冲液(600mM的氯化钾，25mM的磷酸钾，75mM的亚铁(II)氰化钾，25mM的铁(III)氰化钾，pH8)中插入嵌段共聚物中的单一MspA纳米孔(MspA-B2C)得到。在实现单一孔插入嵌段共聚物后，则缓冲液(1mL，600mM的氯化钾，25mM的磷酸钾，75mM的亚铁(II)氰化钾中，25mM铁(III)氰化钾，pH8)流过该系统以除去任何过量的MspA纳米孔(MspA-B2C)。将铁(Ⅲ)氰化物钾(200μM的最终浓度)加入该DNA(0.1nM最终浓度)和酶(3nM最终浓度)预混中且培育1分钟，在氯化镁(10mM的最终浓度)和ATP(1mM的最终浓度)与缓冲液(1260μL，600mM的氯化钾，25mM的磷酸钾，75mM的亚铁(II)氰化钾，25mM铁(III)氰化钾，pH8)混合在一起之前。这个实验混合物随后被加入到单一纳米孔实验系统。实验进行了6个小时后，进行电势翻转过程(在顺侧(cisside)施加+180mV进行2秒，然后0V进行2秒，然后-120mV进行3600秒(重复6次))且监测了由解旋酶控制的DNA的移动。
结果与讨论
图20中所示的DNA构建体。当与该DNA构建体预培养时，T4Dda-E94C/A360C能够结合到构建体的标记为A的区域(SEQIDNO：9)。然而，当在自由溶液中，酶是不能被驱动穿过(标记为黑色框)的停滞基团(4个iSp18间隔区)。因此，该酶在iSp18间隔区(图1中标记为B)处停滞，直到该DNA构建体被纳米孔捕获。一旦被纳米孔捕获，所施加的电势的力使酶T4Dda-E94C/A360C移动穿过停滞的间隔区(4个iSp18间隔区)，并允许由酶控制的DNA构建体X1的DNA移动穿过纳米孔。由解旋酶控制的DNA的移动的例子在图21中示出。当SEQIDNO：38的pT区域在解旋酶的控制下的易位穿过纳米孔时显示为标记为1的部分。当iSp18间隔区在解旋酶的控制下的易位穿过纳米孔显示为标记为2的部分。因为观察的解旋酶事件在解旋酶开始控制DNA移动时显示pT区域以及iSp18信号，解旋酶被观察到具有明确的起点(由iSp18间隔区停滞解旋酶产生)。

Claims (51)

1.一种移动一个或多个停滞的解旋酶穿过多核苷酸上的一个或多个的间隔区的方法，该方法包括(a)将所述一个或多个停滞的解旋酶和所述多核苷酸与跨膜孔接触；以及(b)跨所述孔施加电势，从而移动所述一个或多个停滞的解旋酶穿过所述多核苷酸上的所述一个或多个间隔区。
2.一种控制目标多核苷酸穿过跨膜孔的移动的方法，包括：
(a)提供具有一个或多个间隔区的目标多核苷酸；
(b)将所述目标多核苷酸与所述一个或多个解旋酶接触，使得所述一个或多个解旋酶停滞在所述一个或多个间隔区处；
(c)将所述目标多核苷酸和所述一个或多个停滞的解旋酶与所述孔接触；以及
(d)跨所述孔施加电势，使得所述一个或多个解旋酶移动穿过所述一个或多个间隔区，并控制所述目标多核苷酸穿过所述孔的移动。
3.一种表征目标多核苷酸的方法，包括：
(a)实施权利要求2所述的方法；以及
(b)随着所述多核苷酸相对于所述孔移动，获取一个或多个测量值，其中所述测量值代表所述多核苷酸的一个或多个特征，并由此表征所述目标多核苷酸。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其中提供具有一个或多个间隔区的所述目标多核苷酸，包括修饰所述目标多核苷酸，使得该目标多核苷酸包括一个或多个间隔区。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其中所述一个或多个特征选自(i)所述目标多核苷酸的长度，(ii)所述目标多核苷酸的同一性，(iii)所述目标多核苷酸的序列，(ⅳ)所述目标多核苷酸的二级结构；以及(v)所述目标多核苷酸是否是经修饰的。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述目标多核苷酸通过甲基化，氧化，损伤，用一个或多个蛋白质或一个或多个标记物，标签或间隔区进行了修饰。
7.根据权利要求3至6中任一项所述的方法，其中通过电测量和/或光测量测量所述目标多核苷酸的所述一个或多个特征。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述电测量为电流测量，阻抗测量，隧道测量或场效应晶体管(FET)测量。
9.根据任一前述权利要求所述的方法，其中在施加的电势产生的场的作用下，所述一个或多个解旋酶控制所述目标多核苷酸穿过所述孔的移动。
10.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述一个或多个间隔区具有与所述多核苷酸不同的结构。
11.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述多核苷酸是脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)，且所述一个或多个间隔区包含肽核酸(PNA)，甘油核酸(GNA)，苏糖核酸(TNA)，锁核酸(LNA)或具有核苷酸侧链的合成聚合物。
12.根据任一前述权利要求所述的方法，所述一个或多个间隔区优选包括一个或多个硝基吲哚，一个或多个肌苷，一个或多个吖啶，一个或多个2-氨基嘌呤，一个或多个2-6-二氨基嘌呤，一个或多个5-溴-脱氧尿嘧啶，一个或多个反向胸苷(反向dTs)，一个或多个反向二脱氧胸苷(ddTs)，一个或多个二脱氧胞苷(ddCs)，一个或多个5-甲基胞苷酸，一个或多个5-羟甲基胞苷，一个或多个2'-O-甲基RNA碱基，一个或多个异脱氧胞苷(异-dCs)，一个或多个异脱氧鸟苷(异-dGs)，一个或多个C3基团，一个或多个光裂解(PC)的基团，一个或多个己二醇，一个或多个间隔区9(iSp9)基团，一个或多个间隔区18(iSp18)基团，聚合物或一个或多个硫醇连接。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述聚合物为多肽或聚乙二醇(PEG)。
14.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述一个或多个间隔区包括一个或多个无碱基核苷酸。
15.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述一个或多个间隔区包括引起所述一个或多个解旋酶停滞的一个或多个化学基团。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述一个或多个化学基团是一个或多个荧光团，链霉亲和素/或生物素，胆固醇，亚甲基蓝，二硝基苯酚(DNP)，洋地黄毒苷和/或抗洋地黄毒苷或二苄基环辛炔基团。
17.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述一个或多个间隔区在游离的核苷酸和/或在解旋酶的辅助因子的存在下，能够停滞所述一个或多个解旋酶。
18.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述一个或多个间隔区在约100mM或更低的盐浓度下，能够停滞所述一个或多个解旋酶。
19.根据任一前述权利要求所述的方法，其中该方法包括移动两个或多个停滞的解旋酶穿过每个间隔区。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述两个或多个解旋酶彼此连接。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述两个或多个解旋酶彼此共价地连接。
22.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述一个或多个间隔区包括在多核苷酸中，和/或所述一个或多个间隔区不是与所述多核酸杂交的一个或多个阻断分子的一部分。
23.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述多核苷酸的至少一部分是双链的。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述一个或多个间隔区包括在所述多核苷酸的单链区域或非杂交区域中。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述单链区域包括优先旋入所述孔中的前导序列。
26.根据权利要求23至25中任一项所述的方法，其中使用桥接结构连接双链部分的两条链。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述一个或多个间隔区包括在所述桥接结构中。
28.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述一个或多个解旋酶为(a)一个或多个Hel308解旋酶，一个或多个RecD解旋酶，一个或多个XPD解旋酶或一个或多个Dda解旋酶，(b)由(a)中任意所述解旋酶衍生的一个或多个解旋酶；或(c)在(a)或(b)中的任何所述解旋酶的组合。
29.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述孔是跨膜蛋白孔或固态孔。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述跨膜蛋白孔衍生自溶血素，白细胞素，耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatis)孔蛋白A(MspA)，MspB，MspC，MspD，胞溶素，外膜孔蛋白F(OmpF)，外膜孔蛋白G(OmpG)，外膜磷脂酶A，奈瑟氏菌(Neisseria)自转运脂蛋白(NalP)和WZA。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述跨膜蛋白孔是：
