JPH11137260A - 抗インフルエンザウイルス環状ダンベル型ｒｎａ−ｄｎａキメラ化合物及び抗インフルエンザウイルス剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 細胞毒性を有さず、タンパク質との相互作用
や細胞表面吸着阻害を引き起こすことがなく、しかも、
優れた核酸分解酵素耐性を有する環状ダンベル型ＲＮＡ
−ＤＮＡキメラ化合物を提供する。 【解決手段】 （１）インフルエンザウイルスのＰＢ１
遺伝子、ＰＢ２遺伝子、ＰＡ遺伝子、又はＮＰ遺伝子の
翻訳開始コドンＡＵＧを含有する標的領域の塩基配列に
対して相補的な塩基配列を含むＤＮＡ部分と、前記ＤＮ
Ａ部分の前記塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む
ＲＮＡ部分とを含み、前記ＲＮＡ部分と前記ＤＮＡ部分
とが二重鎖を形成するステム部分、及び（２）前記ステ
ム部分の両端部にそれぞれ位置するヘアピンループ部分
２個を含む。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、抗インフルエンザ
ウイルス環状ダンベル型ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ化合物及
び抗インフルエンザウイルス剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】毎年のように冬になると流行するインフ
ルエンザウイルスは、上気道炎を急性症状とし、頭痛、
関節炎などを伴う全身性の症状を引き起こす。インフル
エンザウイルスは、オルソミクソウイルス科に属し、Ａ
型、Ｂ型、及びＣ型の３型がある。インフルエンザウイ
ルスは、（−）鎖の一本鎖ＲＮＡウイルスで、Ａ型及び
Ｂ型の遺伝子は８分節からなり、Ｃ型の遺伝子は７分節
からなる。インフルエンザウイルスのＡ型及びＢ型の遺
伝子は、８本のマイナス鎖一本鎖状ＲＮＡ分節からな
り、インフルエンザウイルスのＣ型の遺伝子は、７本の
マイナス鎖一本鎖状ＲＮＡ分節からなり、総塩基数は約
１３５００残基あまりで、それぞれの分節は、異なる遺
伝子情報を指令している。

【０００３】インフルエンザウイルス粒子は、宿主細胞
に由来する脂質膜からなる直径８０〜１２０ｎｍのエン
ベロープに包まれており、このエンベロープは、その表
面に、それぞれ第４分節及び第６分節中の遺伝子に指令
されているヘマグルチニン（ＨＡ）及びノイラミニダー
ゼ（ＮＡ）のスパイクを有し、第７分節中の遺伝子に指
令されているマトリックス（Ｍ１）タンパク質によって
裏打ちされている。第７分節からは、ｍＲＮＡのスプラ
イシングによってＭ２と呼ばれるタンパク質も産生さ
れ、そのＭ２が、粒子構造タンパク質として、ＨＡの成
熟に必要なイオンチャンネルとして機能していると考え
られている。

【０００４】インフルエンザウイルス粒子内部に存在す
るウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡ
ポリメラーゼ（第１分節、第２分節、及び第３分節中の
遺伝子にそれぞれ指令されているＰＢ１サブユニットタ
ンパク質、ＰＢ２サブユニットタンパク質、及びＰＡサ
ブユニットタンパク質からなる）と、第５分節中の遺伝
子に指令されているヌクレオキャプシドタンパク質（Ｎ
Ｐ）と一緒になって複合体を形成しており、それ自身で
転写活性を触媒することができる。第８分節からは、感
染細胞にだけ見出される非粒子構成タンパク質であるＮ
Ｓ１と、ｍＲＮＡのスプライシングによって生じ、感染
細胞のみならず粒子中にも存在することが知られるよう
になったＮＳ２とが指令されている。

【０００５】インフルエンザウイルスが感染すると、感
染細胞では、ウイルスゲノムのマイナス（−）鎖ＲＮＡ
を鋳型として、２種類のプラス（＋）鎖ＲＮＡ、すなわ
ち、キャップ構造及びポリ（Ａ）鎖を有するｍＲＮＡ
と、ゲノムのマイナス（−）鎖ＲＮＡに完全相補的なｃ
ＲＮＡとが、合成される。子孫のウイルスゲノムｖＲＮ
Ａは、合成された前記ｃＲＮＡを鋳型として合成され
る。ｍＲＮＡの合成の過程を「転写」と定義し、ｃＲＮ
Ａを経由してｖＲＮＡを合成する過程を「複製」と定義
している。

【０００６】転写反応においては、はじめに、ウイルス
粒子に結合しているＲＮＡポリメラーゼによって、宿主
細胞のｍＲＮＡから、５’キャップ構造を含む１０〜１
３塩基の断片を切断して、これをプライマーとする。次
に、そのプライマーＲＮＡの３’末端にグアニン塩基を
付加し、ｖＲＮＡを鋳型としてｍＲＮＡ合成を開始す
る。鋳型の５’端末から内側１５〜２２塩基の間に存在
するウラシル塩基が５〜７個連続する部分までｖＲＮＡ
を転写し、その後、ＲＮＡの３’末端にポリ（Ａ）を付
加して転写反応を終結させる。一方、複製反応にはＲＮ
ＡポリメラーゼとＮＰが関与している。まず、（−）鎖
ＲＮＡは完全鎖長の（＋）鎖ＲＮＡに転写される。この
後、（＋）鎖ＲＮＡを鋳型として、（−）鎖のゲノムＲ
ＮＡを複製する。

【０００７】このように、インフルエンザウイルスの転
写及び複製には、３種類のＲＮＡポリメラーゼ（ＰＢ
１、ＰＢ２、及びＰＡ）と核タンパク質（ＮＰ）とが関
与しており、それぞれが１つのサブユニットとして機能
している。すなわち、ＰＢ２が宿主細胞のｍＲＮＡのキ
ャップ構造を認識して切断し、キャップとＲＮＡとの初
期構造を形成させる。これを受けて、ＰＢ１はＲＮＡ転
写を始動させ、ＰＡが伸長反応を行う。その際に、ＮＰ
は、ＮＰタンパク質の特殊な構造領域鋳型のｖＲＮＡに
結合してプライマーに近い働きをし、ＲＮＡ合成の完結
に作用する。このように、インフルエンザウイルスＲＮ
Ａポリメラーゼ（ＰＢ１、ＰＢ２、及びＰＡ）及び核タ
ンパク質（ＮＰ）は、転写・複製に重要な作用を有する
と共に、不可欠な要素であることがわかる。

【０００８】インフルエンザウイルスによる感染症の特
徴は、その流行が繰り返されるという点にあり、時に
は、世界的な規模での流行が起こることがある。この理
由は、頻繁に新型ウイルスが出現するためである。すな
わち、新型ウイルスでは通常、抗原性が異なるため、獲
得免疫による生体防御系が無力化されていることに起因
している。インフルエンザウイルスの塩基配列は、その
プロトタイプとしてのＡ／ＰＲ／８／３４株ｃＤＮＡの
クローン化に伴って、すべての塩基配列が１９８２年ま
でに決定されている。その後も、各種の新型インフルエ
ンザウイルスの遺伝子配列がデータベースに蓄積されて
おり、現在ではヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に次ぐ
報告例数となっている。

【０００９】流行が起こるのは、Ａ型又はＢ型のインフ
ルエンザであり、Ｃ型は、通常、流行しない。ヒトＡ型
インフルエンザには、Ｈ１Ｎ１型、Ｈ２Ｎ２型、及びＨ
３Ｎ２型の３亜型がある。流行には、パンデミー（世界
的大流行）と呼ばれるものと、エピデミー（流行）と呼
ばれるものとの２種類の流行がある。パンデミーは、抗
原性の不連続変異（シフト）による新型ウイルスが出現
した場合に起こる。抗原性のシフトは、それまで流行し
ていたヒトインフルエンザウイルスと、動物インフルエ
ンザウイルスとの間で遺伝子交雑が行なわれ、その結
果、動物ウイルスの抗原遺伝子を有する新型ウイルスが
出現することによって起こると考えられている。エピデ
ミーは、新型ウイルスが出現してパンデミーを起こした
後に、抗原性の連続変異（ドリフト）が起こった場合に
みられる。抗原性のドリフトは、抗原遺伝子における突
然変異の蓄積により、抗原タンパク質（ＨＡ又はＮＡ）
の抗原性が著しく変化した場合に起こる。

【００１０】このように抗原変異の著しいインフルエン
ザウイルスに対して、従来のインフルエンザウイルスワ
クチンによる対応では、常に後手に回る可能性がある。
すなわち、流行中のインフルエンザウイルスの型（例え
ば、Ｈ１Ｎ１型、Ｈ２Ｎ２型、又はＨ３Ｎ２型の亜型な
ど）とワクチンの型とが一致しなければ、全く意味がな
いからである。また、リバビリン又は塩酸リマンタジン
などの抗ウイルス剤（ウイルスを殺す薬剤）も存在する
が、これらの抗ウイルス剤の効果は、いずれも満足すべ
きものではなく、しかも、副作用の問題もある。

【００１１】流行中のインフルエンザウイルスの変異遺
伝子配列は、近年急速に発達した遺伝子解析技術によ
り、容易に解析することができるようになった。また、
これらの遺伝子に相補的なアンチセンスＤＮＡも、容易
に合成することができる。このアンチセンスＤＮＡを用
いると、ウイルス遺伝子を直接攻撃することができる。
これがアンチセンス法である。アンチセンス法とは、ｍ
ＲＮＡのある特定領域の塩基配列に相補的なＤＮＡ（ア
ンチセンスＤＮＡ）を作用させることにより、その領域
にコードされたタンパク質の合成を特異的に抑制し、細
胞内においてウイルス遺伝子だけを不活性化させる方法
である。

【００１２】アンチセンスＤＮＡの作用機序は、例え
ば、以下のように考えられている。まず、ｖＲＮＡから
ｍＲＮＡへの転写阻害がある。すなわち、ＤＮＡの２種
類と３種類を形成することによるＲＮＡポリメラーゼ読
み取り阻害によるもの、あるいは、合成途中のｍＲＮＡ
と、アンチセンスＤＮＡとの結合により、ｍＲＮＡの高
次構造が変化することによる阻害などが考えられる。次
に、前駆体ｍＲＮＡから成熟ｍＲＮＡへのプロセシング
の過程での阻害がある。すなわち、イントロン部分が切
り出され、エクソン部分が連結するスプライシングの段
階で、このイントロン部分とエクソン部分との境界部分
にアンチセンスＤＮＡが結合してこの過程を阻害するこ
とが考えられる。また、翻訳阻害としては、ｍＲＮＡの
翻訳開始領域にアンチセンスＤＮＡが結合することによ
るリボソームとの複合体形成の阻害などが考えられる。