(a)由SEQIDNO:2所示的8个相同亚基形成，或(b)由(a)所述亚基的变体形成，基于氨基酸相似性，该变体中8个亚基中的一个或多个相比于SEQIDNO:2的整个序列具有至少50％的同源性并保留有孔活性；或者
(c)SEQIDNO:4所示的7个相同亚基形成的α-溶血素，或(d)所述亚基的变体，基于氨基酸相似性，该变体中7个亚基中的一个或多个相比于SEQIDNO:4的整个序列具有至少50％的同源性并保留有孔活性。
32.跨膜孔和施加的电势在移动一个或多个停滞的解旋酶穿过在多核苷酸上的一个或多个间隔区中的应用。
33.一个或多个间隔区，在多核苷酸与跨膜孔接触前，将一个或多个解旋酶停滞在所述多核苷酸上的应用。
34.一种控制一个或多个解旋酶在目标多核苷酸上加载的方法，包括：
(a)提供具有一个或多个间隔区的目标多核苷酸；以及
(b)将在(a)中提供的所述目标多核酸与所述一个或多个解旋酶接触，使得所述一个或多个解旋酶结合到所述目标多核苷酸并且在每个间隔区处停滞。
35.根据权利要求34所述的方法，其中步骤(a)包括修饰所述目标多核苷酸，使得它包括一个或多个间隔区。
36.根据权利要求34或35所述的方法，其中所述目标多核苷酸具有5'至3'方向上的(L-S)n或(S-L)n，其中L是单链多核苷酸或非杂交的多核苷酸，S是间隔区，n是整数。
37.根据权利要求34至36中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括将在(a)中提供的所述目标多核苷酸与所述一个或多个解旋酶接触，使得所述一个或多个解旋酶结合到所述目标多核苷酸且在每个间隔区处停滞一个解旋酶。
38.根据权利要求37所述的方法，其中步骤(a)包括提供在5'至3'的方向上具有(L1-S)n或(S-L1)n的所述目标多核苷酸，其中，L是单链多核苷酸或非杂交的多核苷酸，其仅对结合一个解旋酶是足够长的，S是间隔区，n是整数。
39.根据权利要求34至36中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括将在(a)中提供的所述目标多核苷酸与所述一个或多个解旋酶接触，使得所述一个或多个解旋酶结合到所述目标多核苷酸且在每个间隔区处停滞两个解旋酶。
40.根据权利要求39的所述的方法，其中步骤(a)包括在5'至3'的方向上提供具有(L2-S)n或(S-L2)n的所述目标多核苷酸，其中L是单链多核苷酸或非杂交的多核苷酸，其仅对结合两个解旋酶是足够长的，S是间隔区，n是整数。
41.根据权利要求39或40所述的方法，其中停滞在每个间隔区处的所述两个解旋酶是彼此不同的。
42.根据权利要求中权利要求39至41任一项所述的方法，其中停滞在每个间隔区处的所述两个解旋酶彼此连接或彼此共价地连接。
43.根据权利要求41所述的方法，其中该方法包括：
(a)提供在5'至3'的方向上具有(L2-S)n或(S-L2)n的所述目标多核苷酸，其中L是单链多核苷酸或非杂交的多核苷酸，其仅对结合两个解旋酶是足够长的，S是间隔区，n是整数；
(b)将阻断多核苷酸杂交到每个区域L2的一部分，使得每个区域L2的剩余部分仅足够结合一个解旋酶；
(c)将在(b)中产生的所述目标多核苷酸与一个或多个解旋酶接触，使得一个解旋酶结合到每个区域L2的剩余部分；
(d)为(c)中的一个或多个结合解旋酶提供游离核苷酸和解旋酶辅助因子，使得所述解旋酶除去每个阻断多核苷酸且在每个间隔区S处停滞；以及
(e)将在(d)中产生的所述目标多核苷酸与一个或多个解旋酶接触，该一个或多个解旋酶不同于在(c)中使用的解旋酶，使得一个不同的解旋酶结合到每个区域L2并且被每个间隔区和停滞在(d)中的解旋酶停滞。
44.根据权利要求34至43任一项所述的方法，其中所述目标多核苷酸具有两个或多个间隔区。
45.根据权利要求34至44任一项所述的方法，其中所述一个或多个停滞的解旋酶使用根据权利要求1至31中任一项所述的方法被移动穿过所述一个或多个间隔区。
46.一种用于控制目标多核苷酸移动的适配器，其中所述适配器包括：(a)在5'至3'方向上的(L-S-D)n或(D-S-L)n，其中L是单链多核苷酸或非杂交的多核苷酸，S是间隔区，D是双链多核苷酸，且其中n是整数，以及(b)停滞在每个适配器上的一个或多个解旋酶。
47.根据权利要求46所述的适配器，其中L仅能够结合一个解旋酶(L1)或仅能够结合两个解旋酶(L2)。
48.根据权利要求47所述的适配器，其中n是1，且一个或两个解旋酶在所述适配器上停滞。
49.一种用于控制所述目标多核苷酸移动的试剂盒，其中所述试剂盒包括(a)一个或多个间隔区，(b)一个或多个解旋酶；以及(c)跨膜孔。
50.根据权利要求49所述的试剂盒，其中所述一个或多个间隔区如权利要求15至18中任一项中所定义的。
51.根据权利要求49或50所述的试剂盒，其中所述试剂盒包括根据权利要求46至48任一项中所述的适配器。
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PCT/GB2014/050175 WO2014135838A1 (en) 2013-03-08 2014-01-22 Enzyme stalling method

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105209634A true CN105209634A (zh) 2015-12-30
CN105209634B CN105209634B (zh) 2020-05-12

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ID=51490681

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201480013152.3A Active CN105209634B (zh) 2013-03-08 2014-01-22 酶停滞方法

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US (3) US10221450B2 (zh)
EP (1) EP2964779B1 (zh)
JP (1) JP6408494B2 (zh)
KR (1) KR102168813B1 (zh)
CN (1) CN105209634B (zh)
AU (1) AU2014224432B2 (zh)
BR (1) BR112015021788B1 (zh)
CA (1) CA2901545C (zh)
SG (1) SG11201507138RA (zh)
WO (1) WO2014135838A1 (zh)

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109219665A (zh) * 2016-05-25 2019-01-15 牛津纳米孔技术公司 方法
WO2020259678A1 (zh) * 2019-06-26 2020-12-30 南京金斯瑞生物科技有限公司 一种含有阻断物的寡核苷酸
CN112567233A (zh) * 2018-08-28 2021-03-26 株式会社日立高新技术 生物分子分析装置
CN113862264A (zh) * 2021-12-03 2021-12-31 北京齐碳科技有限公司 用于靶多核苷酸测序的衔接子、构建体、方法和应用
CN114269947A (zh) * 2019-05-22 2022-04-01 牛津纳米孔科技公开有限公司 方法
CN114364797A (zh) * 2019-09-18 2022-04-15 株式会社日立高新技术 衔接子分子、该衔接子分子与生物分子结合而成的生物分子-衔接子分子复合体、生物分子分析装置和生物分子分析方法
CN114457145A (zh) * 2022-01-29 2022-05-10 成都齐碳科技有限公司 用于表征靶多核苷酸测序的接头、构建体、方法和应用
CN115777019A (zh) * 2021-04-06 2023-03-10 成都齐碳科技有限公司 经修饰的Prp43解旋酶及其用途
CN116478983A (zh) * 2022-11-21 2023-07-25 北京普译生物科技有限公司 一种rna-dna嵌合接头及其应用
WO2024124567A1 (zh) 2022-12-16 2024-06-20 深圳华大生命科学研究院 纳米孔测序方法和试剂盒
US12168799B2 (en) 2011-07-25 2024-12-17 Oxford Nanopore Technologies Plc Hairpin loop method for double strand polynucleotide sequencing using transmembrane pores
US12448646B2 (en) 2012-07-19 2025-10-21 Oxford Nanopore Technologies Plc SSB method
US12584168B2 (en) 2014-02-21 2026-03-24 Oxford Nanopore Technologies Plc Sample preparation method

Families Citing this family (81)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3092369C (en) 2008-09-22 2025-09-23 University Of Washington MSP NANOPORES AND ASSOCIATED PROCESSES
JP5843614B2 (ja) 2009-01-30 2016-01-13 オックスフォード ナノポア テクノロジーズ リミテッド 膜貫通配列決定における核酸構築物のためのアダプター
EP2633080B1 (en) 2010-10-29 2018-12-05 President and Fellows of Harvard College Method of detecting targets using fluorescently labelled nucleic acid nanotube probes