【００１３】更に、リボヌクレアーゼＨの作用を利用し
て、アンチセンス効果をより高めることができるものと
考えられている。リボヌクレアーゼＨは、ＤＮＡ／ＲＮ
Ａの２重鎖に作用し、ｍＲＮＡのみを特異的に切断する
作用を有する。従って、標的遺伝子となるｍＲＮＡとア
ンチセンスＤＮＡとが結合すると、宿主のリボヌクレア
ーゼＨの作用によって標的遺伝子であるｍＲＮＡのみが
切断され、それと同時に、アンチセンスＤＮＡが遊離す
る。次に、このアンチセンスＤＮＡは、別の標的ｍＲＮ
Ａと結合し、こうして形成されるＤＮＡ／ＲＮＡの２重
鎖に対しても、宿主のリボヌクレアーゼＨが作用してｍ
ＲＮＡのみを切断する。ＤＮＡ／ＲＮＡの２重鎖の形
成、及びＲＮＡの切断は、連続的に起こるので、１分子
のアンチセンスＤＮＡによって多分子のｍＲＮＡを切断
することができる。

【００１４】このように、アンチセンス法に関して多く
の作用機序が可能性として考えられるが、アンチセンス
オリゴヌクレオチドを実際に細胞内（特に標的ｍＲＮ
Ａ）において作用機序どおりに作用させるためには、細
胞膜透過性に関する問題点と併せて、核酸分解酵素（ヌ
クレアーゼ）耐性に関する問題点、細胞毒性に関する問
題点、又は非特異的結合（例えば、タンパク質との相互
作用や細胞表面吸着阻害など）を引き起こす問題点など
を解決しなくてはならない。

【００１５】アンチセンスオリゴヌクレオチドの核酸分
解酵素耐性を高める方法としては、ホスホジエステル結
合のリン酸部分を化学修飾する方法を挙げることができ
る。代表的のものは、リン酸基の酸素原子をメチル基で
置換したメチルホスホネート（Ｍ−オリゴマー）、ある
いは、リン酸基の酸素原子を硫黄原子で置換したホスホ
ロチオエート（Ｓ−オリゴマー）などがある。しかし、
メチルホスホネート型アンチセンスオリゴヌクレオチド
は、培地に溶けにくく、しかも、光学異性体が非常に多
くでき、その光学異性体の中には効果のないものも生じ
るため、アンチセンスオリゴヌクレオチドを高濃度で使
用しなくてはならないなどの問題点がある。

【００１６】一方、ホスホロチオエート型アンチセンス
オリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ耐性も高く、細胞
内での寿命も長い。また、Ｓ−オリゴマーとｍＲＮＡと
の２重鎖は、そのＲＮＡを特異的に分解する酵素である
リボヌクレアーゼＨの基質となるので、アンチセンス効
果をより高めることができるものと考えられる。しか
し、Ｓ−オリゴマーは、高濃度において高い毒性を示
し、更には、その特異性が低いことに起因して、非特異
的結合を引き起こす欠点がある。Ｓ−オリゴマーの前記
非特異的結合としては、例えば、細胞内における内在タ
ンパク質と結合したり、あるいは、細胞のレセプターと
の結合により、ウイルスの細胞への結合が阻害されたり
する現象を挙げることができる。

【００１７】

【発明が解決しようとする課題】本発明者は、従来技術
における前記の問題点を解消することを目的として、イ
ンフルエンザウイルス遺伝子における特定領域の塩基配
列を標的配列として選択し、その標的配列に対するアン
チセンスＤＮＡの生体内への投与形態を種々検討した。
その結果、本発明者は、インフルエンザウイルス遺伝子
における特定領域の塩基配列を標的配列とする環状ダン
ベル型ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ化合物が、細胞毒性を有さ
ず、非特異的結合（例えば、タンパク質との相互作用や
細胞表面吸着阻害など）を引き起こすことがなく、しか
も、優れた核酸分解酵素耐性を有することを見出した。
本発明は、このような知見に基づくものである。

【００１８】

【課題を解決するための手段】本発明は、（１）インフ
ルエンザウイルスのＰＢ１遺伝子、ＰＢ２遺伝子、ＰＡ
遺伝子、又はＮＰ遺伝子の翻訳開始コドンＡＵＧを含有
する標的領域の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含
むＤＮＡ部分と、前記ＤＮＡ部分の前記塩基配列に対し
て相補的な塩基配列を含むＲＮＡ部分とを含み、前記Ｒ
ＮＡ部分と前記ＤＮＡ部分とが二重鎖を形成するステム
部分、及び（２）前記ステム部分の両端部にそれぞれ位
置するヘアピンループ部分２つを含むことを特徴とす
る、環状ダンベル型ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ化合物に関す
る。

【００１９】本明細書において、「インフルエンザウイ
ルス」とは、Ａ型、Ｂ型、及びＣ型の各インフルエンザ
ウイルス、並びにそれらの変異体を含む。従って、例え
ば、インフルエンザウイルスのＰＢ１遺伝子は、Ａ型、
Ｂ型、及びＣ型の各インフルエンザウイルス、並びにそ
れらの変異株の各ＰＢ１遺伝子（プラス鎖）を意味し、
同様にインフルエンザウイルスのＰＢ２遺伝子、ＰＡ遺
伝子、又はＮＰ遺伝子は、それぞれ、Ａ型、Ｂ型、及び
Ｃ型の各インフルエンザウイルス、並びにそれらの変異
株の各ＰＢ２遺伝子、ＰＡ遺伝子、又はＮＰ遺伝子（プ
ラス鎖）を意味する。

【００２０】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の環状ダンベル型ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ化合物
は、（１）インフルエンザウイルスのＰＢ１遺伝子、Ｐ
Ｂ２遺伝子、ＰＡ遺伝子、又はＮＰ遺伝子の翻訳開始コ
ドンＡＵＧを含有する標的領域の塩基配列に対して相補
的な塩基配列を含むＤＮＡ部分（以下、アンチセンスＤ
ＮＡ部分と称することがある）と、前記ＤＮＡ部分の前
記塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むＲＮＡ部分
（以下、相補的ＲＮＡ部分と称することがある）とを含
み、前記相補的ＲＮＡ部分と前記アンチセンスＤＮＡ部
分とが二重鎖を形成するステム部分と、（２）前記ステ
ム部分の両端部にそれぞれ位置するヘアピンループ部分
２個とを含む、ダンベル形状の環状化合物である。前記
ステム部分が、ダンベルの棒部分に相当し、前記ヘアピ
ンループ部分のそれぞれが、ダンベルの両側のおもり部
分にそれぞれ相当する。

【００２１】本発明の環状ダンベル型ＲＮＡ−ＤＮＡキ
メラ化合物は、インフルエンザウイルスのＰＢ１遺伝
子、ＰＢ２遺伝子、ＰＡ遺伝子、又はＮＰ遺伝子の翻訳
開始コドンＡＵＧを含有する領域を標的領域とする。前
記の標的領域は、翻訳開始コドンＡＵＧを含有する限り
特に限定されず、前記翻訳開始コドンＡＵＧの上流及び
／又は下流の領域を含むことができる。

【００２２】本発明の環状ダンベル型ＲＮＡ−ＤＮＡキ
メラ化合物においてステム部分を構成するアンチセンス
ＤＮＡ部分は、前記標的領域の塩基配列に対して相補的
な塩基配列を含む。前記アンチセンスＤＮＡ部分には、
その標的領域と特異的に結合して二重鎖を形成すること
ができる限り、標的領域に相補的な塩基配列を連続して
含む必要はなく、非相補的塩基１又はそれ以上が、１又
はそれ以上の箇所で欠失、挿入、及び／又は置換されて
いてもよい。しかし、標的領域に相補的な塩基配列を連
続して含むことが好ましい。

【００２３】本発明の環状ダンベル型ＲＮＡ−ＤＮＡキ
メラ化合物においてステム部分を構成する相補的ＲＮＡ
部分は、前記アンチセンスＤＮＡ部分の塩基配列に対し
て相補的な塩基配列を含む。前記相補的ＲＮＡ部分に
は、前記アンチセンスＤＮＡ部分と特異的に結合して二
重鎖を形成することができる限り、前記アンチセンスＤ
ＮＡ部分に相補的な塩基配列を連続して含む必要はな
く、非相補的塩基１又はそれ以上が、１又はそれ以上の
箇所で欠失、挿入、及び／又は置換されていてもよい。
しかし、前記アンチセンスＤＮＡ部分に相補的な塩基配
列を連続して含むことが好ましい。この相補的ＲＮＡ部
分の塩基配列は、アンチセンスＤＮＡ部分の塩基配列に
対して相補的な配列となるので、その結果として、標的
配列のＲＮＡ配列と同一のセンス配列となるか、あるい
は、標的配列のＲＮＡ配列において、１又はそれ以上の
箇所で非相補的塩基１又はそれ以上が欠失、挿入、及び
／又は置換された塩基配列となる。

【００２４】本発明の環状ダンベル型ＲＮＡ−ＤＮＡキ
メラ化合物におけるステム部分に用いることのできるオ
リゴヌクレオチド残基は、天然型のヌクレオチドからな
ることが必要である。また、本発明の環状ダンベル型Ｒ
ＮＡ−ＤＮＡキメラ化合物におけるステム部分に用いる
ことのできるオリゴヌクレオチド残基において、各ヌク
レオシド間のインターヌクレオシド結合は、それぞれ独
立にリン酸ジエステル結合であることが必要である。

【００２５】本発明の環状ダンベル型ＲＮＡ−ＤＮＡキ
メラ化合物の塩基数は、前記アンチセンスＤＮＡ部分の
塩基数が、前記の標的領域に特異的にハイブリダイズ可
能な塩基数以上である限り、特に限定されるものではな
いが、本発明による環状ダンベル型ＲＮＡ−ＤＮＡキメ
ラ化合物が、細胞膜や核膜を透過することができる塩基
数以下であることが好ましい。前記の標的領域に特異的
にハイブリダイズ可能なステム部分のアンチセンスＤＮ
Ａ部分の塩基数は、好ましくは１５塩基以上、より好ま
しくは２０塩基以上である。また、本発明の環状ダンベ
ル型ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ化合物の膜透過性を保証する
ためには、前記ステム部分のアンチセンスＤＮＡ部分の
塩基数が、好ましくは３０塩基以下、より好ましくは２
８塩基以下である。また、ステム部分の相補的ＲＮＡ部
分の塩基数は、アンチセンスＤＮＡ部分と二重鎖を形成
する必要があるので、アンチセンスＤＮＡ部分の塩基数
と一致することが必要である。従って、本発明の環状ダ
ンベル型ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ化合物におけるアンチセ
ンスＤＮＡ部分の塩基数及び相補的ＲＮＡ部分の塩基数
は、それぞれ、好ましくは１５〜３０塩基、より好まし
くは２０〜２８塩基からなる。