SG10201604316WA (en) 2011-05-27 2016-07-28 Oxford Nanopore Tech Ltd Coupling method
JP6226869B2 (ja) 2011-10-21 2017-11-08 オックスフォード ナノポール テクノロジーズ リミテッド 酵素法
BR112014016112B8 (pt) 2011-12-29 2022-12-27 Oxford Nanopore Tech Ltd Método e aparelho para caracterizar um polinucleotídeo alvo, kit, e, uso de uma helicase
WO2013121201A1 (en) 2012-02-15 2013-08-22 Oxford Nanopore Technologies Limited Aptamer method
JP6271505B2 (ja) 2012-04-10 2018-01-31 オックスフォード ナノポール テクノロジーズ リミテッド 変異体ライセニンポア
EP2875128B8 (en) 2012-07-19 2020-06-24 Oxford Nanopore Technologies Limited Modified helicases
EP2895618B1 (en) 2012-09-14 2017-07-26 Oxford Nanopore Technologies Limited Sample preparation method
EP2917366B1 (en) 2012-11-06 2017-08-02 Oxford Nanopore Technologies Limited Quadruplex method
GB201318465D0 (en) 2013-10-18 2013-12-04 Oxford Nanopore Tech Ltd Method
GB201314695D0 (en) 2013-08-16 2013-10-02 Oxford Nanopore Tech Ltd Method
KR102168813B1 (ko) 2013-03-08 2020-10-22 옥스포드 나노포어 테크놀로지즈 리미티드 효소 정지 방법
AU2014227653B2 (en) 2013-03-15 2017-04-20 The General Hospital Corporation Using RNA-guided foki nucleases (RFNs) to increase specificity for RNA-guided genome editing
WO2014204578A1 (en) 2013-06-21 2014-12-24 The General Hospital Corporation Using rna-guided foki nucleases (rfns) to increase specificity for rna-guided genome editing
US10760064B2 (en) 2013-03-15 2020-09-01 The General Hospital Corporation RNA-guided targeting of genetic and epigenomic regulatory proteins to specific genomic loci
GB201313477D0 (en) 2013-07-29 2013-09-11 Univ Leuven Kath Nanopore biosensors for detection of proteins and nucleic acids
GB201406151D0 (en) 2014-04-04 2014-05-21 Oxford Nanopore Tech Ltd Method
CN118256603A (zh) 2013-10-18 2024-06-28 牛津纳米孔科技公开有限公司 经修饰的酶
JP6749243B2 (ja) 2014-01-22 2020-09-02 オックスフォード ナノポール テクノロジーズ リミテッド １つまたは複数のポリヌクレオチド結合タンパク質を標的ポリヌクレオチドに付着させる方法
GB201406155D0 (en) 2014-04-04 2014-05-21 Oxford Nanopore Tech Ltd Method
EP4245859A3 (en) 2014-03-11 2023-11-08 President and Fellows of Harvard College High-throughput and highly multiplexed imaging with programmable nucleic acid probes
EP3126515B1 (en) 2014-04-04 2018-08-29 Oxford Nanopore Technologies Limited Method for characterising a double stranded nucleic acid using a nano-pore and anchor molecules at both ends of said nucleic acid
GB201417712D0 (en) 2014-10-07 2014-11-19 Oxford Nanopore Tech Ltd Method
US10443097B2 (en) 2014-05-02 2019-10-15 Oxford Nanopore Technologies Ltd. Method of improving the movement of a target polynucleotide with respect to a transmembrane pore
US10400014B2 (en) 2014-09-01 2019-09-03 Oxford Nanopore Technologies Ltd. Mutant CsgG pores
US10266885B2 (en) 2014-10-07 2019-04-23 Oxford Nanopore Technologies Ltd. Mutant pores
GB201418159D0 (en) 2014-10-14 2014-11-26 Oxford Nanopore Tech Ltd Method
GB201418469D0 (en) 2014-10-17 2014-12-03 Oxford Nanopore Tech Ltd Method
KR102457147B1 (ko) 2014-10-17 2022-10-19 옥스포드 나노포어 테크놀로지즈 피엘씨 나노 세공 rna 특징 규명을 위한 방법
ES2891085T3 (es) * 2015-01-30 2022-01-26 Harvard College Obtención de imágenes sin microscopio
GB201502809D0 (en) 2015-02-19 2015-04-08 Oxford Nanopore Tech Ltd Mutant pore
GB201502810D0 (en) 2015-02-19 2015-04-08 Oxford Nanopore Tech Ltd Method
US11169138B2 (en) 2015-04-14 2021-11-09 Katholieke Universiteit Leuven Nanopores with internal protein adaptors
US9926546B2 (en) 2015-08-28 2018-03-27 The General Hospital Corporation Engineered CRISPR-Cas9 nucleases
US9512446B1 (en) 2015-08-28 2016-12-06 The General Hospital Corporation Engineered CRISPR-Cas9 nucleases
KR102837999B1 (ko) 2015-12-08 2025-07-24 카트호리이케 유니버시타이트 로이펜 변형된 나노세공, 그를 포함하는 조성물, 및 그의 용도
AU2017225374B2 (en) 2016-03-02 2020-03-05 Oxford Nanopore Technologies Limited Mutant pore
WO2017174990A1 (en) 2016-04-06 2017-10-12 Oxford Nanopore Technologies Limited Mutant pore
GB201609221D0 (en) 2016-05-25 2016-07-06 Oxford Nanopore Tech Ltd Method
EP4063521B1 (en) 2016-05-25 2024-02-21 Oxford Nanopore Technologies PLC Method of nanopore sequencing
CN109923213B (zh) 2016-09-20 2023-02-28 哈佛学院院长及董事 分子验证系统
GB201620450D0 (en) 2016-12-01 2017-01-18 Oxford Nanopore Tech Ltd Method
JP2020504600A (ja) 2016-12-09 2020-02-13 アルティヴュー， インク． 標識化核酸イメージング剤を使用した多重イメージングのための改善された方法