【００２６】本発明の環状ダンベル型ＲＮＡ−ＤＮＡキ
メラ化合物におけるアンチセンスＤＮＡ部分及び相補的
ＲＮＡ部分の具体的な塩基配列は、標的とするインフル
エンザウイルスの型に応じて適宜決定することができ
る。例えば、インフルエンザウイルスＡ型の或る変異株
を標的とする場合には、最初に、その変異株のＰＢ１遺
伝子、ＰＢ２遺伝子、ＰＡ遺伝子、及び／又はＮＰ遺伝
子の翻訳開始コドンＡＵＧを含有する領域の塩基配列を
解析する。続いて、安定な二重鎖形成の観点から標的配
列領域と塩基数とを決定し、公知の方法で環状ダンベル
型ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ化合物を合成することができ
る。

【００２７】本発明による環状ダンベル型ＲＮＡ−ＤＮ
Ａキメラ化合物における標的領域としては、例えば、イ
ンフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４のＰＢ１遺伝
子［Ｇ．Ｗｉｎｔｅｒ ａｎｄ Ｓ．Ｆｉｅｌｄｓ，Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１０，２１３５
（１９８２）］、ＰＢ２遺伝子［Ｇ．Ｗｉｎｔｅｒａｎ
ｄ Ｓ．Ｆｉｅｌｄｓ，Ｃｅｌｌ，２８，２０３（１９
８２）］、ＰＡ遺伝子［Ｇ．Ｗｉｎｔｅｒ ａｎｄ
Ｓ．Ｆｉｅｌｄｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．，１０，２１３５（１９８２）］、及び／又はＮＰ
遺伝子［Ｇ．Ｗｉｎｔｅｒ ａｎｄ Ｓ．Ｆｉｅｌｄ
ｓ，Ｖｉｏｌｏｇｙ，１１４，４２３（１９８１）］の
翻訳開始コドンＡＵＧを含有する領域を挙げることがで
きる。この標的領域は、特にインフルエンザウイルスＡ
型に対して有効であるが、インフルエンザウイルスＢ型
又はインフルエンザウイルスＣ型に対しても有効であ
る。

【００２８】ＰＢ１遺伝子の翻訳開始コドンＡＵＧを含
有する領域の塩基配列としては、例えば、配列表の配列
番号９の配列で表される塩基配列を挙げることができ
る。本発明による環状ダンベル型ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ
化合物におけるアンチセンスＤＮＡ部分としては、配列
表の配列番号９の配列で表される塩基配列に相補的な塩
基配列の内の少なくとも１５塩基（好ましくは１５〜２
０塩基）を含有し、全体として１５〜３０塩基からなる
オリゴヌクレオチドを挙げることができる。

【００２９】また、ＰＢ２遺伝子の翻訳開始コドンＡＵ
Ｇを含有する領域の塩基配列としては、例えば、配列表
の配列番号１０の配列で表される塩基配列を挙げること
ができ、本発明による環状ダンベル型ＲＮＡ−ＤＮＡキ
メラ化合物におけるアンチセンスＤＮＡ部分としては、
配列表の配列番号１０の配列で表される塩基配列に相補
的な塩基配列の内の少なくとも１５塩基（好ましくは１
５〜２０塩基）を含有し、全体として１５〜３０塩基か
らなるオリゴヌクレオチドを挙げることができる。

【００３０】また、ＰＡ遺伝子の翻訳開始コドンＡＵＧ
を含有する領域の塩基配列としては、例えば、配列表の
配列番号１１の配列で表される塩基配列を挙げることが
でき、本発明による環状ダンベル型ＲＮＡ−ＤＮＡキメ
ラ化合物におけるアンチセンスＤＮＡ部分としては、配
列表の配列番号１１の配列で表される塩基配列に相補的
な塩基配列の内の少なくとも１５塩基（好ましくは１５
〜２０塩基）を含有し、全体として１５〜３０塩基から
なるオリゴヌクレオチドを挙げることができる。

【００３１】更に、ＮＰ遺伝子の翻訳開始コドンＡＵＧ
を含有する領域の塩基配列としては、例えば、配列表の
配列番号１２の配列で表される塩基配列を挙げることが
でき、本発明による環状ダンベル型ＲＮＡ−ＤＮＡキメ
ラ化合物におけるアンチセンスＤＮＡ部分としては、配
列表の配列番号１２の配列で表される塩基配列に相補的
な塩基配列の内の少なくとも１５塩基（好ましくは１５
〜２０塩基）を含有し、全体として１５〜３０塩基から
なるオリゴヌクレオチドを挙げることができる。

【００３２】本発明の環状ダンベル型ＲＮＡ−ＤＮＡキ
メラ化合物におけるヘアピンループ部分は、ステム部分
と一緒になって、ダンベル型の環状構造を形成すること
のできるものであれば特に限定されるものではなく、例
えば、オリゴヌクレオチド残基、又は式： −（−ＣＨ₂ −ＣＨ₂ −Ｏ−）_n − （式中、ｎは１〜６の整数である）で表されるエチレン
グリコール化合物残基などを挙げることができる。

【００３３】本発明による環状ダンベル型ＲＮＡ−ＤＮ
Ａキメラ化合物におけるヘアピンループ部分が、オリゴ
ヌクレオチド残基からなる場合には、それを構成する塩
基の種類、塩基配列、及び／又は塩基数は、アンチセン
スＤＮＡ部分と相補的ＲＮＡ部分とを含むステム部分の
塩基配列に応じて適宜決定することができる。ヘアピン
ループ部分に用いることのできるオリゴヌクレオチド残
基としては、ＤＮＡ又はＲＮＡとの二重鎖を形成するお
それがあるので、１種類の塩基からなるオリゴヌクレオ
チド残基からなることが好ましい。更には、プリン環よ
りもピリミジン環の方が良い点で、オリゴシトシン残基
であることが特に好ましい。ヘアピンループ部分に用い
ることのできるオリゴヌクレオチド残基を構成する塩基
の数は、好ましくは３〜７塩基であり、５塩基が最適で
ある。

【００３４】ヘアピンループ部分に用いることのできる
オリゴヌクレオチド残基は、例えば、デオキシヌクレオ
シド、リボヌクレオシド、及び／又はそれらの修飾リボ
ヌクレオシド、例えば、２’−Ｏ−修飾リボヌクレオシ
ドから形成することができ、耐分解酵素性を有する点で
好ましい。また、ヘアピンループ部分に用いることので
きるオリゴヌクレオチド残基において、各ヌクレオシド
間のインターヌクレオシド結合は、それぞれ独立にリン
酸ジエステル結合、又は修飾リン酸ジエステル結合であ
ることができる。修飾リン酸ジエステル結合としては、
毒性を有さない修飾リン酸ジエステル結合が好ましく、
例えば、リン酸ジエステル結合の非架橋酸素原子２個の
うちの酸素原子１個をメチル基に置換したメチルホスホ
ネート型結合（Ｍｅ−Ｐ結合）、又はリン酸ジエステル
結合の非架橋酸素原子２個のうちの酸素原子１個をアミ
ノ酸若しくは置換アミノ酸基に置換したホスホロアミデ
ート型結合などを挙げることができ、それらの１種又は
それ以上を、ヌクレオシド間の結合の１箇所又はそれ以
上の箇所に導入することができる。

【００３５】本発明による環状ダンベル型ＲＮＡ−ＤＮ
Ａキメラ化合物におけるヘアピンループ部分が、式： −（−ＣＨ₂ −ＣＨ₂ −Ｏ−）_n − （式中、ｎは１〜６の整数である）で表されるエチレン
グリコール化合物残基からなる場合には、その長さ、す
なわち、前記式におけるｎの値は、アンチセンスＤＮＡ
部分と相補的ＲＮＡ部分とを含むステム部分の塩基配列
に応じて適宜決定することができ、好ましくは１〜６の
整数であり、より好ましくは３〜６の整数である。

【００３６】本発明の環状ダンベル型ＲＮＡ−ＤＮＡキ
メラ化合物における好適化合物としては、例えば、イン
フルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４のＰＢ１遺伝子
の翻訳開始コドンＡＵＧを含有する２０塩基からなる領
域を標的配列とする、配列表の配列番号１の配列で表さ
れる塩基配列からなる環状ダンベル型ＲＮＡ−ＤＮＡキ
メラ化合物；インフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３
４のＰＢ２遺伝子の翻訳開始コドンＡＵＧを含有する２
０塩基からなる領域を標的配列とする、配列表の配列番
号３の配列で表される塩基配列からなる環状ダンベル型
ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ化合物；インフルエンザウイルス
Ａ／ＰＲ／８／３４のＰＡ遺伝子の翻訳開始コドンＡＵ
Ｇを含有する２０塩基からなる領域を標的配列とする、
配列表の配列番号５の配列で表される塩基配列からなる
環状ダンベル型ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ化合物；インフル
エンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４のＮＰ遺伝子の翻訳
開始コドンＡＵＧを含有する２０塩基からなる領域を標
的配列とする、配列表の配列番号７の配列で表される塩
基配列からなる環状ダンベル型ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ化
合物などを挙げることができる。これら４種類の本発明
による環状ダンベル型ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ化合物は、
特にインフルエンザウイルスＡ型に対して有効である
が、インフルエンザウイルスＢ型又はインフルエンザウ
イルスＣ型に対しても有効である。

【００３７】本発明の環状ダンベル型ＲＮＡ−ＤＮＡキ
メラ化合物は、公知の方法で合成することができる。ヘ
アピンループ部分がオリゴヌクレオチド残基からなる場
合には、例えば、まず、ＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機を用
いて、目的とする或る環状ダンベル型ＲＮＡ−ＤＮＡキ
メラオリゴヌクレオチドの或る塩基から順に、線状にオ
リゴヌクレオチドを合成していくと、合成過程で、ステ
ム部分及びヘアピンループ部分がその場で次々に形成さ
れ、最後の塩基を結合させた時点で、目的とする環状ダ
ンベル型ＲＮＡ−ＤＮＡキメラオリゴヌクレオチドの或
る１箇所（最初の塩基と最後の塩基との間）が結合され
ていないニックダンベル型ＲＮＡ−ＤＮＡキメラオリゴ
ヌクレオチドが得られる。続いて、得られたニックダン
ベル型オリゴヌクレオチドの５’末端を、リン酸化剤
（Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ
ｒｅａｇｅｎｔ）を用いてリン酸化した後に、Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼでライゲーションさせることによって、環
状ダンベル型ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ化合物を調製するこ
とができる。

【００３８】また、ヘアピンループ部分が、式： −（−ＣＨ₂ −ＣＨ₂ −Ｏ−）_n − （式中、ｎは１〜６の整数である）で表されるエチレン
グリコール化合物残基からなる場合には、ヘアピンルー
プ部分の塩基に代えて、エチレングリコール化合物残基
を用いること以外は、前記と同様の操作によって目的と
する環状ダンベル型ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ化合物を調製
することができる。