CN108220267B (zh) * 2016-12-22 2022-10-04 丰益(上海)生物技术研发中心有限公司 磷脂酶及其应用
GB201707122D0 (en) 2017-05-04 2017-06-21 Oxford Nanopore Tech Ltd Pore
GB201707140D0 (en) 2017-05-04 2017-06-21 Oxford Nanopore Tech Ltd Method
WO2019006214A1 (en) 2017-06-29 2019-01-03 President And Fellows Of Harvard College DETERMINISTIC PROGRESSION OF POLYMERS THROUGH A NANOPORE
WO2019002893A1 (en) 2017-06-30 2019-01-03 Vib Vzw NEW PROTEIN PORES
GB2569977A (en) 2018-01-05 2019-07-10 Oxford Nanopore Tech Ltd Method
CN112189055B (zh) 2018-03-22 2024-07-19 哈佛学院院长及董事 用于分子认证的方法和组合物
GB201807793D0 (en) 2018-05-14 2018-06-27 Oxford Nanopore Tech Ltd Method
GB201808558D0 (en) 2018-05-24 2018-07-11 Oxford Nanopore Tech Ltd Method
GB201808554D0 (en) 2018-05-24 2018-07-11 Oxford Nanopore Tech Ltd Method
GB201808556D0 (en) 2018-05-24 2018-07-11 Oxford Nanopore Tech Ltd Method
GB201809323D0 (en) 2018-06-06 2018-07-25 Oxford Nanopore Tech Ltd Method
GB201907246D0 (en) 2019-05-22 2019-07-03 Oxford Nanopore Tech Ltd Method
US11926819B2 (en) 2019-05-28 2024-03-12 The Regents Of The University Of California Methods of adding polymers to ribonucleic acids
GB201915480D0 (en) 2019-10-25 2019-12-11 Oxford Nanopore Tech Ltd Improved nanopore sensing device, components and method of manufacture
KR20220110213A (ko) 2019-12-02 2022-08-05 옥스포드 나노포어 테크놀로지즈 피엘씨 나노포어를 사용하여 표적 폴리펩티드를 특징분석하는 방법
GB202016874D0 (en) 2020-10-23 2020-12-09 Oxford Nanopore Tech Ltd Nanopore support structure and manufacture thereof
WO2021255476A2 (en) * 2020-06-18 2021-12-23 Oxford Nanopore Technologies Limited Method
CN116075596A (zh) 2020-08-07 2023-05-05 牛津纳米孔科技公开有限公司 鉴定核酸条形码的方法
WO2022243692A1 (en) 2021-05-19 2022-11-24 Oxford Nanopore Technologies Plc Methods for complement strand sequencing
GB202107192D0 (en) 2021-05-19 2021-06-30 Oxford Nanopore Tech Ltd Method
GB202107354D0 (en) 2021-05-24 2021-07-07 Oxford Nanopore Tech Ltd Method
CN114262735B (zh) * 2021-12-15 2025-09-16 成都齐碳科技有限公司 用于表征多核苷酸的衔接体及其用途
GB202118908D0 (en) 2021-12-23 2022-02-09 Oxford Nanopore Tech Ltd Method
GB202118906D0 (en) * 2021-12-23 2022-02-09 Oxford Nanopore Tech Ltd Method
IL320502A (en) 2022-10-28 2025-06-01 Univ Groningen Nanopore-based protein efflux
GB202216162D0 (en) 2022-10-31 2022-12-14 Oxford Nanopore Tech Plc Method
GB202307486D0 (en) 2023-05-18 2023-07-05 Oxford Nanopore Tech Plc Method
GB202307494D0 (en) 2023-05-18 2023-07-05 Oxford Nanopore Tech Ltd Nanopore sequencing and preparation modular instrument
GB202317028D0 (en) 2023-11-06 2023-12-20 Oxford Nanopore Tech Ltd Method
GB202407055D0 (en) 2024-05-17 2024-07-03 Oxford Nanopore Tech Plc Enhanced polynucleotide sequencing
GB202407044D0 (en) 2024-05-17 2024-07-03 Oxford Nanopore Tech Plc Polymer analysis using transformer neural network
GB202407228D0 (en) 2024-05-21 2024-07-03 Oxford Nanopore Tech Plc Method
GB202413618D0 (en) 2024-09-16 2024-10-30 Oxford Nanopore Tech Plc peptide characterisation
GB2644084A (en) 2024-09-16 2026-03-18 Oxford Nanopore Tech Plc Augmented consensus and variant calling
GB202413747D0 (en) 2024-09-18 2024-10-30 Oxford Nanopore Tech Plc Preprocessing nanopore signals

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006028508A2 (en) * 2004-03-23 2006-03-16 President And Fellows Of Harvard College Methods and apparatus for characterizing polynucleotides
CN102245760A (zh) * 2008-07-07 2011-11-16 牛津纳米孔技术有限公司 酶-孔构建体
WO2013014451A1 (en) * 2011-07-25 2013-01-31 Oxford Nanopore Technologies Limited Hairpin loop method for double strand polynucleotide sequencing using transmembrane pores

Family Cites Families (207)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BE755065A (fr) 1969-08-20 1971-02-01 Sicli Extincteur d'incendie a rechargement
FI82266C (fi) 1982-10-19 1991-02-11 Cetus Corp Foerfarande foer framstaellning av il-2 -mutein.
US5198543A (en) 1989-03-24 1993-03-30 Consejo Superior Investigaciones Cientificas PHI29 DNA polymerase
GB8924338D0 (en) 1989-10-28 1989-12-13 Atomic Energy Authority Uk Electrodes
US5215899A (en) 1989-11-09 1993-06-01 Miles Inc. Nucleic acid amplification employing ligatable hairpin probe and transcription
US5424413A (en) 1992-01-22 1995-06-13 Gen-Probe Incorporated Branched nucleic acid probes
FR2703693B1 (fr) 1993-04-06 1995-07-13 Pasteur Institut Procédé rapide de détermination d'une séquence d'ADN et application au séquençage et au diagnostic.