【００３９】本発明による環状ダンベル型ＲＮＡ−ＤＮ
Ａキメラ化合物の膜透過性を向上させるために、種々の
公知の方法を利用することもできる。公知の方法として
は、例えば、リポソームに包埋する方法［Ｍ．Ｍｏｚｕ
ｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５０，
７８２６（１９９１）］、コレステロールをオリゴマー
の末端に導入する方法［Ｂ．Ｏｂｅｒｈａｕｅｒ ａｎ
ｄ Ｅ． Ｗａｇｎｅｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．，２０，５３３（１９９３）］、トランスフ
ェリン−ポリ−Ｌ−リジン複合体［Ｇ．Ｃｉｔｒｏ，Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，
７０３１（１９９２）］と非共有的に結合させ、それぞ
れガラクトースレセプターを発現する肝細胞や、トラン
スフェリンレセプターを発現する癌細胞に、特異的にオ
リゴマーを取り込ませる方法、あるいは、カチオン性の
脂質（例えば、リポフェクチン）をオリゴマーと相互作
用させ、標的細胞に加えることにより、細胞内への取り
組み、更には核内への移行を増大させ、アンチセンス効
果を強める方法［Ｍ．Ｃｈｉａｎｙ ｅｔ ａｌ．，
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６，１８１６２（１９
９１）］などを挙げることができる。

【００４０】本発明の環状ダンベル型ＲＮＡ−ＤＮＡキ
メラ化合物の抗ウイルス効果は、例えば、プラスミドｐ
ＯＵＭＳ１０１［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ，８８，５３６９（１９９１）］及びマウス
乳癌細胞株Ｃ１２７のクローン細胞（以下、７６細胞と
称する）［Ｙ．Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｋ．Ｏｄａ ａｎｄ
Ｓ．Ｎａｋａｄａ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，１１０，３
９５（１９９１）］を用い、前記の７６細胞内のクロラ
ムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（以下、Ｃ
ＡＴと称する）発現量によって確認することができる。

【００４１】前記のプラスミドｐＯＵＭＳ１０１は、イ
ンフルエンザウイルスＰＲ８株の第８分節のタンパク質
コード領域をＣＡＴ遺伝子で置き換えたＤＮＡ断片（前
記第８分節のタンパク質コード領域の５’上流領域の１
３塩基対からなる塩基配列及び前記第８分節のタンパク
質コード領域の３’下流領域の１２塩基対からなる塩基
配列を含む）を、ファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロ
モーターの下流に挿入することにより作成したプラスミ
ドである。また、７６細胞は、ステロイドホルモンであ
るデキサメサゾンの添加によって、インフルエンザウイ
ルスＡ型（Ａ／ＰＲ／８／３４）のＲＮＡポリメラーゼ
（ＰＢ１、ＰＢ２、及びＰＡ）並びにＮＰタンパク質の
発現が誘発される細胞である。

【００４２】具体的には、プラスミドｐＯＵＭＳ１０１
を鋳型として、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼにより、ＣＡＴ
遺伝子を含むネガティブ鎖ＲＮＡ（以下、ｖＲＮＡと称
することがある）をイン・ビトロで合成する。これとは
別に、デキサメサゾンを添加することによりＰＢ１、Ｐ
Ｂ２、ＰＡ、及びＮＰタンパク質の発現を誘導した７６
細胞に、検査対象の環状ダンベル型ＲＮＡ−ＤＮＡキメ
ラ化合物を加え、そのオリゴヌクレオチドが細胞内に取
り込まれたところで、先に合成したｖＲＮＡを７６細胞
に加え、細胞内に取り込ませる。被検環状ダンベル型Ｒ
ＮＡ−ＤＮＡキメラ化合物が、７６細胞内でＰＢ１遺伝
子、ＰＢ２遺伝子、ＰＡ遺伝子、又はＮＰ遺伝子のｍＲ
ＮＡと結合しない場合には、それぞれのＲＮＡポリメラ
ーゼ（すなわち、ＰＢ１、ＰＢ２、及びＰＡ）並びにＮ
Ｐタンパク質によって、ｖＲＮＡが複製され、ＣＡＴが
発現する。一方、被検環状ダンベル型ＲＮＡ−ＤＮＡキ
メラ化合物が、７６細胞内でＰＢ１遺伝子、ＰＢ２遺伝
子、ＰＡ遺伝子、又はＮＰ遺伝子のｍＲＮＡと結合する
場合には、それぞれのＲＮＡポリメラーゼ（すなわち、
ＰＢ１、ＰＢ２、及びＰＡ）、そしてＮＰタンパク質の
産生が制御され、その結果、ｖＲＮＡの複製が抑制され
るので、ＣＡＴの発現量も抑制される。従って、７６細
胞内のＣＡＴ発現量を測定することによって、被検対象
の環状ダンベル型ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ化合物による抗
ウイルス効果を評価することができる。

【００４３】本発明の抗インフルエンザウイルス剤は、
本発明の環状ダンベル型ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ化合物を
有効成分として含有する。本発明の抗インフルエンザウ
イルス剤は、経口、非経口又は局所的な経路のいずれか
により投与することができる。投与量は、治療対象動物
（哺乳類、特にはヒト）の種及びその薬剤に対する個体
の応答性、並びに選択される製剤の剤形及び投与時間や
間隔などに依存して変化するが、一般には、前記環状ダ
ンベル型ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ化合物約５００ｍｇから
約５０００ｍｇ／日の範囲の用量で投与することができ
る。本発明の抗インフルエンザウイルス剤は、前記の環
状ダンベル型ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ化合物以外に、場合
により医薬的に許容することのできる公知の担体若しく
は希釈剤との組合せで、経口、非経口又は局所的な経路
のいずれかにより、単回又は複数回で投与することがで
きる。本発明の抗インフルエンザウイルス剤は、種々の
異なる剤形、例えば、錠剤、カプセル剤、ロゼンジ剤、
トローチ剤、ハードキャンディー、粉末剤、スプレー
剤、クリーム剤、軟膏剤、坐剤、ゼリー剤、ゲル剤、ペ
ースト剤、ローション剤、軟膏剤、水性懸濁剤、注射用
溶液剤、エリキシル剤、又はシロップ剤などにすること
ができる。

【００４４】

【作用】本発明の環状ダンベル型ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ
化合物によるアンチセンス効果は、以下の推論に限定さ
れるものではないが、前記環状ダンベル型ＲＮＡ−ＤＮ
Ａキメラ化合物がリボヌクレアーゼＨの基質となること
から、以下に示す作用によってもたらされるものと考え
られる。すなわち、図１に示すように、本発明の環状ダ
ンベル型ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ化合物が宿主細胞内に効
率よく取り込まれると、細胞内に存在するリボヌクレア
ーゼＨによって相補的ＲＮＡ部分が切断及び分解される
ので、２つのヘアピンループ部分とアンチセンスＤＮＡ
部分とからなる一本鎖オリゴヌクレオチドが細胞内に遊
離する。遊離した一本鎖オリゴヌクレオチドは、そのア
ンチセンスＤＮＡ部分が、例えば、複製された（＋）鎖
ｃＲＮＡに結合することで、ｃＲＮＡを鋳型として子ウ
イルスＲＮＡの合成を防止することができると考えられ
る。また、（−）鎖ｖＲＮＡから転写されたｍＲＮＡ
が、宿主細胞の核から細胞質に放出された場合にも、そ
のｍＲＮＡに、細胞内に遊離したアンチセンスＤＮＡ部
分を含む一本鎖オリゴヌクレオチドが結合し、タンパク
質への翻訳をブロックするものと考えられる。

【００４５】本発明の環状ダンベル型ＲＮＡ−ＤＮＡキ
メラ化合物は、そのステム部分を構成するアンチセンス
ＤＮＡ部分及び相補的ＲＮＡ部分が、非修飾型の天然型
オリゴヌクレオチドであることから、Ｓ−オリゴマーで
問題となったタンパク質との相互作用、又は細胞表面吸
着阻害を引き起こすことがない。また、本発明の環状ダ
ンベル型ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ化合物は、二重鎖からな
るステム部分を有し、しかも全体が完全に環状型の構造
を有しているので、核酸分解酵素耐性が高く、リボヌク
レアーゼＨが作用するまでは、宿主細胞内でも安定に存
在することができるものと考えられる。更には、リボヌ
クレアーゼＨの作用により相補的ＲＮＡ部分が切除され
て、はじめて、アンチセンスＤＮＡ部分を含む一本鎖オ
リゴヌクレオチドが細胞内に遊離されるので、細胞内で
アンチセンス効果を発揮する前に分解される可能性のあ
った従来公知の天然型非環状のアンチセンスオリゴヌク
レオチドに比べて、投与量当たりのアンチセンス効果が
高くなるものと考えられる。

【００４６】

【実施例】以下、実施例によって本発明を具体的に説明
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。

【実施例１】本実施例では、以下の実施例で使用する、
本発明による環状ダンベル型ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ化合
物を設計した。はじめに、標的領域として、ＰＢ２遺伝
子、ＰＢ１遺伝子、ＰＡ遺伝子、及びＮＰ遺伝子の翻訳
開始コドンＡＵＧを含む領域を選択した。ＰＢ２遺伝子
の翻訳開始領域及びその周辺領域の塩基配列（第１番目
〜第５０番目の塩基配列；配列表の配列番号１４の配列
で表される塩基配列）を図２に、ＰＢ１遺伝子の翻訳開
始領域及びその周辺領域の塩基配列（第１番目〜第４９
番目の塩基配列；配列表の配列番号１３の配列で表され
る塩基配列）を図３に、ＰＡ遺伝子の翻訳開始領域及び
その周辺領域の塩基配列（第１番目〜第５４番目の塩基
配列；配列表の配列番号１５の配列で表される塩基配
列）を図４に、ＮＰ遺伝子の翻訳開始領域及びその周辺
領域の塩基配列（第１番目〜第７０番目の塩基配列；配
列表の配列番号１６の配列で表される塩基配列）を図５
に示す。

【００４７】具体的には、ＰＢ２遺伝子の標的領域とし
て、図２に下線で示す第１８番目〜第３７番目の塩基配
列（配列表の配列番号１０の配列で表される塩基配列）
を選択した。ＰＢ１遺伝子の標的領域として、図３に下
線で示す第１５番目〜第３４番目の塩基配列（配列表の
配列番号９の配列で表される塩基配列）を選択した。Ｐ
Ａ遺伝子の標的領域として、図４に下線で示す第１５番
目〜第３４番目の塩基配列（配列表の配列番号１１の配
列で表される塩基配列）を選択した。そして、ＮＰ遺伝
子の標的領域として、図５に下線で示す第３６番目〜第
５５番目の塩基配列（配列表の配列番号１２の配列で表
される塩基配列）を選択した。なお、図２〜図５におい
て、ＡＵＧの上の＊＊＊は、そのＡＵＧが翻訳開始コド
ンであることを示す。

【００４８】ヘアピンループ部分としては、各標的領域
であるＰＢ１遺伝子、ＰＢ２遺伝子、ＰＡ遺伝子、及び
ＮＰ遺伝子に関しては、それぞれ、シトシン５塩基から
なるオリゴシトシン残基を選択し、更に、標的領域であ
るＰＢ２遺伝子に関しては、式： −（−ＣＨ₂ −ＣＨ₂ −Ｏ−）₆ − で表されるヘキサエチレングリコール残基も選択した。
こうして設計した本発明の環状ダンベル型ＲＮＡ−ＤＮ
Ａキメラ化合物５種類（以下、ＣＰＢ２−ＡＵＧ−ａ
ｓ、ＣＰＢ１−ＡＵＧ−ａｓ、ＣＰＡ−ＡＵＧ−ａｓ、
ＣＮＰ−ＡＵＧ−ａｓ、及びＣＰＢ２−ＡＵＧ−ａｓ
Ｈ．Ｅ．Ｇと称する）の内、ヘアピンループ部分がオリ
ゴシトシン残基である環状ダンベル型ＲＮＡ−ＤＮＡキ
メラ化合物４種類（ＣＰＢ２−ＡＵＧ−ａｓ、ＣＰＢ１
−ＡＵＧ−ａｓ、ＣＰＡ−ＡＵＧ−ａｓ、及びＣＮＰ−
ＡＵＧ−ａｓ）を図６に示し、ヘアピンループ部分がヘ
キサエチレングリコール残基である環状ダンベル型ＲＮ
Ａ−ＤＮＡキメラ化合物ＣＰＢ２−ＡＵＧ−ａｓＨ．
Ｅ．Ｇを図７に示す。

【００４９】ＰＢ２遺伝子を標的領域とする環状ダンベ
ル型ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ化合物ＣＰＢ２−ＡＵＧ−ａ
ｓは、配列表の配列番号３の配列で表される塩基配列か
らなり；ＰＢ１遺伝子を標的領域とする環状ダンベル型
ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ化合物ＣＰＢ１−ＡＵＧ−ａｓ
は、配列表の配列番号１の配列で表される塩基配列から
なり；ＰＡ遺伝子を標的領域とする環状ダンベル型ＲＮ
Ａ−ＤＮＡキメラ化合物ＣＰＡ−ＡＵＧ−ａｓは、配列
表の配列番号５の配列で表される塩基配列からなり；そ
して、ＮＰ遺伝子を標的領域とする環状ダンベル型ＲＮ
Ａ−ＤＮＡキメラ化合物ＣＮＰ−ＡＵＧ−ａｓは、配列
表の配列番号７の配列で表される塩基配列からなる。

【００５０】図６の「略号」の欄に示す記号の意味は次
のとおりである。先頭の「Ｃ」は、環状（ｃｉｒｃｕｌ
ａｒ）であることを意味し、「ＡＵＧ」は、標的領域の
塩基配列がウイルス遺伝子の翻訳開始コドンＡＵＧを含
むことを意味する。「ａｓ」は、環状ダンベル型ＲＮＡ
−ＤＮＡキメラ化合物におけるＤＮＡ部分の塩基配列
が、設計対象としたウイルス遺伝子の配列に対するアン
チセンス配列であることを意味する。図６の「配列」の
欄に示す各塩基配列中の「Ａ」及び「ａ」、「Ｇ」及び
「ｇ」、「Ｃ」及び「ｃ」、「Ｔ」、並びに「ｕ」は、
それぞれ、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、並
びにウラシルを表す。「配列」の欄において、アルファ
ベット大文字で示す塩基配列は、その塩基配列を有する
オリゴヌクレオチドがＤＮＡであることを意味し、アル
ファベット小文字で示す塩基配列は、その塩基配列を有
するオリゴヌクレオチドがＲＮＡであることを意味す
る。図６に示す「標的領域」の欄に示す数字は、図２〜
図５に示すウイルス遺伝子内における標的領域の位置を
示す塩基番号である。

【００５１】図７に示す塩基配列中の「Ａ」及び
「ａ」、「Ｇ」及び「ｇ」、「Ｃ」及び「ｃ」、
「Ｔ」、並びに「ｕ」は、それぞれ、アデニン、グアニ
ン、シトシン、チミン、並びにウラシルを表す。また、
図７において、アルファベット大文字で示す塩基配列
は、その塩基配列を有するオリゴヌクレオチドがＤＮＡ
であることを意味し、アルファベット小文字で示す塩基
配列は、その塩基配列を有するオリゴヌクレオチドがＲ
ＮＡであることを意味する。

【００５２】ＰＢ１遺伝子、ＰＢ２遺伝子、ＰＡ遺伝
子、及びＮＰ遺伝子に関して、比較用化合物である環状
ダンベル型ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ化合物５種類（ＣＰＢ
２−ＡＵＧ−ｒａｎ、ＣＰＢ１−ＡＵＧ−ｒａｎ、ＣＰ
Ａ−ＡＵＧ−ｒａｎ、ＣＮＰ−ＡＵＧ−ｒａｎ、及びＣ
ＰＢ２−ＡＵＧ−ｒａｎＨ．Ｅ．Ｇ）を設計した。これ
らの比較用キメラ化合物のステム部分を構成するＤＮＡ
部分は、前記の標的領域（設計対象）の塩基配列を構成
する各塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、及びＴ又はＵ）の塩基数で一
致するが、インフルエンザウイルスの全遺伝子のどの部
分とも二重鎖を形成しないように設計した塩基配列、す
なわち、「ランダムな配列」からなる。比較用化合物で
ある環状ダンベル型ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ化合物の略号
中の記号「ｒａｎ」は、環状ダンベル型ＲＮＡ−ＤＮＡ
キメラ化合物におけるＤＮＡ部分の塩基配列が、標的領
域（設計対象）としたウイルス遺伝子の配列に対してラ
ンダムな配列であることを意味する。

【００５３】環状ダンベル型ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ化合
物ＣＰＢ２−ＡＵＧ−ｒａｎは、配列表の配列番号４の
配列で表される塩基配列からなり；環状ダンベル型ＲＮ
Ａ−ＤＮＡキメラ化合物ＣＰＢ１−ＡＵＧ−ｒａｎは、
配列表の配列番号２の配列で表される塩基配列からな
り；環状ダンベル型ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ化合物ＣＰＡ
−ＡＵＧ−ｒａｎは、配列表の配列番号６の配列で表さ
れる塩基配列からなり；そして、環状ダンベル型ＲＮＡ
−ＤＮＡキメラ化合物ＣＮＰ−ＡＵＧ−ｒａｎは、配列
表の配列番号８の配列で表される塩基配列からなる。環
状ダンベル型ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ化合物ＣＰＢ２−Ａ
ＵＧ−ｒａｎＨ．Ｅ．Ｇは、環状ダンベル型ＲＮＡ−Ｄ
ＮＡキメラ化合物ＣＰＢ２−ＡＵＧ−ｒａｎのヘアピン
ループ部分を形成するシトシン５塩基からなるオリゴシ
トシン残基２個を、ヘキサエチレングリコール残基２個
にそれぞれ置換した化合物である。

【００５４】

【実施例２】本実施例では、前記実施例１で設計した、
本発明による環状ダンベル型ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ化合
物、及び比較用化合物である環状ダンベル型ＲＮＡ−Ｄ
ＮＡキメラ化合物を調製した。

【００５５】（１）ヘアピンループ部分がオリゴヌクレ
オチドからなる環状ダンベル型ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ化
合物の調製 実施例１で設計した塩基配列からなり、しかも、相補的
ＲＮＡ部分の中央部付近にニックを形成させたニックダ
ンベル型ＲＮＡ−ＤＮＡキメラオリゴヌクレオチドを、
ＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機（モデル３９２；アプライド
バイオシステムズ社）により、未修飾（ノーマル）ＤＮ
Ａ用プログラムを用いて合成した。ＤＮＡ／ＲＮＡ自動
合成機によるＲＮＡ−ＤＮＡキメラオリゴヌクレオチド
の合成が終了した後に、ＲＮＡを処理する必要があるた
め、アンモニア水／エタノール混合溶液（２８％アンモ
ニア水：エタノール＝３：１）を用いて、固相担体のコ
ントロールポアグラス（ＣＰＧ）からＲＮＡ−ＤＮＡキ
メラオリゴヌクレオチドを切り出した。

【００５６】ＲＮＡ−ＤＮＡキメラオリゴヌクレオチド
を含有する前記のアンモニア水／エタノール混合溶液を
室温で１時間処理した後に、この溶液を５５℃で約１２
時間処理することにより、塩基部及びリン酸部の脱保護
を行った。続いて、減圧濃縮を実施した後に、テトラブ
チルアンモニウムフルオライド（ＴＢＡＦ）を用いて、
室温で２４時間処理することによって、ＲＮＡ−ＤＮＡ
キメラオリゴヌクレオチドにおけるＲＮＡの２’−水酸
基の保護基であるｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基
（ｔ−ＢＤＭＳ）基の脱保護を行った。その後、２Ｍテ
トラエチルアンモニウム（ＴＥＡＡ）溶液において反応
溶液を中和し、オリゴパックカラム（ＯＰＣ；Ｍｉｌｌ
ｉＧｅｎ社製）を用いて脱塩及び精製を行った。

【００５７】脱保護の終了した５０塩基のＲＮＡ−ＤＮ
Ａキメラオリゴヌクレオチドを１０％ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動法により、以下に示す手順に従って精製
した。すなわち、尿素８．４ｇ、４０％アクリルアミド
溶液（アクリルアミド１８０ｇとＮ，Ｎ’−メチレン−
ビス−アクリルアミド１２０ｇとを滅菌水に溶かし、全
量を１リットルとすることにより調製した）５ｍｌ、及
び１０×ＴＨＡ緩衝液［組成：トリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタン］２ｍｌを攪拌して溶解させた後に、
滅菌水を加えて全量を２０ｍｌとし、続いて、過硫酸ア
ンモニウム（ＰＯＡ）０．０２ｇを加え、溶解させた後
に、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチレンジアミン（Ｔ
ＥＭＥＤ）１０μｌを加え、すぐにゲル板に流し込み、
固化させることによって、１０％ポリアクリルアミドゲ
ルを調製した。