US5714320A (en) 1993-04-15 1998-02-03 University Of Rochester Rolling circle synthesis of oligonucleotides and amplification of select randomized circular oligonucleotides
EP0753071A1 (en) 1993-04-28 1997-01-15 Worcester Foundation For Experimental Biology Cell-targeted lytic pore-forming agents
US5777078A (en) 1993-04-28 1998-07-07 Worcester Foundation For Experimental Biology Triggered pore-forming agents
DE4320201A1 (de) 1993-06-18 1995-01-12 Asta Medica Ag Verwendung von Cetrorelix und weiteren Nona- und Dekapeptiden zur Herstellung eines Arzneimittels zur Bekämpfung von Aids und zur Wachstumsstimulation
US5561043A (en) 1994-01-31 1996-10-01 Trustees Of Boston University Self-assembling multimeric nucleic acid constructs
US7569341B2 (en) 1994-01-31 2009-08-04 Trustees Of Boston University Nucleic acid directed immobilization arrays and methods of assembly
US6362002B1 (en) 1995-03-17 2002-03-26 President And Fellows Of Harvard College Characterization of individual polymer molecules based on monomer-interface interactions
US5795782A (en) 1995-03-17 1998-08-18 President & Fellows Of Harvard College Characterization of individual polymer molecules based on monomer-interface interactions
US6395887B1 (en) 1995-08-01 2002-05-28 Yale University Analysis of gene expression by display of 3'-end fragments of CDNAS
US5866336A (en) 1996-07-16 1999-02-02 Oncor, Inc. Nucleic acid amplification oligonucleotides with molecular energy transfer labels and methods based thereon
DE19648625A1 (de) 1996-11-13 1998-05-14 Soft Gene Gmbh Mikroprojektil für das Einbringen von Substanzen in Zellen durch ballistischen Transfer
JP3891620B2 (ja) 1996-11-14 2007-03-14 株式会社アイシン・コスモス研究所 ヘアピン型構造の核酸プローブ分子、及び該核酸プローブ分子を利用した核酸検出方法
US20020197614A1 (en) 1997-05-16 2002-12-26 Mosaic Technologies, Inc. Electrophoretic analysis of target molecules using adapter molecules
WO1999005167A1 (en) 1997-07-25 1999-02-04 University Of Massachusetts Designed protein pores as components for biosensors
US6087099A (en) 1997-09-08 2000-07-11 Myriad Genetics, Inc. Method for sequencing both strands of a double stranded DNA in a single sequencing reaction
US6127166A (en) 1997-11-03 2000-10-03 Bayley; Hagan Molluscan ligament polypeptides and genes encoding them
JPH11137260A (ja) 1997-11-06 1999-05-25 Soyaku Gijutsu Kenkyusho:Kk 抗インフルエンザウイルス環状ダンベル型ｒｎａ−ｄｎａキメラ化合物及び抗インフルエンザウイルス剤
US6123819A (en) 1997-11-12 2000-09-26 Protiveris, Inc. Nanoelectrode arrays
DE19826758C1 (de) 1998-06-15 1999-10-21 Soft Gene Gmbh Darstellung von linearen kovalent geschlossenen DNA-Molekülen als Expressionskonstrukte
US6743605B1 (en) 1998-06-24 2004-06-01 Enzo Life Sciences, Inc. Linear amplification of specific nucleic acid sequences
US6787308B2 (en) 1998-07-30 2004-09-07 Solexa Ltd. Arrayed biomolecules and their use in sequencing
US6235502B1 (en) 1998-09-18 2001-05-22 Molecular Staging Inc. Methods for selectively isolating DNA using rolling circle amplification
US6150112A (en) 1998-09-18 2000-11-21 Yale University Methods for identifying DNA sequences for use in comparison of DNA samples by their lack of polymorphism using Y shape adaptors
US6267872B1 (en) 1998-11-06 2001-07-31 The Regents Of The University Of California Miniature support for thin films containing single channels or nanopores and methods for using same
US6426231B1 (en) 1998-11-18 2002-07-30 The Texas A&M University System Analyte sensing mediated by adapter/carrier molecules
WO2000034527A2 (en) 1998-12-11 2000-06-15 The Regents Of The University Of California Targeted molecular bar codes
NO986133D0 (no) 1998-12-23 1998-12-23 Preben Lexow FremgangsmÕte for DNA-sekvensering
US7056661B2 (en) 1999-05-19 2006-06-06 Cornell Research Foundation, Inc. Method for sequencing nucleic acid molecules
JP2003502166A (ja) 1999-06-22 2003-01-21 プレジデント・アンド・フェローズ・オブ・ハーバード・カレッジ 固体状態の次元的特徴の制御
WO2001002425A2 (en) 1999-06-29 2001-01-11 University Health Network Peptide conjugates for the stabilization of membrane proteins and interactions with biological membranes
JP2003527087A (ja) 1999-08-13 2003-09-16 イェール・ユニバーシティ バイナリーコード化配列タグ
US6274320B1 (en) 1999-09-16 2001-08-14 Curagen Corporation Method of sequencing a nucleic acid
US6682649B1 (en) 1999-10-01 2004-01-27 Sophion Bioscience A/S Substrate and a method for determining and/or monitoring electrophysiological properties of ion channels
WO2001040516A2 (en) 1999-12-02 2001-06-07 Molecular Staging Inc. Generation of single-strand circular dna from linear self-annealing segments
WO2001059453A2 (en) 2000-02-11 2001-08-16 The Texas A & M University System Biosensor compositions and methods of use
JP2003524422A (ja) 2000-02-25 2003-08-19 インヴィトロジェン コーポレーション トポイソメラーゼリンカー介在型増幅法
US20020132978A1 (en) 2000-03-21 2002-09-19 Hans-Peter Gerber VEGF-modulated genes and methods employing them
DK1265914T3 (da) 2000-03-22 2008-03-10 Curagen Corp WNT-1-relaterede polypeptider og nukleinsyrer, der koder for samme
US6596488B2 (en) 2000-03-30 2003-07-22 City Of Hope Tumor suppressor gene
US6387624B1 (en) 2000-04-14 2002-05-14 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Construction of uni-directionally cloned cDNA libraries from messenger RNA for improved 3′ end DNA sequencing
US7001792B2 (en) 2000-04-24 2006-02-21 Eagle Research & Development, Llc Ultra-fast nucleic acid sequencing device and a method for making and using the same
US20020132350A1 (en) 2000-09-14 2002-09-19 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Targeted genetic manipulation using Mu bacteriophage cleaved donor complex
US6709861B2 (en) 2000-11-17 2004-03-23 Lucigen Corp. Cloning vectors and vector components
AU2002239284A1 (en) 2000-11-27 2002-06-03 The Regents Of The University Of California Methods and devices for characterizing duplex nucleic acid molecules
US20020197618A1 (en) 2001-01-20 2002-12-26 Sampson Jeffrey R. Synthesis and amplification of unstructured nucleic acids for rapid sequencing
US20030087232A1 (en) 2001-01-25 2003-05-08 Fred Christians Methods for screening polypeptides
US7807408B2 (en) 2001-03-19 2010-10-05 President & Fellows Of Harvard College Directed evolution of proteins
US6863833B1 (en) 2001-06-29 2005-03-08 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Microfabricated apertures for supporting bilayer lipid membranes
AU2002320294B2 (en) 2001-07-03 2009-01-15 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Mammalian sweet and amino acid heterodimeric taste receptors
US6852492B2 (en) 2001-09-24 2005-02-08 Intel Corporation Nucleic acid sequencing by raman monitoring of uptake of precursors during molecular replication
EP1487978B1 (en) 2002-03-15 2008-11-19 Nuevolution A/S An improved method for synthesising templated molecules