【００５８】ゲルが固化した後に、ゲル板を電気泳動装
置にセットし、１×ＴＢＥ緩衝液をバッファー槽に満た
し、脱保護の終了した５０塩基のＲＮＡ−ＤＮＡキメラ
オリゴヌクレオチド水溶液をチャージして、１５ｍＡで
６時間電気泳動を行った。電気泳動が終了した後に、バ
ンドの箇所を紫外線（ＵＶ）で確認し、ゲルカッターで
切り出した後、マイクロチューブミキサーにかけ、ゲル
からオリゴマーを溶出させた。その溶出液をろ過滅菌フ
ィルターに通した後に、凍結乾燥をし、滅菌水２ｍｌに
溶かして分子ふるいカラム（セントリコン）を用いて脱
塩、精製を行った。

【００５９】得られた精製オリゴヌクレオチドを、７Ｍ
尿素含有ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、泳動
終了後に、エチジウムブロマイド染色を実施した。得ら
れたオリゴヌクレオチドのいずれにおいても１本のバン
ドを示し、ニックダンベル型ＲＮＡ−ＤＮＡキメラオリ
ゴヌクレオチド（すなわち、実施例１で設計した塩基配
列からなり、しかも、相補的ＲＮＡ部分の中央部付近に
ニックを形成させたＲＮＡ−ＤＮＡキメラオリゴヌクレ
オチド）が得られたことを確認した。こうして得られた
ニックダンベル型ＲＮＡ−ＤＮＡキメラオリゴヌクレオ
チドを、後述する実施例３（３）で使用した。

【００６０】一方、５’−末端にリン酸基を有するＲＮ
Ａ−ＤＮＡキメラオリゴヌクレオチドの合成は、前記の
ように、ＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機によりＲＮＡ−ＤＮ
Ａキメラオリゴヌクレオチドの合成が終了した後に、Ｒ
ＮＡ−ＤＮＡキメラオリゴヌクレオチドの５’末端を保
護しているジメトキシトリチル基を１％トリクロロ酢酸
処理により除去した。続いて、５’末端に水酸基を有す
るＲＮＡ−ＤＮＡキメラオリゴヌクレオチドを担持する
ＣＰＧを、５’−ホスフェート−ＯＮ試薬（Ｃｈｅｍ
ｇｅｎｅｓ社）を用いて処理した後、ニックダンベル型
ＲＮＡ−ＤＮＡキメラオリゴヌクレオチドの前記脱保護
及び分離手法を用いて精製した。

【００６１】５’末端がリン酸化されたニックダンベル
型ＲＮＡ−ＤＮＡキメラオリゴヌクレオチド［波長２６
０ｎｍにおける光学密度（Ｏ．Ｄ．₂₆₀ ）＝０．２］に
１０×リガーゼ緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ及び１
０ｍＭ塩化マグネシウム）１０μｌを加え、全量を１０
０μｌに合わせた後に、９０℃で１０分間アニーリング
を実施した。更に、１Ｍジチオトレイトール（ＤＴＴ）
１μｌ、１００ｍＭ−ＡＴＰ１μｌ、２５μｇ／ｍｌウ
シ血清アルブミン（ＢＳＡ）１μｌ、及びＴ４ＤＮＡリ
ガーゼ（４００ユニット、１２００ユニット、又は２０
００ユニット）を加え、３７℃で４時間インキュベート
した。得られた反応溶液を、常法に従って、フェノール
・クロロホルム抽出処理、及びエタノール沈殿処理を実
施することによって、目的とするオリゴヌクレオチド
（すなわち、本発明による環状ダンベル型ＲＮＡ−ＤＮ
Ａキメラ化合物、及び比較用化合物である環状ダンベル
型ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ化合物）が得られた。

【００６２】（２）ヘアピンループ部分がヘキサエチレ
ングリコールからなる環状ダンベル型ＲＮＡ−ＤＮＡキ
メラ化合物の調製 ヌクレオシド−３’−ホスホロアミダイトの代わりに、
スペーサーホスホロアミダイトを用いること以外は、前
記（１）と同様の操作を繰り返すことにより、目的とす
る環状ダンベル型ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ化合物を調製し
た。

【００６３】（３）ライゲーション効率の比較 前記（１）及び前記（２）で得られたオリゴヌクレオチ
ドにおけるライゲーションの程度を、７Ｍ尿素含有１０
％ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動法により確
認した。結果を図８〜図１２に示す。図８に、種々の量
のＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて調製した、本発明による
環状ダンベル型ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ化合物ＣＰＢ２−
ＡＵＧ−ａｓ、及び比較用化合物である環状ダンベル型
ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ化合物ＣＰＢ２−ＡＵＧ−ｒａｎ
の１０％変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を
示す。

【００６４】図９に、種々の量のＴ４ＤＮＡリガーゼを
用いて調製した、本発明による環状ダンベル型ＲＮＡ−
ＤＮＡキメラ化合物ＣＰＢ１−ＡＵＧ−ａｓ、及び比較
用化合物である環状ダンベル型ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ化
合物ＣＰＢ１−ＡＵＧ−ｒａｎの１０％変性ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動の結果を示す。図１０に、種々の
量のＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて調製した、本発明によ
る環状ダンベル型ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ化合物ＣＰＡ−
ＡＵＧ−ａｓ、及び比較用化合物である環状ダンベル型
ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ化合物ＣＰＡ−ＡＵＧ−ｒａｎの
１０％変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示
す。

【００６５】図１１に、種々の量のＴ４ＤＮＡリガーゼ
を用いて調製した、本発明による環状ダンベル型ＲＮＡ
−ＤＮＡキメラ化合物ＣＮＰ−ＡＵＧ−ａｓ、及び比較
用化合物である環状ダンベル型ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ化
合物ＣＮＰ−ＡＵＧ−ｒａｎの１０％変性ポリアクリル
アミドゲル電気泳動の結果を示す。図１２に、種々の量
のＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて調製した、本発明による
環状ダンベル型ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ化合物ＣＮＰ−Ａ
ＵＧ−ａｓＨ．Ｅ．Ｇ、及び比較用化合物である環状ダ
ンベル型ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ化合物ＣＮＰ−ＡＵＧ−
ｒａｎＨ．Ｅ．Ｇの１０％変性ポリアクリルアミドゲル
電気泳動の結果を示す。

【００６６】図８〜図１２において、レーン１〜レーン
４は、それぞれ、本発明による環状ダンベル型ＲＮＡ−
ＤＮＡキメラ化合物に関する結果を示し、レーン５〜レ
ーン８は、比較用化合物である環状ダンベル型ＲＮＡ−
ＤＮＡキメラ化合物に関する結果を示す。レーン１及び
レーン５は、天然型オリゴヌクレオチドを；レーン２及
びレーン６は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ４００ユニットを用
いて実施したライゲーションにより得られたオリゴヌク
レオチドを；レーン３及びレーン７は、Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼ１２００ユニットを用いて実施したライゲーション
により得られたオリゴヌクレオチドを；そして、レーン
４及びレーン８は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ２０００ユニッ
トを用いて実施したライゲーションにより得られたオリ
ゴヌクレオチドを、電気泳動した結果を示す。

【００６７】更に、図８〜図１２に示す各ブロットをバ
イオイメージで測定した結果を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼの
使用量毎に比較した結果を表１〜表３に示す。表１〜表
３において「−５’３’−」の欄に示す塩基は、Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼによりライゲーションを実施する前のニッ
クダンベル型ＲＮＡ−ＤＮＡキメラオリゴヌクレオチド
における５’末端及び３’末端の塩基である。

【００６８】表１〜表３に示すように、ヘアピンループ
部分がオリゴヌクレオチドからなるニックダンベル型Ｒ
ＮＡ−ＤＮＡキメラオリゴヌクレオチドよりも、ヘアピ
ンループが非核酸であるエチレングリコール化合物から
なるニックダンベル型ＲＮＡ−ＤＮＡキメラオリゴヌク
レオチドの方が、ライゲーション高率が高かった。この
ことから、ヘアピンループ部分が核酸からなる場合に
は、ヘアピンループ部分の核酸とステム部分の核酸とが
相互作用を起こしたり、あるいは、ヘアピンループ部分
内で高次構造をとったりすることによって、ステム部分
における相補的ＲＮＡ部分とアンチセンスＤＮＡ部分と
のハイブリッド形成を阻害しているのではないかと考え
られる。

【００６９】

【表１】 略号 −５’３’− ライゲーション効率（％） ＣＰＢ２−ＡＵＧ−ａｓ −ａｕ− ２３ ＣＰＢ２−ＡＵＧ−ｒａｎ −ｇｃ− ３ ＣＰＢ１−ＡＵＧ−ａｓ −ｇｇ− ５ ＣＰＢ１−ＡＵＧ−ｒａｎ −ｇｕ− − ＣＰＡ−ＡＵＧ−ａｓ −ａｃ− − ＣＰＡ−ＡＵＧ−ｒａｎ −ｇｃ− − ＣＮＰ−ＡＵＧ−ａｓ −ｇｇ− ２７ ＣＮＰ−ＡＵＧ−ｒａｎ −ａｇ− − ＣＰＢ２−ＡＵＧ−ａｓ Ｈ．Ｅ．Ｇ． −ａｕ− ３６ ＣＰＢ２−ＡＵＧ−ｒａｎ Ｈ．Ｅ．Ｇ． −ａａ− ３３

【００７０】

【表２】 略号 −５’３’− ライゲーション効率（％） ＣＰＢ２−ＡＵＧ−ａｓ −ａｕ− ２５ ＣＰＢ２−ＡＵＧ−ｒａｎ −ｇｃ− ７ ＣＰＢ１−ＡＵＧ−ａｓ −ｇｇ− １７ ＣＰＢ１−ＡＵＧ−ｒａｎ −ｇｕ− ＜５ ＣＰＡ−ＡＵＧ−ａｓ −ａｃ− ２１ ＣＰＡ−ＡＵＧ−ｒａｎ −ｇｃ− ＜５ ＣＮＰ−ＡＵＧ−ａｓ −ｇｇ− １９ ＣＮＰ−ＡＵＧ−ｒａｎ −ａｇ− − ＣＰＢ２−ＡＵＧ−ａｓ Ｈ．Ｅ．Ｇ． −ａｕ− ２８ ＣＰＢ２−ＡＵＧ−ｒａｎ Ｈ．Ｅ．Ｇ． −ａａ− ２７

【００７１】

【表３】 略号 −５’３’− ライゲーション効率（％） ＣＰＢ２−ＡＵＧ−ａｓ −ａｕ− ２５ ＣＰＢ２−ＡＵＧ−ｒａｎ −ｇｃ− １０ ＣＰＢ１−ＡＵＧ−ａｓ −ｇｇ− １６ ＣＰＢ１−ＡＵＧ−ｒａｎ −ｇｕ− ＜５ ＣＰＡ−ＡＵＧ−ａｓ −ａｃ− ２１ ＣＰＡ−ＡＵＧ−ｒａｎ −ｇｃ− １３ ＣＮＰ−ＡＵＧ−ａｓ −ｇｇ− ２１ ＣＮＰ−ＡＵＧ−ｒａｎ −ａｇ− − ＣＰＢ２−ＡＵＧ−ａｓ Ｈ．Ｅ．Ｇ． −ａｕ− ３２ ＣＰＢ２−ＡＵＧ−ｒａｎ Ｈ．Ｅ．Ｇ． −ａａ− ２９