WO2003095669A1 (en) 2002-05-10 2003-11-20 The Texas A & M University System Stochastic sensing through covalent interactions
US7452699B2 (en) 2003-01-15 2008-11-18 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Amplification of DNA in a hairpin structure, and applications
WO2004072294A2 (en) 2003-02-12 2004-08-26 Genizon Svenska Ab Methods and means for nucleic acid sequencing
US20040209299A1 (en) 2003-03-07 2004-10-21 Rubicon Genomics, Inc. In vitro DNA immortalization and whole genome amplification using libraries generated from randomly fragmented DNA
JP4722035B2 (ja) 2003-03-25 2011-07-13 アジレント・テクノロジーズ・インク Ｄｎａポリメラーゼ融合物およびその使用
US7745116B2 (en) 2003-04-08 2010-06-29 Pacific Biosciences Of California, Inc. Composition and method for nucleic acid sequencing
US20100035254A1 (en) 2003-04-08 2010-02-11 Pacific Biosciences Of California, Inc. Composition and method for nucleic acid sequencing
US7163658B2 (en) 2003-04-23 2007-01-16 Rouvain Bension Rapid sequencing of polymers
US7344882B2 (en) 2003-05-12 2008-03-18 Bristol-Myers Squibb Company Polynucleotides encoding variants of the TRP channel family member, LTRPC3
US20070122885A1 (en) 2005-08-22 2007-05-31 Fermalogic, Inc. Methods of increasing production of secondary metabolites by manipulating metabolic pathways that include methylmalonyl-coa
WO2005056750A2 (en) 2003-12-11 2005-06-23 Quark Biotech, Inc. Inversion-duplication of nucleic acids and libraries prepared thereby
GB0400584D0 (en) 2004-01-12 2004-02-11 Solexa Ltd Nucleic acid chacterisation
JP2005253427A (ja) 2004-03-15 2005-09-22 Aisin Seiki Co Ltd 核酸検出方法及び核酸単離方法
GB2413796B (en) 2004-03-25 2006-03-29 Global Genomics Ab Methods and means for nucleic acid sequencing
US20050227239A1 (en) 2004-04-08 2005-10-13 Joyce Timothy H Microarray based affinity purification and analysis device coupled with solid state nanopore electrodes
US7618778B2 (en) 2004-06-02 2009-11-17 Kaufman Joseph C Producing, cataloging and classifying sequence tags
WO2005124888A1 (en) 2004-06-08 2005-12-29 President And Fellows Of Harvard College Suspended carbon nanotube field effect transistor
US7700281B2 (en) 2004-06-30 2010-04-20 Usb Corporation Hot start nucleic acid amplification
CA2577079C (en) 2004-08-13 2014-05-20 President And Fellows Of Harvard College An ultra high-throughput opti-nanopore dna readout platform
US20060086626A1 (en) 2004-10-22 2006-04-27 Joyce Timothy H Nanostructure resonant tunneling with a gate voltage source
US7867716B2 (en) 2004-12-21 2011-01-11 The Texas A&M University System High temperature ion channels and pores
US7890268B2 (en) 2004-12-28 2011-02-15 Roche Molecular Systems, Inc. De-novo sequencing of nucleic acids
GB0505971D0 (en) 2005-03-23 2005-04-27 Isis Innovation Delivery of molecules to a lipid bilayer
US7507575B2 (en) 2005-04-01 2009-03-24 3M Innovative Properties Company Multiplex fluorescence detection device having removable optical modules
US7601499B2 (en) 2005-06-06 2009-10-13 454 Life Sciences Corporation Paired end sequencing
US20070020640A1 (en) 2005-07-21 2007-01-25 Mccloskey Megan L Molecular encoding of nucleic acid templates for PCR and other forms of sequence analysis
WO2007018601A1 (en) 2005-08-02 2007-02-15 Rubicon Genomics, Inc. Compositions and methods for processing and amplification of dna, including using multiple enzymes in a single reaction
GB0523282D0 (en) 2005-11-15 2005-12-21 Isis Innovation Methods using pores
CA2633476C (en) 2005-12-22 2015-04-21 Pacific Biosciences Of California, Inc. Active surface coupled polymerases
US7932029B1 (en) 2006-01-04 2011-04-26 Si Lok Methods for nucleic acid mapping and identification of fine-structural-variations in nucleic acids and utilities
EP1994179A2 (en) 2006-02-18 2008-11-26 Michael Strathmann Massively multiplexed sequencing
US8673567B2 (en) 2006-03-08 2014-03-18 Atila Biosystems, Inc. Method and kit for nucleic acid sequence detection
DK3239304T3 (da) 2006-04-04 2020-10-26 Keygene Nv Højgennemløbsdetektering af molekylære markører baseret på AFLP og sekventering med højt gennemløb
US8889348B2 (en) 2006-06-07 2014-11-18 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York DNA sequencing by nanopore using modified nucleotides
JP4876766B2 (ja) 2006-08-10 2012-02-15 トヨタ自動車株式会社 燃料電池
EP2059606A4 (en) 2006-09-06 2010-04-07 Phasebio Pharmaceuticals Inc PEPTIDE FUSION THERAPEUTIC COMPOSITIONS
WO2008045575A2 (en) 2006-10-13 2008-04-17 J. Craig Venter Institute, Inc. Sequencing method
US8343746B2 (en) 2006-10-23 2013-01-01 Pacific Biosciences Of California, Inc. Polymerase enzymes and reagents for enhanced nucleic acid sequencing
GB2445016B (en) 2006-12-19 2012-03-07 Microsaic Systems Plc Microengineered ionisation device
WO2008102120A1 (en) 2007-02-20 2008-08-28 Oxford Nanopore Technologies Limited Lipid bilayer sensor system
AU2008236694B2 (en) 2007-04-04 2014-01-23 The Regents Of The University Of California Compositions, devices, systems, and methods for using a nanopore
EP3543357A1 (en) 2007-05-08 2019-09-25 Trustees of Boston University Chemical functionalization of solid-state nanopores and nanopore arrays and applications thereof
US8698481B2 (en) 2007-09-12 2014-04-15 President And Fellows Of Harvard College High-resolution molecular sensor
GB2453377A (en) 2007-10-05 2009-04-08 Isis Innovation Transmembrane protein pores and molecular adapters therefore.
KR101414713B1 (ko) 2007-10-11 2014-07-03 삼성전자주식회사 리가제 및 엔도뉴클레아제의 존재하에서 롤링서클 증폭에의하여 표적 핵산을 증폭하는 방법
US8951731B2 (en) 2007-10-15 2015-02-10 Complete Genomics, Inc. Sequence analysis using decorated nucleic acids
GB0724736D0 (en) 2007-12-19 2008-01-30 Oxford Nanolabs Ltd Formation of layers of amphiphilic molecules
WO2009084721A1 (en) 2007-12-31 2009-07-09 Fujirebio Inc. Clusters of microresonators for cavity mode optical sensing
US8852864B2 (en) 2008-01-17 2014-10-07 Sequenom Inc. Methods and compositions for the analysis of nucleic acids
US8263367B2 (en) 2008-01-25 2012-09-11 Agency For Science, Technology And Research Nucleic acid interaction analysis
US8231969B2 (en) 2008-03-26 2012-07-31 University Of Utah Research Foundation Asymmetrically functionalized nanoparticles
WO2009120374A2 (en) 2008-03-28 2009-10-01 Pacific Biosciences Of California, Inc. Methods and compositions for nucleic acid sample preparation
US8628940B2 (en) 2008-09-24 2014-01-14 Pacific Biosciences Of California, Inc. Intermittent detection during analytical reactions
MX2010010600A (es) 2008-03-28 2011-03-30 Pacific Biosciences California Inc Composiciones y metodos para secuenciacion de acidos nucleicos.
WO2009132315A1 (en) 2008-04-24 2009-10-29 Life Technologies Corporation Method of sequencing and mapping target nucleic acids
WO2009132124A2 (en) * 2008-04-24 2009-10-29 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Geometric patterns and lipid bilayers for dna molecule organization and uses thereof
JP2011527191A (ja) 2008-07-07 2011-10-27 オックスフォード ナノポア テクノロジーズ リミテッド 塩基検出細孔
US20100092960A1 (en) * 2008-07-25 2010-04-15 Pacific Biosciences Of California, Inc. Helicase-assisted sequencing with molecular beacons
EP2334802A4 (en) 2008-09-09 2012-01-25 Life Technologies Corp METHODS OF GENERATING SPECIFIC LIBRARIES OF GENES
US8481264B2 (en) 2008-09-19 2013-07-09 Pacific Biosciences Of California, Inc. Immobilized nucleic acid complexes for sequence analysis
CA3092369C (en) 2008-09-22 2025-09-23 University Of Washington MSP NANOPORES AND ASSOCIATED PROCESSES
US8383369B2 (en) 2008-09-24 2013-02-26 Pacific Biosciences Of California, Inc. Intermittent detection during analytical reactions
WO2010036287A1 (en) 2008-09-24 2010-04-01 Pacific Biosciences Of California, Inc. Intermittent detection during analytical reactions
JP5794572B2 (ja) 2008-10-24 2015-10-14 エピセンター テクノロジーズ コーポレイションＥｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ 核酸を修飾するためのトランスポゾン末端組成物及び方法
US9080211B2 (en) 2008-10-24 2015-07-14 Epicentre Technologies Corporation Transposon end compositions and methods for modifying nucleic acids
US8486630B2 (en) 2008-11-07 2013-07-16 Industrial Technology Research Institute Methods for accurate sequence data and modified base position determination
GB0820927D0 (en) 2008-11-14 2008-12-24 Isis Innovation Method
CN102317473A (zh) 2008-12-11 2012-01-11 加利福尼亚太平洋生物科学股份有限公司 核酸模板的分类
US20120100530A1 (en) 2009-01-30 2012-04-26 Oxford Nanopore Technologies Limited Enzyme mutant
JP5843614B2 (ja) 2009-01-30 2016-01-13 オックスフォード ナノポア テクノロジーズ リミテッド 膜貫通配列決定における核酸構築物のためのアダプター
CA2751470C (en) 2009-02-16 2016-07-26 Epicentre Technologies Corporation Template-independent ligation of single-stranded dna
JP5861223B2 (ja) 2009-02-23 2016-02-16 サイトムエックス セラピューティクス, インク.CytomX Therapeutics, Inc. プロタンパク質およびその使用方法
EP2227023A1 (en) 2009-03-05 2010-09-08 BRITISH TELECOMMUNICATIONS public limited company Video streaming
FR2943656A1 (fr) 2009-03-25 2010-10-01 Air Liquide Procede et installation de production d'hydrogene mettant en oeuvre un compresseur thermocinetique
GB0905140D0 (en) 2009-03-25 2009-05-06 Isis Innovation Method
US8986928B2 (en) 2009-04-10 2015-03-24 Pacific Biosciences Of California, Inc. Nanopore sequencing devices and methods
BRPI1012752B1 (pt) 2009-04-20 2019-06-25 Oxford Nanopore Technologies Limited Método e aparelho para detectar uma interação de uma entidade molecular com uma proteína de membrana em uma camada de moléculas anfifílicas
GB0910302D0 (en) 2009-06-15 2009-07-29 Lumora Ltd Nucleic acid amplification
US20120015821A1 (en) 2009-09-09 2012-01-19 Life Technologies Corporation Methods of Generating Gene Specific Libraries
CN102741430B (zh) 2009-12-01 2016-07-13 牛津楠路珀尔科技有限公司 生化分析仪器、用于进行生化分析的第一模块以及相关方法
US20120010085A1 (en) 2010-01-19 2012-01-12 Rava Richard P Methods for determining fraction of fetal nucleic acids in maternal samples
FR2955773B1 (fr) 2010-02-01 2017-05-26 Commissariat Energie Atomique Complexe moleculaire de ciblage des antigenes vers les cellules presentatrices d'antigene et ses applications pour la vaccination
KR20110100963A (ko) 2010-03-05 2011-09-15 삼성전자주식회사 미세 유동 장치 및 이를 이용한 표적 핵산의 염기 서열 결정 방법
US20110224106A1 (en) 2010-03-10 2011-09-15 Ibis Biosciences, Inc. Production Of Single-Stranded Circular Nucleic Acid
US8652779B2 (en) 2010-04-09 2014-02-18 Pacific Biosciences Of California, Inc. Nanopore sequencing using charge blockade labels
US8828211B2 (en) 2010-06-08 2014-09-09 President And Fellows Of Harvard College Nanopore device with graphene supported artificial lipid membrane
US20120244525A1 (en) 2010-07-19 2012-09-27 New England Biolabs, Inc. Oligonucleotide Adapters: Compositions and Methods of Use
EP2614156B1 (en) 2010-09-07 2018-08-01 The Regents of The University of California Control of dna movement in a nanopore at one nucleotide precision by a processive enzyme
CA2821299C (en) 2010-11-05 2019-02-12 Frank J. Steemers Linking sequence reads using paired code tags
EP2652153B1 (en) 2010-12-17 2017-07-05 The Trustees of Columbia University in the City of New York Dna sequencing by synthesis using modified nucleotides and nanopore detection
WO2012098561A2 (en) 2011-01-18 2012-07-26 Swamy R K A multipupurpose instrument for triangle solutions, measurements and geometrical applications called triometer
WO2012098562A2 (en) 2011-01-19 2012-07-26 Panacea Biotec Limited Liquid oral compositions of lanthanum salts
EP3037536B1 (en) 2011-01-28 2019-11-27 Illumina, Inc. Oligonucleotide replacement for di-tagged and directional libraries
US20120196279A1 (en) * 2011-02-02 2012-08-02 Pacific Biosciences Of California, Inc. Methods and compositions for nucleic acid sample preparation
AU2012215135B9 (en) 2011-02-11 2017-03-09 Oxford Nanopore Technologies Limited Mutant pores
SG10201604316WA (en) 2011-05-27 2016-07-28 Oxford Nanopore Tech Ltd Coupling method
US20130017978A1 (en) 2011-07-11 2013-01-17 Finnzymes Oy Methods and transposon nucleic acids for generating a dna library
US9145623B2 (en) 2011-07-20 2015-09-29 Thermo Fisher Scientific Oy Transposon nucleic acids comprising a calibration sequence for DNA sequencing
US9632102B2 (en) 2011-09-25 2017-04-25 Theranos, Inc. Systems and methods for multi-purpose analysis
EP3663412B1 (en) 2011-09-23 2022-03-09 Oxford Nanopore Technologies PLC Analysis of a polymer comprising polymer units by means of translocation through a nanopore
US20140308661A1 (en) 2011-09-25 2014-10-16 Theranos, Inc. Systems and methods for multi-analysis
US9810704B2 (en) 2013-02-18 2017-11-07 Theranos, Inc. Systems and methods for multi-analysis
JP6226869B2 (ja) 2011-10-21 2017-11-08 オックスフォード ナノポール テクノロジーズ リミテッド 酵素法
GB201120910D0 (en) 2011-12-06 2012-01-18 Cambridge Entpr Ltd Nanopore functionality control
US9404147B2 (en) 2011-12-19 2016-08-02 Gen-Probe Incorporated Closed nucleic acid structures
BR112014016112B8 (pt) 2011-12-29 2022-12-27 Oxford Nanopore Tech Ltd Método e aparelho para caracterizar um polinucleotídeo alvo, kit, e, uso de uma helicase
US9617591B2 (en) 2011-12-29 2017-04-11 Oxford Nanopore Technologies Ltd. Method for characterising a polynucleotide by using a XPD helicase
JP6333179B2 (ja) 2012-01-20 2018-05-30 ジニア テクノロジーズ， インコーポレイテッド ナノポアベースの分子検出および配列決定
NO2694769T3 (zh) 2012-03-06 2018-03-03
JP6271505B2 (ja) 2012-04-10 2018-01-31 オックスフォード ナノポール テクノロジーズ リミテッド 変異体ライセニンポア
US9116118B2 (en) 2012-06-08 2015-08-25 Pacific Biosciences Of California, Inc. Modified base detection with nanopore sequencing