【００７２】

【実施例３】（１）環状ダンベル型ＲＮＡ−ＤＮＡキメ
ラ化合物の評価系 本実施例では、インフルエンザウイルスＰＲ８株の第８
分節のタンパク質コード領域をクロラムフェニコールア
セチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子で置き換え
たＤＮＡ断片（前記第８分節のタンパク質コード領域の
５’上流領域の１３塩基対からなる塩基配列及び前記第
８分節のタンパク質コード領域の３’下流領域の１２塩
基対からなる塩基配列を含む）をファージＴ７ＲＮＡポ
リメラーゼプロモーターの下流に挿入することにより作
成したプラスミドｐＯＵＭＳ１０１［Ｐｒｏｃ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，５３６９−５３７３（１９
９１）］と、デキサメサゾンの添加によってインフルエ
ンザウイルスＡ型（Ａ／ＰＲ／８／３４）のＲＮＡポリ
メラーゼ（ＰＢ１、ＰＢ２及びＰＡ）及びＮＰタンパク
質の発現が誘導されるマウス乳癌細胞株Ｃ１２７のクロ
ーン細胞（以下、７６細胞と称する）［Ｙ．Ｎａｋａｍ
ｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１
０，３９５（１９９１）］とを用いる評価系によって、
本発明の環状ダンベル型ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ化合物の
抗ウイルス効果を確認した。前記の７６細胞は、前記の
プラスミドｐＯＵＭＳ１０１を鋳型としてイン・ビトロ
で合成した、ＣＡＴ遺伝子を含むネガティブ鎖ＲＮＡの
トランスフェクションによって、ＣＡＴタンパク質を生
成することができるという特徴を有する細胞株である。
本実施例の操作手順の概略を図１３に示す。

【００７３】（２）ＣＡＴ遺伝子を含むネガティブ鎖Ｒ
ＮＡの調製 前記のプラスミドｐＯＵＭＳ１０１の調製は、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，５３
６９−５３７３（１９９１）の記載に従って、常法によ
り行った。図１３に、プラスミドｐＯＵＭＳ１０１の部
分構造を模式的に示す。図１３において、「ＣＡＴ」
は、ＣＡＴタンパク質をコードするＣＡＴ遺伝子を示
し、「Ｔ７」は、ファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロ
モーターを示し、「５’−ＮＳ」は、インフルエンザウ
イルスＰＲ８株の第８分節のタンパク質非コード領域の
５’上流領域の１３塩基対からなる塩基配列を示し、そ
して、「３’−ＮＳ」は、インフルエンザウイルスＰＲ
８株の第８分節のタンパク質非コード領域の３’下流領
域の１２塩基対からなる塩基配列を示し、「ＣＡＰ」は
ｍＲＮＡのキャップ構造を示し、「ＣＡＴタンパク質」
は、ＣＡＴタンパク質タンパク質を示す。プラスミドｐ
ＯＵＭＳ１０１は、３’−ＮＳで表される領域の更に
３’下流側の位置に制限酵素ＭｂｏII認識部位を有す
る。

【００７４】得られたプラスミドｐＯＵＭＳ１０１（１
０μｇ）を、制限酵素ＭｂｏII（東洋紡績社）３２ユニ
ットで切断して直鎖状にした。切断後、フェノール・ク
ロロホルム（同量）により抽出し、上層（水性層）を注
意深く分取し、エタノール沈澱を行った。その後、１／
１５量（約０．６μｇ）を０．８％アガロースゲル電気
泳動（５０Ｖの一定電圧で１．５時間）に供し、切断を
確認した。得られた直鎖状のプラスミドｐＯＵＭＳ１０
１（１０μｇ）を鋳型として、添付の説明書に従って、
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（東洋紡績社）により、ＣＡＴ
遺伝子を含むネガティブ鎖ＲＮＡ（図１３ではｖＲＮＡ
として示す）を合成した。続いて、フェノール・クロロ
ホルム（同量）により抽出し、上層（水性層）を注意深
く分取し、エタノール沈澱を行った。その後、一部（１
／１００量）を、７Ｍ尿素を含むポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動に供し、目的鎖長の合成物を確認した。

【００７５】（３）ＣＡＴタンパク質発現抑制活性の測
定 Ｙ．Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．，１１０，３９５（１９９１）の記載に従って取
得した７６細胞を、１０％非慟化（５６℃で３０分間加
熱処理することにより非慟化した）ウシ胎児血清を含む
ダルベッコＭＥＭ培地（以下、Ｄ−ＭＥＭと称する）
（日水製薬社）５ｍｌ中で、５０〜６０％コンフレント
の状態になるまで培養した。培養液を除去し、１０^-3Ｍ
濃度のデキサメサゾン（シグマ社）（図１３ではＤｅｘ
として示す）をＤ−ＭＥＭで終濃度１０^-6Ｍ（１０００
倍希釈）になるように希釈することにより調製した培地
３ｍｌを、前記の５０〜６０％コンフレントの状態の７
６細胞に添加した。

【００７６】２４時間細胞を培養した後、リン酸緩衝生
理食塩水［以下、ＰＢＳ（−）と称する］を用いて、ウ
シ胎児血清が残存しないように充分に細胞を洗浄した。
実施例２で作製した環状ダンベル型ＲＮＡ−ＤＮＡキメ
ラ化合物（アンチセンス又はランダム）又はニックダン
ベル型ＲＮＡ−ＤＮＡキメラオリゴヌクレオチド（ラン
ダム）（各々０．０３μＭ又は０．３μＭ）と、トラン
スフェクション試薬としてのＮ−［１−（２，３−ジオ
レオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル
アンモニウムメチルサルフェート（ＤＯＴＡＰ：ベーリ
ンガー・マンハイム社）（５μｇ／ｍｌ）とを含む無血
清Ｄ−ＭＥＭ（ＨＥＰＥＳ及びウシアルブミンを含有）
２．５ｍｌを、７６細胞に添加した。

【００７７】更に４時間細胞を培養した後、細胞をＰＢ
Ｓ（−）で洗浄し、更に、前記（２）で得られたＣＡＴ
遺伝子を含むネガティブ鎖ＲＮＡ（１００ｎｇ）とＤＯ
ＴＡＰ（５μｇ／ｍｌ）とを含む無血清Ｄ−ＭＥＭ（Ｈ
ＥＰＥＳ及びウシアルブミンを含有）を７６細胞に添加
し、４時間細胞を培養した。その後、ＤＯＴＡＰを除去
し、ＰＢＳ（−）で細胞を洗浄した後、１０％非慟化ウ
シ胎児血清を含むＤ−ＭＥＭにより２０時間細胞を培養
した。次いで、７６細胞を剥離させ、細胞破砕後、回収
したタンパク質質量をブラッドフォード法により測定し
た。さらに、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識抗ＣＡＴ抗
体（Ａｎｔｉ−ＣＡＴ−ＤＩＧ）（ベーリンガー・マン
ハイム社）を用いる酵素免疫測定法（ＣＡＴ−ＥＬＩＳ
Ａ）により、細胞内に発現されたＣＡＴタンパク質量を
測定した。すなわち、７６細胞内に発現したＣＡＴタン
パク質に結合したＤＩＧ標識抗ＣＡＴ抗体の量をペルオ
キシダーゼ標識抗ＤＩＧ抗体を用いて測定し、ＣＡＴタ
ンパク質発現量を比較した。

【００７８】得られた結果を表４に示した。表４の「略
号」の欄に示す記号の意味は次のとおりである。先頭の
「Ｃ」は、環状（ｃｉｒｃｕｌａｒ）であることを意味
し、先頭の「Ｎ」は、ニックを有することを意味する。
「ＡＵＧ」は、標的領域の塩基配列がウイルス遺伝子の
翻訳開始コドンＡＵＧを含むことを意味し、「ａｓ」
は、環状ダンベル型ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ化合物におけ
るＤＮＡ部分の塩基配列が、設計対象としたウイルス遺
伝子の配列に対するアンチセンス配列であることを意味
する。「ｒａｎ」は、環状ダンベル型又はニックダンベ
ル型ＲＮＡ−ＤＮＡキメラオリゴヌクレオチドにおける
ＤＮＡ部分の塩基配列が、設計対象としたウイルス遺伝
子の配列に対してランダムな配列であることを意味す
る。

【００７９】本発明の環状ダンベル型ＲＮＡ−ＤＮＡキ
メラ化合物であるＣＰＢ２−ＡＵＧ−ａｓ、ＣＰＢ１−
ＡＵＧ−ａｓ、ＣＰＡ−ＡＵＧ−ａｓ、及びＣＮＰ−Ａ
ＵＧ−ａｓにおいては、ＣＰＢ２−ＡＵＧ−ａｓ（濃度
０．０３μＭ及び０．３μＭにおいて、それぞれ４９％
及び８２％）が、最も強くＣＡＴタンパク質の発現を抑
制し、ＣＮＰ−ＡＵＧ−ａｓ（同じく１７％及び３０
％）及びＣＰＡ−ＡＵＧ−ａｓ（同じく１７％及び２９
％）が強く、次にＣＰＢ１−ＡＵＧ−ａｓ（同じく＜５
％及び２１％）の順でＣＡＴタンパク質の発現を抑制し
た。一方、比較用化合物として使用したランダムオリゴ
ヌクレオチドは、本発明の環状ダンベル型ＲＮＡ−ＤＮ
Ａキメラ化合物に比べて、０．０３μＭ及び０．３μＭ
でＣＡＴタンパク質の阻害効果が低く、本発明による環
状ダンベル型ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ化合物のステム部分
に含まれるアンチセンスＤＮＡ部分がアンチセンス効果
を有することを示すことができた。

【００８０】

【表４】 阻害効果（％） オリゴヌクレオチド濃度（μＭ） 略号 ０．０３ ０．３ ＣＰＢ２−ＡＵＧ−ａｓ ４９ ８２ ＣＰＢ２−ＡＵＧ−ｒａｎ ＜５ ８ ＣＰＢ１−ＡＵＧ−ａｓ ＜５ ２１ ＮＰＢ１−ＡＵＧ−ｒａｎ ＜５ ＜５ ＣＰＡ−ＡＵＧ−ａｓ １７ ２９ ＣＰＡ−ＡＵＧ−ｒａｎ １１ ２５ ＣＮＰ−ＡＵＧ−ａｓ １７ ３０ＮＮＰ−ＡＵＧ−ｒａｎ ８ ９

【００８１】

【発明の効果】本発明の環状ダンベル型ＲＮＡ−ＤＮＡ
キメラ化合物によれば、タンパク質との相互作用や細胞
表面吸着阻害を引き起こすことなく、インフルエンザウ
イルスのタンパク質発現を抑制することができる。本発
明の環状ダンベル型ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ化合物は、細
胞毒性を有さず、優れた核酸分解酵素耐性を有する、極
めて効果的な抗インフルエンザ剤を構成することができ
る。

【００８２】

【配列表】

【００８３】配列番号：１ 配列の長さ：５０ 配列の型：核酸 トポロジー：環状 配列の種類：他の核酸 合成キメラオリゴヌクレオチド 配列の特徴 存在位置：１．．２５ 特徴を決定する方法：Ｅ 他の情報：ＤＮＡ 存在位置：２６．．４５ 特徴を決定する方法：Ｅ 他の情報：ＲＮＡ 存在位置：４６．．５０ 特徴を決定する方法：Ｅ 他の情報：ＤＮＡ 配列 TGACATCCAT TCAAATGGTT CCCCCAACCA UUUGAAUGGA UGUCACCCCC 50

【００８４】配列番号：２ 配列の長さ：５０ 配列の型：核酸 トポロジー：環状 配列の種類：他の核酸 合成キメラオリゴヌクレオチド 配列の特徴 存在位置：１．．２５ 特徴を決定する方法：Ｅ 他の情報：ＤＮＡ 存在位置：２６．．４５ 特徴を決定する方法：Ｅ 他の情報：ＲＮＡ 存在位置：４６．．５０ 特徴を決定する方法：Ｅ 他の情報：ＤＮＡ 配列 CTTATAAGTC CATTGATGAC CCCCCGUCAU CAAUGGACUU AUAAGCCCCC 50

【００８５】配列番号：３ 配列の長さ：５０ 配列の型：核酸 トポロジー：環状 配列の種類：他の核酸 合成キメラオリゴヌクレオチド 配列の特徴 存在位置：１．．２５ 特徴を決定する方法：Ｅ 他の情報：ＤＮＡ 存在位置：２６．．４５ 特徴を決定する方法：Ｅ 他の情報：ＲＮＡ 存在位置：４６．．５０ 特徴を決定する方法：Ｅ 他の情報：ＤＮＡ 配列 TTCTTTCCAT ATTGAATATA CCCCCUAUAU UCAAUAUGGA AAGAACCCCC 50

【００８６】配列番号：４ 配列の長さ：５０ 配列の型：核酸 トポロジー：環状 配列の種類：他の核酸 合成キメラオリゴヌクレオチド 配列の特徴 存在位置：１．．２５ 特徴を決定する方法：Ｅ 他の情報：ＤＮＡ 存在位置：２６．．４５ 特徴を決定する方法：Ｅ 他の情報：ＲＮＡ 存在位置：４６．．５０ 特徴を決定する方法：Ｅ 他の情報：ＤＮＡ 配列 CTTCTTATAT ACGATTATAT CCCCCAUAUA AUCGUAUAUA AGAAGCCCCC 50

【００８７】配列番号：５ 配列の長さ：５０ 配列の型：核酸 トポロジー：環状 配列の種類：他の核酸 合成キメラオリゴヌクレオチド 配列の特徴 存在位置：１．．２５ 特徴を決定する方法：Ｅ 他の情報：ＤＮＡ 存在位置：２６．．４５ 特徴を決定する方法：Ｅ 他の情報：ＲＮＡ 存在位置：４６．．５０ 特徴を決定する方法：Ｅ 他の情報：ＤＮＡ 配列 AATCTTCCAT TTTGGATCAG CCCCCCUGAU CCAAAAUGGA AGAUUCCCCC 50

【００８８】配列番号：６ 配列の長さ：５０ 配列の型：核酸 トポロジー：環状 配列の種類：他の核酸 合成キメラオリゴヌクレオチド 配列の特徴 存在位置：１．．２５ 特徴を決定する方法：Ｅ 他の情報：ＤＮＡ 存在位置：２６．．４５ 特徴を決定する方法：Ｅ 他の情報：ＲＮＡ 存在位置：４６．．５０ 特徴を決定する方法：Ｅ 他の情報：ＤＮＡ 配列 TCATAAGTTC GACTTTCGTA CCCCCUACGA AAGUCGAACU UAUGACCCCC 50

【００８９】配列番号：７ 配列の長さ：５０ 配列の型：核酸 トポロジー：環状 配列の種類：他の核酸 合成キメラオリゴヌクレオチド 配列の特徴 存在位置：１．．２５ 特徴を決定する方法：Ｅ 他の情報：ＤＮＡ 存在位置：２６．．４５ 特徴を決定する方法：Ｅ 他の情報：ＲＮＡ 存在位置：４６．．５０ 特徴を決定する方法：Ｅ 他の情報：ＤＮＡ 配列 GGGACGCCAT GATTTTGATG CCCCCCAUCA AAAUCAUGGC GUCCCCCCCC 50

【００９０】配列番号：８ 配列の長さ：５０ 配列の型：核酸 トポロジー：環状 配列の種類：他の核酸 合成キメラオリゴヌクレオチド 配列の特徴 存在位置：１．．２５ 特徴を決定する方法：Ｅ 他の情報：ＤＮＡ 存在位置：２６．．４５ 特徴を決定する方法：Ｅ 他の情報：ＲＮＡ 存在位置：４６．．５０ 特徴を決定する方法：Ｅ 他の情報：ＤＮＡ 配列 TTAGGTGGAG TCAACGCTGT CCCCCACAGC GUUGACUCCA CCUAACCCCC 50

【００９１】配列番号：９ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡ 配列 AACCAUUUGA AUGGAUGUCA 20

【００９２】配列番号：１０ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡ 配列 UAUAUUCAAU AUGGAAAGAA 20

【００９３】配列番号：１１ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡ 配列 CUGAUCCAAA AUGGAAGAUU 20

【００９４】配列番号：１２ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡ 配列 CAUCAAAAUC AUGGCGUCCC 20

【００９５】配列番号：１３ 配列の長さ：４９ 配列の型：核酸 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡ 配列 AGCGAAAGCA GGCAAACCAU UUGAAUGGAU GUCAAUCCGA CCUUACUUU 49

【００９６】配列番号：１４ 配列の長さ：５０ 配列の型：核酸 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡ 配列 AGCGAAAGCA GGUCAAUUAU AUUCAAUAUG GAAAGAAUAA AAGAACUAAG 50

【００９７】配列番号：１５ 配列の長さ：５４ 配列の型：核酸 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡ 配列 AGCGAAAGCA GGUACUGAUC CAAAAUGGAA GAUUUUGUGC GACAAUGCUU CAAU 54

【００９８】配列番号：１６ 配列の長さ：７０ 配列の型：核酸 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡ 配列 AGCAAAAGCA GGGUAGAUAA UCACUCACUG AGUGACAUCA AAAUCAUGGC GUCCCAAGGC 60 ACCAAACGGU 70

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の環状ダンベル型ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ
化合物のアンチセンス機序を示す説明図である。

【図２】インフルエンザウイルスＰＢ２遺伝子の部分塩
基配列を示す説明図である。

【図３】インフルエンザウイルスＰＢ１遺伝子の部分塩
基配列を示す説明図である。

【図４】インフルエンザウイルスＰＡ遺伝子の部分塩基
配列を示す説明図である。

【図５】インフルエンザウイルスＮＰ遺伝子の部分塩基
配列を示す説明図である。

【図６】実施例１で設計した、本発明の環状ダンベル型
ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ化合物の塩基配列を示す説明図で
ある。

【図７】実施例１で設計した、ヘアピンループ部分がヘ
キサエチレングリコール残基である本発明のＰＢ２遺伝
子に対する環状ダンベル型ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ化合物
の化学構造式を示す説明図である。

【図８】実施例２で調製した本発明のＰＢ２遺伝子に対
する環状ダンベル型ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ化合物のポリ
アクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す図面である。

【図９】実施例２で調製した本発明のＰＢ１遺伝子に対
する環状ダンベル型ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ化合物のポリ
アクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す図面である。

【図１０】実施例２で調製した本発明のＰＡ遺伝子に対
する環状ダンベル型ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ化合物のポリ
アクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す図面である。

【図１１】実施例２で調製した本発明のＮＰ遺伝子に対
する環状ダンベル型ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ化合物のポリ
アクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す図面である。

【図１２】実施例２で調製した、ヘアピンループ部分が
ヘキサエチレングリコール残基である本発明のＰＢ２遺
伝子に対する環状ダンベル型ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ化合
物のポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す図面
である。

【図１３】実施例３で行ったＣＡＴタンパク質発現抑制
活性試験の操作の概略を示す説明図である。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （１）インフルエンザウイルスのＰＢ１
   遺伝子、ＰＢ２遺伝子、ＰＡ遺伝子、又はＮＰ遺伝子の
   翻訳開始コドンＡＵＧを含有する標的領域の塩基配列に
   対して相補的な塩基配列を含むＤＮＡ部分と、前記ＤＮ
   Ａ部分の前記塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む
   ＲＮＡ部分とを含み、前記ＲＮＡ部分と前記ＤＮＡ部分
   とが二重鎖を形成するステム部分、及び（２）前記ステ
   ム部分の両端部にそれぞれ位置するヘアピンループ部分
   ２つを含むことを特徴とする、環状ダンベル型ＲＮＡ−
   ＤＮＡキメラ化合物。
2. 【請求項２】 ヘアピンループ部分が、オリゴヌクレオ
   チド残基、又は式： −（−ＣＨ₂ −ＣＨ₂ −Ｏ−）_n − （式中、ｎは１〜６の整数である）で表されるエチレン
   グリコール化合物残基からなる、請求項１に記載の環状
   ダンベル型ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ化合物。
3. 【請求項３】 前記ヘアピンループ部分がオリゴシトシ
   ン残基である、請求項２に記載の環状ダンベル型ＲＮＡ
   −ＤＮＡキメラ化合物。
4. 【請求項４】 配列表の配列番号１の配列で表される塩
   基配列、配列表の配列番号３の配列で表される塩基配
   列、配列表の配列番号５の配列で表される塩基配列、又
   は配列表の配列番号７の配列で表される塩基配列からな
   る、請求項３に記載の環状ダンベル型ＲＮＡ−ＤＮＡキ
   メラ化合物。
5. 【請求項５】 前記ヘアピンループ部分がヘキサエチレ
   ングリコール残基である、請求項２に記載の環状ダンベ
   ル型ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ化合物。
6. 【請求項６】 請求項１に記載の環状ダンベル型ＲＮＡ
   −ＤＮＡキメラ化合物を有効成分として含有することを
   特徴とする、抗インフルエンザウイルス剤。