TWI655213B (zh) 2012-07-13 2019-04-01 Menicon Co., Ltd. 自我組織化肽衍生物的製造方法
US9797009B2 (en) 2012-07-19 2017-10-24 Oxford Nanopore Technologies Limited Enzyme construct
EP2875128B8 (en) 2012-07-19 2020-06-24 Oxford Nanopore Technologies Limited Modified helicases
US11155860B2 (en) 2012-07-19 2021-10-26 Oxford Nanopore Technologies Ltd. SSB method
EP2895618B1 (en) 2012-09-14 2017-07-26 Oxford Nanopore Technologies Limited Sample preparation method
EP2911771B1 (en) 2012-10-26 2017-01-18 Oxford Nanopore Technologies Limited Droplet interfaces
GB201313121D0 (en) 2013-07-23 2013-09-04 Oxford Nanopore Tech Ltd Array of volumes of polar medium
EP2917732B1 (en) 2012-11-09 2016-09-07 Stratos Genomics Inc. Concentrating a target molecule for sensing by a nanopore
US9683230B2 (en) 2013-01-09 2017-06-20 Illumina Cambridge Limited Sample preparation on a solid support
US20140206842A1 (en) 2013-01-22 2014-07-24 Muhammed Majeed Peptides Modified with Triterpenoids and Small Organic Molecules: Synthesis and use in Cosmeceutical
KR102168813B1 (ko) 2013-03-08 2020-10-22 옥스포드 나노포어 테크놀로지즈 리미티드 효소 정지 방법
GB201314695D0 (en) 2013-08-16 2013-10-02 Oxford Nanopore Tech Ltd Method
GB201318465D0 (en) 2013-10-18 2013-12-04 Oxford Nanopore Tech Ltd Method
WO2014142850A1 (en) 2013-03-13 2014-09-18 Illumina, Inc. Methods and compositions for nucleic acid sequencing
JP6441893B2 (ja) 2013-03-19 2018-12-19 ディレクティド・ジェノミクス・エル・エル・シー 標的配列の濃縮
ES2660671T3 (es) 2013-05-24 2018-03-23 Illumina Cambridge Limited Secuenciado pirofosforolítico usando nanoporos
US10017814B2 (en) 2013-08-30 2018-07-10 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Selective modification of polymer subunits to improve nanopore-based analysis
CN118256603A (zh) 2013-10-18 2024-06-28 牛津纳米孔科技公开有限公司 经修饰的酶
GB201406151D0 (en) 2014-04-04 2014-05-21 Oxford Nanopore Tech Ltd Method
GB201321123D0 (en) 2013-11-29 2014-01-15 Linea Ab Q Amplification of circular molecules
JP6749243B2 (ja) 2014-01-22 2020-09-02 オックスフォード ナノポール テクノロジーズ リミテッド １つまたは複数のポリヌクレオチド結合タンパク質を標的ポリヌクレオチドに付着させる方法
GB201403096D0 (en) 2014-02-21 2014-04-09 Oxford Nanopore Tech Ltd Sample preparation method
WO2015148567A1 (en) 2014-03-24 2015-10-01 Bernick David L Molecular adapter for capture and manipulation of transfer rna
EP3126515B1 (en) 2014-04-04 2018-08-29 Oxford Nanopore Technologies Limited Method for characterising a double stranded nucleic acid using a nano-pore and anchor molecules at both ends of said nucleic acid
GB201417712D0 (en) 2014-10-07 2014-11-19 Oxford Nanopore Tech Ltd Method
SG11201610357UA (en) 2014-06-13 2017-01-27 Illumina Cambridge Ltd Methods and compositions for preparing sequencing libraries
US10017759B2 (en) 2014-06-26 2018-07-10 Illumina, Inc. Library preparation of tagged nucleic acid
WO2016003814A1 (en) 2014-06-30 2016-01-07 Illumina, Inc. Methods and compositions using one-sided transposition
WO2016022557A1 (en) 2014-08-05 2016-02-11 Twist Bioscience Corporation Cell free cloning of nucleic acids
US10435685B2 (en) 2014-08-19 2019-10-08 Pacific Biosciences Of California, Inc. Compositions and methods for enrichment of nucleic acids
EP3633047B1 (en) 2014-08-19 2022-12-28 Pacific Biosciences of California, Inc. Method of sequencing nucleic acids based on an enrichment of nucleic acids
US10400014B2 (en) 2014-09-01 2019-09-03 Oxford Nanopore Technologies Ltd. Mutant CsgG pores
GB201418159D0 (en) 2014-10-14 2014-11-26 Oxford Nanopore Tech Ltd Method
WO2016138080A1 (en) 2015-02-24 2016-09-01 Trustees Of Boston University Protection of barcodes during dna amplification using molecular hairpins
CN107208162B (zh) 2015-02-26 2020-12-29 株式会社日立高新技术 核酸分子的构建方法
GB201609220D0 (en) 2016-05-25 2016-07-06 Oxford Nanopore Tech Ltd Method
CN107488656B (zh) 2016-06-13 2020-07-17 陆欣华 一种核酸等温自扩增方法
GB201807793D0 (en) 2018-05-14 2018-06-27 Oxford Nanopore Tech Ltd Method

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006028508A2 (en) * 2004-03-23 2006-03-16 President And Fellows Of Harvard College Methods and apparatus for characterizing polynucleotides
CN102245760A (zh) * 2008-07-07 2011-11-16 牛津纳米孔技术有限公司 酶-孔构建体
WO2013014451A1 (en) * 2011-07-25 2013-01-31 Oxford Nanopore Technologies Limited Hairpin loop method for double strand polynucleotide sequencing using transmembrane pores

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ALAN J. TACKETT等: "Unwinding of Unnatural Substrates by a DNA Helicase", 《BIOCHEMISTRY》 *
ROBERT L. EOFF等: "Chemically Modified DNA Substrates Implicate the Importance of Electrostatic Interactions for DNA Unwinding by Dda Helicase", 《BIOCHEMISTRY》 *
ULRICH F.KEYSER: "Controlling molecular transport through nanopores", 《JOURNAL OF THE ROYAL SOCIETY INTERFACE》 *
李振海 等: "DNA与纳米结构的相互作用及基于力电作用的测序技术", 《力学进展》 *
韦贵将 等: "新一代测序技术的研究进展", 《现代生物医药进展》 *

Cited By (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US12168799B2 (en) 2011-07-25 2024-12-17 Oxford Nanopore Technologies Plc Hairpin loop method for double strand polynucleotide sequencing using transmembrane pores
US12448646B2 (en) 2012-07-19 2025-10-21 Oxford Nanopore Technologies Plc SSB method
US12584168B2 (en) 2014-02-21 2026-03-24 Oxford Nanopore Technologies Plc Sample preparation method
CN109219665B (zh) * 2016-05-25 2022-05-10 牛津纳米孔技术公司 修饰模板双链多核苷酸以用于表征的方法
CN109219665A (zh) * 2016-05-25 2019-01-15 牛津纳米孔技术公司 方法
US11649480B2 (en) 2016-05-25 2023-05-16 Oxford Nanopore Technologies Plc Method for modifying a template double stranded polynucleotide
CN112567233A (zh) * 2018-08-28 2021-03-26 株式会社日立高新技术 生物分子分析装置
CN114269947A (zh) * 2019-05-22 2022-04-01 牛津纳米孔科技公开有限公司 方法
CN114040983A (zh) * 2019-06-26 2022-02-11 南京金斯瑞生物科技有限公司 一种含有阻断物的寡核苷酸
WO2020259678A1 (zh) * 2019-06-26 2020-12-30 南京金斯瑞生物科技有限公司 一种含有阻断物的寡核苷酸
CN114364797B (zh) * 2019-09-18 2023-10-20 株式会社日立高新技术 生物分子分析方法
CN114364797A (zh) * 2019-09-18 2022-04-15 株式会社日立高新技术 衔接子分子、该衔接子分子与生物分子结合而成的生物分子-衔接子分子复合体、生物分子分析装置和生物分子分析方法
CN115777019A (zh) * 2021-04-06 2023-03-10 成都齐碳科技有限公司 经修饰的Prp43解旋酶及其用途
CN113862264A (zh) * 2021-12-03 2021-12-31 北京齐碳科技有限公司 用于靶多核苷酸测序的衔接子、构建体、方法和应用
WO2023143247A1 (zh) * 2022-01-29 2023-08-03 成都齐碳科技有限公司 用于表征靶多核苷酸测序的接头、构建体、方法和应用
CN114457145B (zh) * 2022-01-29 2023-08-11 成都齐碳科技有限公司 用于表征靶多核苷酸测序的接头、构建体、方法和应用
CN114457145A (zh) * 2022-01-29 2022-05-10 成都齐碳科技有限公司 用于表征靶多核苷酸测序的接头、构建体、方法和应用
CN116478983A (zh) * 2022-11-21 2023-07-25 北京普译生物科技有限公司 一种rna-dna嵌合接头及其应用
CN116478983B (zh) * 2022-11-21 2023-10-24 北京普译生物科技有限公司 一种rna-dna嵌合接头及其应用
WO2024124567A1 (zh) 2022-12-16 2024-06-20 深圳华大生命科学研究院 纳米孔测序方法和试剂盒
EP4636094A1 (en) 2022-12-16 2025-10-22 BGI Shenzhen Nanopore sequencing method and kit

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